Academic literature on the topic 'Caratterizzazione strutturale e biochimica'

Il lavoro descrive l'evoluzione delle province italiane nel corso di questi ultimi anni, analizzando la posizione espressa dalle aree prevalentemente distrettuali, in modo da offrire nuove evidenze sul legame tra distretto e sviluppo industriale del paese. Per l'individuazione dei distretti si č scelto di adottare un procedimento di rilevazione indiretta che si basa sull'individuazione della prevalente caratterizzazione strutturale della provincia. Lo studio si distingue in due fasi: nella prima si procede alla rilevazione delledi crescita negli anni 1995-2007; nella seconda si valutano in via preliminare gli effetti della crisi internazionale. I risultati attestano una dinamica migliore per le province altamente distrettuali. Per quanto riguarda gli anni della crisi (2008-2009), queste aree sembrano risentire meno dell'impatto recessivo. Le stime econometriche indicano la presenza di un effetto distretto in grado di influenzare favorevolmente il trend occupazionale nel settore industriale. Il risultato č confermato in presenza di due importanti variabili di controllo: la dimensione settoriale e il ricorso agli ammortizzatori sociali.

Earthquakes induce dynamic stresses in structures, and past seismic events have demonstrated that existing heritage buildings are highly vulnerable. This vulnerability applies to both reinforced-concrete and masonry buildings, which are concentrated in historic centres throughout Italy. Significant variations in construction account for the inadequacy of existing structures to withstand seismic actions, such as the materials used and the construction details, which can be neglected in building practices. This work focuses on the analysis of heritage buildings through an inventory using the <em>Caratterizzazione TIpologica Strutturale</em> (CARTIS) form developed by the Seismic Engineering University Laboratories Network in conjunction with the Civil Protection Department. On knowing a building framework, structural health monitoring (SHM) systems can be applied on the town compartments (TCs) that are prone to the highest vulnerabilities. A priority criticalities scale can be devised starting from the building inventory by identifying the TCs through the CARTIS-based data. This approach can be used to determine a safety threshold obtained via structural parametrical analysis using commercial software (VEMnl) with different building typologies. The next stage consists of the implementation of appropriate SHM to provide important information regarding the structural integrity of the buildings. The proposed methodology is outlined in this paper with reference to the suggested SHM system<span lang="EN-US">.</span>

Alcuni contaminanti ambientali sono non biodegradabili e pericolosi per la salute umana con effetti tossici su svariati target nell’organismo. Ad oggi diversi studi suggeriscono il legame di alcuni di questi contaminanti alle proteine plasmatiche, prima fra tutte l’albumina sierica umana (HSA). L’oggetto del lavoro di tesi è stato dimostrare il legame di uno di questi contaminanti ad HSA sfruttando la tecnica della cristallografia ai raggi X. La risoluzione della struttura tridimensionale della proteina HSA in complesso con il contaminante ed il miristato di sodio ha permesso di identificare i siti e la stechiometria di legame. Utilizzando un approccio competitivo fra ligandi basato su differenti rapporti molari di contaminante, miristato di sodio ed HSA è stato infine possibile ipotizzare diverse affinità di legame per i siti stessi.

2009 - 2010
The maintenance of gastrointestinal tissue integrity is physiologically essential in the presence of the persistent harassment of microbial flora and injurious agents. Even though the repair of the gastric epithelium may be modulated by several factors, the epithelial continuity also depends on a family of small peptides called trefoil factors (TFFs). The trefoil factors family comprises the gastric peptides pS2/TFF1, the spasmolytic peptide (SP)/TFF2 and the intestinal trefoil factor (ITF)/TFF3; they are characterized by a three looped domain, the “trefoil domain”, stabilized by three disulphide bridges. TFF1 and TFF3 also have a seventh cysteine that allows the formation of omo- and/or hetero-dimers. On the other hand TFF2 presents only a monomeric form, containing two trefoil domains in the same polypeptide chain. TFFs are small protease-resistant proteins that are abundantly produced by mucus-secreting cells of the gastrointestinal tract onto the mucosal surface. TFFs are essential in the protection of the mucosal epithelia against a wide range of biological threats, thus contributing to the mucosal repair. The signaling events that mediate the cellular responses elicited by TFFs are only partially understood. Moreover there are convincing evidence that TFFs do play an important role in tumorigenesis, even though their specific roles in cancer are still unclear. TFF1 expression is strongly induced after mucosal injury and it has been proposed that TFF1 functions as a gastric tumor suppressor gene. Several studies confirm that TFF1 expression is frequently lost in gastric cancer because of deletions, mutations or methylation of the TFF1 gene. Infection by Helicobacter pylori, a class 1 carcinogen according to WHO classification, is thought to promote stomach carcinogenesis through induction of aberrant DNA methylation. Samples from infected patients show lower expression of TFF1. Recent studies have also shown that there is a direct relationship between Helicobacter pylori and the dimeric form of the protein. In fact, it was demonstrated that the core oligosaccharide portion of H. pylori lipopolysaccharide (RF-LPS) is able to bind to TFF1. It also seems that the loss of TFF1 is an important event in shaping the NF-kB-mediated inflammatory response during the progression to gastric tumorigenesis, being TFF1 a negative regulator of NF-kB signalling. It is thus emerging a clear correlation between loss of TFF1, the development of inflammatory disease and the neoplastic process. Recent analyses made by our research group allowed us to point out the up-regulation of TFF1 gene expression in rats fed on copper deficient diets, and allowed us to find out the unexpected ability of TFF1 to bind copper ions. The presence of a cysteine surrounded by several negatively charged residues in the carboxy-terminus of the protein suggested the presence of a copper-binding site. Afterwards, it was shown that Cys58 and at least three Glu surrounding residues are essential to efficiently bind copper. Moreover, the incubation of the native peptide with copper salts increases the fraction of peptide omodimers produced by inter-molecular oxidation of Cys58 and disulphide bond formation. The Ph.D. research project was aimed at characterising the structure-function relationship of the TFF1-Cu complex. Briefly, we studied the influence of copper on known TFF1 biological activities and on its gene regulation, then we investigated its involvement in the TFF1 mediated mechanisms of Helicobacter pylori virulence and infection. A preliminary Real Time PCR quantitative analysis showed that copper deficiency positively modulates tff1 expression in an adenocarcinoma cell line (AGS), thus confirming our previous data obtained in vivo in copper deficient rat intestine. In order to map possible copper responsive elements in the proximal promoter sequence, we analysed the expression of a reporter gene (Luciferase) driven by deletion constructs of the tff1 gene promoter. AGS cells transfected with the deletion constructs allowed us to identify the upstream 5’ gene sequence -583/-435 as a promoter region sensitive to the changes of copper concentration. In fact, copper chelation treatments with bathocuproine disulfonate (BCS) were able to stimulate an increase of the promoter activity of the corresponding deletion construct. Following the sequence analysis (Transfac software) we focused our attention on a putative SP1 binding site identified in this region, whose binding ability was then confirmed by electrophoretic mobility shift assay (-561/-552). In agreemente with our in vitro results, it was also observed that copper favours the native TFF1 dimer formation in the culture medium of MCF-7 and HT29-MTX cells (a mucus-secreting clone obtained from the HT29 colon cancer cell line), thus confirming a possible role of the metal in the balance between the monomeric and the dimeric forms To evaluate the effect of copper-TFF1 interaction on the well known motogenic activity of the protein, we performed wound healing assays on an inducible clone of gastric cancer cells (AGS) able to overexpress the peptide (AGS-AC1). As expected, the overexpression of TFF1 stimulates an appreciable increase of cell migration, and copper chelation (BCS) undo the benefits of the increased peptide level. Our previous results showed that copper treatments decreased the amount of secreted protein in culture medium. Further experiments demonstrated that induced AGS-AC1 cells are able to store intracellularly higher amount of copper if compared to uninduced AGS-AC1 cells. This evidence suggests that TFF1 levels may also play a role also in the uptake/traffic of copper in this in vitro model. Finally, we studied the combined influence of TFF1 and copper in Helicobacter pylori infections. Our results demonstrate that Cu-TFF1 complex promotes H. pylori colonization of AGS cells. In fact, AGS-AC1 cells overexpressing TFF1 are more efficiently colonised by H. pylori wild-type (str. P12) if compared to uninduced cells. The presence of copper in a duplicate experiment further increases the colonization, as well as copper chelation by bathocuproine disulfonate (BCS) reduces the observed effect. The same result was obtained with H. pylori str. P12Δ479, an isogenic mutant expressing a truncated LPS core still able to bind to TFF1. On the other hand, H. pylori P12Δ1191, unable to bind TFF1, is not affected by copper levels in the culture medium. Parallel experiments were carried out on mucus secreting HT29-E12 goblet cells, to compare and/or confirm the results obtained in AGS-AC1. The results show that also in HT29-E12 cells the H. pylori colonization follows a similar trend, increasing when incubated in the presence of Cu and decreasing after BCS treatment. The present work contributed interesting results in the field of the biochemistry of the epithelia, in the wake of the research in progress in our laboratory aimed at studying the biological activities of the newly identified metalloprotein Cu-TFF1, whose properties are still poorly characterized. On the basis of the previous structural pieces of evidence we observed that the protein level and the balance of its oligomeric forms can be affected and regulated by copper ions. In turn, this delicate equilibrium is able to affect the integrity and the rheological properties of the epithelial barrier, thus representing a fine tuner, or an Achille’s heel, through which pathogenic microrganisms and deregulated proliferation of neoplastic cells may take advantage for their invasiveness. The role of copper in the TFFs biochemistry represents a new finding in the puzzling and versatile functions of this interesting peptide family, whose thorough comprehension still reserves many questions and surprises. [edited by author]
IX n.s.

Le prime applicazioni industriali di enzimi risalgono a più di cento anni fa. Tuttavia, è solo negli ultimi 50 anni che, grazie all’avvento delle tecnologie del DNA ricombinante, il loro impiego ha subito una forte crescita in moltissimi settori industriali. In particolar modo, grazie alle loro interessanti proprietà, gli enzimi stanno trovando grande impiego in campo medico, principalmente nella diagnostica e nel trattamento di un sempre crescente numero di patologie. Lo scopo di questa tesi è quello di studiare l’elevata specificità di substrato di un enzima umano PLP-dipendente, detto O-fosfoetanolamina fosfo-liasi (ETNPPL), per lo sviluppo di un’applicazione diagnostica. ETNPPL catalizza una reazione irreversibile in cui si ha la degradazione della fosfoetanolamina (PEA) con formazione di acetaldeide, ioni fosfato e ammonio. La caratterizzazione fisico-chimica di questo enzima, già riportata in letteratura, suggerisce un meccanismo di azione simile a quello di altri enzimi PLP-dipendenti. Tale ipotesi implica che nel sito attivo dell’enzima siano presenti gli stessi residui aminoacidici. Tuttavia, ad oggi, una conferma di questa ipotesi mediante caratterizzazione strutturale non è stata ancora ottenuta. Il primo obiettivo di questo lavoro di tesi è stato quello di ottenere la struttura tridimensionale ad alta risoluzione dell’enzima umano ETNPPL attraverso cristallografia ai raggi-X. Per questo scopo, è stato effettuato il clonaggio del gene codificante per la ETNPPL umana all’interno di un vettore che ha permesso l’espressione eterologa dell’enzima in cellule di E.coli. L’enzima così prodotto è stato purificato mediante cromatografia in fase liquida e, una volta testata la sua attività enzimatica, è stato cristallizzato per gli esperimenti di cristallografia ai raggi-X. La struttura 3D dell’enzima ETNPPL è stata infine determinata con una risoluzione di 2.3 Å. Una volta razionalizzata l’elevata specificità dell’enzima per il suo substrato naturale, la fosfo- etanolamina (PEA), si è deciso di studiarne un’applicazione pratica tramite la progettazione e lo sviluppo di un biosensore in grado di rilevare selettivamente la PEA in campioni di urina. L’analisi si colloca in un più ampio contesto legato allo screening del tumore alla prostata che, ad oggi, viene effettuato utilizzando principalmente il test della PSA. Dal momento che livelli elevati di PSA possono essere rinvenuti anche in presenza di altre patologie, il test della PSA comporta un alto numero di falsi positivi. Per questo motivo appare evidente la necessità di ricercare nuovi biomarkers del tumore alla prostata, che siano in grado di aumentare l’attendibilità dei risultati dello screening, eventualmente anche supportando il test della PSA. Recentemente la PEA è stata indicata come possibile biomarker del tumore alla prostata. I livelli di PEA nelle urine di pazienti affetti da questo tumore risultano infatti significativamente inferiori rispetto a quelli delle persone sane. Di conseguenza, un metodo rapido e quantitativo per l’identificazione di PEA nelle urine, basato sull’affinità dell’enzima ETNPPL per il suo substrato naturale, potrebbe essere particolarmente rilevante per la diagnosi della malattia e, al tempo stesso potrebbe essere utilizzato come metodo per validare la PEA come biomarker del tumore alla prostata.
Enzymes have been used in many productive sectors for more than a hundred years. However, over the last 50 years, since the advent of recombinant DNA technologies, they have found a much wider and diverse range of applications, spanning across virtually any kind of human activities. In particular, because of their remarkable properties, enzymes have become the major choice for medical diagnostic applications and are being increasingly utilized for both the detection and the treatment of a broad variety of diseases. The purpose of this thesis is to study and exploit the high substrate specificity of a very peculiar human PLP-dependent enzyme, named O-phosphoethanolamine phospho-lyase (ETNPPL), for diagnostic applications. The enzyme promotes the irreversible degradation of O-phosphoethanolamine (PEA) to acetaldehyde, phosphate and ammonia. The physico-chemical characterization of ETNPPL reported in the literature suggests a mechanism of action that is very similar to other PLP-dependent enzymes, implying that the same residues are present in the active site. However, a structural characterization of human ETNPPL has not yet been reported in the literature. The first issue that I addressed in this thesis was to obtain the high-resolution 3D-structure of ETNPPL by X-ray crystallography in order to validate the mechanism of action proposed in the literature. To this end, starting from the cloning of the DNA fragment encoding for the human ETNPPL into a suitable expression vector, I expressed and purified the human ETNPPL. After assessing the enzymatic activity of the purified protein sample, I carried out crystallization experiments and I obtained good quality crystals for X-ray data collection. I determined the 3D-structure of ETNPPL at 2.3 Å resolution. Once I have completed the structural characterization of the enzyme and I have fully rationalized its high substrate specificity for phosphoethanolamine (PEA), its natural substrate, I set out to investigate one of its possible practical applications by designing and working towards the development of a biosensor for the selective detection of PEA in the urine. PEA levels in the urine of prostate cancer patients have been reported to decrease relative to healthy patients. Therefore, an ETNPPL-based assay for the measurement of PEA concentrations would be most useful in prostate cancer screening. To date, the early detection of prostate cancer involves the prostate-specific antigen (PSA) blood test. However, this approach is known to produce high rates of false positive results since increased PSA levels are often found in men with benign prostatic hyperplasia (BPH), prostatitis and prostate injury. For this reason, the need for new biomarkers that can be used for diagnostic purposes either alone or in combination with standard PSA tests appears evident. A method for the rapid and quantitative detection of this analyte would be of relevance for the diagnosis of such disease and, at the same time, would represent a potent validation tool of PEA as a prostate cancer biomarker.

L’enzima nicotinato fosforibosiltranferasi (NaPRT), coinvolto nella prima reazione della via di Preiss-Handler per la biosintesi della nicotinammide adenindinucleotide (NAD), catalizza la conversione del nicotinato (Na) in Na mononucleotide (NaMN). L’importanza della NaPRT nel metabolismo del NAD è dimostrato dal fatto che, nelle cellule renali embrionali umane, l’aggiunta di Na aumenta sensibilmente il livello intracellulare di NAD, che non mostra un’inibizione a feedback nei confronti dell’enzima (1). Viene qui descritta la caratterizzazione enzimatica della NaPRT umana. La proteina è stata espressa nelle cellule BL21 (DE3) di Escherichia coli e purificata in omogeneità con cromatografia di affinità tramite resina Ni-NTA. Sono stati successivamente determinati i principali parametri cinetici della NaPRT. L’enzima segue una cinetica del tipo Michaelis-Menten con un meccanismo di reazione random. Inoltre, la Km del Na e il PRPP è risultata essere di 44 e 22 M, rispettivamente e la Vmax ha un valore di 0,012 U/mg, anche se in presenza di Pi aumenta fino a 0,3 U/mg. L’ATP sembra svolgere un duplice effetto sull’enzima: a basse concentrazioni di substrato (fino a 80 M) ha un effetto di stimolazione dell’attività, mentre a concentrazioni saturanti dei substrati (1 mM) il nucleotide funge da inibitore. Oltre alla caratterizzazione cinetica, è stato investigato l’effetto di vari metaboliti sull’attività della NaPRT. Come atteso, NAD e NaAD, insieme a NMN e NaMN, non hanno effetto sull’enzima, mentre il piruvato e il diidrossiacetonfosfato producono un effetto stimolatorio. Al contrario, numerosi metaboliti coinvolti nel metabolismo del glucosio e degli acidi grassi inibiscono l’enzima, facendo ipotizzare una regolazione in vivo della sintesi del NAD dipendente dalla NaPRT da parte di questi composti. Inoltre, per meglio comprendere il ruolo di residui altamente conservati all’interno della struttura primaria della proteina, sono stati effettuati studi di mutagenesi sito-diretta. Si è determinato che, le mutazioni che hanno coinvolto i residui situati nel dominio / barrel dell’enzima, diminuiscono fortemente l’attività enzimatica, se confrontata con i valori della proteina wild-type. La NaPRT umana è stata inoltre co-cristallizzata in presenza dell’inibitore enzimatico Acetil-CoA, usando come principale precipitante PEG 4000. I cristalli ottenuti utilizzando radiazioni al sincrotrone all’ ESRF (Grenoble, Francia) mostrano diffrazione con una risoluzione maggiore di 3.0 Å e sono in corso studi di ottimizzazione per ottenere cristalli utili per la determinazione cristallografica. In attesa dell’ottenimento della struttura cristallografica, è stata predetta la struttura 3D dell’enzima attraverso l’homology modeling ed il modello ottenuto è stato utilizzato per condurre simulazioni di docking molecolare al fine di identificare i residui coinvolti nel riconoscimento e nella stabilizzazione dei ligandi.
Nicotinate phosphoribosyltransferase (NaPRT) catalyzes the conversion of nicotinate (Na) to Na mononucleotide (NaMN), the first reaction of the Preiss-Handler pathway for the biosynthesis of nicotinamide adenine dinucleotide (NAD). The importance of NaPRT in NAD metabolism is demonstrated by the fact that, in human embryonic kidney cells, the addition of Na considerably increases NAD levels, which do not show feedback inhibition effect on the enzyme (1). Here we describe the enzymatic characterization of human NaPRT. The protein was expressed in E. coli BL21(DE3) cells and purified to homogeneity by Ni-NTA resin affinity chromatography. The principal kinetic parameters of human NaPRT were determined. It was found that the enzyme followed a Michaelis-Menten kinetic with a random bireactant mechanism, and the Km for Na and PRPP were 44 μM and 22 μM, respectively. The Vmax was attested to be 0.013 U/mg, although in presence of Pi this value increased to 0.3 U/mg. Interestingly, ATP had a stimulation effect on enzymatic activity only at low substrates concentration, whereas at higher substrates concentration (1 mM), it showed an inhibitory effect. In addition to the kinetic characterization, the effect of several metabolites on NaPRT activity was investigated. As expected, NAD and NaAD, in addition to NMN and NaMN, had no effect on the enzyme activity, whereas piruvate and dihydroxyacetone phosphate showed a stimulation effect. On the contrary, several metabolites involved in the glucose or fatty acid metabolism significantly inhibited the enzyme, leading to hypothesize an in vivo NaPRT-depending regulation of NAD synthesis by these compounds. In addition, site-directed mutagenesis experiments were performed to elucidate the role of highly conserved residues. We determined that mutations, which involved residues localized in the / barrel domain of the protein, sensibly lowered the activity of the enzyme with respect of the wild-type protein. Human NaPRT was co-crystallized in presence of the potent enzyme inhibitor Acetyl-CoA using PEG 4000 as the major precipitant. The resulting crystals showed diffraction up to 3.0 Å resolution using synchrotron radiation at the ESRF, Grenoble France and are currently being optimised to undertake crystal structure determination. Finally, the 3D structure of the enzyme was predicted by homology modeling and used to carry out molecular docking simulations in order to identify the residues involved in the recognition and stabilization of ligands

The hemoglobin is a very important protein that in vertebrates binds reversibly the oxygen and transport it to the tissue through the circulatory sistem. The aim of this study is to contribute to the knowledge of structural-functional relationship of the hemoglobin molecule through structural and funcional characterisation of human hemoglobins natural variants and those present in different animal species. We report the identification and characterisation of two new hemoglobin variant, never described before, that we have named HbF-Monserrato-Sassari [Gγ93(F9) Cys Arg] and Hb Roma [β115(G17)Ala Val], and the hemoblobin systems of two species of fish, Mugil cephalus and Ophisurus serpens. HbF-Monserrato-Sassari [Gγ93(F9) Cys Arg] is an abnormal fetal hemoglobin observed in an apparently normal newborn baby during an hemoglobinopathies survey at birth in North Sardinian population. Sequencing of the γ globin genes revealed the TGT CGT transition at codon 93 in one of the two Gγ genes which causes the Arg for Cys amino acid replacement at position 93. The substitution was confirmed by mass spectrometric analysis which confirmed the presence of an additional Gγ chain whose mass value corresponds to the Arg Cys substitution already observed at the DNA level. Since modifications or substitutions at position β93 of HbA are known to affect the arrangement of a salt bridge at the α1β2 sliding contacts that are crucial for subunit cooperativity, the functional properties of the HbF-Monserrato-Sassari variant were analyzed to evaluate the effect of the substitution at the same position of the Gγ chain. The data indicate that substitution Cys Arg causes a significant increase in oxygen affinity and a slight decrease of both Bohr effect and cooperativity, with respect of normal HbF, indicating that Cys γ93 plays a key role for subunit cooperativity in the T R transition of the HbF tetramer. Since studies had shown that nitric oxide, the most important vasodilator agent, in the erytrocytes interacts in part with Cys β93 residues as S-nitrosohemoglobin (SNO-Hb), this variant, because of the loss of Cys γ93 residue, is considered to be potentially compromised in nitric oxide transport. Hb Roma [β115(G17)Ala Val] is an abnormal adult hemoglobin found in a 33- year-hold woman of Central Italian descent. We studied this previously uncharacterised variant because the β115(G17)Ala Val replacement occurs at the α1β1 (or α2β2) interface of the Hb molecule and then provides the opportunity to study how β115(G17)Ala Val substitution could perturb the hemoglobin structure and alter its function. Sequencing of the β-globin gene revealed the GCC GTC transition at codon 115 which causes the substitution of Ala, normally present at position β115, with Val. The substitution was confirmed by mass spectrometric analysis of the globins and tryptic peptides. The oxygen-binding properties, carried out on the mixture HbA/Hb Roma as the variant tetramer is undistinguishable by usual separation procedures, showed a significant increase in oxygen affinity with respect to normal HbA, both in the absence and presence of 2,3- bisphosphoglycerate. With regard to the two species of fish, Mugil cephalus and Ophisurus serpens, it is known that among the vertebrates, fish display the most extensive presence of multiple Hb components, which show considerable differences in amino acid sequence. These structural differences are often responsible for different functional properties. In the case of Mugil cephalus structural and functional characterisations of its hemoglobin system showed two major hemoglobins: HbI and HbII, which have the same functional properties, while hemoglobin system of O. serpens showed at least four anodic (isoelectric points, pI < 8) and one cathodic (pI > 8) components, which have different functional properties: the cathodic Hb may safeguard oxygen uptake under hypoxic and acidotic conditions, the anodic Hbs may be involved in pumping O2 in the swim bladder in order to maintain the neutral buoyancy of the fish. The natural hemoglobin variants are very important to evaluate how an amino acid replacement could perturb the hemoglobin molecule and alter its function, whereas the comparative analysis between hemoglobins of different species allows to verify how this protein might have changed during evolution in relation with the different physiological and habitat needs.

2013/2014
RecQ helicases belong to a ubiquitous family of DNA unwinding enzymes that are essential to maintain genome stability by acting at the interface between DNA replication, recombination and repair. Humans have five different paralogues of RecQ helicases namely RecQ1, BLM, WRN, RecQ4 and RecQ5. This work focuses on the structural and biochemical study of human RecQ4. Germ-line mutations in the RECQ4 gene give rise to three distinct human genetic disorders (Rothmund-Thomson, RAPADILINO and Baller-Gerold syndromes). Despite the important roles of RecQ4 in various cellular processes, RecQ4 have never been fully characterized. In addition to the helicase domain, RecQ4 has a unique N-terminal part that is essential for viability and is constituted by a region homologous to the yeast Sld2 replication initiation factor, followed by a cysteine-rich region, predicted to fold as a Zn knuckle. A part of this work focuses on the structural and biochemical analysis of both the human and Xenopus RecQ4 cysteine-rich regions, and shows by NMR spectroscopy that the Xenopus fragment does indeed assumes the canonical Zn knuckle fold, whereas the human sequence remains unstructured, consistent with the mutation of one of the Zn ligands. Both the human and Xenopus Zn knuckles bind to a variety of nucleic acid substrates, with a preference for RNA. We also investigated the effect of an additional Sld2 homologous region upstream the Zn knuckle. In both the human and Xenopus system, the presence of this region strongly enhances binding to nucleic acids. These results reveal novel possible roles of RecQ4 in DNA replication and genome stability. Recently the catalytic core of RecQ4 has been predicted to include RecQ-like-C-terminal (RQC) domain at the C-terminus of the helicase domain, similar to other RecQ helicases. This domain is composed of a Zn-binding region and a winged helix (WH) domain. Another part of this thesis centers on the structural and biochemical characterization of the catalytic core of RecQ4 including the helicase and RQC domain. The results provide an insight in the Zn binding ligands present in the RQC domain that plays a role in DNA binding and unwinding activity of the protein. Also the presence of the characteristic aromatic residue at the tip of the WH β hairpin and its role in DNA binding and unwinding has been established. Finally, it provides a low resolution SAXS model of the catalytic core of RecQ4.
Elicasi RecQ appartengono a una famiglia ubiquitaria di DNA svolgimento enzimi che sono essenziali per mantenere la stabilità del genoma agendo all'interfaccia tra replicazione del DNA, ricombinazione e riparazione. Gli esseri umani hanno cinque diversi paralogues di RecQ elicasi cioè RecQ1, BLM, WRN, RecQ4 e RecQ5. Questo lavoro si concentra sullo studio strutturale e biochimica di RecQ4 umana. Mutazioni germinali nel gene RECQ4 danno luogo a tre malattie genetiche umane distinte (Rothmund-Thomson, RAPADILINO e sindromi Baller-Gerold). Nonostante i ruoli importanti di RecQ4 in diversi processi cellulari, RecQ4 non sono mai stati pienamente caratterizzato. In aggiunta al dominio elicasi, RecQ4 ha una parte unica N-terminale che è essenziale per la vitalità ed è costituito da una regione omologa al lievito Sld2 fattore di iniziazione replica, seguita da una regione ricca di cisteina, previsto per piegare come stinco Zn . Una parte di questo lavoro si concentra sull'analisi strutturale e biochimica sia della regioni ricche di cisteina Xenopus RecQ4 umana e, e spettacoli di spettroscopia NMR che il frammento Xenopus effettivamente assume la canonica Zn nocca volte, mentre la sequenza di resti umani non strutturato, coerente con la mutazione di uno dei ligandi Zn. Sia il nocche Xenopus Zn umana e si legano ad una varietà di substrati di acido nucleico, con una preferenza per l'RNA. Abbiamo anche studiato l'effetto di un ulteriore regione omologa Sld2 monte la nocca Zn. Sia il sistema Xenopus umano e, la presenza di questa regione migliora fortemente legame ad acidi nucleici. Questi risultati rivelano possibili ruoli nuovi di RecQ4 nella replicazione del DNA e la stabilità del genoma. Recentemente il nucleo catalitico di RecQ4 stato previsto per includere RecQ-like-C-terminale (RQC) dominio al C-terminale del dominio elicasi, simile ad altri elicasi RecQ. Questo dominio è costituito da una regione-Zn vincolanti e un'elica alato (WH) dominio. Un'altra parte di questa tesi incentrata sulla caratterizzazione strutturale e biochimica del nucleo catalitico della RecQ4 compreso il elicasi e il dominio RQC. I risultati forniscono una descrizione nel Zn ligandi presenti nel dominio RQC che svolge un ruolo nel legame al DNA e l'attività svolgimento della proteina legante. Inoltre è stata stabilita la presenza della caratteristica residuo aromatico sulla punta della forcella WH β e il suo ruolo nel legame al DNA e di svolgimento. Infine, esso fornisce una bassa risoluzione SAXS modello del nucleo catalitico di RecQ4.
XXVII Ciclo
1985

La catena respiratoria mitocondriale è principalmente costituita da proteine integrali della membrana interna, che hanno la capacità di accoppiare il flusso elettronico, dovuto alle reazioni redox che esse catalizzano, al trasporto di protoni dalla matrice del mitocondrio verso lo spazio intermembrana. Qui i protoni accumulati creano un gradiente elettrochimico utile per la sintesi di ATP ad opera dell’ATP sintasi. Nonostante i notevoli sviluppi della ricerca sulla struttura e sul meccanismo d’azione dei singoli enzimi della catena, la sua organizzazione sovramolecolare, e le implicazioni funzionali che ne derivano, rimangono ancora da chiarire in maniera completa. Da questa problematica trae scopo la presente tesi volta allo studio dell’organizzazione strutturale sovramolecolare della catena respiratoria mediante indagini sia cinetiche che strutturali. Il modello di catena respiratoria più accreditato fino a qualche anno fa si basava sulla teoria delle collisioni casuali (random collision model) che considera i complessi come unità disperse nel doppio strato lipidico, ma collegate funzionalmente tra loro da componenti a basso peso molecolare (Coenzima Q10 e citocromo c). Recenti studi favoriscono invece una organizzazione almeno in parte in stato solido, in cui gli enzimi respiratori si presentano sotto forma di supercomplessi (respirosoma) con indirizzamento diretto (channeling) degli elettroni tra tutti i costituenti, senza distinzione tra fissi e mobili. L’importanza della comprensione delle relazioni che si instaurano tra i complessi , deriva dal fatto che la catena respiratoria gioca un ruolo fondamentale nell’invecchiamento, e nello sviluppo di alcune malattie cronico degenerative attraverso la genesi di specie reattive dell’ossigeno (ROS). E’ noto, infatti, che i ROS aggrediscono, anche i complessi respiratori e che questi, danneggiati, producono più ROS per cui si instaura un circolo vizioso difficile da interrompere. La nostra ipotesi è che, oltre al danno a carico dei singoli complessi, esista una correlazione tra le modificazioni della struttura del supercomplesso, stress ossidativo e deficit energetico. Infatti, la dissociazione del supercomplesso può influenzare la stabilità del Complesso I ed avere ripercussioni sul trasferimento elettronico e protonico; per cui non si può escludere che ciò porti ad un’ulteriore produzione di specie reattive dell’ossigeno. I dati sperimentali prodotti a sostegno del modello del respirosoma si riferiscono principalmente a studi strutturali di elettroforesi su gel di poliacrilammide in condizioni non denaturanti (BN-PAGE) che, però, non danno alcuna informazione sulla funzionalità dei supercomplessi. Pertanto nel nostro laboratorio, abbiamo sviluppato una indagine di tipo cinetico, basata sull’analisi del controllo di flusso metabolico,in grado di distinguere, funzionalmente, tra supercomplessi e complessi respiratori separati. Ciò è possibile in quanto, secondo la teoria del controllo di flusso, in un percorso metabolico lineare composto da una serie di enzimi distinti e connessi da intermedi mobili, ciascun enzima esercita un controllo (percentuale) differente sull’intero flusso metabolico; tale controllo è definito dal coefficiente di controllo di flusso, e la somma di tutti i coefficienti è uguale a 1. In un supercomplesso, invece, gli enzimi sono organizzati come subunità di una entità singola. In questo modo, ognuno di essi controlla in maniera esclusiva l’intero flusso metabolico e mostra un coefficiente di controllo di flusso pari a 1 per cui la somma dei coefficienti di tutti gli elementi del supercomplesso sarà maggiore di 1. In questa tesi sono riportati i risultati dell’analisi cinetica condotta su mitocondri di fegato di ratto (RLM) sia disaccoppiati, che accoppiati in condizioni fosforilanti (stato 3) e non fosforilanti (stato 4). L’analisi ha evidenziato l’associazione preferenziale del Complesso I e Complesso III sia in mitocondri disaccoppiati che accoppiati in stato 3 di respirazione. Quest’ultimo risultato permette per la prima volta di affermare che il supercomplesso I+III è presente anche in mitocondri integri capaci della fosforilazione ossidativa e che il trasferimento elettronico tra i due complessi possa effettivamente realizzarsi anche in condizioni fisiologiche, attraverso un fenomeno di channeling del Coenzima Q10. Sugli stessi campioni è stata eseguita anche un analisi strutturale mediante gel-elettroforesi (2D BN/SDS-PAGE) ed immunoblotting che, oltre a supportare i dati cinetici sullo stato di aggregazione dei complessi respiratori, ci ha permesso di evidenziare il ruolo del citocromo c nel supercomplesso, in particolare per il Complesso IV e di avviare uno studio comparativo esteso ai mitocondri di cuore bovino (BHM), di tubero di patata (POM) e di S. cerevisiae.

La catena respiratoria mitocondriale è principalmente costituita da proteine integrali della membrana interna, che hanno la capacità di accoppiare il flusso elettronico, dovuto alle reazioni redox che esse catalizzano, al trasporto di protoni dalla matrice del mitocondrio verso lo spazio intermembrana. Qui i protoni accumulati creano un gradiente elettrochimico utile per la sintesi di ATP ad opera dell’ATP sintasi. Nonostante i notevoli sviluppi della ricerca sulla struttura e sul meccanismo d’azione dei singoli enzimi della catena, la sua organizzazione sovramolecolare, e le implicazioni funzionali che ne derivano, rimangono ancora da chiarire in maniera completa. Da questa problematica trae scopo la presente tesi volta allo studio dell’organizzazione strutturale sovramolecolare della catena respiratoria mediante indagini sia cinetiche che strutturali. Il modello di catena respiratoria più accreditato fino a qualche anno fa si basava sulla teoria delle collisioni casuali (random collision model) che considera i complessi come unità disperse nel doppio strato lipidico, ma collegate funzionalmente tra loro da componenti a basso peso molecolare (Coenzima Q10 e citocromo c). Recenti studi favoriscono invece una organizzazione almeno in parte in stato solido, in cui gli enzimi respiratori si presentano sotto forma di supercomplessi (respirosoma) con indirizzamento diretto (channeling) degli elettroni tra tutti i costituenti, senza distinzione tra fissi e mobili. L’importanza della comprensione delle relazioni che si instaurano tra i complessi , deriva dal fatto che la catena respiratoria gioca un ruolo fondamentale nell’invecchiamento, e nello sviluppo di alcune malattie cronico degenerative attraverso la genesi di specie reattive dell’ossigeno (ROS). E’ noto, infatti, che i ROS aggrediscono, anche i complessi respiratori e che questi, danneggiati, producono più ROS per cui si instaura un circolo vizioso difficile da interrompere. La nostra ipotesi è che, oltre al danno a carico dei singoli complessi, esista una correlazione tra le modificazioni della struttura del supercomplesso, stress ossidativo e deficit energetico. Infatti, la dissociazione del supercomplesso può influenzare la stabilità del Complesso I ed avere ripercussioni sul trasferimento elettronico e protonico; per cui non si può escludere che ciò porti ad un’ulteriore produzione di specie reattive dell’ossigeno. I dati sperimentali prodotti a sostegno del modello del respirosoma si riferiscono principalmente a studi strutturali di elettroforesi su gel di poliacrilammide in condizioni non denaturanti (BN-PAGE) che, però, non danno alcuna informazione sulla funzionalità dei supercomplessi. Pertanto nel nostro laboratorio, abbiamo sviluppato una indagine di tipo cinetico, basata sull’analisi del controllo di flusso metabolico,in grado di distinguere, funzionalmente, tra supercomplessi e complessi respiratori separati. Ciò è possibile in quanto, secondo la teoria del controllo di flusso, in un percorso metabolico lineare composto da una serie di enzimi distinti e connessi da intermedi mobili, ciascun enzima esercita un controllo (percentuale) differente sull’intero flusso metabolico; tale controllo è definito dal coefficiente di controllo di flusso, e la somma di tutti i coefficienti è uguale a 1. In un supercomplesso, invece, gli enzimi sono organizzati come subunità di una entità singola. In questo modo, ognuno di essi controlla in maniera esclusiva l’intero flusso metabolico e mostra un coefficiente di controllo di flusso pari a 1 per cui la somma dei coefficienti di tutti gli elementi del supercomplesso sarà maggiore di 1. In questa tesi sono riportati i risultati dell’analisi cinetica condotta su mitocondri di fegato di ratto (RLM) sia disaccoppiati, che accoppiati in condizioni fosforilanti (stato 3) e non fosforilanti (stato 4). L’analisi ha evidenziato l’associazione preferenziale del Complesso I e Complesso III sia in mitocondri disaccoppiati che accoppiati in stato 3 di respirazione. Quest’ultimo risultato permette per la prima volta di affermare che il supercomplesso I+III è presente anche in mitocondri integri capaci della fosforilazione ossidativa e che il trasferimento elettronico tra i due complessi possa effettivamente realizzarsi anche in condizioni fisiologiche, attraverso un fenomeno di channeling del Coenzima Q10. Sugli stessi campioni è stata eseguita anche un analisi strutturale mediante gel-elettroforesi (2D BN/SDS-PAGE) ed immunoblotting che, oltre a supportare i dati cinetici sullo stato di aggregazione dei complessi respiratori, ci ha permesso di evidenziare il ruolo del citocromo c nel supercomplesso, in particolare per il Complesso IV e di avviare uno studio comparativo esteso ai mitocondri di cuore bovino (BHM), di tubero di patata (POM) e di S. cerevisiae.