Dissertations / Theses on the topic 'Clonage de génome dans la levure'

Mycoplasma hominis est un pathogène humain opportuniste responsable d’infections génitales et néo-natales. Modifier génétiquement cette bactérie est nécessaire afin de comprendre les mécanismes de virulence et d’infection de ce pathogène. Il n’existe à ce jour aucun outil moléculaire efficace permettant de manipuler le génome de M. hominis, limitant les recherches sur sa pathogénicité et son métabolisme particulier reposant sur l’arginine. De nouvelles technologies rassemblées sous le terme de Biologie de Synthèse (BS) ont récemment émergé, offrant des perspectives inédites pour l’étude des mycoplasmes en permettant de modifier leurs génomes à grande échelle et de produire des souches mutantes. Ces travaux menés au J. Craig Venter Institute (JCVI, USA) ont montré que le génome de mycoplasmes apparentés pouvait être cloné et manipulé dans la levure avant d’être transplanté dans une cellule receveuse. La levure sert d’hôte d’accueil temporaire pour modifier le génome de la bactérie. Cette approche novatrice ouvre de nombreuses perspectives dans le cadre du développement de la génomique fonctionnelle chez les mycoplasmes pour lesquels les outils génétiques efficaces sont peu nombreux. Le but de cette thèse a été d’adapter pour la première fois certains outils de BS à M. hominis dans le but de créer des mutants déficients pour une fonction donnée. Pour cela, le génome de la souche type de M. hominis PG21 (665 kb) a été cloné dans la levure Saccharomyces cerevisiae par « Transformation-Associated Recombination cloning » (TAR-cloning). Deux clones (B3-2 et B3-4) de levure possédant le génome complet de M. hominis ont été validés par analyse en PCR simplex, PCR multiplex et électrophorèse en champs pulsé (PFGE). Ces clones levures ont ensuite été propagés en milieu sélectif durant 180 générations (30 passages), afin d’évaluer la stabilité du génome bactérien dans son hôte. Cette expérience a montré que (i) si la taille du génome de M. hominis ne variait pas au cours des premiers passages, elle diminuait progressivement à partir du dixième passage (≈60 générations), et que (ii) les zones du génome enrichies en séquence répétées étaient préférentiellement perdues. En tenant compte de ces résultats, le génome de M. hominis a été modifié chez le clone B3-4 par la technique « Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas9 » (CRISPR/Cas9) lors de passages précoces. Des clones de S. cerevisiae possédant un génome de M. hominis PG21 complet délété du gène vaa, codant une protéine d’adhésion majeure, ont été ainsi produits. La dernière étape de cette approche consistait à transplanter le génome modifié dans une cellule receveuse de M. hominis ou de Mycoplasma arthritidis, espèce phylogénétiquement la plus proche de M. hominis. Aucun protocole de transformation de M. hominis n’étant disponible au début de nos travaux, cette étape constituait un verrou majeur dans la mise en place des outils de BS chez cette espèce. Ce verrou a été en partie levé puisqu’une méthode de transformation de M. hominis basée sur du polyéthylène glycol (PEG) et mettant en jeu le plasposon pMT85 (plasmide contenant un transposon conférant la résistance à la tétracycline) a été mise au point au laboratoire. Cette technique de transformation, développée pour la souche de référence M. hominis M132 (745 kb) reste encore peu efficace ; elle est néanmoins reproductible et a permis d’obtenir des mutants d’intérêt de M. hominis. Le transformant n°28-2 a, ainsi, été muté dans le gène Mhom132_2390, codant le précurseur de la protéine P75, une adhésine putative de M. hominis. Le séquençage des génomes complets d’autres transformants a révélé l’insertion de multiples copies du transposon et la présence d’évènements de duplication et d’inversion de larges fragments d’ADN dans au moins deux génomes de M. hominis<br>Mycoplasma hominis is an opportunistic human pathogen responsible for genital and neonatal infections. Genetically modifying this bacterium is necessary to understand the virulence and infection mechanisms of this pathogen. There is currently no effective molecular tool to engineer the genome of this bacterium, limiting research on its pathogenicity and its peculiar metabolism based on arginine.New technologies have recently emerged in the field of Synthetic Biology (BS), offering new perspectives for the study of mycoplasmas by allowing large scale genome modifications and the production of mutant strains. Work at the J. Craig Venter Institute (JCVI, USA) has shown that the genome of related mycoplasmas can be cloned and manipulated in yeast before being transplanted into a recipient cell. The yeast serves as a temporary host to modify the genome of the bacterium. This innovative approach opens many perspectives in the development of functional genomics in mycoplasmas for which there are few effective genetic tools. The goal of this thesis was to adapt a number of BS tools to M. hominis for the first time, in order to create mutants deficient for a given function. To achieve this goal, the genome of the M. hominis type strain PG21 (665 kb) was cloned into the yeast Saccharomyces cerevisiae by Transformation-Associated Recombination cloning (TAR-cloning). Two yeast clones (B3-2 and B3-4) possessing the complete genome of M. hominis were validated by simplex PCR, multiplex PCR and Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) analyses. These yeast clones were then propagated in a selective medium for 180 generations (30 passages) to evaluate the stability of the bacterial genome in its host. This experiment showed that (i) the size of the genome of M. hominis did not change during the first passages, it decreased progressively from the tenth passage (≈60 generations), and (ii) the enriched genome areas in repeated sequence were preferentially lost. Thus, the genome of M. hominis was modified in the B3-4 clone at early passages using the Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas9 (CRISPR/Cas9) technology. Yeast clones with a complete M. hominis PG21 genome with a deleted vaa gene, encoding a major adhesion protein, were produced using this approach. The final step of this approach was to transplant the modified genome into a recipient cell of M. hominis or Mycoplasma arthritidis, the species phylogenetically closest to M. hominis. As no M. hominis transformation protocol was available at the beginning of our work, this step constituted a major obstacle in the implementation of BS tools in this species. This barrier has been partially lifted since a method of transformation of M. hominis based on polyethylene glycol (PEG) and involving the plasposon pMT85 (plasmid carrying a transposon conferring resistance to tetracycline) has been developed in the laboratory. This transformation technique, developed for the reference strain M. hominis M132 (745 kb) still remains not very efficient; it is nevertheless reproducible and allowed to obtain M. hominis mutants of interest. The Mhom132_2390 gene, encoding the precursor of the P75 protein, a putative adhesin of M. hominis, was effectively mutated in transformant No. 28-2. Complete genome sequencing of other transformants revealed the insertion of multiple copies of the transposon and the presence of duplication and inversion of large DNA fragments within at least two M. hominis genomes.In conclusion, this data has opened the way for the development and transposition of existing genetic modification approaches to M. hominis, previously considered as a genetically intractable bacterium

L’ingénierie des génomes des micro-organismes est devenue un standard dans les biotechnologies microbiennes. En 2010, des technologies prometteuses de biologie de synthèse utilisant la levure comme plateforme pour l’assemblage et l’ingénierie de génomes synthétiques bactériens suivi de leur transplantation dans une cellule receveuse ont vu le jour. Ces technologies ont conduit à la création des premières cellules synthétiques et ouvert de nouvelles voies vers la construction de cellules aux propriétés biologiques entièrement contrôlées. Le transfert de ces outils à des micro-organismes d’intérêt industriel comme la bactérie Gram+ Bacillus subtilis (Bsu), modèle dans le secteur des biotechnologies, constituerait une avancée majeure. C’est précisément l’objectif du projet ANR « Bacillus 2.0 », qui réunit deux équipes INRAE et qui se propose d’adapter l’ensemble de ces outils de biologie de synthèse à Bsu afin d’être en mesure de partir d’une conception, assistée par ordinateur, de génomes semi-synthétiques de Bsu jusqu’à l’obtention de nouvelles souches industrielles. Cependant, les premiers travaux réalisés sur ce projet ont montré que le génome entier de Bsu ne pouvait pas être cloné et maintenu en l’état dans la levure. Ces résultats risquaient de remettre en question la faisabilité du projet dans son ensemble et en particulier la pertinence d’utiliser la levure comme plateforme d’assemblage du génome semi-synthétique de Bsu.L’objectif de ma thèse a consisté à démontrer que la levure restait un hôte pertinent pour le projet « Bacillus 2.0 ». Elle s’est déclinée en 3 parties. Dans la première partie, une méthode de clonage de génome récemment développée au laboratoire et dénommée CReasPy-Fusion, a progressivement été adaptée à Bsu. Les résultats obtenus ont montré (i) le transfert possible d'ADN plasmidique entre protoplastes bactériens et sphéroplastes de levure, (ii) l'efficacité d'un système CRISPR-Cas9 porté par les cellules de levure pour capturer/modifier cet ADN plasmidique pendant la fusion Bsu/levure, puis (iii) l'efficacité de ce même système pour capturer des fragments de génome d’une centaine de kb à partir de trois souches différentes. Des observations en microscopie à fluorescence ont également été réalisées et ont mis en évidence deux types d’interactions qui permettraient de passer d’un contact protoplastes/sphéroplastes à un ADN bactérien cloné dans la levure. Dans la seconde partie de ma thèse, la méthode CReasPy-Fusion a été mise à profit pour tenter de cloner de grands fragments du génome de Bsu dans la levure. Des fragments génomiques jusqu’à ~1 Mb ont pu être clonés dans la levure, mais leur capture a nécessité l’ajout préalable d’un grand nombre d’ARS sur le génome de Bsu pour stabiliser les constructions génétiques. La dernière partie a été l’adaptation de la méthode RAGE à Bsu. Cette méthode permet le transfert, non pas d’un génome entier mais de portions de génomes bactériens depuis la levure vers la bactérie à éditer. Une preuve de concept a été réalisée avec l’échange d’un premier fragment de génome de 155 kb par une version réduite de 44 kb.En conclusion, les travaux réalisés au cours de cette thèse ont montré la pertinence d’utiliser la levure comme plateforme d’ingénierie dans les modifications à grande échelle du génome de Bsu. D’une part, nous avons montré que des fragments d’une centaine de kb peuvent être clonés dans la levure, modifiés et transférés dans une cellule receveuse de façon à générer des Bsu mutants. Cette stratégie offre une véritable alternative à la transplantation de génome. D’autre part, nous avons montré que de grands fragments du génome de Bsu (jusqu’à 1Mb) peuvent également être clonés dans la levure à condition de contenir de nombreux ARS dans leurs séquences. Grâce à ces résultats, le clonage d’un génome réduit de Bsu chez la levure est redevenu un objectif réalisable<br>Genome engineering of microorganisms has become a standard in microbial biotechnology. In 2010, promising synthetic biology technologies using yeast as a platform for the assembly and engineering of synthetic bacterial genomes followed by their transplantation into a recipient cell have emerged. These technologies have led to the creation of the first synthetic cells and opened new avenues towards the construction of cells with fully controlled biological properties. Transferring these tools to microorganisms of industrial interest such as the Gram+ bacterium Bacillus subtilis (Bsu), a model in the biotechnology sector, would be a major step forward. This is precisely the aim of the ANR "Bacillus 2.0" project, which brings together two INRAE teams and aims to adapt all these synthetic biology tools to Bsu so as to be able to go from computer-aided design of semi-synthetic Bsu genomes to the production of new industrial strains. However, initial work on this project showed that the entire Bsu genome could not be cloned and maintained in yeast in its current state. These results threatened to call into question the feasibility of the entire project and, in particular, the relevance of using yeast as a platform for assembling the semi-synthetic Bsu genome.The goal of my thesis was to demonstrate that yeast remained a relevant host for the Bacillus 2.0 project. It was divided into 3 parts. In the first part, a genome cloning method recently developed in the laboratory, called CReasPy-Fusion, was progressively adapted to Bsu. The results obtained showed (i) the possible transfer of plasmid DNA between bacterial protoplasts and yeast spheroplasts, (ii) the efficiency of a CRISPR-Cas9 system carried by yeast cells to capture/modify this plasmid DNA during Bsu/yeast fusion, and then (iii) the efficiency of the same system to capture genomic fragments of about a hundred kb from three different strains. Fluorescence microscopy observations were also carried out revealing two types of interaction that would enable the transition from protoplast/spheroplast contact to cloned bacterial DNA in yeast. In the second part of my thesis, the CReasPy-Fusion method was used in an attempt to clone large Bsu genome fragments in yeast. Genomic fragments of up to ~1 Mb could be cloned in yeast, but their capture required the prior addition of a large number of ARS to the Bsu genome to stabilize the genetic constructs. The final part was the adaptation of the RAGE method to Bsu. This method allow the transfer, not of a whole genome, but of portions of bacterial genomes from yeast to the bacteria to be edited. Proof of concept was achieved by exchanging a 155 kb genome fragment with a reduced 44 kb version.In conclusion, the work carried out during this thesis has shown the relevance of using yeast as an engineering platform for large-scale modifications of the Bsu genome. On the one hand, we have shown that fragments of around 100 kb can be cloned in yeast, modified and transferred into a recipient cell to generate Bsu mutants. This strategy offers a real alternative to genome transplantation. On the other hand, we have shown that large fragments of the Bsu genome (up to 1 Mb) can also be cloned in yeast, provided they contain numerous ARS in their sequences. Thanks to these results, cloning a reduced Bsu genome in yeast has once again become an achievable goal

L'expression de récepteurs de type olfactif (OLRs) dans les bourgeons gustatifs de rat a été rapportée, suggérant leur implication dans la perception du goût en tant que récepteurs gustatifs. L'objectif de cette thèse était d'identifier et de caractériser des OLRs exprimés dans les tissus gustatifs humains. Neuf gènes et huit pseudogènes d'OLRs exprimés dans la langue humaine adulte et/ou fœtale ont été identifiés par RT-PCR. Leurs orthologues murins ont été déterminés : 5 sont exprimés dans la langue de souris adulte, dont 3 spécifiquement dans les papilles gustatives. Ils sont tous exprimés dans les tissus sensoriels et le cerveau, mais sont rarement détectés dans d'autres organes. L'un d'eux semble cependant présenter une expression ubiquitaire. Les expériences d'hybridation in situ, n'ont pas permis de détecter clairement l'expression de ces récepteurs dans les cellules gustatives. Un outil cellulaire visant à identifier les ligands de ces récepteurs a été construit<br>The expression of olfactory like receptors (OLRs) in rat taste buds has been previously described, suggesting their involvement in taste perception as gustatory receptors. The aim of this work was to identify and characterize human OLRs expressed in human gustatory tissues. Nine OLRs genes and eight pseudogenes expressed in human adult and/or foetal tongue were identified by RT-PCR. Their murine orthologs were assigned: 5 are expressed in adult mouse tongue, among which 3 are expressed specifically in gustatory papillae. The latter were detected in sensory tissues and brain, but rarely in other organs. Nevertheless, one of them seems to be ubiquitously expressed. In situ hybridization experiments did not show a clear expression of these receptors in mouse taste buds. A cellular tool was constructed in order to identify the ligands of these receptors

Préserver l’intégrité du matériel génétique est crucial pour assurer la survie cellulaire et prévenir le développement tumoral. L’ARN à interférence (RNAi) joue un rôle important dans ce contexte. Il s’agit d’un processus conservé surtout connu pour sa fonction de silencing transcriptionnel visant à induire la formation d’hétérochromatine chez différentes espèces. Au vu des divers rôles protecteurs dans l’intégrité du génome que revêt cet état chromatinien, le RNAi concourt ainsi, par ce biais, à préserver la stabilité du génome. Le RNAi a également été impliqué plus directement dans la réponse au stress génotoxique chez une variété d’eucaryotes. Dans ce cas, il agirait dans la signalisation ou la réparation des dommages de l’ADN. Cependant, cette fonction et les mécanismes moléculaires, qui sous-tendent son implication, restent très peu caractérisés, bien que la fonction soit clairement conservée de la levure à l’Homme.Dans cette étude, nous avons exploré la fonction moléculaire du RNAi dans le maintien de la stabilité génomique, en utilisant la levure Schizosacharomyces pombe comme modèle d’étude. Dans cet organisme, la fonction clé du RNAi dans la formation d’hétérochromatine a été disséquée. Son mécanisme d’action se base sur le complexe effecteur RITS (RNA Induced-Transcriptional Silencing), qui se charge en petits ARN produits par Dcr1. Ces derniers permettent de guider RITS au niveau des régions cibles afin de recruter les facteurs assurant la déposition et la maintenance des marques épigénétiques répressives associées à la formation d’hétérochromatine. En parallele, le RNAi participerait également à la résolution des collisions entre les machineries de réplication et de transcription se produisant au niveau de régions difficiles à répliquer, comme les régions riches en séquences d’ADN répétées. Selon le modèle proposé, il favoriserait la terminaison de la transcription, ce qui permettrait à la fourche de réplication de poursuivre sa progression (Zaratiegui et al., Nature, 2011 ; Castel et al., Cell, 2014).Notre étude a d’abord montré que RITS, et pas seulement Dcr1, sont impliqués dans le maintien de la stabilité génomique chez S. pombe. La combinaison d’approches biochimiques et d’analyses microscopiques a révélé des connexions physiques entre RITS et les processus de réplication et de réparation de l’ADN. Nous nous sommes particulièrement intéressés à la fonction du RNAi dans la stabilité des rDNA. Nos données ont indiqué que le RNAi participe au maintien des nombreuses unités de rDNA, prévenant ainsi des réarrangements chromosomiques majeurs. Cette fonction requière RITS et Dcr1, mais n’implique pas d’autres facteurs essentiels à la formation d’hétérochromatine RNAi-dépendante. D’autre part, nous avons mis en évidence que le RNAi contribue à favoriser la progression des fourches de réplication au niveau d’une région proche des origines de réplication de l’unité ribosomale. Les fourches arrêtées constituent des structures fragiles pouvant entraîner une instabilité génomique. Afin d’explorer plus en détail la fonction du RNAi dans leur prise en charge, nous avons utilisé un système permettant de bloquer localement et de façon inductible la progression d’une seule fourche de réplication dans le génome. L’essai génétique basé sur ce système suggère que RITS et Dcr1 favoriseraient le redémarrage via la recombinaison homologue au niveau de la fourche bloquée. Ils agiraient tout particulièrement sur l’étape de la résection initiant ce processus. Dans l’ensemble, ces travaux permettent une meilleure compréhension de la fonction moléculaire du RNAi dans la réponse cellulaire au stress réplicatif. Cet aspect a été assez peu exploré dans les études actuelles chez les autres espèces eucaryotes<br>Preserving the integrity of genetic material is crucial to ensure cell survival and prevent tumor development. RNA Interference (RNAi) plays an important role in this context. This conserved process is well known to mediate sequence-specific transcriptional gene silencing via the induction of heterochromatin formation in a large variety of species. Through the various protective roles that this chromatin state has on the genome integrity, RNAi contributes to the preservation genomic stability. In parallel, RNAi has been involved also more directly in the cell response to genomic DNA damage in a variety of eukaryotes. In this case, it would participate to DNA damage signalization or repair. However, this function and the molecular mechanisms underlying its involvement remain poorly characterized, eventhough the function appears to be conserved from yeast to human.In this study, we explored the molecular function of RNAi in maintaining genomic stability, using the yeast Schizosacharomyces pombe as a model. In this organism, the key function of RNAi in the formation of heterochromatin has been extensively studied. The mechanism of action relies on the effector RITS complex (RNA Induced-Transcriptional Silencing), which is loaded with Dcr1produced small RNAs. These small RNAs guide RITS to the target regions in order to recruit the factors ensuring the deposition and maintenance of repressive epigenetic marks associated witth the formation of heterochromatin. RNAi has also been involved in the resolution of collisions between the replication and transcription machineries, occurring at hard-to-replicate genomic regions, like at regions containing highly repeated DNA. According to the current model, RNAi favors transcription termination thereby favouring replication fork progression (Zaratiegui et al., Nature, 2011 ; Castel et al., Cell, 2014).Our study first showed that RITS, and not just Dcr1, are involved in maintaining genomic stability in S. pombe. The combination of biochemical and microscopic approaches revealed physical connections between RITS and the DNA replication and repair processes. We studied in particular the implication of RNAi in the genomic stability of the rDNA region. Our data indicated that RNAi participates in the maintenance of the numerous rDNA units, thereby preventing major chromosomal rearrangements. This function requires RITS and Dcr1, but does not involve other factors essential for the formation of heterochromatin. Moreover, we identified that RNAi contributes to promote replication fork progression within a region close to the origin of replication of the ribosomal unit. The terminally-arrested replication forks constitute fragile structures which can cause genomic instability. In order to further explore this function of RNAi, we used a conditional and inducible fork barrier to block replication at a unique locus in the genome. A genetic assay based on this system, strongly suggest that RITS and Dcr1 manages the homologous recombination-dependent fork restart by acting specifically on the DNA resection step of this process. Altogether, our findings provide a better understanding of the RNAi molecular function in the cellular response to replicative stress. This aspect has been poorly explored by the current studies led in other eukaryotic models

Lors de la fécondation, le sperme et l'ovule s'unissent pour former un zygote totipotent. Initialement, le zygote est transcriptionnellement inactif. Au cours des premiers clivages a lieu la mise en route du génome embryonnaire (EGA) et le développement passe alors sous le contrôle de l’information embryonnaire (au stade 8-16-cellules chez le bovin). Cette transition d’un contrôle maternel à un contrôle embryonnaire est appelée « maternal to embryonic transition (MET) ». De la même façon, lors du transfert nucléaire (clonage), un noyau de cellule somatique placé dans un ovocyte énucléé devient totipotent. Ce processus est appelé «reprogrammation nucléaire somatique?». En fait, la reprogrammation nucléaire lors du clonage est équivalente à la MET, toutefois, le clonage est très peu efficace. Les objectifs de cette étude chez les bovins sont a) d'explorer le processus de reprogrammation lors de la MET dans des embryons fécondés in vitro (FIV) et b) d’estimer l'efficacité de la reprogrammation génique après le transfert nucléaire lors du clonage. Nous émettons l'hypothèse que l'acquisition d'un profil d'expression génique correct pourrait être prédictif d’un potentiel de développement à terme de l'embryon, et pourrait être évalué dès juste après l'activation du génome embryonnaire (EGA) chez les bovins. Nous avons développé notre travail selon deux axes a) des analyses globales d'expression génique utilisant une puce dédiée à l’EGA et b) l’analyse du profil d'expression de gènes candidats par qRT-PCR dans les embryons fécondés et clonés. Dans un premier temps nous avons optimisé le protocole d'amplification d'ARNm pour l'analyse du transcriptome de matériels rares. Puis nous avons fait l'analyse du transcriptome avant et après EGA d’embryons issus d’ovocytes prélevés sur des vaches phénotypées comme « bonnes » ou « mauvaises » donneuses d’embryons. En outre, ces ovocytes ont été maturés soit in vivo soit in vitro. Nos analyses montrent que l'effet individuel est plus important que l'effet « bonne ou mauvaise donneuse » ou même que l’effet « conditions de maturation ». Nous avons ensuite analysé les expressions géniques de 5 types d'embryons clonés ayant différents potentiels de développement à terme en fonction de la lignée cellulaire utilisée comme source de cellules donneuses. Globalement, leur expression génique est proche de celle de morulae FIV, mais quelques gènes présentent une expression différente. Ces gènes varient avec la lignée de cellules donneuses et leur nombre n’est pas lié à l’aptitude au développement à terme. L’analyse d’un lien éventuel entre leur nature et cette aptitude devra être poursuivie. Dans un deuxième temps, nous avons analysé les profils d'expression spatio-temporelle des transcrits et des protéines des gènes de pluripotence (OCT4, SOX2 et NANOG) et les niveaux d'ARNm de certains de leurs cibles dans les ovocytes et les embryons précoces chez le bovin. Les profils d'expression de ces gènes ont aussi été analysés dans des embryons clonés présentant différents potentiels de développement à terme. Nos résultats montrent que (1) la triade de gènes de pluripotence n'est probablement pas impliquée dans l’EGA bovine. (2) les transcrits et protéines de SOX2 et de NANOG sont restreints au lignage pluripotent plus tôt que ceux de OCT4, (3) les embryons à faible taux de développement à terme ont un taux de transcription plus élevé, néanmoins, l’équilibre précaire entre les gènes de pluripotence est maintenue. Cet équilibre pourrait permettre un développement normal in vitro, mais le taux de transcription plus élevé pourrait avoir des conséquences délétères sur le développement ultérieur<br>In natural fertilization, sperm and ovum unite to form a totipotent zygote. Initially, the zygote is transcriptionally inactive and after few cleavages (8-16-cell stage in bovine) embryonic genome activation (EGA) takes place and embryo shifts from maternal to embryonic control, the process called maternal to embryonic transition (MET). Likewise, in nuclear transplantation (cloning) a somatic cell nucleus achieves totipotency when placed in an enucleated oocyte, the process called “nuclear reprogramming”. In fact, nuclear reprogramming in cloning experiments is equivalent to MET; however, this process is afflicted with low efficiency. The objectives of this study in bovine were a) to explore the process of MET reprogramming of in vitro fertilized (IVF) embryos and b) to estimate the efficiency of gene reprogramming after nuclear transfer in animal cloning. We hypothesized that the acquisition of a proper gene expression pattern could herald development potential of the embryos, which could be assessed as early as morula stage or after embryonic genome activation (EGA) in bovine. Here, we opted for a study plan consisting of two axes a) global gene expression analysis using an EGA-dedicated microarray and b) candidate gene expression profiling through qRT-PCR in the fertilized and cloned bovine embryos. Firstly, we optimized the protocol of mRNA amplification for transcriptome analysis which generates antisens-RNA (aRNA). Then we did transcriptomic analysis of the 4-cell and morulae derived from two genotypes having better and two genotypes having poorer in vitro embryonic development potentials. In addition, these oocytes were either matured in vivo or in vitro. We observed that the effect of individual genotype was more important than the effect of the phenotypic category (poorer or better) or conditions of oocyte maturation. Furthermore, we explored the expression patterns of 5 types of cloned embryos having different full term developmental potentials depending upon the donor cell line used. Their genes expression patterns closely resembled to the IVF morulae, except for few genes which present differences. These genes vary with the cell line used as somatic cell donor for SCNT and the number of these deregulated genes did not increase with the poorer developmental potential of the cloned embryos. The analysis of an eventual correlation between the potential for embryonic development to term and nature of the deregulated genes should be addressed. Secondly, we charted quantitative and/or qualitative spatio-temporal expression patterns of transcripts and proteins of pluripotency genes (OCT4, SOX2 and NANOG) and mRNA levels of some of their downstream targets in bovine oocytes and early embryos. Furthermore, to correlate expression patterns of these genes with term developmental potential, we used cloned embryos, instead of gene ablation, having similar in vitro but different full term development rates. We chose these genes to be analysed since pluripotency genes are implicated in mouse embryonic genome activation (EGA) and pluripotent lineage specification. Moreover, their expression levels have been correlated with embryonic term development. Our findings affirm: first, the core triad of pluripotency genes probably is not implicated in bovine EGA since their proteins were not detected during pre-EGA phase, despite the transcripts for OCT4 and SOX2 were present. Second, an earlier ICM specification of SOX2 and NANOG makes them better candidates of bovine pluripotent lineage specification than OCT4. Third, embryos with low term development potential have higher transcription rates; nevertheless, precarious balance between pluripotency genes is maintained. This balance presages normal in vitro development but, probably higher transcription rate disturbs it at later stage that abrogates term development

Les télomères sont les structures nucléoprotéiques qui constituent l'extrémité des chromosomes eucaryotes. L'ADN télomérique est formé par la répétition de courtes séquences, qui ne sont pas répliquées intégralement. A chaque division cellulaire, la taille des télomères diminue donc, jusqu'à atteindre un seuil critique au-delà de laquelle la cellule ne peut plus se diviser. Dans les cellules germinales ou chez les organismes unicellulaires, la taille des télomères reste constante grâce à la présence d'une enzyme, la télomérase. Il s'agit d'une transcriptase inverse, formée d'une sous-unité portant l'activité catalytique (Est2 chez S. Cerevisiae), et d'un ARN (TLC1 chez S. Cerevisiae) qui sert de matrice pour l'ajout des répétitions. La réactivation de la télomérase dans des cellules somatiques peut conduire à leur transformation cancéreuse, car elles acquièrent la capacité de proliférer indéfiniment. A l'inverse, un déficit de l'expression ou de l'activité de la télomérase peut conduire à une autre maladie, la dyskératose congénitale. La compréhension de la régulation de la télomérase est donc importante, notamment dans la recherche sur ces deux pathologies. Chez Saccharomyces cerevisiae, la régulation négative de la télomérase implique notamment Pif1, une hélicase conservée chez l'Homme. Elle inhibe la télomérase en la dissociant de l'ADN télomérique. Nous avons montré que Pif1 et un sous domaine de la télomérase, le domaine des doigts, appartiennent à une même voie de régulation. En utilisant de la télomérase, qui la rend résistante à Pif1 au télomère, et qui permet de détecter une interaction entre Pif1 et le complexe télomérase, nous avons caractérisé cette voie. Ainsi, nous avons montré, d'une part, que le domaine des doigts de la télomérase est impliqué dans le maintien global de la stabilité du génome. En effet, de même que Pif1, il limite l'ajout de télomères sur des cassures double-brin de l'ADN, favorisant ainsi leur réparation par des voies conventionnelles. D'autre part, nous avons décrit l'interaction existant entre Pif1 et le domaine des doigts. Par microscopie, nous avons identifié un complexe au moins partiellement cytoplasmique. Des analyses biochimiques in vivo nous ont permis de conclure que ce complexe est indépendant de l'ADN. Il n'est perdu que lors de mutations de la sous-unité catalytique de la télomérase. Nous pensons que les protéines Pif1 et Est2 interagissent directement l'une avec l'autre. Ces résultats permettent de mieux comprendre la régulation de la télomérase chez S. Cerevisiae, et mettent au jour une implication directe, jusqu'alors inconnue, de la télomérase dans le maintien de l'intégrité du génome<br>Most of eukaryotic organisms posses telomeres at the extremity of their linear chromosomes. Telomeres are formed by G-rich repetitive sequences, TG1-3 in Saccharomyces cerevisiae, and of associated proteins. At each stage of replication, telomere length decreases. Telomerase is the reverse transcriptase that is involved in the re-synthesis of telomeres. In S. Cerevisiae, the enzyme is composed of the Est2 protein and of the TLC1 RNA. A few years ago, we described the est2-up34 mutation of the finger domain of Est2, which leads to elongated telomeres. This mutation also makes telomerase resistant to Pif1, a negative regulator of telomerase, which dissociates it from telomeric DNA. Here, we studied more precisely the relationship between Pif1 and telomerase, using the est2-up34 mutation as a tool. First, we analyzed the phenotypes of this mutation at a DSB site. We found that est2-up34 cells are deficient in repair, as GCR rate and sensitivity to genotoxic agents were both increased. The mutated telomerase was more recruited to a lesion, and seems to be insensitive to Rad52 competition. Moreover, est2-up34 mutation is epistatic to RAD24 deletion. We propose that the finger domain is involved in the inhibition of telomerase binding to a DSB, which demonstrate an uncharacterized role in the maintenance of genome stability. Second, we focused on the interaction between Pif1 and telomerase. We found that it exists outside of the nucleus, and is DNA independent. However, the complex formed by Pif1 and telomerase is addressed to DNA after DSB induction, which then could be involved in the regulation of telomerase at a break. Using several gene deletions, we faileds to detect any element required for this interaction. In fact, the complex only depends upon the presence of Est2, suggesting a direct interaction between both proteins. We proposed that Pif1 and the finger domain of telomerase interact to maintain genome stability

Un des défis de la biologie de synthèse (BS), est d’apporter des solutions nouvelles à des enjeux globaux majeurs (thérapeutiques/sanitaires, climatiques), en particulier via la construction de souches de production utiles, performantes et respectueuses de l’environnement.Bacillus subtilis (Bsu) est une bactérie Gram+ non pathogène utilisée en biotechnologie comme plateforme de production de molécules d’intérêt. Or, des études récentes ont établi que des souches de Bsu génétiquement modifiées permettaient d’obtenir une plus grande production de protéines recombinantes. Cela suggère que la production de châssis Bsu réduits pourrait être une étape importante dans l’amélioration des souches à visée industrielle.Le projet ANR Bacillus 2.0 dans lequel s’inscrit cette thèse, vise à transposer à Bsu des outils récents du domaine de la BS, et à mettre en place un pipeline efficace pour construire à haut débit des châssis modulables selon l’application biotechnologique. Ce pipeline rassemble les technologies suivantes : (i) design d’un génome synthétique (ii) assemblage de fragments d’ADN chevauchants au sein de la levure Saccharomyces cerevisiae (iii) isolement du génome et transplantation dans une cellule receveuse bactérienne et (iv) sélection et caractérisation des souches mutantes.Les objectifs de cette thèse étaient d’attester la faisabilité de ces méthodes, en tentant de cloner et maintenir le génome réduit de Bsu MPG192 (2,86 Mb) dans la levure, puis de le modifier avec les outils d’ingénierie disponibles chez S. cerevisiae. Dans un premier temps des stratégies déjà décrites dans la littérature ont été déployées afin de cloner le génome entier de Bsu, mais sont restées infructueuses. En nous basant sur une approche de TAR-Cloning, nous avons tenté de cloner plusieurs fragments obtenus par restriction du génome de Bsu. Initialement, seuls cinq fragments sur sept ont été clonés. L’incapacité à cloner le plus grand de ces fragments (1,50 Mpb) est vraisemblablement due à un manque d’ARS et/ou à sa taille. Concernant le second fragment, un ensemble de facteurs peuvent expliquer notre échec : à nouveau le manque d’ARS mais aussi, la présence de nombreux éléments répétés (7 opérons ribosomiques) ou l’expression délétère de ces gènes. Finalement, d’autres expérimentations ont permis de découper le génome en sous-fragments de tailles variables (6kb à 515kb) et ainsi de cloner en 21 morceaux la totalité du génome de Bsu MGP 192. Le TAR-Cloning imposant des contraintes dans le choix des sites de restriction, une nouvelle méthode de clonage, appelée CReasPy-Fusion, a été développée. Elle combine le système d’édition CRISPR-Cas9 et la fusion entre des sphéroplastes de levure et des cellules bactériennes. Comme preuve de concept, nous avons d’abord travaillé avec six espèces de mycoplasmes, et démontré qu’il est possible de cloner et modifier des génomes entiers. Cette approche a ensuite été transposée à Bsu, validant pour la première fois la fusion entre des sphéroplastes de levure et des protoplastes de bactéries Gram+. Elle a permis la capture précise d’un fragment d’environ 150kb.Bien que le génome entier de Bsu n’ait pas été cloné dans la levure à ce jour, plusieurs éléments critiques ont pu être identifiés. Tout d’abord, ces travaux soulignent l’importance de la méthode de clonage à adopter en fonction de l’organisme avec lequel on travaille. Ensuite, ils mettent en exergue l’existence de facteurs biologiques et techniques qui expliquent les difficultés actuelles et qui devront être pris en compte dans la suite des expérimentations. Enfin, ils ont permis le développement d’une nouvelle technique de clonage appelée CReasPy-Fusion, qui vient étoffer le catalogue des méthodes déjà décrites. Par sa versatilité, elle ouvre des perspectives pour la capture de grands fragments de génome, pour l’élimination de loci problématiques, ou encore, en appui à l’assemblage de fragments synthétiques<br>One of the major challenges in the synthetic biology (BS) field, is to provide new solutions to global issues (therapeutic/sanitary or climatic), in particular through the construction of useful, efficient and environmentally friendly production strains.The well-characterized, non-pathogenic, Gram+ bacterium Bacillus subtilis (Bsu), is widely used in industry as a biotechnological workhorse. Recent studies have established that mutant strains with modified genomes are able to produce larger amounts of recombinant proteins. This suggests that the production of rationally designed Bsu chassis could be an important step in the improvement of valuable strains for industrial purposes.This work was performed within the Bacillus 2.0's ANR project, which aims at applying SB tools for Bsu, and at developing an effective pipeline for the high-throughput construction of versatile Bsu chassis strains. Selected SB technologies for the pipeline include (i) the synthetic genome design, (ii) the in-yeast DNA assembly methods using Saccharomyces cerevisiae, (iii) the from-yeast whole genome isolation and transplantation (GT) to a recipient bacteria cell and, (iv) the characterization of recombinant strains.The objectives of this thesis were to ensure the feasibility of these methods using a Gram+ bacterium, by showing, in particular, that it was possible to clone and maintain in S. cerevisiae the genome of a minimal Bsu strain, MPG192 (2.86 Mbp) and to modify it using the large repertoire of yeast genetic tools. Our first attempts to clone the entire Bsu genome into yeast using already described methods failed. Using a TAR-Cloning approach, we then attempted to clone large DNA fragments obtained by restriction of the Bsu genome. In a first experiment, five out of seven fragments were cloned. Difficulties to clone the largest fragment (1.50 Mbp), are presumably related to its size, and/or the lack of ARS elements. Concerning the other fragment, several factors have been proposed to explain the cloning failure: again, an insufficient number of ARS elements, but also, the presence of many repeated sequences (7 ribosomal operons), and/or the deleterious expression of these genes. Finally with other experiments, the whole 2.86 Mb genome was cloned in 21 pieces ranging from 6 kbp to 515 kbp. As TAR-Cloning imposes constraints in the choice of restriction sites, a new cloning method, called CReasPy-Fusion, was developed. This method allows the simultaneous cloning and engineering of mega-sized genome in yeast using the CRISPR-Cas9 system, after direct bacterial cell to yeast spheroplast cell fusion. As a proof of concept, we demonstrated that the method can be used to capture a piece of genome, or to clone and edit the whole genome from six different Mycoplasma species. This method was then adapted to Bsu, showing for the first-time yeast spheroplast and Gram+ protoplast cell fusion. A fragment of ~150 kb has been successfully cloned in yeast.Even if, the entire Bsu genome has not yet been cloned in yeast, several critical elements have been identified. First of all, this work underlines the importance of the cloning method to be adopted depending on the organism of interest. Then, it emphasizes the existence of both biological and technical factors that explain current difficulties and that will have to be taken into account in subsequent experiments. Finally, it enabled the development of the new in-yeast cloning method called CReasPy-Fusion which expands the catalog of technics already described. Through its versatility, it opens up prospects for the capture of large genome fragments, the suppression of problematic loci, and to support the assembly of synthetic fragments

Ce travail presente l'etude du role des proteines redox associees au cytochrome p450, la nadph-cytochrome p450 reductase et le cytochrome b5, ainsi que leur implication dans la reponse induite par l'exposition du champignon filamenteux rhizopus nigricans a la progesterone. Les arnms specifiquement produits en reponse a la progesterone ont ete amplifies par rt-pcr en utilisant des amorces de sequence degeneree. Les primers ont ete definis en comparant les regions tres conservees de liaison au fmn et fad chez les reductases connues. Les adnc correspondant aux regions centrales de deux nouvelles reductases nommees cpr1-cs et cpr2-cs ont ete clones. D'autre part, par clonage fonctionnel dans une souche de levure s. Cerevisiae dont le gene cpr1 est sous le promoteur conditionnel et le gene cyb5 est inactive, nous avons identifie deux adnc, dont l'expression permet d'abolir l'hypersensibilite au ketoconazole d'une telle levure : un adnc long codant pour une reductase (cpr1-fl) qui inclut la sequence cpr1-cs et un adnc codant pour un cytochrome b5 (cyb5-1). L'etude de l'expression par nothern blot montre que deux transcrits de 2,1 kbp (cpr1-fl et cpr2-cs), correspondent aux reductases que nous avons clonees. Seule cpr1-fl est fortement induit (8-fois) lors de la reponse a la progesterone. Par contre l'expression de cpr2-cs et cyb5-1 n'est pas modifiee. La localisation cellulaire et de la fonction du produit de cpr1-fl ont ete etudiees dans une souche de levure dont le gene de la cpr1 endogene a ete prealablement interrompu. Cette analyse conduite en utilisant l'adnc complet cpr1-fl ainsi qu'une version tronquee commencant au premier atg trouve en 5 - (cpr-s) revele que ces deux adnc codent pour des produits fonctionnellement equivalents localises dans le cytosol et les microsomes. L'addition d'un codon atg immediatement en amont du premier atg de l'adnc de cpr1-fl (cpr1-l) accroit la fraction de l'activite presente dans les microsomes : la resistance au ketoconazole est accrue, alors que l'activite nadph-cytochrome c reductase globale se trouve diminuee. L'adnc du cyb5-1 a ete reformate et son produit surexprime et surproduit dans e. Coli. Puis solubilise par des detergents et purifie. Il montre un spectre d'absorption et des proprietes redox typiques du cytochrome b5. De plus il module fortement les activites testosterone hydroxylase and ethoxycoumarin deethylase des p450 3a4 et 2b6 humains de maniere dependante de la nature de la reductase. L'ensemble des donnes montre que trois composants du systeme monooxygenase de rhizopus nigricans ont ete clones et caracterises. Leur implication differente en reponse a la progesterone a ete demontre.

La recherche de mécanismes de réparation actifs sur le génome mitochondrial de la levure S. Cerevisiae a été menée en examinant les effets de différents facteurs physiologiques et génétiques, interférant avec la réparation nucléaire, sur l’induction de mutants mitochondriaux de type rho- par les radiations UV (254 nm) ou ionisantes (rayons Ɣ). Une période d’incubation des cellules en milieu non nutritif, séparant l’irradiation UV et leur transfert en milieu nutritif, favorise la réparation nucléaire et permet de moduler l’induction de mutants rho-. Des arguments en faveur de l’existence de mécanismes capables de restaurant l’intégrité du génome mitochondrial dans les cellules irradiées en phase exponentielle de croissance et traitées dans ces conditions, sont présentés. L’efficacité de ces mécanismes dépend de la synthèse de novo de protéines d’origine nucléaire et mitochondriale et de celle d’ADN mitochondrial durant l’incubation en milieu non nutritif. La comparaison de la perte de marqueurs mitochondriaux dans les mutants rho- par les radiations dans des souches différant au niveau de gènes contrôlant différents systèmes de réparation nucléaire a montré l’existence de déterminants génétiques communs à la réparation nucléaire et au maintien de l’intégrité du génome mitochondrial. Les voies de réparations nucléaires et mitochondriales ne sont cependant pas identiques et leur régulation est au moins en partie différente<br>Repair mechanisms acting on the mitochondrial genome of yeast have been looked for, by studying the effects of different physiological and genetic factors, known to interfere with nuclear repair, on the induction of mitochondrial rho- mutants by UV (254nm) or ionizing (Ɣ-rays) radiations. Liquid holding cells in non-nutrient medium after UV-irradiation, before plating on nutrient medium, favours nuclear repair and modulates rho- mutant induction. Data are presented, supporting the hypothesis that mechanisms act in UV-irradiated liquid held cells, when treated in exponential phase of growth, to restore the integrity of the mitochondrial genome. Their efficiency is dependent upon de novo nuclear-directed and mitochondrial protein synthesis and upon mitochondrial DNA synthesis during the liquid holding period. The comparison between the patterns of loss of mitochondrial genetic markers among spontaneous and induced rho- mutants let us to postulate a common mechanism generating these mutants. The comparison between rho- mutant induction by UV-or Ɣ-ray irradiation among strains differing at the level of genes controlling different nuclear repair systems demonstrated that nuclear genetic determinants are involved in both nuclear repair and maintenance of intact mitochondrial genomes. Nevertheless, the pathways of nuclear and mitochondrial repair are not identical and their regulation is at least partially different

La floculation chez saccharomyces cerevisiae est un mecanisme qui entraine la formation d'agregats cellulaires ayant tendance a sedimenter. En vue de l'introduction du caractere floculant dans des souches nologiques, le gene de floculation fl05 a ete clone a partir d'une banque de genes d'une levure floculante de type fl05. La caracterisation du gene fl05 a montre que les genes fl01 et fl05 etaient structuralement proches voire identiques et que des homologies existaient aussi avec fl08. La disruption du gene fl05 a revele la presence d'un second gene de floculation, fl05b, dans la souche d'origine du gene fl05 presentant une homologie faible ou nulle avec le gene fl05. L'etude concernant l'expression du gene fl05 a montre l'existence de phenomenes de repression dans certaines souches de levures, l'action se situant probablement au niveau transcriptionnel. Le gene fl05 a ete sequence et presente une phase ouverte de lecture de 1554 aa. La proteine fl05 est riche en serine et en threonine et presente de nombreuses sequences repetees. Les caracteristiques deduites de la sequence proteique suggerent que le produit du gene fl05 est une proteine de structure secretee a la surface certainement directement impliquee dans l'interaction cellulaire. Le gene fl05 a ete transfere dans des souches nologiques et son introduction provoque une floculation intense. Des tests technologiques ont montre que la floculation entrainait une legere reduction des vitesses de fermentations probablement par limitation des vitesses de transfert du substrat

En autorisant la separation de molecules d'adn superieures a 50 kb, les electrophoreses en champs pulses ont ouvert une nouvelle voie en biologie moleculaire. Ces methodes ont ete utilisees pour la separation d'adn de truite et de pleurodele afin de purifier plusieurs genes hormono-dependants. A la suite de ces etudes, un systeme original d'electrophorese bi-dimensionnelle en champs pulses a ete developpe. D'autre part, ces techniques ont egalement servi a la caracterisation de recombinants obtenus apres construction de deux banques genomiques par le biais de chromosomes artificiels de levure

Une analyse de genetique des populations menee sur 78 stocks de trypanosoma brucei s. L. Provenant de toute la zone de distribution du parasite, et basee sur l'utilisation de 18 loci isoenzymatiques variables, nous permet de presenter les conclusions suivantes: les populations naturelles de t. Brucei presentent une structure quasi-clonale. Les variants genetiques individualises sont assimilables a des clones naturels, ou a des familles de clones etroitement apparentes, stables dans l'espace et dans le temps. Ces clones naturels sont a considerer comme des unites taxonomiques (agamospecies) dans toute etude appliquee. Il n'est pas possible, en l'etat actuel de la genetique des populations des microorganismes, d'evaluer l'impact d'eventuels processus de recombinaison occasionnels sur le dernier des clones a l'echelle evolutive. De meme, on ne peut dire si la variabilite genotypique superieure observee dans le reservoir sauvage du parasite, par rapport aux cycles domestiques, est imputable a des phenomenes de recombinaison plus frequents, ou a une variabilite clonale plus forte. Il nous a ete possible d'individualiser un groupe de genotypes qui renferme la majeure partie des isolats humains d'afrique centrale et occidentale, et d'elaborer une sonde d'adn kinetoplastique specifique de ce groupe par la technique dite pcr. Ce groupe correspond a la sous-espece traditionnelle trypanosoma brucei gambiense. Notre sonde, qui confirme l'hypothese clonale, constitue un outil epidemiologique prometteur pour l'identification des parasites de ce groupe. Les autres sous-especes sont plutot a considerer comme des nosodemes que comme des phylums distincts

Le positionnement des nucléosomes le long des génomes eucaryotes est crucial étant donné qu’il affecte l’accessibilité de l’ADN à des protéines impliquées dans la transcription, la réplication, ou encore la réparation de l’ADN. Si il est aujourd’hui admis que les remodeleurs de chromatine ainsi que les préférences des nucléosomes pour certains motifs d’ADN constituent les deux principaux déterminants du positionnement des nucléosomes in vivo, leur importance relative fait encore l’objet de controverses. Dans le cadre de cette problématique nous avons développé une stratégie d’assemblage de répétitions de la séquence 601 positionnante de nucléosome directement dans le génome de Saccharomyces cerevisiae. Cette technique assistée par la technologie CRISPR/Cas9 et des oligonucléotides chevauchants s’est révélée très efficace et a permis d’assembler des répétitions sur une étendue d’environ 15 kilobases. Nous avons ainsi pu isoler trois souches se caractérisant par trois longueurs d’ADN de liaison de respectivement 20, 50 et 90 paires de bases séparant deux 601 consécutifs tout le long des répétitions. Ces longueurs d’ADN de liaison ont été choisies du fait de leur compatibilité avec les modèles de la fibre de 30 nm étudiés in vitro et parce qu’elles sont fréquemment observées chez les eucaryotes. Nous avons ensuite regardé si ces répétitions de la séquence 601 suffisent à dicter la succession des nucléosomes de S. cerevisiae selon le pas de chromatine attendu. Pour cela, nous avons eu recours à une approche de MNase-seq afin d’analyser les positions des dyades des nucléosomes dans les répétitions. Les résultats de ces analyses révèlent de façon intéressante l’incapacité de la séquence 601 à positionner le nucléosome dans ce contexte cellulaire et cela malgré l’étendue de la région de 601 répétés constituée. Nous avons également analysé le positionnement des nucléosomes chez ces trois mêmes souches suite à l’inactivation de Chd1, l’un des deux principaux architectes du paysage nucléosomal chez la levure, afin de s’affranchir de son potentiel effet sur le positionnement des nucléosomes dans la région 601. Nos résultats montrent que l’absence de Chd1 ne permet pas de rétablir un positionnement des nucléosomes sur les monomères de 601, suggérant que le 601 n’est pas positionnant in vivo ou que la région répétée est sous l’influence d’autres facteurs de remodelage. D’un point de vue méthodologique, notre technique de construction de répétitions in vivo permet d’envisager des approches simplifiées de biologie synthétique pour la construction de librairies de répétitions dans le génome de S. cerevisiae<br>Nucleosome positioning along eukaryotic genomes is crucial as it influences DNA accessibility for DNA binding proteins involved in DNA replication, transcription and repair. It is now accepted that both nucleosome preferences for some DNA sequences and remodeling factors play an important role in nucleosome positioning in vivo. However their relative importance remains a matter of debate. To investigate the role played by DNA sequence in nucleosome positioning in a cellular context we developped a strategy to assemble tandem DNA repeats of a nucleosome positioning sequence directly into Saccharomyces cerevisiae’s genome. This method is assisted by CRISPR/Cas9 and overlapping oligonucleotides and it turned out to be very efficient as it allowed to synthetize about 15 kilobases of tandem DNA repeats inside a yeast chromosome. Using this apporoach we obtained three yeast strains differing by the DNA linker length separating two consecutive monomeres of the 601 nucleosome positioning sequence. We chose three lengths of linker (20, 50 and 90 pb) for two reasons. First, they are compatible with the formation of a 30 nm chromatin fiber in vitro, and second, nucleosome repeat length of 167, 197 and 237 pb are found in eukaryotic genomes. We then verified if nucleosomes are effectively positioned according to the theoretic DNA linker lengths we designed in the “601” repeated region. To that goal we performed MNase-seq analysis to deduce nucleosomes dyads positions in the repeats. Interestingly our results show that the 601 sequence is not able to dictate strong nucleosomes positioning differing from the natural nucleosome repeat length of about 165 pb along the repeats in an in vivo context. We further investigated positions of dyads in the same three strains after inactivating the gene coding for the chromatin remodeler Chd1, which could potentially be responsible of the nucleosomes organization in the repeated area. Our results show no effect of Chd1, indicating that the “601” sequence has no positionning effect in vivo or that other trans-acting factors are implicated in nucleosome positioning in the engineered repeats. Finally, this work provides a new fast and simple approach for synthetic DNA repeats construction inside the yeast genome and could easily be applied for other synthetic chromatin engineering approaches

L'etude de la parasitofaune des poissons marins mediterraneens des cotes francaises du languedoc-roussillon et de la baie de kotor (adriatique) en yougoslavie, a revele la presence de 45 especes de myxosporidies, dont huit nouvelles pour la science. Plusieurs aspects de la biologie de ces parasites sont abordes. L'impact de ces parasites en aquaculture a ete etudie a travers le modele thelohanellus nikolskii responsable d'epizooties dans les elevages de carpes d'europe centrale et d'asie. La pathologie liee a cette espece, ainsi que les stades initiaux de la sporogenese ont ete precises. Les affinites des myxosporidies avec le parasite pkx et les marteilia nous a amene a etudier egalement le cas de ces deux autres parasitoses: l'hepatonephrite parasitaire des salmonides (pkd), ainsi que la marteiliose de l'huitre plate ostrea edulis. Les premieres approches moleculaires de ces organismes ont permis la construction d'une banque genomique de m. Refringens et la caracterisation d'une premiere sonde nucleique specifique. L'etude preliminaire de celle-ci a ete realisee, et son utilisation comme outil epidemiologique et de diagnostic, est abordee