Dissertations / Theses on the topic 'CDKIs'

Cyclin-dependent kinases (CDKs) are a family of serine/threonine protein kinases that play a fundamental role in the regulation of eukaryotic cell-cycle progression, particularly at cell- cycle checkpoints. Cell-cycle alterations result in a loss of checkpoint function, which correlates with increased or aberrant CDK activity in human tumours. CDK inhibitors are therefore recognised to have potential therapeutic effects in the treatment of cancer and other proliferative diseases. This research project centres on the medicinal chemistry of a new class of CDK inhibitors, based on the 2,6-diamino-4-alkoxy- 5-nitrosopyrimidine pharmacophore (77). Previous studies, employing a structure-based inhibitor design approach, have resulted in the identification of 2-arylamino-06- alkylguanines exhibiting potent inhibitory activity against CDK2, and exemplified by NU6102 (31; IC50 = 5 nM). Structure-activity relationship studies revealed that the purine pharmacophore is not a prerequisite for CDK-inhibitory activity. Thus, comparable activity resides in the corresponding pyrimidines, where an intramolecular hydrogen bond between a 5-nitroso substituent and a 6-amino group confers a 'purine-mimetic' structure (164; CDK2/A, IC50 = 1 nM). Guided by results obtained previously for the corresponding 06-alkylguanines, systematic structural modifications have been made at the pyrimidine 2-, 4- and 5- positions, via the development and optimisation of efficient synthetic pathways Replacement of the 5-nitroso substituent of the parent inhibitors (77, 164) by groups that are more acceptable from a toxicological standpoint has been a prominent target of this work. Formyl, ketone and oxime functionalities have been successfully introduced at the pyrimidine 5-position, while different alkoxy and arylamino substituents were introduced at the pyrimidine 4-position and 2-position, respectively, to probe additional potential interactions within the ATP ribose-binding domain and CDK2 specificity pocket. The synthesis and structure-activity relationships for this new series of CDK inhibitors have been investigated, as exemplified by (220) (CDK2/A, IC50 = 49 nM), (239) (CDK2/A, IC50 = 7.4 nM) and (109) (CDK2/A, IC50 = 23.3 μM). These studies have resulted in the identification of novel compounds, such as (225), exhibiting improved potency against CDKs, with sub-nanomolar inhibitory activity versus CDK2/A (IC5o = 0.77 nM) and good cell growth inhibition properties (G150 = 0.57 μM).

Cette thèse est divisée en cinq parties. La première partie traite de la chimie des ions iminiums. Après une brève introduction sur leur découverte, sont présentées leurs préparations et leurs applications dans divers champs de la chimie, en particulier dans la synthèse de produits naturels. En suite nous traiterons des ions N-acyl iminiums, en évoquant les mécanismes de leur formation, les diverses applications et leurs particularités. La première partie se termine par la présentation des différentes voies d'accès à des structures du type isoindoquinolinonique obtenues notamment par formation d’ions d'acyl iminiums. La seconde partie de la thèse concerne une étude méthodologique de la réaction de cyclisation présentée par le groupe du Prof. Y. Troin. Cette réaction, basée sur un intermédiaire N-acyl iminium, permet la synthèse d'un système de type isoquinolone. La réaction est une cycloaddition intermoléculaire d’une cétone protégée, et le carboxy benzaldéhyde. entre une amine primaire en Nous avons repris ces premiers travaux et avons étendu la méthode à toute une série de noyaux comme des systèmes benzéniques différemment substitués (avec des groupes -OMe en différentes positions du cycle), des systèmes polyaromatiques (naphtalène) et des hétérocycles (pyridine, quinoléine etc. . . ). La différence de réactivité des différents systèmes est discutée, et une méthode alternative de hydroxy lactames est proposée. synthèse passant par des Dans la troisième partie l’application de nos recherches à la problématique de la chimiothérapie anticancéreuse est abordée. Après avoir rappelé les principales causes, les mécanismes et quelques notions sur le cycle cellulaire et sur quelques médicaments utilisables à ce jour, nous évoquerons le rationnel permettant l’utilisation de la 10-amino-1,3,4,10b-tétrahydro-2H-pyrido[2,1-a]isoindol-6-one pour arriver à une série de diarylurées, inhibiteurs potentiels de kinases dépendantes des cyclines. La quatrième partie traite donc du chemin synthétique utilisé pour atteindre ces objectifs, et se termine par les résultats des tests biologiques et l’étude des premières relations entre structure et activité. Enfin, des perspectives de travail sont évoquées et une conclusion générale est proposée.

Les kinases cycline-dépendantes (CDKs) sont des régulateurs essentiels du cycle de division cellulaire (CDK1, 2, 3, 4, 6, 7), de l’apoptose (CDK1, 5), et de la transcription (CDK7, 9). Les inhibiteurs pharmacologiques de CDKs constituent une nouvelle famille de produits anti-cancéreux potentiels : dix sont actuellement en clinique, dont la roscovitine issue de notre laboratoire. Ma thèse a porté sur l’identification, l’optimisation et la caractérisation détaillée des effets biochimiques et cellulaires de trois nouvelles classes d’inhibiteurs de kinases : indirubines-7-bromées (7BIO), meriolines et nouveaux analogues de la roscovitine (N&N1 et C&R8). Le 7BIO induit une mort cellulaire non-apoptotique par un mécanisme encore inconnu (pas de relargage de cytochrome C, pas d’activation de caspases). En revanche les meriolines et les roscovitine de seconde génération induisent une mort apoptotique classique suite à l’inhibition de CDK9. Qui conduit à une disparition d’un facteur de survie cellulaire essentiel, Mcl-1. Ces trois familles chimiques ont des effets anti-prolifératifs et tumoraux prometteurs
Cyclin-dependent kinases (CDKs) are key regulators of cell division cycle (CDK1, 2, 3, 4, 6, 7), apoptosis (CDK1, 5), and transcription (CDK7, 9). Pharmacological inhibitors of CDKs constitute a new family of potential antitumor agents: ten are under clinical trials, among which roscovitine, was discovered in our laboratory. My thesis is about identification, optimisation and characterization of biochemical and cellular effects of three new kinase inhibitory classes: 7-bromo-indirubins (7BIO), meriolin and new analogs of roscovitine (N&N1 and C&R8). 7BIO induces non-apoptotic cell death through an unknown mechanism (no release of cytochrome C, nor caspase activation). On the other hand, meriolins and second generation roscovitine analogs induce a classical apoptosis due to CDK9 inhibition, thus leading to disappearance of the cell survival factor, Mcl-1. These three classes of chemicals display promising anti-proliferative and antitumor properties

This thesis explores Community Development Finance Institutions (CDFI) as an alternative vehicle for the supply of debt finance to financially excluded enterprises. CDFIs are part of a broader approach to addressing financial exclusion that is experienced by commercial and social enterprises in the US and UK. The thesis explores US and UK CDFI lending processes to develop an understanding of how financial and social objectives are balanced in the lending process and the ways in which CDFIs become embedded in local financial and business support networks. The analysis is based upon detailed comparative research of CDFIs located in the US and the UK; interviews were undertaken with CDFIs, their clients and a quantitative analysis of a CDFIs loan portfolio was undertaken. The research concludes that CDFIs are complex dynamic organizations as they have to balance a double or triple bottom line which has the potential to undermine the firm’s long term survival or mission. The danger is that over time a CDFI will reduce its exposure to risk and become more like a mainstream bank. The tensions with the CDFI business model implies that they will only ever provide a partial solution to the enterprise finance gap.

Mes travaux de recherche portent sur le contrôle du cycle cellulaire chez la levure de fission, Schizosaccharomyces pombe. Chez S. pombe, cette régulation est assurée principalement par une protéine kinase cycline-dépendante (CDK), nommée Cdc2. Au cours du cycle cellulaire, cette enzyme s’associe avec différentes cyclines (Cig1, Cig2, Puc1 et Cdc13), formant ainsi une variété de complexes CDK-cycline qui confèrent des activités spécifiques à chaque phase du cycle. Cependant, il a été montré que ce réseau complexe peut être simplifié et remplacé par un système minimal, qui consiste en la fusion des deux gènes cdc2 et cdc13, indépendant d’un grand nombre de régulations endogènes. Cette découverte a ainsi permis d'établir un nouveau modèle pour le contrôle du cycle cellulaire eucaryote. Dans ce travail nous avons d’une part, voulu comprendre pourquoi la régulation du cycle cellulaire s’est complexifiée au cours de l’évolution, étant donné qu’une grande partie du circuit endogène semble dispensable. Dans ce but, j’ai investigué les limites du système minimal, quand les cellules sont exposées à différents stress. De manière surprenante, nous avons découvert que la simplification du réseau des CDKs confère aux cellules une résistance au stress réplicative. Nous avons montré que ce phénotype était indépendant de la régulation de l’inhibiteur Rum1 et des points de contrôles. Il résulte plutôt du fait que le cycle cellulaire soit régulé uniquement par Cdc13. Nous avons trouvé que le programme de réplication était inchangé dans les minimale qui présentaient moins de dommage à l’ADN comparé aux cellules sauvages. Nos data suggèrent que l’activité des CDKs associée au cyclines de phase G1/S, représente un moyen alternatif de moduler la réponse au stress. D’autre part, en utilisant le même système dans lequel l’activité des CDKs peut être finement modulée par l’inhibiteur. Nous avons démontré que la transcription périodique des gènes dépendait d’une régulation quantitative par les CDKs. Par conséquence nous proposons le model, l’opposé de ce qui a été suggéré chez la S. cerevisiea. Dans notre model, la progression du cycle cellulaire ainsi que la transcription périodique des gènes sont toutes les deux sous le contrôle de l’activité des CDKs
The cyclin-dependent protein kinases (CDKs) are at the core of cell cycle control. In fission yeast, cell proliferation is regulated by CDK1/Cdc2 in association with the four cyclins Cdc13, Cig1, Cig2 and Puc1 at different stages of the cell cycle. However, this complex endogenous system can be replaced by a minimal module consisting of a fusion between Cdc2 and Cdc13 in the absence of G1/S cyclins. Surprisingly, this minimal CDK network drives the entire cell cycle in a wild type manner. Since a number of aspects of cell cycle control in fission yeast appear to be dispensable, we asked why similarly simplified circuits were not selected over the complex endogenous network during evolution. This led us to investigate the limits of such minimal systems, in particular when challenged by different stresses. Unexpectedly, we uncovered that simplification of the CDK network confers resistance to replication stress. We showed that this phenotype is independent from the CDK inhibitor Rum1 and the existing checkpoint pathways. It solely relies on operating the entire cell cycle with a single cyclin, Cdc13, and is associated with reduced genome instability when replication is challenged. However, it is not the consequence of changes in replication organisation along the chromosomes. Our data suggest that G1/S cyclin-associated Cdc2 activity may represent an alternative as yet unknown means of modulating cellular response to DNA stress. We also took advantage of a derivative of the minimal cell cycle network, in which Cdc2 is made sensitive to specific chemical inhibition. As a result, CDK activity can be externally modulated and cell cycle phases can be precisely controlled. Using this system, we re-visited the interplay between CDK and periodic transcription, a highly conserved process that is critical for proper cell proliferation. In contrast with previous studies in budding yeast, we demonstrate that periodic transcription in fission yeast is not independent from cell cycle progression. On the contrary, our work reveals that cell cycle transcriptional oscillations rely on quantitative changes in CDK activity levels. We therefore propose a new model, in which cell cycle progression and periodic transcription are intimately coupled through their common dependency on a unique input, namely CDK activity levels

Les pyrido[d]pyrimidines constituent une classe de composés intéressants tant sur le plan chimique que biologique. Une des applications courante pour cette famille concerne leur utilisation dans l’élaboration de nouvelles drogues inhibitrices de kinases. Dans ce travail nous nous sommes intéressés aux pyrido[3,2-d]pyrimidines, les moins décrites dans la littérature, car leurs voies d’accès sont souvent difficiles et les produits de départ sont très onéreux. Dans le cadre de la recherche de nouveaux agents cytotoxiques et d’inhibiteurs de kinases toujours plus sélectifs, nous avons développé de nouvelles méthodologies originales, efficaces et moins coûteuses, pour la synthèse des 2,4-dichloro et 2,4,7-trichloro pyrido[3,2-d]pyrimidines. La réactivité de ces deux synthons clés a été étudiée lors de réactions de substitutions nucléophiles aromatiques et divers couplages pallado-catalysés qui ont permis l’obtention d’un large panel de molécules polyfonctionnalisées en position 2, 4 et 7. Différentes analyses pharmacologiques ont été réalisées. L’inhibition des kinases (DYRK1A, CDK5, GSK3) par nos produits originaux et l’évaluation de leur cytotoxicité sur diverses cellules humaines cancéreuses ont été réalisées. Certaines molécules ont donné des résultats extrêmement prometteurs. Les relations entre structure et activité de ces nouvelles familles de composés sont discutées.

Les points de contrôle du cycle cellulaire assurent la stabilité du génome en retardant la progression du cycle en réponse à des stress ou des dommages causés sur l'ADN. Le point de contrôle de la phase G2 régule l'entrée des cellules en mitose, tandis que le point de contrôle de la formation des fuseaux mitotiques prévient l'entrée en anaphase, jusqu'à ce que les chromosomes soient correctement alignés. Au cours de ma thèse, je me suis intéressée à l'étude des Rôle de MAPKs (Mitogen-Activated Protein Kinases) et de la protéine P21 qui est un inhibiteur de cdk (cyclin dependent kinase), dans les phases G2 et M. Les MAPKs sont d'importants médiateurs dans les réponses cellulaires induites par une grande variété de stimuli extracellulaires. Nos résultats ont montré que trois protéines membres des MAPKs ont des effets différents sur les points de contrôle G2 et de formation des fuseaux. Les protéines ERKs (extracelluar signal-regulated kinases) n'ont pas de rôle dans la progression de la phase G2 à la phase M, mais interviennent dans la régulation du point de contrôle de formation des fuseaux, et ce, en inhibant l'activité du complexe APC. Les kinases p38 et JNK (c-Jun N-terminal kinase) régulent la progression G2-M mais de façon opposée. L'inhibition de JNK et l'activation de p38 entraînent un retard des cellules en G2 par l'inactivation de cdc2. En outre, nous avons trouvé que c'est uniquement l'inhibition de JNK et non p38 qui mène à l'instabilité génomique. Les cellules accomplissent plusieurs cycles de réplication de l'ADN non accompagnés de mitose, conduisant ainsi à une augmentation de la ploïdie de la cellule. Ce phénomène est probablement dû par un recrutement inapproprié des MCMs (minichromosome maintenance) au niveau de la chromatine pendant la phase G2. Il Y a certainement une activité dépendante de la kinase cdk2 qui permet probablement à la réplication de se faire. Dans le cas de dommage persistant du fuseau mitotique, malgré que le checkpoint est toujours actif, les cellules finissent finalement par sortir de la mitose sans ségrégation chromosomique et sans cytodiérèse. Il en résulte l'apparition de cellules tétraploïdes qui sont dans une pseudo G 1 phase. Dans ce processus appelé "adaptation" or "slippage" les cellules sortent de la mitose alors que le checkpoint est toujours actif. Les causes de ce cet adaptation or slippage sont en général pas bien connus. Au cours de ma thèse, je me suis intéressée aussi à l'étude de ce phénomène. Mes résultats montrent que le complexe APC/C est actif dans ces cellules effectuant ce slippage et que cet activation est dépendante de p2I. Mes résultats montrent que l'inhibition des cdk par p21 déstabilise l'interaction Mad2-Cdc20, qui à son tour va activer APC/C
Cell cycle checkpoints ensure genomic stability by delaying cell cycle progression in response to stress or DNA damage. G2 checkpoint guards entry into mitosis while the spindle checkpoint prevents ce Ils from entering anaphase until ail chromosomes are properly aligned. Ln this reports, we studied the role of MAPKs (Mitogen-Activated Protein Kinases) and the cdk inhibitor, p21 in G2 and M phase. MAPKs are important mediators of cellular responses to a variety of extracellular stimuli. Previous reports have shown that MAPK cascade is essential for entry into mitosis. Our results show that three MAPK members have different effects on G2 and M phase. ERKs (extracelluar signal-regulated kinases) do not have an effect on G2 to M progression but they regulate the spindle checkpoint by inhibiting APC activity. We also found that p38 and JNKs (c¬ Jun N-terminal Kinases) regulate G2-M transition. P38 activation delays cells in G2. The G2 delay by p38 involves activation of MAPKAPK2 and inactivation of cdc2. The G2 delay by inhibition of JNKs involves cdk2 activation and cdc2 inactivation. Inhibition of JNK activity in G2 cells leads to genomic instability. Cells undergo multiple round of DNA replication without undergoing mitosis resulting in an increase in DNA ploidy. This is probably due to inappropriate loading of MCMs (minichromosome maintenance) on chromatin during G2. The presence of Cdk2 activity in G2 may lead polyploidy in JNK inhibited condition

Early Xenopus laevis embryonic cell cycles exemplify rapid, non-pathological cell cycles without checkpoint pathways to arrest cell cycles in response to DNA assaults. There is no transcription or apoptosis during these cell cycles, and they continue unperturbed until the 12th cell cycle, marking a period called the midblastula transition (MBT). At the MBT, the embryo undergoes a period of developmental remodeling: gap phases are acquired, zygotic transcription is initiated, and the maternal mRNAs are degraded. After the MBT, checkpoint pathways can be activated in response to unreplicated DNA, and apoptosis initiates when continued embryonic survival is compromised. These studies examine how cell cycle regulation and apoptotic regulation are related. Specifically, the role of two cell cycle components, Chk1 and cyclin A1/Cdk2, during apoptosis was studied during early development of Xenopus embryos. Chk1 is a serine/threonine kinase that inhibits the activity of cyclin-dependent kinases (Cdks) in response to unreplicated DNA. In the pre-MBT embryo, Chk1 is present, but inactive. Injection of mRNA encoding dominant-negative Chk1 (DN-Chk1) into single-celled embryos results in the initiation of apoptosis after the MBT. The loss of Chk1 function also results in the initiation of additional rapid rounds of DNA replication after the MBT. These results suggest that Chk1 has a required function for the embryo after the MBT, possibly through the regulation of a cyclin/Cdk complex responsible for the apoptotic checkpoint. Cyclin A1 is a maternally provided mRNA that is degraded at the MBT. Prior to the MBT, cyclin A1 complexes exclusively with Cdc2 to regulate mitosis. When embryos are treated with ionizing radiation (IR), cyclin A1 activity and protein level persist after the MBT, and cyclin A1 complexes with Cdk2. When treated with aphidicolin, cyclin A1-associated activity and protein level persists. Injection of cyclin A1/Cdk2 into single-cell embryos results in apoptosis after the MBT; however, inhibition of cyclin A1 expression does not abrogate apoptosis. Therefore, cyclin A1/Cdk2 activity is sufficient, but not required, for the initiation of apoptosis in the early Xenopus embryo. These studies show that Chk1 and cyclin A1/Cdk2 have roles in regulating apoptosis in the post-MBT embryo.
Ph. D.

Os estudos de modelagem molecular das interações entre ligantes baseado em oxindóis (isaepy, isapn, [Cu(isapn)]², isaenim e o SU9516) e as proteínas kinases dependentes de ciclina (CDK1 e CDK2) são apresentados neste trabalho. Uma inibição na atividade da CDK1 e CDK2, que catalisam a fosforilação de grupos específicos em proteínas, tem implicações na indução da apoptose celular. O objetivo é tentar determinar qual destes ligantes potencializa a inibição da síntese de ATP (adenosina trifosfato) em ADP (adenosina difosfato) no sítio ativo da CDK1 e CDK2 para, desta forma, induzir a apoptose de células cancerígenas. Os estudos realizados neste trabalho indicam que dentre os ligantes analisados, o isaepy e o isapn obtiveram melhores resultados de estabilidade e ligações de hidrogênio entre aminoácidos dentro do sítio. Analisamos a influência do íon Cu no aumento da eficácia do isapn na atividade inibitória (complexo [Cu(isapn)]²) e comparamos os resultados obtidos dos estudos do isapn e [Cu(isapn)]², quando inseridos no sítio de ligação do ATP da CDK1, com medidas de eletroforese em gel. Verificamos que os nossos resultados foram corroborados com as medidas de eletroforese. Também discutimos os resultados de cálculos de acoplamento hiperfino para o Cu no [Cu(isapn)]² em diferentes ambientes químicos e fizemos a comparação destes resultados com medidas de EPR. Desta forma, conseguimos verificar o ambiente químico do íon Cu e um aumento da estabilidade do isapn dentro do sítio estudado com a inserção do íon Cu. Este trabalho visa contribuir para a síntese de novos ligantes que aumentem a eficácia da inibição da síntese de ATP em ADP nas CDKs e também para a minimização dos custos através da diminuição da realização de experimentos que se baseiam em métodos de tentativa e erro.
Molecular modeling studies of the interaction of oxindol based ligands (isaepy, isapn [Cu(isapn)]²,isaenim and SU9516) with Cyclin Dependent Kinases proteins (CDK1 and CDK2) are presented here. CDK1 and CDK2 catalyze the phosphorylation of specific groups in proteins and inhibition of its activities implies in induction of cancer cells apoptosis. The goal is to determine which ligands increase the inhibition of ATP (adenosine triphosphate) into ADP (adenosine diphosphate) synthesis which occurs inside the CDK1 and CDK2 active site. We analyze the influence of the Cu ion on increasing the inhibitory activity in isapn ([Cu(isapn)]² metal complex). Comparisons between the results obtained from studies of the isapn and [Cu(isapn)]² inserted into the ATP binding site of CDK1 with measurements of gel electrophoresis were performed. The hyperfine coupling at Cu ion in [Cu(isapn)]² in different chemical environments are here obtained and the results are compared with EPR measurements. This work aims to contribute to the development of new ligands which increase the inhibition of the synthesis of ATP into ADP in the CDKs moreover we aim to assist in the reduction of the costs of measurements that are based on trial and error aproaches.

L'olomoucina i la roscovitina són dos inhibidors de les cinases dependents de ciclines (CDKs) que actuen competint pel lloc d'unió de l'ATP. Presenten una alta especificitat "invitro"davant de la CDK1, 2, 5, 7, 9 i les ERKs. Aquest perfil inhibidor els confereix unes amplies perspectives en la teràpia antitumoral.
En aquest treball, hem mostrat que la línia neuroblàstica de les SH-SY5Y i la promielocítica de les HL60, morien apoptòticament en resposta a ambdós fàrmacs. Una caracterització més extensa del procés, va evidenciar que la sobre expressió de Bcl-2 o Bcl-XL no conferien resistència. En canvi, la inhibició general de les caspases amb z-VAD-fmk, frenava parcialment la mort. En conseqüència, vam hipotetitzar que ens trobàvem davant d'una via extrínseca d'apoptosi, dependent de l'activació de la caspasa 8 (CASP8) o de la caspasa 10 (CASP10). Tanmateix, les CASP8/10 no s'expressen a les SH-SY5Y ja que els seus gens han estat metilats, i és més, no vam observar que es reexpressessin en resposta a l'olomoucina o la roscovitina. En conclusió, la implicació al nostre paradigma experimental d'una via extrínseca canònica d'apoptosi va ser descartada. D'altra banda, la inhibició de la síntesi de proteïnes protegia les SH-SY5Y de l'apoptosi. Curiosament, vam observar l'existència de sinergisme de rescat entre el z-VAD-fmk i ,per exemple, la cicloheximida, fet que suggeria l'existència de diferents vies apoptòtiques en diferents subpoblacions del cultiu cel·lular. La manca de toxicitat del tractament amb PD98059 o UO126, dos inhibidors de la via Erk1/2, anava en contra de que la inhibició de Erk1/Erk2 fos la causa de l'apoptosi. És més, el tractament amb olomoucina i roscovitina induïa la fosforilació i subseqüent activació de les Erk1/2. Sorprenentment, al nostre model, l'isoolomoucina, un isòmer inactiu de l'olomoucina, causava els mateixos efectes sobre les ERKs. Basant-nos en els resultats d'iso-olomoucina, vam concloure que la fosforilació de les ERKs i la seua subseqüent activació, no estaven implicats en els fenòmens d'apoptosi, proliferació i diferenciació. Finalment, vam mostrar que les SH-SY5Y diferenciades esdevenien resistents a l'olomoucina i a la roscovitina, fet que recolzava el paper de la inhibició de les CDKs en tant que esdeveniment iniciador de la cascada apoptòtica. D'altra banda, l'olomoucina i la roscovitina són cada cop més estudiats en el context de la teràpia combinatòria enfront del càncer. Als nostres treballs, hem utilitzat la R-roscovitina, un dels dos estereoisòmers de la roscovitina. La combinació amb el docetaxel (DTX) no era sinèrgica induint mort. En canvi, la R-roscovitina sensibilitzava les SH-SY5Y a l'apoptosi induïda per la nutlina-3, un nou i prometedor f-armac inductor de la via p53.
La olomoucina y la roscovitina son dos inhibidores de las cinasas dependientes de ciclinas (CDKs) cuyo mecanismo de acción es competir con el ATP por la unión a la enzima. Presentan una alta selectividad
"in vitro"ante la CDK1, 2, 5, 7, 9 y las ERKs. Este perfil inhibidor les confiere amplias perspectivas en la terapia antitumoral. En este trabajo, hemos mostrado que la línea de las SH-SY5Y, derivada de neuroblastoma, y la de las HL-60, derivada de una leucemia promielocítica, morían apoptoticamente en respuesta a ambos fármacos. Una caracterización más amplia del proceso apoptótico, evidenció que la expresión forzada de Bcl-2 o de Bcl-XL no conferían resistencia ante ninguna de nuestras drogas. En cambio, sí se hacían parcialmente más resistentes cuando eran tratadas con un inhibidor general de las caspasas (z-VAD-fmk). En consecuencia, nuestra hipótesis fue que nos hallábamos ante una apoptosis por vía extrínseca iniciada por la caspasa 8 (CASP8) y/o la caspasa 10 (CASP10). Curiosamente, dichas caspasas no se expresan en las SH-SY5Y debido a un proceso de metilación génica, y pudimos ver que el tratamiento tampoco inducía su reexpresión. En conclusión, descartamos que las SH-SY5Y iniciasen una vía extrínseca canónica en respuesta a nuestras drogas. Por otro lado, la inhibición de la síntesis proteica en nuestro modelo frenaba la apoptosis. Es más, el z-VAD-fmk junto con, por ejemplo, la cicloheximida, presentaban un sinergismo en el rescate. Esto sugería la coexistencia en nuestro cultivo de distintas subpoblaciones capaces de iniciar diferentes vías apoptóticas. El tratamiento con PD98059 o UO126, dos inhibidores de la via de Erk1/2, se mostró inocuo a la hora de inducir muerte, por lo cual descartamos que la inhibición de Erk1/2 fuera la responsable de la apoptosis. Sorprendentemente, el estudio del estado de fosforilación de Erk1/2, nos permitió constatar que éstas se activaban en respuesta a la olomoucina y la roscovitina. Más sorprende aún, resultó el hecho que la iso-olomoucina, un isómero inactivo de la olomoucina, causara los mismos efectos sobre Erk1/2. Esto nos permitió afirmar que no existía correlación entre la fosforilación de Erk1/2 y la inhibición de las CDKs. En base principalmente a los resultados de la iso-olomoucina, pudimos afirmar que la fosforilación de las ERKs y su subsiguiente activación, no se correlacionaban con la apoptosis, proliferación y diferenciación celular. Finalmente, evidenciamos que las SH-SY5Y diferenciadas se volvían resistentes a la olomoucina y a la roscovitina, hecho a favor de que la inhibición de las CDKs fuera el evento iniciador de la cascada apoptótica. Alternativamente, la olomoucina y la roscovitina están siendo cada vez más estudiadas en el contexto de la terapia combinatoria frente al cáncer. En nuestros experimentos, utilizamos también la R-roscovitina, uno de los dos estereoisómeros de la roscovitina. En su combinación con el docetaxel (DTX), no observamos sinergismo. El caso contrario sucedi´o cuando fue administrada junto a la nutlina-3, un nuevo y prometedor inductor de p53. Vimos como la R-roscovitina sensibilizaba las SH-SY5Y a la apoptosis inducida por la nutlina-3.
Olomoucine and roscovitine are two ATP-competing inhibitors of cyclin-dependent kinases (CDKs) displaying a promising profile as anticancer agents. They exhibit "in vitro"selectivity against CDK1, 2, 5, 7, 9 and ERKs. In this work, we have showed that SH-SY5Y neuroblastoma and HL-60 promielocytic cell lines died by apoptosis in response to both drugs. An extensive characterization of the process in SH-SY5Y cells has shown that neither Bcl-2 nor Bcl-XL overexpression conferred any resistance to both drugs. However, a partial protective effect was detected when cells were treated with a general inhibitor of caspases (z-VAD-fmk). Therefore, the involvement of an extrinsic pathway mediated by Caspase 8 (CASP8) or Caspase 10 (CASP10) could be hypothesised. CASP8/10 are known not to be expressed in SH-SY5Y because of gene silencing and we have found no re-expression was induced by either olomoucine or roscovitine. In conclusion, a canonical extrinsic pathway has been discarded in SH-SY5Y cells facing these drugs. On the other hand, protein synthesis inhibitors protected SH-SY5Y cells from apoptosis.
Interestingly, a synergism in cell protection was observed between z-VAD-fmk and, for instance cycloheximide. This suggested different apoptotic pathways occurring in distinct subpopulations of the cell culture. No lethality was found when cells were treated with either PD98059 or UO126 drugs, two inhibitors of the Erk1/2 pathway, thus discarding, this inhibition as the cause of apoptosis. Furthermore, olomoucine and roscovitine induced the phosphorylation and subsequent activation of Erk1/2 proteins.
Interestingly, iso-olomoucine, an inactive isomer of olomoucine, caused the same effect in our cell model.
Therefore, no correlation existed between Erk1/2 phosphorylation and CDK inhibition. Based mainly on the iso-olomoucine results, we concluded that phosphorylation and subsequent activation of Erk1/2 were not involved in apoptosis, proliferation and differentiation of the cells. Finally, we show that differentiated SH-SY5Y cells became resistant to either olomoucine or roscovitina, thus providing support for CDK inhibition as the initiating event of these apoptotic processes. Olomoucine and roscovitine are being increasingly studied in the context of combinatorial therapy for cancer. In our studies, we have also used R-roscovitine, the right stereoisomer of roscovitine. No synergism was found when combined with docetaxel (DTX). On the contrary, R-roscovitine sensitized SH-SY5Y cells to nutlin-3 induced apoptosis, being nutlin-3 a new promising inductor of the p53 functions.
Lólomoucine et la roscovitine sont deux inhibiteurs des kinases d´ependantes de cyclines (CDKs) qui agissent par inhibition competitive via le site d'union de l'ATP. Son profil inhibiteur est tr-es prometteur dans le traitement du cancer. Présentent une grande spécificité "in vitro"face aux CDK1, 2, 5, 7, 9 e aux ERKs. Dans ce travail, nous avons d´emontré que la lignée neuroblastique SH-SY5Y et la promyélocitique HL-60, mouraient apoptotiquement en réponse àces drogues. Une plus large caractérisation de l'apoptose dans les SH-SY5Y a mis enévidence que la surexpression de Bcl-2 ou de Bcl-XL ne se traduisait par une augmentation de la résistance au traitement. Cependant, le traitement avec un inhibiteur général des caspases (z-VAD-fmk) présentaient des effets protecteurs partiels. Au vu de ces résultats, notre hypothèse reposait sur límplication d'une voie extrinsèque d'apoptose qui d´ependait de l'activation de la caspase 8 (CASP8) ou de la caspase 10 (CASP10). Néanmoins, la m´ethylation des gènes des CASP8 et 10 dans les SH-SY5Y empèche l'expression de ces protéines et, plus encore, l'olomoucine et la roscovitine nínduiraient pas la réexpression de ces caspases. En conclusion, l'apoptose par une voie extrinsèque classique pouvait ètreécartée dans notre paradigme expérimental. D'un autre coté, les inhibiteurs de la synthèse des protéines protégeaient les SH-SY5Y de l'apoptose. De manière surprenante, on avait observé l'existence de synergie dans la protection avec z-VAD-fmk et, par exemple, le cycloheximide.
Ce fait suggérait la présence de différents sous-poupulations cellulaires dans les SH-SY5Y qui engageaient des voies apoptotiques distinctes. Le manque d'effets toxiques du PD98059 or UO126, deux inhibiteurs de la voie d'Erk1/2, avait écarté l'inhibition de Erk1/Erk2 comme la responsable de l'apoptose.
Plus encore, l'olomoucine et la roscovitine induisaient la phosphorylation et subséquente activation d'Erk1/Erk2. De manière surprenante, l'iso-olomoucine, un isomère inactif de l'olomoucine, induisait aussi la phosphorylation et l'activation dans notre modèle cellulaire. Sur base de ces résultats, nous avons conclu que la phosphorylation d'Erk1/Erk2 et son activation, n'avait pas un corr´elat avec l'apoptose, la prolifération et la différentiation cellulaire. Finalement, nous avons mis en évidence que les SH-SY5Y différentiées devenaient résistantes à l'olomoucine ou à la roscovitine. Ce fait suggérait que l'inhibition des CDKs avait un role dans le d´eclenchement de l'apoptose. Alternativement, l'olomoucine et la roscovitine sont de plus en plus étudiées dans le contexte de la th´erapie combinatoire face au cancer.
J'ai utilisé la R-roscovitine dans nos expériences, l'un des deux stéréoisomères de la roscovitine. La combinaison avec le docétaxel (DTX) n'avait pas des effets l´etaux synergiques, en revanche la R-roscovitine sensibilisait les SH-SY5Y à lápoptose par la nutline-3, un nouvel agent inducteur de la voie p53.

L'olomoucina i la roscovitina són dos inhibidors de les cinases dependents de ciclines (CDKs) que actuen competint pel lloc d'unió de l'ATP. Presenten una alta especificitat "invitro"davant de la CDK1, 2, 5, 7, 9 i les ERKs. Aquest perfil inhibidor els confereix unes amplies perspectives en la teràpia antitumoral.En aquest treball, hem mostrat que la línia neuroblàstica de les SH-SY5Y i la promielocítica de les HL60, morien apoptòticament en resposta a ambdós fàrmacs. Una caracterització més extensa del procés, va evidenciar que la sobre expressió de Bcl-2 o Bcl-XL no conferien resistència. En canvi, la inhibició general de les caspases amb z-VAD-fmk, frenava parcialment la mort. En conseqüència, vam hipotetitzar que ens trobàvem davant d'una via extrínseca d'apoptosi, dependent de l'activació de la caspasa 8 (CASP8) o de la caspasa 10 (CASP10). Tanmateix, les CASP8/10 no s'expressen a les SH-SY5Y ja que els seus gens han estat metilats, i és més, no vam observar que es reexpressessin en resposta a l'olomoucina o la roscovitina. En conclusió, la implicació al nostre paradigma experimental d'una via extrínseca canònica d'apoptosi va ser descartada. D'altra banda, la inhibició de la síntesi de proteïnes protegia les SH-SY5Y de l'apoptosi. Curiosament, vam observar l'existència de sinergisme de rescat entre el z-VAD-fmk i ,per exemple, la cicloheximida, fet que suggeria l'existència de diferents vies apoptòtiques en diferents subpoblacions del cultiu cel·lular. La manca de toxicitat del tractament amb PD98059 o UO126, dos inhibidors de la via Erk1/2, anava en contra de que la inhibició de Erk1/Erk2 fos la causa de l'apoptosi. És més, el tractament amb olomoucina i roscovitina induïa la fosforilació i subseqüent activació de les Erk1/2. Sorprenentment, al nostre model, l'isoolomoucina, un isòmer inactiu de l'olomoucina, causava els mateixos efectes sobre les ERKs. Basant-nos en els resultats d'iso-olomoucina, vam concloure que la fosforilació de les ERKs i la seua subseqüent activació, no estaven implicats en els fenòmens d'apoptosi, proliferació i diferenciació. Finalment, vam mostrar que les SH-SY5Y diferenciades esdevenien resistents a l'olomoucina i a la roscovitina, fet que recolzava el paper de la inhibició de les CDKs en tant que esdeveniment iniciador de la cascada apoptòtica. D'altra banda, l'olomoucina i la roscovitina són cada cop més estudiats en el context de la teràpia combinatòria enfront del càncer. Als nostres treballs, hem utilitzat la R-roscovitina, un dels dos estereoisòmers de la roscovitina. La combinació amb el docetaxel (DTX) no era sinèrgica induint mort. En canvi, la R-roscovitina sensibilitzava les SH-SY5Y a l'apoptosi induïda per la nutlina-3, un nou i prometedor f-armac inductor de la via p53.
La olomoucina y la roscovitina son dos inhibidores de las cinasas dependientes de ciclinas (CDKs) cuyo mecanismo de acción es competir con el ATP por la unión a la enzima. Presentan una alta selectividad"in vitro"ante la CDK1, 2, 5, 7, 9 y las ERKs. Este perfil inhibidor les confiere amplias perspectivas en la terapia antitumoral. En este trabajo, hemos mostrado que la línea de las SH-SY5Y, derivada de neuroblastoma, y la de las HL-60, derivada de una leucemia promielocítica, morían apoptoticamente en respuesta a ambos fármacos. Una caracterización más amplia del proceso apoptótico, evidenció que la expresión forzada de Bcl-2 o de Bcl-XL no conferían resistencia ante ninguna de nuestras drogas. En cambio, sí se hacían parcialmente más resistentes cuando eran tratadas con un inhibidor general de las caspasas (z-VAD-fmk). En consecuencia, nuestra hipótesis fue que nos hallábamos ante una apoptosis por vía extrínseca iniciada por la caspasa 8 (CASP8) y/o la caspasa 10 (CASP10). Curiosamente, dichas caspasas no se expresan en las SH-SY5Y debido a un proceso de metilación génica, y pudimos ver que el tratamiento tampoco inducía su reexpresión. En conclusión, descartamos que las SH-SY5Y iniciasen una vía extrínseca canónica en respuesta a nuestras drogas. Por otro lado, la inhibición de la síntesis proteica en nuestro modelo frenaba la apoptosis. Es más, el z-VAD-fmk junto con, por ejemplo, la cicloheximida, presentaban un sinergismo en el rescate. Esto sugería la coexistencia en nuestro cultivo de distintas subpoblaciones capaces de iniciar diferentes vías apoptóticas. El tratamiento con PD98059 o UO126, dos inhibidores de la via de Erk1/2, se mostró inocuo a la hora de inducir muerte, por lo cual descartamos que la inhibición de Erk1/2 fuera la responsable de la apoptosis. Sorprendentemente, el estudio del estado de fosforilación de Erk1/2, nos permitió constatar que éstas se activaban en respuesta a la olomoucina y la roscovitina. Más sorprende aún, resultó el hecho que la iso-olomoucina, un isómero inactivo de la olomoucina, causara los mismos efectos sobre Erk1/2. Esto nos permitió afirmar que no existía correlación entre la fosforilación de Erk1/2 y la inhibición de las CDKs. En base principalmente a los resultados de la iso-olomoucina, pudimos afirmar que la fosforilación de las ERKs y su subsiguiente activación, no se correlacionaban con la apoptosis, proliferación y diferenciación celular. Finalmente, evidenciamos que las SH-SY5Y diferenciadas se volvían resistentes a la olomoucina y a la roscovitina, hecho a favor de que la inhibición de las CDKs fuera el evento iniciador de la cascada apoptótica. Alternativamente, la olomoucina y la roscovitina están siendo cada vez más estudiadas en el contexto de la terapia combinatoria frente al cáncer. En nuestros experimentos, utilizamos también la R-roscovitina, uno de los dos estereoisómeros de la roscovitina. En su combinación con el docetaxel (DTX), no observamos sinergismo. El caso contrario sucedi´o cuando fue administrada junto a la nutlina-3, un nuevo y prometedor inductor de p53. Vimos como la R-roscovitina sensibilizaba las SH-SY5Y a la apoptosis inducida por la nutlina-3.
Olomoucine and roscovitine are two ATP-competing inhibitors of cyclin-dependent kinases (CDKs) displaying a promising profile as anticancer agents. They exhibit "in vitro"selectivity against CDK1, 2, 5, 7, 9 and ERKs. In this work, we have showed that SH-SY5Y neuroblastoma and HL-60 promielocytic cell lines died by apoptosis in response to both drugs. An extensive characterization of the process in SH-SY5Y cells has shown that neither Bcl-2 nor Bcl-XL overexpression conferred any resistance to both drugs. However, a partial protective effect was detected when cells were treated with a general inhibitor of caspases (z-VAD-fmk). Therefore, the involvement of an extrinsic pathway mediated by Caspase 8 (CASP8) or Caspase 10 (CASP10) could be hypothesised. CASP8/10 are known not to be expressed in SH-SY5Y because of gene silencing and we have found no re-expression was induced by either olomoucine or roscovitine. In conclusion, a canonical extrinsic pathway has been discarded in SH-SY5Y cells facing these drugs. On the other hand, protein synthesis inhibitors protected SH-SY5Y cells from apoptosis.Interestingly, a synergism in cell protection was observed between z-VAD-fmk and, for instance cycloheximide. This suggested different apoptotic pathways occurring in distinct subpopulations of the cell culture. No lethality was found when cells were treated with either PD98059 or UO126 drugs, two inhibitors of the Erk1/2 pathway, thus discarding, this inhibition as the cause of apoptosis. Furthermore, olomoucine and roscovitine induced the phosphorylation and subsequent activation of Erk1/2 proteins.Interestingly, iso-olomoucine, an inactive isomer of olomoucine, caused the same effect in our cell model.Therefore, no correlation existed between Erk1/2 phosphorylation and CDK inhibition. Based mainly on the iso-olomoucine results, we concluded that phosphorylation and subsequent activation of Erk1/2 were not involved in apoptosis, proliferation and differentiation of the cells. Finally, we show that differentiated SH-SY5Y cells became resistant to either olomoucine or roscovitina, thus providing support for CDK inhibition as the initiating event of these apoptotic processes. Olomoucine and roscovitine are being increasingly studied in the context of combinatorial therapy for cancer. In our studies, we have also used R-roscovitine, the right stereoisomer of roscovitine. No synergism was found when combined with docetaxel (DTX). On the contrary, R-roscovitine sensitized SH-SY5Y cells to nutlin-3 induced apoptosis, being nutlin-3 a new promising inductor of the p53 functions.
Lólomoucine et la roscovitine sont deux inhibiteurs des kinases d´ependantes de cyclines (CDKs) qui agissent par inhibition competitive via le site d'union de l'ATP. Son profil inhibiteur est tr-es prometteur dans le traitement du cancer. Présentent une grande spécificité "in vitro"face aux CDK1, 2, 5, 7, 9 e aux ERKs. Dans ce travail, nous avons d´emontré que la lignée neuroblastique SH-SY5Y et la promyélocitique HL-60, mouraient apoptotiquement en réponse àces drogues. Une plus large caractérisation de l'apoptose dans les SH-SY5Y a mis enévidence que la surexpression de Bcl-2 ou de Bcl-XL ne se traduisait par une augmentation de la résistance au traitement. Cependant, le traitement avec un inhibiteur général des caspases (z-VAD-fmk) présentaient des effets protecteurs partiels. Au vu de ces résultats, notre hypothèse reposait sur límplication d'une voie extrinsèque d'apoptose qui d´ependait de l'activation de la caspase 8 (CASP8) ou de la caspase 10 (CASP10). Néanmoins, la m´ethylation des gènes des CASP8 et 10 dans les SH-SY5Y empèche l'expression de ces protéines et, plus encore, l'olomoucine et la roscovitine nínduiraient pas la réexpression de ces caspases. En conclusion, l'apoptose par une voie extrinsèque classique pouvait ètreécartée dans notre paradigme expérimental. D'un autre coté, les inhibiteurs de la synthèse des protéines protégeaient les SH-SY5Y de l'apoptose. De manière surprenante, on avait observé l'existence de synergie dans la protection avec z-VAD-fmk et, par exemple, le cycloheximide.Ce fait suggérait la présence de différents sous-poupulations cellulaires dans les SH-SY5Y qui engageaient des voies apoptotiques distinctes. Le manque d'effets toxiques du PD98059 or UO126, deux inhibiteurs de la voie d'Erk1/2, avait écarté l'inhibition de Erk1/Erk2 comme la responsable de l'apoptose.Plus encore, l'olomoucine et la roscovitine induisaient la phosphorylation et subséquente activation d'Erk1/Erk2. De manière surprenante, l'iso-olomoucine, un isomère inactif de l'olomoucine, induisait aussi la phosphorylation et l'activation dans notre modèle cellulaire. Sur base de ces résultats, nous avons conclu que la phosphorylation d'Erk1/Erk2 et son activation, n'avait pas un corr´elat avec l'apoptose, la prolifération et la différentiation cellulaire. Finalement, nous avons mis en évidence que les SH-SY5Y différentiées devenaient résistantes à l'olomoucine ou à la roscovitine. Ce fait suggérait que l'inhibition des CDKs avait un role dans le d´eclenchement de l'apoptose. Alternativement, l'olomoucine et la roscovitine sont de plus en plus étudiées dans le contexte de la th´erapie combinatoire face au cancer.J'ai utilisé la R-roscovitine dans nos expériences, l'un des deux stéréoisomères de la roscovitine. La combinaison avec le docétaxel (DTX) n'avait pas des effets l´etaux synergiques, en revanche la R-roscovitine sensibilisait les SH-SY5Y à lápoptose par la nutline-3, un nouvel agent inducteur de la voie p53.

Le cycle de division cellulaire est gouverné par les complexes cycline-CDK dont l'activité est finement régulée, notamment par des inhibiteurs de CDK (CKI) dont p27Kip1 (p27) fait partie. P27 a également des rôles indépendants de la régulation des complexes cycline-CDK dans le cytoplasme, comme l'inhibition de la GTPase RhoA. Pour étudier les nouvelles fonctions de p27, des souris knock-in dans lesquelles le gène de p27 est remplacé par un allèle (p27CK-) qui ne peut plus lier ou inhiber les complexes cycline-CDK ont été générées. Les animaux p27CK- développent spontanément des tumeurs dans divers organes, suggérant un rôle oncogénique de p27. Ces souris présentent également un phénotype de multinucléation et polyploïdie dans plusieurs tissus. Le but du projet de recherche a été de déterminer dans quelle mesure p27CK- contribue au processus de transformation et peut causer un phénotype de multinucléation et polyploïdie. Une étude de tumorigénèse induite par l'uréthane, qui cause des mutations activant K-Ras montrent que les souris p27CK- développent plus de tumeurs dans le poumon que les animaux p27-/- et p27+/+. Nos résultats suggèrent également que le p27 cytoplasmique peut contribuer à la transformation cellulaire et coopérer avec l'activation de voies oncogéniques spécifiques qui causent sa translocation dans le cytoplasme. Dans un deuxième temps, nous avons caractérisé le phénotype de polyploïdie et de multinucléation des souris p27CK-. Nos résultats suggèrent que p27CK- entraîne la multinucléation en interférant avec l'activation de Citron-K par RhoA ce qui conduit à un défaut de cytocinèse
The cell cycle inhibitor p27Kip1 (p27) also has cyclin-CDK independent functions. Genetic evidence for these functions was provided by p27CK- knock-in mice in which p27 cannot bind or inhibit cyclin-CDK complexes. P27CK- mice have an increased incidence of tumor development in multiple organs compared to wild-type and p27-/- mice, revealing an oncogenic role for p27. In the first part of my PhD thesis, I studied the roles played by p27 during tumorigenesis. The susceptibility to urethane-induced tumorigenesis of mice either entirely lacking p27 or expressing the p27CK- allele was compared. Our results indicate a cooperation between p27CK- and activated Ras. We propose that the p27CK- protein needs to be localized in the cytoplasm in order to function as an oncogene, otherwise it just behaves similarly to a null allele. In the second part of my PhD thesis, a phenotype of multinucleation and polyploidy was identified in p27CK- mice that is not present in p27-/- animals, suggesting a role for p27 in G2/M independent of cyclin-CDK regulation. We identified the Rho effector Citron-Kinase as a p27-interacting protein in vitro and in vivo. Our data suggests that p27 may play a role during cytokinesis via the regulation of Citron-Kinase activity

A biologia da reprodução sexual de plantas é um campo de pesquisa de grande importância, já que a maioria dos alimentos consumidos pelo homem é composta de partes reprodutivas das plantas (frutos e sementes), oriundas do desenvolvimento de partes do pistilo fertilizado. Em Nicotiana tabacum, identificou-se um gene específico de estigma/estilete, SCI1 (Stigma/style Cell-cycle Inhibitor 1), que atua na inibição da proliferação celular (DePaoli et al., 2011). Através de ensaios de pull-down, verificou-se a interação da proteína SCI1 com uma proteína quinase dependente de ciclina (CDK) (Strini, dados não publicados). Este trabalho visou à caracterização dessa nova CDK, ortóloga da CDKG;2 de Arabidopsis. A sequência correspondente de N. tabacum (NtCDKG;2) foi amplificada por PCR, a partir de cDNAs de estigmas/estiletes, clonada e sequenciada, o que permitiu a confirmação de sua identidade. A expressão de NtCDKG;2 foi analisada nos diferentes órgãos vegetativos e reprodutivos, por qRT-PCR, o que evidenciou um perfil de expressão ubíqua. Ao estudar o perfil de expressão desse gene nos estigmas/estiletes dos doze estádios de desenvolvimento floral de N. tabacum, observa-se que NtCDKG;2 é mais expresso nos estádios tardios do desenvolvimento em direção à antese, indicando uma função importante de sua proteína ao final do desenvolvimento do pistilo. Análises de expressão de NtCDKG;2 em estigmas/estiletes, de plantas de N. tabacum com produção aumentada do hormônio auxina no pistilo, sugerem que NtCDKG;2 é regulado transcricionalmente por esse hormônio. A expressão transiente da proteína de fusão NtCDKG;2-GFP, em folhas de N. tabacum, evidenciou a localização nuclear da proteína em estudo. Também foram geradas plantas transgênicas estáveis com superexpressão e com silenciamento por RNAi de NtCDKG;2. Apesar dos altos níveis de transcritos de NtCDKG;2 nas plantas de superexpressão e dos baixos níveis nas plantas silenciadas, não foram observadas alterações fenotípicas macroscópicas nessas plantas. Adicionalmente, obteve-se a expressão da proteína NtCDKG;2, fusionada a uma tag de histidina em sua porção N-terminal, em células de Escherichia coliBL21(DE3)CodonPlusRP. Através dos estudos realizados neste trabalho e análises conjuntas da literatura, é possível propor que NtCDKG;2 codifique uma proteína que está envolvida no controle do ciclo celular nos estigmas/estiletes de N. tabacum.
The biology of plant sexual reproduction is a research field of great importance, since most of the food consumed by humans is composed of plant reproductive parts (fruits and seeds), originated by the development of fertilized pistil parts. In Nicotiana tabacum, it was identified a stigma/style-specific gene, SCI1 (Stigma/style Cell-cycle Inhibitor 1), which acts in the inhibition of cell proliferation (DePaoli et al., 2011). Through pull down assays, the interaction of the SCI1 protein with a cyclin-dependent protein kinase (CDK) was verified (Strini, unpublished). This work aimed the characterization of this new CDK, orthologous to the Arabidopsis CDKG;2. The N. tabacum corresponding sequence (NtCDKG;2) was PCR amplified, from stigmas/styles cDNAs, cloned and sequenced, which allowed the confirmation of its identity. The NtCDKG;2 expression was analyzed in the different vegetative and reproductive organs, by qRT-PCR, evidentiating an ubiquitous expression pattern. Studying the expression pattern of this gene in stigmas/styles of the twelve stages of N. tabacum flower development, it was observed that NtCDKG;2 is more expressed at the later developmental stages towards anthesis, indicating an important function of its protein in the end of pistil development. NtCDKG;2 expression analyses in stigmas/styles of N. tabacum plants with an enhanced auxin production in the pistil suggest that NtCDKG;2 is transcriptionally regulated by this hormone. The transient expression of the fusion protein NtCDKG;2-GFP, in N. tabacum leaves, evidentiated the nuclear localization of the studied protein. Stable transgenic plants overexpressing and silencing NtCDKG;2 by RNAi were also generated. Despite the high transcript levels in the plants overexpressing NtCDKG;2 and the low transcript levels in the silencing plants, macroscopic phenotypic alterations were not observed on these plants. Additionally, the expression of the NtCDKG;2 protein, with a histidine tag fused in its N-terminal, was obtained in Escherichia coli BL21(DE3)CodonPlusRP cells. Through studies performed on this work and literature analyses, it is possible to propose that NtCDKG;2 encodes a protein that is involved in the control of cell cycle at the N. tabacum stigmas/styles.

Le cancer constitue l’une des principales causes de mortalité, et représente, de ce fait aujourd’hui un problème de santé publique majeur. Depuis quelques années, les alcaloïdes marins représentent une source d’inspiration importante pour les chimistes en vue d’obtenir de nouveaux médicaments anticancéreux. Dans cette optique, des recherches effectuées au sein de notre laboratoire ont fait état de la synthèse d’analogues de ces alcaloïdes possédant une structure tris aromatique. Nous avons développé des molécules originale analogues de ces alcaloïdes disposant d’un hétérocycle central (1,2,4-triazine et imidazo[1,2-b][1,2,4,5]tétrazine) sur lequel sont greffés deux noyaux phényles diversement substitués. L’obtention de ces composés a également été l’occasion de développer de nouvelles méthodologies de synthèse. Ainsi une nouvelle réaction de type Buchwald-Hartwig sur des méthylsulfanyl-1,2,4-triazines a pu être mise au point ainsi qu’une méthode de CH arylation palladocatalysée sur le noyau imidazo[1,2-b][1,2,4,5]tétrazine. Une partie est aussi consacrée aux réactions multicomposants de type Groebke-Blackburn. Différentes évaluations pharmacologiques ont été réalisées, notamment des tests d’inhibition sur différentes kinases et de cytotoxicité sur diverses lignées cellulaires cancéreuses humaines
Cancer, one of the leading causes of death, represents today a major public health problem. Over the last few years, marine alkaloids represent a source of inspiration for chemists in order to obtain new anticancer drugs. For this purpose, as a part of our laboratory researches, analogues of marine alkaloids were synthesized possessing a tris-aromatic structure. We developed originals analogs of these alacaloïds formed by a central heterocycle core (1,2,4-triazine et imidazo[1,2-b][1,2,4,5]tetrazine) on wich is graft two arylic moiety variously substituted. Obtaining these compounds was also an opportunity to develop news synthetic methodologies. So a new Buchwald-Hartwig reaction type based on methylsulfanyl-1,2,4-triazines has been perfect, as palladocatalyzed CH arylation pathway on imidazo[1,2-b][1,2,4,5]tetrazine. A part is devoted to Groebke-Blackburn multicomponant reaction. Various pharmacological analyses were carried out in particular with inhibition of various kinases and cytotoxicity evaluation on various human cancer cell lines

La protéine Sic1p appartient à la famille des CKI (Cyclin-Dependent-Kinase Inhibitor), de même que p21/Cip1 ou p27/Kip1 chez les cellules de mammifères, et est exprimé de la fin de la mitose à la fin de la phase G1 du cycle cellulaire chez la levure S. Cerevisiae. Le but majeur de ma thèse était de comprendre l'origine de l'instabilité génétique observée dans les cellules dépourvues de Sic1p. Ces cellules présentent une chute de la viabilité, une augmentation de la perte de chromosomes et sont retardées dans le cycle au cours de la mitose. Des travaux réalisés au laboratoire suggéraient que les mutants sic1d préparaient à chaque cycle un nombre insuffisant d'origines de réplication compétentes pour la phase S. Dans la première partie de ma thèse, afin d'étudier d'éventuels défauts de réplication chez les mutants sic1d, j'ai développé un ensemble de techniques moléculaires, électrophorétiques et microscopiques, fondées sur l'incorporation de BrdU et permettant de mesurer précisément la progression de la phase chez la levure. Dans la seconde partie de ma thèse, en utilisant ces techniques, j'ai montré que les cellules sic1d (1) initient la réplication à partir d'un nombre restreint d'origines, (2) ont une phase S allongée et (3) séparent inefficacement leurs chromatides soeurs pendant l'anaphase. De façon surprenante, les cellules sic1d ne sont pas arrêtées en métaphase comme attendu si le checkpoint S/M avait été activé pour permettre la duplication complète des chromosomes. Enfin, j'ai montré que les mutants sic1d ont une fréquence de réarrangements chromosomiques 600 fois supérieure à celle de cellules sauvages, résultant probablement de l'entrée inappropriée en anaphase. Nous proposons que l'activation précoce des CDKs entraîne une instabilité génétique en altérant la dynamique de réplication qui alors perturbe la ségrégation normale des chromosomes
Sic1p belongs to the CKI family (Cyclin-Dependent-Kinase Inhibitor), like p21 or p27 in mammalian cells, and is expressed from the end of mitosis to the end of G1 phase of the cell cycle in the budding yeast S. Cerevisiae. One of the main goals of my thesis was to gain a better understanding of the molecular basis of the genomic instability observed in cells lacking the SIC1 gene. These strains show a decrease in viability, an increase of chromosome loss and are delayed in mitosis. Previous work in the laboratory had suggested, based on genetic evidences, that sic1 mutants suffer from a reduction in the number of competent replication origins. In the first part of my thesis, to better characterize potential replication defects of sic1 strains, I have developed a set of molecular, electrophoretic and microscopic techniques that allow precise monitoring of S phase progression in yeast cells using BrdU incorporation. In the second part of my thesis, using these techniques, I showed that cells lacking Sic1 initiate DNA replication from fewer origins, have an extended S phase and inefficiently separate sister chromatids during anaphase. To our surprise, sic1d cells were not retarted at metaphase as expected if the S/M checkpoint were triggered to allow completion of replication before mitosis. Sic1d mutants show a 600-fold increase in the frequency of gross chromosomal rearrangements, probably as a consequence of inappropriate entry into anaphase. We propose that precocious CDK activation causes genomic instability by altering the dynamics of S phase which then hinders normal chromosome segregation

Even though the understanding of cell-cycle regulators in plants has tremendously increased over the last years, still little is known about cell-cycle regulation in response to environmental signals like DNA damage. A ubiquitous stress for any organism is DNA stress that can either be caused by exogenous sources or internal processes like chromatid separation or DNA strands separation during replication. The posttranslational regulation of Cdk1-type kinases through inhibitory phosphorylation through Wee1-type kinases in the so-called P-loop at the residue Tyr15 or the analogous positions has been found to be of pivotal importance for the arrest of the cell cycle after DNA damage in yeast and animals. But this mechanism is apparently not conserved in plants, as suggested by the hypersensitivity analysis of CDKA;1 dephospho-mutants. The first half of this study focus on possible regulation of CDKA;1 through T-loop phosphorylation upon replication stress in Arabidopsis. The positively acting phosphorylation on T161 and analogous residues in the so-called T-loop of the kinase that is required for full CDK activity and serves in substrate recognition. Remarkably, a T-loop phospho-mimicry mutant of CDKA;1, was almost 100% resistant to hydroxyurea (HU) and can partially rescue the hypersensitivity of wee1 to HU. T-loop phosphorylation is catalyzed by CDK activating kinases (CAKs) that are themselves CDKs with typical P- and T-loop regions. Evidence is obtained that WEE1 might inhibit CDKDs (Cdk-activating kinases) that would subsequently result in reduced CDKA;1 activity, and thus, cell-cycle arrest upon DNA damage. It is revealed that dephospho-mimicry mutants of CDKD;2 and 3, which can not be inhibited through WEE1 showed hypersensitivity to HU and not to bleomycin, suggesting their involvement in cell-cycle arrest specifically upon replication stress. Hypersensitivity of cdkd;2cdkd;3 to replication stress suggested possible activation of CDKA;1 through CDKD;1 independent of WEE1. An essential role of CDKDs in stabilizing CDKA;1 kinase activity during gamete development has been suggested. Defects observed in cdka;1VFcdkd mutants during meiosis but not in cdka;1VF mutants emphasize on importance of CDKA;1 T-loop phosphorylation for appropriate meiotic division.In second part of this study interaction between cell-cycle and circadian has been studied. A feedback loop in which the cell cycle could potentially regulate the circadian clock was suggested as a number of circadian genes were found to be deregulated in a microarray experiment with holomorphic CDKA;1 mutants. Thus the circadian gating of cell division of wildtype and cdka;1 mutants was studied under diurnal growth conditions. The altered time of division observed in cell-cycle mutants supported the idea of cell-cycle regulation in a time dependent manner. Expression profile of clock genes were analyzed in cdka;1 mutants through luciferase assay system. An altered period and intensity of expression observed in these mutants compared to wild type plants suggested a direct or indirect effect of CDKA;1 activity on clock gene expression.

Orientador: Fernanda Canduri
Banca: Andreia Machado Leopoldino
Banca: José Ramon Beltran Abrego
Resumo: As CDKs têm sido extensivamente estudadas, porque exercem papéis essenciais na regulação da proliferação celular, nos processos neuronais e transcricionais. A progressão do ciclo celular é firmemente controlada pela atividade das CDKs. Este projeto de Mestrado tem como objetivo estudar a interação das proteínas CDK8 e CDK10 com vários inibidores, e estabelecer as bases estruturais para inibição das mesmas. Foram realizadas modelagens moleculares dos complexos binários CDKs:Inibidores, utilizando como molde a estrutura da CDK2 complexada com os mesmos ligantes: ATP, flavopiridol, olomoucina e roscovitina. Para realização dessas modelagens foi utilizado o programa Parmodel, que é uma implementação paralela do programa MODELLER. Espera-se que os modelos computacionais produzam avanços no entendimento de suas estruturas, destacando-se seus sítios de ligações, para um possível estudo sobre inibidores específicos para estas CDKs.
Abstract: The CDKs have been extensively studied because of their essential role in the regulation of cell proliferation, in the neuronal process and transcription. Cell cycle progression is tightly controlled by the activity of CDKs. This master project aimed to study the interaction of the CDK8 and CDK10 with several inhibitors in order to establish the structural bases for its inhibition. Were carried out the molecular modeling of the binary complexes CDKs:Inhibitors, using as template the CDK2 structure with the following ligands and inhibitors: ATP, Flavopiridol, Olomoucine and Roscovitine. For the achievement of those modeling was utilized the Parmodel program which is a parallel implementation of the MODELLER program. One expects that the computational models produce advances in the agreement structures, showing their binding sites, for a possible study about specific inhibitors against CDKs.
Mestre

Les flavonoides sont des composes d'origine vegetale exercant une action pleiotropique au niveau cellulaire. Ils sont notamment consideres comme de bons inhibiteurs de la proliferation bien que leurs cibles au niveau du cycle cellulaire ne soient pas connues. La progression des cellules eucaryotes au travers des differentes phases du cycle cellulaire est controlee par une famille de ser/thr kinases, les cdks (cyclin-dependent kinases) associees a leurs partenaires cyclines. La formation et l'activation des complexes cdk-cyclines s'effectuent selon un ordre precis permettant le bon deroulement du cycle. Toute perturbation dans l'expression ou l'activite des proteines participant a ce reseau integre peut conduire a une deregulation de la proliferation et a la transformation cellulaire. Nous avons recherche les effets du ly294002, derive du flavonol quercetine, sur la proliferation de cellules de melanome choroidien humain ocm-1, sur l'expression et l'activite des complexes cdk-cyclines impliques dans la progression en g1 et la transition g1/s. Nous montrons que cet inhibiteur de pi 3-kinases induit un arret des cellules en g1 par inhibition des activites cdk2 et cdk4. L'inhibition de cdk4 est probablement due a une diminution de son expression, alors que l'inhibition de cdk2 resulte d'une expression accrue de p27 k i p 1 et d'une augmentation de son association a cdk2. Afin d'etablir des relations structure/fonction, nous avons etendu cette etude a divers membres de la famille des flavonoides. Nous montrons que les composes qui induisent un arret des cellules en phase g1 inhibent specifiquement cdk2 en augmentant le taux de p27 k i p 1 et/ou p21 c i p 1. Les composes qui conduisent a un bloc g2 inhibent cdk1 en maintenant la kinase phosphorylee sur la tyr15. Ceci est vraisemblablement la consequence de l'inactivation de la phosphatase cdc25c comme nous le montrons dans le cas de la genisteine. Nous avons egalement etabli que p21 n'est pas implique dans l'arret des cellules en phase g2 induit par ce compose.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:22:54Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-12-22Bitstream added on 2014-06-13T19:08:27Z : No. of bitstreams: 1 silva_arl_me_sjrp.pdf: 1113092 bytes, checksum: 4bc901361a078aaf5ad31ba8777c0f38 (MD5)
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
As CDKs têm sido extensivamente estudadas, porque exercem papéis essenciais na regulação da proliferação celular, nos processos neuronais e transcricionais. A progressão do ciclo celular é firmemente controlada pela atividade das CDKs. Este projeto de Mestrado tem como objetivo estudar a interação das proteínas CDK8 e CDK10 com vários inibidores, e estabelecer as bases estruturais para inibição das mesmas. Foram realizadas modelagens moleculares dos complexos binários CDKs:Inibidores, utilizando como molde a estrutura da CDK2 complexada com os mesmos ligantes: ATP, flavopiridol, olomoucina e roscovitina. Para realização dessas modelagens foi utilizado o programa Parmodel, que é uma implementação paralela do programa MODELLER. Espera-se que os modelos computacionais produzam avanços no entendimento de suas estruturas, destacando-se seus sítios de ligações, para um possível estudo sobre inibidores específicos para estas CDKs.
The CDKs have been extensively studied because of their essential role in the regulation of cell proliferation, in the neuronal process and transcription. Cell cycle progression is tightly controlled by the activity of CDKs. This master project aimed to study the interaction of the CDK8 and CDK10 with several inhibitors in order to establish the structural bases for its inhibition. Were carried out the molecular modeling of the binary complexes CDKs:Inhibitors, using as template the CDK2 structure with the following ligands and inhibitors: ATP, Flavopiridol, Olomoucine and Roscovitine. For the achievement of those modeling was utilized the Parmodel program which is a parallel implementation of the MODELLER program. One expects that the computational models produce advances in the agreement structures, showing their binding sites, for a possible study about specific inhibitors against CDKs.

Orientador: Ricardo de Lima Zollner
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas
Made available in DSpace on 2018-08-24T11:47:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Figueiredo_Daniellade_M.pdf: 3504963 bytes, checksum: 2a5ced4957aa0233b6b6f5417ad31dc3 (MD5) Previous issue date: 2014
Resumo: A procura por novos fármacos a partir de plantas medicinais tem motivado a busca alternativa de substâncias com potencial antiinflamatório que possam auxiliar no tratamento das doenças inflamatórias, como no caso do diabetes mellitus tipo1. Como ferramenta para estudar essas substâncias que modulam a inflamação, é comum o uso de animais com propensão a desenvolver a doença, como os camundongos NOD (diabéticos não obesos). Dentre os constituintes das folhas de Passiflora alata Curtis, conhecido popularmente por maracujá doce, os flavonóides são compostos que podem atuar como antioxidantes e antiproliferativos, podendo modular a expressão de substâncias reguladoras do ciclo celular promovendo, desta forma, a sua interrupção em células em proliferação. Como resultados, nós obtivemos no grupo tratado com extrato aquoso das folhas de P. alata, redução na incidência do diabetes, aumento da expressão de insulina e diminuição do infiltrado inflamatório, estresse oxidativo e células CDK6+ em ilhotas pancreáticas. Como neste modelo animal a expressão de CDK6 está presente no infiltrado inflamatório, a sua diminuição no grupo tratado sugere que componentes nas folhas de P. alata possam atuar na inibição do ciclo celular de células inflamatórias ativadas promovendo efeito antiinflamatório e, consequentemente, diminuição na incidência do diabetes tipo 1. Visto os efeitos antiinflamatórios e consequente preservação de células beta, o estudo visa investir no desenvolvimento de novas drogas com potencial de interferir na evolução da doença, atuando desta forma como suporte no tratamento do diabetes autoimune
Abstract: The search for new medicinal drugs from plants has motivated the search for alternative potential anti-inflammatory substances that may assist in the treatment of inflammatory diseases, such as type 1 diabetes mellitus. As a tool to study these substances that modulate inflammation, is common to use animals with a propensity to develop the disease, such as NOD mice (non-obese diabetic). Among the constituents of Passiflora alata Curtis leaves, known popularly as sweet passion fruit, flavonoids are compounds that can act as antioxidants and anti-proliferative, which can modulate the expression of cell cycle regulatory substances promoting in this way, the cell cycle arrest in proliferating cells. As a result, we have obtained in the treated group with P. alata leaves aqueous extract, reduction in the incidence of diabetes, increased expression of insulin and decreased inflammatory infiltrate, oxidative stress and CDK6+ cells in pancreatic islets. As in this animal model the marking of CDK6 is present in the inflammatory infiltrate, the decreased expression of this protein in the treated group suggests that components in the leaves of P. alata may act on cell cycle inhibition of activated inflammatory cells promoting anti-inflammatory effect and reduction in the incidence of type 1 diabetes. Since the anti-inflammatory effects and consequent preservation of beta cells, the study intend to investing in the development of new drugs with the potential to interfere with the course of the disease, acting as a support in the treatment of autoimmune diabetes
Mestrado
Clinica Medica
Mestra em Clínica Médica

La Transició Epiteli-Mesènquima és el mecanisme pel qual les cèl·lules epitelials generades en regions particulars, poden dissociar-se de l'epiteli i migrar cap a nous destins, gràcies a uns canvis morfològics que transformen les cèl·lules epitelials en cèl·lules mesenquimals. Aquest procés fonamental durant el desenvolupament, també és rellevant en la progressió de tumors epitelials malignes i en tots dos casos les cèl·lules perden cohesió i adhesió i guanyen mobilitat. Aquests processos morfogènics impliquen una reorganització important del citoesquelet que serà incompatible amb un estat proliferatiu actiu, fins que les cèl·lules necessitin colonitzar un nou territori.
Snail és un factor clau en la regulació dels processos EMT, tant en el desenvolupament com en la progressió tumoral gràcies a la seva capacitat de reprimir directament la transcripció de gens epitelials i promoure l'expressió de gens mesenquimals.
Uns clons estables de dues línies cel·lulars epitelials, generats en el nostre grup proliferaven més lentament a l'expressar Snail de manera que ens vam proposar descriure el mecanisme utilitzat per Snail per fer disminuir la taxa de proliferació cel.lular al ser expressat ectòpicament en cèl.lules en cultiu que havien patit una EMT.
Els resultats d'aquesta tesi indiquen que Snail bloqueja el cicle cel·lular al ser expressat en cèl·lules epitelials fent que disminueixin els nivells de proteïna CDC25A, fosfatasa que pot activar els complexes CDK-ciclina implicats en la progressió per diverses etapes del cicle. Els nostre estudi suggereix que Snail reté el mRNA de CDC25A al nucli, impedint que sigui exportat i traduit.

Thesis (Ph. D.)--Ohio State University, 2005.
Title from first page of PDF file. Document formatted into pages; contains xix, 94 p.; also includes graphics (some col.). Includes bibliographical references (p. 87-94). Available online via OhioLINK's ETD Center

This thesis explores Centralised Demand Information Sharing (CDIS) in supply chains. CDIS is an information sharing approach where supply chain members forecast based on the downstream member’s demand. The Bullwhip Effect is a demand variance amplification phenomenon: as the demand moves upstream in supply chains, its variability increases. Many papers in the literature show that, if supply chain members forecast using the less variable downstream member’s demand, this amplification can be reduced leading to a reduction in inventory cost. These papers, using strict model assumptions, discuss three demand information sharing approaches: No Information Sharing (NIS), Downstream Demand Inference (DDI) and Demand Information Sharing (DIS). The mathematical analysis in this stream of research is restricted to the Minimum Mean Squared Error (MMSE) forecasting method. A major motivation for this PhD research is to improve the above approaches, and assess those using less restrictive supply chain assumptions. In this research, apart from using the MMSE forecasting method, we also utilise two non-optimal forecasting methods, Simple Moving Averages (SMA) and Single Exponential Smoothing (SES). The reason for their inclusion is the empirical evidence of their high usage, familiarity and satisfaction in practice. We first fill some gaps in the literature by extending results on upstream demand translation for ARMA (p, q) processes to SMA and SES. Then, by using less restrictive assumptions, we show that the DDI approach is not feasible, while the NIS and DIS approaches can be improved. The two new improved approaches are No Information Sharing – Estimation (NIS-Est) and Centralised Demand Information Sharing (CDIS). It is argued in this thesis that if the supply chain strategy is not to share demand information, NIS-Est results in less inventory cost than NIS for an Order Up To policy. On the other hand, if the strategy is to share demand information, the CDIS approach may be used, resulting in lower inventory cost than DIS. These new approaches are then compared to the traditional approaches on theoretically generated data. NIS-Est improves on NIS, while CDIS improves on the DIS approach in terms of the bullwhip ratio, forecast error (as measured by Mean Squared Error), inventory holding and inventory cost. The results of simulation show that the performance of CDIS is the best among all four approaches in terms of these performance metrics. Finally, the empirical validity of the new approaches is assessed on weekly sales data of a European superstore. Empirical findings and theoretical results are consistent regarding the performance of CDIS. Thus, this research concludes that the inventory cost of an upstream member is reduced when their forecasts are based on a Centralised Demand Information Sharing (CDIS) approach.

Protein phosphorylation by members of the cyclin-dependent kinase (CDK) family determines the cell cycle and regulates gene transcription. CDK12 and CDK16 are relatively poorly characterised family members containing atypical domain extensions and represent novel targets for structural studies, as well as cancer drug discovery. In this thesis, I developed protocols to express and purify the human CDK12 kinase domain in complex with its obligate partner, CycK. I solved three distinct crystal structures of the complex providing insights into the structural mechanisms determining CycK assembly and kinase activation. These structures revealed a C-terminal kinase extension that folded flexibly across the active site of CDK12 to potentially gate the binding of the substrate ATP. My structures also identified Cys1039 in the C-terminal extension as the binding site for the first selective covalent inhibitor of CDK12, which has enormous potential as a pharmacological probe to investigate the functions of CDK12 in the DNA damage response and cancer. I also identified rebastinib and dabrafenib as potent, clinically-relevant inhibitors of CDK16 and solved a co-crystal structure that defined the extended type II binding mode of rebastinib. Preliminary trials using these relatively non-selective compounds to inhibit CDK16 in melanoma and medulloblastoma cancer cell lines revealed rebastinib as the more efficacious drug causing loss of cell proliferation in the 1-2 micromolar range. Use of the co-crystal structure to design more selective derivatives would be advantageous to further explore the specific role of CDK16. Finally, I identified a D-type viral cyclin from Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus that could bind to the CDK16 kinase domain and interfere with its functional complex with human CycY causing loss of CDK16 activity. These studies provide novel insights into the structural and regulatory mechanisms of two underexplored CDK family subgroups and establish new opportunities for cancer drug development.

Ischemic stroke occurs as a result of a lack or severe reduction of blood supply to the brain. Presently therapeutic interventions are limited and there is a need to develop new and efficacious stroke treatments. To this end, a great deal of research effort has been devoted to studying the potential molecular mechanisms involved in ischemic neuronal death. Correlative evidence demonstrated a paradoxical activation of the cell cycle machinery in ischemic neurons. The levels and activity of key cell cycle regulators including cyclin D1, Cdk2 and Cdk4 are upregulated following ischemic insults. However, the functional relevance of these various signals following ischemic injury was unclear. Accordingly, the research described in this thesis address the functional relevance of the activation of the cell cycle machinery in ischemic neuronal death. The data indicate that the inhibition of Cdk4 protects neurons from ischemia-induced delayed death, whereas abrogation of Cdk5 activity prevents excitotoxicity-induced damage in vitro and in vivo. Examination of upstream activators of mitotic-Cdks showed that Cdc25A is a critical mediator of delayed ischemic neuronal death. Investigation of the potential molecular mechanism by which cell cycle regulators induced neuronal death revealed perturbations in the levels and activity of key downstream targets of Cdk4. The retinoblastoma protein family members, pRb and p130 are increasingly phosphorylated following ischemic stresses. Importantly, p130 and E2F4 proteins are drastically reduced following ischemic insults. Additionally, E2F1 association with promoters of pro-apoptotic genes are induced while that of E2F4 is reduced. These changes appear to be important determinants in ischemic neuronal death. Cumulatively, the data supports the activation of the cell cycle machinery as a pathogenic signal contributing to ischemic neuronal death. The development of neuroprotectant strategies for stroke has been hampered in part by its complex pathophysiology. Previous research indicated that flavopiridol, a general CDK-inhibitor, is unable to provide sustained neuroprotection beyond one week following cerebral ischemia. The potential benefit of combining flavopiridol with another neuroprotectant, minocycline, was explored. The data indicate that while this approach provided histological protection 10 weeks after insult, the protected neurons are not functional due to progressive dendritic degeneration. This evidence indicates that targeting cell cycle pathways in stroke while important must be combined with other therapeutic modalities to fully treat stroke-induced damage.

La dérégulation du système de surveillance qui bloque la prolifération lorsque l'intégrité du génome est compromise fait partie intégrante de la cancérogenèse. Nous cherchons à décortiquer les mécanismes qui, en phase G2, orchestrent l'arrêt du cycle cellulaire, irréversible, en présence des lésions de l'ADN (sénescence) ou réversible (quiescence), en absence de signaux mitogéniques ou confluence. L'objectif du premier volet fut d'élucider les rôles respectifs de l'inhibiteur de CDK (CKI) p21Waf1 et des kinases Chk1 et Chk2 dans l'arrêt en G2 dû au stress génotoxique menant à la sénescence. Nous avons montré que dans les cellules humaines normales cet arrêt nécessite l'action de p21 et Chk1 tandis que Chk2 n'est pas requise. Au contraire, dans plusieurs lignées cancéreuses, malgré la présence de p53, ce rôle de p21 est compromis à cause d'une activation inefficace de la kinase ATM. Par conséquent, en dépit d'une forte activation de Chk1 bloquant la mitose, ces cellules ne parviennent pas à initier la sénescence (Lossaint et al., soumis). L'objectif du deuxième volet fut de mettre en évidence le programme déclenchant la quiescence lors de confluence ou en absence de sérum. Les travaux antérieurs de l'équipe ont montré que cette décision pouvait être prise avant la mitose même si l'arrêt du cycle n'a lieu qu'en phase G1 suivante. En étudiant les fibroblastes synchronisés nous avons trouvé que la quiescence est précédée par l'inhibition pré-mitotique de la phosphorylation de pRb due à une diminution de cycline D1 et une stabilisation du CKI p27Kip1 (Chassot et al., 2008). De plus, nos résultats récents montrent que la présence de sérum entre le point R et la mitose est requise pour initier la réplication de l'ADN au cycle suivant. Les travaux futurs devraient élucider comment différentes voies de signalisation, via la voie cycline D-pRb, affectent divers composants de l'appareil de réplication de l'ADN pour inhiber la progression du cycle de façon réversible ou irréversible
Cancer is a multi-step process resulting from abrogation of several barriers to uncontrolled proliferation. They include inhibitory pathways with appropriate checkpoints that lead to reversible (quiescence) or irreversible (senescence, apoptosis) block of cell proliferation. We are especially interested in pathways orchestrating cell cycle exit that operate in the G2 phase. The first objective of this thesis was to decipher mechanisms that prevent mitosis in response to DNA damage. We found that Cdk inhibitor p21Waf1 plays a crucial role in blocking mitotic onset in normal cells; acting in tandem with checkpoint kinase Chk1, p21 inactivates mitotic Cdks and inhibits pRb phosphorylation, thereby irreversibly blocking mitotic entry. In contrast, in p53-proficient transformed cells, the induction of p21 in G2 is impaired, most likely because of deficient ATM activation. While, in some cases, Chk1 hyper-activation prevents mitosis, the absence of p21 compromises the senescence program from G2. Finally, we showed that Chk2 is dispensable for G2 arrest in both non-transformed and transformed cells (Lossaint et al., submitted). Our second objective was to elucidate the pathways that induce quiescence (G0). This reversible cell cycle exit occurs in G1, requires pRb family members and p27Kip1-dependent Cdk inactivation. Based on observations obtained in our team and the data in the literature, we hypothesized that reversible cell cycle exit program might be launched before mitosis. By using an in vitro wounding model, we showed that confluence-driven quiescence is preceded by pre-mitotic CDK inhibition by p27, cyclin D1 downregulation and reduced pre-mitotic pRb phosphorylation (Chassot et al., 2008). Moreover, our results obtained in synchronized fibroblasts that were serum-starved after release from G1/S block suggest that cyclin D1 might stimulate proliferation by keeping pocket proteins phosphorylated during G2/M progression (Lossaint et al., in preparation)

La phosphorylation des protéines par les kinases est l’une plus importantes modification post-traductionnelle dans les processus cellulaires tels que la division, la différenciation, la prolifération et l’apoptose. Due à leur rôle clef, un dérèglement des protéines kinases peut entrainer de nombreuses pathologies proliférative telles que le cancer et non prolifératives telles que les maladies neurodégénératives. Le travail de thèse s’est construit autour de 2 séries d’inhibiteurs de protéine kinases comportant les noyaux imidazo[1,2-b]pyridazine et imidazo[4,5-b]pyridine. L’objectif est d’inhiber sélectivement les protéines kinases choisies, pour leurs implications dans les pathologies visées au laboratoire. Les imidazo[1,2-b]pyridazines ont été préparées pour identifier des inhibiteurs de CLK1 et DYRK1A, cibles potentielles dans la maladie d’Alzheimer. Parmi les imidazo[1,2-b]pyridazines synthétisées, plusieurs molécules se sont révélées particulièrement sélectives de DYRKs et CLKs, avec des IC50 < 100 nM. Une relation structure-activité basée sur la synthèse de 70 molécules, a permis de dégager des éléments structuraux de la sélectivité des molécules. L’évaluation des produits a également été portée sur les kinases de parasites. Il a ainsi été possible d’identifier quelques inhibiteurs actifs sur PfCLK1. La seconde partie de cette thèse avait pour objectif l’optimisation du protocole de synthèse imidazo[4,5-b]pyridines, analogue de la roscovitine. Des dérivés s’étaient révélés capables d’inhiber la formation de kystes, dans un modèle cellulaire de polykystose rénale. Une synthèse en sept étapes a conduit à plusieurs grammes d’imidazo[4,5-b]pyridine 3,5,7 trisubstitués, qui sont ainsi disponibles pour l’évaluation in vivo
Phosphorylation by protein kinases is one of the most important post-translational modification in cellular processes such as division, differentiation, proliferation and apoptosis. Kinase deregulation is associated with numerous diseases such as cancer or neurodegenerative diseases. Imidazo[1,2-b]pyridazine and imidazo[4,5-b]pyridine were prepared to inhibit protein kinases involved in diseases targeted in the laboratory. The imidazo[1,2-b]pyridazines were synthesized to identify inhibitors of CLK1 and DYRK1A, potential targets in Alzheimer's disease. Among the imidazo[1,2-b]pyridazines synthesized, several molecules were found selective of DYRKs and CLKs, with IC50 < 100 nM. A structure-activity relationship based on the synthesis of 70 molecules, led to the identification of the structural bases of the selectivity. Products were also evaluated against parasite kinases. It was possible to identify some highly potent inhibitors on PfCLK1. The aim of second part of this thesis was to optimize the synthetic process to obtain imidazo[4,5-b]pyridines, which are close analogues of roscovitine. Derivatives had proved capable of inhibiting the formation of cysts in a cellular model of polycystic kidney disease. A seven-step synthesis has led to several grams of 3,5,7-trisubstituted imidazo[4,5-b]pyridine which is now available for evaluation in vivo

Le cancer, qui est la deuxième cause de mortalité en France, est aujourd'hui un problème de santé publique majeur et fait l'objet de multiples recherches. De nombreuses molécules ont été synthétisées dans l'optique de trouver des médicaments plus efficaces, plus sélectifs et surtout présentant moins d'effets secondaires. Parmi ces molécules se trouve la famille des indolocarbazoles, dont la rébeccamycine et la staurosporine sont les représentants les plus connus. Les relations structure-activité (RSA) de cette famille ont été étudiées.
Dans le cadre de la recherche de nouveaux agents cytotoxiques et d'inhibiteurs de kinases toujours plus sélectifs, la structure principale des phénylcarbazoles, appartenant à la famille des indolocarbazoles, a été modifiée par introduction d'une tropone centrale, cycle à 7 chaînons porteur d'une fonction carbonyle. Les différentes voies de synthèse permettant d'accéder à cette nouvelle famille de composés appelés oxophénylarcyriaflavines ont été étudiées. La méthode de choix retenue pour l'étape finale de la synthèse est la cyclisation électrophile en position 2 de l'indole. Cette synthèse a ensuite été généralisée aux composés substitués par des groupements hydroxyles en position 5 de l'indole d'une part et en position 4' et 5' du noyau phényle d'autre part. Les 17 molécules finales ainsi synthétisées ont subi divers tests biologiques permettant d'établir les RSA de cette nouvelle famille de composés. Finalement, la méthodologie mise au point pour les oxophénylarcyriaflavines a été étendue à la synthèse de la toute première famille de composés bisindoliques possédant également une tropone centrale.

Η αλματώδης πρόοδος που έχει γινει τα τελευταία χρόνια στην αποκωδικοποίηση των σηματοδοτικών μονοπατιών και η σημαντική αποσαφήνιση των κυτταρικών στοιχείων που εμπλέκονται στην γένεση, την ανάπτυξη, την εξάπλωση του καρκίνου, έχει στρέψει ένα σημαντικό κομμάτι της επιστημονικής κοινότητας προς την κατεύθυνση ανακάλυψης χημικών αναστολέων του κυτταρικού κύκλου. Εξέχοντα ρόλο σε αυτή τη διαδικασία παίζουν οι κυκλινο-εξαρτώμενες κινάσες (cyclin dependent kinases, CDKs). Οι CDKs είναι μια οικογένεια πρωτεϊνικών κινασών σερίνης/θρεονίνης, οι οποίες ενεργοποιούνται σε συγκεκριμένα σημεία του κυτταρικού κύκλου. Η απορρύθμισή τους συμβάλλει στην εκδήλωση παθολογικών καταστάσεων όπως νεοπλασιών και νευροεκφυλιστικών παθήσεων. Η παρούσα εργασία είχε σαν στόχο τη δημιουργία μικρών μορίων που θα αποτελέσουν πρόδρομα σταδια για την σύνθεση ενώσεων οι οποίες θα μελετηθούν ως προς την ικανότητα τους να αναστείλουν την δράση διαφόρων πρωτεϊνικών κινασών, μεταξύ άλλων και των κυκλινο-εξαρτώμενων κινάσων (CDKs). Κατέστη δυνατόν να συντεθεί η ένωση 11 η οποία έχει λειτουργικές ομάδες οι οποίες, αν τροποποιηθούν κατάλληλα, μπορούν να μας δώσουν πρόδρομα μόρια για την σύνθεση τελικών ενώσεων.
The rapid progress made in recent years to decode the signaling pathways and important clarification cellular components involved in the genesis, development, spread of cancer, has turned an important part of scientific community towards the discovery of chemical inhibitors of cell cycle. Prominent role in this process played by cyclin-dependent kinases (cyclin dependent kinases, CDKs). The CDKs are a family of protein serine / threonine kinases that are activated in specific parts of the cell cycle. Deregulation contributes to the onset illnesses such as cancer and neurodegenerative diseases This work was aimed at the creation of small molecules that will be precursor stages to synthesize compounds which will be studied in their ability to inhibit the action of various protein kinases including the cyclin-dependent kinases (CDKs). It was possible to synthesize the compound 11 which has functional groups which, if modified properly, can give us precursor molecules for the synthesis of final compounds.

碩士
國立海洋大學
水產生物技術研究所
90
Abstract Microglials are resident monocyte-lineaged cells in the brain. Their characteristic feature is that they react to injury and diseases of the brain and become functionally activated and generates (ROS) reactive oxygen species. Reactive oxygen species play an important role in apoptosis under microglial cells activated. Progression through the cell cycle is regulated by cyclins and cyclin-dependent kinases (CDK). The cyclin inhibitor p21 can induce G1 arrest and block entry into S phase by inactivating CDKs. We conciude that transduction of TAT-p21 into cells resulted in the loss of CDK kinase activity, elicited an G1 cell cycle arrest, and inhibited apoptosis elicited by oxidative stress.

Σκοπός της παρούσης εργασίας είναι η στατιστική ανάλυση της σχέσης δομής-δράσης των χημικών ενώσεων που παράγονται από οξινδόλια και πουρίνες πάνω στα σύμπλοκα CDKs/Cyclins και η εξαγωγή συμπερασμάτων πάνω στις σχέσεις αυτές. Για το σκοπό αυτό ανατρέξαμε στην διεθνή βιβλιογραφία για να συλλέξουμε όσες πληροφορίες έχουν δημοσιευτεί έως τώρα για τις δύο αυτές ομάδες ενώσεων. Έπειτα μέσω ειδικών προγραμμάτων έγινε η επεξεργασία τους και η ανάλυση τους. Σκοπός είναι να συσχετίσουμε τη δομή των ενώσεων αυτών με τη δράση και τη βιολογική τους απόκριση πάνω στα σύμπλοκα των CDKs με τις κυκλίνες.
-

The L5 signal of the Global Positioning System (GPS) is becoming available on an increasing number of Block IIF satellites. As the third civilian signal, L5 is superior in signal design to the L1 C/A and L2C civilian signals. This new signal has been marked healthy for use on selected satellites since 2010, yet the hardware capable of tracking the L5 signal is still in the early stages of development. This work investigates the characteristics of the new signal and the quality of data produced by L5-tracking receivers. Commonly used receiver models chosen for this study are the Leica GRX1200+GNSS, the Trimble NetR8, and the Javad Delta TRE-G3TH. The metrics used in this analysis to assess the quality of data produced by these receivers are signal strength, receiver phase noise, receiver code noise, and multipath. The data used in these analyses were obtained from the International GNSS Service for the days of the year 275 to 281 in 2011. Metrics averaged over the GPS week 1656 provide a good indication of the overall performance of the receivers.
text

Le cancer de l’ovaire (COv) est le cancer gynécologique le plus létal chez la femme et les traitements existants, chirurgie et chimiothérapie, ont peu évolué au cours des dernières décennies. Nous proposons que la compréhension des différents destins cellulaires tels que la sénescence que peuvent choisir les cellules du cancer de l’ovaire en réponse à la chimiothérapie pourrait conduire à de nouvelles opportunités thérapeutiques. La sénescence cellulaire a été largement associée à l’activité de la protéine TP53, qui est mutée dans plus de 90% des cas de cancer de l’ovaire séreux de haut grade (COv-SHG), la forme la plus commune de la maladie. Dans nos travaux, à partir d’échantillons dérivés de patientes, nous montrons que les cultures primaires du cancer de l’ovaire séreux de haut grade exposées au stress ou à des drogues utilisées en chimiothérapie entrent en senescence grâce à l’activité d’un isoforme du gène CDKN2A (p16INK4A). Dans ces cellules, nous avons évalué les caractéristiques fondamentales de la sénescence cellulaire tels que les altérations morphologiques, l’activité béta galactosidase associée à la sénescence, les dommages à l’ADN, l’arrêt du cycle cellulaire et le phénotype sécrétoire associé à la sénescence. En utilisant des micromatrices tissulaires construites à partir d’échantillons humains de COv-SHG pré- et post-chimiothérapie, accompagnées de leurs données cliniques, nous avons quantifié des marqueurs de sénescence incluant une diminution de la prolifération cellulaire quelques semaines après chimiothérapie. De façon intéressante, l’expression de p16INK4A dans les échantillons de COv-SHG prétraitement corrèle avec une survie prolongée des patientes suite au traitement. Ceci suggère ainsi pour la première fois un impact biologique bénéfique pour la présence de cellules cancéreuses qui sont capable d’activer la sénescence, particulièrement pour le traitement du cancer de l’ovaire. Dans le but de complémenter les thérapies actuelles avec des approches de manipulation pharmacologique de la sénescence, nos résultats suggèrent qu’il serait important de déterminer l’impact positif ou négatif de la sénescence induite par la thérapie sur la progression de la maladie et la survie, pour chaque type de cancer de façon indépendante.
Human ovarian cancer (OvCa) is the deadliest gynecologic malignancy and existing surgical/chemotherapeutic treatment options have been relatively static for decades. We propose that understanding OvCa cell fate decisions taken in response to chemotherapy could guide new therapeutic opportunities. Damage-induced cellular senescence is often associated with TP53 activity, which is heavily mutated in high grade serous (HGS) OvCa (>90%), the most common form of this disease. Here, using patient derived tissues, we show that primary HGS-OvCa cultures predominantly trigger CDKN2A- associated (p16INK4A isoform) senescence following exposure to stress or chemotherapy. Key senescence hallmarks including altered morphology, senescence-associated-Betagalactosidase, DNA damage, cell cycle arrest and the senescence-associated secretory phenotype were evaluated and detected in damaged cells. Using tissue microarrays built from pre- and post-treatment human HGS-OvC tissue samples with accompanying clinical data, we quantified post-treatment hallmarks of senescence including reduced cell proliferation weeks after chemotherapy. Importantly, p16INK4A expression in pretreatment HGS-OvC samples correlated with increased patients survival, suggesting for the first time that senescence-competence in human cancer cells may have a beneficial impact on treatment outcomes for patients. In order to guide the potential improvement of existing human therapies via pharmacological senescence manipulation, our results suggests that it is important to determine for many types of human cancer whether treatment-induced senescence positively or negatively impacts disease progression and patient survival.