Dissertations / Theses: 'Checkpoint immunitaire'

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Soussan, Sarah. "B lymphocytes and autoantibodies in immune-related adverse events following immune checkpoint inhibitors in cancer patients." Electronic Thesis or Diss., Sorbonne université, 2024. https://accesdistant.sorbonne-universite.fr/login?url=https://theses-intra.sorbonne-universite.fr/2024SORUS022.pdf.

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Abstract:

Les anticorps monoclonaux thérapeutiques ciblant les inhibiteurs de checkpoints immunitaires, tels que PD-1 et CTLA-4, ont pour objectif d'induire la réactivation de l'immunité anti-tumorale. Cependant, une limite à l'utilisation de ces immunothérapies anti-cancéreuses est l'émergence de toxicités auto-immunes ou irAEs (« immune-related adverse events »). La survenue d'effets secondaires spécifiquement associés à ce type de traitement est observée chez 30 à 90% des patients. De plus, les toxicités peuvent nécessiter une réduction ou un arrêt de l'immunothérapie. Des premières études ont démontré une importante implication des lymphocytes T, ciblés par les immunothérapies, dans l'émergence d'effets secondaires. Cependant, une contribution importante des lymphocytes B dans les réponses anti-tumorales suggèrent également un rôle de l'immunité humorale dans ces toxicités. Une étude phénotypique et fonctionnelle des lymphocytes B périphériques et des autoanticorps circulants a donc été conduite sur deux cohortes de patients atteints de cancer solide, traités par immunothérapie et développant ou non des toxicités. La caractérisation des lymphocytes B périphériques au cours du traitement a été réalisé par cytométrie spectrale. De plus, un protocole de culture de lymphocytes B triés nous a permis d'étudier leur capacité de production d'anticorps et leur association avec l'émergence de toxicités. Des approches complémentaires ont été réalisées afin d'évaluer l'auto-réactivité sérique et plasmatique des patients au cours de l'immunothérapie, notamment chez des patients développant des effets secondaires cardiaque et/ou musculaire. L'étude des fonctions pathogéniques des auto-anticorps issus de patients et présentant des réactivités contre des antigènes cardiaques a été réalisée sur des lignées de cardiomyocytes et dans un modèle de sphéroïdes cardiaques. Chez les patients atteints de mélanome et développant des toxicités, une faible expression de molécules inhibitrices (FcγRIIB, CD85j et LAIR-1) à la surface des lymphocytes B périphériques a été observé. Par ailleurs, les lymphocytes B issus de patients atteints de cancer du poumon et développant des toxicités présentent une forte expression du marqueur d'activation CD95 et de re-circulation CXCR5. D'autre part, un enrichissement en populations de lymphocytes B hautement différenciées et activées a été identifié avant l'initiation du traitement chez les patients ayant développé des toxicités. De plus, nous avons identifié chez des patients présentant des toxicités des titres élevés d'auto-anticorps. Ces auto-anticorps peuvent être dirigés contre des autoantigènes cardiaques et musculaires chez des patients atteints de myocardites et/ou myosites. Pour finir, des résultats préliminaires ont permis d'identifier une fixation des auto-anticorps réactifs contre des antigènes cardiaques sur des lignées de cardiomyocytes. Le traitement de sphéroïdes cardiaques avec ces auto-anticorps peut induire une altération de leur contractilité et de la cinétique calcique associée. Nous avons donc mis en évidence une forte activation des lymphocytes B périphériques, associée à une production d'auto-anticorps, chez des patients ayant développé des effets secondaires. Ces résultats soutiennent un rôle potentiel de l'immunité humorale dans les mécanismes sous-jacents à l'émergence d'effets secondaires faisant suite aux immunothérapies anti-checkpoints immunitaires
Immune checkpoints inhibitors (ICI) have revolutionized the treatment of previously incurable malignancies. Unfortunately, the use of ICI also induces a bystander breakdown of peripheral tolerance leading to immune related Adverse Events (irAEs) in 30-90% of treated patients, drastically reducing quality of life and requiring therapy dose reduction or discontinuation. As ICI directly target T cells, they have been considered the main culprit for irAEs. Nevertheless, T cells cannot fully explain adverse events, and the role of B cells and their associated mechanisms have not been characterized. We therefore studied the involvement of peripheral B-cell compartment in irAEs, using both phenotypic and functional approaches, in two cohorts of solid cancer patients treated with anti-PD-1 and/or anti-CTLA-4 monoclonal antibodies. Deep phenotyping of B-cell subsets throughout the treatment and at the onset of irAEs has been performed by multi-parametric spectral flow cytometry. Subsequently, to analyze the functions of B-cell subsets, notably their ability to produce antibodies, we set-up a B-cell culture system allowing in vitro differentiation of B cells into antibody-secreting cells. This gave us the opportunity to analyze the antibody production by circulating B cells and their association with irAEs occurence. The screening of circulating B cells phenotype and function was conducted alongside the evaluation of the serum and plasma reactivity of cancer patients by complementary approaches (ELISA, Western Blot, Immunofluorescence assays). We found that, before treatment, patients that develop ICI-induced irAEs exhibit a significantly lower expression on B cell subsets of the FcγRIIB, CD85j and LAIR-1 inhibitory receptors in melanoma patients and higher expression of the CD95 and CXCR5, respectively activating and lymphoid organs re-circulatory markers in lung cancer patients. In addition, increased in baseline abundance of hyper-activated IgD- memory B cell subset or plasmablasts precursor were observed in patients that will undergo irAEs. Moreover, a part of irAEs patients exhibit baseline or ICI-induce circulating autoantibodies which could be directed against the related tissue of irAEs occurrence. Indeed, patients experiencing cardiac/muscular irAEs demonstrated autoantibodies directed against cardiac tissues and well-defined cardiac/muscle antigens. Finally, IgG derived from cardiac/muscular irAEs patients bound to human cardiomyocytes and perturbed the calcium kinetic and the contractibility of cardiac spheroids. These findings highlight a predisposition of irAEs incidence in patients with baseline highly activated and differentiated circulating B cells associated with autoantibody production. Overall, these results support the potential role of the humoral adaptative immunity in the mechanisms of ICI-induced irAEs

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Dal, Cin Julian. "Analyse tissulaire des myopathies inflammatoires idiopathiques et induites par immune-checkpoint-inhibitor : apport des nouvelles approches transcriptomiques." Electronic Thesis or Diss., Sorbonne université, 2023. https://accesdistant.sorbonne-universite.fr/login?url=https://theses-intra.sorbonne-universite.fr/2023SORUS151.pdf.

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Abstract:

Les myosites forment un groupe hétérogène de pathologies auto-immunes partageant une atteinte musculaire des patients. Les myosites sont séparées en 5 sous-entités : les dermatomyosites (DM), les syndromes des anti-synthétases (ASyS), les myosites à inclusions (IBM), les myopathies nécrosantes auto-immunes (IMNM) et les myosites induites par inhibiteur de point de contrôle immunitaire (ICI). Les mécanismes physiopathologiques, le phénotype clinique et le pronostic de chaque sous-entité sont différents. Parmi les myosites, ce travail s’est concentré sur les IMNM et les myosites induites par ICI, leur pronostic étant le plus sombre. Des études transcriptomiques à haute résolution, spatiale ainsi qu’en cellule unique ont permis d’étudier le tissu musculaire des patients atteints de ces myosites. Dans les myosites induites par ICI, ces études ont confirmé la cytotoxicité de lymphocytes T CD8 et leur rôle central, principalement celui des populations de lymphocytes T résidents mémoires identifiés dans le muscle ainsi que des macrophages. Nous proposons un modèle pathogénique basé sur la réaction de lymphocytes T résidents mémoires aux traitements ICI. Dans les IMNM, des sous-groupes de macrophages ont été identifiés composés respectivement des macrophages pro-inflammatoires, anti-inflammatoires et de macrophages accompagnés de progéniteurs fibro-adipeux (FAP). Nous proposons que la nécrose stimulerait les macrophages et induirait leur recrutement ce qui permettrait la prolifération des FAP à l’origine de la fibrose exacerbée des patients. La compréhension de ces mécanismes parmi d’autres permet d’envisager de nouvelles cibles thérapeutiques et d’améliorer le pronostic des patients
Myositis are a heterogeneous group of autoimmune pathologies characterized by muscle damage in patients. Myositis are separated into 5 subgroups: dermatomyositis (DM), anti-synthetase syndromes (ASyS), inclusion body myositis (IBM), autoimmune necrotizing myopathies (IMNM) and immune-checkpoint inhibitor (ICI)-induced myositis. The pathophysiological mechanisms, clinical phenotype and prognosis of each subgroup are different. Among myositis, this work focused on IMNM and ICI-induced myositis, which have the poorest prognosis. High-resolution, spatial and single-cell transcriptomic studies have made it possible to study the muscle tissue of patients with these myositis. In ICI-induced myositis, these studies have confirmed the cytotoxicity of CD8 T cells and their central role, mainly of a population of resident memory T cells identified in the muscle, as well as macrophages. We propose a pathogenic model based on the reaction of resident memory T cells to ICI treatments. In IMNM, subgroups of macrophages have been identified composed respectively of pro-inflammatory macrophages, anti-inflammatory macrophages, and macrophages close to fibro-adipogenic progenitors (FAP). We propose that necrosis can stimulate macrophages and induce their recruitment, which would allow the proliferation of FAPs at the origin of exacerbated fibrosis in patients. Understanding mechanisms among others makes it possible to consider new therapeutic targets and improve patient prognosis

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Tannous, Désirée. "The combination of Gadolinium-based nanoparticles, radiotherapy and immune checkpoint inhibitors : a novel therapeutic opportunity for cancer treatment." Thesis, université Paris-Saclay, 2022. http://www.theses.fr/2022UPASL082.

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Abstract:

Les découvertes scientifiques liées à la radiothérapie sont en progression continue et près de 60 % des patients diagnostiqués d'un cancer sont traités par radiothérapie. Cependant, ce traitement fait face à de nombreuses limitations dues à la radiorésistance et aux effets secondaires infligés sur les tissus sains. Pour surmonter ces problèmes, un intérêt particulier a été suscité sur le rôle que pourrait jouer la nanomédecine dans l'amélioration de la réponse anti-tumorale médiée par le système immunitaire. Dans ce contexte, nous avons décidé d'évaluer la capacité de la combinaison de nanoparticules de Gadolinium (AGuIX) avec les rayonnements ionisants (RI) à stimuler une réponse immunologique anti-tumorale et à augmenter l'efficacité de la radiothérapie associée à des inhibiteurs de points de contrôle immunitaires. AGuIX sont de très petites nanoparticules composées d'une matrice de polysiloxane et de chélates de gadolinium. Grâce aux propriétés magnétiques du Gadolinium, ces nanoparticules jouent le rôle d'agent de contraste, en plus de ses propriétés radiosensibilisantes, permettant ainsi un meilleur ciblage et un index thérapeutique renforcé.Nos travaux révèlent la capacité de AGuIX + RI à induire une instabilité génomique et à stimuler les voies de signalisation cellulaire immunomodulatrices. En parallèle, nous démontrons le potentiel anti-tumoral de la combinaison d'AGuIX + RI en évaluant la croissance tumorale et la survie globale à l'aide d'un modèle préclinique de souris immunocompétentes porteuses de tumeurs. Nos résultats suggèrent un effet synergique de la combinaison d'AGuIX + RI sur la croissance tumorale en stimulant le système immunitaire. Enfin, nous révélons la capacité de la combinaison d'AGuIX + RI à surmonter la résistance aux inhibiteurs de points de contrôle immunitaires. En conclusion, nos travaux montrent que la combinaison d'AGuIX + RI stimule des voies de signalisation immunomodulatrices, induit une forte réponse anti-tumorale synergique et permet de surmonter la résistance aux immunothérapies
Scientific discoveries linked to radiotherapy are in continuous progress and almost 60% of cancer diagnosed patients are treated with radiotherapy. However, radiation therapy still faces many limitations due to radioresistance and the side effects inflected on healthy tissues. To overcome these factors, a particular interest has been aroused on the role that nanomedicine could play in the improvement of immune-mediated anti-tumor response. In this context, we decided to assess the ability of the combination of Gadolinium nanoparticles (AGuIX) with ionizing radiation (IR) to stimulate an anti-tumor immunological response and to increase the effectiveness of radiotherapy combined to immune checkpoint blockers.AGuIX are very small nanoparticles composed of a polysiloxane matrix and gadolinium chelates. Thanks to the magnetic properties of gadolinium, these nanoparticles play the role of a contrast agent, in addition to its radiosensitizing properties, thus allowing a better targeting and an enhanced therapeutic index.Our work reveals the ability of the AGuIX+IR combination to induce genomic instability and to stimulate immunomodulatory cell signaling pathways in treated human and murine cancer cells. In parallel, we demonstrate the anti-tumor activity of this combination by assessing tumor growth and overall survival using a preclinical model of immunocompetent mice bearing tumors. Our results strongly demonstrate a synergistic effect of AGuIX + IR combination on tumor growth and overall survival by stimulating the immune system. Finally, we reveal the capacity of AGuIX + IR combination to overcome immune checkpoint blockers resistance.In conclusion, our work shows that the combination of AGuIX+IR stimulates immunomodulatory signaling pathways, induces a strong synergistic anti-tumor response and helps overcoming resistance to immunotherapies

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Nougue, Manon. "Rôle immunomodulateur du système lymphatique lors du développement tumoral mammaire." Electronic Thesis or Diss., Toulouse 3, 2023. http://www.theses.fr/2023TOU30261.

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Abstract:

Le système lymphatique est un réseau vasculaire unidirectionnel transportant la lymphe qui permet le drainage des fluides interstitiels, le transport des lipides intestinaux, ainsi que la surveillance et la tolérance immunitaire. Néanmoins, le système lymphatique est impliqué dans de nombreuses pathologies et particulièrement dans la progression tumorale. En effet, le système lymphatique favorise la dissémination des métastases qui sont acheminées par les vaisseaux lymphatiques jusqu'aux organes distants. Plus récemment, le système lymphatique a été identifié comme un régulateur clé des réponses immunitaires lors du développement tumoral. Le système immunitaire est indispensable à la détection des tumeurs et à l'établissement de réponses lymphocytaires anti-tumorales. Cependant, lors des stades de développement tumoral avancés, des mécanismes d'échappement immunitaire se mettent en place en faveur de la croissance des tumeurs. Ces mécanismes sont notamment médiés par les tumeurs elles-mêmes mais aussi par différents acteurs de l'environnement tumoral. Le système lymphatique est un de ces acteurs, particulièrement retrouvé dans l'environnement tumoral mammaire. Les adénocarcinomes mammaires à des stades avancés répondent aux immunothérapies qui ciblent les points de contrôle immunitaire responsables de l'échappement immunitaire. En effet, le système lymphatique potentialise la réponse des tumeurs à ces immunothérapies car il joue un rôle double dans l'immunomodulation en contexte tumoral. Les vaisseaux lymphatiques sont capables de recruter les lymphocytes T dans la tumeur pour stimuler la surveillance immune anti-tumorale mais sont aussi capables d'engendrer des mécanismes immunosuppresseurs des lymphocytes T par l'expression de points de contrôle immunitaire. Durant de ma thèse, j'ai donc étudié les mécanismes immunomodulateurs du système lymphatique lors du développement des tumeurs mammaires. J'ai observé que le système lymphatique contrôle le passage de la surveillance immune vers l'immunosuppression, particulièrement induite par les ligands du point de contrôle immunitaire TIGIT. J'ai ainsi montré que l'activation des vaisseaux lymphatiques tumoraux entraine la surexpression du ligand Nectine-2 qui va inhiber les lymphocytes T surexprimant TIGIT. Cela va alors réduire la réponse des lymphocytes T CD8+ cytotoxiques afin de favoriser la croissance tumorale
The lymphatic system is a unidirectional vascular network transporting lymph, enabling drainage of interstitial fluids, transport of intestinal lipids, and also immune monitoring and tolerance. Nevertheless, the lymphatic system is involved in many pathologies, and particularly in tumor progression. Indeed, the lymphatic system promotes the metastatic spread, carried by lymphatic vessels to distant organs. More recently, the lymphatic system has been identified as a key regulator of immune responses during tumor development. The immune system is essential for tumor detection and establishment of anti-tumor lymphocyte responses. However, at advanced stages of tumor development, immune escape mechanisms are established in favor of tumor growth. These mechanisms are mediated not only by tumors themselves, but also by various players in the tumor environment. The lymphatic system is one of these players, particularly found in breast tumor environment. Advanced-stage breast adenocarcinomas respond to immunotherapies that target immune checkpoints responsible for immune escape. Indeed, the lymphatic system potentiates tumor response to these immunotherapies, playing a dual role in immunomodulation in the tumor context. Lymphatic vessels are able to recruit T cells to the tumor site to stimulate anti-tumor immune surveillance, but are also able to generate T cell immunosuppressive mechanisms through the expression of immune checkpoints. During my thesis, I therefore studied immunomodulatory mechanisms of the lymphatic system during mammary tumor development. I observed that the lymphatic system controls a switch from immune surveillance to immunosuppression, particularly induced by ligands of TIGIT immune checkpoint. I have shown that activation of tumor lymphatic vessels leads to overexpression of Nectin-2, which inhibits T cells overexpressing TIGIT. This in turn reduces cytotoxic CD8+ T cell responses to promote tumor growth

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Miloro, Giorgia. "Déterminer le rôle du récepteur de mort Fas/CD95 dans la co-stimulation des cellules T." Thesis, Université Côte d'Azur, 2020. https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-03179255.

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Abstract:

Fas (CD95 / TNFRSF6), un récepteur transmembranaire de type I de la superfamille des récepteurs au TNF (TNFR), est un activateur de mort cellulaire bien connu. Cependant, il a également été impliqué dans des fonctions de non-mort cellulaires, telles que la survie, la différenciation et la migration. Alors que la cascade moléculaire qui initie l'apoptose lors de l'engagement de Fas avec son ligand FasL est particulièrement bien décrite, les informations concernant les mécanismes moléculaires sous-tendants les voies non apoptotiques médiées par Fas sont rares.Comme indiqué par les manifestations d’auto-immunité et de lymphoprolifération chez les patients ALPS porteurs de mutations dans le récepteur ou dans son ligand, le système Fas / FasL joue un rôle majeur dans l'homéostasie des lymphocytes T et dans le contrôle de l'auto-immunité et du cancer. D'un côté, la mort médiée par Fas a été décrite comme critique pour (i) la suppression des lymphocytes autoréactifs, et donc dans le maintien de la tolérance périphérique; (ii) le contrôle du nombre de lymphocytes activés par des antigènes faibles lors d'infections par des pathogènes.De l'autre côté, certaines fonctions de non mort de Fas ont été décrites dans les cellules T, parmi lesquelles le rôle de Fas comme récepteur co-régulateur de l’activation du TCR. Malgré l'importance potentielle de ce rôle dans les stratégies immunothérapeutiques, seules quelques études controversées liées à cette implication ont été réalisées. En effet, alors que plusieurs études ont décrit Fas comme un récepteur costimulateur du TCR, d'autres ont défini une inhibition de l'activation des lymphocytes T lors d’une stimulation concomitante de Fas et du TCR. Dans ce contexte, l'objectif de mon projet de thèse consistait à disséquer moléculairement la co-signalisation Fas-TCR.En utilisant à la fois des cellules T primaires et des lignées cellulaires portant un TCR transgéniquespécifique, nous avons pu définir Fas comme un récepteur co-stimulateur. En exploitant les approches biochimiques ainsi que la cytométrie en flux et la microscopie, nous avons déchiffré la co-stimulation Fas-TCR à la fois au niveau fonctionnel et moléculaire. Premièrement, nous avons montré que la co-stimulation Fas-TCR se produit à la fois dans les cellules T naïves et les cellules T mémoire ainsi que dans les souspopulations CD4 + et CD8 +. Moléculairement, nous avons décrit que Fas renforce la signalisation TCR dès les étapes précoces, puisque la phosphorylation des premières protéines impliquées dans l'activation du TCR est augmentée. En outre, les formes membranaires et solubles de FasL sont capables d'initier le signal co-stimulateur de Fas. Enfin, nous avons pu exclure l'implication de FADD et Caspase-8, premiers acteurs de la signalisation Fas, dans la co-activation, et , de manière importante, l'implication du domaine de mort de Fas, suggérant le rôle d'un autre domaine de Fas . Décrire les mécanismes moléculaires et le contexte dans lequel la co-stimulation Fas-TCR se produit pourrait être d'une importance cruciale dans la compréhension de la physiopathologie de Fas dans les cellules T, mais également pour l’établissement de futures stratégies immunothérapeutiques
Fas (CD95/TNFRSF6), a type-I transmembrane receptor of the tumor necrosis factor receptor (TNFR) superfamily, is a well-known cell death activator. However, it has been also implicated in non-cell death processes including cell survival, differentiation, migration. Whereas the molecular cascade that initiates apoptosis upon Fas engagement with its ligand FasL is particularly well described, the informations concerning the molecular mechanisms underlying the Fas mediated non-apoptotic pathways are sparse.As indicated by the induction of autoimmunity and lymphoproliferation in ALPS patients harboringmutations in either the receptor or its ligand, the Fas/FasL system plays a major role in T cell immune homeostasis and thus, in the control of autoimmunity and cancer. On one side, the Fas mediated death has been described critical for (i) the deletion of autoreactive lymphocytes, and thus in the maintenance of peripheral tolerance; (ii) the control of the number of lymphocytes activated by weak antigens during pathogen infections.On the other side, and beyond cell death induction, some Fas non-death pathways have been described in T cells, among which the role of Fas as co-regulatory receptor for the TCR during its activation. Despite the potential importance of this role in immunotherapeutic strategies, only few and controversial studies related to this involvement were done. Indeed, whereas several studies have described Fas as a TCR co-stimulatory receptor, others defined an inhibition of T cell activation by Fas-TCR concomitant stimulation. In this context, the aim of my PhD project consisted into molecularly dissect the Fas-TCR co-signaling.By using both primary T cells and cell lines bearing a specific transgenic TCR, we could define Fas as a costimulatory receptor. By exploiting biochemical approaches as well as flow cytometry and microscopy we could decipher the Fas-TCR crosstalk both at functional and molecular level. First, we show that Fas-TCR costimulation occurs in both naïve and in memory T cells as well as in both CD4+ and CD8+ T cell subpopulations.Molecularly, we could describe that Fas enhances the TCR signaling at membrane proximal level, since the phosphorylation of the first proteins involved in TCR activation is increased. Furthermore, both membrane-bound and soluble FasL are capable to initiate Fas co-stimulatory signal. Lastly, we could exclude the involvement of FADD and Caspase-8, first actors of Fas signaling, in the co-activation, and even more importantly, the involvement of the death domain of Fas cytoplasmic tail, unveiling the implication of another Fas receptor domain. To describe the molecular mechanisms and the context where Fas-TCR co-stimulation occurs might be of an outstanding importance in the comprehension of Fas physiopathology in T cells and for future studies that might involve its potential for immunotherapeutic strategies

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Dupaty, Léa. "Evaluation in vivo de protéines immunorégulatrices dérivées de CTLA-4 et de PD-L1 pour leur capacité à inhiber les réponses immunitaires dans le contexte de la thérapie génique musculaire par AAV." Thesis, Normandie, 2018. http://www.theses.fr/2018NORMR133/document.

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Abstract:

La thérapie génique consiste à introduire du matériel génétique dans des cellules dans l’objectif de traiter une pathologie. Le plus souvent, la thérapie génique s’effectue au moyen d’un vecteur viral, transportant le gène jusque dans les cellules cibles. Dans le cas des maladies monogéniques, l’adeno-associated virus (AAV) s’est imposé progressivement comme un vecteur de choix. Son absence de pathogénicité, son large tropisme et sa capacité à transduire des cellules quiescentes sont autant d’avantages comparés à d’autres vecteurs utilisés en thérapie génique. L’utilisation d’AAV est approuvé en Europe pour le traitement d’un déficit rare en lipoprotéine lipase et vient récemment d’être approuvé par les autorités américaines pour le traitement d’un déficit de la vision. Toutefois, les essais de thérapies géniques se heurtent souvent aux réponses immunitaires dirigées contre l’AAV. En effet, les différents composants de ce vecteur viral ont été identifiés comme pouvant déclencher des réponses immunitaires s’opposant à l’efficacité à long terme de la thérapie génique. De plus, la protéine transgénique peut s’avérer immunogène, ce qui conduit au déclenchement de réponses immunitaires, à la destruction des cellules transduites et in fine à l’échec de la thérapie génique. En clinique, des immunosuppresseurs sont utilisés pour palier à ses effets indésirables. Toutefois, de par leurs effets secondaires infectieux et tumorigènes, des stratégies visant plutôt à induire de la tolérance vis-à-vis de la protéine transgénique, associées à un bénéfice pour la santé des patients, se sont développées.L’objectif de ce travail de thèse a été d’implémenter une nouvelle stratégie visant à étudier l’effet immunorégulateur et tolérogène de protéines de fusion dérivées de CTLA-4/Fc et de PD-L1/Fc. Pour cela, nous avons utilisé un modèle murin récapitulant les réponses immunitaires induites par un AAV permettant l’expression d’une protéine modèle fortement immunogène, l’ovalbumine (Ova). Ensuite, des AAV codant pour les protéines au potentiel immunorégulateur ont été synthétisés et injectés aux souris conjointement à l’AAV-Ova. Cette stratégie d’immunorégulation vectorisée (VIR) nous a permis d’évaluer la capacité de chacune des protéines à moduler les réponses immunitaires dirigées contre l’Ova directement in vivo. Au total, ce travail a permis de mettre en évidence i) l’intérêt et les limites de la stratégie VIR, ii) celui du rôle délétère de CTLA-4/Fc au long terme sur les lymphocytes Tregs CD4+FoxP3+, périphériques et centraux, iii) et de démontrer l’intérêt de 2 nouvelles molécules dérivées PD-L1/Fc sur la persistance de l’Ova
Gene therapy consist into introducing genetic material into cells to treat genetic disorders. Most gene therapies use viral vectors to carry the gene within target cells. In case of monogenic disorders, adeno-associated viruses (AAV) has become a vector of choice because of its lack of pathogenicity, its large tropism and its capacity to transduce quiescent cells. The use of AAV is approved in Europe to treat a rare lysosomal storage disease and has recently been approved by the FDA to treat a genetic cause of blindness. However, most clinical trials face immune responses directed against AAV components which may be highly immunogenic. This deleterious immunogenicity often lead to the trial failure. In addition, transgenic protein can also be immunogenic, aimaing to the destruction of transduced cells and ultimatly to gene therapy failure. In clinic, immunosuppressive drug remain the only option to counteract unwanted immune responses. These drugs possess infectious and tumorigenic side effects, therefore strategies aiming to rather capable to induce tolerance toward the transgenic protein are being developped and needed. The objectif of this work was to implement a new strategy aiming to study the immunoregulatory and tolerogenic effect of fusion proteins derived from CTLA-4 and PD-L1. We used a murin model recapitulating the immunes responses induced by an AAV coding for an immunogenic model protein, ovalbumin (Ova) presented in previous studies by our group and others. Then, we synthesized AAV coding for our newly designed immunoregulatory protein and injected them into mice along with AAV-Ova. This strategy of vectorized immunoregulation (VIR) allowed to evaluate the intrinsic capacity of each individual proteins to modulate immune responses against Ova directly in vivo. Eventually, this work allow to 1) assess the benefits and limits of the VIR strategy, 2) the deletrious long-term effects of CTLA-4/Fc on central and peripheral Tregs in mice, 3) to demonstrate the interest of new molecules specifically derived from PD-L1/Fc over the immune tolerance through the long-term persistance of Ova transgene

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Delage, Laure. "Des déficiences génétiques comme modèles naturels pour l'étude de la régulation des checkpoints immunitaires et la caractérisation des réponses auto-immunes." Electronic Thesis or Diss., Université Paris Cité, 2021. http://www.theses.fr/2021UNIP5190.

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Abstract:

Des mutations récessives de NBEAL2 ont été décrites chez des patients atteints du syndrome des plaquettes grises (SPG). Ce syndrome se caractérise par une macro-thrombopénie, avec des plaquettes dénuées de granules-alpha, conduisant à des troubles de la coagulation, souvent associés à une splénomégalie. Ainsi, NBEAL2 a un rôle crucial dans le trafic des granules-alpha plaquettaires. En outre, notre laboratoire a montré que les patients avec un déficit en NBEAL2 peuvent présenter des caractéristiques cliniques semblables aux syndromes lymphoprolifératifs auto-immuns ; suggérant un rôle de NBEAL2 dans l'homéostasie immunitaire et la tolérance. Une cohorte internationale plus large de patients SPG a confirmé et décrit de nouvelles anomalies immunitaires chez ces patients (maladies auto-immunes, autoanticorps, lymphopénies). Si le rôle de NBEAL2 dans le trafic des granules est souvent étudié, le mécanisme exact conduisant au développement des manifestations auto-immunes chez les patients SPG reste inconnu. NBEAL2 appartient à une famille de protéines, impliquées dans le trafic vésiculaire, et possédant toutes un domaine BEACH conservé. Dans cette famille de protéines à domaine BEACH, une des protéines les plus proche de NBEAL2 est LRBA. LRBA est impliqué dans le recyclage de CTLA-4, un checkpoint immunitaire inhibiteur. CTLA-4 joue un rôle crucial dans la régulation des réponses immunitaires et la tolérance. Des mutations récessives de LRBA conduisent à des caractéristiques cliniques semblables aux déficiences partielles en CTLA-4 : auto-immunité, infiltrations lymphocytaires et lymphopénie B progressive. En condition physiologique, LRBA empêche la dégradation lysosomale de CTLA-4 et permet son recyclage à la membrane plasmatique. Par analogie avec LRBA, nous avons étudié l'importance de NBEAL2 dans le trafic intracellulaire des checkpoints immunitaires et nous avons apporté un nouveau regard sur son rôle dans les lymphocytes. NBEAL2 est ainsi une protéine d'échafaudage, se liant à LRBA, et impliquée dans le trafic de CTLA-4 ainsi que le trafic vésiculaire en général. Ces travaux apportent de nouvelles connaissances sur la régulation de CTLA-4 dans les lymphocytes T activés, une nouvelle liste de partenaires pour la protéine NBEAL2 ainsi qu'un nouveau modèle pour le trafic vésiculaire dans lequel est impliqué NBEAL2. Enfin, une meilleure compréhension des mécanismes conduisant à l'auto-immunité chez les patients atteints du syndrome des plaquettes grises pourrait conduire à un diagnostic plus précoce et un traitement adapté
Recessive NBEAL2 mutations have been reported in patients with Gray Platelet Syndrome (GPS). This syndrome is characterized by a macro-thrombocytopenia, with platelets lacking alpha-granules, leading to bleeding disorders, often associated with splenomegaly. Thus, NBEAL2 plays a crucial role in the trafficking of alpha-granules in platelets. Moreover, our lab has also described NBEAL2 deficiencies in patients presenting clinical features of the autoimmune lymphoproliferative syndrome, suggesting a role of NBEAL2 in immune homeostasis and tolerance. A broader international cohort of GPS patients has been described, revealing immune system abnormalities (autoimmune diseases, autoantibodies, lymphopenia). If the role of NBEAL2 in the traffic of granules is often investigated, the exact mechanism leading to the development of autoimmune manifestations in GPS patients remains unknown. NBEAL2 belongs to a protein family involved in vesicular trafficking, all of which possess a conserved BEACH domain. Within this BEACH-domain containing proteins family, one of the closest members to NBEAL2 is LRBA. LRBA is involved in the recycling of CTLA-4, an inhibitory immune checkpoint. CTLA-4 plays a crucial role in the regulation of immune responses and tolerance. Recessive mutations of LRBA lead to similar clinical features as partial CTLA-4 deficiency: autoimmunity, lymphocytic infiltrations, and progressive B lymphopenia. Physiologically, LRBA prevents the lysosomal degradation of CTLA-4 and allows its recycling to the membrane. By analogy with LRBA, we investigated the importance of NBEAL2 in immune checkpoints intracellular trafficking and we brought new insights on its role in lymphocytes. Thus, NBEAL2 is a scaffold protein, binding LRBA, and involved in CTLA-4 trafficking as well as in vesicular trafficking in general. This work brings new knowledge to the regulation of CTLA-4 in activated T lymphocytes, a list of new partners for NBEAL2 protein and a new model of vesicular trafficking in which NBEAL2 is involved. Finally, a better understanding of the mechanisms leading to autoimmunity in patients with gray platelets syndrome could lead to better diagnosis and treatment management

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Bendavid-Anquetil, Céline. "Rôle des anticorps monoclonaux au cours des myopathies auto-immunes : de l’étude des auto-anticorps spécifiques des myopathies nécrosantes auto-immunes à la description physiopathologique des myosites induites par l’immunothérapie anti-tumorale." Electronic Thesis or Diss., Sorbonne université, 2021. http://www.theses.fr/2021SORUS257.

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Abstract:

Les myosites sont des maladies auto-immunes rares qui peuvent survenir soit de manière spontanée, les myopathies inflammatoires idiopathiques (MII), soit être induites par des traitements comme les inhibiteurs de points de contrôle immunitaire (ICI). Parmi les myosites, ce travail s’est concentré sur l’étude de deux entités : les myosites nécrosantes auto-immunes (MNAI) et les myosites induites par les ICI. Les MII sont divisées en sous-groupes homogènes en termes de phénotype clinique, biologique et histologique en partie grâce à l’identification des auto-anticorps spécifiques de myosite. Chacune de ces entités est associée à des anticorps qui jouent un rôle dans la survenue de la maladie par des mécanismes différents. Au cours des MNAI, les auto-anticorps anti-SRP (Signal recognition particle) semblent jouer un rôle pathogène direct via l’activation de la voie classique du complément. Treize auto-anticorps anti-SRP issus de prélèvement de patients ont été produits dont cinq auto-anticorps reconnaissant de manière spécifique la SRP par deux techniques différentes. Ces auto-anticorps anti-SRP humains seront utilisés pour développer des modèles de MNAI et comprendre leurs mécanismes d’action au cours de la pathologie ainsi que leurs cibles antigéniques. Concernant les myosites sous ICI, les anticorps monoclonaux thérapeutiques, dirigés contre les molécules de co-stimulation inhibitrices, induisent une rupture de tolérance immunitaire au sein du tissu musculaire. La description de séries de patients issus de base de pharmacovigilance a permis d’identifier un phénotype clinique spécifique associé à un mauvais pronostic notamment en cas d’atteinte cardiaque associée. L’étude de la réponse immunitaire systémique et du profil transcriptomique musculaire a mis en évidence un rôle central des lymphocytes T cytotoxiques et des macrophages dans la physiopathologie de la maladie. L’identification des mécanismes physiopathologiques est une étape essentielle à la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques afin d’améliorer la prise en charge des patients
Myositis is a rare autoimmune disease that may occur spontaneously, idiopathic inflammatory myopathies, or be induced by treatments such as immune checkpoint inhibitors (ICI). Among myositis, this work focused on the study of two entities: immune-mediated necrotizing myopathy (IMNM), and ICI-induced myositis. Inflammatory myopathies are separated into homogeneous subgroups in terms of clinical, biological, and histological phenotype thanks to the identification of myositis-specific autoantibodies. Each of these entities is associated with antibodies that play a role in the occurrence of the disease by different mechanisms. In IMNM, anti-SRP (signal recognition particle) autoantibodies appear to play a direct pathogenic role via activation of the classical complement pathway. Thirteen anti-SRP autoantibodies from patient samples were produced, including five autoantibodies specifically recognizing SRP by two different techniques. These human anti-SRP autoantibodies will be used to develop models of IMNM and to understand their mechanisms of action as well as to define their antigenic targets. Regarding ICI-induced myositis, therapeutic monoclonal antibodies directed against inhibitory co-stimulatory molecules induce a break of immune tolerance within the muscle tissue. The description of a series of patients from pharmacovigilance database allowed us to characterize a specific clinical phenotype associated with a poor prognosis, particularly in the case of associated myocarditis. The study of the systemic immune response and of the muscle transcriptomic profile has highlighted a central role of cytotoxic T lymphocytes and macrophages in the pathophysiology of the disease.Eventually, the description of pathophysiological mechanisms is mandatory to identify new therapeutic targets and then improve myositis treatment strategy

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Anna, François. "Développement d'une immunothérapie anti-tumorale basée sur un récepteur antigénique chimérique (CAR) ciblant le point de contrôle immunitaire HLA-G : implications pour les tumeurs et leur microenvironnement." Thesis, Université de Paris (2019-....), 2019. https://wo.app.u-paris.fr/cgi-bin/WebObjects/TheseWeb.woa/wa/show?t=4021&f=26655.

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Abstract:

Au cours de la dernière décennie, l’avènement des immunothérapies antitumorales a été une vraie percée dans le monde de la cancérologie avec le succès clinique des inhibiteurs de point de contrôle immunitaire (ICP) ou des thérapies cellulaires basées sur l’utilisation de récepteurs antigéniques chimériques (CAR). Cependant, aujourd’hui elles montrent leurs limites contre les tumeurs solides, notamment à cause d’un manque d’antigène spécifique et d’un microenvironnement tumoral complexe capable de moduler la réponse immune au profit de l’expansion des cellules cancéreuses. La molécule HLA-G est une protéine immunosuppressive participant exclusivement à la tolérance foeto-maternelle en contexte normal mais dont la fonction a été détournée par les tumeurs pour inhiber la réponse effectrice à son encontre. HLA-G est donc identifié comme un excellent antigène associé aux tumeurs et son inhibition est un élément crucial pour restaurer la réponse immunitaire anti-tumorale. Cependant, aucune stratégie immunothérapeutique ciblant HLA-G n’existait jusqu’à aujourd’hui.L’absence de traitement efficace contre ou ciblant HLA-G provient de l’incapacité à générer efficacement des anticorps contre cette protéine complexe du fait de la présence de nombreuses isoformes et de leurs caractères immunotolérogéniques. Dans la première partie de ces travaux, grâce à une méthode d’immunisation originale basée sur l’utilisation de vecteurs lentiviraux, nous avons pu générer des anticorps capables de reconnaitre le site d’interaction de HLA-G avec ses récepteurs et donc de potentiellement bloquer la fonction ICP de HLA-G. La deuxième partie de cette étude décrit la génération d’une thérapie CAR ciblant HLA-G en tant qu’antigène spécifique aux tumeurs. Tout d’abord, nous nous sommes préalablement concentrés sur la régulation et l’expression de la chaine CAR au niveau transcriptionnel. Cette approche visait à limiter les multiples effets secondaires liés à une thérapie CAR tels que l’activation continue des cellules CAR-T ou l’élimination de cellules saines exprimant l’antigène ciblé. Nous avons ensuite généré deux nouveaux CAR de 3ème génération capable de reconnaitre spécifiquement les isoformes majoritaires de HLA-G en contexte tumoral, et nous avons démontré leur efficacité à éliminer des tumeurs exprimant HLA-G in vitro et in vivo. Enfin, une série d’optimisations ont été réalisées sur la structure des protéines CAR pour augmenter leur capacité cytotoxique et permettre leur régulation par l’introduction du gène suicide iC9 pour les modèles précliniques. Nous démontrons pour la première fois que la thérapie CAR anti-HLA-G est extrêmement efficace in vitro et in vivo.Enfin, nous discutons du potentiel des immunothérapies anti-HLA-G aussi bien au travers des anticorps monoclonaux bloquants que des cellules CAR-T dans le contexte des tumeurs solides, de leurs implications sur le microenvironnement et de leur possible combinaison avec d’autres immunothérapies
Over the last decade, anti-tumor immunotherapies have been a breakthrough in the oncology field following the clinical successes obtained with immune checkpoint inhibitors (ICPs) or chimeric antigenic receptors (CAR) based therapies. However, they are less effective against solid tumors, especially because of the lack of tumor specific antigen and of a tumor microenvironment capable of inhibiting the immune response favoring the tumor expansion. The HLA-G molecule is an immunosuppressive protein originally exclusively demonstrated to be involved in maternal-fetal tolerance but whose function has been hijacked by tumors to inhibit and escape from immune responses. HLA-G is now identified as an exquisite tumor associated antigen and its inhibition is crucial to restore the anti-tumor immune responses. Yet, no immunotherapy directed against HLA-G has been developed to date.The lack of effective treatment against or targeting HLA-G is related to the inefficiency to induce antibodies against this complex protein since HLA-G could be expressed through several isoforms that are immunosuppressives. In the first part of this study, thanks to an original immunization method based on the use of lentiviral vectors, we demonstrate the possibility to generate antibodies which are capable to recognize the HLA-G interaction domain with its receptors and are expected to inhibit the ICP function of HLA-G. The second part describes a CAR-T cell immunotherapy targeting HLA-G for its TAA properties. We first focused on the regulation and on the expression of the CAR chain at the transcriptional level. This approach was meant to limit the side effects caused by CAR therapies such as continuous activation of the CAR-T cells or elimination of healthy cells expressing the targeted antigen. We then generated two new 3rd generation CARs demonstrated to specifically recognize major HLA-G isoforms expressed by tumor cells and to eradicate HLA-G expressing tumor cells in vitro and in vivo. Several optimizations were carried out on the CAR chain structure to increase CAR-T cells cytotoxic function and to control their persistence through the insertion of the iC9 suicide gene. Given the results presented here, we provide the first vitro and vivo proofs of concept that a CAR therapy directly targeting HLA-G, and more generally an ICP is strikingly efficient.Finally, we discussed the potential for both anti-HLA-G blocking monoclonal antibodies and CAR-T cells immunotherapies against solid tumors and its implication against the tumor microenvironment and possible combinations with other immunotherapies

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Wierz, Marina. "Characterization of the Tumor Microenvironment in Chronic Lymphocytic Leukemia by Mass Cytometry : Implications for Immunotherapy Dual PD1/LAG3 Immune Checkpoint Blockade Limits Tumor Development in a Murine Model of Chronic Lymphocytic Leukemia High-dimensional Mass Cytometry Analysis Revealed Microenvironment Complexity in Chronic Lymphocytic Leukemia." Thesis, université Paris-Saclay, 2020. http://www.theses.fr/2020UPASL020.

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Abstract:

La leucémie lymphoïde chronique (LLC), la leucémie la plus fréquente chez l'adulte, est caractérisée par l'accumulation de lymphocytes B matures dans le sang périphérique et les tissus lymphoïdes. La progression de la LLC est fortement dépendante des interactions complexes au sein du microenvironnement tumoral (TME) et malgré les récentes avancées dans le traitement de la LLC ciblant la TME, la LLC reste une maladie incurable. Par conséquent, nous voulions caractériser en profondeur le paysage immunitaire dans le TME dans la LLC murine et humaine afin d'identifier de nouvelles cibles potentielles pour une approche immunothérapeutique. À cette fin, nous avons effectué une caractérisation complète et approfondie par cytométrie de masse à haute dimension pour établir une cartographie approfondie des sous-populations de cellules immunitaires. Nous démontrons que les changements pertinents dans la composition des cellules immunitaires, en particulier l'expansion de sous-populations spécifiques de cellules immunitaires lymphoïdes et myéloïdes, sont associés à une forte suppression immunitaire contribuant ainsi à un phénotype d'échappement dans la LLC. Ces changements associés à la LLC peuvent être restaurés dans les modèles précliniques par un double blocage du point de contrôle immunitaire PD1/LAG3. De plus, nous démontrons une forte hétérogénéité des cellules T entre les patients qui peut être stratifiée en fonction de leur profil de cellules T, et la corrélation de sous-ensembles de cellules T spécifiques avec le temps jusqu'au traitement initial, mettant en évidence leur valeur pronostique potentielle. En conclusion, avec cette première étude CyTOF dans la LLC, nous avons élargi les connaissances actuelles sur la complexité phénotypique du TME. Nous avons démontré que le double ciblage des points de contrôle immunitaires contrôlait efficacement le développement de la LLC dans les modèles précliniques et pouvait donc avoir des avantages potentiels dans la LLC pour restaurer une immunité anti-tumorale fonctionnelle
Chronic lymphocytic leukemia (CLL), the most frequent leukemia in adults, is characterized by the accumulation of mature B lymphocytes in peripheral blood and lymphoid tissues. The progression of CLL is highly dependent on complex interactions within the tumor microenvironment (TME) and despite recent advances in CLL treatment targeting the TME, CLL remains an incurable disease. Therefore, we wanted to deeply characterize the immune landscape in the TME in murine and human CLL to identify novel potential targets for an immunotherapeutic approach. For this purpose, we performed a comprehensive and extensive characterization by high-dimensional mass cytometry to establish an extensive cartography of immune cell subsets. We demonstrated that relevant changes in the immune cell composition, especially the expansion of specific lymphoid and myeloid immune cell subsets, are associated with strong immune suppression thereby contributing to an escape phenotype in CLL. These CLL-associated changes can be restored in preclinical models by a dual PD1/LAG3 immune checkpoint blockade. Moreover, we demonstrated a high T cell heterogeneity between patients that can be stratified according to their T cell profile, and the correlation of specific T cell subsets with time to initial treatment, highlighting their potential prognostic value. In conclusion, with this first CyTOF study in CLL, we expanded the current knowledge of the phenotypic complexity of the TME. We demonstrated that dual targeting of immune checkpoints efficiently controlled CLL development in preclinical models and therefore could have potential benefits in CLL to restore a functional anti-tumor immunity

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Balança, Camille-Charlotte. "Contribution des réponses immunitaires adaptatives spécifiques des antigènes tumoraux à l'efficacité clinique de l'immunothérapie par inhibition de l'axe PD-1/PD-L1." Thesis, Toulouse 3, 2021. http://www.theses.fr/2021TOU30007.

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Abstract:

Les lymphocytes infiltrant la tumeur (TIL) épuisés, sont caractérisés par l'expression de points de contrôle de l'immunité (PCI), par exemple PD-1. Une des approches majeures en immunothérapie, basée sur l'inhibition des PCI, s'est avérée efficace dans le contrôle de la progression tumorale dans plusieurs cancers. Malgré cette avancée, seule une proportion des patients en retire un bénéfice clinique. Afin d'améliorer les réponses à l'inhibition des PCI, il est nécessaire de comprendre les mécanismes impliqués dans l'épuisement des TIL et d'élucider quels lymphocytes T (LT) sont capables de répondre à cette immunothérapie. Au site tumoral, nous mettons en évidence que seuls les LT CD8 spécifiques des antigènes (Ag) tumoraux expriment quatre PCI ainsi que d'autres marqueurs d'épuisement et perdent la molécule de co-stimulation CD28, contrairement au LT CD8 spécifiques circulants. Les TIL CD8 spécifiques sont dysfonctionnels, néanmoins, ils possèdent un potentiel cytotoxique élevé et expriment des marqueurs de résidence. Nous montrons que l'inhibition de PD-1 a une double action sur les LT CD8 spécifiques. Elle rétablit leurs fonctions dans la tumeur et augmente leur prolifération dans la périphérie. De manière importante, l'infiltration des tumeurs par ces TIL spécifiques et épuisés est prédictive de la réponse à la thérapie et de la survie des patients traités par immunothérapie ciblant l'axe PD-1/PD-L1. Les LT CD4 auxiliaires sont essentiels pour l'amorçage de la réponse T CD8. En revanche, leur rôle effecteur dans la tumeur a été moins étudié. Ici, nous montrons que les LT CD4 spécifiques des Ag tumoraux, également épuisés au site tumoral, peuvent être identifiés par des marqueurs qui leur sont propres. Des similarités dans le programme d'épuisement des LT CD4 et CD8 ont été retrouvées. Le blocage de PD-1 sur les TIL CD4 rétablit leur activation, ce qui va permettre la maturation des cellules dendritiques et, par conséquent, l'augmentation de la prolifération des TIL CD8 spécifiques de la tumeur. Nos résultats révèlent que les TIL CD4 et CD8 spécifiques des Ag tumoraux épuisés peuvent être identifiés chez les patients par des marqueurs caractéristiques et qu'ils répondent à l'inhibition du PD-1 en rétablissant les fonctions des LT CD8 de manière directe et indirecte. Ces données identifient des biomarqueurs prédictifs de la réponse à l'immunothérapie et positionnent les LT spécifiques des Ag tumoraux comme des acteurs de la réponse clinique à l'immunothérapie bloquant le PD-1
Exhausted tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) are characterized by immune checkpoint (IC) expression, for instance PD-1. One of the major immunotherapy approaches, based on IC inhibition, has proved efficient in the control of tumor progression in many cancers. Despite this progress, only a proportion of patients experience clinical benefit. To improve responses to IC inhibitors, understanding mechanisms involved in TIL exhaustion and investigating which T cells are able to respond to immunotherapy are required. We investigated both CD8 and CD4 T-cell exhaustion and its relation to tumor antigen (Ag) specificity and to responsiveness to IC inhibition in cancer patients. We demonstrated that CD8 T-cell exhaustion at the tumor site was only attained by tumor Ag-specific cells that were characterized by the sequential acquisition of ICs and by CD28 loss. Their circulating counterparts expressed less ICs and at lower levels and were CD28+. Specific CD8 TILs were dysfunctional, nonetheless, they maintained high cytotoxic potential and expressed tissue residency markers. We showed that PD-1 inhibition has a dual effect on specific CD8 T cells. It rescued their effector functions at the tumor site and enhanced their proliferation in the periphery. Importantly, the quantity of exhausted and specific TILs was predictive of response to therapy and of survival in patients treated with PD-1-targeting immunotherapy. Assessment of CD4 TIL exhaustion underscored similarities with the CD8 exhaustion program, in particular their specificity for tumor Ag and sequential acquisition of ICs although ICs characterizing terminally exhausted CD4 TILs were different than those found in CD8 TILs. Importantly, PD-1 blockade on CD4 TILs restored their helper functions, leading to dendritic cell maturation and, consequently, increased tumor-specific CD8 T-cell proliferation. Our data imply that under anti-PD-1/PD-L1, effector functions of terminally exhausted CD8 TILs is rescued and the tumor site is replenished by memory CD8 T cells which proliferate following direct blockade of PD-1 and through reinvigoration of the helper activity of tumor Ag-specific CD4 T cells. Our results position tumor Ag-specific T cells as major players of responsiveness to PD-1-blocking immunotherapy and identify predictive biomarkers of response to immunotherapy

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Liu, Peng. "Mort cellulaire immunogène induite par le crizotinib dans le cancer poumon non à petites cellules." Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2018. http://www.theses.fr/2018SACLS148.

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Abstract:

De nombreuses données suggèrent que le succès thérapeutique de certaines chimiothérapies conventionnelles, radiothérapies, ainsi que des thérapies ciblées est dû à leur capacité a induire la mort cellulaire immunogène (ICD), ce qui stimule la libération ou l'exposition des motifs moléculaires associés à un dommage (DAMPs) conduisant à leur reconnaissance par le système immunitaire, rétablissant ainsi l'immunosurveillance. En utilisant un criblage non polarisé, le crizotinib a été identifié en tant qu'inhibiteur de tyrosine-kinase ayant la capacité de stimuler la libération de caractéristiques distinctives de l’ICD. Des expériences faites par la suite ont montréque le crizotinib induit l'exposition de la calreticulin, la sécrétion d'ATP et la libération d’HMGB1, ainsi que le stress du réticulum endoplasmique dans les lignées cellulaires cancéreuses murines et humaines, notamment en combinaison avec les agents non immunogènes tel que le cisplatine. L’ICD causée par la combinaison du crizotinib avec la chimiothérapie a aussi été observée dans les cellules du cancer bronchique non à petites cellules (NSCLC), cellules ne possédant pas de mutations activatrices d’ALK ou ROS1 ; cela suggère un mode d'action hors-cible. Des études comparatives ont montré que seule la conformation utilisée en clinique, l’isoforme (R)-crizotinib, a la capacité de stimuler l’ICD ; le (S)-énantiomère ne possède pas ces caractéristiques. Combinées au cisplatine, les cellules fibrosarcome MCA205 et les cellules cancéreuses du poumon TC-1 traitées avec le crizotinib ont vacciné efficacement les souris immunocompétentes syngéniques contre la croissance des cellules vivantes de même type. Le crizotinib a amélioré l'efficacité de la chimiothérapie dans trois modèles de cancer du poumon orthotopiques : transplantable, induit par des carcinogènes et induites par les oncogènes. De façon remarquable, l’effet du crizotinib est aboli si un des signaux de l’ICD est bloqué. L'efficacité anticancéreuse dans chaque modèle s’est révélé être lié à l'infiltration de lymphocytes T, montrant l’implication d’une réaction immunitaire. Cela a été confirmé par des expériences chez des souris immunodéficientes (nu/nu, déficientes en thymodépendantes lymphocytes T) et dans des souris immunocompétentes dans lesquelles l’interféron gamma a été neutralisé à l’aide d’un anticorps ; l’effet du crizotinib était aboli dans les deux modèles. La combinaison du crizotinib avec le cisplatine a entraîné un accroissement de l'expression de PD-1, PDL-1 et CTLA-4 dans la tumeur, s’accompagnant par conséquent d'une sensibilisation importante des NSCLC à l'immunothérapie avec des anticorps anti-PD-1 et CTLA-4. Ainsi, la combinaison du crizotinib avec la chimiothérapie conventionnelle et les inhibiteurs des points de contrôle immunitaire peuvent être actifs contre le NSCLC. Les données présentées dans cette thèse pourraient faciliter la conception d’essais cliniques afin d’établir de nouvelles stratégies combinatoires pour le traitement des NSCLC
Accumulating evidence suggests that certain conventional chemotherapies, radiotherapies, as well as targeted therapies mediate their long-term therapeutic success by inducing immunogenic cell death (ICD), which stimulate the release or exposure of danger-associated molecular patterns from or on cancer cells, causing their recognition by the immune system, thus reinstating immunosurveillance. An unbiased screen identified crizotinib as a tyrosine kinase inhibitor that is potent in provoking hallmarks of ICD. In subsequent low-throughput validation experiments, crizotinib promoted Calreticulin exposure, ATP secretion, HMGB1 release, as well as ER stress in both human and murine cancer cells, especially if it is combined with normally non-ICD inducing chemotherapeutics such as cisplatin. ICD induced by the combination of chemotherapy and crizotinib was also observed in non-small cell lung carcinoma (NSCLC) cells lacking activating mutations of the crizotinib targets ALK and ROS1, suggesting an off-target-mediated mode of action. Comparative studies indicated that exclusively the clinically used (R) isoform of crizotinib was efficient in inducing cell death and stimulating ICD hallmarks whereas the (S) enantiomer lacked those characteristics. When combined with cisplatin, crizotinib-killed fibrosarcoma MCA205 cells as well as lung cancer TC-1 cells efficiently vaccinated syngeneic immunocompetent mice against a re-challenge with live cancer cells of the same types. Crizotinib improved the efficacy of chemotherapy with non-ICD inducers (such as cisplatin and mitomycin C) on three distinct (transplantable, carcinogen- or oncogene induced) orthotopic NSCLC models, none of which relied on the activation of ALK or ROS1. Of note these anticancer effects were completely lost if any of the ICD signals was blocked. These anticancer efficacies in different models were linked to an increased T lymphocyte infiltration as a sign of an immune response and were lost if such tumors grew on immunodeficient (nu/nu) mice that are athymic and hence lack thymus-dependent T lymphocytes, or on immunocompetent mice with a neutralization of interferon-. The combination of cisplatin and crizotinib led to an increase in the expression of CTLA-4, PD-1 and PD-L1 in tumors, coupled to a strong sensitization of NSCLC to immunotherapy with antibodies blocking CTLA-4 and PD-1. Hence, a combination of crizotinib, conventional chemotherapy and immune checkpoint blockade may be active against NSCLC, and these data might facilitate the design of clinical trials to evaluated novel combination regiments for the treatment of NSCLC

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GUIDA, ANNALISA. "Decifrare la risposta immunitaria ai checkpoint inibitori e ricerca di nuovi biomarcatori nel carcinoma renale metastatico." Doctoral thesis, Università degli studi di Modena e Reggio Emilia, 2020. http://hdl.handle.net/11380/1201007.

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Abstract:

Nivolumab rappresenta attualmente uno standard per il trattamento di seconda linea del carcinoma renale metastatico (mRCC). E’ un anticorpo monoclonale IgG4 diretto contro programmed death-1 (PD-1) ed agisce inibendo il legame tra PD-1 e il suo ligando. Nella maggior parte dei pazienti, il farmaco ripristina la risposta immunitaria antitumorale T-mediata, migliorando la sopravvivenza e il tasso di rispsote obiettive. Tuttavia, in un certo numero di pazienti non si osserva una risposta al trattamento, motivando la crescente necessità di predire e incrementare il numero di pazienti responsive al trattamento con inibitori dei checkpoint immunitari. Il sistema immunitario rappresenta quindi un mediatore dell’attività del farmaco, suggerendo che l’equilibrio tra agenti regolatori positivi e negativi del sistema immunitario possono avere un ruolo chiave nell’efficacia terapeutica. Oggetto di attenzione sono fattori solubili coinvolti nel reclutamento e nella regolazione delle cellule T effettrici, i sottotipi di cellule T regolatorie e il rapporto tra cellule T effetrici e regolatorie. L’obiettivo principale del progetto è identificare biomarcatori sierici e immunitari in pazienti affetti da mRCC e trattati con Nivolumab per predire quali pazienti possono beneficiare del trattamento. E’ uno studio prospettico, longitdinale, su pazienti affetti da mRCC trattati con Nivolumab nella normale pratica clinica. Lo studio indaga le variazioni nei principali parametri immunitari nella popolazione in esame, attraverso l’analisi di prelievi ematici al basale e a distanza di 1, 2, 3, 6 ed eventualmente 12 mesi. Vengono prelevati 30 mL di sangue periferico da cui sono estratte le cellule perferiche mononucleate. Le cellule vengono conservate in azoto liquido. Vengono testati i seguenti anticorpi: CD3, CD4, CD8, CD25, CD127, FoxP3, ICOS, CXCXR6, CXCR3, CD95, CD45RA, CCR7, CD95, HLA-DR, CD38, CD28, CD27, CD71, CD87, CD39, TIM3, TIGIT, CCR4, Glycoforin, PD-1/IgG4, CD57, KI-67. Questa citometria a flusso multicolor viene analizzata in collaborazione con il Dr. Lugli (Humanitas Milano). I campioni vengono ottenuti attraverso un citometro a flusso BD Symphony. Per l’analisi dei dati viene utilizzato FlowJo 9.6 per MacOSX. Da gennaio 2016 a ottobre 2018 sono stati arruolati 21 pazienti. L’età media è di 60 anni (33-79). La maggiro parte dei pazienti ha un’istologia a cellule chiare (90%). Il Nivolumab è stato somministrato come terapia di seconda linea nel 59% dei casi e di terza linea nel 27% dei casi. Secondo International Metastatic Renal Cell Carcinoma Database Consortium Score (IMDC score) il 72% ha un rischio prognostico intermedio e il 14% ha un rischio prognostico sfavorevole. Con un follow up mediano di 14 mesi (min 2 max 31), il tasso di sopravvivenza a 6 e 12 mesi è rispettivamente del 74% (95%CI 48-88) e del 47% (95%CI 22-68). La mediana di sopravvivenza libera da progressione è di 4.2 mesi (95%CI 3-10). Un controllo di malattia è stato registrato in 8 pazienti (40%) definiti responder (R). Al momento dell’analisi il trattamento era in corso di 4 pazienti. Dati preliminari mostrano che KI67, marker di proliferazione, aumenta dopo 15 giorni di trattamento. Coerentemente anche HLA-DR e CD38 sono aumentati. La riattivazione del sistema immunitario è l’obiettivo del trattamento con Nivolumab. Auspichiamo di individuare marker facilmente misurabili predittivi di risposta al trattamento. Un follow up più lungo sarà necesario per confermare i dati preliminari.
Nivolumab represents the new second-line treatment for metastatic renal cell carcinoma (mRCC). This drug is a fully human IgG4 against PD-1 and his role is to inhibits programmed death-1 (PD-1)/PD-1 ligand 1 (PD-L1) immune checkpoint. In the majority of patients, this drug is able to restore the patient’s tumour-specific T-cell-mediated response thus improving both overall survival and objective response rate. However, a lack of clinical response occurs in a number of patients, raising questions about how to predict and increase the number of patients who receive long-term clinical benefit from immune checkpoint therapy. The requirement for the immune system as a mediator of the drug's activity suggests that the balance of positive and negative regulators of the immune response at the time of therapy may be critical for therapy efficacy. Of particular interest are soluble factors involved in the recruitment and regulation of effector T cells, the frequency of different subsets of regulatory T cells and the ratio between effector T cells and regulatory T cells. The main aim of this project is to identify immune and serum biomarkers that are modulated in patients with metastatic renal cell carcinoma during and treated with immune checkpoint inhibitors and that can discriminate patients who most likely benefit from such therapy. This is a prospective, longitudinal, study on patients with mRCC who will receive Nivolumab in standard clinical practice. The project investigates changes in main immune parameters in patients with mRCC treated with nivolumab by analysing blood samples at baseline and after 1, 2, 3, 6 and eventually 12 months. Thirty mL of blood were collected and peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were isolated according to standard procedures. PBMC were stored in liquid nitrogen. Then, PBMC were thawed according to standard procedures and stained with a viability probe and the following antibodies recognizing: CD3, CD4, CD8, CD25, CD127, FoxP3, ICOS, CXCXR6, CXCR3, CD95, CD45RA, CCR7, CD95, HLA-DR, CD38, CD28, CD27, CD71, CD87, CD39, TIM3, TIGIT, CCR4, Glycoforin, PD-1/IgG4, CD57, KI-67. This 28-color multicolour flow cytometry panel was set up in collaboration with Dr. Lugli (Humanitas, Milan). Samples were acquired by using a BD Symphony flow cytometer. Compensation was set using single stained controls and gating strategy was checked by using FMO. Data analysis was performed using FlowJo 9.6 under Mac OSX. From January 2016 until October 2018 we enrolled 21 patients. The median age was 60 years (33-79). The majority of patients had clear cell histology (90%). Nivolumab was given as second-line therapy in 57% of patients, as third line therapy in 29% of cases. According with International Metastatic Renal Cell Carcinoma Database Consortium Score (IMDC score) 72% of patients were in the intermediate prognostic risk group and 14% in poor risk. With a median follow-up of 14 months (min: 2 max: 31), 6-months and 12-months survival rate were 74% (95%CI 48-88) and 47% (95%CI 22-68), respectively. Median progression-free survival (PFS) was 4.2 months (95% 3-10). Disease control was achieved in 8 patients (40%), defined responder (R). At time of analysis treatment was ongoing in 4 patients. Preliminary data on PBMC show that Ki-67, a marker of cell proliferation, is increased after 15 days of therapy in some patients. Accordingly, the expression of HLA-DR and CD38 are increased. Reactivation of the immune system is one of the main goals of nivolumab. We expect to identify easily measurable immune biomarkers that predict the responsiveness to nivolumab. Finding novel biomarkers that predict the response to therapy with nivolumab and monitor its efficacy can be of great benefit for the success of treatment. Longer follow up is required to assess preliminary immunological data.

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Cohen, Romain. "Caractérisation phénotypique et clinique des cancers colorectaux métastatiques avec instabilité des microsatellites Clinical and molecular characterization of hereditary and sporadic metastatic colorectal cancer harbouring microsatellite instability/DNA mismatch repair deficiency Association of primary resistance to immune checkpoint inhibitors in metastatic colorectal cancer with misdiagnosis of microsatellite instability or mismatch repair deficiency status." Thesis, Sorbonne université, 2018. http://www.theses.fr/2018SORUS313.

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Abstract:

L’instabilité des microsatellites (MSI) est un phénotype tumoral dû à une déficience héréditaire ou acquise du système de réparation des mésappariements de l’ADN (MMR : mismatch repair). Le phénotype MSI est retrouvé dans 5% des cancers colorectaux métastatiques (CCRm) et est un facteur prédictif positif majeur de l’efficacité des inhibiteurs de checkpoints immunitaires (ICKi). L’objectif de mon travail a été de caractériser sur le plan clinique et moléculaire les CCRm MSI, d’en évaluer les modalités diagnostiques et d’évaluer la réponse aux ICKi. Dans un 1er travail, je montre que l’histoire naturelle clinique des CCRm MSI diffère selon le mécanisme sporadique ou héréditaire de la déficience MMR (Cohen et al., Eur J Cancer 2017). Dans un 2e travail, je montre que près de 10% des CCRm détectés comme MSI/MMR-déficients en vie réelle correspondent à des faux positifs des analyses immunohistochimiques et/ou de PCR, et que ces faux positifs sont responsables de la majorité des cas de résistance primaire aux ICKi observés dans les essais cliniques (Cohen*, Hain* et al., JAMA Oncol. 2018). Après une revue de la littérature concernant le phénotype MSI, son impact dans le cadre du CCR et des ICKi, je présente les résultats des travaux développés durant ce doctorat, avant de proposer différentes perspectives à l’ère de l’immunothérapie des cancers MSI
Microsatellite instability (MSI) is a tumor phenotype linked to somatic or germline inactivating alterations of DNA mismatch repair (MMR) genes. MSI is observed in approximately 5% of metastatic colorectal cancers (mCRC) and has recently emerged as a major positive predictive biomarker for the efficacy of immune checkpoint inhibitors (ICKi) amongst mCRC patients. The objectives of my work was to clinically and molecularly characterize MSI mCRC, to evaluate the accuracy of MSI screening methods and the response to immunotherapy in the context of ICKi clinical trials. Fist, I show that sporadic and inherited MSI mCRC display distinct natural history (Cohen et al., Eur J Cancer 2017). In a second work, I show that MSI testing in routine practice is associated with almost 10% of false positives due to misinterpration of IHC and PCR assays. Moreover, these false-positives are the main cause of mCRC primary resistance to ICKi observed in clinical trials (Cohen*, Hain* et al., JAMA Oncol. 2018). After summarizing the literature concerning MSI, its consequences on CRC and immunotherapy, I present the results of the nosologic and diagnostic works developed during this doctoral thesis. Then I will go on perspectives in the context of MSI cancer

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LO, TARTARO DOMENICO. "Melanoma metastatico e carcinoma renale: focus sul ruolo delle cellule T CD8+ nelle risposte agli inibitori dei checkpoint immunitari." Doctoral thesis, Università degli studi di Modena e Reggio Emilia, 2022. http://hdl.handle.net/11380/1278345.

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Abstract:

I linfociti T CD8 giocano un ruolo centrale nell’immunità al cancro mediante la loro capacità di uccidere le cellule maligne. Tuttavia, la prolungata esposizione agli antigeni nel microambiente tumorale contribuisce a indurre un grave esaurimento delle cellule T CD8 (Tex). Durante gli ultimi due decenni il trattamento del cancro è stato rivoluzionato dagli inibitori dei checkpoint immunitari (ICIs), che bloccano l’attività dei recettori inibitori, come il PD-1, presenti sulla superfice delle cellule Tex, rinvigorendole. Nonostante l’osservazione di risposte durature alla terapia ICI, non tutti i pazienti rispondono al trattamento. Abbiamo focalizzato la nostra attenzione sull'identificazione delle alterazioni che si verificano nei linfociti T CD8 circolanti di pazienti con melanoma metastatico (mM) e carcinoma renale metastatico (mRCC) durante il trattamento con anti-PD1, al fine di capire come e perché alcuni pazienti rispondono o no alla terapia. La prima coorte comprendeva 28 pazienti mM, 17 dei quali definiti responsivi (R) mentre 11 non responsivi (NR) alla terapia. La seconda coorte comprendeva invece 19 pazienti mRCC, 5 dei quali definiti responsivi (R) mentre 14 non responsivi (NR). I PBMC crioconservati, ottenuti prima dell'inizio della terapia (T0) dopo il primo (T1), secondo (T2) e terzo ciclo di terapia (T3), sono stati studiati mediante citometria a flusso a 30 parametri in combinazione con il sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq) e analizzate utilizzando FAUST, un nuovo metodo non parametrico per la scoperta non supervisionata di popolazioni cellulari. Nei pazienti R con mM abbiamo riscontrato un aumento delle cellule effettrici di memoria (EM) proliferanti esprimenti alti livelli di Ki67, ICOS, CD95, HLA-DR, CD71, CD98, CXCR6, granulisina e CD38, sia prima che dopo il primo e il secondo ciclo di terapia. L’scRNA-seq ha rivelato la presenza delle cellule T invarianti associate alla mucosa (MAIT) attivate esprimenti il CD69 e CXCR4 e il loro aumento nei pazienti R rispetto ai NR, sia prima e dopo la terapia con ICI. Insieme all'aumento in percentuale abbiamo anche osservato una maggiore capacità delle MAIT nei pazienti R di produrre IFN-g e GRZM-B, solo al T0. L'analisi in silico di dataset pubblici ha rivelato la presenza delle MAIT all'interno delle lesioni primarie e metastatiche, e dopo terapia il loro livello era aumentato nelle lesioni che regredivano. Infine, abbiamo correlato il livello mediano delle cellule MAIT circolanti (1,7% delle cellule T CD8) con la risposta alla terapia. Utilizzando questo valore come soglia, i pazienti che presentavano una percentuale di MAIT al di sopra della soglia hanno mostrato una risposta migliore alla terapia. L’analisi delle cellule T CD8 dei pazienti con mRCC ha rivelato la presenza di 61 clusters. A causa del numero basso di pazienti che rispondono alla terapia, abbiamo trovato percentuali simili tra i clusters dei pazienti R e NR sia prima che dopo terapia. Tuttavia, analizzando insieme tutti i pazienti trattati con anti-PD1 (n=19), si osserva come la terapia abbia indotto una ridistribuzione di diverse sottopopolazioni di cellule T CD8. In particolare, le cellule T staminali di memoria (TSCM) sono diminuite dopo il terzo ciclo di terapia. Al contrario, le sottopopolazioni di cellule EM sono aumentate in percentuale dopo la terapia. In termini di funzionalità, abbiamo osservato che, se comparate con le cellule EM, le TSCM dopo la terapia perdono la capacità di proliferare sebbene mantengano una più alta polifunzionalità, producendo simultaneamente TNF e IFN-g. In conclusione, abbiamo fornito l’evidenza che i pazienti mM e mRCC rispondono in modo diverso alla terapia con anti-PD1, i primi sono caratterizzati da più alti livelli di cellule MAIT attivate nei pazienti R, mentre i secondi sono caratterizzati da un pool probabilmente esaurito di TSCM circolante.
CD8 T lymphocytes play a central role in immunity to cancer through their capacity to kill malignant cells. However, prolonged exposure to cognate antigens in tumor microenvironment contribute to induce severe CD8 T cell exhaustion (Tex). During the last decade cancer treatment has been revolutionized by immune check point inhibitors (ICIs) that block the activity of inhibitor receptors, such as PD-1 present on the surface of Tex cells, reinvigorating them. Despite observations of durable responses to ICI therapy, not all patients respond to the treatment. Therefore, we focused our attention on identifying alterations that occur in circulating CD8 T lymphocytes of metastatic melanoma (mM) and metastatic renal-cell carcinoma (mRCC) patients during treatment with anti-PD1, in order to understand how and why some patients respond or not to ICI therapy. The first cohort comprised 28 patients with mM, 17 of whom were defined responders (R) whereas 11 non-responders (NR). Cryopreserved PBMC, obtained prior to initiating therapy (T0) after the first (T1) and second therapy cycles (T2), was studied by 30 parameter high-dimensional flow cytometry in combination with single cell RNA-sequencing (scRNAsq). The second cohort comprised 19 patients with mRCC, 5 of which were defined responders (R) whereas 14 non-responders (NR). Cryopreserved PBMC, obtained prior to initiating therapy (T0) after the first (T1), second (T2) and third therapy cycle (T3), was studied by 28 flow cytometry and analyzed using FAUST, a novel non-parametric method for unsupervised discovery of cell population. In R patients we found an increase of proliferating effector memory (EM) cells expressing high level of Ki67, ICOS, CD95, HLA-DR, CD71, CD98, CXCR6, granulysin and CD38, both before and after first and second cycle of ICI therapy. scRNA-seq revealed the presence of activated mucosal associated invariant T (MAIT) cells expressing CD69 and CXCR4, and their increase in R compared to NR, before and after ICI therapy. Along with increased percentage of peripheral MAIT cells we also observed greater ability to produce IFN-g and GRZM-B in R patients, before starting therapy but not after. In silico analysis of public datasets revealed the presence of MAIT cells within primary and metastatic lesions and their increased level within lesions regressing after ICI. Finally, to associate our finding with clinical outcomes, we correlated the median level (1.7% of CD8 T cells) of circulating MAIT cells with the response to therapy. Using this value as a threshold, patients who exhibited MAIT frequency above the threshold showed a better response to therapy. Flow cytometry reveals that CD8 T cells from mRCC patients could be classified in 61 cell clusters. Due to the relatively low number of patients responding to therapy, we found similar percentages of clusters in R and NR at all timepoints. However, considering all patients treated with anti-PD1 (n=19), therapy induced a redistribution of different subpopulations of CD8 T cells. In particular, T stem cell memory (TSCM) decreased after the third cycle of therapy. On the contrary, the EM compartments increased after therapy. In terms of functionality, we observed that, if compared with EM, after therapy TSCM lost proliferative potential but retained more polyfunctionality, producing simultaneously TNF and IFN-g. In conclusion, we provide evidence that mM and mRCC patients differently respond to anti-PD1 therapy, the formers are characterized by more activated MAIT in R patients, while the latter are characterized by a pool of circulating likely-exhausted TSCM.

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Micelli, Lupinacci Renato. "Caractérisation anatomo-clinique et phénotypique des adénocarcinomes canalaires du pancréas avec instabilité des microsatellites." Thesis, Paris 6, 2017. http://www.theses.fr/2017PA066311/document.

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Abstract:

L’adénocarcinome canalaire du pancréas (ACP) est un problème majeur de santé publique. L’ACP se développe principalement à partir de deux lésions précurseurs : les néoplasies intra-épithéliales pancréatiques et les tumeurs intracanalaires papillaires et mucineuses du pancréas (TIPMP). Les mécanismes moléculaires sous-tendant l’oncogenèse pancréatique sont nombreux. Nous avons étudié le mécanisme de cancérogenèse MSI (MicroSatellite Instability) où il existe une déficience dans le système de réparation des erreurs de réplication de l’ADN ou système MMR (Mismatch Repair). Ce mécanisme de cancérogenèse original est caractérisé par une instabilité génétique de l’ADN affectant les séquences répétées microsatellites du génome. Le phénotype MSI a été décrit dans le syndrome de Lynch (SL), dans lequel il existe une mutation germinale d’un des gènes du système MMR (MLH1, MSH2, MSH6 et PMS2). L’intérêt de l’étude des cancers MSI s’est accru de façon considérable avec le développement des immunothérapies dirigées contre les checkpoints immunitaires (ICK), en particulier PD-1/PD-L1. Nous avons confirmé que la fréquence du phénotype MSI se situe entre 1-2%. Nous avons montré que l’immunohistochimie est la méthode de screening plus adaptée pour l’identification de l’ACP MSI en comparaison avec les techniques de biologie moléculaire. Le phénotype MSI a été plus fréquemment observé dans un contexte de TIPMP. Les cas MSI identifiés présentaient des caractéristiques biologiques évocatrices du SL. Egalement, nos résultats confirment la présence d’un processus de carcinogenèse MSI immunogénique, mais suggèrent des évènements somatiques spécifiques à l’organe d’origine du cancer. Par ailleurs, les ACP MSI étaient caractérisés par un infiltrat inflammatoire riche en lymphocytes cytotoxiques T CD8+ et surexprimaient l’ICK PD-L1 permettant de supposer une probable réponse clinique de l’ACP MSI à l’immunothérapie anti-PD1/PD-L1
Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is a major health problem in France and around the world. PDAC is developed mainly from two precursor lesions: pancreatic intraepithelial neoplasia and intraductal papillary mucinous neoplasm (IPMN). There are several molecular mechanisms underlying pancreatic oncogenesis. Particularly, we were interested in the MSI (MicroSatellite Instability) which is due to a defective DNA Mismatch Repair (MMR) system, which normally functions to recognize and repair erroneous insertions, deletions, and mis-incorporation of bases that can arise during DNA replication and recombination. The MSI phenotype was first described in the familial cancer condition known as Lynch syndrome (LS), where the MMR genes MLH1, MSH2, MSH6 or PMS2 harbor germline mutations. Interest in MSI tumors has recently increased after studies have highlighted the concomitant expression of multiple active immune checkpoint (ICK) markers including PD-1 and PD-L1 and the role of the MSI status to predict clinical benefit from immune checkpoint blockade. A Our results indicate that the MSI phenotype occurs in PDAC with a frequency of 1-2%. Our data showed that IHC using antibodies against the four MMR proteins was more sensitive for the assessment of MSI status than PCR-based methods. In addition, we demonstrate for the first time a statistically significant positive association between MSI and IPMNs in PDAC. MSI PDAC, including IPMN, are unlikely to be sporadic since they display molecular features that are usually observed in LS-related neoplasms. Also, our results highlight that an MSI-driven immunogenic pathway to cancer is active in MSI PDACs but suggest that MSI-driven somatic events may be tissue-specific. We observed a stronger lymphocytic tumor infiltration by activated TCD8 cells in MSI PDAC compared to MSS PDAC and found a positive association between PD-L1 expression and MSI status, suggesting that MSI PDAC could be responsive to ICK blockade therapy

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Cohen, Charlotte. "La Fractalkine (FKN) comme traitement des métastases osseuses de CNPC au sein d’une stratégie multimodale : une étude préclinique sur un modèle murin." Thesis, Université Côte d'Azur, 2020. http://www.theses.fr/2020COAZ6030.

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Abstract:

Le cancer du poumon touche plus de 50 000 personnes par an en France. Au moment du diagnostic, 60% des patients présentent une maladie métastatique. Ces métastases siègent au niveau osseux dans 20 à 40% des cas et sont associées à une survie réduite (5 à 10% à 5 ans) et à une altération de la qualité de vie. L’identification de nouvelles thérapeutiques potentielles est nécessaire à l’amélioration du pronostic vital et fonctionnel de ces patients.Une chimiokine, la fractalkine (FKN), constitue une piste thérapeutique intéressante. Ayant un rôle dans le recrutement leucocytaire, ainsi que sur le métabolisme osseux, délivrée localement, elle pourrait permettre de restaurer une immunité anti-tumorale et agir sur l’ostéolyse. Son impact sur le développement tumoral est complexe, et dépend de l’expression de son récepteur par les cellules tumorales, sa forme, la localisation des lésions, et du type de cancer.Nous avons tout d’abord voulu déterminer l’impact de la FKN sur le développement de métastases osseuses de CNPC (cancer pulmonaire non à petites cellules) dans un modèle syngénique murin, utilisant des cellules LL2 exprimant soit un niveau faible (LL2-FKNlo), soit un niveau élevé de FKN (LL2-FKNhi). La FKN avait un effet anti-tumoral, permettant une réduction du poids des tumeurs de 73% dans le groupe LL2-FKNhi comparé au groupe LL2-FKNlo à J14. L’expression élevée de FKN était associée à une augmentation du recrutement des monocytes inflammatoires, des cellules Natural Killer (NK), et plus particulièrement des lymphocytes B (LB), constituant un microenvironnement immunopermissif. Elle était également associée à des modifications significatives du niveau d’expression de gènes impliqués dans l’ostéoformation et la régulation de l’immunité.L’effet anti-tumoral de la FKN tendant à s’atténuer au cours du temps, et la proportion de lymphocytes T régulateurs (LTreg) FOXP3+ infiltrant le microenvironnement tumoral des tumeurs LL2-FKNhi étant supérieure à celle des tumeurs LL2-FKNlo, nous avons suspecté leur implication dans cette perte d’effet. Nous avons testé des associations de traitements, capables de stimuler l’immunité anti-tumorale via le blocage de CPI (Ac monoclonaux anti-CTLA4, anti-PD1, anti-PDL1, anti-TIM3), ou capables de bloquer l’activité des LTreg (cyclophosphamide, Ac anti-GITR), en association à une expression élevée de la FKN dans le but de de renforcer et/ou prolonger son effet anti-tumoral. A ce jour, les schémas d’administration que nous avons choisis n’ont pas permis d’obtenir un tel résultat. D’autres protocoles doivent encore être testés.Ces travaux nous ont permis de montrer un effet anti-tumoral de la FKN dans un modèle murin de métastases osseuses de CNPC, d’en préciser les mécanismes sous-jacents et d’identifier de nouvelles pistes d’associations de traitements, prenant en compte le rôle anti-tumoral des LB et pro-tumoral des LTreg dans ce modèle murin
In France, about 50 000 new cases of lung cancer are diagnosed every year. Sixty percent of them are already metastatic. Bone localizations are described in 20 to 40% of cases and they are associated with poor survival (5 to 10 % at 5 years) and impaired quality of life. New therapeutic options are mandatory to improve survival and functional prognosis.A chemokine, the fractalkine (FKN), represents a promising one. It is known for its capacity of leukocytes recruitment and its impact on the bone metabolism. It could be able to restore anti-tumor immunity and to act on osteolysis, when delivered locally. The impact on tumor development is highly complex and depends on the expression of its receptor by tumor cells, its molecular form, the location of the lesion, and the tumor type.We first planned to determine the impact of the FKN on the tumor development within a syngeneic murine model of bone metastasis of lung cancer, using either LL2 lung cancer cell line expressing a low (LL2-FKNlo) or a high level of FKN (LL2-FKNhi).FKN had an anti-tumoral effect, able to reduce the tumor-weight by 73% in the LL2-FKNhi groups, compared to LL2-FKNlo one, at day 14. High level of expression of FKN was associated with an increase in the recruitment of inflammatory monocytes, natural killer cells, and more specifically B lymphocytes (LB). Together, they formed an immunopermissive tumoral microenvironment. We also noted significant modification of expression level of genes involved in osteoformation and regulation of immunity.The FKN anti-tumor effect tended to decrease after day 14. At the same time, we quoted a high level of infiltration of LL2-FKNhi tumors by T regulatory lymphocytes (LTreg). We suspected their implication in this loss of effect.We tried therapeutic associations, able to stimulate anti-tumor immunity through immune checkpoint blockade (monoclonal antibody against CTLA4, PD1, PDL1, or TIM3) or to block LTreg (cyclophosphamide, anti-GITR antibody) in association with high FKN expression. The goal was to prolong and/or to reinforce its anti-tumoral effect.To date, the used administration protocols weren’t able to induce such an effect. Other protocols need to be tested.This work highlighted an anti-tumoral effect of FKN in this murine model of bone metastasis of lung cancer and identified the underlying mechanisms. It pointed out new therapeutics associations options based on the anti-tumoral implication of LB, and pro-tumoral action of LTreg

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Casadei, Beatrice <1986&gt. "Ruolo del Microbiota Intestinale Nella Risposta al Trattamento con Anticorpi anti Checkpoints Immunitari in Pazienti Affetti da Linfoma." Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2021. http://amsdottorato.unibo.it/9789/1/Casadei%20B.%20PhD%20Def.pdf.

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Abstract:

L’interazione tra il sistema immunitario dell’ospite e la cellula tumorale rappresenta uno degli elementi cardine dello sviluppo del clone neoplastico: la capacità della cellula cancerosa di evadere il controllo immunitario sfruttando meccanismi fisiologici come i checkpoint immunitari è alla base di diverse neoplasie, incluse le sindromi linfoproliferative. Lo sviluppo di anticorpi monoclonali che bloccano selettivamente l’interazione tra il recettore trans-membrana PD-1 (programmed death -1) ed i propri ligandi (PD-L1 e PD-L2), rappresenta una delle scoperte terapeutiche più promettenti in ambito onco-ematologico. Nonostante l’importante efficacia antitumorale degli anticorpi anti checkpoint immunitari dimostrata dai differenti studi clinici condotti sia in ambito oncologico che ematologico, una parte dei pazienti, a parità di patologia e di farmaco ricevuto, non risponde alla terapia o sviluppa eventi avversi immuno-relati. La comprensione della variabilità di risposta dimostrata dai pazienti con stessa patologia, sottoposti a stesso trattamento rappresenta pertanto un punto chiave allo scopo di identificare strategie che possano potenziare l’efficacia terapeutica di tali anticorpi, riducendone gli effetti collaterali. Studi recenti hanno evidenziato il ruolo del microbiota intestinale (MI) nel modellare la risposta immunitaria sistemica e, nel contesto neoplastico, nel modificare e mediare l’attivazione del sistema immunitario ad agenti chemio-immunoterapici. È noto che il MI sia un ecosistema plastico che può riorganizzare funzionalità e composizione in maniera adattativa in risposta a diversi fattori ambientali. La struttura individuale del MI e la sua dinamicità temporale possono, pertanto, influenzare l’outcome delle chemio-immunoterapie onco-ematologiche, modulandone l’efficacia e la tossicità. In questo scenario, ipotizziamo che la caratterizzazione longitudinale (pre, durante e post-terapia) del MI di pazienti affetti da linfoma trattati con anticorpi anti-checkpoint inibitori e la sua correlazione con la risposta al trattamento e con lo sviluppo di eventi avversi possa avere un ruolo nel delineare l’outcome di tali pazienti e nell’identificare nuovi criteri di stratificazione del rischio.
Single-agent monoclonal antibodies targeting the immune checkpoint PD-1 (programmed death 1) are an efficient and safe therapeutic option in patients with relapsed/refractory B-cell lymphoma. However, many patients progress or lose response to anti-PD1. Recent studies have highlighted the role of the gut microbiota (GM) in influencing the response to chemo-immunotherapeutic agents. Here, we hypothesize that the longitudinal characterization (pre, during, and post-therapy) of GM of lymphoma patients treated with checkpoint inhibitors and its correlation with treatment response and development of adverse events may have a role in outlining the outcome of such patients and in identifying new risk stratification criteria.

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Zielonka, Elisabeth Maria. "The function of p53 homologs in oocyte meiotic checkpoints and the innate airway immune system." Strasbourg, 2011. http://www.theses.fr/2011STRA6041.

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Abstract:

P53, un important gène suppresseur de tumeur, est muté dans plus de 70% des cancers. Ses paralogues p63 et p73 sont présents chez les mammifères mais diffèrent structuralement de p53. Les femelles ne possèdent qu’un réservoir limité de gamètes bloqués à la naissance au stade dictyé. Durant cette phase, les ovocytes sont très sensibles aux dommages de l'ADN, provoquant l'apoptose et réduisant la fertilité. TAp63α est un acteur clé du maintien de l'intégrité génomique dans les ovocytes. La cassure par irradiation du double brin d'ADN active TAp63α par phosphorylation. Contrairement à TAp63α, p53 reste dans un état dimérique inactif dans les ovocytes arrêtés. En cas d'ADN endommagé, le dimère inactif TAp63α est phosphorylé, formant un tétramère actif par l’assemblage de deux dimères. Dans cet état tétramérique, l’affinité de TAp63α pour l'ADN est plus élevée, conduisant à l'induction de gènes identifiés par profil d'expression génique comme liés à l'apoptose. Pour mieux comprendre l'inflammation bronchique chronique et aiguë, le rôle de p73 dans le système immunitaire inné des voies aériennes est étudié, sachant que le knockdown de p73 chez la souris provoque une inflammation chronique des voies respiratoires. Un modèle in vitro a été créé, différenciant les cellules souches humaines des voies respiratoires supérieures par un système de culture à interface air-liquide, donnant naissance à des cellules ciliées exprimant TAp73 et à des cellules sécrétrices. Le modèle knockout conditionné de TAp73 in vivo et le modèle des voies respiratoires in vitro ont permis d’analyser moléculairement la réponse immunitaire innée des cellules ciliées et de la voie cellulaire impliquant p73
P53 is a major tumor suppressor gene, which is mutated in over 70% of cancer cases. Its two mammalian paralogs, p63 and p73, differ structurally from p53. Females only possess a limited pool of gametes, which all enter dictyate arrest around the time of birth. During this phase, oocytes are extremely sensitive to DNA damage, which causes apoptosis and reduces fertility. TAp63α is a key player in maintaining the genomic integrity in oocytes. The exact mechanism so far remains unknown. It is clear that DNA DSB caused by irradiation activate TAp63α through phosphorylation. We were able to show that, unlike p53 TAp63α in arrested oocytes is kept in an inactive imeric state. In the case of DNA damage, the inactive dimeric TAp63α gets hosphorylated, and thus activated. This leads to a formation together with a econd dimer of a tetrameric TAp63α. In this tetrameric state TAp63α has a igher DNA binding affinity, leading to the induction of apoptosis related enes, as identified by gene expression profiling. He second part pertains to the role of p73 in the innate immune system of he airway. The overall aim is to better understand chronic and acute airway nflammation. Previous work showed that p73 knockdown in mice results in hronic airway inflammation. We developed an in vitro model by differentiating uman upper airway stem cells in an air-liquid interface culture system, which ave rise to both ciliated cells expressing TAp73 and secretory cells. Ogether, the engineering of a conditional TAp73 in vivo model and the in itro airway model permit a molecular analysis of the innate immune response f ciliated cells and the pathway involving p73

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CORTELLINI, ALESSIO. "Studio sul ruolo della storia familiare di neoplasie come fattore predittivo surrogato per l'immunoterapia con inibitori dei checkpoint immunitari PD-1/PD-L1." Doctoral thesis, Università degli Studi dell'Aquila, 2022. http://hdl.handle.net/11697/191960.

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Abstract:

Preliminary phase Background: Tumors related to inherited cancer susceptibility syndromes seem to have an "immune sensitive phenotype" due to DDR genes alterations. We investigated whether family history of cancer (FHC) could be used as surrogate predictor of clinical benefit for PD-1/PD-L1 checkpoint blockade. Methods: A multicenter retrospective study of advanced patients with cancertreated with PD-1/PD-L1 immunotherapy. FHC was collected for both lineal and collateral lines and patients were categorized as follow: FHC-high (in case of at least one cancer diagnoses in both the lineal and collateral family lines), FHC-low (in case of at least one cancer diagnoses, but in only one family line) and FHC-negative. Clinical endpoints of interest were overall survival (OS) and progression free survival (PFS) Results: 822 consecutive patients from 21 centres were enrolled, including non-small cell lung cancer (57.8%), melanoma (23.1%), renal cell carcinoma (16.2%), and others (2.9%). 458 patients (55.7%) were FHC-negative, 289 (35.2%) were FHC-low and 75 (9.1%) FHC-high, respectively. The median follow-up was 15.6 months. FHC-high patients achieved a significantly longer PFS (HR=0.69 [95%CI: 0.48-0.97], p = 0.0379) and OS (HR=0.61 [95%CI: 0.39-0.93], p = 0.0210), when compared to FHC-negative patients. After adjusting for the primary tumour, gender, age, treatment line, number of metastatic sites and ECOG-PS, FHC-high was confirmed an independent predictor for PFS (HR=0.64 [95%CI: 0.45–0.91], p=0.0148) and OS (HR=0.57 [95%CI: 0.37–0.88], p=0.0114). Secondary phase and translational exploratory analysis Methods: We present the outcomes analysis according to FHC in two large multicenter cohorts of patients with metastatic non-small cell lung cancer (NSCLC) receiving either first-line pembrolizumab (PD-L1 expression ≥ 50%) or first-line chemotherapy at 29 European institutions. Patients were categorized as FHC-high and non-FHC-high. To explore the association between somatic DDR genes alteration and FHC, we gathered relevant baseline clinic-pathologic information and targeted DNA tumour sequencing (FoundationOne CDx assay), from a parallel cohort of patients with NSCLC from the participating institutions. 24 genes of interest were selected (MLH1, MSH6, PMS2, ATM, ATR, CHEK1, CHEK2, BAP1, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, PALB2, RAD51, RAD51C, RAD52, FANCA, FANCC, FANCG, FANCL, POLD1, POLE, ERCC4, XRCC2). Results: 728 and 652 patients were included in the pembrolizumab and chemotherapy cohort, respectively. Within the chemotherapy cohort 48.3% of patients received immunotherapy as later line. We performed a perfect random case-control matching between the two cohorts and 607 patients from each cohort were randomly paired on the basis of the FHC, age (< 70 vs. ≥ 70 years old), ECOG-PS (0-1 vs ≥ 2), and burden of disease (≥ 2 vs < two metastatic sites). As compared to FHC-low/negative patients, FHC high were confirmed to have a significantly longer OS (HR=0.67 [95%CI: 0.46-0.95], p = 0.0281), and PFS (HR=0.65 [95%CI: 0.48-0.89]; p = 0.0074) within the pembrolizumab cohort. On the contrary, no significant associations were found between FHC and OS (HR = 0.71 [95%CI: 0.49 – 1.03], p = 0.0756), PFS (HR = 0.52 [95%CI: 0.35 – 0.77], p = 0.0009), and DCR (69.7% vs 63.1%, p = 0.1202), within the chemotherapy cohort. Overall, 118 patients were included in the parallel DDR genes cohort, of which 20 FHC-high (16.9%) and 98 FHC-low/negative (83.1%). The prevalence of at least one DDR genes mutations was 20% (4/20) and 24.5% (24/74) for FHC-low/negative and FHC-high patients (p = 0.6684). Conclusions: FHC-high status identifies NSCLC patients with improved outcomes to pembrolizumab but not chemotherapy, suggesting its role as a surrogate marker for immunotherapy. Somatic DDR genes alterations are not associated with FHC and further prospective investigations with broader germline testing are warranted.

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Ullah, Matti. "Immune Checkpoints in Peritoneal Carcinomatosis : HLA-G, PD-L1 & the Impact of Cancer Therapies." Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2019. http://www.theses.fr/2019SACLS288.

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Abstract:

Carcinomatose péritonéale est un terme utilisé pour désigner la dissémination métastatique généralisée du cancer dans la cavité péritonéale. Il se caractérise par l’accumulation de liquide appelé « ascite » et est considéré comme étant au stade terminal du cancer, car il est difficile à traiter. L'ascite accumulée dans la PC comprend des cellules tumorales, cytokines et cellules immunitaires. Les cellules cancéreuses expriment des protéines spécifiques qui les aident à supprimer les cellules immunitaires et à survivre, appelées points de contrôle immunitaires. Des points de contrôle immunitaires sont présents pour réguler le système immunitaire et sont cruciaux contre la tolérance de soi. PD-1 / PD-L1 et CTLA-4 sont des voies de contrôle immunitaire bien établies adaptées au cancer pour échapper à l'immunité. Récemment, HLA-G a été reconnu comme un point de contrôle et il a été constaté que la survie globale était diminuée dans plusieurs types de cancers solides.Au cours de ma thèse, nous avons évalué l'expression de HLA-G dans la carcinomatose ovarienne. Nous avons constaté que les cellules cancéreuses dans l'ascite de presque tous les patients atteints de carcinomatose ovarienne exprimaient HLA-G. De plus, des taux croissants de sHLA-G1 et de HLA-G5 ont été trouvés dans les ascites. Cette présence de sHLA-G s'est révélée être corrélée positivement avec les Tregs et en corrélation négative avec les cellules T cytotoxiques (CD8) et les cellules NK. De plus, nous avons constaté que les ascites peuvent induire l’expression de HLA-G dans des «Hospicells» via des cytokines inflammatoires. Parmi les cytokines inflammatoires, le TGF-β et IL-1β ont une importance capitale dans l’induction de HLA-G. En outre, nous avons constaté que IL-1β implique la voie NF-κB. Dans une cohorte distincte de carcinomatose péritonéale, composée de patients atteints de PC d'origine différente, nous avons constaté que le groupe de cellules cancéreuses dans l'ascite avait une expression génique hétérogène de PD-L1, CTLA-4 et HLA- G. En outre, nous avons constaté que tous les patients présentaient des taux solubles de HLA-G et PD-L1 dans leur ascite. Cependant, seulement 5 patients présentaient des taux de CTLA-4 solubles dans leur ascite. De plus, nous avons trouvé une très forte corrélation positive entre le niveau de gène de PD-L1 et de CTLA-4, alors qu'aucune corrélation n'a été trouvée pour HLA-G avec PD-11 et CTLA-4 suggérant que HLA-G agit indépendamment des deux points de contrôle immunitaires. En outre, nous avons évalué l'expression de ces points de contrôle immunitaires par des nodules de cancer présents sur la membrane péritonéale. Nous avons trouvé une faible expression de HLA-G et PD-L1, mais la moitié des échantillons étaient fortement positifs pour sHLA-G. Nous avons également constaté que le sHLA-G pouvait être absorbé par l'ascite par la couche mésothéliale. Cette sHLA-G absorbée peut fournir un environnement immunosuppresseur pour la fixation des grappes de cellules cancéreuses à la membrane péritonéale. In vitro, nous avons constaté que l'ascite peut exercer une action immunosuppressive et retarder la lyse des cellules cancéreuses par les cellules immunitaires.De plus, nous avons constaté que la différenciation des cellules cancéreuses se traduit par une augmentation des propriétés immunosuppressives par une expression accrue de HLA-G ou PD-L1. En outre, l'expression de HLA-G et PD-L1 dépend de la phase du cycle cellulaire. Les cellules cancéreuses, si elles sont bloquées dans les cellules mitotiques, expriment des niveaux élevés de HLA-G et de PD-L1, tandis qu'une expression plus faible a été observée en phase G1. Par conséquent, nous suggérons d’éviter l’utilisation d’inhibiteurs de la mitose car ils pourraient augmenter la suppression immunitaire du cancer. De plus, le Ki-67 étant directement lié à l'index mitotique, nous suggérons de développer une échelle de Ki-67 pour évaluer le profil d'immunosuppresseur des patients cancéreux
Peritoneal carcinomatosis (PC) is a term used for widespread metastatic dissemination of cancer to the peritoneal cavity. It is characterized by the accumulation of fluid called “ascites” and is considered a terminal stage of cancer, as it is hard to treat. The overall survival rate for untreated patients is six-months. However, owing to modern techniques like HIPEC, the survival rate can be increased up to five years. The ascites accumulated in PC, consists of tumor cells, cytokines and immune cells. Cancer cells express specific proteins to suppress immune cells activity and their attack, known as immune checkpoints. PD-1/PD-L1 and CTLA-4 are well established immune checkpoint pathways adapted by cancer in evading immunity. Recently, HLA-G has been recognized as an immune checkpoint and has been found to decrease overall survival in several types of solid cancers. We evaluated the expression of HLA-G in ascites from ovarian carcinomatosis. We found that HLA-G is expressed by cancer cells in ascites from all of the patients(n=16) with ovarian carcinomatosis. Moreover, increased levels of sHLA-G1 and HLA-G5 were found in ascites. This presence of sHLA-G isoforms was found to be positively correlated with Tregs and negatively correlated with cytotoxic T-cells (CD8) and NK-cells suggesting the role of HLA-G in immune suppression. Further, we found that ascites can induce the expression of HLA-G in “Hospicells” via inflammatory cytokines. Among the inflammatory cytokines, TGF-β and IL-1β are of crucial importance in HLA-G induction with IL-1β being more potent compared to TGF-β. Further, we found that IL-1β induces HLA-G expression through NF-κB pathway.In a separate cohort of peritoneal carcinomatosis(n=27), consisting of patients with cancer from a different origin, we found that cancer cell cluster in ascites (n=23) had a heterogeneous gene expression of PD-L1, CTLA-4 and HLA-G. Further, we found that all of the patients presented soluble levels of HLA-G in their ascites. However, one patient was negative for soluble PD-L1 and only 5 patients presented soluble CTLA-4 levels in their ascites. This heterogeneity explains why some of the patients respond to immune therapy while others don’t. This also suggests the need for prescreening patients before immune therapy. Moreover, we found a very strong positive correlation (rs=0.793) between gene level of PD-L1 and CTLA-4, while no correlation was found for HLA-G with PD-L1 and CTLA-4 suggesting that HLA-G acts independently of both the immune checkpoints. Also, we evaluated the expression of these immune checkpoints by cells in peritoneal tissue (n=20). We found low expression of HLA-G and PD-L1, but the majority of the samples were found strongly positive for sHLA-G presence. This sHLA-G can provide an immune-suppressive environment for the attachment of the cancer cell clusters to the peritoneal membrane to form cancer nodule. Additionally, we developed an in-vitro cytotoxicity assay to show that the ascites can provide the immune-suppressive action by interfering with immune cell interaction and delaying the lysis of cancer cells by the immune cells.In parallel, we found that the differentiation of the cancer cells results in increased expression of immune checkpoints like HLA-G or PD-L1. This may render these cells more immune resistant and can protect against immune attack. However, in-vivo mice model is needed to study the oncogenic potential of these differentiated cells. Further, we report that the expression of HLA-G and PD-L1 is dependent on the cell cycle phase. The cancer cells, if blocked in mitotic phase express high levels of HLA-G and PD-L1, while lowest expression was observed in G1-phase. Therefore, we suggest avoiding the use of mitotic inhibitors as it may increase the immune suppression of cancer. Moreover, as Ki-67 is directly related to the mitotic index, we suggest developing a Ki-67 scale to evaluate the immune-suppressive profile of cancer patients

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Mestrallet, Guillaume. "Propriétés immunitaires des kératinocytes humains et de leurs précurseurs Human Keratinocytes Inhibit CD4+T-Cell Proliferation Through TGFB1 Secretion and Surface Expression of HLA-G1 and PD-L1 Immune Checkpoints." Thesis, université Paris-Saclay, 2021. http://www.theses.fr/2021UPASL052.

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Abstract:

La peau humaine protège le corps des infections et des blessures. Cela implique des cellules immunitaires et des cellules épithéliales, mais leurs interactions sont encore peu caractérisées. Mon travail montre que les kératinocytes inhibent la prolifération des lymphocytes T CD4 +, et ce même dans des conditions inflammatoires. Cela se fait par la sécrétion de facteurs solubles tels que le TGFB1 ainsi que par l'expression à la surface cellulaire de points de contrôle immunitaires tels que HLA-G et PD-L1. À cet égard, je décris pour la première fois l'expression de HLA-G dans la peau humaine saine et son rôle dans l'immunomodulation tissulaire médiée par les kératinocytes. La surexpression de HLA-G avec un vecteur inductible augmente les propriétés immunomosuppressives des kératinocytes, ouvrant des perspectives pour leur utilisation en thérapie cellulaire dans des contextes allogéniques.Les cellules souches sont essentielles pour le maintien et le renouvellement des tissus, mais leur capacité à se protéger des réactions immunitaires n’est pas encore bien caractérisée. Mon travail montre que les précurseurs de kératinocytes de l'épiderme interfolliculaire sont capables d'inhiber la prolifération des lymphocytes T CD4 +. L’échappement immunitaire des précurseurs de kératinocytes peut être expliquée par une surexpression des points de contrôle immunitaires HLA-G et PD-L1. Ces résultats ouvrent également des perspectives pour étudier l’échappement immunitaire dans le cancer de la peau et les pathologies auto-immunes
Human skin protects the body from infection and injury. It involves immune cells and epithelial cells, but their interactions remain to be explored. Here, we address this point showing that keratinocytes inhibit CD4+ T cell proliferation even under inflammatory conditions. This is done through secretion of soluble factors such as TGF-β as well as cell-surface expression of immune checkpoints such as HLA-G and PD-L1. In this regard, we describe for the first time the expression of HLA-G in healthy human skin and its role in tissue keratinocyte-driven immunomodulation. Overexpression of HLA-G with an inducible vector increases the immunomosupressive properties of keratinocytes, opening perspectives for their use in cell therapy in allogeneic settings.Stem cells are essential for the maintenance and renewal of tissues, but their ability to be protected from immune reactions remains unclear. Here, we show that keratinocyte precursors of the interfollicular epidermis are able to inhibit CD4+ T cell proliferation. The immune escape of keratinocyte precursors may be explained by an overexpression of HLA-G and PD-L1 immune checkpoints. These results indicate prospects for investigating immune escape in skin cancer and autoimmune pathologies

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Giraldo-Castillo, Nicolas. "The Immune Microenvironment in Clear Cell Renal Cell Carcinoma : The heterogeneous immune contextures accompanying CD8+ T cell infiltration in clear cell Renal Cell Carcinoma." Thesis, Paris 6, 2015. http://www.theses.fr/2015PA066321/document.

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Abstract:

Dans cette étude, nous avons tenté de décrypter les mécanismes reliant l’augmentation de lymphocytes infiltrant les tumeurs (LIT) T CD8+ et un pronostic clinique défavorable dans le cancer du rein à cellules claires (ccRCC). Pour cela, nous avons déterminé 1) la relation entre le pronostic associé à l'expression d’immune checkpoints et l’infiltrat de cellules dendritiques (DC) et de LT CD8+ et 2) les caractéristiques phénotypiques des LIT T CD8+. L’expression des immune checkpoints a été déterminée par immunohistochimie dans une cohorte de 135 ccRCC. Nous avons constaté que les densités des cellules exprimant CD8, PD-1 et LAG-3 sont corrélées, et associées à une diminution de PFS et OS. Egalement, les patients dont les tumeurs présentent des densités élevées de cellules PD-1+ et PD-L1 et/ou PD-L2 +, ont le taux de survie le plus faible. Des densités élevées de DC immatures isolées dans le stroma tumoral sont associées à une forte expression d’immune checkpoints et à un faible taux de survie chez ces patients. En revanche, les patients présentant un taux de survie prolongé ont une densité élevée de lymphocytes CD8+, des DC matures au sein de structures lymphoïdes tertiaires, ainsi qu’une faible expression d’immune checkpoints. Nous avons analysé les LIT T CD8+ chez 21 patients ccRCC par Cytométrie de Flux. On a trouvé un groupe de patients (8/21) dont les tumeurs sont caractérisées par la surexpression de marqueurs inhibiteurs (PD1 et TIM3) et de d'activation (CD69 et CD38), par l'expansion des cellules T CD8 + mémoires effectrices et un plus grand potentiel d’agressivité. En résumé, nous avons démontré qu’une densité élevée de LIT T CD8+ dans les ccRCC est accompagnée d’une forte expression d’immune checkpoints et d’une réponse immunitaire mal coordonnée dans un sous-groupe de tumeurs agressives
To decipher the potential mechanisms linking increased CD8+ T cell infiltration with an adverse clinical outcome in ccRCC, in this study we determined: 1) the prognosis associated with the expression of immune checkpoints and its coordination with dendritic cell (DC) and CD8+ cell infiltration, and 2) the phenotypic traits of CD8+ tumor infiltrating lymphocytes. The prognosis associated with CD8+ and DC infiltrations, in addition to the expression of immune checkpoints were investigated in a cohort of 135 ccRCC by quantitative immunohistochemistry. We found that the densities of CD8+, PD-1+ and LAG-3+ cells were closely correlated, and independently associated with decreased PFS and OS. In addition, patients whose tumors presented both high densities of PD-1+ cells and PD-L1+ and/or L2+ tumor cells, displayed the worst clinical outcome. High densities of immature DC isolated in the tumour stroma were associated with high expression of immune checkpoints and patients’ poor clinical outcome. In contrast, the presence of mature DC within Tertiary Lymphoid Structures identified, among the tumours with high CD8+-TIL densities, those with low expression of immune checkpoints and prolonged survival. We also investigated the phenotype of freshly isolated CD8+TIL in 21 ccRCC by flow cytometry. We found a group tumors (8/21) characterised by the over-expression of inhibitory (PD-1 and TIM-3) and activation markers (CD69 and CD38), the expansion of the effector memory cell subpopulation (CCR7-CD45RA-), and a trend toward more aggressive features. In summary, we demonstrated that the infiltration with CD8+ TIL in ccRCC is accompanied by the enhanced expression of immune checkpoints and a poorly coordinated immune response in a subgroup of aggressive tumors

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Arakelian, Tsolère. "Impact of Targeting the Autophagy Related Gene Beclin 1 on the Immune Landscape of Melanoma." Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2018. http://www.theses.fr/2018SACLS193.

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Abstract:

L'immunothérapie basée sur le blocage des points de contrôle immunitaire (ICBs) est un traitement prometteur pour les patients atteints de mélanome ; cependant, seule une petite sous-population en tire un bénéfice à long terme. Un des défis pour améliorer l'efficacité et étendre le bénéfice des ICBs aux patients non répondeurs est de concevoir des approches innovantes permettant de transformer les tumeurs dites "froides ou désertes pour les cellules immunitaire" en tumeurs dites "chaudes ou infiltrées par les cellules immunitaires" qui sont éligibles aux ICBs. Nous avons étudié l'impact du ciblage du gène de l'autophagie Beclin1 sur le paysage immunitaire des tumeurs de mélanome B16-F10. Nos résultats ont démonté que ce ciblage inhibait significativement la croissance tumorale B16-F10 et augmentait l'infiltration des leucocytes CD45+. Le phénotypage immunitaire a révélé une augmentation de l'infiltration de cellules NK (Natural Killer) actives, de macrophages inflammatoires et résidents de type 1, de cellules dendritiques et de lymphocytes T CD8+ actifs. L’inhibition de la croissance tumorale Becn1- n'était plus observée par la déplétion des CD8+ de l'hôte, soulignant ainsi leur rôle dans le contrôle du développement de ces tumeurs. Nos résultats ont démontré que La régulation du paysage immunitaire des tumeurs Becn1- était associée à une modulation du réseau de cytokines/chémokines dans le microenvironnement tumoral (TME). Ainsi, les tumeurs Becn1- présentaient une signature de cytokines inflammatoires (comprenant CCL5, CXCL10 et IFNg) qui pourrait être responsable de l'établissement de microenvironnement inflammatoire permissif aux cellules CD8. Nous avons révélé que la surexpression de l'IFNg dans le TME des tumeurs Becn1- était responsable de l'induction de PD-L1 sur les cellules tumorales par la voie d'activation JAK/STATs. En conclusion, cette étude met en évidence Beclin1 comme une cible majeure, capable d'induire l'infiltration des cellules effectrices immunitaires dans les mélanomes en induisant une signature inflammatoire. Elle fournit également la preuve de concept pour combiner des inhibiteurs d'autophagie avec les ICBs comme une approche de pointe pour améliorer leur efficacité
Immune Checkpoint Blockades (ICBs)-based immunotherapy has emerged as a promising treatment for melanoma patients; however only a small subset of patients reaps a long term benefit. One of the major challenges to enhance the efficacy and extend the benefit of ICBs to non-responder patients is to design innovative approaches allowing the switch of “immune desert cold tumors” to “immune infiltrated hot tumors" which are eligible for ICB-based therapies. Here, we investigated the impact of targeting the early autophagy gene Beclin1 on the immune landscape of B16-F10 melanoma tumors. We found that targeting Beclin1 (Becn1-) significantly inhibited B16-F10 tumor growth and increased the infiltration of CD45+ leukocytes into the tumor bed. Immune phenotyping revealed an increased infiltration of active Natural Killer (NK) cells, inflammatory and resident type 1 macrophages, dendritic cells, and active CD8+ T lymphocytes. The inhibition of Becn1- tumor growth was no longer observed by depleting host CD8+ T cells, thus highlighting their major role in the control of Becn1- B16-F10 tumor development. We showed that Beclin1-dependent regulation of the immune landscape was associated with profound modulation of the cytokine/chemokine network in the tumor microenvironment (TME). Importantly, we revealed that Becn1- tumors displayed an inflammatory cytokine signature (comprised, but not restricted to, CCL5, CXCL10 and IFNg) that could be responsible for the switch from cold non T-inflamed to hot T-inflamed tumors. Mechanistically, we reported that the overexpression of IFNg in Becn1- TME was responsible for the induction of Programed Death ligand-1 (PD-L1) on tumor cells through the activation of JAK/STATs pathway. Overall, this study highlights Beclin1 as a valuable target, able to drive immune effectors cells into the melanoma tumors by inducing an inflammatory signature. This study provides the proof of concept for combining drugs inhibiting early autophagy process along with ICBs as a cutting-edge approach to improve their efficacy

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Xie, Wei. "Transcription Inhibitor Lurbinectedin and Oncolytic Peptide LTX-401 trigger Immunogenic Cell Death and Synergize With Immune Checkpoint Blockade Lurbinectedin Synergizes With Immune Checkpoint Blockade To Generate Anticancer Immunity Tumor Lysis With LTX-401 Creates Anticancer Immunity Autophagy Induction by Thiostrepton Improves the Efficacy of Immunogenic Chemotherapy Oncolysis With DTT-205 and DTT-304 Generates Immunological Memory in Cured Animals." Thesis, université Paris-Saclay, 2020. http://www.theses.fr/2020UPASL072.

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Abstract:

Le cancer est la deuxième cause de décès dans le monde. Malgré l'existence des traitements standards, le développement et la recherche de stratégies thérapeutiques innovantes et de médicaments est toujours nécessaire. La combinaison des médicaments induisant la mort cellulaire immunogène (ICD) et l'inhibition des points de contrôle immunitaire (ICB), semble être un protocole prometteur. Dans cette thèse, nous avons démontré que la Lurbinectedine, un inhibiteur de la transcription nouvellement approuvé pour le traitement du cancer du poumon récidivant, déclenche les caractéristiques de l'ICD dans quatre différentes lignées cellulaires humaines et murines in vitro. Vaccinée par des cellules de fibrosarcome traitées par la lurbinectedine, les souris immunocompétentes sont protégées du rechallenge des tumeurs syngéniques. La lurbinectedine limite la croissance du fibrosarcome transplanté d'une manière immunodépendante. Dans les souris, le fibrosarcome murin (MCA205) transplanté et le cancer du sein, induit par des hormones en combinaison avec des cancérigènes, ont été sensibilisés par la lurbinectedine aux deux ICB : PD-1 et CTLA-4. Il convient de noter que la mémoire immunologique à long terme a été générée chez des souris guéries. En outre, nous avons évalué la capacité anticancéreuse de LTX-401, un peptide oncolytique conçu pour l'immunothérapie locale. Les injections intratumorales séquentielles de LTX-401 retardent considérablement la croissance des tumeurs sous-cutanées MCA205 et TC-1 chez un hôte immunocompétent, mais montrent un effet thérapeutique limité sur les tumeurs syngéniques abscopales. Une seule administration de LTX-401 augmente l'efficacité de l'ICB anti-CTLA-4 ou anti-PD-1 + anti-CTLA-4. De plus, le traitement séquentiel avec LTX-401 et les deux ICB présente une immunité antitumorale systémique à la fois contre la tumeur traitée et la tumeur abscopale. En conclusion, la lurbinectedine et le LTX-401 induisent la mort cellulaire immunogène des cellules cancéreuses et renforcent les effets anticancéreux des inhibiteurs de points de contrôle immunitaires. Ces résultats jettent les bases expérimentales de traitements combinés et peuvent faciliter les conceptions d'essais cliniques
Cancer is the second leading cause of death worldwide, despite the existence of standard treatment, innovative therapeutic strategies and drugs are still in urgent demand. The combination of immunogenic cell death (ICD) inducing drugs and immune checkpoint blockade (ICB) seems to be a promising modality. In this thesis, we demonstrated Lurbinectedin, a transcription inhibitor newly approved for relapsed lung cancer treatment, triggers hallmarks of ICD in four different human and murine cell lines in vitro. Vaccinated with Lurbinectedin-treated fibrosarcoma cell protects immunocompetent mice from rechallenge with syngeneic tumours. Lurbinectedin restrains transplanted fibrosarcoma growth in an immune dependent manner. Both transplanted MCA205 cancer and hormone/carcinogen induced breast cancer were sensitized by Lurbinectedin to PD-1 and CTLA-4 double ICBs. Of note, long-term immunological memory was generated in cured mice. Further, we evaluated the anticancer capacity of LTX-401, an oncolytic peptide designed for local immunotherapy. Sequential intratumoral injections of LTX-401 dramatically retards subcutaneous MCA205 and TC-1 tumour growth in immunocompetent host, yet shows limited therapeutic effect of anti-CTLA-4 or anti-PD-1/anti-CTLA-4 ICBs. Moreover, sequential LTX-401 treatment with double ICBs exhibits systemic antitumor immunity to both treated and abscopal tumour. In conclusion, lurbinectedin and LTX-401 induce cancer cell immunogenic cell death and enhance the anticancer effects of immune chekcpoint blockade. These results lay the experimental foundation of combination regiments and may facilitate the clinical trial design

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Girard, Pauline. "Pathophysiologie des pDCs et des Lymphocytes Tγδ en contexte de mélanome, et potentiel de leur interaction pour le développement de nouvelles thérapies The features of circulating and tumor-infiltrating gdT cells in melanoma patients display critical perturbations with prognostic impact on clinical outcome Potent Bidirectional Cross-Talk Between Plasmacytoid Dendritic Cells and γδT Cells Through BTN3A, Type I/II IFNs and Immune Checkpoints." Thesis, Université Grenoble Alpes, 2020. http://www.theses.fr/2020GRALV042.

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Abstract:

.Les pDCs et Tγδ ont des rôles cruciaux dans l’initiation et l’orientation des réponses immunitaires. Leurs fonctions uniques, leur grande plasticité et leur capacité d’interagir avec de nombreux acteurs immunitaires leur permettent de créer un lien entre l’immunité innée et l’immunité adaptative. Elles contribuent donc grandement aux réponses immunitaires protectrices et pathogéniques, et sont de ce fait très prometteuses pour le développement d’immunothérapies anti-tumorales, autant en tant que vecteurs que cibles. Cependant, les lymphocytes Tγδ n’ont pas été étudiés de manière approfondie en contexte de mélanome, et les interactions entre pDCs et Tγδ n’ont été explicitées ni en contexte sain, ni en contexte mélanome, ou le contrôle immunitaire de la tumeur ‡ long terme est encore un défi. Nous avons réalisé une étude détaillée du phénotype et de la fonction des lymphocytes Tγδ circulant et infiltrant le mélanome, et analysé leur impact sur l’évolution clinique. Nous avons aussi caractérisé les interactions bidirectionnelles entre les pDCs et les Tγδ issus de sang de donneurs sains, et de sang ou de tumeur de patients. Nous avons mis en évidence que le mélanome détourne les fonctions effectrices des Tγδ dans le but d’échapper au contrôle immunitaire, et que les caractéristiques des Tγδ issus de sang ou de tumeurs de patients peuvent étre des bio-marqueurs prometteurs d’évolution clinique. Nous avons également montré que les interactions entre pDCs et Tγδ sont médiées par les IFNs de type I et II et par le récepteur BTN3A, essentiel pour l’activation des Td2+, et sont dérégulées en contexte de mélanome. L’administration de cytokines et d’anticorps ciblant les points de contrôle immunitaire peut rétablir des interactions fonctionnelles entre les deux populations cellulaires. De façon intéressante, nous avons observé une augmentation de l’expression de BTN3A sur les pDCs et Tγδ issus de sang de patients ou de tumeurs, tout en soulignant une potentielle dysfonction de cette molécule. Notre étude révèle que le mélanome détourne les interactions entre pDCs et Tgd notamment via la dérégulation de BTN3A. De tels résultats motivent l’exploitation de ces effecteurs immunitaires ainsi que de leur synergie, pour développer de nouvelles approches thérapeutiques exploitant leur potentiel anti-tumoral tout en évitant leur détournement par la tumeur pour améliorer l’évolution clinique des patients. Nos découvertes soutiennent l’exploitation de ces partenaires puissants et prometteurs pour élaborer de nouvelles stratégies thérapeutiques et restaurer des réponses immunes appropriées en contexte de cancer, infections et auto-immunité
Both pDCs and γδT cells harbor critical roles in immune responses induction and orientation. Their unique features, high functional plasticity and ability to interact with many immune cell types allow them to bridge innate and adaptive immunity. They actively contribute to protective and pathogenic immune responses, which render them very attractive both as targets and vectors for cancer immunotherapy. Yet, γδT cells have not been extensively explored in melanoma, and despite strategic and closed missions, cross-talks between pDCs and γδT cells have not been deciphered yet, neither in healthy context nor in cancers, especially in melanoma where the long-term control of the tumor still remains a challenge. We provided here a detailed investigation of the phenotypic and functional properties of circulating and tumor-infiltrating γδT cells in melanoma patients, as well as their impact on clinical evolution. We also characterized the bidirectional cross-talks between pDCs and γδT cells both from healthy donor’s blood, patient’s blood and tumor micro-environment. Our study highlighted that melanoma hijacked γδT cells to escape from immune control, and revealed that circulating and tumor-infiltrating γδT cell features are promising potential biomarkers of clinical evolution. We also demonstrated crucial bidirectional interactions between these key potent immune players though type I and II IFN and BTN3A that are dysfunctional in the context of melanoma. Reversion of the dysfunctional bidirectional cross-talks in melanoma context could be achieved by specific cytokine administration and immune checkpoint targeting. We also revealed an increased expression of BTN3A on circulating and tumor-infiltrating pDCs and γδT cells from melanoma patients but stressed out its potential functional impairment.Thus, our study uncovered that melanoma hijacked pDCs/ γδT cells bidirectional interplay to escape from immune control, and pointed out BTN3A dysfunction. Such understanding will help harnessing and synergizing the power of these potent immune cells to design new therapeutic approaches exploiting their antitumor potential while counteracting their skewing by tumors to improve patient outcomes. Our findings pave the way to manipulate these potent and promising cell partners to design novel immunotherapeutic strategies and restore appropriate immune responses in cancers, infections and autoimmune diseases

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Lachaud, Sophie. "Régulation de l'expression de PD-L1 dans le mélanome : identification de cibles thérapeutiques au moyen d’un crible génétique pour traiter le mélanome cutané TIE1 Regulates PD-L1 Expression in Melanoma." Thesis, université Paris-Saclay, 2020. http://www.theses.fr/2020UPASL065.

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Abstract:

Le mélanome cutané est une tumeur qui se développe à partir de cellules épidermiques appelées mélanocytes. Bien qu’il ne représente qu’environ 1% des cancers cutanés, le mélanome est responsable de 75% des décès dus aux cancers de la peau. L’agressivité du mélanome est liée à son très fort potentiel métastatique et une fois qu’il est disséminé les chances de survie diminuent dramatiquement. Le traitement par chirurgie est efficace lorsque le diagnostic est précoce. Mais, dans les cas de mélanomes non résécables ou métastatiques, les traitements offerts aux patients étaient jusqu’à récemment très limités.L’arrivée des immunothérapies pour le traitement des stades avancés du mélanome a suscité beaucoup d’espoirs. Ces anticorps monoclonaux agissent en stimulant le système immunitaire afin d’éliminer des cellules cancéreuses. Les plus récents et les plus efficaces sont ceux qui ciblent l’axe “programmed cell death protein 1” (PD-1/PD-L1). Le rôle principal de du point de contrôle immunitaire PD-1 est de limiter l’activité des cellules T périphériques lors d’une réponse immunitaire. En effet, l’activation des cellules T par l’interaction des TCR avec des complexes CMH/peptides spécifiques conduit à la sécrétion d’IFNγ. Ces cytokines vont stimuler l’expression de PD-L1 et PD-L2 à la membrane plasmique des cellules environnantes. Lorsque PD-1 est engagé par PD-L1, son ligand prédominant, il s’ensuit un signal qui inhibe des lymphocytes T CD8+. Cette boucle d’autorégulation atténue ainsi la réponse des cellules T et limite l'ampleur des lésions tissulaires pouvant être entraînées par une réponse immunitaire excessive. Certaines cellules cancéreuses, dont le mélanome qui est très immunogène, sont capables de mettre à profit ce système en surexprimant PD-L1 pour inhiber les fonctions effectrices et la prolifération des lymphocytes T CD8+ et ainsi échapper au système immunitaire. En empêchant l’interaction de PD-1 avec PD-L1, les anticorps monoclonaux dirigés contre l’un ou l’autre des partenaires conduisent à une restauration, au moins partielle, de l’activité des cellules T contre les cellules cancéreuses et conduit ainsi à une régression tumorale. La plupart des mélanomes expriment un niveau basal de PD-L1 faible, qui est fortement augmentée par l’IFNγ;, produit notamment par les lymphocytes T CD8+. Par conséquent, on peut supposer qu’en prévenant l’expression de PD-L1 induite par IFNγ, il est possible de prolonger la réponse des lymphocytes T effecteurs et de limiter ainsi la progression tumorale à la manière des anti-PD-1/PD-L1.Mon projet de thèse a eu pour but d’identifier les régulateurs positifs de l’expression de PD-L1 à la membrane plasmique des mélanomes par une méthode de crible génétique, en restreignant notre étude aux gènes pertinents d’un point de vue thérapeutique. Ce crible qui repose sur une librairie de shARN ciblant les gènes codant pour des protéines dont l’inhibiteur est déjà connu ou ayant une structure ou une activité qui permet le développement d’un inhibiteur pharmacologique. L’analyse des cribles par bioinformatique a permis d’identifier de nouveaux régulateurs positifs de l’expression de PD-L1 à la membrane plasmique qui pourront servir de cibles pharmacologiques pour de nouvelles thérapies visant à prévenir l’expression de PD-L1 dans les mélanomes
Cutaneous melanoma arises from melanocytes, the pigment-producing cells of the skin. is responsible for approximately 75% of deaths due to skin cancers. This tumor account for approximately 1% of cutaneous melanoma, but is responsible for 75% of deaths due to skin cancer. Its aggressiveness is coming from its highly metastatic potential and once it is disseminated, chances of survival decrease drastically. Treatment by surgery is efficient when it is diagnosed early. Though, until recently, for metastatic or unresectable melanoma, treatments were quite limited.The arrival of immunotherapies to treat advanced melanoma arouse a lot of hope. These monoclonal antibodies boost the immune system in order to kill cancer cells. The most recent and efficient are the ones targeting the programmed cell death protein 1 or its ligand (PD-1/PD-L1). The main role of PD-1 immune checkpoint is to limit the activation of engaged peripheral T cells. Indeed, the activation of T cells by the interaction of its TCR with MHC/peptide complexes leads to IFNγ; secretion. This cytokine will induce the expression of PD-L1 and PD-L2 at the plasma membrane of surrounding cells. The engagement of PD-1 with its main ligand PD-L1 leads to the inhibition of CD8+ T lymphocytes. This feedback loop attenuates T-cell responses and limits the extent of immune-mediated tissue damage that can happen with an excessive immune response. Some cancer, including melanoma which is highly immunogenic, escape the immune system by taking advantage of this mechanism to overexpress PD-L1 and inhibit effector functions and proliferation of CD8+ T lymphocytes. Immunotherapies targeting PD-1 or PD-L1 with monoclonal antibodies were then deployed to disrupt the interaction between the two partners and restore, at least partially, T-cell activity against cancer cells and drive to tumor regression. Most of the time, basal PD-L1 expression in melanoma is low and is strongly increased by IFNγ, produced by immune cells like CD8+ T lymphocytes. Thus, preventing IFNγ-induced PD-L1 expression would restore the effector functions of LT CD8+ and avoid tumor progression as anti-PD-1/PD-L1.This aim of my thesis project was to make use of a genetic screen to identify positive regulators of the expression of PD-L1 at the plasma membrane of melanoma with a genetic screen by focusing on druggable genes. This screen was based on a shRNA library targeting genes coding for a protein for which an inhibitor already exists or harboring a structure or an activity that could lead to drug development. The bioinformatic analysis led to the identification of new regulators that positively regulate PD-L1 at the plasma membrane of melanoma that could serve as therapeutic targets for melanoma treatment

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Lequeux, Audrey. "Impact du ciblage du domaine de liaison de HIF-1α avec HIF-1β sur le paysage immunitaire du mélanome Targeting HIF-1 Alpha Transcriptional Activity Drives Cytotoxic Immune Effector Cells into Melanoma and Improves Combination Immunotherapy Hijacker of the Antitumor Immune Response: Autophagy is Showing its Worst Facet Impact of Hypoxic Tumor Microenvironment and Tumor Cell Plasticity on The Expression of Immune Checkpoints Improving Cancer Immunotherapy by Targeting the Hypoxic Tumor Microenvironment: New Opportunities and Challenges." Thesis, université Paris-Saclay, 2020. http://www.theses.fr/2020UPASL026.

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Abstract:

L’hypoxie est une caractéristique majeure des tumeurs solides et elle est capable d’induire un microenvironnement tumoral immunosuppressif. Nous avons étudié l’impact de l’inhibition du domaine de liaison de HIF-1α avec HIF-1β sur le paysage immunitaire du mélanome murin B16-F10. Le ciblage de ce domaine de liaison inhibe l’activité transcriptionnelle de HIF-1α dans les cellules B16-F10 in vitro. In vivo, l’inhibition de l’activité transcriptionnelle de HIF-1α dans le mélanome B16-F10 montre une diminution significative de la croissance tumorale et une amélioration consistante de la survie des souris. La croissance tumorale est restaurée dans les souris immunodéficientes, soulignant l’importance du système immunitaire dans le contrôle de la croissance du mélanome. L’étude du phénotype des cellules immunitaires intra-tumorales révèle une augmentation de l’infiltration des cellules Natural Killer (NK), des lymphocytes T CD4+, des T régulateurs, des macrophages de type M1 et M2 et des cellules dendritiques lorsque l’activité transcriptionnelle de HIF-1α est inhibée. La déplétion de cellules NK dans notre modèle expérimental restaure la croissance tumorale, soulignant le rôle des NK dans la surveillance du mélanome B16-F10. Le changement du paysage immunitaire observé dans notre modèle corrèle également avec une modification du réseau de cytokines caractérisé par une nette augmentation de la sécrétion de CCL5 et de CCL2. En conclusion, cette étude met en évidence le rôle de HIF-1α dans le contrôle de la croissance et le remodelage du paysage immunitaire du mélanome B16-F10. Elle indique la possibilité de combiner un inhibiteur de HIF-1α avec une immunothérapie basée sur le blocage des points de contrôle immunitaire pour étendre leur efficacité et leur bénéfice thérapeutiques à un plus grand nombre de patients cancéreux
Hypoxia is a major feature of solid tumors and is able to induce a tumor immunosuppressive microenvironment. Here, we investigated the impact of inhibiting of the binding domain of HIF-1α to HIF-1β on the immune landscape of B16-F10 melanoma. Targeting this binding domain inhibits the transcriptional activity of HIF-1α in B16-F10 cells in vitro. In vivo, inhibiting the transcriptional activity of HIF-1α in B16-F10 melanoma shows a significant decrease in tumor growth and a consistent improvement in mice survival. Tumor growth is restored in immunodeficient mice, highlighting the critical role of the immune system in controlling melanoma growth. The phenotyping of intra-melanoma immune cells reveals an increase in Natural Killer (NK), CD4+ T cells, regulatory T cells, M1 and M2 macrophages and dendritic cells. NK depletion restores tumor growth in our experimental model, highlighting the role of NK cells in melanoma surveillance. The alteration of the immune landscape that we observed also correlates with a clear increase of secreted CCL5 and CCL2. In conclusion, this study highlights the role of HIF-1α in controlling the growth and the immune landscape of B16-F10 melanoma. It indicates the opportunity of combining HIF-1α inhibitors with immune checkpoint blockade to extend immune checkpoint blockade efficiency and therapeutic benefit to a larger number of cancer patients

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Ben, Saad Elham. "Étude de l'endocytose du récepteur PD-1 dans les lymphocytes T humains." Thesis, 2019. http://hdl.handle.net/1866/23924.

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Abstract:

PD-1 (Programmed Cell death protein -1) est un récepteur co-inhibiteur exprimé à la surface de lymphocytes T (LT) activés. Ce récepteur joue un rôle important dans le maintien de la tolérance périphérique tout en protégeant contre les maladies auto-immunes et inflammatoires. Cependant, une expression élevée et permanente de PD-1 et ses ligands PD-L1 et PD-L2 (PD-Ls) perturbe la réponse immunitaire contre les pathogènes et les cellules tumorales. Les inhibiteurs de points de contrôle immunitaires (ICI) ciblant l'axe PD-1/PD-Ls représentent aujourd’hui une avancé majeure dans le traitement de différents types de cancer, tant sur le plan de l’efficacité que de la tolérance. Le nivolumab (nivo) et le pembrolizumab (pembro) sont deux anticorps monoclonaux (AcM) anti-PD-1 qui bloquent l’interaction de PD-1 avec ses ligands. Ces AcM ont montré des résultats prometteurs dans le traitement de multiples types de cancers comme le mélanome, le cancer bronchique non à petites cellules, le carcinome à cellules rénales, etc. Malgré l’importance thérapeutique de nivo et de pembro dans le cancer, aucune étude n’a défini le devenir de PD-1 après la liaison à ces deux AcM. L’objectif de cette étude a été donc d’évaluer l’endocytose de PD-1 suite au liaison à des AcM anti-PD-1 (clone J110, nivo, pembro) et de déterminer s’il y a différence entre nivo et pembro vis à vis leur capacités à induire l'internalisation de PD-1. L’étude de l’endocytose de PD-1 a été réalisé sur des LT humains obtenus à partir du sang périphérique de donneurs sains et activés avec des Ac anti-CD3/anti-CD28 ou concanavaline A afin d’exprimer le récepteur PD-1. L’analyse des données par cytométrie en flux a montré que l’engagement de PD-1 avec l’Ac anti-PD-1 (clone J110) induit son endocytose dans les LT humains et que 50% de la totalité de PD-1 de surface est internalisé dans les premiers 30 minutes suivant l’incubation de cellules à 37°C, suivi d’un taux d’endocytose plus lent (56% en 60min). Notre étude a montré également que la liaison de nivo et de pembro au PD-1 induit son endocytose et que la plupart de récepteur est internalisée dans les 30 min suivant l’incubation de cellules à 37°C. Toutefois, 32 à 50% des récepteurs sont résistants à l’endocytose. L’analyse comparative de nivo et de pembro a révélé une différence statistiquement significative (p=0.03) entre le taux d’internalisation du complexe PD-1/nivo et celui du PD-1/pembro (46% versus 25% en 30min, respectivement). Même à des concentrations élevées de pembro, la liaison de nivo induit une meilleure internalisation de PD-1, ce qui suggère que nivo pourrait être plus efficace. Bien que les ICI comme nivo et pembro sont connus de bloquer l’interaction de PD-1 avec ses ligands, PD-L1 et PD-L2, notre étude a montré pour la première fois que ce deux AcM induisent aussi l’endocytose du récepteur PD-1 dans les LT humains avec des taux différents, et que 32% à 50% de récepteurs PD-1 sont résistants à l’endocytose. Ces résultats pourraient être exploités pour améliorer l’internalisation de PD-1 dans les LT humains et par la suite augmenter les potentiels thérapeutiques de nivolumab et de pembrolizumab dans le traitement du cancer. Mots clés : Récepteur PD-1, Ligands de PD-1, Lymphocytes T, Inhibiteurs de point de contrôle immunitaires, Anticorps anti-PD-1, Nivolumab, Pembrolizumab, Endocytose, Cancer
PD-1 (Programmed Cell death protein -1) is a co-inhibitory receptor expressed on the surface of activated T cells. It plays an important role in maintaining peripheral tolerance and protecting against autoimmune and inflammatory diseases. However, permanent expression of PD-1 and its ligands PD-L1/ PD-L2 (PD-Ls) disrupts the immune response against pathogens and tumor cells. Immune checkpoint blockade (ICB) targeting the PD-1/PD-Ls axis has revolutionized the treatment of many cancers. Nivolumab (nivo) and pembrolizumab (pembro) are two anti-PD-1 monoclonal antibodies (mAb) that block the interaction between PD-1 and its ligands. They have shown promising results in the treatment of multiple types of cancers such as melanoma, non-small cell lung cancer, renal cell carcinoma, etc. Surprisingly, despite the success of anti-PD-1 in cancer immunotherapy, no-one has defined the destiny of surface PD-1 following antibody binding. Therefore, the objective of my master thesis was to define the fate of surface PD-1 following antibody binding and whether different anti-PD-1 Abs in the clinic differ in their ability to induce PD-1 endocytosis. The study of PD-1 endocytosis was performed on human T lymphocytes obtained from peripheral blood of healthy donors and activated with anti-CD3/anti-CD28 Ab or concanavalin A to express PD-1 receptor. Data analysis by flow cytometry showed that following anti-PD-1 Ab binding, 50% of PD-1 becomes endocytosed by 30min. In addition, we found that the PD-1 receptor is internalised upon its engagement with nivo and pembro and that most of the receptor is endocytosed within 30 min. However, 32 to 50% of the receptors are resistant to endocytosis. The comparative analysis of nivo and pembro has revealed a statistically significant difference (p=0.03) between the internalisation rate of the PD-1/nivo complex versus PD-1/pembro (46% versus 25% by 30min, respectively). Even at high concentrations of pembro, nivo induces better internalization of PD-1, suggesting that nivo could be more effective than pembro. Our study showed for the first time that ICB involves not only in the blockade of PD-1/PD-Ls interaction, but also in the endocytosis of PD-1 receptors from the surface of human T-cells, which differs between nivolumab and pembrolizumab. These results could be exploited to increase the therapeutic potential of nivolumab and pembrolizumab in cancer treatment. Keywords: PD-1 receptor, PD-1 ligands, T lymphocytes, Immune checkpoint blockade, Anti-PD1 antibodies, Nivolumab, Pembrolizumab, Endocytosis, Cancer

Dissertations / Theses on the topic 'Checkpoint immunitaire'

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