Dissertations / Theses on the topic 'Caratterizzazione strutturale e biochimica'

Alcuni contaminanti ambientali sono non biodegradabili e pericolosi per la salute umana con effetti tossici su svariati target nell’organismo. Ad oggi diversi studi suggeriscono il legame di alcuni di questi contaminanti alle proteine plasmatiche, prima fra tutte l’albumina sierica umana (HSA). L’oggetto del lavoro di tesi è stato dimostrare il legame di uno di questi contaminanti ad HSA sfruttando la tecnica della cristallografia ai raggi X. La risoluzione della struttura tridimensionale della proteina HSA in complesso con il contaminante ed il miristato di sodio ha permesso di identificare i siti e la stechiometria di legame. Utilizzando un approccio competitivo fra ligandi basato su differenti rapporti molari di contaminante, miristato di sodio ed HSA è stato infine possibile ipotizzare diverse affinità di legame per i siti stessi.

2009 - 2010
The maintenance of gastrointestinal tissue integrity is physiologically essential in the presence of the persistent harassment of microbial flora and injurious agents. Even though the repair of the gastric epithelium may be modulated by several factors, the epithelial continuity also depends on a family of small peptides called trefoil factors (TFFs). The trefoil factors family comprises the gastric peptides pS2/TFF1, the spasmolytic peptide (SP)/TFF2 and the intestinal trefoil factor (ITF)/TFF3; they are characterized by a three looped domain, the “trefoil domain”, stabilized by three disulphide bridges. TFF1 and TFF3 also have a seventh cysteine that allows the formation of omo- and/or hetero-dimers. On the other hand TFF2 presents only a monomeric form, containing two trefoil domains in the same polypeptide chain. TFFs are small protease-resistant proteins that are abundantly produced by mucus-secreting cells of the gastrointestinal tract onto the mucosal surface. TFFs are essential in the protection of the mucosal epithelia against a wide range of biological threats, thus contributing to the mucosal repair. The signaling events that mediate the cellular responses elicited by TFFs are only partially understood. Moreover there are convincing evidence that TFFs do play an important role in tumorigenesis, even though their specific roles in cancer are still unclear. TFF1 expression is strongly induced after mucosal injury and it has been proposed that TFF1 functions as a gastric tumor suppressor gene. Several studies confirm that TFF1 expression is frequently lost in gastric cancer because of deletions, mutations or methylation of the TFF1 gene. Infection by Helicobacter pylori, a class 1 carcinogen according to WHO classification, is thought to promote stomach carcinogenesis through induction of aberrant DNA methylation. Samples from infected patients show lower expression of TFF1. Recent studies have also shown that there is a direct relationship between Helicobacter pylori and the dimeric form of the protein. In fact, it was demonstrated that the core oligosaccharide portion of H. pylori lipopolysaccharide (RF-LPS) is able to bind to TFF1. It also seems that the loss of TFF1 is an important event in shaping the NF-kB-mediated inflammatory response during the progression to gastric tumorigenesis, being TFF1 a negative regulator of NF-kB signalling. It is thus emerging a clear correlation between loss of TFF1, the development of inflammatory disease and the neoplastic process. Recent analyses made by our research group allowed us to point out the up-regulation of TFF1 gene expression in rats fed on copper deficient diets, and allowed us to find out the unexpected ability of TFF1 to bind copper ions. The presence of a cysteine surrounded by several negatively charged residues in the carboxy-terminus of the protein suggested the presence of a copper-binding site. Afterwards, it was shown that Cys58 and at least three Glu surrounding residues are essential to efficiently bind copper. Moreover, the incubation of the native peptide with copper salts increases the fraction of peptide omodimers produced by inter-molecular oxidation of Cys58 and disulphide bond formation. The Ph.D. research project was aimed at characterising the structure-function relationship of the TFF1-Cu complex. Briefly, we studied the influence of copper on known TFF1 biological activities and on its gene regulation, then we investigated its involvement in the TFF1 mediated mechanisms of Helicobacter pylori virulence and infection. A preliminary Real Time PCR quantitative analysis showed that copper deficiency positively modulates tff1 expression in an adenocarcinoma cell line (AGS), thus confirming our previous data obtained in vivo in copper deficient rat intestine. In order to map possible copper responsive elements in the proximal promoter sequence, we analysed the expression of a reporter gene (Luciferase) driven by deletion constructs of the tff1 gene promoter. AGS cells transfected with the deletion constructs allowed us to identify the upstream 5’ gene sequence -583/-435 as a promoter region sensitive to the changes of copper concentration. In fact, copper chelation treatments with bathocuproine disulfonate (BCS) were able to stimulate an increase of the promoter activity of the corresponding deletion construct. Following the sequence analysis (Transfac software) we focused our attention on a putative SP1 binding site identified in this region, whose binding ability was then confirmed by electrophoretic mobility shift assay (-561/-552). In agreemente with our in vitro results, it was also observed that copper favours the native TFF1 dimer formation in the culture medium of MCF-7 and HT29-MTX cells (a mucus-secreting clone obtained from the HT29 colon cancer cell line), thus confirming a possible role of the metal in the balance between the monomeric and the dimeric forms To evaluate the effect of copper-TFF1 interaction on the well known motogenic activity of the protein, we performed wound healing assays on an inducible clone of gastric cancer cells (AGS) able to overexpress the peptide (AGS-AC1). As expected, the overexpression of TFF1 stimulates an appreciable increase of cell migration, and copper chelation (BCS) undo the benefits of the increased peptide level. Our previous results showed that copper treatments decreased the amount of secreted protein in culture medium. Further experiments demonstrated that induced AGS-AC1 cells are able to store intracellularly higher amount of copper if compared to uninduced AGS-AC1 cells. This evidence suggests that TFF1 levels may also play a role also in the uptake/traffic of copper in this in vitro model. Finally, we studied the combined influence of TFF1 and copper in Helicobacter pylori infections. Our results demonstrate that Cu-TFF1 complex promotes H. pylori colonization of AGS cells. In fact, AGS-AC1 cells overexpressing TFF1 are more efficiently colonised by H. pylori wild-type (str. P12) if compared to uninduced cells. The presence of copper in a duplicate experiment further increases the colonization, as well as copper chelation by bathocuproine disulfonate (BCS) reduces the observed effect. The same result was obtained with H. pylori str. P12Δ479, an isogenic mutant expressing a truncated LPS core still able to bind to TFF1. On the other hand, H. pylori P12Δ1191, unable to bind TFF1, is not affected by copper levels in the culture medium. Parallel experiments were carried out on mucus secreting HT29-E12 goblet cells, to compare and/or confirm the results obtained in AGS-AC1. The results show that also in HT29-E12 cells the H. pylori colonization follows a similar trend, increasing when incubated in the presence of Cu and decreasing after BCS treatment. The present work contributed interesting results in the field of the biochemistry of the epithelia, in the wake of the research in progress in our laboratory aimed at studying the biological activities of the newly identified metalloprotein Cu-TFF1, whose properties are still poorly characterized. On the basis of the previous structural pieces of evidence we observed that the protein level and the balance of its oligomeric forms can be affected and regulated by copper ions. In turn, this delicate equilibrium is able to affect the integrity and the rheological properties of the epithelial barrier, thus representing a fine tuner, or an Achille’s heel, through which pathogenic microrganisms and deregulated proliferation of neoplastic cells may take advantage for their invasiveness. The role of copper in the TFFs biochemistry represents a new finding in the puzzling and versatile functions of this interesting peptide family, whose thorough comprehension still reserves many questions and surprises. [edited by author]
IX n.s.

Le prime applicazioni industriali di enzimi risalgono a più di cento anni fa. Tuttavia, è solo negli ultimi 50 anni che, grazie all’avvento delle tecnologie del DNA ricombinante, il loro impiego ha subito una forte crescita in moltissimi settori industriali. In particolar modo, grazie alle loro interessanti proprietà, gli enzimi stanno trovando grande impiego in campo medico, principalmente nella diagnostica e nel trattamento di un sempre crescente numero di patologie. Lo scopo di questa tesi è quello di studiare l’elevata specificità di substrato di un enzima umano PLP-dipendente, detto O-fosfoetanolamina fosfo-liasi (ETNPPL), per lo sviluppo di un’applicazione diagnostica. ETNPPL catalizza una reazione irreversibile in cui si ha la degradazione della fosfoetanolamina (PEA) con formazione di acetaldeide, ioni fosfato e ammonio. La caratterizzazione fisico-chimica di questo enzima, già riportata in letteratura, suggerisce un meccanismo di azione simile a quello di altri enzimi PLP-dipendenti. Tale ipotesi implica che nel sito attivo dell’enzima siano presenti gli stessi residui aminoacidici. Tuttavia, ad oggi, una conferma di questa ipotesi mediante caratterizzazione strutturale non è stata ancora ottenuta. Il primo obiettivo di questo lavoro di tesi è stato quello di ottenere la struttura tridimensionale ad alta risoluzione dell’enzima umano ETNPPL attraverso cristallografia ai raggi-X. Per questo scopo, è stato effettuato il clonaggio del gene codificante per la ETNPPL umana all’interno di un vettore che ha permesso l’espressione eterologa dell’enzima in cellule di E.coli. L’enzima così prodotto è stato purificato mediante cromatografia in fase liquida e, una volta testata la sua attività enzimatica, è stato cristallizzato per gli esperimenti di cristallografia ai raggi-X. La struttura 3D dell’enzima ETNPPL è stata infine determinata con una risoluzione di 2.3 Å. Una volta razionalizzata l’elevata specificità dell’enzima per il suo substrato naturale, la fosfo- etanolamina (PEA), si è deciso di studiarne un’applicazione pratica tramite la progettazione e lo sviluppo di un biosensore in grado di rilevare selettivamente la PEA in campioni di urina. L’analisi si colloca in un più ampio contesto legato allo screening del tumore alla prostata che, ad oggi, viene effettuato utilizzando principalmente il test della PSA. Dal momento che livelli elevati di PSA possono essere rinvenuti anche in presenza di altre patologie, il test della PSA comporta un alto numero di falsi positivi. Per questo motivo appare evidente la necessità di ricercare nuovi biomarkers del tumore alla prostata, che siano in grado di aumentare l’attendibilità dei risultati dello screening, eventualmente anche supportando il test della PSA. Recentemente la PEA è stata indicata come possibile biomarker del tumore alla prostata. I livelli di PEA nelle urine di pazienti affetti da questo tumore risultano infatti significativamente inferiori rispetto a quelli delle persone sane. Di conseguenza, un metodo rapido e quantitativo per l’identificazione di PEA nelle urine, basato sull’affinità dell’enzima ETNPPL per il suo substrato naturale, potrebbe essere particolarmente rilevante per la diagnosi della malattia e, al tempo stesso potrebbe essere utilizzato come metodo per validare la PEA come biomarker del tumore alla prostata.
Enzymes have been used in many productive sectors for more than a hundred years. However, over the last 50 years, since the advent of recombinant DNA technologies, they have found a much wider and diverse range of applications, spanning across virtually any kind of human activities. In particular, because of their remarkable properties, enzymes have become the major choice for medical diagnostic applications and are being increasingly utilized for both the detection and the treatment of a broad variety of diseases. The purpose of this thesis is to study and exploit the high substrate specificity of a very peculiar human PLP-dependent enzyme, named O-phosphoethanolamine phospho-lyase (ETNPPL), for diagnostic applications. The enzyme promotes the irreversible degradation of O-phosphoethanolamine (PEA) to acetaldehyde, phosphate and ammonia. The physico-chemical characterization of ETNPPL reported in the literature suggests a mechanism of action that is very similar to other PLP-dependent enzymes, implying that the same residues are present in the active site. However, a structural characterization of human ETNPPL has not yet been reported in the literature. The first issue that I addressed in this thesis was to obtain the high-resolution 3D-structure of ETNPPL by X-ray crystallography in order to validate the mechanism of action proposed in the literature. To this end, starting from the cloning of the DNA fragment encoding for the human ETNPPL into a suitable expression vector, I expressed and purified the human ETNPPL. After assessing the enzymatic activity of the purified protein sample, I carried out crystallization experiments and I obtained good quality crystals for X-ray data collection. I determined the 3D-structure of ETNPPL at 2.3 Å resolution. Once I have completed the structural characterization of the enzyme and I have fully rationalized its high substrate specificity for phosphoethanolamine (PEA), its natural substrate, I set out to investigate one of its possible practical applications by designing and working towards the development of a biosensor for the selective detection of PEA in the urine. PEA levels in the urine of prostate cancer patients have been reported to decrease relative to healthy patients. Therefore, an ETNPPL-based assay for the measurement of PEA concentrations would be most useful in prostate cancer screening. To date, the early detection of prostate cancer involves the prostate-specific antigen (PSA) blood test. However, this approach is known to produce high rates of false positive results since increased PSA levels are often found in men with benign prostatic hyperplasia (BPH), prostatitis and prostate injury. For this reason, the need for new biomarkers that can be used for diagnostic purposes either alone or in combination with standard PSA tests appears evident. A method for the rapid and quantitative detection of this analyte would be of relevance for the diagnosis of such disease and, at the same time, would represent a potent validation tool of PEA as a prostate cancer biomarker.

L’enzima nicotinato fosforibosiltranferasi (NaPRT), coinvolto nella prima reazione della via di Preiss-Handler per la biosintesi della nicotinammide adenindinucleotide (NAD), catalizza la conversione del nicotinato (Na) in Na mononucleotide (NaMN). L’importanza della NaPRT nel metabolismo del NAD è dimostrato dal fatto che, nelle cellule renali embrionali umane, l’aggiunta di Na aumenta sensibilmente il livello intracellulare di NAD, che non mostra un’inibizione a feedback nei confronti dell’enzima (1). Viene qui descritta la caratterizzazione enzimatica della NaPRT umana. La proteina è stata espressa nelle cellule BL21 (DE3) di Escherichia coli e purificata in omogeneità con cromatografia di affinità tramite resina Ni-NTA. Sono stati successivamente determinati i principali parametri cinetici della NaPRT. L’enzima segue una cinetica del tipo Michaelis-Menten con un meccanismo di reazione random. Inoltre, la Km del Na e il PRPP è risultata essere di 44 e 22 M, rispettivamente e la Vmax ha un valore di 0,012 U/mg, anche se in presenza di Pi aumenta fino a 0,3 U/mg. L’ATP sembra svolgere un duplice effetto sull’enzima: a basse concentrazioni di substrato (fino a 80 M) ha un effetto di stimolazione dell’attività, mentre a concentrazioni saturanti dei substrati (1 mM) il nucleotide funge da inibitore. Oltre alla caratterizzazione cinetica, è stato investigato l’effetto di vari metaboliti sull’attività della NaPRT. Come atteso, NAD e NaAD, insieme a NMN e NaMN, non hanno effetto sull’enzima, mentre il piruvato e il diidrossiacetonfosfato producono un effetto stimolatorio. Al contrario, numerosi metaboliti coinvolti nel metabolismo del glucosio e degli acidi grassi inibiscono l’enzima, facendo ipotizzare una regolazione in vivo della sintesi del NAD dipendente dalla NaPRT da parte di questi composti. Inoltre, per meglio comprendere il ruolo di residui altamente conservati all’interno della struttura primaria della proteina, sono stati effettuati studi di mutagenesi sito-diretta. Si è determinato che, le mutazioni che hanno coinvolto i residui situati nel dominio / barrel dell’enzima, diminuiscono fortemente l’attività enzimatica, se confrontata con i valori della proteina wild-type. La NaPRT umana è stata inoltre co-cristallizzata in presenza dell’inibitore enzimatico Acetil-CoA, usando come principale precipitante PEG 4000. I cristalli ottenuti utilizzando radiazioni al sincrotrone all’ ESRF (Grenoble, Francia) mostrano diffrazione con una risoluzione maggiore di 3.0 Å e sono in corso studi di ottimizzazione per ottenere cristalli utili per la determinazione cristallografica. In attesa dell’ottenimento della struttura cristallografica, è stata predetta la struttura 3D dell’enzima attraverso l’homology modeling ed il modello ottenuto è stato utilizzato per condurre simulazioni di docking molecolare al fine di identificare i residui coinvolti nel riconoscimento e nella stabilizzazione dei ligandi.
Nicotinate phosphoribosyltransferase (NaPRT) catalyzes the conversion of nicotinate (Na) to Na mononucleotide (NaMN), the first reaction of the Preiss-Handler pathway for the biosynthesis of nicotinamide adenine dinucleotide (NAD). The importance of NaPRT in NAD metabolism is demonstrated by the fact that, in human embryonic kidney cells, the addition of Na considerably increases NAD levels, which do not show feedback inhibition effect on the enzyme (1). Here we describe the enzymatic characterization of human NaPRT. The protein was expressed in E. coli BL21(DE3) cells and purified to homogeneity by Ni-NTA resin affinity chromatography. The principal kinetic parameters of human NaPRT were determined. It was found that the enzyme followed a Michaelis-Menten kinetic with a random bireactant mechanism, and the Km for Na and PRPP were 44 μM and 22 μM, respectively. The Vmax was attested to be 0.013 U/mg, although in presence of Pi this value increased to 0.3 U/mg. Interestingly, ATP had a stimulation effect on enzymatic activity only at low substrates concentration, whereas at higher substrates concentration (1 mM), it showed an inhibitory effect. In addition to the kinetic characterization, the effect of several metabolites on NaPRT activity was investigated. As expected, NAD and NaAD, in addition to NMN and NaMN, had no effect on the enzyme activity, whereas piruvate and dihydroxyacetone phosphate showed a stimulation effect. On the contrary, several metabolites involved in the glucose or fatty acid metabolism significantly inhibited the enzyme, leading to hypothesize an in vivo NaPRT-depending regulation of NAD synthesis by these compounds. In addition, site-directed mutagenesis experiments were performed to elucidate the role of highly conserved residues. We determined that mutations, which involved residues localized in the / barrel domain of the protein, sensibly lowered the activity of the enzyme with respect of the wild-type protein. Human NaPRT was co-crystallized in presence of the potent enzyme inhibitor Acetyl-CoA using PEG 4000 as the major precipitant. The resulting crystals showed diffraction up to 3.0 Å resolution using synchrotron radiation at the ESRF, Grenoble France and are currently being optimised to undertake crystal structure determination. Finally, the 3D structure of the enzyme was predicted by homology modeling and used to carry out molecular docking simulations in order to identify the residues involved in the recognition and stabilization of ligands

The hemoglobin is a very important protein that in vertebrates binds reversibly the oxygen and transport it to the tissue through the circulatory sistem. The aim of this study is to contribute to the knowledge of structural-functional relationship of the hemoglobin molecule through structural and funcional characterisation of human hemoglobins natural variants and those present in different animal species. We report the identification and characterisation of two new hemoglobin variant, never described before, that we have named HbF-Monserrato-Sassari [Gγ93(F9) Cys Arg] and Hb Roma [β115(G17)Ala Val], and the hemoblobin systems of two species of fish, Mugil cephalus and Ophisurus serpens. HbF-Monserrato-Sassari [Gγ93(F9) Cys Arg] is an abnormal fetal hemoglobin observed in an apparently normal newborn baby during an hemoglobinopathies survey at birth in North Sardinian population. Sequencing of the γ globin genes revealed the TGT CGT transition at codon 93 in one of the two Gγ genes which causes the Arg for Cys amino acid replacement at position 93. The substitution was confirmed by mass spectrometric analysis which confirmed the presence of an additional Gγ chain whose mass value corresponds to the Arg Cys substitution already observed at the DNA level. Since modifications or substitutions at position β93 of HbA are known to affect the arrangement of a salt bridge at the α1β2 sliding contacts that are crucial for subunit cooperativity, the functional properties of the HbF-Monserrato-Sassari variant were analyzed to evaluate the effect of the substitution at the same position of the Gγ chain. The data indicate that substitution Cys Arg causes a significant increase in oxygen affinity and a slight decrease of both Bohr effect and cooperativity, with respect of normal HbF, indicating that Cys γ93 plays a key role for subunit cooperativity in the T R transition of the HbF tetramer. Since studies had shown that nitric oxide, the most important vasodilator agent, in the erytrocytes interacts in part with Cys β93 residues as S-nitrosohemoglobin (SNO-Hb), this variant, because of the loss of Cys γ93 residue, is considered to be potentially compromised in nitric oxide transport. Hb Roma [β115(G17)Ala Val] is an abnormal adult hemoglobin found in a 33- year-hold woman of Central Italian descent. We studied this previously uncharacterised variant because the β115(G17)Ala Val replacement occurs at the α1β1 (or α2β2) interface of the Hb molecule and then provides the opportunity to study how β115(G17)Ala Val substitution could perturb the hemoglobin structure and alter its function. Sequencing of the β-globin gene revealed the GCC GTC transition at codon 115 which causes the substitution of Ala, normally present at position β115, with Val. The substitution was confirmed by mass spectrometric analysis of the globins and tryptic peptides. The oxygen-binding properties, carried out on the mixture HbA/Hb Roma as the variant tetramer is undistinguishable by usual separation procedures, showed a significant increase in oxygen affinity with respect to normal HbA, both in the absence and presence of 2,3- bisphosphoglycerate. With regard to the two species of fish, Mugil cephalus and Ophisurus serpens, it is known that among the vertebrates, fish display the most extensive presence of multiple Hb components, which show considerable differences in amino acid sequence. These structural differences are often responsible for different functional properties. In the case of Mugil cephalus structural and functional characterisations of its hemoglobin system showed two major hemoglobins: HbI and HbII, which have the same functional properties, while hemoglobin system of O. serpens showed at least four anodic (isoelectric points, pI < 8) and one cathodic (pI > 8) components, which have different functional properties: the cathodic Hb may safeguard oxygen uptake under hypoxic and acidotic conditions, the anodic Hbs may be involved in pumping O2 in the swim bladder in order to maintain the neutral buoyancy of the fish. The natural hemoglobin variants are very important to evaluate how an amino acid replacement could perturb the hemoglobin molecule and alter its function, whereas the comparative analysis between hemoglobins of different species allows to verify how this protein might have changed during evolution in relation with the different physiological and habitat needs.

2013/2014
RecQ helicases belong to a ubiquitous family of DNA unwinding enzymes that are essential to maintain genome stability by acting at the interface between DNA replication, recombination and repair. Humans have five different paralogues of RecQ helicases namely RecQ1, BLM, WRN, RecQ4 and RecQ5. This work focuses on the structural and biochemical study of human RecQ4. Germ-line mutations in the RECQ4 gene give rise to three distinct human genetic disorders (Rothmund-Thomson, RAPADILINO and Baller-Gerold syndromes). Despite the important roles of RecQ4 in various cellular processes, RecQ4 have never been fully characterized. In addition to the helicase domain, RecQ4 has a unique N-terminal part that is essential for viability and is constituted by a region homologous to the yeast Sld2 replication initiation factor, followed by a cysteine-rich region, predicted to fold as a Zn knuckle. A part of this work focuses on the structural and biochemical analysis of both the human and Xenopus RecQ4 cysteine-rich regions, and shows by NMR spectroscopy that the Xenopus fragment does indeed assumes the canonical Zn knuckle fold, whereas the human sequence remains unstructured, consistent with the mutation of one of the Zn ligands. Both the human and Xenopus Zn knuckles bind to a variety of nucleic acid substrates, with a preference for RNA. We also investigated the effect of an additional Sld2 homologous region upstream the Zn knuckle. In both the human and Xenopus system, the presence of this region strongly enhances binding to nucleic acids. These results reveal novel possible roles of RecQ4 in DNA replication and genome stability. Recently the catalytic core of RecQ4 has been predicted to include RecQ-like-C-terminal (RQC) domain at the C-terminus of the helicase domain, similar to other RecQ helicases. This domain is composed of a Zn-binding region and a winged helix (WH) domain. Another part of this thesis centers on the structural and biochemical characterization of the catalytic core of RecQ4 including the helicase and RQC domain. The results provide an insight in the Zn binding ligands present in the RQC domain that plays a role in DNA binding and unwinding activity of the protein. Also the presence of the characteristic aromatic residue at the tip of the WH β hairpin and its role in DNA binding and unwinding has been established. Finally, it provides a low resolution SAXS model of the catalytic core of RecQ4.
Elicasi RecQ appartengono a una famiglia ubiquitaria di DNA svolgimento enzimi che sono essenziali per mantenere la stabilità del genoma agendo all'interfaccia tra replicazione del DNA, ricombinazione e riparazione. Gli esseri umani hanno cinque diversi paralogues di RecQ elicasi cioè RecQ1, BLM, WRN, RecQ4 e RecQ5. Questo lavoro si concentra sullo studio strutturale e biochimica di RecQ4 umana. Mutazioni germinali nel gene RECQ4 danno luogo a tre malattie genetiche umane distinte (Rothmund-Thomson, RAPADILINO e sindromi Baller-Gerold). Nonostante i ruoli importanti di RecQ4 in diversi processi cellulari, RecQ4 non sono mai stati pienamente caratterizzato. In aggiunta al dominio elicasi, RecQ4 ha una parte unica N-terminale che è essenziale per la vitalità ed è costituito da una regione omologa al lievito Sld2 fattore di iniziazione replica, seguita da una regione ricca di cisteina, previsto per piegare come stinco Zn . Una parte di questo lavoro si concentra sull'analisi strutturale e biochimica sia della regioni ricche di cisteina Xenopus RecQ4 umana e, e spettacoli di spettroscopia NMR che il frammento Xenopus effettivamente assume la canonica Zn nocca volte, mentre la sequenza di resti umani non strutturato, coerente con la mutazione di uno dei ligandi Zn. Sia il nocche Xenopus Zn umana e si legano ad una varietà di substrati di acido nucleico, con una preferenza per l'RNA. Abbiamo anche studiato l'effetto di un ulteriore regione omologa Sld2 monte la nocca Zn. Sia il sistema Xenopus umano e, la presenza di questa regione migliora fortemente legame ad acidi nucleici. Questi risultati rivelano possibili ruoli nuovi di RecQ4 nella replicazione del DNA e la stabilità del genoma. Recentemente il nucleo catalitico di RecQ4 stato previsto per includere RecQ-like-C-terminale (RQC) dominio al C-terminale del dominio elicasi, simile ad altri elicasi RecQ. Questo dominio è costituito da una regione-Zn vincolanti e un'elica alato (WH) dominio. Un'altra parte di questa tesi incentrata sulla caratterizzazione strutturale e biochimica del nucleo catalitico della RecQ4 compreso il elicasi e il dominio RQC. I risultati forniscono una descrizione nel Zn ligandi presenti nel dominio RQC che svolge un ruolo nel legame al DNA e l'attività svolgimento della proteina legante. Inoltre è stata stabilita la presenza della caratteristica residuo aromatico sulla punta della forcella WH β e il suo ruolo nel legame al DNA e di svolgimento. Infine, esso fornisce una bassa risoluzione SAXS modello del nucleo catalitico di RecQ4.
XXVII Ciclo
1985

La catena respiratoria mitocondriale è principalmente costituita da proteine integrali della membrana interna, che hanno la capacità di accoppiare il flusso elettronico, dovuto alle reazioni redox che esse catalizzano, al trasporto di protoni dalla matrice del mitocondrio verso lo spazio intermembrana. Qui i protoni accumulati creano un gradiente elettrochimico utile per la sintesi di ATP ad opera dell’ATP sintasi. Nonostante i notevoli sviluppi della ricerca sulla struttura e sul meccanismo d’azione dei singoli enzimi della catena, la sua organizzazione sovramolecolare, e le implicazioni funzionali che ne derivano, rimangono ancora da chiarire in maniera completa. Da questa problematica trae scopo la presente tesi volta allo studio dell’organizzazione strutturale sovramolecolare della catena respiratoria mediante indagini sia cinetiche che strutturali. Il modello di catena respiratoria più accreditato fino a qualche anno fa si basava sulla teoria delle collisioni casuali (random collision model) che considera i complessi come unità disperse nel doppio strato lipidico, ma collegate funzionalmente tra loro da componenti a basso peso molecolare (Coenzima Q10 e citocromo c). Recenti studi favoriscono invece una organizzazione almeno in parte in stato solido, in cui gli enzimi respiratori si presentano sotto forma di supercomplessi (respirosoma) con indirizzamento diretto (channeling) degli elettroni tra tutti i costituenti, senza distinzione tra fissi e mobili. L’importanza della comprensione delle relazioni che si instaurano tra i complessi , deriva dal fatto che la catena respiratoria gioca un ruolo fondamentale nell’invecchiamento, e nello sviluppo di alcune malattie cronico degenerative attraverso la genesi di specie reattive dell’ossigeno (ROS). E’ noto, infatti, che i ROS aggrediscono, anche i complessi respiratori e che questi, danneggiati, producono più ROS per cui si instaura un circolo vizioso difficile da interrompere. La nostra ipotesi è che, oltre al danno a carico dei singoli complessi, esista una correlazione tra le modificazioni della struttura del supercomplesso, stress ossidativo e deficit energetico. Infatti, la dissociazione del supercomplesso può influenzare la stabilità del Complesso I ed avere ripercussioni sul trasferimento elettronico e protonico; per cui non si può escludere che ciò porti ad un’ulteriore produzione di specie reattive dell’ossigeno. I dati sperimentali prodotti a sostegno del modello del respirosoma si riferiscono principalmente a studi strutturali di elettroforesi su gel di poliacrilammide in condizioni non denaturanti (BN-PAGE) che, però, non danno alcuna informazione sulla funzionalità dei supercomplessi. Pertanto nel nostro laboratorio, abbiamo sviluppato una indagine di tipo cinetico, basata sull’analisi del controllo di flusso metabolico,in grado di distinguere, funzionalmente, tra supercomplessi e complessi respiratori separati. Ciò è possibile in quanto, secondo la teoria del controllo di flusso, in un percorso metabolico lineare composto da una serie di enzimi distinti e connessi da intermedi mobili, ciascun enzima esercita un controllo (percentuale) differente sull’intero flusso metabolico; tale controllo è definito dal coefficiente di controllo di flusso, e la somma di tutti i coefficienti è uguale a 1. In un supercomplesso, invece, gli enzimi sono organizzati come subunità di una entità singola. In questo modo, ognuno di essi controlla in maniera esclusiva l’intero flusso metabolico e mostra un coefficiente di controllo di flusso pari a 1 per cui la somma dei coefficienti di tutti gli elementi del supercomplesso sarà maggiore di 1. In questa tesi sono riportati i risultati dell’analisi cinetica condotta su mitocondri di fegato di ratto (RLM) sia disaccoppiati, che accoppiati in condizioni fosforilanti (stato 3) e non fosforilanti (stato 4). L’analisi ha evidenziato l’associazione preferenziale del Complesso I e Complesso III sia in mitocondri disaccoppiati che accoppiati in stato 3 di respirazione. Quest’ultimo risultato permette per la prima volta di affermare che il supercomplesso I+III è presente anche in mitocondri integri capaci della fosforilazione ossidativa e che il trasferimento elettronico tra i due complessi possa effettivamente realizzarsi anche in condizioni fisiologiche, attraverso un fenomeno di channeling del Coenzima Q10. Sugli stessi campioni è stata eseguita anche un analisi strutturale mediante gel-elettroforesi (2D BN/SDS-PAGE) ed immunoblotting che, oltre a supportare i dati cinetici sullo stato di aggregazione dei complessi respiratori, ci ha permesso di evidenziare il ruolo del citocromo c nel supercomplesso, in particolare per il Complesso IV e di avviare uno studio comparativo esteso ai mitocondri di cuore bovino (BHM), di tubero di patata (POM) e di S. cerevisiae.

La catena respiratoria mitocondriale è principalmente costituita da proteine integrali della membrana interna, che hanno la capacità di accoppiare il flusso elettronico, dovuto alle reazioni redox che esse catalizzano, al trasporto di protoni dalla matrice del mitocondrio verso lo spazio intermembrana. Qui i protoni accumulati creano un gradiente elettrochimico utile per la sintesi di ATP ad opera dell’ATP sintasi. Nonostante i notevoli sviluppi della ricerca sulla struttura e sul meccanismo d’azione dei singoli enzimi della catena, la sua organizzazione sovramolecolare, e le implicazioni funzionali che ne derivano, rimangono ancora da chiarire in maniera completa. Da questa problematica trae scopo la presente tesi volta allo studio dell’organizzazione strutturale sovramolecolare della catena respiratoria mediante indagini sia cinetiche che strutturali. Il modello di catena respiratoria più accreditato fino a qualche anno fa si basava sulla teoria delle collisioni casuali (random collision model) che considera i complessi come unità disperse nel doppio strato lipidico, ma collegate funzionalmente tra loro da componenti a basso peso molecolare (Coenzima Q10 e citocromo c). Recenti studi favoriscono invece una organizzazione almeno in parte in stato solido, in cui gli enzimi respiratori si presentano sotto forma di supercomplessi (respirosoma) con indirizzamento diretto (channeling) degli elettroni tra tutti i costituenti, senza distinzione tra fissi e mobili. L’importanza della comprensione delle relazioni che si instaurano tra i complessi , deriva dal fatto che la catena respiratoria gioca un ruolo fondamentale nell’invecchiamento, e nello sviluppo di alcune malattie cronico degenerative attraverso la genesi di specie reattive dell’ossigeno (ROS). E’ noto, infatti, che i ROS aggrediscono, anche i complessi respiratori e che questi, danneggiati, producono più ROS per cui si instaura un circolo vizioso difficile da interrompere. La nostra ipotesi è che, oltre al danno a carico dei singoli complessi, esista una correlazione tra le modificazioni della struttura del supercomplesso, stress ossidativo e deficit energetico. Infatti, la dissociazione del supercomplesso può influenzare la stabilità del Complesso I ed avere ripercussioni sul trasferimento elettronico e protonico; per cui non si può escludere che ciò porti ad un’ulteriore produzione di specie reattive dell’ossigeno. I dati sperimentali prodotti a sostegno del modello del respirosoma si riferiscono principalmente a studi strutturali di elettroforesi su gel di poliacrilammide in condizioni non denaturanti (BN-PAGE) che, però, non danno alcuna informazione sulla funzionalità dei supercomplessi. Pertanto nel nostro laboratorio, abbiamo sviluppato una indagine di tipo cinetico, basata sull’analisi del controllo di flusso metabolico,in grado di distinguere, funzionalmente, tra supercomplessi e complessi respiratori separati. Ciò è possibile in quanto, secondo la teoria del controllo di flusso, in un percorso metabolico lineare composto da una serie di enzimi distinti e connessi da intermedi mobili, ciascun enzima esercita un controllo (percentuale) differente sull’intero flusso metabolico; tale controllo è definito dal coefficiente di controllo di flusso, e la somma di tutti i coefficienti è uguale a 1. In un supercomplesso, invece, gli enzimi sono organizzati come subunità di una entità singola. In questo modo, ognuno di essi controlla in maniera esclusiva l’intero flusso metabolico e mostra un coefficiente di controllo di flusso pari a 1 per cui la somma dei coefficienti di tutti gli elementi del supercomplesso sarà maggiore di 1. In questa tesi sono riportati i risultati dell’analisi cinetica condotta su mitocondri di fegato di ratto (RLM) sia disaccoppiati, che accoppiati in condizioni fosforilanti (stato 3) e non fosforilanti (stato 4). L’analisi ha evidenziato l’associazione preferenziale del Complesso I e Complesso III sia in mitocondri disaccoppiati che accoppiati in stato 3 di respirazione. Quest’ultimo risultato permette per la prima volta di affermare che il supercomplesso I+III è presente anche in mitocondri integri capaci della fosforilazione ossidativa e che il trasferimento elettronico tra i due complessi possa effettivamente realizzarsi anche in condizioni fisiologiche, attraverso un fenomeno di channeling del Coenzima Q10. Sugli stessi campioni è stata eseguita anche un analisi strutturale mediante gel-elettroforesi (2D BN/SDS-PAGE) ed immunoblotting che, oltre a supportare i dati cinetici sullo stato di aggregazione dei complessi respiratori, ci ha permesso di evidenziare il ruolo del citocromo c nel supercomplesso, in particolare per il Complesso IV e di avviare uno studio comparativo esteso ai mitocondri di cuore bovino (BHM), di tubero di patata (POM) e di S. cerevisiae.

The topic of this thesis concerns the study of catalytic processes for the synthesis of chiral 3,4,5-trisubstituted piperidine and 2,6-disubstituted morpholine. Substrates possessing an α,β-unsaturated ester and a ketone moiety, able to undergo addition/cyclization cascade reactions with different pro-nucleophiles (thiophenols, acetone cyanohydrin and malononitrile), have been evaluated. Chiral and achiral systems for phase-transfer catalysis have been applied as catalysts. Moderate enantiomeric excesses have been obtained for the morpholinic products and good to excellent values for the piperidinic products, by using cyclopeptoids and quaternary ammonium salts derived from Chincona alkaloids as catalysts respectively. Moreover, the absolute configuration of the 3,4,5-trisubstituted piperidines has been determined through quantomechanical simulations of their chirooptical spectra. Finally, the relative configuration of the 2,6-disubstituted morpholines has been assigned through NMR experiments.

Lo scopo principale di questo lavoro consiste nell’analisi morfologica e strutturale di nanopartcelle depositate in presenza di liquidi ionici tramite caratterizzazione al SEM e successiva microanalisi eseguita sui campioni.

Tesi relativa ad un’attività svolta presso IEMCA, azienda attiva nel settore della produzione di caricatori automatici di barre per torni. L’oggetto dello studio è la pinza elastica del caricatore, un componente fondamentale nella fase di alimentazione della barra al tornio e nella successiva fase di recupero dello spezzone non lavorato. Il processo di introduzione avviene sulla base di un’interferenza controllata tra la barra e la pinza elastica, che tende ad aprirsi, generando perciò tensioni flettenti che sollecitano il componente in alcuni punti critici. Durante il suo ciclo di vita, la pinza risulta soggetta a numerosi cicli di introduzione/estrazione, determinando forze e tensioni tempo varianti che portano spesso ad una rottura per fatica. Obiettivo dello studio è lo sviluppo di un modello semplificato della pinza che permetta di stimare forze e tensioni nei punti critici e di prevedere la vita a fatica del componente in funzione di alcuni parametri di progetto (geometria, materiale, interferenza massima). La semplificazione del modello proposto rispetto al componente reale consiste nello sviluppo in piano di una geometria cilindrica: ciò consente di definire un modello di calcolo analitico di facile implementazione ed analisi. I risultati forniti dal modello analitico sono stati confrontanti con quelli ottenuti da simulazioni numeriche al FEM nonchè con dati sperimentali. Il confronto ha dato esito soddisfacente rendendo così il modello proposto una linea guida per il futuro sviluppo di modelli più complessi che rispettino la reale geometria della pinza.

La DNA topoisomerasi IB umana è un enzima monomerico essenziale nel risolvere problemi topologici generati durante procesi chiave nucleari quali la replicazione, trascrizione, combinazione e riparazione del DNA. Latopo IB rilassa DNA superavvolti sia negativi che positivi in assenza di cationi metallici, attraverso la rottura transiente di un singolo filamento di DNA. Durante il ciclo catalitico il residuo Tyr723 viene usato come nucleofilo per rompere il legame fosfodiesterico del backbone del DNA generando un complesso covalente enzima-DNA all'estremità 3' del filamento tagliato. Il gruppo ossidrile 5' del filamento tagliato è libero di ruotare e di agire come nucleofilo attaccando il gruppo fosfato per rompere il legame tra il DNA e l'enzima risaldando il filamento precedentemente tagliato. Secondo studi cristallografici e di proteolisi limitata la topo IB è organizzata in quattro domini: N-terminale, core, linker e C-terminale che contiene il residuo attivo della Tyr723. L'enzima inoltre risulta essere l'unico bersaglio di farmaci chemioterapici quali la camptotecina ed i suoi derivati. Studi di mutanti ipersensibili, come la topoisomerasi I Asp677Gly-Val703Ile, permettono di comprendere i meccanismi alla base del funzionamento dell'enzima e della sua interazione con la droga ed intercorrelazione tra i diversi domini proteici. A tal fine sono stati eseguiti saggi di caratterizzazione biochimica del mutante in vivo ed in vitro analizzando le principali fasi del ciclo. Lo sviluppo sempre maggiore di nuovo farmaci antitumorali ci ha portato a volgere l'attenzione sull'effetto inibitorio del cEPA e a comprenderne il meccanismo. Gli esperimenti mostrano che il cEPA ha un meccanismo differrente dalla CPT inibendo il taglio dell'enzima sul DNA substrato sebbene permetta la formazione del complesso non covalente enzima-DNA. Di particolare interesse è il dominio N-terminale, in quanto è l'unica regione dell'enzima con una struttura 3D sconosciuta, in quanto non è possibile cristallizzarla. Il dominio è stato overespresso in E. coli BL21 come proteina di fusione con la GST. Sono stati esegiuti studi preliminari di struttura mediante tecniche spettroscopiche di fluorescenza, di dicroismo circolare e di NMR monodimensionale. Questi spettri indicano un eqiuilibrio tra regioni strutturate e non strutturate, ma per ricevere ulteriori informazioni strutturali è necessario eseguire spettri NMR bidimensionali producendo il dominio marcato con isotopi N15 e C13.
Human DNA topoisomerase IB (topo IN) is an essential monomeric enzyme involved in resolving the torsional stress assiciated with DNA replication, trascription and chromatin condensation. Topo IB catalyzes changes in the supehelical state of the duplex DNA by transiently breaking a single strand allowing the broken strand to move through the break. Phosphodiester bond energy is preserved during catalysis through the formation of a transient phosphotyrosine bond between the active-site tyrosine and the 3' end of the broken strand. According to X-ray crystallography and biochemical analysyses topo IB is organized into four domains: N-terminal domain,core, linker and C-terminal domain which contains the active site Tyr723. The topo IB is also an important target of the antitumor drug camptothecin for chemotherapy of uman cancers. The biochemical and structural-dynamical properties of the Asp677Gly-Val703Ile double mutant displaying a pronounced CPT sensitivity as been investigated to better understad the action mechanism of the enzyme and the interaction of CPT with the cleavable topoI-DNA complex. The results have shown that the CPT hypersensitivity of the mutations its done to a reduction of its religation rate and demonstrated the occurrence of a long range communication between domains localized far away one from the other.The inhibition efficiency on human topo IB wild type of the cEPA has been investigated analyzing the different steps of the enzyme catalytic cycle. The experiments show that cEPA has a mechanism different from CPT, inhibiting the cleavage of the enzyme on the DNA although permitting the non covalent enzyme-DNA interaction. The human topoI N-terminal domain is the only region of the enzyme with an unknown 3D structure since it is not possible to crystallize it. This domain has been overproduced into E.coli BL21,to carry out preliminary spectroscopic analysis consisting of CD, fluorescence and NMR spectra. The spectra indicate an equilibrium between the structured and unstructured regions. We are now producing the isotope labeled protein,growing the bacterial cells in minimum medium containing N15,in the attempt to gain further structural information by high-field 2D NMR spectroscopy.

L’ attività di ricerca del Dottorato di Ricerca in Scienze e Tecnologie Biologiche, XXVII ciclo, si inserisce nell’ambito della chimica delle sostanze naturali ed è rivolta all’isolamento e alla caratterizzazione strutturale dei metaboliti secondari provenienti da matrici vegetali . Le specie oggetto di studio sono piante, utilizzate nella medicina popolare per le loro caratteristiche fitoterapiche, oppure sono impiegate anche nell’alimentazione. L’indagine chimica si è concentrata sulle seguenti specie vegetali: Olea europea L., Gentiana lutea L. e su una varietà autoctona del Molise appartenente alla specie Allium cepa L. Il decotto di foglie di Olea europea, viene utilizzato nella medicina popolare per la nota attività ipotensiva e ipoglicemica. L’estratto delle radici di Gentiana lutea è impiegato per alleviare i disturbi gastrici, inoltre le radici vengono impiegate anche per la realizzazioni di bevande utilizzate come aperitivo e amaro. La specie Allium cepa è nota per l’attività antibatterica che esplica sull’apparato digerente. La purificazione e l’isolamento dei metaboliti secondari è stata realizzata mediante l’utilizzo di tecniche cromatografiche quali: cromatografia su colonna, cromatografia su strato sottile, HPLC (High Pressure Liquid Chromatography), DCCC (Droplet Countercurrent Chromatography). La caratterizzazione strutturale di tutti i composti isolati è avvenuta attraverso tecniche spettroscopiche di Risonanza Magnetica Nucleare con esperimenti monodimensionli (1H-NMR, 13C-NMR) e bidimensionali (COSY, HSQC, HMBC, ROESY). L’analisi ha condotto all’isolamento di diversi metaboliti secondari. Molti composti isolati sono stati sottoposti a test di valutazione dell’attività biologica. Alcuni prodotti hanno mostrato una notevole attività antiossidante e una potenziale capacità di inibire l’enzima xantina ossidasi. Infine alcuni dei composti isolati sono stati analizzati in silico, mediante l’utilizzo di una tecnica innovativa, la ChemGPS. La ChemGPS, ha consentito di realizzare uno studio predittivo sulle eventuali attività biologiche.
The research activity in Biological Sciences and Technology, PhD XXVII cycle, is focused on the chemistry of natural substances. The main aim is isolation and structural characterization of secondary metabolites from plants. The plant species used in this study are useful in folk medicine due to their herbal medicinal properties and edible food plants. The chemical investigation is mainly focused on the following plant species: Olea europea L., Gentiana lutea L. and Allium cepa L., a local variety found in Molise region. The decoction of the leaves of Olea europea, is widely used in folk medicine for hypotensive and hypoglycemic activities. The extract of Gentiana lutea roots is used to relieve an upset stomach. However, the roots are also used for the preparation of beverages. The species Allium cepa is known for its antibacterial activity in the digestive system. The purification and isolation of secondary metabolites was achieved by using chromatographic techniques such as column chromatography, thin layer chromatography (TLC), High Pressure Liquid Chromatography (HPLC), Droplet Countercurrent Chromatography (DCCC). The structural characterization of all isolated compounds was based on spectroscopic techniques using both mono-dimensional and two-dimensional experiments such as, NMRs (Nuclear Magnetic Resonance, i.e. 1H NMR, 13C NMR and COSY, HSQC, HMBC, ROESY, respectively). The analysis led to the isolation of several secondary metabolites. Many compounds were tested for biological activity and some of them showed a remarkable antioxidant activity and a potential inhibition of xanthine oxidase enzyme. Finally, some of the isolated compounds were analyzed in silico, by using a novel technique called ChemGPS. A predictive study on the biological activities was of the isolated test compounds was possible due to this analysis.

Gli istoni sono proteine basiche che possono essere classificate in varie classi: H1, H2A, H2B, H3 e H4. Queste proteine formano l’ottamero proteico attorno al quale si avvolge il DNA per formare il nucleosoma che è l’unità fondamentale della cromatina. A livello delle code N-terminali, gli istoni possono essere soggetti a numerose modifiche posttraduzionali quali acetilazioni, metilazioni, fosforilazioni, ADP-ribosilazioni e ubiquitinazioni. Queste modifiche portano alla formazione di diversi siti di riconoscimento per diversi complessi enzimatici coinvolti in importanti processi come la riparazione e la replicazione del DNA e l’assemblaggio della cromatina. La più importante e la più studiata di queste modifiche è l’acetilazione che avviene a livello dei residui amminici della catena laterale dell’amminoacido lisina. I livelli corretti di acetilazione delle proteine istoniche sono mantenuti dall’attività combinata di due enzimi: istone acetil transferasi (HAT) e istone deacetilasi (HDAC). Gli enzimi appartenenti a questa famiglia possono essere suddivisi in varie classi a seconda delle loro diverse caratteristiche, quali la localizzazione cellulare, la dimensione, l’omologia strutturale e il meccanismo d’azione. Recentemente è stato osservato che livelli aberranti di HDAC sono coinvolti nella carcinogenesi; per questo motivo numerosi gruppi di ricerca sono interessati alla progettazione e alla sintesi di composti che siano in grado di inibire questa classe enzimatica. L’inibizione delle HDAC può infatti provocare arresto della crescita cellulare, apoptosi o morte cellulare. Per questo motivo la ricerca farmaceutica in campo antitumorale è mirata alla sintesi di inibitori selettivi verso le diverse classi di HDAC per sviluppare farmaci meno tossici e per cercare di comprendere con maggiore chiarezza il ruolo biologico di questi enzimi. Il potenziale antitumorale degli inibitori delle HDAC deriva infatti dalla loro capacità di interferire con diversi processi cellulari, generalmente non più controllati nelle cellule neoplastiche. Nella maggior parte dei casi l’attività antitumorale risiede nella capacità di attivare programmi di differenziamento, di inibire la progressione del ciclo cellulare e di indurre apoptosi. Inoltre sembra essere molto importante anche la capacità di attivare la risposta immunitaria e l’inibizione dell’angiogenesi. Gli inibitori delle HDAC possono essere a loro volta classificati in base alla struttura chimica, alla loro origine (naturale o sintetica), e alla loro capacità di inibire selettivamente le HDAC appartenenti a classi diverse. Non è ancora chiaro se la selettività di queste molecole verso una specifica classe di HDAC sia importante per ottenere un effetto antitumorale, ma sicuramente inibitori selettivi possono essere molto utili per investigare e chiarire il ruolo delle HDAC nei processi cellulari che portano all’insorgenza del tumore. Nel primo capitolo di questa tesi quindi è riportata un’introduzione sull’importanza delle proteine istoniche non solo da un punto di vista strutturale ma anche funzionale per il destino cellulare. Nel secondo capitolo è riportato lo stato dell’arte dell’analisi delle proteine istoniche che comprende sia i metodi tradizionali come il microsequenziamento e l’utilizzo di anticorpi, sia metodi più innovativi (RP-LC, HILIC, HPCE) ideati per poter essere accoppiati ad analisi mediante spettrometria di massa. Questa tecnica consente infatti di ottenere importanti e precise informazioni che possono aiutare sia a identificare gli istoni come proteine che a individuare i siti coinvolti nelle modifiche post-traduzionali. Nel capitolo 3 è riportata la prima parte del lavoro sperimentale di questa tesi volto alla caratterizzazione delle proteine istoniche mediante tecniche cromatografiche accoppiate alla spettrometria di massa. Nella prima fase del lavoro è stato messo a punto un nuovo metodo cromatografico HPLC che ha consentito di ottenere una buona separazione, alla linea di base, delle otto classi istoniche (H1-1, H1-2, H2A-1, H2A-2, H2B, H3-1, H3-2 e H4). La separazione HPLC delle proteine istoniche ha permesso di poter eseguire analisi accurate di spettrometria di massa mediante accoppiamento con un analizzatore a trappola ionica tramite la sorgente electrospray (ESI). E’ stato così possibile identificare e quantificare tutte le isoforme istoniche, che differiscono per il tipo e il numero di modifiche post-traduzionali alle quali sono soggette, previa estrazione da colture cellulari di HT29 (cancro del colon). Un’analisi così dettagliata delle isoforme non può essere ottenuta con i metodi immunologici e permette di eseguire un’indagine molto accurata delle modifiche delle proteine istoniche correlandole ai diversi stadi della progressione del ciclo e alla morte cellulare. Il metodo messo a punto è stato convalidato mediante analisi comparative che prevedono la stessa separazione cromatografica ma accoppiata a uno spettrometro di massa avente sorgente ESI e analizzatore Q-TOF, dotato di maggiore sensibilità e risoluzione. Successivamente, per identificare quali sono gli specifici amminoacidi coinvolti nelle diverse modifiche post-traduzionali, l’istone H4 è stato sottoposto a digestione enzimatica e successiva analisi mediante tecniche MALDI-TOF e LC-ESI-MSMS. Queste analisi hanno permesso di identificare le specifiche lisine acetilate della coda N-terminale e la sequenza temporale di acetilazione delle lisine stesse. Nel quarto capitolo sono invece riportati gli studi di inibizione, mirati a caratterizzare le modifiche a carico delle proteine istoniche indotte da inibitori delle HDAC, dotati di diverso profilo di potenza e selettività. Dapprima Il metodo messo a punto per l’analisi delle proteine istoniche è stato applicato all’analisi di istoni estratti da cellule HT29 trattate con due noti inibitori delle HDAC, valproato e butirrato, somministrati alle cellule a dosi diverse, che corrispondono alle dosi con cui sono stati testati in vivo, per convalidare il metodo per studi di inibizione di composti incogniti. Successivamente, lo studio è proseguito con lo scopo di evidenziare effetti legati alla diversa potenza e selettività degli inibitori. Le cellule sono state trattate con due inibitori più potenti, SAHA e MS275, alla stessa concentrazione. In entrambi i casi il metodo messo a punto ha permesso di evidenziare l’aumento dei livelli di acetilazione indotto dal trattamento con gli inibitori; ha inoltre messo in luce differenti livelli di acetilazione. Ad esempio il SAHA, potente inibitore di tutte le classi di HDAC, ha prodotto un’estesa iperacetilazione di tutte le proteine istoniche, mentre MS275 selettivo per la classe I di HDAC, ha prodotto modifiche molto più blande. E’ stato quindi deciso di applicare questo metodo per studiare la dose e la tempo-dipendenza dell’effetto di quattro diversi inibitori delle HDAC (SAHA, MS275, MC1855 e MC1568) sulle modifiche post-traduzionali di istoni estratti da cellule HT29. Questi inibitori differiscono oltre che per la struttura chimica anche per il profilo di selettività nei confronti delle HDAC appartenenti alle diverse classi. Sono stati condotti quindi studi di dose-dipendenza che hanno consentito di ottenere i valori di IC50 (concentrazione capace di ridurre della metà la quantità relativa dell’istone meno acetilato) caratteristici per ogni inibitore nei confronti di tutte le classi istoniche. E’ stata inoltre calcolata la percentuale massima di inibizione per ogni inibitore. Infine sono stati eseguiti studi di tempo-dipendenza. I risultati ottenuti da questi studi hanno permesso di correlare i livelli di acetilazione delle varie classi istoniche con la selettività d’azione e la struttura chimica degli inibitori somministrati alle cellule. In particolare, SAHA e MC1855, inibitori delle HDAC di classi I e II a struttura idrossamica, hanno causato l’iperacetilazione di tutte le proteine istoniche, mentre MC1568 (inibitore selettivo per HDAC di classe II) ha prodotto l’iperacetilazione solo di H4. Inoltre la potenza e la selettività degli inibitori nel provocare un aumento dei livelli di acetilazione a livello delle distinte classi istoniche è stata correlata al destino biologico della cellula, tramite studi di vitalità cellulare. E’ stato osservato che il SAHA e MC1855, inibitori potenti e non selettivi, somministrati alla coltura HT29 a dose 50 μM producono morte cellulare, mentre MS275 alla stessa dose produce accumulo citostatico in G1/G0. MC1568, invece, non produce effetti significatici sul ciclo cellulare. Questo studio ha perciò dimostrato che l’analisi tramite HPLC-ESI-MS delle proteine istoniche permette di caratterizzare finemente la potenza e la selettività di nuovi composti inibitori delle HDAC, prevedendone l’effetto sul ciclo cellulare. In maggiore dettaglio è risultato che l’iperacetilazione di H4 non è in grado di provocare modifiche significative sul ciclo cellulare. Questo metodo, insieme alle analisi MALDI-TOF e LC-ESI-MSMS che permettono di individuare l’ordine di acetilazione delle lisine della coda N-terminale, potrà fornire importanti informazioni sugli inibitori delle HDAC e potrà essere applicato per delineare la potenza, la selettività e il meccanismo di azione di nuovi potenziali inibitori di questa classe enzimatica in colture cellulari tumorali.

Gli istoni sono proteine basiche che possono essere classificate in varie classi: H1, H2A, H2B, H3 e H4. Queste proteine formano l’ottamero proteico attorno al quale si avvolge il DNA per formare il nucleosoma che è l’unità fondamentale della cromatina. A livello delle code N-terminali, gli istoni possono essere soggetti a numerose modifiche posttraduzionali quali acetilazioni, metilazioni, fosforilazioni, ADP-ribosilazioni e ubiquitinazioni. Queste modifiche portano alla formazione di diversi siti di riconoscimento per diversi complessi enzimatici coinvolti in importanti processi come la riparazione e la replicazione del DNA e l’assemblaggio della cromatina. La più importante e la più studiata di queste modifiche è l’acetilazione che avviene a livello dei residui amminici della catena laterale dell’amminoacido lisina. I livelli corretti di acetilazione delle proteine istoniche sono mantenuti dall’attività combinata di due enzimi: istone acetil transferasi (HAT) e istone deacetilasi (HDAC). Gli enzimi appartenenti a questa famiglia possono essere suddivisi in varie classi a seconda delle loro diverse caratteristiche, quali la localizzazione cellulare, la dimensione, l’omologia strutturale e il meccanismo d’azione. Recentemente è stato osservato che livelli aberranti di HDAC sono coinvolti nella carcinogenesi; per questo motivo numerosi gruppi di ricerca sono interessati alla progettazione e alla sintesi di composti che siano in grado di inibire questa classe enzimatica. L’inibizione delle HDAC può infatti provocare arresto della crescita cellulare, apoptosi o morte cellulare. Per questo motivo la ricerca farmaceutica in campo antitumorale è mirata alla sintesi di inibitori selettivi verso le diverse classi di HDAC per sviluppare farmaci meno tossici e per cercare di comprendere con maggiore chiarezza il ruolo biologico di questi enzimi. Il potenziale antitumorale degli inibitori delle HDAC deriva infatti dalla loro capacità di interferire con diversi processi cellulari, generalmente non più controllati nelle cellule neoplastiche. Nella maggior parte dei casi l’attività antitumorale risiede nella capacità di attivare programmi di differenziamento, di inibire la progressione del ciclo cellulare e di indurre apoptosi. Inoltre sembra essere molto importante anche la capacità di attivare la risposta immunitaria e l’inibizione dell’angiogenesi. Gli inibitori delle HDAC possono essere a loro volta classificati in base alla struttura chimica, alla loro origine (naturale o sintetica), e alla loro capacità di inibire selettivamente le HDAC appartenenti a classi diverse. Non è ancora chiaro se la selettività di queste molecole verso una specifica classe di HDAC sia importante per ottenere un effetto antitumorale, ma sicuramente inibitori selettivi possono essere molto utili per investigare e chiarire il ruolo delle HDAC nei processi cellulari che portano all’insorgenza del tumore. Nel primo capitolo di questa tesi quindi è riportata un’introduzione sull’importanza delle proteine istoniche non solo da un punto di vista strutturale ma anche funzionale per il destino cellulare. Nel secondo capitolo è riportato lo stato dell’arte dell’analisi delle proteine istoniche che comprende sia i metodi tradizionali come il microsequenziamento e l’utilizzo di anticorpi, sia metodi più innovativi (RP-LC, HILIC, HPCE) ideati per poter essere accoppiati ad analisi mediante spettrometria di massa. Questa tecnica consente infatti di ottenere importanti e precise informazioni che possono aiutare sia a identificare gli istoni come proteine che a individuare i siti coinvolti nelle modifiche post-traduzionali. Nel capitolo 3 è riportata la prima parte del lavoro sperimentale di questa tesi volto alla caratterizzazione delle proteine istoniche mediante tecniche cromatografiche accoppiate alla spettrometria di massa. Nella prima fase del lavoro è stato messo a punto un nuovo metodo cromatografico HPLC che ha consentito di ottenere una buona separazione, alla linea di base, delle otto classi istoniche (H1-1, H1-2, H2A-1, H2A-2, H2B, H3-1, H3-2 e H4). La separazione HPLC delle proteine istoniche ha permesso di poter eseguire analisi accurate di spettrometria di massa mediante accoppiamento con un analizzatore a trappola ionica tramite la sorgente electrospray (ESI). E’ stato così possibile identificare e quantificare tutte le isoforme istoniche, che differiscono per il tipo e il numero di modifiche post-traduzionali alle quali sono soggette, previa estrazione da colture cellulari di HT29 (cancro del colon). Un’analisi così dettagliata delle isoforme non può essere ottenuta con i metodi immunologici e permette di eseguire un’indagine molto accurata delle modifiche delle proteine istoniche correlandole ai diversi stadi della progressione del ciclo e alla morte cellulare. Il metodo messo a punto è stato convalidato mediante analisi comparative che prevedono la stessa separazione cromatografica ma accoppiata a uno spettrometro di massa avente sorgente ESI e analizzatore Q-TOF, dotato di maggiore sensibilità e risoluzione. Successivamente, per identificare quali sono gli specifici amminoacidi coinvolti nelle diverse modifiche post-traduzionali, l’istone H4 è stato sottoposto a digestione enzimatica e successiva analisi mediante tecniche MALDI-TOF e LC-ESI-MSMS. Queste analisi hanno permesso di identificare le specifiche lisine acetilate della coda N-terminale e la sequenza temporale di acetilazione delle lisine stesse. Nel quarto capitolo sono invece riportati gli studi di inibizione, mirati a caratterizzare le modifiche a carico delle proteine istoniche indotte da inibitori delle HDAC, dotati di diverso profilo di potenza e selettività. Dapprima Il metodo messo a punto per l’analisi delle proteine istoniche è stato applicato all’analisi di istoni estratti da cellule HT29 trattate con due noti inibitori delle HDAC, valproato e butirrato, somministrati alle cellule a dosi diverse, che corrispondono alle dosi con cui sono stati testati in vivo, per convalidare il metodo per studi di inibizione di composti incogniti. Successivamente, lo studio è proseguito con lo scopo di evidenziare effetti legati alla diversa potenza e selettività degli inibitori. Le cellule sono state trattate con due inibitori più potenti, SAHA e MS275, alla stessa concentrazione. In entrambi i casi il metodo messo a punto ha permesso di evidenziare l’aumento dei livelli di acetilazione indotto dal trattamento con gli inibitori; ha inoltre messo in luce differenti livelli di acetilazione. Ad esempio il SAHA, potente inibitore di tutte le classi di HDAC, ha prodotto un’estesa iperacetilazione di tutte le proteine istoniche, mentre MS275 selettivo per la classe I di HDAC, ha prodotto modifiche molto più blande. E’ stato quindi deciso di applicare questo metodo per studiare la dose e la tempo-dipendenza dell’effetto di quattro diversi inibitori delle HDAC (SAHA, MS275, MC1855 e MC1568) sulle modifiche post-traduzionali di istoni estratti da cellule HT29. Questi inibitori differiscono oltre che per la struttura chimica anche per il profilo di selettività nei confronti delle HDAC appartenenti alle diverse classi. Sono stati condotti quindi studi di dose-dipendenza che hanno consentito di ottenere i valori di IC50 (concentrazione capace di ridurre della metà la quantità relativa dell’istone meno acetilato) caratteristici per ogni inibitore nei confronti di tutte le classi istoniche. E’ stata inoltre calcolata la percentuale massima di inibizione per ogni inibitore. Infine sono stati eseguiti studi di tempo-dipendenza. I risultati ottenuti da questi studi hanno permesso di correlare i livelli di acetilazione delle varie classi istoniche con la selettività d’azione e la struttura chimica degli inibitori somministrati alle cellule. In particolare, SAHA e MC1855, inibitori delle HDAC di classi I e II a struttura idrossamica, hanno causato l’iperacetilazione di tutte le proteine istoniche, mentre MC1568 (inibitore selettivo per HDAC di classe II) ha prodotto l’iperacetilazione solo di H4. Inoltre la potenza e la selettività degli inibitori nel provocare un aumento dei livelli di acetilazione a livello delle distinte classi istoniche è stata correlata al destino biologico della cellula, tramite studi di vitalità cellulare. E’ stato osservato che il SAHA e MC1855, inibitori potenti e non selettivi, somministrati alla coltura HT29 a dose 50 μM producono morte cellulare, mentre MS275 alla stessa dose produce accumulo citostatico in G1/G0. MC1568, invece, non produce effetti significatici sul ciclo cellulare. Questo studio ha perciò dimostrato che l’analisi tramite HPLC-ESI-MS delle proteine istoniche permette di caratterizzare finemente la potenza e la selettività di nuovi composti inibitori delle HDAC, prevedendone l’effetto sul ciclo cellulare. In maggiore dettaglio è risultato che l’iperacetilazione di H4 non è in grado di provocare modifiche significative sul ciclo cellulare. Questo metodo, insieme alle analisi MALDI-TOF e LC-ESI-MSMS che permettono di individuare l’ordine di acetilazione delle lisine della coda N-terminale, potrà fornire importanti informazioni sugli inibitori delle HDAC e potrà essere applicato per delineare la potenza, la selettività e il meccanismo di azione di nuovi potenziali inibitori di questa classe enzimatica in colture cellulari tumorali.

Feline Immunodeficiency Virus (FIV), a non-primate lentivirus, causes an immunodeficiency syndrome in domestic cats, that is striking similar to AIDS in humans. FIV is similar to HIV-1 in many molecular and biochemical properties, thus representing an attractive model for AIDS research in many different aspects ranging from pathogenesis to therapeutic approaches. In addition, based on these similarities and exploiting its peculiar features, FIV could be the basis for the development of a safe gene delivery system to target specific cells in different human organs and tissues. In order to fully take advantages of these important properties and considering that the present understanding of FIV biology lags behind knowledge accumulated on HIV, different aspects of FIV life cycle need to be further investigated. RNA-enveloped viruses bud from infected cells by exploiting the Multivesicular Body (MVB) pathway. In this context, ubiquitination of structural viral proteins and their direct interaction with cellular factors involved in the MVB biogenesis through short proline rich regions, named Late domains (L domains), are crucial mechanisms. As for all the other retroviruses, FIV Gag can assemble and lead to Virus Like Particles (VLPs) budding from cells in the absence of any other viral factors. The overall goal of the project is to optimize FIV structural proteins production with the aim to improve VLPs release. In particular, we focused our attention on the production and maturation of viral particles and specifically, on the role of the major structural FIV Gag protein in viral budding. Moreover, we investigated the interaction between Gag and the cellular proteins belonging to the MVBs to understand how FIV exploits this cellular pathway for its budding. Here we report that, in contrast with HIV-1, FIV is strictly dependent for its budding on a PSAP-type L domain, mapping in the carboxy-terminal region of Gag, irrespective of a functional viral protease. Moreover, a LLDL motif was identified in the p2 Gag C-terminal region. We were able to show that the budding of a FIV mutant construct containing the completely knocked down L domain was rescued by the overexpression of AIP1 and that this cellular protein is incorporated in FIV VLPs. In the present study we demonstrate that FIV, thanks to its L domain function, hijacks the MVB biogenesis machinery to execute its efficient exit from cells. Indeed, the MVB pathway block by the overexpression of a dominant negative mutant of the cellular AAA-ATPase Vps4, which is essential for the MVB formation, induces a significant reduction of released VLPs, also in the absence of viral protease. Moreover, this result was supported by Tsg101 incorporation in VLPs and by the demonstration of CHMP3 involvement in FIV release. We provide evidence that FIV budding is related to Gag ubiquitination that is linked to the presence of an active L domain. Moreover, although FIV Gag does not contain a PPxY motif, we show that the Nedd4-2s ubiquitin ligase enhances FIV Gag ubiquitination and it is capable to rescue viral mutants characterized by a completely knocked down L domain or by the lack of the p2 Gag region. Nedd4-2s may cooperate with other L domains to enhance viral budding, maybe leading to the ubiquitination and consequent activation of MVB components, as we demonstrate here it occurs for Tsg101. In contrast with HIV-1, we show that Nedd4-2s ubiquitin ligase is not incorporated in FIV viral particles. In conclusion our data bring to light peculiar aspects of FIV Gag carboxy-terminal region and in particular those related to viral budding, that may have an impact when FIV is employed as a model for studying HIV pathogenesis and therapy, or for its biotechnological applications. We also demonstrate that a non-primate lentivirus shares with HIV-1 a novel mechanism of connection to the cellular budding machinery.
Lo studio dei determinanti virali e cellulari che regolano il rilascio delle particelle retrovirali dalle cellule infettate riveste un ruolo cruciale sia nello studio della biologia di base del virus, allo scopo di identificare nuovi target terapeutici, sia nello sviluppo di vettori per il trasferimento di proteine/geni a scopo vaccinale/terapeutico. In tale contesto, la poliproteina Gag, espressa in assenza di ogni altra proteina virale, è in grado di produrre particelle simil virali (VLP). I virus ad RNA dotati di envelope gemmano dalle cellule infettate sfruttando il pathway del Multivesicular Body (MVB). In questo ambito, fondamentali sono l'ubiquitinazione delle proteine strutturali virali e la loro diretta interazione con fattori cellulari coinvolti nella biogenesi dei MVB attraverso corti motivi aminoacidici ricchi in prolina, noti come domini di assemblaggio tardivo (Late assembly domain o L domain). Il presente lavoro di dottorato si inserisce in un progetto di ricerca più ampio che si propone di ottimizzare la produzione delle proteine strutturali del Virus dell'Immunodeficienza Felina (FIV), al fine di migliorare l'ottenimento di VLP. In particolare, ci si è proposti di valutare aspetti quali produzione e maturazione delle particelle simil virali e di studiare le interazioni della proteina Gag con proteine cellulari che cooperano con la funzione dei motivi tardivi in essa contenuti. A tale scopo, è stata ottenuta una serie di costrutti FIV-derivati, esprimenti la proteina Gag mutagenizzata nella regione carbossi-terminale a livello dell'L domain, che com'è noto svolge un ruolo essenziale nelle fasi tardive della replicazione virale. In questo modo è stato possibile dimostrare come FIV, a differenza del Virus dell'Immunodeficienza Umana (HIV), è strettamente dipendente per la sua gemmazione dal dominio L PSAP, indipendentemente dalla funzionalità della proteasi virale. E' stato inoltre identificato un secondo putativo L domain con funzione ausiliaria, motivo LLDL, localizzato all'interno della regione p2 di Gag situato a valle rispetto al primo. E' stato possibile dimostrare come i suddetti domini L permettano a FIV di sfruttare il pathway cellulare di biogenesi dei MVB per gemmare in modo efficiente dalle cellule e di come tale fenomeno sia correlato ad una significativa ubiquitinazione di Gag, possibile solamente in presenza di un L domain attivo. In particolare è stato osservato come il blocco del pathway dei MVB, mediante la sovraespressione di un mutante dominante negativo della proteina cellulare Vps4, essenziale per la formazione dei MVB, porti ad una riduzione significativa nel rilascio di VLP anche in assenza di proteasi attiva. Inoltre, questo risultato è supportato dalla dimostrazione dell'incorporazione di Tsg101 nelle particelle virali e del coinvolgimento di CHMP3 nella gemmazione virale. Infine, sono state fornite interessanti evidenze che, sebbene FIV non possieda un dominio PPxY, l'ubiquitino ligasi Nedd4-2s aumenta il livello di ubiquitinazione della proteina Gag. Probabilmente, Nedd4-2s può cooperare con altri L domain per aumentare il rilascio virale o forse può portare all'ubiquitinazione e conseguente attivazione di componenti del MVB come dimostrato in questo studio avviene per Tsg101. Inoltre, questa particolare ubiquitino ligasi è in grado, senza venire incorporata nelle particelle virali, di ripristinare un efficiente rilascio di un mutante di FIV privo di un attivo L domain. In conclusione i dati ottenuti hanno permesso di chiarire alcune caratteristiche peculiari della regione carbossi-terminale della proteina Gag di FIV e più in particolare della fase di rilascio delle particelle virali. E' stato dimostrato come un lentivirus dei non primati condivida con HIV-1 un nuovo meccanismo di collegamento al macchinario cellulare di gemmazione.

Neuromelanin and lipofuscin are two pigment that both accumulate in central nervous system with aging. The presence and the morphology of these substances have been described more than one century ago but in the past the two pigments haven’t been unmistakably distinct. Today is important to discriminate the two pigments and understand their role in brain aging. Over the past years the capacity of neuromelanin and lipofuscine to interact with different cellular component and extra-cellular environment has been investigated. The role of these pigments in the pathogenesis of neurodegenerative disease is clear. In this study the co-presence of neuromelanin and lipofuscin in the same neuron of human brain has been verified and a unique description is given. Because of the main studies on human brain lipofuscins are in situ observations we propose a new method to isolate the lipofuscins from human brain tissue. Here we illustrate a new and pioneering method to isolate lipofuscins from human premotor cortex – gray matter. This method consents to obtain lipofuscins sample without sub-cellular organelles contaminants. For this reason the lipofuscins isolated with this methodology is suitable for proteomic and lipidomic analyses. The lipofuscine isolated from human premotor cortex have been analyzed with -omics technologies. The preliminary data show the presence of lysosomal degradative pathways and mithocondria. This study shows that some neurons in central nervous system are able to accumulate both neuromelanin and lipofuscin. The two storage systems seem to result from two different metabolic processes.

It is well-known that crystalline materials obtain their fundamental physical properties from the molecular arrangement within the solid, and altering the placement and or interactions between these molecules can impact the properties of the particular solid. Solid state chemistry looks at an attempt to alter the chemical and physical solid-state properties of APIs through many different strategies as the formation of salts, polymorphs, hydrates, solvates, and cocrystals. The final aim of this work is to study the chemical and physical propriety of new crystal structures. The work consists of three parts. The first is the cocrystallization of α,ω-alkanedicarboxylics acids with pirimidine. Single-crystal X-ray diffraction analysis of this adduct have been carried out at RT, 150 and 200 K. The cocrystals show an alteration of their melting point similar to pure acids. The two significant deviations are for the cocrystals with succinico and glutarico acids. The second object of work is the structure determination of β polymorph undecandioic acids. In literature is known the other polymorph α. We observed that the thermodynamic relation for this dimorphics system is monotropic. In the third part we synthesized and analyzed the stability of four new salts of serine and oxalic acid. This project highlights the advantage of the solid state synthesis.

I recenti terremoti verificatisi in Italia e nel mondo hanno rimarcato il ruolo fondamentale delle strutture sanitarie per la gestione delle emergenze post-sisma. A seguito di eventi sismici, diversi ospedali (L'Aquila 2009, Amatrice 2016) hanno perso la loro funzionalità a causa di danni a componenti strutturali, non strutturali, attrezzature mediche ed impianti. Il ruolo primario degli ospedali dopo eventi calamitosi porta a sviluppare analisi specifiche e strategie di monitoraggio volte a valutare le loro condizioni di salute, possibilmente in tempo reale. Come risultato di questo processo, le strutture sanitarie diventano "intelligenti" e possono supportare efficacemente la mitigazione della vulnerabilità sismica, agendo sulla preparazione del personale medico e supportando la gestione e il mantenimento di sottosistemi strutturali e non strutturali nel tempo. Il monitoraggio continuo della salute e delle prestazioni degli ospedali può supportare la formulazione di piani di mitigazione delle catastrofi e la definizione delle priorità di investimento per garantire la sicurezza generale. Nel presente lavoro di tesi, è analizzato un sistema di monitoraggio focalizzato all' individuazione del danno post-terremoto delle strutture sanitarie, evidenziando le caratteristiche nella valutazione delle prestazioni dei membri strutturali, non strutturali, delle attrezzature e delle installazioni. Successivamente, sono presentati alcuni risultati di un progetto di monitoraggio in corso dell'Ospedale di Campobasso (Sud Italia), focalizzando l'attenzione sulla risposta della struttura in condizioni operative ed a seguito di eventi sismici. Viene proposto un nuovo metodo di rilevamento del danno a partire da misure di vibrazione. Sono inoltre discussi i risultati dei test sperimentali di analisi modale in condizioni operative su un distributore di farmaci al fine di valutarne la prospettiva applicativa per la qualificazione delle apparecchiature mediche in vista della valutazione della vulnerabilità sismica di componenti non strutturali. Le potenzialità dei metodi di rilevamento dei danni basati sull'analisi dei parametri modali sono valutate mediante test di laboratorio su un serbatoio in acciaio. Garantire la fornitura di liquidi e gas medicinali dopo un terremoto è uno dei compiti più importanti per garantire l'operatività dell'ospedale. I serbatoi non ancorati sono vulnerabili ai carichi sismici. Questi tipi di serbatoi sono frequentemente riscontrati all'interno di ospedali esistenti. Serbatoi d'acqua sul tetto o serbatoi di carburante diesel per i generatori di emergenza sono esempi di serbatoi solitamente non ancorati. Il loro danno può causare esplosioni e perdite di sostanze tossiche, con le relative conseguenze in termini di inquinamento e perdite di vita. A causa della loro configurazione, durante un evento sismico i serbatoi di stoccaggio di liquidi e gas applicano grandi forze ai supporti, che possono collassare causandone il rovesciamento. Pertanto, sono stati effettuati alcuni test di identificazione modale output-only per la caratterizzazione dinamica di un serbatoio d'acqua verticale a pressione atmosferica con diversi rapporti di riempimento e di ancoraggio. Questo studio fornisce suggerimenti utili per lo sviluppo di sistemi di monitoraggio in grado di diagnosticare lo stato di salute di serbatoi simili dopo eventi sismici.
Recent earthquakes occurred in Italy and throughout the world have remarked the critical role of health facilities for post-earthquake emergency management. Due to earthquake, several hospitals (L’Aquila 2009, Amatrice 2016) have lost their functionality because of damage to structural as well as non-structural members, equipment and installations. The primary role of hospitals after hazardous events leads to develop specific analysis and monitoring strategies aimed at assessing their conditions, possibly in real time. As a result of this process, health facilities become “smart” and they can effectively support the mitigation of seismic vulnerability, by acting on preparedness of the medical staff and supporting the management and the maintenance of structural as well as non-structural subsystems over time. Continuous monitoring of health and performance of hospitals can support the formulation of disaster mitigation plans and the definition of investment priorities to ensure the overall safety. In the present thesis, the main monitoring programs focused on post-earthquake damage assessment of health facilities are reviewed, pointing out their limitations in assessing the performance of structural as well as non-structural members, equipment and installations. Some results of an on-going monitoring project for the main hospital in Campobasso (Southern Italy) are presented, afterwards. Attention is focused on the response of the structure in operational conditions and after seismic events. A modal-based damage detection method is proposed. The results of experimental as well as operational modal analysis tests on a drug dispenser are also discussed in order to assess their applicative perspectives for qualification of medical equipment in view of seismic vulnerability assessment of non-structural components. The potentialities of modal based damage detection methods for the assessment of non-structural components are finally assessed by laboratory testing of a steel tank. Ensuring supply of liquids and medical gases after an earthquake is one of the most important tasks to keep the hospital operational. Unanchored tanks are vulnerable to earthquake loadings. This type of tanks is frequently encountered in existing hospitals. Rooftop water tanks or diesel fuel tanks for emergency generators are examples of usually unanchored tanks. Their damage can cause explosions and leakage of toxic substances, with the related consequences in terms of pollution and life losses. Due to their configuration, liquid and gas storage tanks apply large forces to the supports, which can collapse causing tank toppling. Thus, some output-only modal identification tests have been carried out to characterize the dynamic response of a vertical atmospheric water tank under different filling ratios and anchoring. The study has provided useful hints for the development of modal based structural health monitoring systems able to diagnose the health state of similar tanks after seismic events.

L’obiettivo di questa tesi è porre le basi dell’utilizzo dell’Arundo Donax in campo strutturale estendendo la conoscenza del suo comportamento meccanico attraverso una completa caratterizzazione meccanica. La canna comune vanta delle caratteristiche meccaniche molto simili a quelle di diverse specie di Bambù, materiale ampiamente utilizzato nei paesi dell’Asia orientale e dell’America Latina, dove è inserito nelle normative che ne regolarizzano l’utilizzo ai fini strutturali. La principale norma di riferimento per il bambù è la ISO 22157 (2019), che descrive le procedure di prova da seguire in laboratorio per una corretta caratterizzazione meccanica del materiale. La sopracitata norma è stata di riferimento nella definizione delle diverse prove eseguite sull’Arundo Donax, ma le esigue dimensioni dei campioni, se paragonate a quelle del bambù, hanno portato al progetto di nuove metodologie di prova, studiate “su misura” per ottenere una corretta caratterizzazione del materiale. La modalità di prova a compressione assiale non presenta particolari differenze da quanto indicato nella ISO 22157; lo studio si è quindi incentrato sulle possibili soluzioni da adottare nell’esecuzione dei test a trazione, a taglio e a compressione trasversale, prove che anche per il bambù presentano una significativa dispersione dei risultati e sono in continuo aggiornamento dal punto di vista normativo. Le ridotte dimensioni della sezione comportano diverse difficoltà nel monitoraggio della prova con tecniche di misurazione standard. Si utilizza la DIC, una tecnica di monitoraggio contactless in grado di costruire dei campi vettoriali di deformazione della superfice del campione; tale tecnica di acquisizione permette di cogliere al meglio il comportamento di un materiale fortemente anisotropo come l’Arundo Donax, le cui proprietà meccaniche sono dipendenti dalla direzione di applicazione del carico e le cui caratteristiche di rigidezza variano sullo spessore e lungo lo sviluppo del culmo.

L’obiettivo del presente lavoro è verificare l’affidabilità di una parte di macchina radiologica di Cefla Dentale, nello specifico del gruppo di fissaggio paziente, attraverso la valutazione sperimentale della risposta strutturale della stessa. Partendo dall’analisi dell’architettura e del funzionamento dei singoli sottosistemi del gruppo, sono stati definiti gli obiettivi (in relazione alle prestazioni desiderate) e la tipologia di prova; a seguire, si è passati alla pianificazione dei test, comprendente l’individuazione dei parametri da monitorare per la verifica finale, la definizione dei carichi nominali, del numero di cicli di funzionamento (corrispondenti alla vita utile media) e la definizione di attrezzature idonee allo scopo specifico. L’intento è stato quello di eseguire i test con contrazione dei tempi di prova, utilizzando come fattori di accelerazione la frequenza di funzionamento unitamente all’applicazione di opportuni sovraccarichi, con il duplice scopo di fare emergere eventuali elementi critici ma in un tempo nettamente inferiore a quello reale di funzionamento della macchina.

La nicotinammide mononucleotide (NMN) deamidasi è uno degli enzimi chiave del ciclo dei nucleotidi piridinici (PNC), l’insieme delle trasformazioni biochimiche che consentono alla cellula di generare il coenzima NAD dalla vitamina B3 assunta attraverso fonti esogene (dieta, mezzo di crescita) o ottenuta metabolicamente dalla degradazione intracellulare del dinucleotide stesso. Catalizzando la deamidazione della forma mononucleotidica della vitamina (NMN), l’enzima infatti fornisce il substrato per la successiva reazione di sintesi del NAD. Una proteina dotata di attività NMN deamidasica è stata identificata recentemente, mediante un approccio biochimico, nel batterio Shewanella oneidensis. In questo lavoro di tesi, studi genetici in vivo ne hanno confermato il coinvolgimento nel metabolismo della vitamina B3. Analisi di omologia di sequenza hanno rivelato che l’NMN deamidasi è altamente conservata e presente nella maggior parte delle specie batteriche, mentre è assente negli archea e negli eucarioti. In alcuni batteri il dominio responsabile dell’attività catalitica si trova fuso ad una proteina a funzione ancora sconosciuta. Sia l’enzima costituito dai due domini, sia quello a singolo dominio, mostrano una stretta specificità di substrato e una elevata efficienza catalitica. Ciò suggerisce che l’enzima possa svolgere un importante ruolo nella regolazione dei livelli intracellulari di NMN. L’NMN deamidasi è sia filogeneticamente che strutturalmente distinta da tutte le amidoidrolasi ad oggi caratterizzate. L’ enzima ricombinante è stato utilizzato per mettere a punto un saggio enzimatico molto sensibile che consente la determinazione dei livelli cellulari di entrambe le forme mononucleotidiche della vitamina, l’NMN e l’NaMN.
Nicotinamide mononucleotide (NMN) deamidase is one of the key enzymes of the pyridine nucleotide cycle (PNC), a network of biochemical transformations that allow cells to recycle the byproducts of endogenous NAD consumption back to the coenzyme, and to salvage the available pyridine bases, nucleosides and nucleotides as NAD precursors. By catalyzing the deamidation of the mononucleotide form of the vitamin (NMN), the enzyme provides the substrate to the subsequent step towards NAD biosynthesis. Recently, through a biochemical approach, a protein endowed with NMN deamidase activity was identified in the bacterium Shewanella oneidensis. In this work, in vivo genetic studies confirmed the role of the enzyme in the vitamin B3 biosynthesis. Sequence homology analyses revealed that NMN deamidase is a highly conserved enzyme present in most bacterial species; it is absent in Archaea and in Eukaryotes. In some bacterial species, the NMN deamidase functional domain is found fused with a protein of unknown function. Both the single- and the two- domain enzymes show a remarkable high affinity for the substrate, as well as a high catalytic efficiency; this result is consistent with the proposed enzyme’s role in contributing to NMN levels regulation. NMN deamidase is both phylogenetically and structurally distinct from enzymes catalyzing the hydrolysis of amide bonds belonging to known superfamilies. The recombinant enzyme was used to set up an enzymatic assay for the determination of intracellular levels of both the monucleotide forms of the vitamin B3, NMN and NaMN.

L’enzima polinucleotide fosforilasi (PNPasi, E.C. 2.7.7.8) è coinvolto nel metabolismo dei nucleotidi, sia negli eucarioti che nei procarioti. L’enzima catalizza la degradazione fosforolitica dell’RNA, rilasciando nucleosidi 5’-difosfato dall’estremità 3’ del substrato, e la reazione inversa di polimerizzazione. In questo lavoro è descritta la purificazione e la caratterizzazione biochimica della PNPasi isolata dall’eubatterio psicrofilo di origine Antartica Pseudoalteromonas haloplanktis (Ph, temperatura ottimale di crescita 4-20°C) identificata sulla base della sua capacità di catalizzare la seguente reazione reversibile: RNA(n) + Pi ↔ RNA(n-1) + ppN L’enzima ha mostrato una struttura omotrimerica con un Mr pari a 255000, come valutato da analisi della massa molecolare in condizioni native e denaturanti. Utilizzando software bioinformatici dedicati sono state ottenute, a partire dalla sequenza amminoacidica, predizioni della struttura secondaria e terziaria del monomero. Inoltre, sono stati condotti studi sulla composizione amminoacidica che hanno permesso di evidenziare che la PhPNPasi mostra i tipici adattamenti delle proteine psicrofile. I parametri cinetici sono stati determinati a 15°C, utilizzando poli(A) come primer e GDP marcato come substrato. E’ stato valutato l’effetto sull’attività enzimatica di concentrazioni crescenti di GDP, consentendo di calcolare i parametri cinetici. L’attività della PhPNPasi è risultata essere stimolata dalla presenza di alcuni cationi monovalenti nella miscela di reazione, caratteristica già evidenziata per un altri enzimi isolati da P. haloplanktis. Tra essi il CsCl ad una concentrazione 0,9 M è risultato il più efficace, aumentando l’attività dell’enzima di circa 7 volte. L’attività enzimatica della PhPNPasi aumenta con l’incremento della temperatura, raggiungendo un valore massimo a 40°C; oltre questa temperatura si osserva un decremento della velocità di reazione, probabilmente dovuto alla sua inattivazione termica. Nell’intervallo 0-40°C è stato calcolato un valore di energia di attivazione (Ea) pari a 87 kJ/mol. La PhPNPasi è un enzima piuttosto sensibile al trattamento termico, infatti l’energia di attivazione della reazione di inattivazione termica nell’intervallo 30-70°C è risultata pari a 96,7 kJ/mol, valore significativamente più basso di quello osservato per altre proteine isolate da fonti mesofile o termofile. La termostabilità di questo enzima è stata valutata anche con analisi di tipo spettroscopico. Le curve di UV melting hanno mostrato una temperatura di semidenaturazione di 46°C, valore significativamente più alto di quello a cui si registra la massima attività catalitica. I risultati indicano che il centro catalico della PhPNPasi è molto meno stabile del resto della struttura della proteina.
Polynucleotide phosphorylase (PNPase) is involved in the nucleotide metabolism pathway of both eukaryotes and prokaryotes. The enzyme catalyzes the phosphorolytic degradation of RNA, releasing nucleoside 5’-diphosphates from the 3’ end of the substrate, and the reverse reaction of nucleoside 5’-diphosphate polymerization. In this work it’s described the procedure of isolation and the characterization of PNPase from the psychrophilic eubacterium Pseudoalteromonas haloplanktis (Ph, optimal growth condition 4-20°C), identified for its ability to catalyse the following reversible reaction: RNA(n) + Pi ↔ RNA(n-1) + ppN PhPNPase showed a homotrimeric structure of 255 kDa, as evaluated by molecular mass analysis under native and denatured conditions. Using bioinformatic software, starting from the amino acid sequence, a prediction of the secondary and tertiary monomer structure have been obtained. Besides, studies on the amino acid composition have been carried out, thus evidencing that PhPNPase shows the typical adaptation of proteins isolated from psychrophilic organisms. The kinetic parameters have been determined at 15°C, using poly(A) as a primer and [3H]GDP as substrate. The effect of increasing concentration of [3H]GDP on the activity has been evaluated, thus allowing the determination of the kinetic parameters of the polymerization reaction. The activity of PhPNPase is stimulated by selected monovalent cations added in the reaction mixture, a feature already observed for other enzymes isolated from P. haloplanktis. Among the cations tested, CsCl, added to 0.9 M final concentration, has resulted the most effective, enhancing PhPNPase activity of about 7-fold. The effect of temperature on the activity and stability of PhPNPase has also been tested. In particular, the activity of PhPNPase increases with increasing temperature, reaching a maximum at 40°C; beyond this temperature a straight decay of the activity has been observed, due to thermal inactivation of the enzyme. In the 0-40°C interval, a value of 87 kJ/mol for the energy of activation of the reaction (Ea) has been calculated. Studies about the effect of temperature on PhPNPase stability have shown that this enzyme is a quite thermolabile protein; in fact, the Ea of the thermal inactivation reaction in the 30-70°C interval, is 96.7 kJ/mol, a value significantly lower than those observed for other proteins isolated from mesophilic and thermophilic sources. The thermostability of this enzyme has also been investigated by spectroscopic analysis. UV-melting curves have shown a temperature for half-denaturation of 46°C, a value significantly higher than that found for the maximum catalytic activity. These results indicate that the catalitic centre of PhPNPase is less stable of the overall protein structure.

Dendritic Cells (DCs) derived from human blood monocytes that have been nurtured in GM-CSF and IL-4, followed by maturation in a monocyte-conditioned medium, are the most potent APCs known. These DCs have many features of primary DCs, including the expression of molecules that enhance antigen capture and selective receptors that guide DCs to and from several sites in the body, where they elicit the T cell mediated immune response. For these features, immature DCs (iDC) loaded with tumor antigen and matured (mDC) with a standard cytokine cocktail, are used for therapeutic vaccination in clinical trials of different cancers. However, the efficacy of DCs in the development of immunocompetence is critically influenced by the type (whole lysate, proteins, peptides, mRNA), the amount and the time of exposure of the tumor antigens used for loading in the presentation phase. The aim of the present study was to create instruments to acquire more information about DC antigen uptake and presentation mechanisms to improve the clinical efficacy of DCbased vaccine. In particular, two different tumor antigen were studied: the monoclonal immunoglobulin (IgG or IgA) produced in Myeloma Multiple, and the whole lysate obtained from melanoma tissues. These proteins were conjugated with fluorescent probe (FITC) to evaluate the kinetic of tumor antigen capturing process and its localization into DCs, by cytofluorimetric and fluorescence microscopy analysis, respectively. iDC pulsed with 100μg of IgG-FITC/106 cells were monitored from 2 to 22 hours after loading. By the cytofluorimetric analysis it was observed that the monoclonal antibody was completely captured after 2 hours from pulsing, and was decreased into mDC in 5 hours after maturation stimulus. To monitor the lysate uptake, iDC were pulsed with 80μg of tumor lysate/106 cells, then were monitored in the 2h to 22 hours interval time after loading. Then, to reveal difference between increasing lysate concentration, iDC were loaded with 20-40-80-100-200-400μg of tumor lysate/106 cells and monitored at 2-4-8-13h from pulsing. By the cytofluorimetric analysis, it was observed that, the 20-40-80-100μg uptake, after 8 hours loading was completed reaching a plateau phase. For 200 and 400μg the mean fluorescence of cells increased until 13h from pulsing. The lysate localization into iDC was evaluated with conventional and confocal fluorescence microscopy analysis. In the 2h to 8h time interval from loading an intensive and diffuse fluorescence was observed within the cytoplasmic compartment. Moreover, after 8h, the lysate fluorescence appeared to be organized in a restricted cloudy-shaded area with a typical polarized aspect. In addition, small fluorescent spots clearly appeared with an increment in the number and fluorescence intensity. The nature of these spot-like formations and cloudy area is now being investigated detecting the colocalization of the fluorescence lysate and specific markers for lysosomes, autophagosomes, endoplasmic reticulum and MHCII positive vesicles.

Dendritic Cells (DCs) derived from human blood monocytes that have been nurtured in GM-CSF and IL-4, followed by maturation in a monocyte-conditioned medium, are the most potent APCs known. These DCs have many features of primary DCs, including the expression of molecules that enhance antigen capture and selective receptors that guide DCs to and from several sites in the body, where they elicit the T cell mediated immune response. For these features, immature DCs (iDC) loaded with tumor antigen and matured (mDC) with a standard cytokine cocktail, are used for therapeutic vaccination in clinical trials of different cancers. However, the efficacy of DCs in the development of immunocompetence is critically influenced by the type (whole lysate, proteins, peptides, mRNA), the amount and the time of exposure of the tumor antigens used for loading in the presentation phase. The aim of the present study was to create instruments to acquire more information about DC antigen uptake and presentation mechanisms to improve the clinical efficacy of DCbased vaccine. In particular, two different tumor antigen were studied: the monoclonal immunoglobulin (IgG or IgA) produced in Myeloma Multiple, and the whole lysate obtained from melanoma tissues. These proteins were conjugated with fluorescent probe (FITC) to evaluate the kinetic of tumor antigen capturing process and its localization into DCs, by cytofluorimetric and fluorescence microscopy analysis, respectively. iDC pulsed with 100μg of IgG-FITC/106 cells were monitored from 2 to 22 hours after loading. By the cytofluorimetric analysis it was observed that the monoclonal antibody was completely captured after 2 hours from pulsing, and was decreased into mDC in 5 hours after maturation stimulus. To monitor the lysate uptake, iDC were pulsed with 80μg of tumor lysate/106 cells, then were monitored in the 2h to 22 hours interval time after loading. Then, to reveal difference between increasing lysate concentration, iDC were loaded with 20-40-80-100-200-400μg of tumor lysate/106 cells and monitored at 2-4-8-13h from pulsing. By the cytofluorimetric analysis, it was observed that, the 20-40-80-100μg uptake, after 8 hours loading was completed reaching a plateau phase. For 200 and 400μg the mean fluorescence of cells increased until 13h from pulsing. The lysate localization into iDC was evaluated with conventional and confocal fluorescence microscopy analysis. In the 2h to 8h time interval from loading an intensive and diffuse fluorescence was observed within the cytoplasmic compartment. Moreover, after 8h, the lysate fluorescence appeared to be organized in a restricted cloudy-shaded area with a typical polarized aspect. In addition, small fluorescent spots clearly appeared with an increment in the number and fluorescence intensity. The nature of these spot-like formations and cloudy area is now being investigated detecting the colocalization of the fluorescence lysate and specific markers for lysosomes, autophagosomes, endoplasmic reticulum and MHCII positive vesicles.

This research investigated someone of the main problems connected to the application of Tissue Engineering in the prosthetic field, in particular about the characterization of the scaffolding materials and biomimetic strategies adopted in order to promote the implant integration. The spectroscopic and thermal analysis techniques were usefully applied to characterize the chemico-physical properties of the materials such as – crystallinity; – relative composition in case of composite materials; – Structure and conformation of polymeric and peptidic chains; – mechanism and degradation rate; – Intramolecular and intermolecular interactions (hydrogen bonds, aliphatic interactions). This kind of information are of great importance in the comprehension of the interactions that scaffold undergoes when it is in contact with biological tissues; this information are fundamental to predict biodegradation mechanisms and to understand how chemico-physical properties change during the degradation process. In order to fully characterize biomaterials, this findings must be integrated by information relative to mechanical aspects and in vitro and in vivo behavior thanks to collaborations with biomedical engineers and biologists. This study was focussed on three different systems that correspond to three different strategies adopted in Tissue Engineering: biomimetic replica of fibrous 3-D structure of extracellular matrix (PCL-PLLA), incorporation of an apatitic phase similar to bone inorganic phase to promote biomineralization (PCL-HA), surface modification with synthetic oligopeptides that elicit the interaction with osteoblasts. The characterization of the PCL-PLLA composite underlined that the degradation started along PLLA fibres, which are more hydrophylic, and they serve as a guide for tissue regeneration. Moreover it was found that some cellular lines are more active in the colonization of the scaffold. In the PCL-HA composite, the weight ratio between the polymeric and the inorganic phase plays an essential role both in the degradation process and in the biomineralization of the material. The study of self-assembling peptides allowed to clarify the influence of primary structure on intermolecular and intermolecular interactions, that lead to the formation of the secondary structure and it was possible to find a new class of oligopeptides useful to functionalize materials surface. Among the analytical techniques used in this study, Raman vibrational spectroscopy played a major role, being non-destructive and non-invasive, two properties that make it suitable to degradation studies and to morphological characterization. Also micro-IR spectroscopy was useful in the comprehension of peptide structure on oxidized titanium: up to date this study was one of the first to employ this relatively new technique in the biomedical field.

This research investigated someone of the main problems connected to the application of Tissue Engineering in the prosthetic field, in particular about the characterization of the scaffolding materials and biomimetic strategies adopted in order to promote the implant integration. The spectroscopic and thermal analysis techniques were usefully applied to characterize the chemico-physical properties of the materials such as – crystallinity; – relative composition in case of composite materials; – Structure and conformation of polymeric and peptidic chains; – mechanism and degradation rate; – Intramolecular and intermolecular interactions (hydrogen bonds, aliphatic interactions). This kind of information are of great importance in the comprehension of the interactions that scaffold undergoes when it is in contact with biological tissues; this information are fundamental to predict biodegradation mechanisms and to understand how chemico-physical properties change during the degradation process. In order to fully characterize biomaterials, this findings must be integrated by information relative to mechanical aspects and in vitro and in vivo behavior thanks to collaborations with biomedical engineers and biologists. This study was focussed on three different systems that correspond to three different strategies adopted in Tissue Engineering: biomimetic replica of fibrous 3-D structure of extracellular matrix (PCL-PLLA), incorporation of an apatitic phase similar to bone inorganic phase to promote biomineralization (PCL-HA), surface modification with synthetic oligopeptides that elicit the interaction with osteoblasts. The characterization of the PCL-PLLA composite underlined that the degradation started along PLLA fibres, which are more hydrophylic, and they serve as a guide for tissue regeneration. Moreover it was found that some cellular lines are more active in the colonization of the scaffold. In the PCL-HA composite, the weight ratio between the polymeric and the inorganic phase plays an essential role both in the degradation process and in the biomineralization of the material. The study of self-assembling peptides allowed to clarify the influence of primary structure on intermolecular and intermolecular interactions, that lead to the formation of the secondary structure and it was possible to find a new class of oligopeptides useful to functionalize materials surface. Among the analytical techniques used in this study, Raman vibrational spectroscopy played a major role, being non-destructive and non-invasive, two properties that make it suitable to degradation studies and to morphological characterization. Also micro-IR spectroscopy was useful in the comprehension of peptide structure on oxidized titanium: up to date this study was one of the first to employ this relatively new technique in the biomedical field.

The Sulfate Permease SulP is a ubiquitous family of membrane transporters that uptake or exchange inorganic anions. In bacteria and plants, these transporters mediate the uptake of sulfate, a source of sulfur, a key element in bacterial and eukaryotic metabolism. Genes involved in sulfur metabolism have been found to be virulence determinants in mammalian pathogens. In Mycobacteria, for example, overexpression screening of several bacterial genes related to environmental stresses revealed inducible, stable accumulation of the high affinity sulfate-specific SulP transporter Rv1739c. In mammals, the SulP transporters are represented by the SLC26 family (Solute Linked Carrier). Mammalian anion transporters are versatile anion exchangers, with important roles in normal physiology and human pathophysiology. The clinical relevance of the Slc26 gene family has been highlighted with the identification of pathogenetic mutations in four genes involved in inherited human diseases (Slc26A2 - diastrophic dysplasia, Slc26A3 - congenital chloride diarrhoea, Slc26A4 - Pendred syndrome, Slc26A5 - non-syndromic deafness). The SulP proteins consist of a N-terminal hydrophobic core composed of a variable number of trans-membrane stretches and a C-terminal cytoplasmic portion that includes a STAS (Sulphate Transporter and Anti-Sigma factor antagonist) domain. The N-terminal domain is associated with anion transport, while the function of the STAS domain remains unknown; nevertheless, in plant SulP and mammalian SLC26 transporters, STAS is considered to play a fundamental role, essential for plasma membrane targeting and transport function. Sequence analysis revealed an unexpected similarity between the C-terminal cytoplasmatic part of SulP transporters and the bacterial antisigma-factor antagonists ASA, typified by Bacillus subtilis SPOIIAA (117 aa). SpoIIAA consists of a four-strands β-sheet surrounded by four α-helices. Unlike the bacterial ASA, the STAS domains of the anion transporters are poorly characterized in terms of both their function and structure. In the STAS domains, the β-scaffold and the loop between strand β3 and helix α2 are highly conserved, while a variable loop of different length is predicted between helix α1 and strand β3 and a variable extension is present at the C-terminal. These elements indicate that, probably, the 3D structure of the anion transporters STAS domains deviates unpredictably from that of the bacterial ASA. Thus, the structural characterization of the STAS domains of the SulP transporters family is important to understand their physiology and the role of mutations in the related pathologies. As far as the structural organization of these proteins is concerned, no three dimensional structures of domains or full-length sequences are available yet, either for mammalian SLC26 anion transporter or for other members of the SulP family. This is the main aim of this project. In fact, the limited dimensions of the protein make it investigable by solution NMR techniques. We focused our attention on three STAS domains, which were expressed in E. coli and studied by NMR: 1) Rv1739c STAS from Mycobacterium tuberculosis: we expressed a single 15N-labelled sample which allowed us to collect HSQC experiments of good quality; unfortunately, the protein revealed to be extremely temperature sensitive and denatured while testing different temperature conditions. However, the real trouble with this protein was the poor yield in its expression. Unfortunately, just before changing the expression strategy to improve the expression (from a common thrombin-removable His-tag to a removable SUMO fusion domain), NMR assignment of the same protein was published. 2) SULTR1;2 STAS from Arabidopsis thaliana: we expressed a single 15N-labelled sample which allowed us to collect HSQC experiments that revealed a self-aggregation compatible with the formation of homodimers. The protein showed to be very unstable and precipitated quantitatively within few hours after the beginning of the experiments. 3) Prestin STAS from Rattus norvegicus. Prestin (SLC26A5) is highly and almost exclusively expressed in the outer hair cells (OHCs) of the organ of Corti in the inner ears of mammals; unlike the other members of the SLC26 family, it has the unique property of voltage-dependent conformational changes and it is considered the key player in the OHCs electromotility. In response to changes in the trans-membrane voltage, the motor protein is thought to undergo a structural rearrangement that changes its area in the plasma membrane with the consequence that the cell changes its length by up to 5%. Mutations of Prestin have been shown to cause severe hearing deficit. We were able to produce the recombinant 15N-labeled and 15N-13C-labeled STAS domain of Prestin, stable at millimolar concentration (1.2 mM) in the form of a wellfolded monomer. We collected the following 13C,15N heteronuclear NMR experiments: HNCO, HNCA, HN(CA)CO, CBCA(CO)NH, HNCACB, H(CA)NH, HBHA(CBCACO)NH, H(CCCO)NH, (H)CC(CO)NH, HCCH-TOCSY, CBHD, aromatic-13C-HSQC, (H)C(NC)H-His, (HB)CB(CGCC)H-TOCSY (for Tyr and Phe), 13C-NOESY (aromatic and aliphatic), 15N-NOESY. Besides, a C-detected HCACO experiment was collected. All these experiments required about 45 days. The assignment of the backbone and the side chains is now complete for about 90% of the residues. Unfortunately this protein has some problems of conformational exchange that quenches the HN backbone signals of two stretches of residues (35-55 and 73-80). Nevertheless, it was possible to obtain some interesting structural information.
Le Permeasi del Solfato (SulP) rappresentano una famiglia di trasportatori di membrana che assorbono o scambiano anioni inorganici. Nei batteri e nelle piante, questi trasportatori mediano l’assorbimento del solfato, una fondamentale fonte di zolfo, essenziale per il metabolismo di Procarioti ed Eucarioti. È stato dimostrato che alcuni geni coinvolti nel metabolismo dello zolfo costituiscono dei fattori di virulenza in alcuni patogeni di mammifero. Nei Micobatteri, ad esempio, l’analisi dell’espressione genica in risposta a stress ambientali ha dimostrato un accumulo inducibile e stabile della proteina Rv1739c, un trasportatore ad alta affinità e specifico per il solfato appartenente alla famiglia SulP. Nei mammiferi, i trasportatori SulP sono rappresentati dalla famiglia SLC26 (Solute Linked Carrier). I trasportatori di mammifero sono degli scambiatori anionici molto versatili, essenziali per normale fisiologia e coinvolti nella fisiopatologia umana. La rilevanza clinica della famiglia Slc26 è stata evidenziata con l’identificazione di mutazione patogeniche in quattro geni coinvolti in patologie ereditarie (Slc26A2 - displasia diastrofica, Slc26A3 - diarrea congenita con perdita di cloruro, Slc26A4 - sindrome di Pendred, Slc26A5 - sordità non sindromica). Le proteine SulP sono costituite da una regione idrofobica N-terminale composta da un numero variabile di segmenti trans-membrana e da una porzione C-terminale citoplasmatica che include un dominio STAS (Sulphate Transporter and Anti-Sigma factor antagonist). Il dominio N-terminale è associato al trasporto anionico, mentre la funzione del dominio STAS rimane sconosciuta; ciononostante, nei trasportatori SulP vegetali e SLC26 di mammifero, lo STAS è considerato fondamentale per il corretto indirizzamento verso la membrana plasmatica e per la funzione di trasporto. L'analisi di sequenza ha dimostrato un’inattesa similarità tra la regione citoplasmatica C-terminale dei trasportatori SulP e le proteine batteriche ASA (AntiSigma-factor Antagonist), caratterizzate grazie alla determinazione strutturale di SPOIIAA (117 aa) di Bacillus subtilis. SpoIIAA presenta un foglietto β costituito da quattro filamenti, circondato da quattro α-eliche. A differenza degli ASA batterici, i domini STAS dei trasportatori anionici sono scarsamente caratterizzati per quanto riguarda sia la loro funzione, sia la loro struttura. Nei domini STAS, il foglietto β e il loop compreso tra il filamento β3 e l’elica α2 sono molto conservati, mentre, a livello del loop compreso tra l’elica α1 e il filamento β3 e in posizione C-terminale, sono previste delle estensioni variabili di differente lunghezza. Queste osservazioni indicano che, probabilmente, la struttura tridimensionale dei domini STAS dei trasportatori anionici devia in modo imprevedibile da quella degli ASA batterici. Pertanto, la caratterizzazione strutturale degli STAS della famiglia SulP è fondamentale per comprenderne la fisiologia e il ruolo che le mutazioni hanno nell’insorgere delle patologie. Attualmente non è disponibile alcuna struttura tridimensionale sperimentale né dei trasportatori SulP, né dei loro domini. La determinazione strutturale dei domini STAS è il principale scopo di questo progetto. In effetti, le dimensioni limitate di queste proteine le rendono studiabili mediante tecniche di NMR in soluzione. I domini STAS delle proteine presentate qui di seguito sono stati espressi in E. coli e studiati mediante NMR: 1) STAS di Rv1739c da Mycobacterium tuberculosis: abbiamo espresso un campione marcato con l’isotopo 15N, che ci ha consentito di raccogliere esperimenti HSQC di ottima qualità; la proteina tuttavia si è dimostrata estremamente sensibile alla temperatura e si è denaturata mentre venivano testate diverse condizioni. Il principale problema con questa proteina è comunque stata la bassa resa ottenuta dalla sua espressione. Sfortunatamente, poco prima di cambiare strategia di clonaggio (passando da una comune His-tag rimuovibile con trombina ad un dominio di fusione SUMO rimuovibile), l’assegnazione NMR della stessa proteina è stata pubblicata. 2) STAS di SULTR1;2 da Arabidopsis thaliana: abbiamo espresso un campione marcato con l’isotopo 15N, che ci ha consentito di raccogliere esperimenti HSQC che hanno dimostrato un livello di aggregazione compatibile con la formazione di omodimeri. La proteina si è dimostrata molto instabile ed è precipitata in modo massivo entro poche ore dall’inizio degli esperimenti. 3) STAS di Prestina da Rattus norvegicus. La Prestina (SLC26A5) è espressa in grandi quantità e in modo quasi esclusivo nelle cellule cigliate esterne OHC (Outer Hair Cell) dell’organo del Corti, nell’orecchio interno dei mammiferi; a differenza degli altri membri della famiglia SLC26, ha la proprietà unica di subire modificazioni conformazionali voltaggio-dipendenti, ed è considerata fondamentale nell’elettromotilità delle cellule OHC. In risposta a variazioni del voltaggio trans-membrana, agisce come un motore molecolare, subendo riarrangiamenti strutturali che ne alterano la sezione nella membrana plasmatica, modificando di conseguenza la lunghezza cellulare di anche il 5%. Mutazioni della Prestina sono state individuate come la causa di gravi deficit uditivi. Abbiamo prodotto un campione di STAS marcato con 15N e un campione doppiamente marcato con 15N e 13C; questo dominio si è dimostrato stabile alle concentrazioni millimolari (1.2 mM), nella forma di un monomero ben strutturato. Abbiamo raccolto i seguenti esperimenti NMR 13C,15N-eteronucleari: HNCO, HNCA, HN(CA)CO, CBCA(CO)NH, HNCACB, H(CA)NH, HBHA(CBCACO)NH, H(CCCO)NH, (H)CC(CO)NH, HCCH-TOCSY, CBHD, 13C-HSQC per gruppi aromatici, (H)C(NC)H-His, (HB)CB(CGCC)H-TOCSY (per Tyr e Phe), 13C-NOESY (per gruppi aromatici and alifatici), 15N-NOESY, oltre ad un C-detected HCACO. Tutti questi esperimenti hanno richiesto un tempo macchina di oltre 45 giorni. L’assegnazione della catena principale e delle catene laterali è completa per circa il 90% dei residui. Purtroppo questa proteina presenta alcuni problemi di scambio conformazionale che ne sopprimono i segnali dei gruppi HN in catena principale di due sequenze (35-55 and 73- 80). È stato tuttavia possibile fare alcune interessanti considerazioni di tipo strutturale.

My Ph.D. project was focused on the characterization of a prokaryotic potassium channel, called SynK, that was identified in the genome of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC6803, a photoheterotrophic organism. SynK was cloned, expressed, and assigned as a potassium selective channel. In order to study its physiological role, I produced a SynK-deficient Synechocystis strain, which is unable to grow under normal illumination conditions. Growth may be restored if an electron donor is added or if high-intensity illumination is applied. Western blotting experiments, performed with antibodies raised against SynK, revealed that expression of the channel protein is correlated with growth and seems to be regulated by redox-state. The location of SynK in thylakoid membranes was shown by immunogold electron microscopy. Fluorimetric experiments indicated that SynK-deficient cyanobacteria are unable to build up a proton gradient across the thylakoid membrane upon illumination. These data indicate the crucial role played by SynK in regulating photosynthesis in these organisms. I also worked on purification and molecular characterization of a higher plants thylakoid potassium channel that was identified by immunoblot using antibodies raised against the prokaryotic channel.

Le Glutatione Transferasi sono una famiglia di enzimi ubiquitari, ampiamente distribuiti nell’organismo umano e costituiscono parte importante di un meccanismo cellulare integrato di risposta allo stress chimico e ossidativo, che coinvolge diversi sistemi di detossificazione interdipendenti tra loro. Più precisamente, tali enzimi agiscono nella cosiddetta fase II dopo l’intervento del sistema del citocromo P-450, il principale responsabile delle reazioni della fase I, tra le quali la più importante sembra essere quella di ossigenazione (Guengerich, 1990). In questo modo la fase I produce un metabolita più solubile in acqua e meno tossico che può essere escreto direttamente, ma che spesso viene utilizzato come substrato per le reazioni della fase II. Queste ultime prevedono la coniugazione del metabolita attivato ad un composto endogeno polare come il glutatione (GSH), l’acido glucuronico o la glicina. Nella maggioranza delle specie la reazione che avviene più frequentemente nella fase II è rappresentata dalla coniugazione con il GSH, catalizzata dalle GST (Sheehan et al., 2001). In ogni caso, le GST realizzano la loro funzione di protezione catalizzando l’attacco nucleofilo del GSH ridotto, sotto forma di anione tiolato (GS-), al centro elettrofilo di un’ampia varietà di composti non polari, endogeni e xenobiotici (Armstrong, 1991). A partire dagli anni ‘80 sono stati identificati numerosi polimorfismi a carico delle GST (Hayes et al. 2000) che contribuiscono a definire le differenze interindividuali in risposta a numerosi composti xenobiotici, compresi farmaci e chemioterapici. Sebbene ormai siano stai identificati polimorfismi per tutte le GST citosoliche, ai fini dei nostri studi, risultano di particolare interesse quelli riguardanti la GSTP1, GSTM1 e GSTT1. Nel caso delle GSTM1, sono stati individuati sia casi di duplicazione che di deplezione genica (Widersten M. et al. 1991; Xu S. et al. 1998); queste variazioni sembrano essere responsabili di una differenza di attività nei confronti dei perossidi. Per la GSTP1 sono state identificate quattro varianti alleliche che differiscono a livello degli aminoacidi 104 e 113 (Ali Osman F. et al. 1997; Harries L.W. et al 1997; Watson MA et al. 1998). In fine, per quanto riguarda il gene GSTT1 della classe Theta, esso risulta deleto nel 10%-20% degli individui (Pemble S. et al. 1994; Rebbeck T. M., 1997; Strange R. C., Fryer A., 1999); negli individui Theta nulli, la perdita del gene comporta una ridotta capacità dell’enzima a coniugare il GSH con alcuni substrati quali il Dibromoetano (DBE), il Diclorometano (DCM), l’etilene ossido (EO) e il metil bromuro (MB) (Sherhatt P. J. et al. 1997; Guengerich F. P. et al. 1995). Il clorambucile è un agente alchilante a base di azoto usato nel trattamento primario della leucemia linfocitica cronica, la più comune leucemia nei paesi occidentali (Foon et al., 1990). Esso sembra svolgere la sua funzione citotossica mediante formazione di legami interstrand di DNA che possono portare la cellula a morte per apoptosi. Uno studio ha riportato che le varianti alleliche della GSTP1-1 possono differire significativamente con l’enzima wt nella capacità di formare il prodotto di coniugazione GSH-CHL, indicando questi polimorfismi come potenziali responsabili dello sviluppo della farmaco resistenza (Pandya et al., 2000). Il benzene è un composto ubiquitariamente presente nell’ambiente, in particolare come prodotto del petrolio (Snyder et al., 1993) e del fumo di sigarette (Best et al., 2001). L’esposizione al benzene, che risulta particolarmente frequente per alcune categorie di lavoratori, è stata associata con numerosi effetti dannosi per la salute, mediati da intermedi genotossici e citotossici che inducono danni al DNA (Erexson et al., 1985; Yager et al., 1990; Zhang et al., 1993; Kim et al., 2004) tanto che il benzene è stato riconosciuto come agente carcinogeno di primo livello (WHO, 1993). L’esposizione al benzene si verifica generalmente per inalazione e la misura di benzene nell’urina o nel sangue è utilizzata come marker di una recente esposizione (Weisel et al., 1996; Ashley et al., 1994). Alcuni studi indicano che sia la Glutatione trasferasi T1 (GSTT1) che la Glutatione trasferasi M1 (GSTM1) sono implicate nella detossificazione del benzene ossido (Snyder et al., 1993; Ross, 1996). L’assenza del gene di queste proteine comporta la perdita dell’attività enzimatica (Alves et al., 2002; Seidegard et al., 1988;Sprenger et al., 2000). La GST P1-1 è, tra i membri della famiglia delle GST, la più espressa nelle linee cellulari tumorali (Doroshow et al., 1995). In modo particolare, tali linee cellulari contengono livelli aumentati di GSTP1-1 rispetto al tessuto sano (Eaton et al., 1999; . Tsuchida et al., 1992; Peters et al., 1989), e la sua espressione è, generalmente, inversamente proporzionale alla prognosi e alla risposta ad agenti chemioterapici (Nishimura et al., 1998). Tuttavia, al contrario di quanto accade nella maggior parte dei tumori umani, nel tumore della prostata la GSTP1-1 sembra essere assente (Lee et al., 1994; Moskaluk et al., 1997; Murray et al., 1995; Sullivan et al., 1998), mentre risulta presente nelle cellule epiteliali basali del tessuto sano le quali vengono perse durante lo sviluppo del tumore invasivo (Lee et al., 1994; Moskaluk et al., 1997). L’assenza di espressione della GSTP1-1 nel tessuto tumorale risulta associata ad una ipermetilazione del promotore della proteina stessa (Lee et al., 1994; Brooks et al., 1998; Millar et al., 1999). Oltre alle GST ben caratterizzate dei mammiferi, sono state studiate anche GST provenienti da altri organismi sia eucaroitici che procariotici (Sheehan et al., 2001), tra cui i cianobatteri o alghe blu-verdi, considerati progenitori dei cloroplasti vegetali. (Bryant, DA et al., 1986). Il cianobatterio Synechocystis sp. PCC 6803 è diventato un sistema modello per numerosi studi molecolari e biochimici, compresi studi sulla fotosintesi (Gombos et al., 1992), risposta allo stress (Hagemann M. et al.,1990) analisi riguardanti l’heat shock (Suzuki I.,et al., 2001). Il sequenziamento del suo intero genoma ha permesso di assegnare, sulla base delle omologie di sequenza, putativi ruoli funzionali alle diverse proteina codificate, tuttavia molte di queste proteine devono ancora essere caratterizzate da un punto di vista biochimico e fisiologico. In particolare sono state individuate tre putative glutatione trasferasi (sll0067, sll1147 e sll1545). SCOPO DEL LAVORO La prima parte del mio progetto di dottorato si propone di analizzare da un punto di vista cinetico la funzionalità delle varianti alleliche della GST P1-1 e di valutarne l’attività in risposta al trattamento con chemioterapico clorambucile. Per raggiungere questo obiettivo, i mutanti I104V, A113V e I104V/A113V sono stati clonati, espressi in cellule di E.coli TOP10 e purificati mediante cromatografia per affinità al glutatione. Le proteine ottenute dalla purificazione sono state utilizzate sia per la caratterizzazione biochimica in presenza di diversi cosubstrati (CDNB, EA, NBD-Cl), sia per effettuare prove di termostabilità a diverse temperature (10°C-55°C), sia per valutare l’effetto inibitore del clorambucile. Inoltre, è stato possibile determinare, mediante cristallografia a raggi X, l’interazione del clorambucile con il sito attivo di queste varianti alleliche in modo da valutare l’eventuale variazione di legame tra l’enzima wt e i suoi mutanti. Un secondo punto preso in considerazione nel corso del mio progetto di dottorato è stato quello relativo allo studio dei polimorfismi, non solo della GSTP1-1, ma anche delle GSTT1-1 e della GSTM1-1, specialmente nelle loro forme polimorfiche più diffuse (date dalla delezione dei geni GSTM1 e GSTT1). In modo particolare la nostra attenzione si è focalizzata sul ruolo che tali polimorfismi potrebbero avere in soggetti occupazionalmente esposti al benzene. A tale scopo sono stati condotti studi di genotipizzazione per i geni GSTT1, GSTM1 e GSTP1 (anche se l’analisi di quest’ultimo non è stata ancora terminata), condotti su DNA estratto da campioni di sangue intero, accompagnati da studi di carattere fenotipico volti a saggiare l’attività specifica degli enzimi GSTP1-1 e GSTT1-1 presenti nei campioni, utilizzando i substrati specifici per questi enzimi (rispettivamente, CDNB e EPNP). Anche in questo caso le analisi sono ancora in fase di svolgimento. La terza parte del mio dottorato è stata basata sullo studio della GSTP1-1 in linee cellulari tumorali immortalizzate di prostata a diverso grado patologico. In questo contesto i nostri studi sono consistiti nella coltura di linee cellulari immortalizzate della prostata e nella valutazione dell’alterazione di espressione della GSTP1-1 sia mediante tecnica del Western Blotting, sia mediante saggio dell’attività enzimatica. In fine, una parte importante del mio dottorato è stata impiegata nella caratterizzazione biochimica di una delle tre GST sequenziate a partire dal genoma del cianobatterio Synechocystis PCC 6803. Gli esperimenti di caratterizzazione biochimica sono stati basati sull’individuazione della corretta modalità di purificazione di questo enzima; sull’analisi delle sue proprietà cinetiche in base sia allo studio dell’attività enzimatica, in presenza di diversi cosubstrati, (CDNB, EA, EPNP, NBD-Cl e Cu-OOH), che allo studio della dipendenza dell’attività enzimatica alla concentrazione di GSH utilizzata. Sono stati condotti, inoltre, studi sulla stabilità termica dell’enzima a diverse temperature (10°C-55°C). In fine, queste analisi di tipo biochimico sono state accompagnate da studi di modeling e analisi della sequenza primaria di tale proteina mirati a definirne la struttura tridimensionale e le origini filogenetiche. In conclusione, si è cercato di capire se tale proteina fosse indotta in seguito a stress dato dall’esposizione delle cellule di Synechocystis alla luce UV. RISULTATI E DISCUSSIONE La purificazione ha dato risultati simili per tutti gli enzimi (GSTP1-1 wt, I104V, A113V e I104V/A113V), data la loro simile affinità per il GSH. Infatti, gli studi cinetici condotti sulla GSTP1-1 wt e sui suoi mutanti hanno permesso di stabilire che il sito di legame per il GSH (sito G) non è influenzato dalla presenza delle mutazioni. Saggiando l’attività specifica dei mutanti della GSTP1-1 (I104V, A113V I104V/A113V) in presenza di tre differenti co-substrati (CDNB, EA, NBD-Cl) non sono state trovate differenze rilevanti, fatta eccezione per il mutante I104V (*B) che ha mostrato una significativa riduzione dell’attività nei confronti del CDNB. Inoltre, è stato possibile osservare un aumento dei valori di KmCDNB, ad indicare che la mutazione (da Ile a Val) può influenzare il legame del CDNB probabilmente a causa della differente idrofobicità o della differente grandezza tra i due residui. Nel caso dell’EA, la Tyr108 svolge un ruolo importante nella reazione di addizione di Micheal poiché stabilizza lo stato di transizione grazie al suo gruppo idrossile; per questo mutazioni a carico di residui localizzati vicino alla Tyr108 possono alterare la catalisi. In accordo con quanto detto sopra, è possibile osservare nel mutante I104V un decremento di circa 2 volte nei valori di kcat. In fine, usando l’NBD-Cl come cosubstrato, il principale cambiamento osservato nel mutante I104V è rappresentato dalla forte riduzione del valore di kcat e di efficienza catalitica (da 250±12 s−1 mM a 37±5 s−1 mM). E’ stato riportato che nella reazione che si verifica usando l’NDB-Cl come cosubstrato, lo step limitante, di natura fisica, è dato dai lenti movimenti dell’elica 4 su cui sono localizzati sia il residuo Tyr108 che Ile104 (Caccuri et al., 1996). Tale rigidità è data dalla possibile presenza di un legame idrogeno tra il gruppo idrossile della Tyr108 e l’atomo di ossigeno dell’NBD-Cl; infatti, la perdita di tale legame nel mutante Y108F comporta un aumento di circa 8 volte del valore di kcat (Lo Bello et al., 1997). La stabilità termica della GSTP1-1 wt e delle sue varianti all’eliche (I104V, A113V e I104V/A113V) è stata saggiata incubando i vari enzimi a differenti temperature (10-55°C) per 15 minuti. I nostri studi non indicano alcuna riduzione dell’attività enzimatica, anche protraendo l’esperimento fino alle 24h il risultato, per tutte le varianti alleliche. Solamente dopo una breve incubazione a 50°C abbiamo osservato una minore termostabilità del mutante 104 rispetto all’enzima wt, in accordo con esperimenti precedentemente condotti (Johansson et al., 1998). Per quanto riguarda l’interazione tra il CHL e la GSTP1-1 wt e i suoi mutanti, nel corso del lavoro da noi condotto sono stati effettuati studi cristallografici (Parker M, dell’università di Melbourne) che ci hanno permesso di osservare come questo agente chemioterapico si vada a collocare nel sito-H dell’enzima, secondo le stesse modalità in tutti i mutanti e nell’enzima wt. L’analisi del genotipo della GST M1-1 e T1-1, condotta su un campione di 183 individui di cui 157 occupazionalmente esposti al benzene e 24 controlli, ha dimostrato che il gene polimorfico GST M1 è assente nel 45 % circa degli individui, mentre il gene polimorfico GST T1 è assente nel 10% circa degli stessi individui Il nostro progetto prevede, oltre alla genotipizzazione della GSTT1 e GSTM1 descritta precedentemente, anche l’analisi dei polimorfismi della GSTP1-1 negli stessi soggetti oltre ad un’analisi di tipo fenotipico. La prima verrà eseguita sfruttando le tecnica della PCR e del sequenziamento genico. La seconda mediante saggio di attività enzimatica direttamente su lisato di eritrociti, dopo centrifugazione per rimuovere la membrana sia in presenza di CDNB (substrato della GST P1-1) che di EPNP (substrato preferenziale della GST T1-1). Le analisi condotte sulla GST short ci permettono di ottenere una prima caratterizzazione di questo enzima. In primo luogo è stato possibile osservare una buona similarità di sequenza con le GSTI e GSTIII di Zea mays particolarmente a carico dei residui presenti nel sito G. Inoltre, dalle analisi condotte sull’attività specifica dell’enzima in presenza di differenti cosubstrati (CDNB, EA, EPNP, Cu-OOH e NBD-Cl) è stato possibile osservare una buona attività perossidasica dell’enzima. Dagli studi di stabilità termica risulta che la GST short è molto più termolabile della GSTP1-1 umana, infatti la sua attività si riduce già a partire dai 40°C e diventa più bassa dell’88% a 50°C. Anche in questo caso la bassa stabilità dell’enzima a partire da temperature inferiori rispetto a quelle mostrate dalla GSTP1-1 umana potrebbe essere attribuita alla sua diversa struttura. In fine, per quanto riguarda l’analisi dei livelli di GSTP1-1 in linee cellulari prostatiche mediante tecnica di Western Blotting, la presenza della banda corrispondente alla GSTP1-1 risulta essere particolarmente evidente nelle cellule iperplastiche benigne (BPH) che rappresentano il nostro controllo positivo. Si tratta, infatti, di cellule che presentano un certo grado di iperplasia ma che non sono tumorali; per questo motivo risulta evidente la presenza dell’enzima GSTP1-1 il cui promotore non è metilato. Nelle linee cellulari tumorali del gruppo G2, associato ad una prognosi positiva per il paziente, la banda di espressione della GSTP1-1 risulta presente ma con un’intensità minore rispetto a quella presente nelle linee cellulari iperplastiche benigne. Inoltre, in base agli studi da noi condotti, ad un maggiore livello di aggressività del tumore (linee cellulari del gruppo G1, associate ad una peggiore prognosi per il paziente) corrisponde una sempre minore espressione della banda relativa alla GSTP1-1 che, infatti, risulta del tutto assente nelle linee cellulari tumorali metastatiche, LNCaP (controllo negativo). Ulteriori analisi di western blotting condotte andando ad analizzare la presenza delle GSTT1-1, GSTM2-2 e GSTA1-1, ci hanno permesso di escludere che la scomparsa della GSTP1-1 fosse in qualche modo compensata dalla comparsa di GST appartenenti ad altre classi. In fine, i valori di Attività Specifica, calcolati usando GSH1 mM e CDNB 1mM, risultano progressivamente più bassi passando dalle linee cellulari iperplastiche benigne (HBP) fino a diventare nulli nelle linee cellulari tumorali metastatiche, LNCaP ad ulteriore conferma di quanto osservato mediante Western Blotting.
Glutathione S-transferases (GSTS) are considered part of a coordinated defence strategy, together with other GSH-dependent enzymes, the cytochrome P450s (Phase I enzymes) and some membrane transporters (Phase III) such as MRP1 and MRP2, to remove from the cell the products of oxidative stress generated after interaction of reactive oxygen species, that escape the first line of defense, with cellular macromolecules such as DNA, lipids and proteins. Glutathione S-transferases (EC 2.5.1.18) catalyze the conjugation of glutathione (GSH) with a variety of toxic compounds (carcinogens, anticancer drugs, reactive oxygen species and products of cellular metabolism) that contain an electrophilic atom, i.e. carbon, nitrogen or sulphur. In mammals, there are three major families of proteins that exhibit glutathione transferase activity: two of these, the cytosolic and mitochondrial GSTs, comprise soluble enzymes, while the third family are microsomal (MAPEG) and are referred to as membrane-associated proteins in eicosanoid and glutathione metabolism (Hayes et al., 2005). The human cytosolic GSTs are dimeric proteins; each subunit contains a very similar binding site for GSH (G-site) and a second one for the hydrophobic co-substrate (H-site). Structural differences at the H-site confer a certain degree of substrate selectivity. The human cytosolic GSTs can be grouped into at least seven gene-independent classes on the basis of their amino acid sequence and immunological properties: Alpha, Mu, Pi, Sigma, Theta, Omega, and Zeta Cytosolic GSTs display polymorphisms in humans, and this is likely to contribute to interindividual differences in responses to xenobiotics . A lot of studies suggest that that combinations of polymorphisms in Mu, Pi, and Theta class GST contribute to diseases development. In the first part of this work we analyzed three common polymorphisms in the GSTP1, GSTT1, and GSTM1 genes either decrease or abolish GST enzyme activity: the GSTP1 allelic variants, that differ at either a single codon position (Ile104 (HGSTP1*A), Val104 (HGSTP1*B), Val113 HGSTP1*D) or at two different positions (Val104/Val113 (HGSTP1*C)), and the homozygous deletions of the GSTT1 or GSTM1 gene that lead to an absence of enzymatic activity. The commonly used anti-cancer drug chlorambucil is the primary treatment for patients with chronic lymphocytic leukaemia. Chlorambucil has been shown to be detoxified by human glutathione transferase Pi (GST P1-1), an enzyme that is often found over-expressed in cancer tissues. The allelic variants of GST P1-1 are associated with differing susceptibilities to leukaemia and differ markedly in their efficiency in catalysing glutathione (GSH) conjugation reactions. Here, we perform detailed kinetic studies of the allelic variants with the aid of three representative co-substrates. We show that the differing catalytic properties of the variants are highly substrate-dependent. We show also that all variants exhibit the same temperature stability in the range 10 °C to 55 °C. We have determined the crystal structures of GST P1-1 in complex with chlorambucil and its GSH conjugate for two of these allelic variants that have different residues at positions 104 and 113. Chlorambucil is found to bind in a non-productive mode to the substrate-binding site (H-site) in the absence of GSH. This result suggests that under certain stress conditions where GSH levels are low, GST P1-1 can inactivate the drug by sequestering it from the surrounding medium. However, in the presence of GSH, chlorambucil binds in the H-site in a productive mode and undergoes a conjugation reaction with GSH present in the crystal. The crystal structure of the GSH–chlorambucil complex bound to the *C variant is identical with the *A variant ruling out the hypothesis that primary structure differences between the variants cause structural changes at the active site. Finally, we show that chlorambucil is a very poor inhibitor of the enzyme in contrast to ethacrynic acid, which binds to the enzyme in a similar fashion but can act as both substrate and inhibitor. In another part of this work we determined in the peripheral blood lymphocytes of 157 workers exposed to benzene, using 25 individuals not exposed as external controls, the presence of polymorphic genes GSTT1 and GSTM1 and the distribution of GSTP1 allelic variants. We have also evaluated the glutathione transferases (GST) activities and the levels of glutathionylated hemoglobin in the RBC of the same samples. Because this study is in progress again, we can’t estabilish the finals conclusions. During my Phd project I have also analyzed the presence of GSTP1-1 enzyme in prostatic cancer cells lines. In contrast to frequent overexpression of GST-pi observed in many types of cancer, the vast majority of primary human prostate tumors contain no detectable GST pi. So, this enzyme is abundant in normal prostate basal epithelial cells, but basal cells are lost during development of invasive cancer. Absence of GST pi expression in human prostate cancer is accompanied by hypermethylation of regulatory sequences within the GST pi gene, whereas no such hypermethylation is present in normal tissues or benign prostatic hyperplasia (HPB). So we employed Western blot analysis and specific activity assays to measure GST pi expression in diferrents prostatic cancer cells lines selected on the basis of their tumor staging. We have analyzed HBP lines (positive controls), G1 cells lines (associated with a negative prognosis), G2 cells lines (associated with good prognosis) and LNCaP (negative controls). At the and of this study we observed that the most relevant expression of GST pi was detectable in HPB cells, but also in G2 and G1 cells is possible to note a very low presence of this enzyme. The last part of my project comprehend the purification and the enzymatic caratherization of a new GST, called GST short, sequenzed by the cyanobacteria Synechocystis sp PCC 6803 genome. Cyanobacteria represent a group of widely distributed prokaryotes performing oxygenic photosynthesis similar to plants. This, together with their generally accepted role as progenitors of plant plastids, and their ease of genetic manipulation, has made them extremely useful in studies of environmental gene regulations and the mechanism of oxygenic photosynthesis. In according to its phylogenetic origin, GST short presents a very similar G-site sequence with the sequence previously described for GSTI and GSTIII of Zea mays. It is also active towards several classical substrates, but at the same moderate rates that have been observed for other glutathione transferases derived from prokaryotes. Particulary, it was possible observe a strong perossidase activity. We have also analyzed the GST short thermal stability respect to hGSTP1-1 (10°-55°C) and the results indicate that the cyanobacterial enzyme is less resistant at this temperatures than human enzyme probably because its different structure. The cloning, expression and characterization of this cyanobacterial glutathione transferase is also described . The possible significance of the observed catalytic properties is discussed in the context of structural organization and glutathione transferase evolution.

Il lavoro svolto durante il Dottorato di ricerca riguarda l’applicazione di tecniche di microscopia elettronica e diffrazione di raggi X a materiali nanostrutturati. La ricerca è stata articolata su tre macroaree tematiche: materiali per l’immagazzinamento dell’idrogeno allo stato solido (film sottili e compositi), materiali per uso biomedico (biomateriali e detector) e leghe metalliche leggere. Per la prima area, film sottili di Mg puro e Mg drogato con Nb e campioni compositi di particelle di Pd e silicone, sono stati sottoposti a cicli di assorbimento/desorbimento di H2. La caratterizzazione ha mostrato che il Nb nei film sottili forma dei clusters, creando percorsi percolativi che velocizzano la reazione con H2. I compositi hanno mostrato, invece, un comportamento peculiare rispetto all’idrogeno e una propria identità scientifica, aprendo nuove prospettive applicative. Nel campo dei biomateriali è stata caratterizzata la lega Co-Cr-Mo prodotta tramite Direct Metal Laser Sintering (DMLS), al fine di ottimizzare i parametri produttivi e far luce sui fenomeni che hanno luogo nella microstruttura durante la produzione. I risultati hanno indicato che il laser induce una trasformazione martensitica atermica dalla fase da γ (fcc) alla fase ε (hcp) nella polvere metallica, producendo un intricato network di lamelle ε nella fase γ. E’ la prima volta in assoluto che viene osservato un fenomeno di questo genere in simili condizioni. Nel campo dei detector per applicazioni mediche è stata caratterizzata una serie di cristalli scintillatori LYSO (detector per la PET). Questo lavoro ha permesso di chiarire la microstruttura e legare la produzione di luce alle caratteristiche strutturali di tali cristalli. Nel campo delle leghe metalliche leggere per impieghi aereonautici, è stata affrontata la caratterizzazione strutturale della lega AZ31B saldata per Friction Stir Welding (FSW) e della lega di allumino 2219, sottoposta ad Equal Channel Angular Pressing (ECAP).
This Ph.D. Thesis is about the application of electron microscopy and X-ray diffraction to several classes of materials. Three different macro areas have been addressed to: materials for solid state hydrogen storage (thin films and composites), materials for biomedical use (biomaterials and detectors) and light metal alloys. In the first thematic area, thin films of pure Mg and Mg doped with 5at.% Nb and composite samples of particles of Pd and silicon, have all been subjected to cycles of absorption/desorption of hydrogen. The characterization showed that Nb in thin films forms clusters, creating percolative paths that speed up the reaction with H2. The composites showed a behavior with hydrogen which makes them materials having their own scientific identity, opening new application perspectives . In the field of biomaterials a Co-Cr-Mo alloy produced via Direct Metal Laser Sintering (DMLS) has been characterized, in order to optimize the production parameters and clarify the phenomena occurring in the microstructure during production. The results showed that the laser induces, in the powder, a martensitic athermal transformation from the γ (fcc) phase to the ε phase (hcp), producing an intricate network of ε lamellae in the γ phase. This is the first time ever that this phenomenon was observed in similar conditions. In the field of detectors for medical applications a series of LYSO crystal scintillators (detectors for PET) has been characterized. This work allowed to clarify the microstructure and to correlate the light yield properties to the microstructure of the crystals. In the field of light metal alloys for aeronautical applications, the research was focused on the structural characterization of the AZ31B alloy welded with Friction Stir Welding (FSW) and on the aluminum alloy 2219 subjected to Equal Channel Angular Pressing (ECAP).

Thesis reports on two metallo-proteins nucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase purified from Euphorbia characias latex (ELNPP) and from prickly pear (Opuntia ficus indica) fruits (ONPP). ELNPP has a molecular mass of 80 kDa and is formed by two apparently identical subunits, each containing 1 Ca²⁺ and 1 Mg²⁺ ion. ONPP is a homodimeric protein displaying a molecular mass of 105 kDa. In this enzyme also is present 1 Ca²⁺ and 1 Mg²⁺ ion in each subunit. Both ELNPP and ONPP are glycosylated proteins, with an optimum pH of 10.0, are stable at high temperatures and are inhibited by AMP and by EDTA. At the moment we are not able to suggest the exact physiological role of ELNPP and ONPP, however, the high catalytic efficiency of hydrolysis of NAD (P) (H), compared to very low activity of other natural substrates tested, suggesting that these enzymes may modulate the activity of dehydrogenase. In addition, it is observed an increase in the enzymatic activity of ONPP from June to August correlated with the possible modulation of the activity of dehydrogenase, leading us to hypothesize that the ONPP may be one of the factors that influence the ripening of fruits. ------------------------------------------------------------ La tesi di dottorato riporta la purificazione e caratterizzazione di nucleotide pirofosfatasi/fosfodiesterasi dal lattice di Euphorbia characias (ELNPP) e dai frutti di Opuntia ficus indica (ONPP). La ELNPP è una metallo proteina con una massa molecolare di 80 kDa, formata da due identiche subunità ognuna contenente uno ione Ca²⁺ e uno ione Mg²⁺. La ONPP è una proteina omodimerica che mostra una massa molecolare di 105 kDa. Anche in questo enzima in ogni subunità è presente uno ione Ca²⁺ e uno ione Mg²⁺. Sia la ELNPP che la ONPP sono proteine glicosilate, hanno un optimum di pH a 10.0, sono stabili ad alte temperature e sono inibite dall’EDTA e dall’AMP. Attualmente non siamo in grado di suggerire l’esatto ruolo fisiologico della ELNPP e della ONPP, tuttavia l'alta efficienza catalitica di idrolisi di NAD(P)(H), rispetto all'attività molto bassa verso gli altri substrati naturali saggiati, suggerisce che questi enzimi possano modulare l’attività delle deidrogenasi. Inoltre, è stato osservato un aumento dell’attività enzimatica della ONPP da giugno ad agosto che, correlato con la possibile modulazione dell’attività delle deidrogenasi, ci porta ad ipotizzare che la ONPP possa essere uno dei fattori che influenzano la maturazione dei frutti

2008/2009
Scopo della ricerca. La ricerca di dottorato è mirata allo studio delle risorse geotermiche profonde (acquiferi profondi e sub superficiali) presenti nel sottosuolo della Bassa Pianura Friulana, mediante l’integrazione di metodi geofisici applicati con metodi stratigrafici e idrogeologici, geochimici e numerici. Le tematiche del dottorato si sono focalizzate su: delimitazione spaziale e caratterizzazione dei sistemi acquiferi (anche come reservoirs a bassa entalpia); studio dei meccanismi di ricarica e circolazione delle acque; definizione della struttura geotermica e valutazione della risorsa nell’area di Grado (Gorizia), dove è stato perforato un pozzo esplorativo (1110 m di profondità). I risultati preliminari della ricerca costituiscono il primo studio integrato in Regione per la caratterizzazione e valutazione della risorsa geotermica effettuato con metodi geofisici da pozzo. Alla luce del modello geologico preesistente, il nuovo modello concettuale emerso dalle ricerche effettuate risulta per molti versi innovativo. Fasi di acquisizione dei dati. Il dottorato è risultato sinergico alle attività di ricerca sviluppate dal DICA dell’Università degli Studi di Trieste, nell’ambito di alcuni progetti innovativi finanziati negli ultimi anni dal Servizio Geologico regionale (Direzione Centrale Ambiente e Lavori Pubblici - RFVG) che hanno permesso la raccolta di numerosi dati inediti. I progetti sono: “Realizzazione della Carta Geologico-Tecnica della Risorsa Geotermica Nazionale e definizione delle Linee Guida per il suo Utilizzo”[Progetto 1]; “Perforazione del pozzo esplorativo Grado-1 per la quantificazione della Risorsa Geotermica - Progetto Geotermia Grado”[Progetto 2]; “Studio sugli acquiferi regionali finalizzato anche alla definizione di linee guida per il corretto e compatibile utilizzo delle loro acque”[Progetto 3]. Questi progetti sono stati completati con diverse collaborazioni con DISGAM e DST dell’Università di Trieste e l’OGS di Trieste. Attività di ricerca. La ricerca si è articolata in diverse fasi operative, anche in accordo ai progetti sopraccitati: 1)Definizione del quadro geologico e strutturale dell’avampaese friulano mediante analisi della letteratura esistente. 2)Studio degli acquiferi sotterranei profondi della Pianura friulana (fino alla profondità massima di 600 m circa) [Progetto 1]. In particolare, in questa fase: sono stati esaminati i dati in sito, analisi geochimiche ed isotopiche di campioni di acqua provenienti da alcuni acquiferi significativi; sono state elaborate mappe delle isobate del tetto dei sistemi acquiferi e mappe delle isoterme delle acque di strato. 3)Raccolta, analisi e contributo alla realizzazione di un database dei pozzi per acqua perforati nella Pianura Friulana che ha integrato oltre 1800 litostratigrafie e altri dati accessori [Progetto 3]. Lo studio ha compreso l’elaborazione numerica delle superfici delimitanti i principali sistemi di acquiferi e delle relative mappe, mediante l’applicazione di diverse metodologie statistiche e l’analisi dei variogrammi sperimentali. Questo ha aggiornato il modello idrogeologico ottenuto dal Progetto 1. 4)Studio del reservoir geotermico profondo mediante un pozzo esplorativo di circa 1100 m di profondità a Grado (Gorizia) e all’acquisizione e all’elaborazione dei dati del pozzo [Progetto 2]. Questa fase ha impegnato la dottoranda in assistenza continua alla D.L. in cantiere (tra gennaio ed aprile 2008) e nelle specifiche attività di: acquisizione e analisi di dati tecnici di perforazione, parametri chimico-fisici dei fluidi di circolazione, produzione del master log e well log di cantiere; monitoraggio termico e prove idrauliche di pompaggio nel reservoir geotermico; raccolta e analisi dei cuttings e delle carote, descrizione macroscopica delle litologie, ricostruzione della stratigrafia sulla base delle analisi preliminari di laboratorio sui cuttings e sulle carote; analisi delle caratteristiche geochimiche principali delle acque campionate; acquisizione e analisi dei logs geofisici di pozzo, che hanno fornito gli elementi-chiave per la ricostruzione delle strutture profonde. 5)Ricostruzione geologica della struttura di Grado e modello idrogeologico e termico per il termalismo profondo, mediante l’integrazione dei dati disponibili e dei nuovi dati acquisiti, con particolare attenzione a: stratigrafie e logs geofisici provenienti da pozzi perforati da Eni, Ina Naftaplin e altri; sezioni sismiche a terra, in Laguna di Grado e Marano e nel Golfo di Trieste; carte del tetto dei carbonati e delle isobate del Quaternario nella Pianura Friulana; mappe di anomalia gravimetrica e magnetica per il Golfo di Trieste ed il suo entroterra. Risultati del dottorato di ricerca. I dati acquisiti nell’area di Grado e Laguna circostante, integrati con le informazioni regionali hanno permesso di individuare e ricostruire una struttura dinarica esterna, non nota precedentemente, che costituisce la sede del sistema di circolazione termale che è caratterizzato da diversa permeabilità. La struttura è interessata da rilevanti faglie beanti sub-verticali e strutture tettoniche che probabilmente mettono in contatto i sistemi termali più profondi con il tetto del reservoir. L’area di Grado è caratterizzata da: una copertura di età plio-pleistocenica di sedimenti sciolti alternati, caratterizzati da granulometria variabile da ghiaioso-sabbiosa a limoso-argillosa; una potente successione clastica costituita da sedimenti neogenici marnoso-arenacei (semilitoidi) e dalle torbiditi del Flysch paleogenico; un basamento carbonatico composito, reservoir del sistema geotermico, rinvenuto a partire da 618 m di profondità nel pozzo Grado-1. Il basamento è risultato suddiviso in intervalli ben distinti. Sono stati individuati calcari di rampa paleogenici e la loro sequenza di sviluppo e annegamento con la comparsa del flysch. I calcari ad Alveolinidae e Nummulitidae sono stati differenziati dai sottostanti calcari micritici di piattaforma di età cretacica superiore anche grazie al riconoscimento di netti marker nel Gamma Ray Log. La correlazione tra i diversi logs geofisici acquisiti in pozzo ha permesso di differenziare ulteriormente il reservoir carbonatico in intervalli distinti per litologia (densità, porosità, resistività, radioattività naturale, …) e moduli elastici; le facies geofisiche sono risultate ben relazionabili a quelle riscontrate nell’offshore croato. I dati idraulici acquisiti durante le prove di strato (con portata naturale e stimolata) e le analisi geochimiche ed isotopiche delle acque hanno permesso di affinare il modello di circolazione idrotermale. Questo considera almeno due sistemi di circolazione all’interno dei carbonati, separati da un setto idraulico: il tratto 616–830 m circa è caratterizzato da circolazione di acque in poche fratture ma molto aperte (con portata spontanea di circa 15 l/s e temperatura di circa 41.4°C); nel tratto 830–1000 m circa si ha una debole circolazione di acque all’interno di un ammasso roccioso più massiccio, interessato da un reticolo fitto ma con modesta apertura; a partire da 1000 m circa si rinvengono acque più calde (45°C a fondo pozzo) in un reservoir a notevole permeabilità (per fratturazione e incarsimento) che potrebbe richiamare i fluidi del sistema idrotermale presente alla profondità di 600-800 m. A scala locale, le strutture tettoniche presenti e probabilmente riattivate recentemente costituiscono una importante via di migrazione, circolazione e cortocircuitazione dei fluidi profondi (acqua e gas) con i sistemi più superficiali. A scala più ampia, il quadro strutturale elaborato per l’area di Grado è caratterizzato da un sistema di strutture inverse ovest-vergenti che coinvolgono il basamento carbonatico e le soprastanti coperture e da un raddoppio tettonico individuato nei calcari; queste strutture sono state interpretate come il fronte dinarico più esterno e costituiscono la diretta prosecuzione di fronti compressivi affioranti in Istria. Il modello stratigrafico elaborato risulta inoltre coerente con il quadro stratigrafico generale desumibile dai pozzi perforati nell’offshore croato e con quanto ipotizzato a partire dalle mappe di anomalia gravimetrica e dalle sezioni sismiche disponibili. Nel più ampio contesto della Bassa Pianura friulana le attività di ricerca hanno consentito di:  caratterizzare preliminarmente dal punto di vista chimico-fisico ed isotopico le acque profonde circolanti a diverse profondità (in seno alle coperture post paleogeniche) nelle aree caratterizzate da anomalie geotermiche e le relative mappe delle isoterme  valutare la presenza di alcune strutture tettoniche (coinvolgenti le coperture prequaternarie e giungenti in prossimità della superficie) in grado di veicolare fluidi profondi con acque superficiali nelle aree a nordorientali della Laguna di Grado  rappresentare mappe regionali delle superfici delimitanti tetto e letto dei principali sistemi di acquiferi confinati evidenziati dalle litostratigrafie dei pozzi e ricostruire un modello numerico schematico del sottosuol. L’insieme dei risultati ottenuti ha permesso dunque di validare le ipotesi di lavoro formulate inizialmente e di proporre un più solido, rinnovato e, per molti versi, innovativo modello geologico-termico basato su inediti dati sperimentali. Il modello geologico elaborato risulta decisivo anche in relazione all’imminente realizzazione del pozzo esplorativo Grado-2, che permetterà al contempo di validare le ipotesi assunte e fornire ulteriori dati sperimentali.
XXII Ciclo
1979

The heart is especially vulnerable to mitochondrial derangements. In fact, many cardiomyopathies are caused by anomalous mitochondrial metabolism or alterations of mitochondrial bioenergetics. The involvement of mitochondria in cardiac diseases is likely to be extended to structural changes, since mitochondrial activity and cellular signaling are tightly linked with mitochondrial morphology. A major example of this link is provided by the relationship between mitochondrial fragmentation and the progression of apoptosis. Among the proteins involved in mitochondrial dynamics, the dynamin-like GTPase Optic Atrophy 1 (OPA 1) is required for mitochondrial inner membrane fusion and maintenance of normal cristae structure. The research activity of this thesis was aimed at both investigating whether OPA 1 is altered in hearts subjected to ischemia and reperfusion and elucidating the relationships between OPA 1 changes and alterations in mitochondrial morphology. Due to the established role of mitochondria in generating reactive oxygen species, oxidative stress was investigated as a crucial mechanism altering OPA 1 structure and function.The susceptibility of OPA 1 to oxidation was initially characterized in intact hearts, cardiomyoblasts and isolated mitochondria. In isolated rat hearts perfused with hydrogen peroxide (H2O2) or subjected to ischemia and reperfusion OPA 1 was found to undergo the formation of high molecular weight (HMW) bands that were barely detectable in normoxic hearts. Since these HMW bands were only observed in electrophoreses carried out under non-reducing conditions, their formation reflected the oxidation of vicinal cysteinyl residues resulting in the generation of disulphide cross-bridges. In mitochondria isolated from heart perfused with H2O2, Blue Native-PAGE (BN-PAGE) analysis displayed the aggregation of OPA 1 in various complexes with high molecular weight (ranging from xx to xx). These complexes were not present in mitochondria isolated from normoxic rat hearts. Then OPA 1 complex formation was analyzed both in HL-1, a proliferating atrial cardiomyocites derived from mouse AT-1 cells, and in mouse embryonic fibroblasts (MEFs), as a model cell line. Oxidative stress caused by incubation with H2O2 resulted in the formation of OPA 1 complexes that disappeared under reducing conditions, confirming the presence of intermolecular cross-bridges. Notably, under the same experimental condition causing OPA 1 aggregation (i.e., incubation with increasing concentration of H2O2) a fragmentation of mitochondrial network was observed in HL-1 cells suggesting that oxidation of cysteine residues might hamper the ability of OPA 1 to favour mitochondrial fusion. This hypothesis was validated by identifying which residues of cysteine were involved in the formation of disulfides cross-bridges. Since NMR and crystallographic structure of OPA 1 is not available, 3D structure information were obtained by means of homology modeling. In a collaborative effort with Prof. S. Moro (Faculty of Pharmacy, University of Study of Padova), analyses were carried out aimed at identifying the cysteine residues exposed on the protein surface that is also the region involved in OPA 1 dimerization. As a result of this study, cysteines 853, 856 and 874 were indicated as the residues that more likely contribute to the formation of OPA 1 complexes. This hypothesis was verified by performing site-directed mutagenesis experiments on the expression construct containing wild-type Opa1 isoform 1. By substituting the native cysteine residues with serine. This approach allowed us obtaining the following mutants: (i) the double mutant in C853-6S; (ii) the single mutants in C853S or in C874S. New clones have been sequenced to ensure fidelity. Lentiviral vectors containing the mutated cysteine plasmids were produced in order to transfect OPA 1-/- MEF cell line (kindly given by Prof. L. Scorrano). Both C853S and C853-6S expressed detectable level of OPA 1, while cells containing OPA 1 mutated in the single residue C874S were not obtained. Cells harbouring the OPA 1 mutants were assessed for mitochondrial morphology. Under control conditions C853-6S cells displayed punctuate mitochondria that is similar to the mitochondrial phenotype displayed by OPA 1-/- MEF cells; conversely, the expression of the C853S mutant restored the fusion morphology. Cells were incubated with H2O2 in order to elucidate the relationship between OPA 1 aggregation and disulphide crossbridge formation. OPA 1 complex formation was inhibited in both cell lines. To investigate the correlation between OPA 1 aggregation and mitochondrial fission, C853S cells were treated with H2O2. In C853S mutants the time required for completing the fission process was doubled with respect of MEF wild type cells. In conclusion these findings highlight the relevance of cysteine 853 in maintaining the role of OPA 1 in mitochondrial fusion, and especially in the derangement of this function caused by oxidative stress. In fact, when cells expressing the mutant C853S were exposed to a severe oxidative stress, OPA 1 aggregation was prevented along with a significant delay in the occurrence of mitochondrial fission.
Il cuore è particolarmente soggetto a disfunzioni mitocondriali e numerose cardiomiopatie sono associate ad un anomalo metabolismo mitocondriale o ad alterazioni bioenergetiche mitocondriali. Studi recenti hanno messo in evidenza come l’attività dei mitocondri e le vie di trasduzione del segnale cellulare influenzino la morfologia dei mitocondri, ad esempio, la frammentazione della rete mitocondriale è correlata al processo di apoptosi. La proteina OPA 1, GTPasi appartenente alla famiglia delle dinamine, è coinvolta nel processo di fusione della membrana interna mitocondriale e nel mantenimento della struttura delle cristae interne mitocondriali. Tuttavia sono necessari maggiori studi atti a contribuire ad una maggiore comprensione delle proteine e dei meccanismi alla base delle funzionalità di OPA 1. Nel presente lavoro di tesi è stato studiato l’effetto dello stress ossidativo sulla proteina mitocondriale OPA 1 nel cuore, dato che i mitocondri sono sede di produzione e bersaglio delle specie reattive dell’ossigeno (ROS). Inizialmente, utilizzando cuori di ratto isolati e perfusi ex-vivo, è stato valutato l’effetto di ischemia/riperfusione e perfusione con perossido di idrogeno (H2O2) sulla proteina OPA 1. Nei campioni trattati è stata osservata la formazione di complessi ad alto peso molecolare (high molecular weight, HMW) della proteina in esame. In condizioni riducenti, tali complessi vengono disgregati. Questi risultati indicano che in condizioni di forte stress ossidativo con H2O2 si ha l’aggregazione di OPA 1 e che nella formazione dell’aggregato è coinvolta la formazione di ponti disolfuro. In seguito, mediante Blue Native-PAGE (BN-PAGE), è stata eseguita un’analisi dei complessi proteici a partire da mitocondri isolati da cuore di ratto in condizioni normossiche e da cuori perfusi con H2O2. L’analisi ha dimostrato che OPA 1 aggrega in complessi di diverso peso molecolare in condizioni native. La formazione del complesso di OPA 1 è stata analizzata sia cellule HL-1, una linea di cardiomiociti da atrioma murino, che in fibroblasti embrionali murini (mouse embryonic fibroblasts, MEFs). Al fine di indurre stress ossidativo le cellule sono state incubate con 1 mM H2O2 per 2 ore. Il complesso di OPA 1 scompare in condizioni riducenti, confermando la formazione di ponti disolfuro intermolecolari. Inoltre, in cellule HL-1 incubate con concentrazioni crescenti di H2O2 è stata osservata frammentazione della rete mitocondriale. Ci siamo proposti di individuare quali fossero i residui cisteinici coinvolti nella formazione del ponte disolfuro. La struttura della proteina OPA 1 non è stata determinata né mediante NMR né mediante tecnica cristallografica. In collaborazione con il Prof. S. Moro (Facoltà di Farmacia, Università degli Studi di Padova) è stata ipotizzata la struttura 3D della proteina mediante homology modelling al fine di caratterizzare quali fossero i residui cisteinici esposti sulla superficie proteica. In questo modo le cisteine 853, 856 e 874 sono stati individuati come residui più probabilmente coinvolti nella formazione del complesso di OPA 1. Per confermare questa ipotesi, sono stati eseguiti degli esperimenti di mutagenesi sito-diretta a partire da un costrutto plasmidico contenente la sequenza genica per l’isoforma 1 umana del gene OpaI. Mediante questa tecnica sono stati ottenuti plasmidi mutati a livello delle singole cisteine 853 (C853S) e 874 (C874S), ed un doppio mutante cisteina 853-6 (C853-6S). I cloni sono stati sequenziati per confermare le avvenute mutazioni. Sono stati prodotti vettori lentivirali contenenti i plasmidi mutagenizzati al fine di esprimere stabilmente la proteina di interesse nella linea cellulare MEF OPA 1-/- (gentilmente fornita dal Prof. L. Scorrano). Sono state ottenute linee cellulari esprimenti la proteina OPA 1 mutata a livello del singolo residuo cisteinico 853 e dei residui 853-6, mentre non è stata ottenuta la linea esprimente la proteina mutata in C874S. È stata quindi valutata la morfologia mitocondriale nelle linee cellulari ottenute. Le cellule C853-6S presentano mitocondri disgregati con un fenotipo simile alla linea MEF OPA 1-/-; al contrario, nelle cellule esprimenti la proteina OPA 1 mutata a livello del residuo 853, si verifica il ripristino del fenotipo di fusione mitocondriale. Al fine di chiarire la relazione tra l’aggregazione di OPA 1 e la formazione dei ponti disolfuro, le cellule sono state incubate con H2O2. La formazione del complesso di OPA 1 risulta inibita in ambedue le linee cellulari contenenti la proteina mutata. Le cellule C853S sono state trattate con H2O2 per verificare la correlazione tra l’aggregazione della proteina in esame e il processo di fissione mitocondriale. I cloni C853S completano il processo di fissione mitocondriale in un tempo doppio rispetto alla linea MEF WT. Per concludere, in condizioni di elevato stress ossidativo la proteina OPA 1 è esposta ad ossidazione che ne modifica lo stato di aggregazione. Tale processo è correlato ad una diminuzione della fusione mitocondriale e, nelle cellule HL-1, ad un aumentato rilascio di citocromo c. Il meccanismo di aggregazione della proteina è stato stabilito mediante mutagenesi sito specifica che mette in luce il ruolo del residuo cisteinico 853.

Secondo la teoria delle cellule staminali tumorali, lo sviluppo del tumore sarebbe sostenuto dalla presenza di una distinta sottopopolazione di cellule tumorali, denominate cancer stem cells (CSCs), dotate della capacità di autorigenerarsi e di una spiccata resistenza agli agenti chemioterapici. Nel presente studio, è stato messo a punto un protocollo di crescita volto all’arricchimento in CSCs, mediante formazione di sfere, delle linee cellulari Hep-2 (carcinoma della laringe), T24 (carcinoma della vescica), MG63 (osteosarcoma), CaCo-2 (carcinoma del colon-retto) e A549 (carcinoma polmonare). Successivamente è stata effettuata un caratterizzazione molecolare e fenotipica delle popolazioni arricchite in CSCs, mediante rispettivamente l’analisi di espressione di markers di staminalità e la valutazione in vivo del potenziale tumorigenico. Inoltre, a carico delle CSCs e delle cellule di controllo, sono stati analizzati i livelli dell’enzima nicotinamide N-metiltrasferasi (NNMT). L’analisi immunocitochimica e mediante Real-Time PCR hanno evidenziato elevati livelli di espressione dei markers di staminalità nelle popolazioni cellulari arricchite in CSCs rispetto ai controlli. In seguito all’inoculo in topi atimici delle cellule relative alla linea Hep-2, la popolazione arricchita in CSCs dava luogo a masse tumorali di dimensioni maggiori rispetto a quelle originatesi dalle cellule di controllo, evidenza che suggerisce la spiccata capacità da parte delle CSCs di indurre la formazione in vivo di tumori. Le analisi condotte a carico dell’NNMT mostrano un’overespressione dell’enzima nelle popolazioni arricchite in CSCs rispetto ai controlli. In considerazione dell’importante ruolo svolto dalle CSCs nello sviluppo di recidive e nella diffusione metastatica, i risultati riportati in questo lavoro potrebbero contribuire allo sviluppo di nuove strategie terapeutiche per il trattamento del cancro e suggeriscono il significativo coinvolgimento dell’NNMT nel metabolismo della cellula neoplastica.
According to cancer stem cells theory, tumor development would be maintained by a distinct subpopulation of tumor cells, termed cancer stem cells (CSCs), that have the ability to self-renew and to resist to chemotherapeutic agents. In the present study, we setup a culture system to enrich CSCs from Hep-2 (laryngeal cancer), T24 (bladder cancer), MG63 (osteosarcoma), CaCo-2 (colorectal cancer) and A549 (lung cancer) cancer cell lines, through sphere formation. We further performed molecular and phenotypic characterization of CSC-enriched cell populations, by exploring the expression levels of stem markers and in vivo evaluating their tumorigenic potential, respectively. Moreover, we investigated the expression levels of the enzyme nicotinamide N-methyltransferase (NNMT) in CSCs and parental cells. Real-Time PCR and immunocytochemistry revealed that CSC-enriched populations showed increased expression levels of stem markers compared with controls. After subcutaneous injection of Hep-2 cells into immunocompromised mice, CSC-enriched population yielded tumors of a much larger size compared with those generated by parental cells, suggesting the strong ability of CSCs to form tumors in vivo. NNMT expression analysis revealed enzyme upregulation in CSC-enriched populations compared to parental counterpart. Considering the fundamental role of CSCs in tumor relapse and onset of metastases, findings reported in this work could contribute to the development of new therapeutic strategies for cancer treatment and suggest an important involvement of NNMT in cancer cell metabolism.

Human Semicarbazide-Sensitive Amine Oxidase (SSAO/VAP-1) is a transmembrane glycoprotein, which catalyzes the oxidative deammination of primary amines to aldehydes, with the release of the ammonium ion and hydrogen peroxide. The physiological role of SSAO/VAP-1 is not still clear: in adipocytes, SSAO/VAP-1 activity has an “insuline” like effect, while in vascular and sinusoidal hepatic endothelium, SSAO/VAP-1 is involved in the leucocyte extravasation at sites of inflammation. On these basis, the development of new specific inhibitors for SSAO/VAP-1 is an important target for the development of new anti-inflammatory drugs, while the development of new specific substrates can help to clarify the physio-pathological functions of this enzyme. To obtain information about the characteristics of a molecule to be recognized by human SSAO active site, a kinetic characterization of SSAO/VAP-1 from adipocytes was performed. Primary amines, with different size, sterical hindrance and charge distribution were used as “probe-substrates”. 1,12 diaminododecane and cis-4-chloro-butenylamine resulted the substrates with the higher catalytic efficiency among those tested. From these measurements, it was possible to estimate the value of the dielectric constant of the active site of SSAO/VAP-1, that was found to be in the range 10-20. From the effect of pH on Vmax/KM of SSAO/VAP-1 for some substrates, it was possible to highlight that a residue in its protonated form impedes the catalysis. The preliminary analysis of the 3D structures of VAP-1 shows that this residue could be Lys 393. From the effect of ionic strength and of temperature on the enzyme activity it appeared that the hydrophobic effect has an important role in the active site-substrate recognition step. Various classes of compounds (phosphonium and ammonium salts, pyridine and aniline derivatives and N-oxides) as SSAO/VAP-1 inhibitors were also tested . Although they are good inhibitors of the bovine serum enzyme and of 82% of sequence homology between the two enzymes, they resulted poor inhibitors of the human SSAO/VAP-1 (with Ki=3-4mM). From these studies, it emerges that a potential good substrate (or inhibitor) for the human SSAO/VAP-1 should be a molecule characterized by a large apolar moiety and by the presence of a positive charge at a distance higher than 10-12 ? from the reactive amino group. To obviate the use of radioactive isotopes, a discontinuos fluorimetric method for the detection of SSAO/VAP-1 activity in human plasma was set up. The method was validated and applied to the measurement of soluble SSAO/VAP-1 activity in human plasma from healthy controls and from patients with various diseases. A significant increase of soluble SSAO/VAP-1 activity was found in patients with “moderate-severe” Alzheimer disease and in patients with coronary stent implantation. In these patients in addition to SSAO/VAP-1 augment, an increase of circulating extracellular superoxide dismutase activity was also found, suggesting a condition of “oxidative stress”, probably due to the presence of the stent. In the patients with hepatic cirrhosis (induced by alcohol abuse) it was possible to highlight an increase of soluble SSAO/VAP-1 activity in the patients with “mild-moderate” hepatic cirrhosis (according to Child score), while in the patients with “severe” hepatic cirrhosis this increase of activity is lower. These results suggest that high levels of soluble SSAO/VAP-1 are the consequence of an intense inflammatory response, while the relative decrease of the SSAO/VAP-1 level in plasma in the severe state of cirrhosis, could be due to a fall down of the immune defences in these patients. To investigate a possible role of SSAO/VAP-1 activity in adipocytes, a preliminary study was carried out incubating the cells with insuline, methylamine, catalase and malvidine 3-glucoside. From this study, it appears that some proteins are differently expressed in the presence of these factors. In particular, the presence of insuline, methylamine and malvidine 3-glucoside appears to modulate the expression of SSAO/VAP-1 and of MAO, suggesting that both the enzymes are involved in a common signaling pathway, mediated by the insuline. In future the identification of the expressed proteins by Mass-Spectrometry, associated with Immunoblotting, using specific antibodies may contribute to clarify the connection between SSAO/VAP-1 and insuline pathway and will contribute to obtain new information about the role of this enzyme.
L’ammino ossidasi umana sensibile alla semicarbazide (SSAO/VAP-1) è una glicoproteina transmembrana, che catalizza la deamminazione ossidativa di ammine primarie ad aldeidi, con rilascio dello ione ammonio e perossido di idrogeno. Il suo ruolo fisiologico non è ancora chiaro: in adipociti, l’attività SSAO/VAP-1 ha un effetto che mima quello dell’insulina, mentre nell’endotelio vascolare e sinusoidale epatico, SSAO/VAP-1 è coinvolta nell’extravasazione dei leucociti ai siti di infiammazione. Su queste basi, lo sviluppo di nuovi specifici inibitori per SSAO/VAP-1 è un target importante per lo sviluppo di nuovi farmaci antinfiammatori, mentre lo sviluppo di nuovi specifici substrati può contribuire a chiarire le funzioni fisio-patologiche di questo enzima. Per ottenere informazioni sulle caratteristiche che una molecola dovrebbe possedere per essere riconosciuta dal sito attivo dell’enzima umano SSAO, è stata eseguita una caratterizzazione cinetica di SSAO/VAP-1 da adipociti, utilizzando ammine primarie, caratterizzate da differente lunghezza, ingombro sterico e distribuzione di carica. L’1,12 diamminododecano e la cis-4-cloro-butenilammina sono risultati i substrati con la più alta efficienza catalitica fra quelli provati. E’ stato possibile stimare il valore di costante dielettrica del sito attivo di SSAO/VAP-1, che è compreso in un intervallo di circa 10-20. Dall’effetto del pH sul rapporto Vmax/KM della SSAO/VAP-1 per alcuni substrati, è stato possibile evidenziare che un residuo nella sua forma protonata inibisce la catalisi. Da un’analisi preliminare delle strutture 3D di VAP-1, questo residuo potrebbe essere la lisina 393. Dall’effetto della forza ionica e della temperatura sull’attività enzimatica è stato possibile dedurre che l’effetto idrofobico sembra avere un ruolo importante nella fase di riconoscimento substrato - sito attivo della SSAO/VAP-1. Sono state anche provate varie classi di composti (sali di fosfonio ed ammonio, piridina, anilina e i suoi derivati e gli N-ossidi), che sebbene siano buoni inibitori per l’enzima da siero bovino, si sono rivelati inibitori poco efficienti per l’enzima umano SSAO/VAP-1 (valori minimi di Ki=3-4 mM), anche se l’omologia di sequenza fra i due enzimi è elevata (82%). Dall’insieme di questi studi, è emerso che un buon substrato o inibitore per l’enzima umano SSAO/VAP-1 dovrebbe essere una molecola caratterizzata da una larga porzione apolare e dalla presenza di una carica positiva ad una distanza maggiore di 10-12 ? dal gruppo amminico reattivo. Per ovviare all’impiego di isotopi radioattivi, è stato messo a punto un metodo fluorimetrico discontinuo per la misura dell’attività di SSAO/VAP-1 nel plasma umano. Il metodo è stato validato e applicato alla misura dell’attività della forma solubile di SSAO/VAP-1 nel plasma umano di individui controllo e in pazienti affetti da diverse patologie. Un aumento significativo dei livelli di attività SSAO/VAP-1 plasmatica è stato trovato in pazienti con Alzheimer “moderato-grave” ed in pazienti con impianto di stent coronarico. In questi pazienti oltre a SSAO/VAP-1, è stato trovato inoltre un aumento dei livelli di attività della superossido dismutasi circolante nel plasma, suggerendo una condizione di “stress ossidativo”, probabilmente dovuta alla presenza dello stent. Nel caso dei pazienti con cirrosi epatica esotossica (indotta da abuso di alcool), è stato messo in luce un aumento dell’attività della forma solubile si SSAO/VAP-1 nei pazienti con cirrosi epatica “lieve-moderata” (classificazione Child), mentre nei pazienti con cirrosi epatica “grave”, questo aumento si riduce. I risultati ottenuti suggeriscono che elevati livelli della forma solubile di SSAO/VAP-1, sono la conseguenza di un’intensa risposta infiammatoria, mentre la relativa diminuzione del livello di SSAO/VAP-1 nello stato più grave della patologia, potrebbe essere dovuto ad un crollo delle difese immunitarie in questi pazienti. Per cercare di chiarire un possibile ruolo dell’attività di SSAO/VAP-1 negli adipociti, è stato condotto uno studio preliminare trattando le cellule con fattori quali insulina, metilammina, catalasi e malvidina 3-glucoside. L’analisi SDS-PAGE, evidenzia che alcune proteine sono espresse in maniera differente nell’incubazione degli adipociti con questi fattori. In particolare, la presenza di questi composti modula l’espressione di SSAO/VAP-1 e delle MAO, suggerendo che entrambi gli enzimi sono coinvolti in una comune via di segnale, mediata dall’insulina. In futuro l’identificazione delle proteine espresse tramite Spettrometria di Massa, associata ad analisi tramite Immunoblotting con anticorpi specifici, potrà contribuire a chiarire il collegamento tra SSAO/VAP-1 e la via di segnale mediata dall’insulina e a dare nuove informazioni sul ruolo di questo enzima.

This thesis has been focused on the proteomic characterization of human saliva from donors of different ages, starting from birth up to adult age, and pediatric brain tumor tissues. The first study has been performed in order to compare the acid-insoluble fraction of saliva from preterm with at-term newborns and adults and establish if differences exist. In the second study medulloblastoma and pilocytic astrocytoma pediatric brain tumor extracts have been compared. In both studies 2- DE analysis was coupled with high resolution tandem mass spectrometry (MS/MS). The proteomic characterization of the acid-insoluble fractions of saliva from preterm newborns allowed to integrate data previously obtained on the acid-soluble fraction by HPLC-electrospray ionization (ESI)-mass spectrometry (MS), and to evidence several differences between preterm newborns, at-term newborns and adults. Spots differentially expressed between the three groups, according to image analysis of the gels, were submitted to in-gel tryptic digestion and the peptide mixture analyzed by high performance HPLC-ESI-MS/MS for their characterization. By this strategy, we identified three over-expressed proteins in atterm newborns with respect to preterm newborns and adults (BPI fold-containing family A member 1, two proteoforms of annexin A1, and keratin type 1 cytoskeletal 13), and several over-expressed proteins in adults (fatty acid-binding protein, S100A6, S100A7, two proteoforms of S100A9, several proteoforms of prolactin-inducible protein, Ig kappa chain, two proteoforms of cystatin SN, one proteoform of cystatin S and several proteoforms of α-amylase 1). Moreover, for the first time, it was possible to assign by MS/MS four spots of human saliva 2-DE, already detected by other authors, to different proteoforms of S100A9. The strategy applied used a sequential staining protocol to the 2-DE gels, first with Pro-Q Diamond, that allows specific detection of phosphoproteins, and successively with total protein SYPRO Ruby stain. In the second study, proteomic analysis of two pediatric brain tumor tissues pointed out differences between medulloblastoma, the prevalent malignant tumor in childhood, and pilocytic astrocytoma, the most common, that only rarely shows a malignant progression. Due to the limited availability of bioptic tissue, the study was performed on pooled tumor tissues, and was focused on acid-insoluble fraction to integrate the characterization performed by a group of colleagues in Rome on the acid-soluble fraction by high performance HPLC-ESI-MS/MS. The results indicated that the two tumors exhibit different proteomic profiles and evidenced interesting differential expression of several proteins. Among them, peroxiredoxin- 1, peptidyl-prolyl cis–trans isomerase A, heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A2/B1, mitochondrial isoform of malate dehydrogenase, nucleoside diphosphate kinase A, glutathione S-transferase P and fructose bisphosphate aldolase A resulted significantly over-expressed in medulloblastoma while glial fibrillary acidic protein, serotransferrin, α crystallin B chain, ferritin light chain, annexin A5, fatty acid-binding protein (brain), sorcin and apolipoprotein A-I resulted significantly over-expressed in pilocytic astrocytoma. In conclusion, the work done allowed to evidence the usefulness of using an integrated bottom-up/top-down approach, based on 2-DE-MS analysis and high performance MS in order to obtain a complete characterization of the proteome under investigation, revealing and identifying, not only peptides and small proteins, but also proteins with higher MW, that often it is not possible to identify by using exclusively a top-down ESI-MS approach.