Dissertations / Theses on the topic 'Biotechnological potential'

Mestrado em Biologia Molecular e Celular
Marine sponges harbor microbial communities of immense ecological and biotechnological importance. Recently, they have been focus of heightened attention due to the wide range of biologically active compounds with potential application, particularly, in chemical, cosmetic and pharmaceutical industries. However, we still lack fundamental knowledge of their microbial ecology and biotechnological potential. The development of high-throughput sequencing technologies has given rise to a new range of tools that can help us explore the biotechnological potential of sponges with incredible detail. Metagenomics, in particular, has the power to revolutionize the production of bioactive compounds produced by unculturable microorganisms. It can offer the identification of biosynthetic genes or gene clusters that can be heterologously expressed on a cultivable and suitable host. This review focus on the exploration of the biotechnological potential of sponge-associated microorganisms, and integration of molecular approaches, whose increasing efficiency can play an essential role on achieving a sustainable source of natural products.
As esponjas marinhas abrigam comunidades microbianas de grande importância ecológica e biotecnológica. Recentemente, estas têm recebido maior atenção devido ao grande número de compostos com actividade biológica, com potencial aplicação, particularmente, nas indústrias química, cosmética e farmacêutica. No entanto, a ecologia e o potencial biotecnológico dos seus microrganismos ainda permanecem largamente desconhecidos. O desenvolvimento de tecnologias de sequenciação de alta resolução deu origem a novo grupo de abordagens que nos podem ajudar a explorar o potencial biotecnológico das esponjas com um detalhe sem precedentes. As abordagens metagenómicas, em particular, tem poder para revolucionar a produção de compostos com actividade biológica produzidos por microrganismos não cultiváveis, ao permitir a identificação de genes ou clusters de genes biosintéticos com capacidade para serem expressos heterologamente num organismo hospedeiro adequado e cultivável. Esta revisão foca particularmente a exploração do potencial biotecnológico dos microrganismos associados a esponjas, e a integração de abordagens moleculares, cuja eficiência crescente pode desempenhar um papel essencial no desenvolvimento de uma fonte sustentável de produtos naturais.

Submitted by Alison Vanceto (alison-vanceto@hotmail.com) on 2017-08-08T16:54:32Z No. of bitstreams: 1 TeseAEM.pdf: 3699711 bytes, checksum: 3b2fdf705faaa9314eeacec123aa76fd (MD5)
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Made available in DSpace on 2017-08-08T17:38:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseAEM.pdf: 3699711 bytes, checksum: 3b2fdf705faaa9314eeacec123aa76fd (MD5) Previous issue date: 2017-06-09
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)
In aquatic environments, phytoplankton consists mostly of photosynthetic microorganisms that serve as the basis of food chains. However, besides photoautotrophy, it is widely reported in the literature that many microalgae can take up dissolved organic matter present in the environment concomitantly with the photosynthesis, a metabolic pathway known as mixotrophy. Little is known about the ecophysiology of mixotrophy in microalgae, and almost all studies are focused on the use of this metabolic pathway to increase the production of algal biomass and stimulate the production of specific biomolecules. Another important issue, considering the current anthropic activity, is that most of the contaminants eliminated in aquatic environments, such as metals and nanoparticles, affect the phytoplankton. However, so far, no ecotoxicological study involving mixotrophic metabolism was found in the literature. To better understand mixotrophy in microalgae, this work chose the chlorophycean freshwater Chlorella sorokiniana as test organism. We divided the study into two parts: the first focused on the physiological/biotechnological interest through the study of growth, photosynthetic parameters, changes in cellular volume, and production of biomolecules (proteins, carbohydrates and lipids); the second part focused on the ecotoxicological effects of cadmium (Cd) and titanium dioxide nanoparticles (NPs-TiO2). To stimulate mixotrophy, glucose (1.0 g.L-1 or 5 x 10-3 mol.L-1) was used as the organic carbon source. The results showed that during mixotrophy, the microalga C. sorokiniana presented higher population growth and production of biomolecules, such as chlorophyll a and lipids, when compared to photoautotrophic cultures. It was also observed that the photosynthetic parameters were affected by mixotrophy, although they did not interfere in the growth of the microalga, and that the presence of bacteria in the cultures acted as a stimulant factor in the production of algal biomass. Regarding the ecotoxicological effects of contaminants, microalgae in mixotrophy were more resistant to both Cd and NPs-TiO2 than those in photoautotrophy, but with changes in the biochemical composition what can affected the energy transfer in the environment. In general, we can conclude that mixotrophy should be considered in studies with phytoplankton, since aquatic environments present a myriad of organic carbon that can be used by these microorganisms. As general conclusions, we can mention that organic carbon acted as an extra source of structural carbon and energy for microalgae, not necessarily relying solely on photosynthesis to survive, so stimulating the growth and production of biomolecules of biotechnological interest, and increased cellular viability in environments contaminated with metals and nanoparticles. This study is a contribution to the understanding of mixotrophy and photoautotrophy metabolisms in a freshwater Chlorophyta with biotechnological potential.
Nos ambientes aquáticos, o fitoplâncton é formado basicamente de microrganismos fotossintetizantes que servem como base das cadeias alimentares. Entretanto, além da fotoautotrofia, é vastamente citado na literatura que muitas microalgas alimentam-se de matéria orgânica dissolvida presente no ambiente concomitantemente à realização da fotossíntese, uma via metabólica conhecida como mixotrofia. Sabe-se pouco sobre a ecofisiologia em metabolismo mixotrófico nas microalgas, sendo os estudos, em sua quase totalidade, voltados ao uso dessa via metabólica para aumentar a produção de biomassa algal e estimular a produção de biomoléculas específicas. Outra questão importante, considerando a atividade antrópica atual, é que a maioria dos contaminantes eliminados nos ambientes aquáticos, como metais e nanopartículas, são estudados em fitoplâncton sob metabolismo fotoautotrófico, não sendo encontrados trabalhos ecotoxicológicos envolvendo o metabolismo mixotrófico na literatura. Para entender melhor o metabolismo algal em mixotrofia, este trabalho escolheu a microalga Chlorophyta de água doce Chlorella sorokiniana como organismo-teste. Para melhor organizá-lo, foi dividido em duas partes: a primeira focou no interesse fisiológico/biotecnológico através do estudo do crescimento, parâmetros fotossintéticos, volume celular, e produção de biomoléculas (proteínas, carboidratos e lipídeos); a segunda parte focou nos efeitos ecotoxicológicos de cádmio (Cd) e de nanopartículas de dióxido de titânio (NPs-TiO2). Para estimular a mixotrofia, glicose (1.0 g.L-1 ou 5 x 10-3 mol.L-1) foi utilizada como fonte de carbono orgânico. Os resultados mostraram que durante a mixotrofia, a microalga C. sorokiniana apresentou maiores crescimento populacional e produção de biomoléculas, como clorofila a e lipídeos, quando comparada com as culturas em fotoautotrofia. Também foi observado que os parâmetros fotossintéticos foram afetados em mixotrofia, porém não interferindo no crescimento da microalga, e que a presença de bactérias pode ter atuado como fator estimulante na produção de biomassa algal. Em relação aos efeitos ecotoxicológicos dos contaminantes, as microalgas em mixotrofia foram mais resistentes tanto ao Cd quanto às NPs-TiO2 do que em fotoautotrofia, porém com mudanças na composição bioquímica, podendo afetar a transferência de energia nos ecossistemas aquáticos. De modo geral, podemos concluir que a mixotrofia deve ser considerada em estudos com fitoplâncton, visto que os ambientes aquáticos apresentam uma miríade de fontes de carbono orgânico para esses microrganismos. Na mixotrofia, o carbono orgânico funciona como uma fonte extra de carbono estrutural e de energia para as microalgas, não dependendo obrigatoriamente somente da fotossíntese para sobreviver, estimulando o crescimento e produção de biomoléculas de interesse biotecnológico, além de aumentar a viabilidade celular em ambientes contaminados tanto com Cd quanto com NPs-TiO2. Este estudo é uma contribuição ao entendimento dos metabolismos mixotróficos e fotoautotróficos em uma Chlorophyta de água doce com potencial biotecnológico.
CNPq: 302175/2015-6
FAPESP: 2014/15894-0

Halophilic and halotolerant microorganisms are known to have numerous potential biotechnological applications, but to date, they have been largely underexploited in comparison to other extremophiles. The overall aim of the research presented within this thesis was to further investigate some of the biotechnologically useful products and processes that halophilic and halotolerant microorganisms are known to possess. Firstly, halotolerant bacterial isolates from a polluted marine environment were shown to be extremely tolerant to l-alkyl-3-methylimidazolium chloride ionic liquids, with much greater levels of tolerance to these compounds than has previously been reported for other microorganisms, and in addition, some of the isolates had the ability to biodegrade these compounds. This indicates that bacteria from the marine environment, due to their adaptation to salinity and the presence of hydrocarbons within this environment, would be highly suited to biological processes involving exposure to ionic liquids. Kilroot salt mine was investigated as a source of halophilic microorganisms as its culturable microbiome has never before been profiled; exploration of this environment indicated a great culturable biodiversity of both bacteria and archaea. The haloarchaeal isolates were shown to form biofilms, which enhanced the tolerance of the haloarchaea to an antimicrobial challenge. This is the first time this protective function ofhaloarchaeal biofilms has been demonstrated. Screening the isolates against a panel of antibiotics revealed an unexpectedly high level of natural resistance, indicating the presence of antimicrobial-producing microorganisms in the salt mine environment. To examine this further, organic extracts of each isolate from the mine were tested against a range of pathogenic bacteria, with approximately 40% displaying antimicrobial activities. One activity of particular interest was that of a haloarchaeal isolate of the genus Halorubrum, which exhibited both in vitro and in vivo antimicrobial and antibiofilm activity against P. aeruginosa. Whole genome sequence analysis of this isolate revealed further biotechnologically-important functions which provides numerous opportunities for additional studies, and reinforces the biotechnological potential of these organisms that is waiting to be exploited.

FundaÃÃo Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientifico e TecnolÃgico
Dental Caries is an infectious disease naturally multi-factorial that begins in the childhood, able to spread its intensity and prevalence according to the mouth ambient conditions of each host. The risk of the patients to develop, in some time of their lives, carious lesions can be measured through a complex analysis using health determinant factors and other specific factors of the health-disease process. Since the dental caries forward diagnostic as well as the review of the auxiliary determinant factors of the dental caries danger evaluation, the treatment becomes simpler, less invasive and costing lower. It has been quite broad-casted lately the use of lectins to diagnose and to prevent some diseases. When dealing with dental caries disease, through many years this strategy has been explored still inceptively. Looking through this perspective, the goal of this trial was to investigate the biotechnological potential of the red marine alga Hypnea musciformis (HML) applied to Dentistry. It is about an explanatory-experimental study of quantitative approach through the health questionnaire and data statistics analysis. The research makes reference to some comparative analysis of salivary tests and the cariogenic activity in twelve year-old students and it searches to evaluate the biotechnological potentialities of the lectin from the red marine alga Hypnea musciformis (HML) in the diagnose and prevention of the dental caries. The concentration area of this trial was the macromolecules/ lectin biotechnological application. In the present trial were compared obtained results through the application of the conventional clinical exams to dental caries and salivary tests of dental caries activity pointed by the CARIOGRAMÂ program in association with lab analysis using specific lectins. From this trial, it has been concluded that, about lectins as a biotechnological potential to prevention and diagnose of the dental caries, it has been noticed that there is recognition of resident glycoconjugate on pacifier saliva of high and low risk observed in immunofluorescence pattern. The results showed that the tested lectin has the capacity to intervene on the bacterial growth in a negative way, it is being distinguished statistically (p<0,01) in relation to control group of saline and BSA. However, inhibition studies of the microbial biofilms using the HML are being programmed to evaluate the using possibility of these protein as biotech input to be used for dental caries prevention. It could be said also that the obtained results by the use of HML in the antimicrobial activity were promising, showing that this lectin has presented antimicrobial activity even on very small amounts. As to the use of these protein in the biofilm formation and developing there was no characteristic pattern.
A cÃrie à uma doenÃa infecciosa de natureza multifatorial que se inicia na infÃncia, podendo aumentar de intensidade e prevalÃncia de acordo com as condiÃÃes do ambiente bucal de cada hospedeiro. O risco do paciente em desenvolver, em algum perÃodo de seu ciclo de vida, lesÃes cariosas pode ser medido atravÃs de uma anÃlise complexa que utiliza os fatores determinantes da saÃde e outros fatores especÃficos do processo saÃde-doenÃa. A partir do diagnÃstico precoce da doenÃa cÃrie, assim como anÃlise dos fatores determinantes auxiliares da avaliaÃÃo do risco de cÃrie, o tratamento torna-se mais simples, menos invasivo e de menor custo. Tem sido bastante difundida ultimamente a utilizaÃÃo de lectinas para diagnÃstico e prevenÃÃo de algumas doenÃas. Em se tratando da doenÃa cÃrie, ao longo de muitos anos, essa estratÃgia tem sido explorada ainda de forma incipiente. Nesta perspectiva, o objetivo deste trabalho foi investigar as potencialidades biotecnolÃgicas da lectina de alga marinha da espÃcie de Hypnea musciformis (HML) aplicadas à odontologia. Trata-se de um estudo explicativo-experimental de abordagem quantitativa atravÃs de questionÃrio de saÃde e anÃlises estatÃsticas de dados. A pesquisa faz referÃncia à uma anÃlise comparativa de testes salivares e atividade cariogÃnica em escolares de 12 anos de idade e a busca avaliar as potencialidades biotecnolÃgicas da lectina de alga marinha da espÃcie de Hypnea musciformis (HML) no diagnÃstico e prevenÃÃo de cÃrie dentÃria. A Ãrea de concentraÃÃo deste estudo MacromolÃtulas / AplicaÃÃo BiotecnolÃgica de Lectinas. No presente estudo, foram comparados os resultados obtidos atravÃs da aplicaÃÃo de exame clÃnico convencional para cÃrie e testes salivares de atividade cariogÃnica apontados pelo programa CARIOGRAM em associaÃÃo com anÃlises laboratoriais com a utilizaÃÃo de lectinas especÃficas. A partir deste estudo, concluiu-se que, em se tratando do uso de lectinas como potencial biotecnolÃgico para a prevenÃÃo e diagnÃstico de cÃrie dentÃria, percebeu-se que hà reconhecimento de glicoconjugados presentes na saliva de pacientes de alto e baixo risco observados em padrÃo de fluorescÃncia. Os resultados demonstram que a lectina testada tem a capacidade de interferir no crescimento bacteriano de forma negativa, sendo estatisticamente significante (p<0,01) em relaÃÃo aos grupos controle de salina e BSA. Entretanto estudos de inibiÃÃo da formaÃÃo de biofilmes microbianos utilizando a HML estÃo sendo programados, para assim avaliar a possibilidade de utilizaÃÃo dessas proteÃnas como insumos biotecnolÃgicos a ser utilizados para prevenÃÃo da cÃrie dentÃria. Pode-se ainda afirmar que os resultados obtidos pelo uso de HML na atividade antibacteriana foram promissores, mostrando que esta lectina apresentou atividade antibacteriana mesmo em quantidades muito pequenas. Quanto ao uso destas proteÃnas na formaÃÃo e desenvolvimento de biofilmes, nÃo houve padrÃo caracterÃstico.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-02-15Bitstream added on 2014-06-13T18:44:34Z : No. of bitstreams: 1 dayoowoyemi_i_dr_rcla.pdf: 2213436 bytes, checksum: 57ef54bb4924dae1b326ff6c146c0802 (MD5)
Atualmente, existe um crescente interesse em explorar diversos habitats, a fim de revelar a biodiversidade microbiana, incluindo as leveduras. Tal diversidade ainda não acessada guarda a descoberta de novas espécies para ciência, provavelmente muitas das quais com potencial para aproveitamento em processos biotecnológicos. Com o objetivo de explorar e conservar a diversidade de fungos, o Central de Recursos Microbianos da UNESP (CRM – UNESP) mantém em seu acervo várias estirpes de leveduras isoladas de ecossistemas diversos, sendo alguns deles pouco explorados. No início deste trabalho sabíamos que muitas das leveduras depositadas no acervo do CRM – UNESP não estavam totalmente caracterizadas tanto em nível taxonômico, quanto em relação ao potencial biotecnológico que poderiam apresentar. Portanto, o presente estudo foi desenhado para caracterizar e identificar taxonomicamente leveduras depositadas no CRM – UNESP, bem como selecionar estirpes que produzem enzimas extracelulares degradadoras de polissacarídeos como amilase, celulase, xilanase, pectinase e ligninase. Usando uma abordagem polifásica, um total de 340 isolados de leveduras foi identificado, sendo que 71,2% compreendem 43 taxa de ascomicetos e os restantes 28,8% foram classificados em 27 taxa de basidiomicetos. O estudo também levou à descoberta de 8 prováveis novas espécies. Baseado nesta constatação, a classificação taxonômica e análise filogenética foi realizada para duas espécies anamórficas de ascomicetos e uma espécie teleomórfica de basidiomiceto. A descrição destas três espécies é apresentada neste estudo. Os resultados demonstraram que Wickerhamiella kiyanii FB1-1DASPT e W. pindamonhangabaensis H10YT pertencem à clade Wickerhamiella da ordem Saccharomycetales...
In recent time, there has been an increasing interest in exploring diverse ecological habitats in order to reveal the yeast biodiversity. The increased awareness in the biotechnological potentials of yeasts has also spurred attempts to search for new species with novel biotechnological capabilities. Aiming to explore and conserve the fungal diversity from various ecosystems, the UNESP – Central for Microbial Resources (UNESP – CMR) harbors various strains of ecologically diverse yeasts isolates, some of which were yet to be identified. Therefore, this study was designed to identify and characterize some yeasts from the UNESP – MRC and to select strains possessing extracellular plant polysaccharide degrading enzymes namely amylase, cellulase, xylanase, pectinase and ligninase. Using a polyphasic approach, a total of 340 strains were identified. Taxonomic classification grouped 71.2% of these isolates into 43 ascomycetous taxa while the remaining 28.8% were classified in 27 basidiomycetous taxa. The study also led to the discovery of 8 putative new species. As a result, we classified two anamorphic species in the Ascomycota and one teleomorphic species in the Basidiomycota. In this study we provide the description of both species. Our results demonstrated that the two ascomycetous species proposed as Wickerhamiella kiyanii FB1-1DASPT and W. pindamonhangabaensis H10YT belong to the Wickerhamiella clade of the Saccharomycetales (Saccharomycetes) while the basidiomycetous species proposed as Bulleromyces texanaensis ATT064T belong to the Bulleromyces / Papiliotrema / Auriculibuller clade of the Tremellales (Agaricomycotina). In order to show the significance of intraspecific diversity in yeasts, in one of our studies, we subjected 11 strains, (including the type strain CBS 8960T) of Hannaella kunmingensis... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Fernando Carlos Pagnocca
Coorientador: André Rodrigues
Banca: Lara Durães Sette
Banca: Vanderlei Gerlado Martins
Banca: Paula Benevides de Morais
Banca: Aline Silva
Resumo: Atualmente, existe um crescente interesse em explorar diversos habitats, a fim de revelar a biodiversidade microbiana, incluindo as leveduras. Tal diversidade ainda não acessada guarda a descoberta de novas espécies para ciência, provavelmente muitas das quais com potencial para aproveitamento em processos biotecnológicos. Com o objetivo de explorar e conservar a diversidade de fungos, o Central de Recursos Microbianos da UNESP (CRM - UNESP) mantém em seu acervo várias estirpes de leveduras isoladas de ecossistemas diversos, sendo alguns deles pouco explorados. No início deste trabalho sabíamos que muitas das leveduras depositadas no acervo do CRM - UNESP não estavam totalmente caracterizadas tanto em nível taxonômico, quanto em relação ao potencial biotecnológico que poderiam apresentar. Portanto, o presente estudo foi desenhado para caracterizar e identificar taxonomicamente leveduras depositadas no CRM - UNESP, bem como selecionar estirpes que produzem enzimas extracelulares degradadoras de polissacarídeos como amilase, celulase, xilanase, pectinase e ligninase. Usando uma abordagem polifásica, um total de 340 isolados de leveduras foi identificado, sendo que 71,2% compreendem 43 taxa de ascomicetos e os restantes 28,8% foram classificados em 27 taxa de basidiomicetos. O estudo também levou à descoberta de 8 prováveis novas espécies. Baseado nesta constatação, a classificação taxonômica e análise filogenética foi realizada para duas espécies anamórficas de ascomicetos e uma espécie teleomórfica de basidiomiceto. A descrição destas três espécies é apresentada neste estudo. Os resultados demonstraram que Wickerhamiella kiyanii FB1-1DASPT e W. pindamonhangabaensis H10YT pertencem à clade Wickerhamiella da ordem Saccharomycetales... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)
Abstract: In recent time, there has been an increasing interest in exploring diverse ecological habitats in order to reveal the yeast biodiversity. The increased awareness in the biotechnological potentials of yeasts has also spurred attempts to search for new species with novel biotechnological capabilities. Aiming to explore and conserve the fungal diversity from various ecosystems, the UNESP - Central for Microbial Resources (UNESP - CMR) harbors various strains of ecologically diverse yeasts isolates, some of which were yet to be identified. Therefore, this study was designed to identify and characterize some yeasts from the UNESP - MRC and to select strains possessing extracellular plant polysaccharide degrading enzymes namely amylase, cellulase, xylanase, pectinase and ligninase. Using a polyphasic approach, a total of 340 strains were identified. Taxonomic classification grouped 71.2% of these isolates into 43 ascomycetous taxa while the remaining 28.8% were classified in 27 basidiomycetous taxa. The study also led to the discovery of 8 putative new species. As a result, we classified two anamorphic species in the Ascomycota and one teleomorphic species in the Basidiomycota. In this study we provide the description of both species. Our results demonstrated that the two ascomycetous species proposed as Wickerhamiella kiyanii FB1-1DASPT and W. pindamonhangabaensis H10YT belong to the Wickerhamiella clade of the Saccharomycetales (Saccharomycetes) while the basidiomycetous species proposed as Bulleromyces texanaensis ATT064T belong to the Bulleromyces / Papiliotrema / Auriculibuller clade of the Tremellales (Agaricomycotina). In order to show the significance of intraspecific diversity in yeasts, in one of our studies, we subjected 11 strains, (including the type strain CBS 8960T) of Hannaella kunmingensis... (Complete abstract click electronic access below)
Mestre

The major advances in the identification of the human genome that took place from the early 1990s onwards triggered a significant increase in the number of patent applications concerning newly discovered human gene sequences that nevertheless failed to disclose the function of the isolated material, and thus did not meet the patent law requirement of industrial application. In order to address this issue the 1998 Directive on the legal protection of biotechnological inventions (Biotech Directive) 1 required patent applicants to disclose the industrial applicability of inventions covering human gene sequences and related proteins at the time of the patent application. Furthermore, the Biotech Directive established functionality-related protection for all types of genetic inventions, thus restricting the scope of protection granted to human genetic inventions to their ability to perform the industrial application disclosed by the applicant. This thesis analyses the implications of the Biotech Directive's approach towards the industrial application of human genes and fragments thereof in respect of three issues: the assessment of the industrial applicability of inventions concerning sequences or partial sequences of human genes; the distinction between discoveries and patentable inventions when the claimed subject matter is human genetic material; and the determination of the scope of protection awarded to patents over genetic information. The thesis argues that the requirement of industrial application can act as an efficient checkpoint for preventing the grant of patents over human genetic discoveries of no practical benefit to society, but also for impeding the issuance of overly broad patents in this field. At the same time, a strict interpretation of this requirement does not imply that patent authorities will systematically overlook the interests of private firms, but it is intended to set a realistic standard that serves to avoid the rise of undue barriers in the pursuit of research and innovation in this industry.

S obzirom  da su cijanobakterije (modrozelene alge) identifikovane kao jedna odnajperspektivnijih grupa organizama za izolaciju novih i biološki aktivnih prirodnihprodukata, cilj ove teze bio  je utvrđivanje biotehnološkog potencijala  autohtonihfilamentoznih sojeva  cijanobakterija izolovanih sa područja Vojvodine koji pripadajuazotofiksirajućim rodovima  Nostoc  i  Anabaena  i neazotofiksirajućem rodu    Spirulina. Biotehnološki potencijal testiranih sojeva je određen  u smislu produkcije biomase, fikobiliproteinskih pigmenata, masnih kiselina, fenolnih jedinjenja, antioksidanata, antibakterijskih i antikancerogenih agenasa. Dobijeni rezultati su pokazali  da su produkcija biomase i sadržaj fikobiliproteinskih pigmenata kod svih testiranih sojeva zavisili od primenjenih uslova kultivacije, pri  čemu je  kod sojeva roda  Spirulina produkcija biomase bila jače stimulisana primenom kontinualnog osvetljenja, a kod azotofiksirajućih sojeva rodova  Nostoc  i  Anabaena  organskim izvorima ugljenika (glicerolom i glukozom). Kao soj sa najvećim potencijalom za  proizvodnju biomase izdvaja se soj  Spirulina  S1, a za produkciju fikobiliproteina sojevi  Spirulina  S1,  Nostoc 2S1,  Anabaena  Č2 i  Spirulina  S2.  Određivanjem sadržaja masnih kiselina GC-FID metodom utvrđeno je da su  kod svih sojeva  najzastupljenije bile palmitinska, palmitoleinska, oleinska i linolna kiselina, pri čemu su  sojevi roda Spirulina produkovali i  γ-linolensku kiselinu, dok su svi  sojevi rodova  Nostoc  i  Anabaena  produkovali  -linoleinsku kiselinu.  Najzastupljenije fenolne komponente testiranih etanolnih ekstrakata određene HPLC-MS/MS metodom  bile su hinska kiselina i katehin, pri čemu je najveći sadržaj fenolnih jedinjenja registrovan kod soja  Nostoc  2S7B. Hemijskom karakterizacijom ekstrakata kod testiranih sojeva takođe je utvrđen značaj azotnih uslova kultivacije  u cilju povećanja produkcije  fenolnih jedinjenja,  kao i  -linoleinske kiseline. Poređenjem rezultata antioksidantne aktivnosti u korišćenim testovima  DPPH  i FRAP, kao sojevi sa najvećim  antioksidantnim potencijalom izdvajaju se  Spirulina  S1 i Spirulina  S2. Antibakterijska aktivnost metanolnih ekstrakata  registrovana je kod sojeva Nostoc 2S7B, Nostoc 2S1, Anabaena Č2, Anabaena Č5, Spirulina S1 i  Spirulina S2, koji su ispoljili efekat na Gram-pozitivne i Gram-negativne bakterije, pri čemu su  sojevi Anabaena  Č2, Nostoc  2S7B  i  Nostoc  2S1  delovali na najviše bakterijskih sojeva.  Kod svih testiranih sojeva je primenom MTT testa uočena antikancerogena tj. citotoksična aktivnost dimetil sulfoksidnih (DMSO) ekstrakata prema HepG2 ćelijskoj liniji, među kojima su najveću aktivnost  ispoljili sojevi  Nostoc  LC1B i  Nostoc  2S7B.  Primenom bioeseja  Artemia salina, Daphnia magna  i   Danio rerio  konstatovan je mali broj sojeva koji su ispoljili toksičnost na test organizme, dok na ćelijsku liniju  RTL-W1  testirani sojevi nisu ispoljili citotoksičnost  in vitro, što sa aspekta potencijalne biotehnološke primene sojeva ima veliki značaj. Kao najtoksičniji izdvojili su se sojevi  Nostoc  LC1B  i Nostoc S8 koji su ispoljili  toksičnost u sva tri bioeseja. Ispitivanjem toksičnosti in vitro u enzimskim esejima konstatovano je da je manji broj sojeva inhibirao aktivnost enzimaprotein fosfataze 1 (PP1) u odnosu na aktivnost enzima  acetilholinesteraze  (AChE). Primenom Analitičkog hijerarhijskog procesa u grupnom kontekstu, najveću težinu su dobili kriterijumi antikancerogena ativnost, produkcija biomase i sadržaj fikocijanina, navedenim redom. Konačno, u višekriterijumskom kontekstu najbolje rangiran soj jeSpirulina S1, na drugom mestu je soj Spirulina S2, dok je na trećem soj  Nostoc  LC1B.
Cyanobacteria (blue-green algae) have been identified as one  of the most promising groups of organisms for the isolation of new and biologically active natural products, therefore, the aim of this thesis was to determine the biotechnological potential of autochthonous filamentous cyanobacterial strains isolated from  Vojvodina region,  which belong to the N ₂-fixing genera  Nostoc  and  Anabaena  and non-N₂-fixing genus  Spirulina. Biotechnological potential of tested strains was determined using the production of biomass, phycobiliprotein pigments, fatty acids, phenolic co mpounds, antioxidants, antibacterial and anticancer agents. The obtained results showed that the production of biomass and phycobiliprotein pigments, in all tested strains, depended on the cultivationconditions, whereas biomass production was strongly stimulated by continuous light in Spirulina  strains, and by organic carbon sources (glycerol and glucose) in N₂-fixingstrains. The highest potential for biomass production was shown in  Spirulina  S1 strain.On the other hand, the highest potential  for the production of phycobiliproteins wasshown in strains  Spirulina  S1,  Nostoc  2S1,  Anabaena C2 and  Spirulina  S2. By determination of the content of fatty acids using GC-FID method it was found that in allthe tested strains the most common fatty acids were palmit ic, palmitoleic, oleic andlinoleic acid, whereby the strains of the genus  Spirulina produced γ-linolenic acid as well,while all strains of the Nostoc  and Anabaena  genera produced y-linolenic acid. The most frequent phenolic compounds of tested strains determined by using the HPLC-MS/MSmethod were quinic acid and catechin, with the highest content of phenolic compounds registered in Nostoc  strain 2S7B. By chemical characterization of the extracts in the tested strains it was also stated a significance of  the nitrogen cultivation conditions in order toincrease the production of phenolic compounds, as well as  y-linolenic acid. Comparing the results of the antioxidant activity in the DPPH and FRAP tests, it  was shown that strains  Spirulina  S1 and  Spirulina  S2 had the highest antioxidant potential. The antibacterial activity of the intracellular methanolic extracts was registered in strains Nostoc  2S7B,  Nostoc  2S1,  Anabaena  C2,  Anabaena  C5,  Spirulina  S1 and  Spirulina  S2, that  inhibited the growth of  Gram-positive and Gram  -negative bacteria. Using MTT test, anti-cancer ie. cytotoxic activity of  dimethyl sulfoxide  (DMSO) extracts to the HepG2 cell line was detected in all tested strains, however, the highest activity was exhibited in strains Nostoc  LC1B and Nostoc 2S7B . In bioassays Artemia salina,  Daphnia magna  and Danio rerio  a small number of strains exhibited toxicity to the test organisms, while in case of cell line RTL-W1 tested strains did not show  in vitro  cytotoxicity, which is of great importance from the aspect of the potential biotechnological application of thestrains.  Nostoc  LC1B and  Nostoc  S8 strains induced toxicity in all three bioassays, and therefore considered as the most toxic strains. By testing  in vitro  toxicity in enzyme assays, it was found that few strains inhibited the activity of  protein phosphatase (PP1) enzyme in relation to  acetylcholinesterase  enzyme  (AChE) activity. Using the Analytical hierarchical process in the group context, the highest weight was given to the criteria of anticancer  activity, biomass production, and the phycocyanin content, respectively. Finally, in the multi-criteria context, the best-ranked strain is  Spirulina  S1,  Spirulina  strain S2 is on the second place, while Nostoc strain LC1B is the third one.

FundaÃÃo de Amparo à Pesquisa do Estado do CearÃ
This work evaluated the biotechnological potential of lectins in the induction of apoptosis of neoplastic cells; the effect on wound healing in a murine model (in vivo) and established the level of toxicity on Artemia sp. Lectins are proteins or glycoproteins ubiquitously distributed in nature, being found from bacteria to humans. Since carbohydrates can act as mediators of biological information, the interaction with lectins can trigger some biologically important effect. To verify the role of lectins in the induction of apoptosis, A549 cells (lung carcinoma) were grown for 1 hour with lectins isolated from seeds of Canavalia ensiformis (ConA), C. brasiliensis (ConBr), C. boliviana (ConBol), C. grandiflora (Cgran) and C. gladiata (CGL) labeled with FITC. In addition, the relative gene expression of p53, Bax, Bcl-2 and caspase 9 was also evaluated when the cells were cultured with ConA, ConBr and ConBol. The data showed that all lectins interacted with A549 cells. Nevertheless, p53 and Bax had no significant change. Unlike, the expression of BCL-2 was down-regulated while caspase 9 was up-regulated by treatment with lectins. Concerning the pro-healing potential, the lectin isolated from the red alga Bryothamnion seafortii (BS) was tested by topical treatment of skin lesions. The data showed that BS improved the quality of healing, probably through the induction of fibroblast proliferation. Finally, the lethality test of Artemia sp. was carried out to determine the toxicity of some Diocleinae lectins. ConBr is the most toxic lectin against Artemia, while ConA is the least toxic, and ConBol, ConM, ConGr and CGL exhibit intermediate levels of toxicity.
Este trabalho avaliou o potencial biotecnolÃgico de lectinas na induÃÃo da apoptose de cÃlulas neoplÃsicas, o efeito sobre a cicatrizaÃÃo de feridas em modelo murino (in vivo) e estabeleceu o nÃvel de toxicidade sobre Artemia sp. Lectinas sÃo proteÃnas ou glicoproteÃnas distribuÃdas ubiquamente na natureza, sendo encontradas desde bactÃrias atà seres humanos. Tais proteÃnas possuem a capacidade de ligar-se seletivamente a carboidratos. Considerando que carboidratos possam atuar como mediadores da informaÃÃo biolÃgica, a sua interaÃÃo com lectinas pode desencadear algum efeito biolÃgico importante. Para verificar o papel das lectinas sobre a induÃÃo da apoptose, cÃlulas A549 (carcinoma de pulmÃo) foram cultivadas durante 1 hora juntamente com lectinas isoladas das sementes de Canavalia ensiformis (ConA), C. brasiliensis (ConBr), C. boliviana (ConBol), C. grandiflora (Cgran) e C. gladiata (CGL) marcadas com FITC. Em adiÃÃo, a expressÃo gÃnica relativa de p53, Bax, BCL-2 e caspase 9 foi tambÃm avaliada quando as cÃlulas foram cultivadas com ConA, ConBr e ConBol. Os dados mostraram que todas as lectinas intergiram com as cÃlulas A549. NÃo obstante, p53 e Bax nÃo tiveram nenhuma alteraÃÃo significativa. PorÃm, BCL-2 teve sua expressÃo diminuÃda enquanto a da caspase 9 foi aumentada pelo tratamento com as lectinas. Com relaÃÃo ao potencial pro-cicatrizante, a lectina isolada da alga vermelha Bryothamnion seafortii (BS) foi testada atravÃs do tratamento tÃpico de lesÃes cutÃneas. Os dados mostraram que BS melhora a qualidade da cicatrizaÃÃo, muito possivelmente atravÃs da induÃÃo da proliferaÃÃo de fibroblastos. Por fim, o teste de letalidade sobre Artemia sp. foi utilizado para verificar a toxicidade de algumas lectinas da subtribo Diocleinae. Os resultados mostraran que ConBr e ConA sÃo as lectinas mais tÃxica e menos tÃxica, respectivamente. ConBol, ConM, Cgran e CGL exibiram nÃveis intermediÃrios de toxicidade.

The production of biofuels and oleochemicals from renewable sources offers an opportunity to reduce our dependence on fossil fuels. The work contained in this dissertation has focused on developing and improving methods for the production of biodiesel from non-traditional feedstocks and understanding biosynthetic pathways that result in the production of oleochemicals and fuels. Pure vegetable oil can account for 70-80% of the total cost of biodiesel production. Many low-cost oils contain high amounts of free fatty acids, which are unsuitable for base-catalyzed transesterification. Herein an approach is described that efficiently accomplishes the simultaneous esterification and transesterification of both free fatty acids and triglycerides found in low-cost oils. The approach utilizes an acid catalyst and longer-chain alcohols to improve biodiesel yields from oils high in free fatty acids. Microalgae are a promising biodiesel feedstock, due to its high lipid productivity and its ability to be cultivated using resources, land and water, unsuitable for agriculture. As part of this work, reaction conditions were optimized for the direct (or in situ) transesterification of algal biomass to biodiesel. This approach accomplishes the simultaneous extraction and conversion of the total lipids from microalgae and results in increased yields compared to extraction followed by conversion. The use of this process to effectively produce biodiesel from wet algal biomass is also discussed. Wax esters are a class of oleochemicals that can be used for a wide range of applications in diverse industries. The chemical composition of native wax esters from the bacterium Marinobacter aquaeolei was determined. It was found that including small alcohols in the growth medium resulted in the in vivo formation of esters similar to biodiesel. All of the proteins involved in the wax ester biosynthetic pathway are not known. The cloning, purification, and characterization of a putative fatty aldehyde reductase from M. aquaeolei, believed to be involved in the production of wax esters, is reported. Finally, the expression of a ws/dgat (wax ester synthase) gene from M. aquaeolei in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 is discussed as an approach to producing biodiesel in vivo from sunlight and CO2.

Infecções fúngicas em humanos vem aumentando nos últimos anos e acometem principalmente pacientes imunocomprometidos, portadores do vírus HIV, transplantados ou com câncer. Os antifúngicos empregados no tratamento pertencem a poucos grupos de fármacos e o aparecimento de resistência antifúngica em muitos patógenos leva à necessidade de desenvolvimento de novos agentes antifúngicos. As cepas Trichosporon japonicum QU139 e Candida catenulata LV102 apresentam atividade killer sobre diversas leveduras patogênicas, apresentando bom potencial para desenvolvimento de novos agentes antimicrobianos. O objetivo do trabalho foi a otimização das condições para produção e detecção dos compostos antimicrobianos, para seu futuro uso terapêutico, e sua purificação. O efeito killer da cepa T. japonicum QU139 foi avaliado pelo método dos poços contra células sensíveis de Cryptococcus gattii C20 nos meios GYP, YM e Queijo em diferentes pH e temperaturas. A máxima atividade killer foi encontrada no meio GYP, pH 4,5 à 25°C após 24 horas de incubação para T.japonicum QU139 e C. catenulata LV102. Não foi possível isolar o composto antimicrobiano produzido pela levedura T.japonicum QU139 pelos métodos de isolamento de proteína/glicoproteína, corroborando a hipótese de que a toxina seja um glicolipídeo.
Human fungal infections have increased in the last years and affect mainly immunocompromised patients, carriers of HIV vírus, transplanted or with cancer. The antifungal agents used in treatment belong to a few groups of drugs and the increase of antifungal resistance in many pathogens leads to the necessity of developing new antifungal agents. Strains Trichosporon japonicum QU139 and Candida catenulata LV102 showed killer activity against several pathogenic yeasts, having a good potential for the development of new antimicrobial agents. The objective of the work was the optimization of conditions for production and detection of the antimicrobial compounds, aiming their future terapeutic use, and their purification. The killer effect of T. japonicum QU139 strain was evaluated by the well method against sensitive cells of Cryptococcus gattii C20 in media GYP, YM and Cheese in different pH and temperatures. The maximum killer activity was found in media GYP, pH 4.5, 25°C after 24 hours of incubation for T.japonicum QU139 and C. catenulata LV102. The isolation of the antimicrobial compound produced by the yeast T.japonicum QU139 was not possible by the methods for isolation of proteins/glicoproteins, corroborating the hypothesis that the toxin is a glycolipid.

L’amenuisement des ressources pétrochimiques couplé à la pollution engendrée par l’exploitation des plastiques posent de nombreuses questions et conduisent à un besoin urgent de solutions alternatives. Les polyhydroxyalcanoates (PHA) sont des polymères qui ont su se démarquer et naturellement s’imposer comme matériaux de remplacement, de par leurs caractères à la fois biosourcé et biodégradable. Leur synthèse par un grand nombre d’organismes procaryotes et eucaryotes, à partir d’une large gamme de substrats carbonés, rend leur production quasi illimitée et conduit à l’obtention de polymères aux propriétés allant de celles d’un thermoplastique rigide à un élastomère. Malgré cela, les rendements et les coûts de production représentent toujours les principaux verrous à leur développement. Parmi les solutions envisagées, l’exploitation de ressources marines, telles que les bactéries halophiles, suscite un fort intérêt tant les capacités d’adaptation de ces souches sont étendues et avantageuses. Halomonas sp. SF2003 est une souche marine naturellement productrice de PHA possédant une grande capacité d’adaptation face à de nombreux substrats et conditions environnementales. L’étude et l’optimisation de sa production de PHA font l’objet de ce travail. Le séquençage de son génome, couplé à des tests phénotypiques, ont permis l’étude de différents gènes et voies métaboliques confirmant son caractère adaptatif. Dans le même temps, l’influence de différents paramètres sur la production de PHA a été étudiée. Ces travaux, faisant appel à des techniques de biologie moléculaire et des bioprocédés, contribueront au développement du potentiel biotechnologique de la souche Halomonas sp. SF2003
Depletion of oil ressources coupled to pollution caused by over-exploitation of plastics generate a plentiful of issues and lead to an urgent need for alternatives. PolyHydroxyAlkanoates (PHA) are biopolymers which have distinguished and naturally imposed themselves due to their biosourcing and biodegradability features. Their synthesis by a wide variety of eukaryotic and prokaryotic organisms, from various carbon substrates, makes their production almost unlimited and allows obtaining polymers exposing rigid thermoplastic to elastomeric properties. Despite that, the production yield and the cost are still the main locks to their development. Among possibilities studied, exploitation of marine resources, like halophilic bacteria, arouse a strong interest since adaptability of these strains is extensive and attractive. Halomonas sp. SF2003 is a PHA producing marine bacterium which naturally exposes a considerable versatility in front of carbon substrates and environmental conditions. Characterization and optimization of its PHA production are the main subjects of the presented study. Genome sequencing and annotation, in addition to phenotypic tests, allowed characterization of various genes and metabolic pathways attesting of the adaptative strain character. In the same time, impact of various parameters on Halomonas sp. SF2003 PHA production has been investigated. This work, employing molecular biology and bioprocess tools, will contribute to future development of biotechnological potential of Halomonas sp. SF2003

The culture of coconut is economically relevant to Brazil but suffers with the breeding of pests that target coconut trees and bring on economic losses. One of the pests responsible for such is the palm weevil R. palmarum L., which is attracted to the infestation site by the odor released from the fermentation of plant tissues. This is particularly problematic when the crop, processing and disposal sites are in close location, for the residue discarded (i.e. green coconut shell) undergoes the action of microorganisms that produce volatile compounds and attract the pest to the crop site. This research had as its objective the isolation and characterization of bacteria and yeasts responsible for the fermentation of green coconut shell and production of volatile compounds that are attractive to the palm weevil. For such, green coconut shells were exposed to the local environment for the development of the fermentative processes, having the emitted volatiles analyzed on five different days of fermentation (0, 3, 5, 7, and 10 days). Thirty different compounds belonging to different chemical classes were detected for all of the analyzed days, being alcohols, ketones, aldehydes and hydrocarbons the most frequently found. Isolation procedures were performed immediately after the opening of the coconuts and at the sixth day of fermentation. After purification, thirty eight strains (15 bacteria and 23 yeasts) were obtained and characterized. The characterization of the strains was based on the determination of orphological, physiological and biochemical characteristics and the evaluation of the biotechnological potential. The isolated strains presented variable biochemical profile, although each of them displayed at least one positive result for the tested enzymes. Although bacterial isolates were halotolerant, yeast strains were more. Among the bacterial strains, the isolate A5 stood out for displaying activity for all of the tested enzymes except for laccase besides being capable of degrading filter paper in liquid media. The isolate E4 stood out among the yeast strains for presenting activity for five of the tested enzymes (amylases, pectinases, xylanases, proteases and lipases/esterases) besides displaying tolerance up to 10% NaCl. Therefore each strain presented different biotechnological potential, some of them being potential candidates for the production of volatile compounds by fermentation of the green coconut shell. A few strains were identified to the genus level by the technique of MILDI-TOF, resulting in identification of three bacterial (Bacillus, Pantoea e Arthrobacter) e three yeasts (Pichia, Cryptococcus e Rhodotorula) genera. The production of volatile compound by four selected strains was investigated and resulted on the detection of over 100 different compounds, among which are included ketones, carboxylic acids, pyrazines, esters, hydrocarbons, aldehydes, terpenes and terpenoids. A few of the detected volatiles had been previously reported as attractive to R. palmarum confirming that there is a relationship between the metabolic activity of the isolated microorganisms and production of volatiles attractive to this pest.
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
A cultura do coqueiro é economicamente importante para o Brasil, mas sofre com a proliferação de pragas que almejam os coqueiros e causam prejuízo econômico. Uma das pragas é a broca-do-olho-do-coqueiro, R. palmarum L., que é atraído para os locais de infestação pelo odor de fermentação de tecidos vegetais. Isto é particularmente problemático quando os locais de plantação, de processamento dos frutos e de descarte de resíduos são próximos, pois o resíduo gerado (casca do coco-verde, por exemplo) sofre ação de microrganismos que produzem compostos voláteis e atraem o inseto para a plantação. Esta pesquisa teve como objetivo o isolamento e a caracterização de bactérias e leveduras responsáveis pela fermentação da casca do coco-verde com concomitante produção de compostos voláteis atrativos para a broca-do-olho-do-coqueiro. Para tanto, cascas de coco-verde recém-abertas foram expostas ao ambiente para desenvolvimento de processo fermentativo, sendo a emissão de voláteis analisada em cinco dias diferentes de fermentação (dias 0, 3, 5, 7 e 10). Trinta compostos de classes químicas variadas foram detectados para os diferentes dias de fermentação, sendo encontrados álcoois, cetonas, aldeídos e hidrocarbonetos com maior frequência. Isolamentos foram realizados após abertura dos cocos e no sexto dia de fermentação. Após purificação, trinta e oito linhagens (15 bactérias e 23 leveduras) foram obtidas e caracterizadas. A caracterização teve como base a determinação de características morfológicas, fisiológicas e bioquímicas e a avaliação do potencial biotecnológico. As linhagens isoladas exibiram perfil bioquímico variado, sendo que todos apresentaram pelo menos um resultado positivo para alguma das enzimas extracelulares testadas. Embora as bactérias tenham sido halotolerantes, as leveduras foram mais. Dentre as bactérias isoladas, o isolado A5 se destacou por apresentar atividade para todas as enzimas testadas exceto lacases, além de demostrar capacidade de degradar papel de filtro em meio líquido. O isolado E4 se destacou entre as leveduras por apresentar atividade para cinco enzimas (amilases, pectinases, xilanases, proteases e lipases/esterases), além de apresentar tolerância a 10% de NaCl. Portanto, cada linhagem isolada apresentou potencial biotecnológico variável, algumas sendo potenciais candidatas para a produção de voláteis pela fermentação da casca do coco-verde. Alguns isolados foram identificados a nível de gênero pela técnica de MALDI-TOF, resultando na identificação de três gêneros de bactérias (Bacillus, Pantoea e Arthrobacter) e três de leveduras (Pichia, Cryptococcus e Rhodotorula). A produção de voláteis por culturas puras de quatro isolados selecionados foi estudada, sendo encontrados mais de 100 compostos diferentes, principalmente cetonas, ácidos carboxílicos, pirazinas, ésteres, hidrocarbonetos, aldeídos, terpenos e terpenóides. Alguns dos voláteis detectados já haviam sido relatados como atrativos para o R. palmarum., confirmando que existe relação entre a atividade metabólica dos microrganismos isolados e produção de voláteis atrativos para esta praga.

>Magister Scientiae - MSc
Microorganisms of the class Actinobacteria and domain Archaea are interesting from a biotechnological perspective owing to their metabolic attributes as producers of secondary metabolites and resilience under harsh environmental conditions respectively. Lake Magadi is a soda lake well studied in terms of its geology and limnology. Research attention has also been drawn to the microbial populations which thrive in this unique habitat but currently there are no reports on the assessment of its microflora using molecular methods. This study aimed to assess the actinobacterial and archaeal communities within Lake Magadi, Kenya a hypersaline –highly alkaline habitat using metagenomic methods as a preliminary study to identify potential candidates for exploitative biology Samples from two sites dubbed Lake Magadi station 2 (LM2) and Lake Magadi salt pan 4 (LMS4) within the Lake Magadi were analyzed using the 16S rRNA gene as a phylogenetic marker. Cluster analysis of taxon-specific 16S rDNA PCR-DGGE profiles revealed moderately heterogeneous actinobacterial and archaeal populations across the sample sites under investigation which is probably a reflection of the differences in abiotic conditions at the study sites. This observation was also confirmed from the multi-dimensional scaling (MDS) plot. PCR-based clonal libraries of actinobacterial and archaeal communities of both study sites retrieved a total of thirty-two clones (twenty actinobacterial and twelve archaeal) were sequenced. Analysis of the sequences revealed cultured and uncultured signatures of microorganisms typical of hypersaline and or highly alkaline niches. A few (3) sequences presented novelty (<96%) in identities with any previously identified organism. It was concluded that the species dominance at site LMS4 [situated within the salt flats of Lake Magadi and site for exploration of trona and its mineralized extensions (nacholite and gayllusite)] is likely to be dictated by anthropogenic stress since most of the microbial signals associated with the study site are typical of saline and or alkaline environmental samples exposed to especially mining but also agricultural and waste management practices. Isolation studies also revealed previously identified strains peculiar to hypersaline brines and sediments. The strains retrieved were affiliated to the taxonomically diverse genus Bacillus and Halomonas sp. The true applications and potential opportunities these isolates have for biotechnology have been well documented. Observations made from the culture dependent and culture independent methods suggests strongly that study site LMS4 is subjected to environmental conditions more severe than at site LM2. This study is a guide for future studies as it provides primary information on the haloalkaliphilic representatives of the actinobacteria phylum and domain Archaea within the soda lake environment. It can serve as a pedestal for investigation into the molecular machinery that supports the haloalkaliphilic lifestyles of inhabiting microorganisms and consequently give leads as to how they can be commercially exploited.

Tese de doutoramento em Bioengenharia
Ashbya gossypii (syn. Eremothecium gossypii) is a filamentous Saccharomycete which has long been known in the scientific and industrial communities, first as a cotton pathogen and subsequently as a riboflavin overproducer. This fungus has the smallest free living eukaryotic genome known, which shares a high degree of gene homology and gene order conservation with that of Saccharomyces cerevisiae. It has haploid nuclei and is prone to genetic manipulation, allowing the use of simple PCR-based gene targeting strategies and free propagation of plasmids containing replicons from S. cerevisiae. Moreover, it grows well in a variety of defined, complex and waste-based media, and has a long history of safe use in the industrial production of riboflavin (vitamin B2). These unique features led to expanded interest in A. gossypii as a “minimal” host for the production of, yet unexploited, valuable compounds other than riboflavin, namely heterologous proteins. However, although two heterologous proteins have already been successfully secreted by A. gossypii, little is still known about the protein secretion ability of this fungus. To further understand the biotechnological potential of A. gossypii as a cell factory organism, this thesis primarily focused on the characterization of the A. gossypii protein secretory pathway at the genomic, transcriptomic and proteomic levels. Based on experimental observations and on the data from the genomic and transcriptomic analyses, a hydrolytic enzyme, invertase, was deduced to be natively secreted by A. gossypii and molecularly characterized. To further address A. gossypii as a heterologous protein producer, the β-galactosidase from Aspergillus niger was expressed in this fungus under the regulation of different native and heterologous promoters. In addition, a new molecular tool for use in A. gossypii was developed to generate mutant strains free of exogenous selection markers, allowing the creation of improved A. gossypii strains suitable for industrial applications. The results presented in this thesis demonstrate that the amount and variety of proteins natively secreted by A. gossypii to the culture medium is rather low, being more similar to that of yeast than to that of other filamentous fungi. Similarly, the N-glycosylation patterns produced by A. gossypii are generally more similar to those produced by yeast than to those produced by other filamentous fungi. However, extensive hyperglycosylation only occurs in certain culture conditions. Like other filamentous fungi, A. gossypii also seems to be able to trim its N-glycans. A conventional unfolded protein response (UPR) was not activate in A. gossypii in response to heterologous protein secretion nor to dithiothreitol (DTT)-induced secretion stress, as generally observed in other fungi. However, the transcriptional responses of A. gossypii to DTT-induced stress indicate that alternative mechanisms exist in this fungus to cope with protein secretion stress. The A. gossypii invertase was demonstrated to be encoded by the AFR529W (AgSUC2) gene, which is functionally complemented by the S. cerevisiae SUC2 (ScSUC2) gene. The signal sequences of both AgSuc2p and ScSuc2p were able to direct the secretion of invertase into the culture medium in A. gossypii. Similarly to the invertases of other fungi, the expression of the A. gossypii invertase is regulated by the sugars present in the medium. These results expanded our knowledge about the A. gossypii native secretion capacities, being invertase the second hydrolytic enzyme natively secreted by this fungus to be experimental characterized. The β-galactosidase from A. niger was successfully expressed in A. gossypii under the regulation of different promoters. The native TEF promoter revealed to be the best promoter for overexpressing heterologous β-galactosidase in A. gossypii, inducing 2-fold higher secreted activity than the A. gossypii GPD promoter and 7-fold higher than the S. cerevisiae PGK1 and ADH1 promoters. The levels of active β-galactosidase secreted by a S. cerevisiae laboratorial strain transformed with the same plasmids were up to 37 times lower than those obtained in A. gossypii. The secretion of active β-galactosidase by A. gossypii was approximately 1.5-fold higher in glycerol- than in glucose-containing medium. These results highlight the potential of A. gossypii as a heterologous protein producer and open new opportunities to further optimize its secretion capacities using this enzyme as a model. As its activity is easy to detect, the screening for improved secretion will be facilitated. The Cre-loxP recombination system, which has been widely used in other organisms, was successfully adapted for use in A. gossypii, allowing the removal and reuse of selection marker genes in targeted engineering of this fungus. The set of disruption cassettes and plasmids constructed greatly expand the possibilities for genetically engineer A. gossypii, being these suitable for use in both laboratorial and industrial strains, as they do not required any predetermined genetic background. In the future, targeted improvement of A. gossypii strains for industrial applications will benefit from this molecular tool.
O Ashbya gossypii (sin. Eremothecium gossypii) é um Saccharomycete filamentoso há muito conhecido nas comunidades científica e industrial, primeiro como patogénio do algodão e subsequentemente como super-produtor de riboflavina. Este fungo tem o mais pequeno genoma eucariótico não parasitário conhecido, o qual partilha um elevado grau de homologia e conservação de ordem génica com o genoma da Saccharomyces cerevisiae. Ele tem núcleos haplóides e é de fácil manipulação genética, permitindo o uso de estratégias de manipulação genética direcionada simples e a livre propagação de plasmídeos contendo sequências de replicação de S. cerevisiae. Além do mais, cresce bem numa variedade de meios definidos, complexos e baseados em resíduos, e tem um longo historial de utilização segura na produção industrial de riboflavina (vitamina B2). Estas características únicas levaram a um interesse alargado em A. gossypii como hospedeiro “mínimo” para a produção de outros compostos de interesse, ainda inexplorados, para além da riboflavina, nomeadamente proteínas heterólogas. No entanto, apesar de duas proteínas heterólogas já terem sido secretadas por A. gossypii com sucesso, pouco ainda se conhece acerca da capacidade de secreção de proteínas deste fungo. Para melhor compreender o potencial biotecnológico de A. gossypii como fábrica celular, esta tese focou-se primariamente na caracterização da via de secreção de proteínas do A. gossypii aos níveis genómico, transcriptómico e proteómico. Com base em observações experimentais e nos dados das análises genómicas e transcriptómicas, uma enzima hidrolítica, invertase, foi prevista ser nativamente secretada por A. gossypii e molecularmente caracterizada. Para melhor avaliar o A. gossypii como produtor de proteínas heterólogas, a β-galactosidase de Aspergillus niger foi expressa neste fungo sob a regulação de diferentes promotores nativos e heterólogos. Adicionalmente, uma nova ferramenta molecular para uso em A. gossypii foi desenvolvida para gerar estirpes mutantes livres de marcadores de selecção exógenos, permitindo a criação de estirpes de A. gossypii melhoradas para aplicações industriais. Os resultados apresentados nesta tese demonstram que a quantidade e variedade de proteínas nativamente secretadas por A. gossypii para o meio de cultura é relativamente baixa, sendo mais comparável à das leveduras do que à de outros fungos filamentosos. De modo semelhante, os padrões de N-glicosilação produzidos por A. gossypii são genericamente mais semelhantes aos produzidos pelas leveduras do que aos produzidos por outros fungos filamentosos. No entanto, hiperglicosilação extensa só ocorre em determinadas condições de cultura. Tal como outros fungos filamentosos, o A. gossypii parece ter também a capacidade de produzir N-glicanos truncados. Uma unfolded protein response (UPR) convencional não foi ativada em A. gossypii em resposta à secreção de proteínas heterólogas nem ao stress de secreção induzido por ditiotreitol (DTT), como geralmente observado noutros fungos. No entanto, as respostas transcricionais do A. gossypii ao stress induzido por DTT indicam que existem mecanismos alternativos neste fungo para lidar com o stress de secreção proteica. A invertase de A. gossypii foi demonstrada ser codificada pelo gene AFR529W (AgSUC2), que é funcionalmente complementado pelo gene SUC2 de S. cerevisiae (ScSUC2). As sequências sinal da AgSuc2p e ScSuc2p conseguiram direcionar em A. gossypii a secreção de invertase para o meio de cultura. Similarmente às invertases de outros fungos, a expressão da invertase de A. gossypii é regulada pelos açúcares presentes no meio. Estes resultados expandiram o nosso conhecimento acerca das capacidades de secreção nativas do A. gossypii, uma vez que a invertase é apenas a segunda enzima hidrolítica nativamente secretada por este fungo a ser experimentalmente caracterizada. A β-galactosidase de A. niger foi espressa com sucesso em A. gossypii sob a regulação e diferentes promotores. O promoter nativo TEF revelou-se o melhor promotor para sobre-expressar β-galactosidase heteróloga em A. gossypii, induzindo 2 vezes mais atividade secretada do que o promotor GPD de A. gossypii e 7 vezes mais do que os promotores PGK1 e ADH1 de S. cerevisiae. Os níveis de β-galactosidase ativa secretada por uma estirpe laboratorial de S. cerevisiae transformada com os mesmos plasmídeos foram até 37 vezes mais baixos do que os obtidos em A. gossypii. A secreção de β-galactosidase ativa por A. gossypii foi cerca de 1.5 vezes mais alta em meio contendo glicerol em vez de glucose. Estes resultados evidenciam o potencial do A. gossypii como produtor de proteínas heterólogas e abrem novas oportunidades para optimizar as suas capacidades de secreção usando esta enzima como modelo. Como ela é de fácil deteção, o rastreio de melhorias na secreção será facilitado. O sistema de recombinação Cre-loxP, que tem sido amplamente usado em diferentes organismos, foi adaptado com sucesso para utilização em A. gossypii, permitindo a remoção e reuso de marcadores de selecção em engenharia genética direcionada neste fungo. O conjunto de cassetes de deleção e plasmídeos construídos expandem as possibilidades para manipular geneticamente o A. gossypii, sendo adequados quer para uso em estirpes laboratoriais, quer em estirpes industriais, pois não requerem a existência de nenhum background genético predeterminado. No futuro, o melhoramento direcionado de estirpes de A. gossypii para aplicações industriais irá beneficiar desta ferramenta molecular.

Morocco has been a target of few studies despite its excellent potential for research and discovery of new species of cyanobacteria with biotechnological interest. Taking this into account, this work had as the main objective of to know the diversity of terrestrial, marine and freshwater cyanobacteria in the region of El Jadida, in Morocco. In this way, strains were isolated from samples collected in the El Jadida region. Subsequently, the isolated strains were morphologically characterized, where their main characteristics were analysed, such as color, shape, and dimensions. Then, the 16S rRNA gene of 11 isolated strains was sequenced, with that information the genus of the isolates was known and later a phylogenetic tree was built. In order to assess the toxic potential of the isolates, PCR detected the genes responsible for the production of the main cyanotoxins (cylindrospermopsin, saxitoxin, anatoxin, microcystins and nodularins). Finally, one of the isolated strains, strain 1, was selected to carry out three biotechnological tests: antioxidant, anti-obesity and anti-inflammatory. Regarding the experimental results, 15 strains of cyanobacteria were isolated, 11 filamentous and 4 cocoids. Of the 11 strains sequenced, there is a possibility that some of them are new genera of cyanobacteria, yet to be described. Of the isolated strains, 3 demonstrated toxic potential, and in 1 of them the genes responsible for the production of cylinderspermopsin were detected and in 2 of them the genes responsible for the production of nodularins were detected. Regarding biotechnological tests, strain 1 showed pro-oxidant activity and there was no anti-obesity behavior or anti-inflammatory activity. The entire project was developed in partnership with CIIMAR (Interdisciplinary Center for Marine and Environmental Research), under the EBB (European Marine Biological Resource Center Biobank) and EMERTOX (Emergent Marine Toxins in the North Atlantic and the Mediterranean) projects.
Marrocos, por ser um local alvo de poucos estudos, representa uma fonte com excelente potencial para a pesquisa e descoberta de novas espécies de cianobactérias com interesse biotecnológico. Tendo isso em conta, este trabalho teve como principal objetivo conhecer a diversidade de cianobactérias terrestres, marinhas e de água doce da região de El Jadida, em Marrocos. Para tal, procedeu-se ao isolamento de estirpes a partir das amostras recolhidas na região de El Jadida. Posteriormente as estirpes isoladas foram caracterizadas morfologicamente, onde foram registadas as suas principais características, tais como, cor, forma e dimensões. De seguida procedeu-se à sequenciação do gene 16S rRNA de 11 estirpes isoladas, com essa informação conheceu-se o género dos isolados e posteriormente foi contruída uma árvore filogenética. Para avaliar o potencial tóxico dos isolados, através de PCR fez-se a deteção dos genes responsáveis pela produção das principais cianotoxinas (cilindrospermopsina, saxitoxina, anatoxina, microcistinas e nodularinas). Por fim, uma das estirpes isoladas, a estirpe 1, foi selecionada para a realização de três ensaios biotecnológicos: antioxidante, antiobesidade e anti-inflamatório. Relativamente aos resultados experimentais, foram isoladas 15 estirpes de cianobactérias, sendo 11 filamentosas e 4 cocoides. Das 11 estirpes sequenciadas, existe a possibilidade de algumas pertencerem a novos géneros de cianobactérias, ainda por descrever. Das estirpes isoladas, 3 demonstraram potencial tóxico, sendo que em 1 delas foram detetados os genes responsáveis pela produção de cilindrospermopsina e em 2 delas foram detetados os genes responsáveis pela produção de nodularinas. Relativamente aos ensaios biotecnológicos, a estirpe 1 apresentou atividade pro-oxidante e não se verificou um comportamento anti-obesidade, nem atividade antiinflamatória. Todo o projeto foi desenvolvido em parceria com o CIIMAR (Centro Interdisciplinar de Investigação Marinha e Ambiental), no âmbito dos projetos EBB (European Marine Biological Resource Centre Biobank) e EMERTOX (Emergent Marine Toxins in the North Atlantic and the Mediterranean).
Mestrado em Biotecnologia

Although knowledge about the ecological group of lignicolous marine fungi is still scarce, especially in Portugal, it is known that they play an essential ecological role in marine and estuarine ecosystems, namely in the degradation of organic matter present in wood and consequent contributing to the functioning of the aquatic “microbial ring” that drives the biogeochemical cycles and the maintenance of trophic relationships. In addition to their environmental contribution, they are also a source of compounds with biotechnological potential, with applications in various industrial and pharmaceutical areas. In this study, in order to investigate the occurrence of lignicolous marine fungi in the estuary of Ria de Aveiro, blocks of wood (Pinus pinaster) were submerged in a marina, for one year. Seventeen different fungal species were successfully identified, with a high prevalence of species belonging to the family Lulwortiaceae. Through phylogenetic analyses based on the ribosomal ITS (internal transcribed spacer), LSU (large ribosomal subunit) and SSU (small ribosomal subunit) regions combined with morphological and physiological studies, two genera (Lulworthiopsis and Marinomyces) were introduced to accommodate Lulworthia cf. purpurea and Papulaspora halima, respectively. In the same way, Lulworthiopsis maritima sp. nov., Halosphaeria submersa sp. nov. and Zalerion pseudomaritima sp. nov. were proposed as novel species. To assess their biotechnological potential, isolates of interest were selected and enzymatic and antibacterial tests were carried out. As expected from lignicolous species, most isolates tested positive for cellulolytic and pectinolytic activities. Halosphaeria submersa, M. halima and Z. maritima revealed an interesting potential in several extracellular enzymatic activities. Differences were also detected in enzyme production in the presence and absence of salt, thus proposing that these activities can be stimulated or inhibited depending on the salinity. Regarding the results of antibacterial activity, the selected isolates showed more effective against Gram-positive bacteria. Lulworthiopsis purpurea and M. halima showed antibacterial activity against the multiresistant Gram-negative bacteria of Pseudomonas aeruginosa and Klebsiella pneumoniae, respectively, representing an anti-bacterial potential effective in combating these pathogenic strains. Future taxonomic and biotechnological studies focused on lignicolous marine fungi may bring benefits to several areas of research.
Apesar de o conhecimento relativo ao grupo ecológico dos fungos marinhos lenhícolas ser ainda escasso, especialmente em Portugal, é sabido que possuem um papel ecológico essencial nos ecossistemas marinhos e estuarinos, nomeadamente na degradação da matéria orgânica presente na madeira e consequente contribuição para o funcionamento do “anel microbiano” aquático que impulsiona os ciclos biogeoquímicos e a manutenção das relações tróficas. Para além do seu contributo ambiental são também uma fonte de compostos com potencial biotecnológico, com aplicações em várias áreas industriais e farmacêuticas. Neste trabalho, de modo a investigar a ocorrência de fungos marinhos lenhícolas no estuário da Ria de Aveiro, blocos de madeira (Pinus pinaster) foram submersos numa marina, durante um ano. Dezassete espécies de fungos diferentes foram identificadas com sucesso, observando-se uma predominância de espécies pertencentes à família Lulwortiaceae. Através de análises filogenéticas baseadas nas regiões do DNA ribossomal ITS (internal transcribed spacer), LSU (large subunit ribossomal) e SSU (small subunit ribosomal) conjugadas com estudos morfológicos e fisiológicos foram introduzidos dois géneros (Lulworthiopsis e Marinomyces) para acomodar Lulworthia cf. purpurea e Papulaspora halima, respetivamente. De igual modo, Lulworthiopsis maritima sp. nov., Halosphaeria submersa sp. nov. e Zalerion pseudomaritima sp. nov. são propostas como espécies novas. Para avaliar as suas potencialidades biotecnológicas, isolados de interesse foram selecionados e realizaram-se testes enzimáticos e antibacterianos. Como era esperado de espécies lenhícolas, a maioria dos isolados testaram positivo para as atividades celulolíticas e pectinolíticas. Halosphaeria submersa, M. halima e Z. maritima revelaram um interessante potencial em várias atividades enzimáticas extracelulares. Foram ainda detetadas diferenças na produção enzimática na presença e ausência de sal, sugerindo assim que estas atividades possam ser estimuladas ou inibidas consoante a salinidade. Em relação aos resultados da atividade antibacteriana, os isolados selecionados apresentaram uma maior eficácia contra bactérias Gram-positivo. Lulworthiopsis purpurea e M. halima mostraram atividade antibacteriana contra as bactérias Gram-negativo multirresistentes Pseudomonas aeruginosa e Klebsiella pneumoniae, respetivamente, representando um potencial antibacteriano eficaz no combate a estas espécies patogénicas. Futuros estudos taxonómicos e biotecnológicos focados em fungos marinhos lenhícolas podem vir a trazer benefícios para diversas áreas de investigação.
Mestrado em Microbiologia

This work explored the potential of halophyte plants from the Algarve coast as sources of bioactive compounds with biotechnological applications in the pharmaceutical, food and cosmetic areas. Halophytes are salt-tolerant plants that survive in extreme environments and are equipped with powerful defence mechanisms to manage environmental stress, including the production of bioactive molecules. Despite their enormous potential, halophytes are still quite underexplored regarding their biotechnological applications. This study focused on Frankenia laevis L. (sea-heath), Halopeplis amplexicaulis (Vahl) Ces., Pass. & Gibelli, Juncus acutus L. (spiny rush), J. inflexus L. (wire rush), J. maritimus L. (seaside rush), Limonium algarvense Erben (sea lavender), and Polygonum maritimum L. (sea knotgrass). Methanol and dichloromethane extracts from different plant organs were prepared, evaluated for in vitro antioxidant, antidiabetic, anti-hyperpigmentation and neuroprotective activities, and chemically characterized. Sea lavender and sea knotgrass were selected for their high in vitro antioxidant, neuroprotective, anti-hyperpigmentation and antidiabetic properties, and Juncus species for their in vitro antioxidant and neuroprotective capacities. Sea lavender and sea knotgrass had a high phenolics content, presenting a broad diversity of phenolic acids and flavonoids, respectively. The sea knotgrass had the highest in vitro antioxidant, anti-inflammatory, antidiabetic, neuroprotective and anti-hyperpigmentation properties, closely followed by the sea lavender. Hence, sea lavender and sea knotgrass were selected for experimental production in a greenhouse using different irrigation salinities; freshwater-irrigated plants had the best growth performance and biological properties. Juncunol, a compound isolated from the spiny rush, had in vitro neuroprotective properties, as well as apoptosis-inducing capacity towards hepatocellular carcinoma cells. In conclusion, the halophytes sea lavender, sea knotgrass and spiny rush can be useful sources of bioactive molecules that can potentially help to prevent oxidative stress-related diseases, delay neurodegeneration and hyperpigmentation. The spiny rush is also a promising source of compounds, namely juncunol, with in vitro antihepatocellular carcinoma activity.
Este trabalho teve como objetivo principal explorar o potencial biotecnológico de plantas halófilas do Algarve como fonte de compostos bioativos com aplicação em diferentes indústrias, tais como a alimentar, farmacêutica e cosmética. As plantas halófilas são capazes de tolerar elevadas concentrações de salinidade, e são encontradas em ambientes extremos, como sapais, salinas, dunas e praias, onde se encontram expostas a elevados níveis de radiação ultravioleta e a outros stresses ambientais, tais como secura e alagamento. De forma a minimizar os efeitos do stress ambiental, estas plantas estão equipadas com poderosos mecanismos de defesa que incluem, por exemplo, a produção de diversos compostos bioativos, como os compostos fenólicos, cujas propriedades biológicas lhes conferem variadas aplicações biotecnológicas. De facto, algumas plantas halófilas já foram utilizadas para o desenvolvimento de ingredientes inovadores para a indústria alimentar (por exemplo, Hippophae rhamnoides L., Salicornia sp. e Chenopodium quinoa Willd.), cosmética (particularmente Armeria marítima (Mill.) Willd. e Crithmum maritimum L.) e/ou farmacêutica (como suplementos alimentares, nomeadamente Atriplex halimus L. e C. quinoa). No entanto, tanto as atividades biológicas como o potencial biotecnológico destas plantas continuam pouco explorados. Na região do Algarve (sul de Portugal) existem várias espécies halófilas, mas poucas têm sido estudadas apesar do seu grande potencial comercial. De forma a preencher esta lacuna, este trabalho avaliou várias espécies comuns na costa Algarvia quanto ao seu potencial enquanto fontes de compostos e/ou extratos bioativos com aplicações biotecnológicas nas áreas farmacêutica, cosmética e/ou alimentar. As espécies selecionadas foram a Frankenia laevis L. (urze do mar), Halopeplis amplexicaulis (Vahl) Ces., Pass. & Gibelli, Juncus acutus L. (junco-agudo), J. inflexus L. (junco-curvado ou junco-desmedulado), J. maritimus L. (junco-das-esteiras ou junco-marítimo), Limonium algarvense Erben (ladina), e Polygonum maritimum L. (polígonomarítimo). Para tal, começou-se por preparar extratos de metanol e diclorometano dos diferentes órgãos (sementes, flores, pedúnculos, folhas, e/ou raízes), que foram posteriormente avaliados quanto às suas atividades antioxidante (atividade redutora de radicais e quelante de metais), antidiabética (inibição das enzimas α-glucosidase e α-amilase), anti-hiperpigmentação (inibição da enzima tirosinase) e neuroprotetora (inibição das enzimas acetil- e butirilcolinesterase) in vitro. A ladina e o polígono-marítimo tiveram as mais elevadas atividades antioxidante, neuroprotetora e anti-hiperpigmentação, enquanto que o polígonomarítimo revelou também elevada capacidade antidiabética. Por sua vez, as espécies de Juncus mostraram propriedades antioxidante e neuroprotetora. Estas espécies foram então selecionadas para serem estudas em maior detalhe relativamente às suas propriedades biológicas e à sua composição química, usando diferentes solventes de extração, metodologias e modelos experimentais in vitro. Os extratos metanólicos feitos a partir dos órgãos da ladina foram estudados quanto à sua atividade antioxidante e composição química através de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). A maior capacidade antioxidante e conteúdo em compostos fenólicos, nomeadamente em catequina e ácido gálico, foi observada nos extratos das flores. Posteriormente, infusões e decocções (formulações normalmente utilizadas em medicina tradicional) das flores foram avaliadas quanto às suas atividades antioxidante, anti-inflamatória e composição química, em comparação com o chá verde, uma vez que este último é conhecido pelas suas propriedades medicinais. A ladina apresentou atividades semelhantes às do chá verde, mas menor toxicidade do que este quando testada em linhas celulares de mamífero. Os principais compostos da ladina, detetados por HPLC, foram os ácidos gálico, salicílico e gentísico. De seguida, foi estudado o potencial antioxidante, neuroprotetor e antidiabético de infusões e decocções obtidas de misturas de flores da ladina e chá verde, em diferentes proporções, para determinar possíveis efeitos sinérgicos ou antagónicos. As infusões e decocções de ambas as espécies tiveram elevada atividade antioxidante, mas a sua combinação aumentou sinergicamente a capacidade de sequestração de radicais •OH e a redução da peroxidação lipídica. Para além disso, extratos da ladina apresentaram maior capacidade de inibição das enzimas acetil- e butirilcolinesterase, comparativamente com o chá verde, e as misturas com o chá verde tiveram efeitos sinérgicos. Por sua vez, o chá verde apresentou maior atividade inibitória da enzima α-glucosidase, mas esta atividade decresceu quando misturado com a ladina. A diversidade de compostos detetados por HPLC aumentou nas misturas, as quais ficaram enriquecidas nos ácidos hidroxibenzóico, cafeíco e siríngico. Devido aos resultados promissores obtidos com os extratos da ladina, foi testado o seu cultivo em estufa sob irrigação com água com diferentes salinidades (água doce e água salina proveniente de uma aquacultura). Avaliou-se a influência da salinidade da água da rega no crescimento das plantas, nas propriedades antioxidantes, composição química e citotoxicidade de extratos preparados a partir da biomassa dos diferentes órgãos da planta. Os resultados foram comparados com os obtidos com extratos de plantas colhidas do meio selvagem, que mostraram ser mais ativas. No entanto, as plantas cultivadas mantiveram elevada atividade antioxidante in vitro, especialmente as irrigadas com água doce, assim como baixa toxicidade contra células de mamífero. A análise por cromatografia líquida (LC) acoplada a espectrometria de massa de ultra-alta resolução (UHRMS/MS), mostrou que as flores possuíam maior diversidade de compostos, e que a sua abundância variou com a salinidade da irrigação. Por exemplo, o teor de apigenina e luteolina aumentou com a salinidade, enquanto que o de miricetina diminuiu. A quercetina foi detetada apenas nas plantas silvestres, enquanto que o eriodictiol foi identificado apenas nas plantas cultivadas. Uma vez que o género Polygonum é tradicionalmente utilizado para o tratamento de doenças relacionadas com a inflamação e diabetes, as propriedades antioxidante, antiinflamatória, antidiabética foram avaliados assim como o seu perfil químico. O extrato metanólico das folhas mostrou a maior capacidade antioxidante, enquanto que o extrato de diclorometano das folhas apresentou maior atividade anti-inflamatória. O extrato de metanol das raízes e das folhas exibiu maior atividade antidiabética. A análise por cromatografia gasosa e espectrometria de massa (GC-MS) permitiu identificar os compostos β-sitosterol, estigmasterol, 1-octacosanol e ácido linolénico como os possíveis responsáveis pelas atividades observadas. Em seguida, o potencial neuroprotetor desta espécie foi estudado através da avaliação do efeito protetor in vitro sobre o stress oxidativo induzido e a neuroinflamação, seguido pela determinação da sua composição química por cromatografia líquida de ultra-alta pressão (UHPLC) acoplada a espectrometria de massa (MS/MS). Os extratos metanólicos (raízes e folhas) apresentaram a maior atividade neuroprotetora e anti-inflamatória, assim como de redução da citotoxicidade induzida por peróxido de hidrogénio. O polígono-marítimo foi também estudado quanto às suas propriedades anti-hiperpigmentação. Nesta fase, foram utilizados diferentes solventes e metodologias de extração, para otimizar a extração de compostos fenólicos e flavonoides. O extrato de 100% acetona foi selecionado, e apresentou elevada atividade antioxidante, anti-inflamatória e anti-hiperpigmentação. A análise dos seus constituintes foi realizada por LC-UHRMS, e as moléculas miricitrina, catequina e monogaloilhexose foram as principais detetadas. À semelhança da ladina, o polígono-marítimo também foi produzido em estufa, irrigado com diferentes salinidades e sujeito a três colheitas (em intervalos de 6 semanas). A influência destes fatores no seu crescimento, perfil antioxidante, anti-inflamatório e químico (LC-UHRMS), de extratos preparados a partir da biomassa, foi estudada. Neste caso, os extratos de plantas irrigadas com água doce foram mais ativos que os provenientes de plantas irrigadas com água salgada artificial, especialmente na terceira colheita. Alguns compostos permitiram diferenciar entre salinidades ou colheitas, como o hiperosídeo, cuja concentração aumentou com a salinidade, e os teores de ácido cafeico 3-sulfato que diminuíram da primeira para a segunda e terceira colheitas. O potencial antioxidante e neuroprotetor de extratos de diclorometano e metanol obtidos dos vários órgãos das espécies de Juncus foram também explorados. A espécie junco-agudo apresentou os melhores resultados, particularmente o extrato de diclorometano das folhas. O composto responsável pela atividade foi isolado e identificado por HPLC como sendo o juncunol (um composto derivado do fenantreno). Esta molécula tinha sido previamente isolada das partes aéreas do junco-agudo, tendo revelado uma promissora atividade seletiva e citotóxica contras células de carcinoma hepatocelular. Deste modo, foi feito um estudo preliminar do seu modo de ação em células de hepatocarcinoma humano. Este composto mostrou promover a indução de apoptose, potencialmente relacionada com uma diminuição do potencial de membrana mitocondrial, assim como interrupção do ciclo celular na fase G0/G1. Considerando as espécies acima mencionadas, tanto a ladina como o polígono-marítimo apresentaram um elevado teor em compostos fenólicos, no entanto, a ladina teve um teor de flavonoides mais elevado. O perfil de fenólicos mostrou elevada prevalência de ácidos fenólicos na ladina e de flavonoides no polígono-marítimo. Os extratos de polígono-marítimo apresentaram a maior capacidade antioxidante, anti-inflamatória, neuroprotetora, antidiabética e anti-hiperpigmentação in vitro. No entanto, a ladina mostrou atividades bastante próximas deste. A molécula juncunol, isolado do junco-agudo, apresentou propriedades neuroprotetoras, assim como capacidade de indução de apoptose e paragem do ciclo celular em células do carcinoma hepatocelular. No geral, tanto a ladina como o polígono-marítimo mostraram ser fontes de ingredientes bioativos que podem ajudar a prevenir doenças relacionadas ao stress oxidativo, hiperpigmentação, diabetes, e distúrbios neurodegenerativos. O junco-agudo tem o potencial de ser usada como fonte de antioxidantes, agentes neuroprotetores e anti-tumorais. Em conclusão, o resultado deste trabalho demonstra que as três espécies de plantas halófilas estudadas são boas candidatas a serem utilizadas para fins comerciais: como bebidas à base de plantas (infusões/decocções da ladina), como fontes de moléculas importantes para a indústria (junco-agudo – juncunol), ou como ingredientes para a indústria cosmética (polígonomarítimo) e farmacêutica (junco-agudo – juncunol, polígono-marítimo e/ou ladina), e ainda como nutracêuticos/suplementos alimentares (junco-agudo, polígono-marítimo e/ou ladina). Adicionalmente, o perfil químico e atividades biológicas podem ajudar a explicar as suas aplicações biotecnológicas.
The author acknowledges the Portuguese Foundation for Science and Technology – FCT for funding the PhD scholarship (SFRH/BD/116604/2016). GreenVet (ALG-01-0145-FEDER-028876)

Dissertação de Mestrado em Biodiversidade e Biotecnologia Vegetal, apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra.
Wild and integrated multi-trophic aquaculture (IMTA) samples of the Portuguese edible seaweed Osmundea pinnatifida were screened for antioxidant, antitumor and antimicrobial (antibacterial and antifungal) activities. Extracts were obtained using solvents with different polarity, namely methanol, dichloromethane and n-Hexane. The antioxidant activity was assessed through the 2,2-diphenly-1-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging activity and oxygen radical absorbance capacity (ORAC) methods. Total phenolic content (TPC) was also estimated. The antitumor activity was evaluated in HepG-2, MCF-7 and SH-SY5Y cell lines through the 3-[4, 5-dimethylthiazol2-yl]-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) assay. The antibacterial activity was assessed against Escherichia coli and Staphylococcus aureus through a standardized broth microdilution assay. In turn, antifungal activity against Candida albicans was studied using the standardized disk diffusion and broth microdilution; and also against Alternaria infectoria and Aspergillus fumigatus through radial growth inhibition and standardized broth microdilution assays, specific to filamentous fungi. Light, confocal and fluorescence microscopy observation, along with cell wall chitin and β-glucan quantification were also used to study the effect of the extracts on the A. infectoria and Asp. fumigatus fungal cell wall and morphology. Among the solvents used for extraction, dichloromethane was the most effective to extract phenolic compounds in both samples. It were accounted 46.82 mg gallic acid equivalents (GAE)/g of dry extract in dichloromethane extract of wild sample (Dw) and 43.48 mg GAE/g in dichloromethane extract of IMTA-cultivated (Dc). The highest ORAC was also verified in the dichloromethane extracts (Dw: 414 μmol trolox equivalents (TE)/g; Dc: 499.9 μmol TE/g), evidencing a high correlation with the TPC content (r=0.9499, P<0.01) which was also sustained by the principal components analysis (PCA). The tested extracts were weak DPPH radical scavengers due to the high EC50 values obtained (>900 μg/mL). However, the effect of some fractions was dose-dependent. Dichloromethane extracts promoted a cytostatic effect on MCF-7 cells. Additionally, they shown cytotoxicity in SH-SY5Y cells and inhibited its proliferation. Dc presented higher cytotoxicity (IC50: 923.6 μg/mL) whereas Dw was more effective (IC50: 508.8 μg/mL) in inhibiting SH-SY5Y cells proliferation. All this effects were dose-dependent. Overall, there were no statistically significant differences (P>0.05) in the antioxidant and antitumor activities shown by the wild and IMTA-cultivated samples. The n-Hexane fraction of the wild seaweed (Hw) inhibited the sporulation of A. infectoria in RPMI medium at 30 μg/mL and also induced a statistically significant (P< 0.01) decrease in β-glucan content in mycelium grown in YME at the same concentration. All the studied extracts inhibited the radial growth of Asp. fumigatus in PDA. n-Hexane fractions at 100 μg/mL were the most effective (Hw: 14.64%; Hc: 19.83%). Furthermore, liquid cultures in YME supplemented with 100 μg/mL of Dw and 30 μg/mL of Hw showed abnormal conidial heads, completely devoid of conidia. Asp. fumigatus grown in YME supplemented with 100 μg/mL of Dw and with 100 μg/mL of Dc induced a statistically significant (P<0.01 and P<0.03, respectively) reduction in chitin content. Asp. fumigatus treated with 30 μg/mL of Hw also presented decreased chitin contents, although not significant. Thus, the present study reveals Osmundea pinnatifida as a promising source of biologically active compounds with interest for further biotechnological applications.
A Osmundea pinnatifida é uma espécie de alga vermelha edível abundante na costa portuguesa. Amostras selvagens e cultivadas em aquacultura multitrófica integrada (AMTI) foram avaliadas quanto à suas atividades antioxidante, antitumoral e antimicrobiana (antibacteriana e antifúngica). Os extratos foram obtidos através um processo de extração sequencial, no qual foram usados solventes orgânicos de diferentes polaridades, nomeadamente metanol, diclorometano e n-Hexano. A atividade antioxidante foi avaliada através de métodos in vitro. Foram usados os métodos do DPPH (2,2-diphenly-1-picrylhydrazyl) e índice ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity). O conteúdo em polifenóis foi também estimado através do método de Folin-Ciocalteu. Por sua vez, a atividade antitumoral foi avaliada em três linhas celulares, HepG-2, MCF-7 e SH-SY5Y, através do método MTT (3-[4, 5-dimethylthiazol2-yl]-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide). A atividade antibacteriana foi avaliada contra Escherichia coli e Staphylococcus aureus através do método standardizado da microdiluição em meio líquido. A atividade antifúngica contra Candida albicans foi estudada usando métodos standardizados – difusão em disco e microdiluição em meio líquido. Foi também aferida a atividade antifúngica contra os fungos filamentosos Alternaria infectoria e Aspergillus fumigatus através da inibição do crescimento radial e do método standardizado de microdiluição em meio líquido, específico para fungos filamentosos. Observações em microscopia ótica, confocal e de fluorescência, juntamente com a quantificação dos conteúdos em quitina e em β-glucano, foram também usados para estudar o efeito dos extratos na parede celular de A. infectoria e Asp. fumigatus. Entre os solventes usados na extração, o de diclorometano foi o mais eficaz na extração de compostos fenólicos em ambas as amostras. Para o extrato de diclorometano da amostra selvagem (Dw) foram determinados 46,82 mg de equivalentes em ácido gálico (EAG)/g de extrato seco, enquanto que para o extrato de diclorometano da amostra cultivada em AMTI (Dc) o conteúdo em fenóis foi estimado em 43,48 mg EAG/g. O índice ORAC mais elevado também foi verificado nos extratos de diclorometano (Dw: 414 μmol de equivalentes de trolox (ET)/g; Dc: 499,9 μmol ET/g), evidenciando uma elevada correlação com o conteúdo total em polifenóis (r=0,9499; P<0,01), que foi corroborada pela análise de componentes principais. Os extratos testados apresentaram uma fraca capacidade de reduzir o radical DPPH devido aos valores elevados de EC50 obtidos (>900 μg/mL). No entanto, o efeito de algumas frações dependente da concentração. Os extratos de diclorometano promoveram um efeito citostático nas células MCF-7. Para além disso, estes extratos exibiram citotoxicidade em células SH-SY5Y e inibiram a sua proliferação. Dc apresentou uma citotoxicidade maior (IC50: 923,6 μg/mL), enquanto que Dw foi mais eficaz (IC50: 508,8 μg/mL) na inibição da proliferação em células SH-SY5Y. Estes efeitos demonstraram ser dependentes da concentração. No geral, não se verificaram diferenças estatisticamente significativas (P>0,05) entre a amostra selvagem e a cultivada em AMTI ao nível das atividades antioxidante e antitumoral. A fração de n-Hexano da alga selvagem (Hw) inibiu a esporulação de A. infectoria em meio RPMI a 30 μg/mL. Para além disso, induziu um decréscimo estatisticamente significativo (P<0,01) no conteúdo em β-glucano no micélio crescido em meio YME, à concentração referida anteriormente. Todos os extratos em estudo inibiram o crescimento radial de Asp. fumigatus em PDA. Entre eles, as frações de n-Hexano a 100 μg/mL foram as mais eficazes (Hw: 14,64%; Hc: 19,83%). Para além disso, culturas líquidas em meio YME suplementado com 100 μg/mL de Dw e 30 μg/mL de Hw evidenciaram cabeças aspergilares anormais, completamente desprovidas de conídios. Asp. fumigatus crescido em meio YME suplementado com 100 μg/mL de Dw e com 100 μg/mL de Dc induziram uma redução estatisticamente significativa (P<0,01 e P<0,03) nos conteúdos de quitina. Asp. fumigatus tratados com 30 μg/mL de Hw também apresentou um decréscimo nos conteúdos de quitina, apesar de não ser significativo. Assim, o presente estudo revelou a Osmundea pinnatifida como uma fonte bastante promissora de compostos biologicamente ativos com interesse para futuras aplicações biotecnológicas.

The increasing spectrum of multidrug-resistant bacteria has caused a major global public health concern, necessitating the discovery of novel antimicrobial agents. Additionally, recent advancements in the use of microbial cells for the scalable production of industrial enzymes has encouraged the screening of new environments for efficient microbial cell factories. The unique ecological niche of the Red Sea points to the promising metabolic and biosynthetic potential of its microbial system. Here, ten sequenced Bacilli strains, that are isolated from microbial mat and mangrove mud samples from the Red Sea, were evaluated for their use as platforms for protein production and biosynthesis of bioactive compounds. Two of the species (B.paralicheniformis Bac48 and B. litoralis Bac94) were found to secrete twice as much protein as Bacillus subtilis 168, and B. litoralis Bac94 had complete Tat and Sec protein secretion systems. Additionally, four Red Sea Species (B. paralicheniformis Bac48, Virgibacillus sp. Bac330, B. vallismortis Bac111, B. amyloliquefaciens Bac57) showed capabilities for genetic transformation and possessed competence genes. More specifically, the distinctive biosynthetic potential evident in the genomes of B. paralicheniformis Bac48 and B. paralicheniformis Bac84 was assessed and compared to nine available complete genomes of B. licheniformis and three genomes of B. paralicheniformis. A uniquely-structured trans-acyltransferase (trans-AT) polyketide synthase/nonribosomal peptide synthetase (PKS/NRPS) cluster in strains of this species was identified in the genome of B. paralicheniformis 48. In total, the two B. paralicheniformis Red Sea strains were found to be more enriched in modular clusters compared to B. licheniformis strains and B. paralicheniformis strains from other environments. These findings provided more insights into the potential of B. paralicheniformis 48 as a microbial cell factory and encouraged further focus on the strain’s metabolism at the system level. Accordingly, a draft metabolic model for B. paralicheniformis Bac48 (iPARA1056) was reconstructed, refined, and validated using growth rate and growth phenotypes under different substrates, generated using high-throughput Phenotype Microarray technology. The presented studies indicate that several of the isolated strains represent promising chassis for the development of cell factories for enzyme production and also point to the richness of their genomes with specific modules of secondary metabolism that have likely evolved in Red Sea Bacilli due to environmental adaptation.

Nowadays, there is an increasing demand for food products or bioactive compounds with potential to enhance human health, highlighting the importance of building a cutting edge and scientifically supported knowledge on that regard. In this context, marine macroalgae comprise one of the most promising natural resources, especially considering their large biodiversity and rich phytochemical profile. In fact, marine macroalgae are currently labelled as functional food, since they have demonstrated to hold a multiplicity of beneficial properties, namely antiviral, antifungal, antibacterial, antihypertensive, antidiabetic, neuroprotective, anti-inflammatory, immunomodulatory, among other effects. Besides these health-promoting properties, marine macroalgae are an important element of the diets of several Eastern countries, some of them depicting the highest life expectancy rates and low incidence of diet-related chronic diseases (e.g. cardiovascular diseases and cancer), namely Japan or South Korea. Despite that, there are only a few studies addressing their genome protective capacity, providing some clues concerning macroalgae antioxidant, antigenotoxic and antimutagenic properties. Bearing in mind the importance of the genome integrity and stability, as well as the causal linkage between the DNA damage and multiple diseases, this thesis was built up on the hypothesis that marine macroalgae consumption, as whole food, could be translated on a genoprotective action. Hence, the main goal was to address the properties of the marine macroalgae Ulva rigida (sea lettuce), Fucus vesiculosus (bladderwrack) and Graciliaria (ogonori) towards the DNA integrity promotion and underlying mechanisms. Moreover, as a secondary objective, it was intended to assess the genoprotection afforded by those marine macroalgae included in the diets of farmed fish and human driven models, validating their concept as functional feed/food, especially, in the context of aquaculture and human nutrition. Therefore, four experimental trials were delineated and, in all of them, the respective organisms’ diet was supplemented with the described marine macroalgae species, either individually or in a mix with equal parts of the three species.In the first trial, the gilthead seabream (Sparus aurata) diet was supplemented with aquacultured U. rigida, F. vesiculosus and G. gracilis (5% of supplementation) for 60 days, followed by the treatment of fish with realistic doses/intervals of two aqua-medicines frequently adopted in aquaculture to prevent and/or treat diseases, oxytetracycline (OTC) and formalin (FOR). The genetic damage was assessed by the erythrocytic nuclear abnormalities (ENA) assay and, to shed light on the modulation of the erythrocytic population dynamics, the erythrocyte maturity index (EMI) was also assessed. The macroalgae-supplemented aquafeed evidenced a solid genoprotection against the toxicity induced by the aqua-medicines OTC and FOR, and model genotoxicant, cyclophosphamide (CP). Moreover, OTC and FOR induced an erythrocyte population instability (translated into an aging effect), which was counteracted by the algae supplementation. In turn, U. rigida, F. vesiculosus and two species of Gracilaria, G. vermiculophylla and G. gracilis, were individually tested through their incorporation on the fruit fly (Drosophila melanogaster) diet, at 2.5 and 5%, 1.25 and 5% and 1.25 and 10% of supplementation, respectively. In this trial, the macroalgae incorporated were from aquaculture or wild origin, to evaluate the influence of the growing conditions on the genome protective potential. The macroalgae antigenotoxic potential against the basal and streptonigrin-induced genetic damage was evaluated through the somatic mutation and recombination test (SMART). Marine macroalgae showed to enhance genome protection, especially against the genetic damage induced by streptonigrin. While U. rigida revealed differences on the antigenotoxic potential associated with the growing conditions (higher genoprotective action afforded by the aquacultured alga), F. vesiculosus depicted similar responses between origins. In turn, Gracilaria showed rather contradictory indications, since the lowest supplementation level enhanced the genome integrity, while the highest showed toxicity signals, especially the wild-harvested species. Furthermore, in the second trial with D. melanogaster, the two U. rigida batches from aquaculture and wild origin (2.5 and 5% supplementation) confirmed to hold differences on the genome protective potential, evaluated through the comet assay improved with the adoption of the endonucleases formamidopyrimidine DNA glycosylase (FPG) and endonuclease III (EndoIII). Although U. rigida from both origins showed a DNA-protective action, especially against the streptonigrin-induced genetic damage, an origin-based genoprotection capacity was evident, since aquacultured alga demonstrated higher antigenotoxic potential. This may be attributed to the phytochemical profile, determined through gas chromatography- and ultra-high-performance liquid chromatography-mass spectrometry analyses, depicting differences on the relative quantity of some phytocompounds, namely fatty alcohols, sterols, sesquiterpenoids and glycerol esters. In the mice (Mus musculus) trial, the antigenotoxic potential of aquacultured macroalgae U. rigida, F. vesiculosus and G. gracilis was investigated, through the comet and the micronucleus assays, considering either a direct consumption (5% supplementation) or an indirect intake via fish (S. aurata) (10% supplementation) that was previously fed with an algae-supplemented diet. The direct consumption of the macroalgae mixture allowed the genoprotection against the methyl methanesulfonate-induced genotoxic damage, besides the accomplishment of a more favourable oxidant status, thus possibly involving desmutagens substances. In turn, the hypothesis concerning the transference of macroalgae genoprotective properties via consumption of fish fed with an algae-supplemented feed was not confirmed. Nevertheless, the transference of the macroalgae phytocompounds is plausible, particularly considering the achievement of a lower pro-oxidant challenging condition. This thesis carries new perspectives regarding the marine macroalgae beneficial properties towards the genome integrity. In fact, U. rigida, F. vesiculosus and Gracilaria species revealed to enhance the genome protection both in farmed fish and human driven models. Overall, the present findings convey new evidences likely to contribute to the development of algaculture and pisciculture industries, as well as to the redefinition of human nutritional habits, reinforcing and validating the concept of marine macroalgae as functional food/feed and subsequent health benefits.
Atualmente, assiste-se a uma crescente procura por alimentos ou compostos bioativos com potencial para melhorar a saúde humana, evidenciando a importância de construir, a esse respeito, um conhecimento de vanguarda e cientificamente suportado. Neste contexto, as macroalgas marinhas constituem um dos mais promissores recursos naturais, tendo em conta, especialmente, a sua vasta biodiversidade e rico perfil fitoquímico. De facto, as macroalgas marinhas são, atualmente, classificadas como alimentos funcionais, tendo demonstrado possuir uma multiplicidade de propriedades benéficas, nomeadamente antiviral, antifúngica, antibacteriana, anti-hipertensiva, antidiabética, neuroprotetora, anti-inflamatória, imunomoduladora, entre outras. Além destas propriedades promotoras da saúde, as macroalgas marinhas são um elemento importante das dietas de vários países orientais, alguns deles revelando as mais elevadas taxas de esperança média de vida e baixa incidência de doenças crónicas relacionadas com a dieta (ex: doenças cardiovasculares e cancro), como o Japão e a Coreia do Sul. Apesar disto, apenas alguns estudos abordaram a sua capacidade protetora do genoma, fornecendo algumas pistas sobre as propriedades antioxidante, antigenotóxica e antimutagénica das macroalgas. Tendo em mente a importância da integridade e da estabilidade do genoma, assim como a ligação causal entre o dano no ADN e múltiplas doenças, esta tese foi alicerçada na premissa de que o consumo de macroalgas marinhas, como alimento integral, pode traduzir-se numa ação genoprotetora. Assim, o principal objetivo foi avaliar as propriedades das macroalgas marinhas Ulva rigida (alface-do-mar) Fucus vesiculosus (bodelha) e Gracilaria (cabelo-de-velha) em relação à promoção da integridade do ADN e os mecanismos subjacentes. Além disso, como objetivo secundário, pretendeu-se avaliar a genoproteção promovida por aquelas macroalgas marinhas quando incluídas nas dietas de peixes de aquacultura e de organismos-modelo de investigação focada no Homem, validando a sua assunção como ração/alimento funcional, especialmente, no contexto de aquacultura e de nutrição humana. Deste modo, foram delineados quatro ensaios experimentais e, em todos eles, a dieta dos respetivos organismos foi suplementada com as espécies de macroalgas marinhas descritas, ou individualmente ou em mistura das três espécies em partes iguais. No primeiro ensaio, a dieta de dourada (Sparus aurata) foi suplementada com U. rigida, F. vesiculosus e G. gracilis de aquacultura (5% de suplementação) durante 60 dias, a que se seguiu o tratamento dos peixes com doses/intervalos realistas de dois medicamentos frequentemente adotados em aquacultura para prevenir e/ou tratar doenças, oxitetraciclina (OTC) e formalina (FOR). O dano genético foi avaliado pelo ensaio das anomalias nucleares eritrocíticas (ANE) e para clarificar a modulação da dinâmica da população eritrocítica, o índice de maturidade eritrocítica (IME) foi avaliado. A dieta suplementada com macroalgas evidenciou uma sólida genoproteção contra a genotoxicidade induzida pelos medicamentos OTC e FOR, e pelo genotóxico modelo, ciclofosfamida (CP). Além disso, OTC e FOR induziram uma instabilidade na população eritrocítica (traduzida num efeito de envelhecimento), a qual foi neutralizada pela suplementação das algas. Por seu lado, U. rigida, F. vesiculosus e duas espécies de Gracilaria, G. vermiculophylla e G. gracilis, foram individualmente avaliadas através da sua incorporação na dieta da mosca-da-fruta (Drosophila melanogaster) a 2.5 e 5%, 1.25 e 5% e 1.25 e 10% de suplementação, respetivamente. Neste ensaio, as macroalgas incorporadas foram de aquacultura ou de colheita selvagem, de forma a avaliar a influência das condições de crescimento no potencial protetor do genoma. O potencial antigenotóxico das macroalgas contra o dano genético basal e induzido pela estreptonigrina foi avaliado através do teste de mutação somática e recombinação (SMART). As macroalgas marinhas mostraram aumentar a proteção do genoma, especialmente contra o dano genético induzido pela estreptonigrina. Enquanto a U. rigida revelou diferenças no potencial antigenotóxico associadas às condições de crescimento (maior ação genoprotetora promovida pela alga de aquacultura), F. vesiculosus mostrou respostas semelhantes entre as origens. Por seu lado, a Gracilaria mostrou indicações bastante contraditórias, uma vez que o nível mais baixo de suplementação aumentou a integridade do genoma, enquanto o mais alto mostrou sinais de toxicidade, especialmente para a espécie de colheita selvagem. Além disso, no segundo ensaio com D. melanogaster, os dois lotes de U. rigida, de aquacultura e de origem selvagem (suplementação de 2.5 e 5%), confirmaram diferenças no potencial protetor do genoma, avaliado através do ensaio do cometa melhorado com a adoção das endonucleases glicosilase formamidopirimidina (FPG) e endonuclease III (EndoIII). Embora a U. rigida das duas origens tenha mostrado uma ação protetora do ADN, especialmente contra o dano genético induzido pela estreptonigrina, uma capacidade genoprotetora dependente da origem foi evidente, sendo que a alga de aquacultura demonstrou maior potencial. Isto pode ser atribuído ao perfil fitoquímico, determinado por análises de cromatografia de gás e cromatografia líquida de ultra e alta performance acopladas a espectrometria de massa, revelando diferenças na quantidade relativa de alguns fitocompostos, nomeadamente álcoois alifáticos, esteróis, sesquiterpenos e ésteres do glicerol. No ensaio com murganhos (Mus musculus), o potencial antigenotóxico das macroalgas de aquacultura U. rigida, F. vesiculosus e G. gracilis foi investigado, através dos ensaios do cometa e dos micronúcleos, considerando um consumo direto (5% de suplementação) ou uma ingestão indireta via peixe (S. aurata) (10% de suplementação) que foi previamente alimentado com uma dieta suplementada com algas. O consumo direto da mistura das macroalgas promoveu a genoproteção contra o dano genotóxico induzido pelo metanossulfonato de metilo, além de um estado pró-oxidante mais reduzido, possivelmente envolvendo substâncias desmutagénicas. Por outro lado, a hipótese relativa à transferência das propriedades genoprotetoras das macroalgas via consumo de peixe alimentado com ração suplementada com algas não se confirmou. Ainda assim, a transferência de fitocompostos das macroalgas é plausível, particularmente considerando a promoção de uma menor condição pró-oxidante. Esta tese aporta novas perspetivas acerca das propriedades benéficas das macroalgas relativamente à integridade do genoma. De facto, U. rigida, F. vesiculosus e espécies de Gracilaria demonstraram aumentar a proteção do genoma em peixe de aquacultura e em organismos-modelo para o Homem. No geral, as presentes conclusões transmitem novas evidências que poderão contribuir para o desenvolvimento das indústrias de algacultura e piscicultura, assim como para a redefinição dos hábitos nutricionais humanos, reforçando o conceito de alimento/ração funcional e subsequentes benefícios para a saúde.
Programa Doutoral em Biologia

Plants naturally host complex microbial communities in which the plant and the symbiotic partners act as an integrated metaorganism. These communities include beneficial (i.e. plant growth promoting, PGP) microorganisms which provide fundamental ecological services able to enhance host plant fitness and stress tolerance. PGP microorganisms represent a potential bioresource for agricultural applications, especially for desert farming under the harsh environmental conditions occurring in hot/arid regions (i.e. drought and salinity). In this context, understanding the ecological aspects of the associated microorganisms is crucial to take advantage of their ecological services. Here, hot/desert ecosystems were selected and two contrasting plant categories were used as models: (i) wild plants (i.e. speargrasses) growing in hot-desert sand dunes and (ii) the main crop cultivated in desert ecosystems, the date palm. By using highthroughput DNA sequencing and microscopy, the ecology and functionality of the microbial communities associated with these plants were characterized. Additionally, the PGP services of bacteria isolated from date palm were explored. I found that the harsh conditions of the desert strongly affect the selection and assembly of microbial communities associated with three different speargrass species, determining a plant species-independent core microbiome always present among the three plant species and carrying important PGP traits. On the contrary, in agroecosystems where desert farming practices are used, the plant species, i.e. date palm exerts a stronger selective pressure than the environmental and edaphic factors favoring the recruitment of conserved microbial assemblages, independent of the differences in the soil and environmental conditions among the studied oases. Such selective pressure also favors the recruitment of conserved PGP microorganisms (i.e. Pseudomonas sp. bacterial strains) able to protect their host from salinity stress through the induction of root architectural changes regulated by the modification of the root system auxin homeostasis. Overall, we found that deserts are unique ecosystems that challenge the paradigm of microbial community assembly, as it was defined from studies in non-arid ecosystems. The understanding of the ecological features regulating the ecological properties of such unique microbial community assembly will be a key-step to improve the chances of successful application of ‘PGP microorganisms’ in arid agroecosystems.

In fungi belonging to the phylum Basidiomycota, sexual identity is usually determined by two genetically unlinked MAT loci, one named PR locus, which encodes one or more pheromone receptors (Ste3) and pheromone precursors (Mfa), and the other, named HD locus, that comprehends at least one pair of divergently transcribed genes encoding homeodomain transcription factors (HD1 and HD2). The two MAT loci work as two distinct mating compatibility check points. Most basidiomycete species are heterothallic, meaning that sexual reproduction requires mating between two sexually compatible individuals harboring different alleles at both MAT loci. However, some species are known to be homothallic, one individual can complete the sexual cycle without mating with a genetically distinct partner. While the molecular underpinnings of the heterothallic life cycles of several basidiomycete model species have been dissected in detail, much less is known concerning the molecular basis for homothallism. The general aim of this research was to study the molecular mechanisms of sexual reproduction in fungi, specifically those governing the homothallic life cycle of P. rhodozyma. Six MAT genes were found in P. rhodozyma, organized in two MAT loci, most likely located on different chromosomes. The PR locus was shown to be composed of two clusters, at approximately 5 kb from one another, each encoding one STE3 gene and one MFA gene, while the HD locus encompassed two divergently transcribed homeodomain transcription factors genes, HD1 and HD2. Functional genetic analysis was performed by targeted gene deletion of the MAT elements found in P. rhodozyma and the results allowed the proposal of a molecular model controlling the homothallic sexual behavior of P. rhodozyma. In this model (i) each pheromone interacts with the pheromone receptor of the other cluster (Mfa1 activates Ste3-2 while Mfa2 activates Ste3-1); since neither pheromone receptor is required per se for sporulation they seem to be functionally redundant; and (ii) both homeodomain proteins appear to work together to regulate genes required for sexual development. Comparison of the MAT regions of additional Phaffia species and of other representatives within the order Cystofilobasidiales, indicate that transitions to homothallism probably occurred several times independently. Furthermore, it revealed a particularly dynamic pattern of MAT gene evolution, with the generation of new receptors within each genus and exceptionally large numbers of mature pheromones encoded in the genomes of some of the species. In conclusion, this work allowed for the first time the elucidation of the basic molecular mechanisms governing the homothallic life cycle of a basidiomycete. At the same time the genetic manipulation of the MAT genes of P. rhodozyma also allowed the generation of preferably outcrossing strains, which may be potentially useful for further improvement of this yeast as an industrial organism by way of selective breeding.

Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011
Xanthophyllomyces dendrorhous é uma levedura basidiomiceta cuja grande relevância biotecnológica advém do facto de ser a única espécie cujo principal pigmento produzido é astaxantina. Este carotenoide possui várias atividades biológicas relevantes e inúmeras aplicações industriais, sendo o segundo carotenoide mais rentável do mercado. Apesar do interesse nesta levedura devido às suas aplicações biotecnológicas, ainda são limitados os conhecimentos sobre a sua biologia e biogeografia. X. dendrorhous foi isolada pela primeira vez durante a década de 60 do século passado a partir de exsudados de árvores de folha caduca em diversas localizações no Hemisfério Norte, tendo-se considerado durante muito tempo restrita a estes habitats e latitudes. Inicialmente descrita como uma levedura assexuada designada Phaffia rhodozyma, em 1995 o seu estado sexuado, Xanthophyllomyces dendrorhous, foi observado e descrito pela primeira vez. O seu ciclo sexuado é caracterizado pela conjugação entre a célula-mãe e a gémula, após a qual ocorre a formação de um holobasídio aéreo que subsequentemente dá origem a basidiósporos na sua extremidade apical. Este estado sexuado é despoletado pela presença de polióis no meio de cultura. Taxonomicamente esta levedura encontra-se classificada na ordem Cystofilobasidiales, classe Tremellomycetes e subfilo Agaricomycotina. A descoberta de um novo habitat de X. dendrorhous em 2007 na Argentina (Patagónia), veio mostrar que esta levedura possui uma distribuição geográfica mais diversificada do que aquela considerada inicialmente. Nas florestas da Patagónia, X. dendrorhous encontra-se associada aos corpos frutíferos de um fungo ascomiceta, parasita obrigatório de árvores Nothofagus, denominado Cyttaria. À semelhança dos exsudados de árvores, os corpos frutíferos de Cyttaria são ricos em açúcares simples, estando presentes nos troncos de Nothofagus uma vez por ano. Após a descoberta de novas populações de X. dendrorhous no Hemisfério Sul foi realizado um estudo filogenético da região ITS (internal transcribed spacer) do rDNA das estirpes de X. dendrorhous e das diferentes árvores hospedeiras tendo-se verificado concordância entre ambas as filogenias. Este facto levou à formulação da hipótese de que a variabilidade intraespecífica observada em X. dendrorhous, poderia dever-se ao facto de cada linhagem se encontrar associada a um hospedeiro diferente. Após a descoberta de X. dendrorhous no Hemisfério Sul, a exploração de outras regiões geográficas onde, tanto Nothofagus como Cyttaria estão presentes, foi levada a cabo em 2009 por elementos do laboratório de acolhimento. As amostras biológicas recolhidas na Austrália e Nova Zelândia resultaram na obtenção de novos isolados de Xanthophyllomyces. Face ao número crescente de isolados de Xanthophyllomyces existentes, o presente trabalho teve como principal objetivo o estudo das relações filogenéticas entre as diferentes linhagens existentes assim como, a exploração de possíveis relações entre a variabilidade genética encontrada em Xanthophyllomyces e os hospedeiros aos quais esta levedura se encontra associada. De forma a atingir este objetivo, duas abordagens distintas foram exploradas: (i) amplificação, sequenciação e estudo filogenético de sete fragmentos de genes de Xanthophyllomyces e (ii) a cariotipagem de isolados representativos das diferentes linhagens encontradas. Os dados obtidos foram analisados sob o ponto de vista da associação aos hospedeiros e localização geográfica dos isolados. Os resultados mostraram a existência de quatro populações distintas em X. dendrorhous. A estrutura populacional encontrada sugere que as populações naturais se propagam preferencialmente de forma clonal. Cada uma das diferentes populações apresenta-se associada a diferentes plantas hospedeiras, sendo esse o fator que mais parece influenciar a estrutura populacional. No entanto verificou-se também alguma diferenciação geográfica apesar da sua influência parecer menos relevante. Na filogenia concatenada dos sete fragmentos de genes estudados foi observado que cada grupo filogenético principal agrupa estirpes isoladas a partir de um mesmo hospedeiro, sendo igualmente possível verificar a existência de subdivisões dentro destes mesmos grupos, que estão por sua vez associadas à origem geográfica dos isolados. Este facto foi corroborado pelas networks filogenéticas construídas no software Splistree4 e pela análise da estrutura populacional usando uma abordagem bayesiana implementada no software Structure. A determinação dos cariótipos de estirpes representativas de cada uma das populações encontradas em X. dendrorhous revelou padrões únicos de cromossomas para cada estirpe. O número de cromossomas das onze estirpes estudadas varia entre seis e 11, sendo o seu tamanho entre 0,8 Mb e 3,5 Mb. Não foi observada uma relação entre a estrutura populacional de X. dendrorhous e os cariótipos observados para as diferentes estirpes. Verificou-se que um dos isolados em estudo, possui três genes heterozigóticos. Os alelos de cada gene foram separados por clonagem e posteriormente sequenciados, tendo-se verificado a existência de dois alelos distintos para cada gene heterozigótico. A análise filogenética permitiu observar que, para os três genes heterozigóticos, os alelos encontrados pertencem a duas populações distintas originárias respectivamente da Australásia (em associação com Nothofagus) e Japão (em associação com Betula). Este facto sugere a existência de contacto entre as duas populações. Diversos estudos biogeográficos têm sido realizados sobre os géneros Nothofagus, Betula e Cornus. Enquanto que a biogeografia de Nothofagus parece ter sido moldada por fenómenos como a fragmentação do super continente Gondwana e eventos de dispersão a longas distâncias, as histórias biogeográficas de Betula e Cornus parecem ter sido influenciadas por migrações intercontinentais através das pontes terrestres de Bering e do Oceano Atlântico durante o período geológico Terciário. A análise da atual distribuição de X. dendrorhous levando em consideração as histórias biogeográfias dos seus hospedeiros parece sugerir uma correlação entre ambas. É possível que a distribuição de X. dendrorhous no Hemisfério Sul esteja relacionada com a biogeografia de Nothofagus, assim como a sua distribuição no hemisfério Norte parece ser coerente com as histórias biogeográficas de Betula e Cornus. A coexistência de Nothofagaceae, Fagaceae e Betulaceae na região do arquipélago indo-australiano poderá ter permitido um salto de hospedeiro por parte de X. dendrorhous que assim colonizou outras áreas no Hemisfério Norte. Entre os isolados recolhidos na Australásia foram encontradas duas putativas novas espécies de Xanthophyllomyces. É possível observar que a divergência destas novas espécies relativamente a X. dendrorhous se verifica ao nível molecular tanto na região ITS como nas sete regiões genómicas estudadas. As duas espécies, Xanthophyllomyces sp. I e Xanthophyllomyces sp. II apresentam o mesmo estado sexuado que X. dendrorhous, assim como produção de astaxantina. O presente estudo constitui o primeiro registo da existência de mais do que uma espécie no género Xanthophyllomyces. Com este estudo iniciou-se a exploração da recém descoberta biodiversidade existente na Australásia, identificando-a como um possível hotspot de diversidade e possivelmente como ponto de origem do género Xanthophyllomyces.

Dissertação de Mestrado em Biodiversidade e Biotecnologia Vegetal apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia
Atualmente, o aquecimento global, causado pelo aumento dos gases do efeito de estufa na atmosfera, é uma preocupação séria entre os cientistas (Bhola et al., 2013; Rasul et al., 2017). Para além das alterações diretas na atmosfera, as produções agrícolas também estão a ser afetadas, sendo esperadas reduções na produção de alimento (Altieri & Nicholls, 2013).O aumento da população mundial e a expansão da economia levam ao aumento da procura por fontes alternativas de alimento, bem como por fontes de biocombustíveis amigas do ambiente (Harun et al., 2010; Hannon et al., 2014).As microalgas podem ser utilizadas para aumentar o valor nutricional dos alimentos e como suplemento das rações de animais convencionais, afetando positivamente a saúde e o crescimento de ambos, humanos e animais (Spolaore et al., 2006; Guedes & Malcata, 2012).Para além disso, as microalgas conseguem utilizar de forma eficiente o CO2, sendo responsáveis por mais de 40 % da fixação global de carbono. Neste contexto, as culturas de microalgas podem ser consideradas como um dos principais processos biológicos de fixação de CO2 para a mitigação dos níveis de CO2 na atmosfera e, consequentemente, atenuação do aquecimento global (Pires et al., 2012).Como o trabalho foi desenvolvido na ALGAFARM (empresa de produção de microalgas), a estirpe isolada foi avaliada de acordo com a necessidade de se adequar à empresa. Foi testado meio com 10 mM de azoto e 1 mM de azoto. Para maiores concentrações de biomassa e composição bioquímica melhorada para alimentação humana e animal, o meio com 10 mM de azoto é o mais adequado.A estirpe de Chlorococcum foi avaliada em scale-up de reatores até ao PBR de escala industrial de 10000 L. As melhores produtividades volumétricas, máxima e global, foram obtidas no PBR de escala piloto de 2500 L com 0,153 g.L-1.dia-1 e 0,098 g.L-1.dia-1, respetivamente. No entanto, as melhores produtividades areais, máxima e global, foram conseguidas pelo PBR de escala industrial de 10000 L com 36,559 g.m-2.dia-1 e 17,419 g.m-2.dia-1, respetivamente.A melhor composição bioquímica do Chlorococcum foi obtida no PBR de escala piloto de 2500 L com 55,72 % de conteúdo de proteína, 18,35 % de conteúdo de lípidos totais (onde 74,70 % são PUFAs), 17,71 % de hidratos de carbono e 7,61 % de cinzas e atingindo valores de 4,02 % de clorofila total e 1,09 % de conteúdo de carotenóides totais (onde 71,01 % é luteína e 16,57 % é β-caroteno).O Chlorococcum isolado nas instalações da ALGAFARM mostrou ter grande potencial para alimentação animal e humana uma vez que atingiu valores elevados de proteína e, também, porque contém uma quantidade relevante de ácidos gordos polinsaturados.Esta estirpe, sem otimização do crescimento, atingiu facilmente valores elevados de clorofila total, que pode ser utilizada como corante alimentar natural. Também é adequada para aplicação nas indústrias nutracêutica e farmacêutica uma vez que mostrou um conteúdo de carotenóides totais de mais de 1 % do peso seco da biomassa, maioritariamente constituído por luteína (5.374 mg.g-1) e β-caroteno (1.247 mg.g-1).Apesar do Chlorococcum sp. ter sido reportado na literatura como tendo a capacidade de produzir astaxantina, este pigmento não foi encontrado como componente no conteúdo de carotenóides totais, uma vez que a sua produção não foi induzida.O Chlorococcum isolado foi avaliado por microscopia eletrónica tradicional e por análise molecular com o objetivo de identificar a espécie. No entanto, não foi encontrada homologia. Estes resultados não excluem a possibilidade desta estirpe poder ser uma nova espécie, ainda não identificada. No entanto, não permite ter 100 % de certeza e são necessárias mais análises.
Currently, global warming, caused by the increase of greenhouse gases in the atmosphere, it is a serious concern among scientist (Bhola et al., 2013; Rasul et al., 2017). Beyond the direct atmospheric changes, the agricultural productions are also being affected and that are expected reductions in food production (Altieri & Nicholls, 2013).The increasing world’s population and expanding economy leads to increasing demand on alternative sources of food as well as environmental friendly sources of biofuels (Harun et al., 2010; Hannon et al., 2014).Microalgae can be used to enhance the nutritional value of food and as supplement of conventional animal feed, positively affecting the health and growth of humans and animals (Spolaore et al., 2006; Guedes & Malcata, 2012).Beyond, microalgae can efficiently use CO2, being responsible for more than 40 % of global carbon fixation. In this context, microalgal cultures can be considered one of the main biological CO2 fixation process for the mitigation of CO2 levels at the atmosphere and, consequently, the global warming (Pires et al., 2012).As the work was developed at ALGAFARM (microalgae production company), the isolated strain was evaluated according to the needs for being suitable for the company. Medium with 10 mM of nitrogen and 1 mM of nitrogen were tested. For high biomass concentration and improved biochemical composition for food and feed, the 10 mM of nitrogen medium is more suitable.The strain of Chlorococcum was evaluated in scale-up reactors until industrial scale 10000 L PBR. The best volumetric productivities, maximum and global, were obtained in the pilot scale 2500 L PBR with 0.153 g.L-1.day-1 and 0.098 g.L-1.day-1, respectively. However, the best areal productivities, maximum and global, were reached in industrial scale 10000 L PBR with 36.559 g.m-2.day-1 and 17.419 g.m-2.day-1, respectively.Chlorococcum better biochemical composition was obtained in the pilot scale 2500 L PBR with 55.72 % of protein content, 18.35 % of total lipids content (where 74.70 % are PUFAs), 17.71 % of carbohydrates and 7.61 % of ashes and reaching values of 4.02 % of total chlorophyll and 1.09 % of total carotenoids content (where 71.01 % is lutein and 16.57 % is β-carotene).Chlorococcum strain isolated in the ALGAFARM facilities showed to have a great potential for feed and food applications since it reached high values of proteins content and it also contain relevant amount of polyunsaturated fatty acids. This strain, without growth optimization, easily reached high values of total chlorophyll, which can be used as natural food colorant. It is also suitable for application in nutraceutical and pharmaceutical industries since showed a total carotenoids content of more than 1 % of biomass dry weight, mainly constituted by lutein (5.374 mg.g-1) and β-carotene (1.247 mg.g-1).Despite of Chlorococcum sp. was reported in the literature to have the capacity to produce astaxanthin (Liu & Lee, 1999; Yuan et al., 2002), this pigment was not found as component of total carotenoids content, since its production was not induced.The isolated Chlorococcum was evaluated traditional microscopic observation and by molecular analysis to identify the specie. However, any homology was found. The results do not exclude the possibility of this strain could be a new specie, not yet identified. Although, it do now allows to be 100 % sure of it and more analysis is need.

Lung cancer currently leads the cancer-related mortality rate worldwide. It is a highly incident, invasive and metastatic cancer. Cancer treatment is usually ensured by the combination of surgery, and adjuvant therapies (chemo- and radiotherapy). However, this approach presents problems in terms of efficacy, toxicity to peripheral tissues and resistance. These limitations associated with the occurrence of bacterial respiratory tract infections (IBTR) promote the ineffectiveness of cancer treatment, leading to high mortality and morbidity. In recent years there has been an effort to produce a new generation of compounds that fill these clinical gaps, but the results are still not satisfactory. Thus, the search for new natural compounds that evidence anticancer and/or antimicrobial activity is crucial. In this context, microorganisms constitute a rich source of bioactive compounds, due to their secondary metabolism developed in response to stress conditions, ensuring their survival/resilience. Extreme and/or under-exploited environments, such as caves, sustain microorganisms with high biotechnological potential. Thus, the objectives of this work were: (1) to make the state of the art on lung cancer, BTRI associated with it, available treatments and the discovery of new natural compounds with therapeutic value; (2) present an unprecedented review of calcareous karstic caves, the microbial habitats it sustain and the biotechnological power of these microorganisms for industrial, environmental and medical applications; (3) screening the antimicrobial and anticancer activity of bacteria isolated from under-exploited environmental niches. Archaea and Bacteria in karst caves underwent an evolution under selective pressures, thus developing a highly specialized biosynthetic metabolism and sustained by a peculiar genetic diversity. In particular, karst cave bacteria and archaea have the ability to synthesize enzymes adapted to low temperatures, as well as have a very attractive resistome and parvome for biotechnological applications. The screening for the bioactivity of bacteria isolated from limestone caves demonstrated its antimicrobial potential against BTRI-promoting bacteria (live colony and crude extract assays). In addition, some of the extracts from different fractions of bacterial culture (mostly Pseudomonas spp.) showed anticancer activity, since the cellular activity of lung cancer cells was decreased/inhibited. This study contributes to the search for natural compounds that may be useful in the fight against lung cancer in the futur
O cancro do pulmão lidera atualmente a taxa de mortalidade associada a cancro, à escala mundial. É um cancro altamente incidente, invasivo e metastizante. O tratamento do cancro é normalmente assegurado pela combinação de cirurgia, e terapias adjuvantes (quimio- e radioterapia). No entanto, esta abordagem apresenta problemas em termos de eficácia, toxicidade para tecidos periféricos e resistência. Estas limitações associadas à ocorrência de infeções bacterianas do trato respiratório (IBTR) fomentam a ineficácia do tratamento do cancro, conduzindo a elevada mortalidade e morbidade. Nos últimos anos tem havido um esforço para produzir uma nova geração de compostos que colmatem estas lacunas clínicas, mas os resultados ainda não são satisfatórios. Assim, a busca de novos compostos naturais que evidenciem atividade anticancerígena e/ou antimicrobiana é premente. Neste contexto, os microorganismos constituem uma rica fonte de compostos bioativos, graças ao seu metabolismo secundário desenvolvido em resposta a condições de stress, para garantir a sua sobrevivência/resiliência. Ambientes extremos e/ou sub-explorados, como as grutas, sustentam microorganismos com elevado potencial biotecnológico. Assim, os objetivos deste trabalho consistiram em: (1) fazer o estado da arte sobre o cancro do pulmão, IBTR a ele associadas, tratamentos disponíveis e a descoberta de novos compostos naturais com valor terapêutico; (2) apresentar uma inédita revisão acerca de grutas Cársicas calcárias, os habitats microbianos que sustentam e o poder biotecnológico desses microorganismos para aplicações industriais, ambientais e médicas; (3) realizar o rastreio da atividade antimicrobiana e anticancerígena de bactérias isoladas de nichos ambientais sub-explorados. Archaea e Bacteria em grutas Cársicas sofreram uma evolução sob pressões seletivas, desenvolvendo assim um metabolismo biossintético altamente especializado e sustentado por uma diversidade genética peculiar. Em particular, têm capacidade de sintetizar enzimas adaptadas a temperaturas baixas, assim como possuem um resistoma e parvoma muito atraentes para aplicações biotecnológicas. O rastreio da bioatividade de bactérias isoladas de grutas calcárias demonstrou o seu potencial antimicrobiano contra bactérias promotoras de IBTR (ensaios com colónia viva e extratos brutos). Além disso, alguns dos extratos de diferentes frações de cultura bacteriana (Pseudomonas spp.) apresentaram atividade anticancerígena, uma vez que a atividade de células de cancro do pulmão de rato (Lewis lung cancer) foi diminuída/inibida. Este estudo constitui um contributo na procura de compostos naturais que futuramente possam servir no combate ao cancro do pulmão.
Mestrado em Biologia Molecular e Celular

Microbial enzymes implicated in plant cell hydrolysis may have several potential aplications such as biomass degradation biocatalysts or with biofuel production. Bark beetles establish symbiosis with several microbial strains which play different roles benifitting the beetle, as the production of hydrolytic enzymes to degrade the ingested wood, the protection against mirobial antagonist or the detoxification of the environment. Fungal symbionts have been traditionally the best studied, but several recent research with bacterial symbionts of several bark beetle species show that bacterial also display important functions for the host. In this study, the bacterial communities of the bark beetle species Cryphalus piceae and Pithophtorus pithophtorus, collected in the Czech Republic from pine and fir trees, respectively, were isolated and 55 out of 89 samples were identified by 16S rRNA gene amplification and sequencing. Members of the genera Erwinia, Pantoea, Curtobacterium, Yersinia, Pseudomonas and Staphylococcus were detected. The isolates were object of study for their possible biotechnological potential in (ligno)cellulose materials degradation by screening several enzymes implicated in plant cell hydrolysis, as cellulases, xylanases, amylases, laccases, as well as their capability for colorant...

Dissertação de Mestrado em Bioquímica apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia
Atualmente, acredita-se que os organismos que constituem maioritariamente a biosfera na Terra, os microrganismos, se encontram em elevada percentagem na biosfera de profundidade. Este termo é referente ao conjunto de habitats que se localizam abaixo da superfície dos continentes e do fundo dos oceanos e englobam microrganismos que podem ser utilizados para o estudo de estratégias de sobrevivência em condições extremas. No entanto, em escassas situações é possível simular todas as condições necessárias ao cultivo destes extremófilos em ambiente laboratorial e, por este motivo, a maioria destes microrganismos permanece por cultivar – designando-se por “microbial dark matter”. A nascente de Alfaguara, localizada nos Peridotitos de Ronda, no sul de Espanha, está associada a um aquífero de profundidade gerado por reações de serpentinização. Com o objetivo de perceber qual a diversidade estrutural das populações bacterianas aeróbias heterotróficas presentes neste habitat, uma série de métodos dependentes de cultivo foi aplicada. Posteriormente, os isolados foram agrupados por perfil de RAPD, o(s) isolado(s) representativo(s) de cada grupo foram sumariamente caracterizados e sua filogenia foi determinada pela sequenciação do gene 16S rRNA. Com esta análise, determinou-se que a maioria dos isolados pertenciam ao filo Firmicutes, nomeadamente ao género Bacillus. Outros pertenciam ao filo Actinobacteria, sendo mais relacionados com espécies dos géneros Microbacterium, Micrococcus e Kocuria. O potencial biotecnológico dos isolados também foi avaliado ao determinar a sua capacidade para degradar quitina, carboximetilcelulose, xilano e amido. Nenhum dos isolados testados degradou quitina, no entanto, todos os isolados apresentaram actividade de degradação positiva para pelo menos um dos outros três substratos testados. Alguns deles exibiram essa atividade a valores de pH mais elevados. Além disso, a principal atividade de degradação foi obtida para xilano.Para determinar a diversidade estrutural o mais aprofundada possível, métodos independentes de cultivo, nomeadamente a plataforma de sequenciação massiva Illumina, foram aplicados. O género aeróbio facultativo Hydrogenophaga/Serpentinomonas, comumente identificado neste tipo de ambientes, foi identificado como sendo o mais abundante na comunidade bacteriana, mas a classe Clostridia, associada a microrganismos estritamente anaeróbios também se mostrou bastante representada. Os géneros aeróbios Candidatus nitrocosmicus e Candidatus nitrosoarchaeum, foram o grupo de archaeas maioritariamente identificados. No entanto, apesar da sua abundância, estes grupos de archaeas não são normalmente encontrados em ecossistemas associados a serpentinização, tornando a comunidade de archaeas de Alfaguara distinta das já conhecidas e descritas na literatura.
Microorganisms constitute a large portion of the biosphere on Earth and part of them is present in the deep biosphere: a set of habitats physically located below the surface of continents and/or the bottom of the ocean. Microorganisms living in these environments can be a leverage to better understand strategies of survival/growth in extreme conditions; however, only a small percentage can be recovered and cultured on laboratory conditions. The set of microbial organisms that remains uncultured comprises the “microbial dark matter”.Alfaguara spring is a deep aquifer hyperalkaline spring, associated with serpentinization reactions, located at Peridotites of Ronda, South of Spain. To access the diversity of the aerobic heterotrophic bacteria present in this habitat, an extensive culture-dependent isolation process was conducted. Isolates were grouped by RAPD profiling, representative isolate(s) of each group were summarily characterized, and its phylogenetic placement was determined by 16S rRNA gene sequencing. The vast majority of the isolates were phylogenetically related to the phylum Firmicutes, namely with genus Bacillus. Others were related to phylum Actinobacteria, specifically with species belonging to genera Microbacterium, Micrococcus and Kocuria. The biotechnological potential of the isolates was accessed by screening their ability to degrade chitin, carboxymethyl cellulose, xylan and starch. All isolates were successful in the degradation of at least one of the substrates and some of them showed that ability at higher pH values. The major degradation activity (either by activity and number of isolates) was obtained for xylan. None of the isolates degraded chitin. The structural microbial diversity was also accessed by culture-independent methods, namely metagenomic 16S rDNA Illumina tags. Hydrogenophaga/Serpentinomonas was the most abundant genus found in the Alfaguara community, a common population found in this kind of environments. In addition, members of Clostridia, a class of strictly anaerobe microorganisms was also rather abundant. Moreover, Candidatus nitrocosmicus and Candidatus nitrosoarchaeum were the major archaeal populations detected. Despite their abundance, these two groups of aerobic archaea are not normally found at sites associated with serpentinization, making the Alfaguara deep aquifer community distinct from those already known.
Outro - Projeto de Investigação Exploratória IF/01061/2014

博士
國立中興大學
生命科學系所
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H series stands for 11 extreme halophilic microorganisms which were isolated from solar saltern in Chulta Vista, California. The presence of glycerol diether moieties indicates these isolates are members of haloarchaea. All of them confirmed to be able to accumulate the biodegradable polyesters, poly-beta-hydroxyalkanoates (PHAs), which makes them more potentially in biotechnological applications. The 16S rRNA gene phylogeny and presence of major glycolipid, S2-DGD, indicate those isolates are the member of the genus Haloterrigena. All isolates are catalase-positive but oxidase-negative strains and capable to reduce nitrate and utilize citrate suggesting they are facultative anaerobes. Most strains can hydrolyze casein, gelatin, Tween 20/80, lecithin and typtophan, except for strain H1. Based on the phylogenetic analysis and biochemical tests, three new species, Htg. mahii, Htg. proteolyticus and Htg. esterolyticus are proposed. Htg. esterolyticus strain H13 of the isolates was choosen for the genomic investigation with the strategy named “low-pass shotgun sequencing”. The genome size of strain H13 was estimated about 3.96 Mb by PFGE. After library construction, clones were randomly sequenced until the total contig length was covered ~15 % of the genome. From the partial genome sequence, 1,207 CDSs could be identified and the coding ratio was estimated about 73.64 %. The GC content of the genome and median pI of proteins were 64.98 % and 4.22, respectively. Both characters indicated that strain H13 possesses the similar strategy in adaption under hash conditions like other haloarchaea. The functional genome snapshot shows strain H13 possesses higher gene content involved in energy, fatty acid and inorganic ion metabolism but less in carbohydrate and nucleotide metabolism. This suggests strain H13 may prefer to used fatty acids rather than carbohydrates. Gluconeogenesis, pyruvate metabolism, TCA-methylasparte cycle, BCAA biosynthesis and degradation, fatty acid oxidation, PHA biosynthesis and haloalkane degradation could be reconstructed from the partial genome. Those findings suggest amino acids and fatty acids could server good carbon sources for the biosynthesis of sugars and PHAs. The presence of full set of genes of haloalkane degradation suggests that strain H13 could be applied in bioremediation. Genes required for organic compatible solutes utilizing could be identified suggesting strain H13 may have a relative delicate stress adaptation strategy. The manganese catalase from strain H13 shares some structure features with the mesophilic and thermophilic counterparts which suggests it could be a thermotolerant enzyme with broadly usage at different temperatures. The abilities of utilizing tributyrylglyceride and olive oil indicate strain H13 contains esterase/lipase which can be applied in biodiesel production; however, it is not yet confirmed in the partial genome of strain H13.