Academic literature on the topic 'Cassures simple-brin de l'ADN – Dissertation universitaire'

L'instabilité génomique due à la dérégulation des voies de réparation de l'ADN peut être à l’initiation de cancer et entraîner par la suite une résistance à la chimiothérapie et à la radiothérapie. La compréhension de ces mécanismes biologiques est donc essentielle dans la lutte contre le cancer. RAD51 est la protéine centrale de la voie de réparation des cassures double-brin de l'ADN par recombinaison homologue. Cette réparation conduit à une réparation fidèle de l'ADN. L'activité recombinase de la protéine RAD51 est finement régulée par des modifications post- traductionnelles telles que la phosphorylation. Au cours de la dernière décennie, de plus en plus d’études, suggèrent l'existence d'une relation entre les récepteurs à activité tyrosine kinases, souvent suractivés et impliqués dans l’agressivité et la prolifération cancéreuse, et la réparation de l'ADN. Parmi ces récepteurs à activité tyrosine kinases, le duo c-Met/HGF-SF est souvent muté, sur exprimé ou activé constitutivement dans de nombreux cancers et son inhibition a été montrée comme induisant une diminution de la réparation par recombinaison homologue. Au travers de cette thèse, nous montrons pour la première fois que c-Met est capable de phosphoryler la protéine RAD51 sur quatre résidus tyrosine localisés principalement dans l'interface monomère- monomère du nucléofilament de la recombinase humaine. Nous montrons l’implication de ces phosphorylations sur l’activité de RAD51 dans les différentes étapes de la recombinaison homologue. L'ensemble des résultats obtenus suggère le rôle possible de ces modifications dans la régulation de RAD51 et souligne l'importance de c-Met dans la réponse aux lésions de l'ADN
Genomic instability due to deregulation of DNA repair pathways may be at the onset of cancer and subsequently lead to resistance to chemotherapy and radiotherapy. Understanding these biological mechanisms is therefore essential in the fight against cancer. RAD51 is the core protein of the homologous recombinant double-stranded DNA repair pathway. This repair leads to faithful DNA repair. The recombinase activity of the RAD51 protein is finely regulated by post-translational modifications such as phosphorylation. Over the last decade, more and more studies have suggested the existence of a relationship between receptors with tyrosine kinase activity, which are often overactivated and involved in aggressiveness and cancer proliferation; and DNA repair. Among these receptors with tyrosine kinase activity, the c-Met/HGF-SF duo is often mutated, over-expressed or constitutively activated in many cancers and its inhibition has been shown to induce a decrease in repair by homologous recombination. Through this thesis, we show for the first time that c-Met is able to phosphorylate the RAD51 protein on four tyrosine residues located mainly in the human recombinase nucleofilament monomer- monomer interface. We show the implication of these phosphorylations on the activity of RAD51 in the different steps of homologous recombination. All the results obtained suggest the possible role of these modifications in the regulation of RAD51 and underline the importance of c-Met in the response to DNA damage

Les génomes bactériens évoluent principalement grâce au transfert horizontal de gènes. La conjugaison bactérienne en est un des mécanismes majeurs. Elle est notamment médiée par les éléments intégratifs et conjugatifs (ICE). En plus de leur transfert, les ICE codent d'autres fonctions conférant à leur hôte un avantage adaptatif, comme par exemple des résistances aux antibiotiques dont la diffusion est un enjeu majeur en santé publique. Il est donc nécessaire de comprendre comment les ICE se transfèrent si l'on veut limiter leur dissémination. Le transfert d'un ICE d'une cellule donatrice vers une cellule réceptrice implique son excision du chromosome, son transfert puis son intégration dans les génomes des deux cellules partenaires. Les données de la littérature révèlent que l'initiation de ce transfert est médiée par un complexe nucléoprotéique appelé relaxosome, dont la protéine clé est la relaxase, une transestérase codée par l'élément. Le rôle de la relaxase est d'effectuer une coupure simple brin sur l'ADN de l'ICE au niveau d'un site conservé, appelé nic. Ce clivage libère une extrémité 3'OH libre, servant d'amorce pour initier la réplication en cercle roulant. Le complexe ADN-relaxase est alors dirigé vers le pore de conjugaison. Au cours de ma thèse j'ai étudié un ICE modèle, ICESt3 de Streptococcus thermophilus qui appartient à la superfamille ICESt3/Tn916/ICEBs1, très répandue chez les Firmicutes. Ces ICE possèdent une relaxase non canonique, appartenant à la famille MOBT, apparentée aux initiateurs de réplication à cercle roulant de la famille Rep_trans. L'objectif de ma thèse était d'élucider le fonctionnement de la relaxase RelSt3 afin de décrypter les mécanismes moléculaires d'initiation du transfert conjugatif médié par une relaxase MOBT. Mes recherches ont conduit à l'identification du site de liaison de RelSt3 sur l'origine de transfert (oriT) d'ICESt3. Ce site, appelé bind, a pour originalité d'être distant du site nic, ce qui n'est pas le cas des autres familles de relaxases. RelSt3 présente un domaine HTH à son extrémité N-terminal. J'ai montré que ce domaine est requis pour la fixation de RelSt3 sur le site bind, et important pour son activité catalytique. Des tests de conjugaison ont démontré que ce domaine HTH est crucial pour le transfert conjugatif d'ICESt3. Des prédictions structurales de ce domaine en complexe avec l'ADN ont conduit à l'identification de l'interface d'interaction avec le site bind, confirmée par mutagénèse dirigée. J'ai également démontré que RelSt3 présente une activité de coupure-religature et qu'elle se fixe de façon covalente sur l'extrémité 5' du brin clivé, démontrant ainsi que cette enzyme participe aux étapes initiale et terminale de la conjugaison. Dans la littérature, il a été démontré que les relaxases interagissent fréquemment avec d'autres protéines accessoires, codées par l'ICE ou la bactérie hôte pour former le relaxosome. Le deuxième objectif de ma thèse était d'identifier des partenaires de RelSt3. L'analogie avec ICEBs1 chez Bacillus subtilis a permis d'identifier deux protéines candidates OrfL et OrfM codées par ICESt3, ainsi qu'une hélicase cellulaire, probablement impliquée dans la réplication en cercle roulant, nommée PcrA. Une caractérisation de ces protéines candidates a été effectuée en utilisant des approches biochimiques et biophysiques. Le réseau d'interaction entre l'ensemble de ces protéines a été dressé en utilisant des approches in vitro, ainsi que l'approche double hybride in vivo. Ces données nous permettent d'avoir un premier aperçu des constituants du relaxasome d'ICESt3. J'ai par ailleurs montré que OrfL et OrfM stimulent l'activité catalytique de RelSt3 in vitro, et qu'elles sont toutes les deux essentielles à la conjugaison d'ICESt3.Ce travail nous apporte une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires en jeu lors de la conjugaison d'un ICE pilotée par une relaxase de la famille MOBT
Bacterial genomes evolve mainly through horizontal gene transfer. Bacterial conjugation is one of the major mechanisms for these transfers. Conjugation is mediated by integrative and conjugative elements (ICE). In addition to their transfer function, ICEs encode other functions that may provide an adaptive advantage to their host, such as resistance to antibiotics whose dissemination is a major public health issue. It is therefore necessary to understand how ICEs are transferred in order to limit their dissemination.The transfer of an ICE from a donor cell to a recipient cell requires its excision from the chromosome, its transfer from one cell to the other and then its integration into the genomes of the two partner cells. According to the literature, the initiation of ICE transfer is mediated by a nucleoprotein complex called relaxosome, whose key protein is the relaxase, a transesterase encoded by the element. The role of the relaxase is to perform a single-stranded cleavage on the DNA of the ICE at a conserved site, called nic. This cleavage releases a free 3'OH end, used as a primer to initiate rolling circle replication. The DNA-relaxase complex is then driven to the conjugation pore.During my PhD thesis, I studied ICESt3 from Streptococcus thermophilus which belongs to the ICESt3/Tn916/ICEBs1 superfamily, widespread among Firmicutes. These ICEs encode a non-canonical relaxase belonging to the MOBT family, which is related to the rolling circle replication initiators of the Rep_trans family. The general objective of my thesis was to elucidate the function of the RelSt3 relaxase in order to decipher the molecular mechanisms of initiation of conjugative transfer mediated by a MOBT relaxase.My work led to the identification of the RelSt3 binding site on ICESt3 origin of transfer (oriT). This site, called bind, is peculiar in that it is distant from the nic site, which is not the case for other relaxase families. RelSt3 possesses an HTH domain at its N-terminus. I have shown that this domain is required for the binding of RelSt3 to its bind site, and that it is important for its catalytic activity. Conjugation assays demonstrated that this HTH domain is crucial for the conjugative transfer of ICESt3. Structural predictions of the HTH domain in complex with DNA led to the identification of the interaction interface with the bind site, confirmed by mutagenesis. I also demonstrated that RelSt3 exhibits a nicking-closing activity and that it covalently binds to the 5' end of the cleaved strand, demonstrating that this enzyme participates in both initial and final steps of conjugation.In the literature, it has been shown that relaxases interact frequently with other accessory proteins, encoded by the ICE or by the host bacteria, participating in relaxosome formation. The second objective of my thesis was to identify RelSt3 partners. Comparisons with available data on ICEBs1 from Bacillus subtilis allowed to identify two candidate proteins, OrfL and OrfM, that may belong to the relaxosome of ICESt3, as well as a cellular helicase, PcrA , probably involved in the rolling circle replication. A characterization of these proteins was performed using biochemical and biophysical approaches. The interaction network between all of these proteins was established using in vitro approaches, as well as with the in vivo two-hybrid approach. These data provide a first insight into the components of the ICESt3 relaxasome. I also showed that OrfL and OrfM stimulate the catalytic activity of RelSt3 in vitro, and that they are both essential for ICESt3 conjugation.This work lead to a better understanding of the molecular mechanisms required during the conjugation of an ICE driven by a MOBT family relaxase

Les gènes BRCA et FANC, impliqués respectivement dans la prédisposition familiale au cancer du sein et dans l'anémie de Fanconi, font partie des gènes suppresseurs de tumeurs de type " caretakers " et jouent un rôle important dans le maintien de la stabilité du génome. Ces gènes sont étroitement associés et pourraient participer dans une voie métabolique commune. L'objectif de mon travail de thèse à été de mieux comprendre leur rôle dans la réparation des cassures double brin de l'ADN (CDB) chez l'Homme. En utilisant des approches moléculaires basées sur l'utilisation de substrats extrachromosomiques ou intégrés dans le génome, porteurs de CDB-modèles, nous avons examiné l'impact de l'inactivation de ces gènes, par ARN interférant, sur le fonctionnement des deux voies majeures de réparation des CDB : la voie End-Joining (EJ) et la Recombinaison Homologue (RH). Nous avons montré que : (i) la déplétion de BRCA1 affecte sévèrement le processus EJ ; (ii) le lien moléculaire entre BRCA1 et cette voie de réparation est l'association de BRCA1 avec XRCC4, l'un des acteurs principaux de ce mécanisme : (iii) les produits des gènes FANCF et FANCG, appartenant au core complexe FANC, contrôlent la voie EJ, mais ne sont pas impliqués dans la RH ; (iv) FANCJ et FANCD1/BRCA2, dont l'action se situe en aval du complexe FANC (comme BRCA1), contrôlent la RH. En conclusion, l'ensemble des résultats montre que la voie BRCA/FANC intervient dans la réparation des CDB et suggère une spécialisation fine des gènes qui y participent
The BRCA and FANC genes (respectively implicated in breast cancer predisposition and in Fanconi anemia) are classified as “caretakers” tumor suppressor genes and are involved in the maintenance of genomic stability. These genes are tightly associated and could participate in a common pathway. The aim of my thesis work was to improve our understanding of there function in the DNA double strand break (DSB) repair in Human cells. By using molecular approaches based on intra- or extra- chromosomal substrates, carrying model-DSB, we studied the impact of siRNA mediated depletion of these factors on the two major DSB repair pathways in mammalian cells: End-joining (EJ) and Homologous Recombination (HR). We have shown that: (i) BRCA1 depletion severely impairs the EJ pathway, (ii) the novel interaction between BRCA1 and XRCC4 (a key actor of EJ), constitutes a molecular and functional link between BRCA1 and this repair pathway; (iii) depletion of the Fanconi genes products FANCF and FANCG, which belong to the core complex, leads to an impairment of EJ but does not affect HR; (iv) FANCJ and FANCD1/BRCA2 which act downstream of the complex, control HR. On conclusion, our work shows that the BRCA/FANC pathway is implicated in DSB repair, and suggests a tight specialisation of each gene

L'objectif de mon travail de thèse a été de mieux comprendre le rôle des gènes BRCA (prédisposition familiale aux cancers du sein) et FANC (anémie de Fanconi) dans la gestion des cassures double brin de l'ADN (CDB). La progression du cycle cellulaire en présence de CDB et le recrutement des protéines impliquées dans la gestion de ces lésions ont été étudiées dans les cellules humaines. J'ai montré que la présence d'un seul allèle muté de BRCA1 abolit le blocage de la réplication de l'ADN en présence de CDB et réduit / ralenti le recrutement aux sites des dommages de certains protéines majeurs de la réponse cellullaire à ces lésions. La diminution importante de la quantité de la protéine BRCA1 sauvage présente dans les cellules hétérozygotes pour BRCA1 après exposition aux radiations ionisantes, pourrait être à l'origine de ces anomalies. Au contraire, dans les cellules BRCA2 +/- et BRCA2 -/-/FANCD, en présence de CDB, le blocage de la progression du cycle cellulaire s'effectue normalement
The aim of my thesis work was to better understand the role of BRCA and FANC genes, respectively implicated in familial breast and ovarian cancers and in Fanconi anemia (predisposing to leukaemia), in cellular response to DNA double strand breaks (DSB). The cell cycle progression in the presence of DSB and the recruitment of poteins involved in the processing of these lesions were studied. We demonstrated that a single mutated BRCA1 allele is sufficient to abrogate the intra S-phase checkpoint in the presence of DSB, and to impair the recruitment at sites of lesions of key proteins involved in DNA damage response. The severe reduction of the overall BRCA1 protein level observed in ionizing radiation-treated BRCA1 heterozygogous cells may be at origin of the observed defects. In contrast, in BRCA2 +/- and BRCA2 -/-/ FANCD1cells, the arrest of cell cycle progression is fully efficient in response to DSB

La sénescence est un état d’arrêt prolifératif mis en place par les cellules en réponse à des dommages à l’ADN. Elle est considérée comme un mécanisme de protection qui s’oppose à l’initiation et au développement d’un cancer. Or, les mécanismes de sénescence et la capacité des cellules à s’échapper de cet état et à générer des cellules transformées semblent varier selon les types cellulaires. Chez les kératinocytes humains normaux de peau (NHEKs), la sénescence est transitoire et débouche pour la plupart des cellules sur une mort par autophagie et, pour environ une sur dix mille, sur une émergence néoplasique post-sénescence. Les cellules émergentes présentent des caractères de transformation et accumulent des mutations et des délétions. Cet échappement néoplasique de la sénescence n’est jamais observé dans les fibroblastes normaux de peau (NHDFs) qui, au contraire, une fois en sénescence sont bloqués irréversiblement dans le cycle cellulaire.J’ai participé dans un premier temps à l’étude du rôle de l’autophagie dans la balance échappement néoplasique et mort des NHEKs sénescents. Nous avons pu démontrer que les progéniteurs de cellules néoplasiques ont une activité autophagique modérée plus faible que ceux qui subissent la mort. Ainsi, ils échappent à la mort par autophagie tout en gardant un niveau d’activité autophagique de ménage suffisant pour éliminer leurs composés altérés par le stress oxydant et être capable de ré-entrer en mitose.J’ai ensuite cherché à caractériser les dommages oxydants mutagènes impliqués dans l’échappement néoplasique. Ma stratégie a été d’analyser de façon comparative les NHEKs par rapport aux NHDFs, puisque les uns mais non les autres développent une émergence néoplasique. J’ai ainsi pu constater que le taux de cassures augmente à la sénescence dans les deux types cellulaires, mais que ces cassures sont de nature différente, uniquement des SSBs (Single Strand Breaks) pour les NHEKs et principalement des DSBs (Double Strand Breaks) pour les NHDFs. L’accumulation de DSBs à la sénescence des NHDFs s’accompagne d’une induction robuste de la voie DDR (DNA Damage Response), d’une activation la voie p53-p21 et d’un arrêt stable dans le cycle cellulaire. Dans le cas des NHEKs, l’augmentation du taux de SSBs est la conséquence de l’augmentation du niveau de stress oxydant et de la perte de l’expression et de l’activité de la PARP1. Ceci contribue à une agglomération aberrante de XRCC1 au niveau des cassures engendrant une induction de la voie p38MAPK - p16INK4a et un arrêt dans le cycle cellulaire caractéristique de la sénescence. D’une manière paradoxale, l’échappement néoplasique de la sénescence dépend également de cette accumulation de SSBs non réparés. Ainsi, la nature des dommages à l’ADN influence le devenir des cellules sénescentes. Les DSBs renforcent la stabilité de l’arrêt du cycle cellulaire alors que les SSBs promeuvent l’acquisition de mutations et l’échappement néoplasique
Senescence is a permanent cell-cycle arrest activated in response to DNA damage. If a cell escapes from this state, it should inherit mutations and could potentially initiate a tumor. NHDFs (Normal Human Dermal Fibroblasts) display a classical irreversible and stable senescence plateau. In contrast, senescent NHEKs (Normal Human Epidermal Keratinocytes) experience two different outcomes. Most of them undergo autophagic cell death and about one on 10000 spontaneously resumes mitosis and generates clones of transformed, mutated and tumorigenic cells.I contributed in a first time to studying the role of macroautophagy in the cell death / post-senescence neoplastic emergence balance of senescent NHEKs. We have shown that macroautophagy plays antagonistic roles during senescence, inducing cell death or promoting neoplastic transformation, depending on its level of activation. Indeed, the progenitors of post-senescent emergent cells display oxidative stress and autophagic activity levels slightly lower than the average, what allows them to avoid autophagic cell death and to ensure the quality control indispensable for mitosis re-entry.Since oxidative stress is the motor of the post-senescence neoplastic emergence in NHEKs, I wondered next whether oxidative stress could operate through the generation of some mutagenic DNA damage. I took advantage of the comparison of senescent NHEKs to NHDFs. I have shown that unlike NHDFs, NHEKs do not suffer from significantly shortened telomeres, nor accumulate DSBs, do not activate a DDR (DNA Damage Response) pathway and in consequence do not significantly activate the p53/p21 pathway. Instead, they suffer from a decrease in PARP1 expression, which compromises the repair of SSBs generated by oxidative stress. In consequence, SSBR foci, precisely XRCC1 foci, become persistent. These persistent foci initiate a signalization, through p38MAPK, which leads to up-regulation of p16INK4A and to cell cycle arrest. Notably, the accumulation of unrepaired SSBs is sufficient for the post-senescence neoplastic emergence phenomenon, in addition, paradoxically to its involvement in the onset of senescence.In conclusion, senescence results from the persistence of a DNA damage signalization, but the exact nature of the damages could vary in different cell types depending on their repair capacities and could dictate completely different outcomes. Namely, persistent DSBs, including telomeric ones, dictate a permanent tumor-suppressor cell cycle arrest, whereas persistent SSBs are permissive to mutation and senescence evasion

Rayons ionisants, dessiccation, ou encore métabolites secondaires exogènes sont autant de facteurs qui peuvent engendrer des dommages à l’ADN chez les bactéries du sol, notamment en provoquant la formation de cassures double-brin (DSB), préjudice majeur pour une cellule. Chez les procaryotes, l’évolution a sélectionné deux principaux mécanismes de réparation des DSB, à savoir la recombinaison homologue (RH) et le non-homologous end joining (NHEJ). La RH est un mécanisme quasi-ubiquiste dans le monde bactérien qui repose sur l’utilisation d’une copie intacte de la molécule endommagée comme matrice pour la réparation de la DSB. Contrairement à la RH, le NHEJ n’est présent que chez 20 à 25% des bactéries et est considéré comme un mécanisme mutagène puisque la réparation de la DSB se fait sans matrice homologue et peut entrainer l’ajout ou la délétion de nucléotides au site de cassure. Chez la bactérie modèle Mycobacterium, seuls deux acteurs sont nécessaires pour la réparation par NHEJ. Ainsi, un dimère de protéine Ku se fixe sur la cassure puis recrute la protéine multifonctionnelle LigD, qui catalyse le traitement puis la ligation des extrémités grâce à ses domaines polymérase, nucléase et ligase. Les mécanismes de réparation des DSB chez les Streptomyces étaient peu connus à l’initiation de ce travail. Cette bactérie présente des caractéristiques génomiques remarquables avec notamment un chromosome linéaire de grande taille (6 à 12 Mb). En ce qui concerne la RH, nous avons focalisé nos recherches sur les étapes tardives (post-synaptiques) et étudié le rôle du complexe RuvABC et de RecG impliqués chez Escherichia coli dans la migration de la croix de Holliday et de sa résolution. La construction de mutants simples et multiples a montré que bien que les gènes codant ces protéines soient très conservés chez les Streptomyces, leur déficience ne se traduit chez Streptomyces ambofaciens que par une faible baisse de la recombinaison suite à un événement de conjugaison. Aucune baisse de l’efficacité de recombinaison intrachromosomique n’a en revanche été observée. Ces résultats suggèrent que des acteurs alternatifs majeurs sont encore à découvrir chez les Streptomyces. Le décryptage du mécanisme de NHEJ chez S. ambofaciens constitue une première dans ce genre bactérien. Une étude génomique exhaustive a permis de révéler la très grande diversité du nombre d’acteurs potentiels de ce mécanisme (Ku, LigDom, PolDom, NucDom) et de l’organisation des gènes qui les codent.. L’analyse fonctionnelle a révélé que l’ensemble des acteurs étaient impliqués dans la réponse à l’exposition à un faisceau d’électrons accélérés, connus pour induire, entre autre, la formation de DSB. La génération de DSB, par coupure endonucléasique I-SceI, a par ailleurs permis de mettre en évidence au niveau moléculaire des réparations de type NHEJ (délétions ou insertions de quelques nucléotides, intégration de fragments d’ADN). Les cassures dans les régions terminales du chromosome sont accompagnées de grandes délétions (jusqu’à 2,1 Mb) et de réarrangements de grande ampleur incluant circularisations du chromosome et amplifications d’ADN. Les conséquences de la réparation de DSB chez S. ambofaciens sont en tous points similaires aux réarrangements observés spontanément ou par comparaison des génomes des espèces types. Ainsi, il est possible de lier la plasticité du génome à la réparation de DSB. En outre, l’intégration de matériel génétique exogène serait favorisée au cours de la réparation NHEJ ce qui donnerait à ce système de réparation une place importante dans le processus de transfert horizontal, mécanisme d’évolution majeur chez les bactéries
Ionizing radiation, desiccation or exogenous secondary metabolites are all factors that can cause DNA damage in soil bacteria, especially by triggering double strand breaks (DSB), the most detrimental harm for the cell. In prokaryotes, evolution selected two main DSB repair pathways, namely homologous recombination (HR) and non-homologous end joining (NHEJ). HR is almost ubiquitous in bacteria and relies on an intact copy of the damaged DNA molecule as a template for DSB repair. In contrast to HR, NHEJ is only present in 20 to 25% of bacteria and is considered as a mutagenic pathway since DSB repair is performed without the need of any template and can lead to nucleotide addition or deletion at DSB site. In the bacterial model Mycobacterium, two partners are sufficient for a functional NHEJ pathway. Thus, Ku protein dimer recognizes and binds the DSB and then recruits the multifunctional LigD protein for extremities treatment and ligation thanks to its polymerase, nuclease and ligase domains. At the beginning of this work, few informations on DSB repair in Streptomyces were available. This bacteria exhibits remarkable genomic features including a large linear chromosome (6 to 12 Mb). Regarding HR, we focused on the late stage (post-synaptic step) in studying the role of RuvABC complex and RecG, involved in branch migration and Holliday junction resolution in E. coli. Construction of single and multiple mutants showed that although the genes encoding these proteins are highly conserved in Streptomyces, their deficiency in Streptomyces ambofaciens only results in a mild decrease of recombination after conjugation events. Besides, no decrease of intrachromosomal recombination efficiency could be observed. These results suggest that major alternative factors are still to be discovered in Streptomyces. This work was also the first occasion to decipher a NHEJ pathway in Streptomyces. An exhaustive genomic study revealed a great diversity in the number of factors potentially implicated in this pathway (Ku, LigDom, PolDom, NucDom) and in the organization of their encoding genes. Functional analyses revealed that all the factors, whatever they are conserved or not between species, were involved in the response to electron beam exposure, known to induce, amongst other things, DSB formation. Generation of DSB by I-SceI endonuclease cleavage was also used to evidence at a molecular level NHEJ type DSB repair (deletions or insertions of several nucleotides, integration of DNA fragments). Targeted breaks in the terminal regions of the chromosome were accompanied by large deletions (up to 2.1 Mb) and major rearrangements including chromosome circularizations and DNA amplifications. Consequences of DSB repair in S. ambofaciens are in all points similar to chromosome rearrangements observed spontaneously or by comparing genomes of different species. Thus, it is possible to link the genome plasticity to DSB repair. In addition, the integration of exogenous genetic material would be favoured during NHEJ repair which would give this repair system a major role in the horizontal transfer process, known to be a main evolution mechanism in bacteria

L'hétérochromatine, de nature compacte et répétitive, limite l’accès à l'ADN et fait de la réparation des DSBs un processus difficile que les cellules doivent surmonter afin de maintenir leur intégrité génomique. Pour y étudier la réparation des DSBs, nous avons conçu un système CRISPR / Cas9 dans lequel les DSB peuvent être efficacement et spécifiquement induites dans l'hétérochromatine de fibroblastes de souris NIH3T3. En développant un système CRISPR / Cas9 hautement spécifique et robuste pour cibler l'hétérochromatine péricentrique, nous avons montré que les DSB en G1 sont positionnellement stables et réparés par NHEJ. En S / G2, ils se déplacent vers la périphérie de ce domaine pour être réparés par HR. Ce processus de relocalisation dépend de la résection et de l'exclusion de RAD51 du domaine central de l'hétérochromatine. Si ces cassures ne se relocalisent pas, elles sont réparées dans le cœur du domaine de l'hétérochromatine par NHEJ ou SSA. D'autre part, les DSBs dans l'hétérochromatine centromérique activent NHEJ et HR tout au long du cycle cellulaire. Nos résultats révèlent le choix de la voie de réparation différentielle entre l'hétérochromatine centromérique et péricentrique, ce qui régule également la position des DSBs
Heterochromatin is the tightly packed form of repetitive DNA, essential for cell viability. Its highly compacted and repetitive nature renders DSB repair a challenging process that cells need to overcome in order to maintain their genome integrity. Developing a highly specific and robust CRISPR/Cas9 system to target pericentric heterochromatin, we showed that DSBs in G1 are positionally stable and repaired by NHEJ. In S/G2, they relocate to the periphery of this domain to be repaired by HR. This relocation process is dependent of resection and RAD51 exclusion from the core domain of heterochromatin. If these breaks fail to relocate, they are repaired within heterochromatin by NHEJ or SSA. On the other hand, DSBs in centromeric heterochromatin activate both NHEJ and HR throughout the cell cycle. Our results reveal the differential repair pathway choice between centromeric and pericentric heterochromatin that also regulates the DSB position

La poly(ADP-ribosyl)ation est une modification post-traductionnelle des protéines par les poly(ADP-ribose) polymérases (PARPs). PARP3 a été identifiée comme un nouvel acteur de la réparation des cassures double-brin (DSBs). Nous avons évalué la contribution de PARP3 dans les différentes voies de réparation (HR, C-NHEJ ou A-EJ). Les résultats obtenus définissent PARP3 comme un modulateur de l’étape de résection d’ADN simple-brin permettant d’engager le choix de la voie de réparation. Nous avons montré que PARP3 favorise le recrutement du complexe Ku70/Ku80 aux sites de cassures et module la balance BRCA1/53BP1. Ces deux événements limitent l’étape de réparation de la voie HR et A-EJ et oriente la réparation vers la voie du C-NHEJ. Par immunoprécipitation de la chromatine, nous avons étudié les conséquences de l’absence de PARP3 sur les modifications d’histones, connues pour moduler la décision entre les différentes voies de réparation. Nos résultats actuels ne nous ont pas permis d’établir de lien entre PARP3 et les modifications d’histones en réponse aux DSBs. Nous avons toutefois observé qu’en absence de dommages, l’absence de PARP3 induit un enrichissement de H3K36me2 une marque d’histone connue pour réguler les gènes transcriptionnellement actifs. Dans un second projet, nous avons étudié l’impact de l’absence de PARP3 sur la viabilité cellulaire et la progression tumorale de cellules cancéreuses mutées en BRCA1. Nous avons montré par des approches in vitro et in vivo que l’absence de PARP3 induit une diminution de la survie et de la prolifération cellulaire plus marquée, une amplification exacerbée des centrosomes, ainsi qu’un ralentissement plus important de la progression tumorale, faisant de PARP3 une cible prometteuse en thérapie du cancer
Poly(ADP-ribosyl)ation is a post-translational modification of proteins catalyzed by poly(ADPribose) polymerases (PARPs). PARP3 was identified as a novel actor of the double-strand break (DSBs) repair pathway. We evaluated the contribution of PARP3 in these repair pathways(HR, C-NHEJ ou A-EJ). Our results defined PARP3 as a modulator of the single strand DNA resection process which plays a role in driving the repair pathway choice. We showed that PARP3 enhances the recruitement of the Ku70/Ku80 complexe to damaged sites and modulates the BRCA1/53BP1 balance. These two events prevent the DNA end resection step initiating HR and A-EJ and drives the repair towards the C-NHEJ. By chromatin immunoprecipitation, we studied the consequences of the absence of PARP3 on histone modifications, known to modulate the decision of the DSBs repair pathways. Our current results didn’t allow us to establish a link between PARP3 and histone modifications in response to DSBs. However, in absence of DNA damage and PARP3, we observed an accumulation of H3K36me2, a histone mark known to regulate transcriptionally active genes. In a second project, we studied the impact of the absence of PARP3 on cell viability and tumor progression in breast cancer cell lines mutated in BRCA1. By in vitro and in vivo approaches, we showed that the absence of PARP3 induces an important decrease in cell survival and proliferation, an increase in centrosomal amplification and a strong delay in tumor progression. The roles of PARP3 in both cellular response to DNA damage and mitotic progression introduce PARP3 as a possible promising therapeutic target in cancer therapy