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Dissertations / Theses on the topic 'Bactéries – Sécrétion'
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Pichon, Samuel. "Système de sécrétion de type IV et protéines à domaines ankyrines dans les interactions Wolbachia-arthropodes." Poitiers, 2009. http://theses.edel.univ-poitiers.fr/theses/2009/Pichon-Samuel/2009-Pichon-Samuel-These.pdf.
Full textAbstract:
Wolbachia est une bactérie Gram(-) intracellulaire modifiant la reproduction de nombreux arthropodes. Chez l'isopode Armadillidium vulgare, la souche wVulC entraîne la féminisation des mâles. Nous avons caractérisé deux opérons vir s’exprimant dans tous les tissus hôtes et codant un système de sécrétion de type IV (T4SS) pouvant permettre d'exporter des effecteurs bactériens vers le cytoplasme de l'hôte. La comparaison des séquences et de l'organisation des gènes de 37 souches de Wolbachia a révélé la forte conservation des deux opérons vir suggérant l'importance du T4SS dans la biologie de la bactérie. Nous avons également identifié, dans le génome en cours de séquençage de wVulC, 66 gènes codant des protéines à domaines ankyrines. Ces motifs forment des sites d'interactions protéine-protéine chez les eucaryotes et sont supposés être impliqués chez Wolbachia dans l'interaction avec des protéines de l’hôte. Nous avons montré qu'une des trois copies du gène pk2 de wVulC, n'est exprimée que chez des souches féminisantes mais chez aucune des 3 souches induisant l’incompatibilité cytoplasmique chez les isopodes terrestres. Ce produit du gène pk2 pourrait être impliqué dans la féminisation de l’hôte. Toutefois, nous avons réalisé des tests d'interaction par double-hybride en levures et par la méthode CRAfT (Crerecombinase Reporter Assay for Translocation) entre les protéines du T4SS et cinq protéines à domaines ankyrines dont Pk2 afin de savoir si ces dernières étaient sécrétées par ce système. Les résultats montrent qu'aucun des cinq produits de gènes ank testés n'est sécrété par la bactérie mais se révèlent encourageants pour identifier les effecteurs de WolbachiaWolbachia are intracellular Gram(-) bacteria that are reproductive manipulators of many arthropods. In the isopod Armadillidium vulgare, the Wolbachia wVulC strain induces male feminization. Here, we characterized two vir operons which are expressed in all host tissues and which encode a type IV secretion system (T4SS) used to translocate bacterial effectors into host cytoplasm. Gene organization and sequence comparison in 37 Wolbachia strains highlighted the high conservation of both vir operons and their importance for the biology of the bacteria. We also identified in the on-going assembly of the wVulC genome, 66 ankyrin domain-encoding genes. Ankyrin motifs are known to mediate protein-protein interactions in eukaryotic organisms and thus are suggested to mediate in Wolbachia the interaction with host molecules. We showed that one of the three copies of the wVulC pk2 gene is only expressed in feminizing strains but not in the three strains inducing cytoplasmic incompatibility in terrestrial isopods. The associated Pk2 protein could be involved in male feminization. We thus tested the interaction between three T4SS proteins and five ankyrins (including Pk2) via the yeast twohybrid and CRAfT (Cre-recombinase Reporter Assay for Translocation) methods. None of the five ankyrin proteins were revealed to be secreted by the wVulC strain. Nevertheless, this promising approach may enable us to identify Wolbachia effectors
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Nicaud, Jean-Marc. "Contribution à l'étude de mécanisme de sécrétion de protéines par les bactéries à Gram négatif : étude de la sécrétion d'enzymes par Myxococcus xanthus et étude de la sécrétion d'hémolysine par Escherichia coli." Compiègne, 1986. http://www.theses.fr/1986COMPE054.
Full textAbstract:
La sécrétion de protéines par les microorganismes représente un outil important pour étudier la migration des protéines. De telles études peuvent aussi avoir des répercussions en biotechnologie pour produire des protéines étrangères dans le milieu de culture. La production de nombreuses protéines par Myxococcus xanthus et d’hémolysine par Escherichia coli représentent deux exemples pour aborder la sécrétion de protéines dans le milieu de culture par bactéries à Gram négatif. Chez Myxococcus xanthus, nous avons déterminé la production de l’activité phosphatase acide périplasmique et des activités bactériolytique et protéasique extracellulaires au cours de la croissance, parallèlement aux protéines totales extracellulaires. Ces résultats ont démontré que la présence d’enzymes dans le milieu de culture résulte bien d’un mécanisme de sécrétion. L’obtention et l’étude biochimique et génétique de mutants de transposition affectés dans la production d’enzymes extracellulaires a révélé l’existence d’un mécanisme de sécrétion complexe, régulant la production coordonnée d’une cinquantaine de protéines produites pendant la phase de croissance exponentielle. Chez Escherichia coli nous avons montré que l’hémolysine est une protéine 107Kd sécrétée en phase exponentielle par des souches possédant un déterminant HLY. Un déterminant HLY se compose de quatre gènes contigus appelés hlyC, hlyA, hlyB et hlyD. Le gène hlyA code pour une protéine non hémolytique de 107Kd activée par le produit du gène hlyC. Les formes active ou inactive sont transportées grâce à un mécanisme de transport spécifiques post-traductionnel dont les fonctions sont codées par les gènes hlyB et hlyD. Ces protéines reconnaissent une « séquence topo-génique » de la partie COOH-terminal de la protéine de 107Kd et permettent le passage de la protéine directement du cytoplasme dans le milieu de culture. Les mécanismes de sécrétion chez ces deux bactéries à Gram négatif peuvent représenter des alternatives, pour la sécrétion de protéines d’intérêt industriel, aux systèmes actuellement utilisés.
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Pawlak, Barbara. "Mécanisme de sécrétion des protéines chez myxococcus xanthus : étude de la sécrétion d'une protéine étrangère après clonage du gène en aval d'un promoteur inductible." Rouen, 1991. http://www.theses.fr/1991ROUES005.
Full textAbstract:
Nous avons étudié le mécanisme de sécrétion de Myxococcus xanthus, bactérie à gram-négatif, en utilisant comme sonde une protéine étrangère, la phosphatase hyperacide de Escherichia coli, qui est partiellement sécrétée chez M. Xanthus. Nous devions tout d'abord cloner son gène, appA, sous contrôle d'un promoteur inductible. En utilisant le gène lact comme gène rapporteur, nous avons comparé l'efficacité d'induction de deux promoteurs chez M. Xanthus, l'un endogène, le promoteur carQRs, inductible par la lumière, et l'autre exogène, le promoteur hybride tac, inductible par l'IPTG chez E. Coli en présence du gène répresseur lacIq: le système lacIq ptac est fonctionnel et inductible par l'IPTG chez M. Xanthus, mais le promoteur carQRs est plus fort chez M. Xanthus. Malgré de nombreux essais, nous ne sommes cependant pas parvenu à obtenir une souche de M. Xanthus chez laquelle la production de phosphatase hyperacide était inductible par la lumière. Nous avons alors clone le gène appA en aval du promoteur tac, puis obtenu une souche de M. Xanthus chez laquelle la production de phosphatase était inductible par l'IPTG. Par dosage, après induction, de l'activité appA dans les cellules et dans le surnageant, au cours du temps, et à trois niveaux d'induction différents, nous avons obtenu des cinétiques de sécrétion de la phosphatase hyperacide chez M. Xanthus dont l'analyse nous a permis de poser les bases d'un modèle de sécrétion chez M. Xanthus
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Brugirard-Ricaud, Karine. "Rôle du système de sécrétion de type III de la bactérie entomopathogène Photorhabdus luminescens au cours du processus infectieux." Lyon 1, 2004. http://www.theses.fr/2004LYO10264.
Full textAbstract:
Les entérobactéries des genres Xenorhabdus et Photorhabdus associées symbiotiquement à des nématodes des sols sont pathogènes par injection chez de nombreux insectes. Un locus codant pour un système de sécrétion de type III (ou TTSS) qui permet de délivrer des protéines bactériennes dites effectrices dans le cytosol de la cellule hôte, a été identifié chez Photorhabdus luminescens. Ce locus code pour la machinerie de sécrétion/translocation, des régulateurs de l'expression génique et une protéine effectrice LopT, homologue à la cytotoxine YopT de Yersinia. Un deuxième effecteur potentiel, homologue au premier et appelé LopT2 a été identifié dans une autre partie du génome à proximité d'un vestige de phage. L'objectif de ce travail a été de caractériser ce système de sécrétion et d'évaluer son rôle dans le processus infectieux chez l'insecte. Dans un premier temps, nous avons démontré en utilisant des souches de Xenorhabdus et Photorhabdus constitutivement marquées à la GFP (Green Fluorescent Protein) que ces deux bactéries avaient une localisation extracellulaire dans l'insecte. Le système de sécrétion de type III est présent chez toutes les espèces de Photorhabdus suggérant une acquisition avant la séparation des espèces mais pas chez Xenorhabdus. De plus, les composants de la machinerie de sécrétion sont hautement conservés mais les effecteurs prédits diffèrent entre P. Luminescens et P. Asymbiotica, deux espèces au spectre d'hôte différent (respectivement les Invertébrés et l'Homme). L'expression hétérologue chez Yersinia nous a permis de montrer que LopT ou LopT2 sont transloqués dans le cytoplasme de cellules de mammifères, comme le démontre l'apparition d'une forme électrophorétique différente de la GTPase RhoA. De plus, des études in vitro, ont mis en évidence que LopT est capable de libérer RhoA et Rac des membranes de cellules humaines et d'insectes. En outre, des essais d'infection réalisés in vivo chez le lépidoptère Spodoptera littoralis et chez l'orthoptère Locusta migratoria avec une souche de TT01 arborant une fusion traductionnelle des gènes lopT ou lopT2 avec le gène rapporteur GFP ont révélé que ces deux gènes sont induits uniquement dans des sites de défense tels que les nodules. Le mutant de la machinerie de sécrétion d'une part, n'induit plus la formation de nodules et d'autre part, est phagocyté par les macrophages d'insecte suggérant que LopT et LopT2, ou d'autres effecteurs, joueraient un rôle primordial dans l'inhibition de la phagocytose et indiquant un lien entre l'expression du TTSS et la nodulation chez l'insect
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Page, Anne-Laure. "Les chaperons impliqués dans la voie de sécrétion de type III de Shigella flexneri." Paris 7, 2002. http://www.theses.fr/2002PA077137.
Full text
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Meli, Albano Carlo. "Relations structure/activité des protéines de membrane externe impliquées dans la sécrétion de type V chez les bactéries à Gram négatif." Montpellier 1, 2007. http://www.theses.fr/2007MON13514.
Full textAbstract:
L’hémagglutinine filamenteuse (FHA) de B. Pertussis est sécrétée par la voie à deux partenaires ou voie « TPS ». Les deux protéines impliquées sont l’adhésine FHA et son transporteur de membrane externe FhaC. La maturation finale de FHA est assurée par l’autotransporteur (AT) SphB1. Mon travail de thèse inclus l’étude des relations structure/activité de FhaC. En analysant les propriétés « canal » de dérivés de FhaC et leur capacité à sécréter FHA, nous avons proposé que la translocation se réalise par le pore de FhaC. A partir de l’obtention de la structure cristalline de FhaC, nous avons déterminé les fonctions des éléments structuraux conservés : une boucle L6 extracellulaire qui obstrue le canal ainsi que 2 domaines POTRA périplasmiques responsables de l’interaction avec FHA. Ces données structure/fonction nous ont permis de proposer un modèle de translocation de FHA. Par ailleurs, nous avons étudié les propriétés physico-chimiques de différents mutants de l’AT SphB1.
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Guschinskaya, Natalia. "Caractérisation moléculaire des signaux de sécrétion des protéines sécrétées par le système de sécrétion de type II de la bactérie phytopathogène Dickeya dadantii." Thesis, Lyon 1, 2014. http://www.theses.fr/2014LYO10085/document.
Full textAbstract:
Le système de sécrétion de type II (T2SS) assure le transport de protéines sous une forme repliée du périplasme dans le milieu extracellulaire. Ce système est largement exploité par les bactéries à Gram négatif pathogènes des plantes, des animaux et de l'homme où il permet la sécrétion de facteurs de virulence (des toxines et des enzymes lytiques). La bactérie phytopathogène Dickeya dadantii utilise le T2SS appelé Out, pour sécréter une douzaine de pectinases qui dégradent les parois des cellules végétales. Les protéines sécrétées par le T2SS n'ont pas de motif de sécrétion apparent et leur sécrétion implique plusieurs interactions transitoires avec les composants du système. La nature moléculaire de ces interactions n'est pas connue. Afin de capter ces interactions transitoires lors du processus de sécrétion, j'ai utilisé le pontage dirigé in vivo. Cette technique repose sur l'incorporation d'un analogue photoréactif d'un acide aminé (le para-benzoyl Lphénylalanine, pBpa) à la place des résidus soupçonnés de faire partie d'un site d'interaction. Le pontage est ensuite activé par une courte exposition des cellules aux UV ce qui permet la formation des complexes protéiques. Tout d'abord, cette technique a été utilisée pour introduire le pBpa dans plusieurs régions exposées à la surface d'une exoprotéine, PelI. Cette stratégie a permis de mettre en évidence qu'un élément structural, la boucle 3 du domaine Fn3 de PelI, est impliquée dans l'interaction avec la sécrétine OutD, le composant du T2SS situé dans la membrane externe, et avec le domaine PDZ d'OutC, un composant de la membrane interne. Ces résultats suggèrent que la boucle 3 fait partie d'un motif de sécrétion. Deux autres régions ont été identifiées au sein de PelI : le linker entre les deux domaines de PelI qui est impliqué dans l'interaction avec OutD et une région exposée du domaine catalytique qui interagit avec la protéine OutC. La même approche a été utilisée pour introduire le pBpa dans les deux composants du T2SS, OutC et OutD. Ces expériences ont suggéré que le domaine PDZ d'OutC interagit avec une autre exoprotéine, PelB. Cette étude, de façon complémentaire à d'autres approches, nous a permis de démontrer certains détails moléculaires essentiels de la sécrétion par le T2SSThe type II secretion system (T2SS) transports folded proteins from the periplasm through the outer membrane into the milieu. In many pathogenic Gram-negative bacteria, the T2SS secretes various virulence factors in host tissue and is directly involved in pathogenesis. The phytopathogen Dickeya dadantii secretes a dozen of pectinases through a T2SS named Out. The secreted proteins are lacking an obvious common signal and secretion is thought to involve multiple transient interactions of folded exoproteins with several T2SS components. Molecular nature of these interactions remains unknown. To address this question we used an in vivo sitespecific photo-crosslinking approach to capture such transient interactions within the functional T2SS of D. dadantii. In this technique, the photo-crosslinker para-benzoyl-L-phenylalanine, pBpa, is introduced in vivo in place of a residue of interest and UV-irradiation of living cells provokes the formation of complexes between the protein of interest and its partners. First, in a systematic approach, pBpa was introduced at several surface-exposed sites of the secreted protein PelI. This strategy permitted us to identify that one structural element, loop 3 of Fn3 domain in PelI, interacts both with the secretin, the outer membrane T2SS component, and with the PDZ domain of OutC, an inner membrane T2SS component. These results suggest that this loop 3 is a part of the secretion motif. The same approach permitted us to identify two other regions of PelI interacting with the T2SS: a linker situated between the two domains of PelI, which interacts with OutD, and an exposed region of the catalytic domain of PelI interacting with OutC. In another approach, pBpa was introduced into the T2SS components, OutC and OutD. These experiments suggested that the PDZ domain of OutC interacts with the secreted protein PelB. This study, in complement with other approaches, allowed us to uncover some important molecular features of the protein secretion by the T2SS
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Bergeau, Dorian. "Contribution à l'études des systèmes de sécrétion chez la bactérie Pseudomonas fluorescens." Rouen, 2015. http://www.theses.fr/2015ROUES026.
Full textAbstract:
Les systèmes de sécrétion de type III (SST3) sont utilisés par certaines bactéries pathogènes, afin d’injecter des effecteurs au travers des membranes cellulaires eucaryotes, entraînant la colonisation de l’hôte et la paralysie de ses défenses. Récemment, des gènes SST3 ont été détectés chez Pseudomonas fluorescens, une rhizobactérie saprophyte retrouvée inopinément en milieu clinique. La diversité, la phylogénie et la virulence associée aux gènes SST3 ont été étudiés chez des P. Fluorescens issus de milieux hospitaliers ou de plantes. Un 1er groupe réunit les isolats d’infections sanguines, proches des espèces P. Putida et P. Mosselii. Ces bactéries portent des gènes SST3 de la famille Ysc présentant 99% d’homologie à ceux du pathogène opportuniste, P. Aeruginosa. Un 2d groupe intègre les autres isolats hospitaliers (expectoration, abcès) aux côtés des souches environnementales. Ces bactéries sont psychrotrophes et présentent une diversité phylogénétique plus vaste. Les membres sont porteurs de gènes SST3 appartenant à la famille Hrp1, trouvés chez le phytopathogène P. Syringae. Une étude des composants externes de P. Fluorescens modèles issus de ces travaux a été réalisée par microscopie électronique en transmission. Elle révèle les 1ères images d’un SST3 chez P. Fluorescens. Il s’agit d’un pilus Hrp1 d’environ 1,5 μm de long, dont la production est induite par des sucres végétaux et fongiques. Ces SST3 seraient impliqués dans l’induction des systèmes de défense des plantes. Notre étude révèle aussi la présence de faisceaux dendritiques imposants et de vésicules, possiblement impliqués dans l’adhésion, la nutrition et/ou la communication des colonies microbiennesType III secretion systems (T3SS) are used by some pathogenic bacteria to inject effectors through the eukaryotic cell membranes. These structures allow the colonization of the host cell and the paralysis of its defenses. Recently, T3SS genes were detected in Pseudomonas fluorescens saprophytic rhizobacterium surprisingly found in clinical environment. The T3SS genes diversity, phylogeny and virulence were investigated in P. Fluorescens found in hospital or plant environments. A cluster integrates isolates of blood infections, close to P. Putida and P. Mosselii species. These bacteria harbor T3SS genes belonging to Ysc family and share 99% of homology with T3SS of the opportunistic pathogen P. Aeruginosa. The second cluster includes other hospital isolates (respiratory tract or abscess) close to environmental P. Fluorescens. These bacteria are psychrotrophs and have a broader phylogenetic diversity. Their T3SS genes belong to the Hrp1 family, usually found in the plant pathogen P. Syringae. A study of external components of some P. Fluorescens models was performed by transmission electron microscopy. It reveals the first images of a P. Fluorescens T3SS. This T3SS is a Hrp1 pilus of around 1. 5 μm long whose production is induced by plant and fungal sugars. It could be involved in the induction of plant defense systems. Our study also reveals the presence of dendritic fibril bundles and vesicles, possibly involved in adhesion, nutrition and /or communication at the scale of the microbial colony
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Guédin, Sandrine. "L'hémagglutinine filamenteuse de Bordetella pertussis : voie de sécrétion et caractérisation de son transporteur FhaC." Lille 1, 2001. https://pepite-depot.univ-lille.fr/RESTREINT/Th_Num/2001/50376-2001-27.pdf.
Full textAbstract:
Bordetella pertussis, la bactérie à gram négatif responsable de la coqueluche, synthétise et sécrète de nombreuses toxines et adhésines dont l'hémagglutinine filamenteuse (FHA). La FHA est l'adhésine majeure responsable de la fixation de la bactérie au tractus respiratoire de l'hôte ainsi que la protéine extracellulaire la plus abondante de B. Pertussis. Elle est synthétisée avec un peptide-signal clivé à son passage de la membrane cytoplasmique, suggérant qu'elle traverse la membrane cytoplasmique via la machinerie sec. Elle traverse ensuite la membrane externe via une seule protéine auxiliaire spécifique, FhaC. Ce mode de secrétion à 2 partenaires, la protéine sécrétée et sa protéine auxiliaire spécifique ( "Two-Partner-Secretion" ou TPS), est présent chez diverses bactéries pathogènes. Nous avons cherché à déterminer si la FHA traverse le périplasme en cours de sécrétion, et à étudier l'influence de sa conformation sur sa sécrétion via FhaC. Nous avons greffé par voie génétique à un troncat N-terminal de la FHA, un domaine protéique qui adopte un repliement globulaire maintenu par un pont disulfure intramoléculaire, CtxB. La formation de ce pont disulfure est catalysée par une disulfide oxydase périplasmique, DsbA. La sécrétion de cette protéine chimérique n'a été possible que lorsque la formation du pont disulfure de CtxB était empêchéeL'observation qu'un domaine globulaire entrave la sécrétion de la FHA via FhaC, suggère que la FHA pourrait transiter par le périplasme sans s'y replier, et traverser la membrane externe dans une conformation étendue. FhaC appartient à une famille de protéines de membrane externe (TpsB) toutes impliquées dans la sécrétion de facteurs de virulence et peu caracterisées. FhaC a été purifiée et incorporée dans des membranes artificielles ou elle formerait des canaux perméables aux sucres et aux ions. Nous avons également établi un modèle topologique de FhaC selon lequel FhaC formerait un tonneau dans la membrane externe, et l'avons testé par l'insertion aléatoire d'épitopes. Nos résultats ont confirmé que l'extrémité N-terminale est exposée à la surface cellulaire et que la moitié C-terminale forme un tonneau transmembranaire. Enfin, un changement de conformation a été mis en évidence dans la portion C-terminale de FhaC au cours de la sécrétion de la FHA
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Merah, Mostefa. "Obtention et étude de mutants de Myxococcus xanthus affectés dans la production d'activités enzymatiques exocellulaires." Rouen, 1992. http://www.theses.fr/1992ROUES017.
Full textAbstract:
Myxococcus xanthus est une bactérie à gram-négatif qui sécrète de nombreuses activités enzymatiques durant la phase exponentielle de croissance. Nous avons tenté dans une première étape de cloner un gène de structure de l'une des trois activités sécrétées par cette bactérie: protéase, endoprotéase acide et glucanase en utilisant le promoteur mobile Ptac permettant de créer des phénotypes conditionnels inductibles par l'IPTG. Les résultats que nous avons obtenus ont montré que le clonage d'un fragment d'ADN de M xanthus situé en aval du Ptac dans E. Coli est faisable. Mais l'obtention conditionnelle par cette méthode n'a pas été possible faute de méthode de criblage suffisamment fiable. L'analyse des mutants d'insertion obtenus montre que la majorité sont affectés dans la production de certaines des activités seulement et sont vraisemblablement des mutants de régulation. Une du mutant paraît toucher le mécanisme de sécrétion et le cycle de développement multicellulaire et pourrait faire partie d'une famille comprenant au moins 6 gènes suggérant une relation entre mécanisme de sécrétion et le développement
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Rossi, Maria-Silvia. "Etude des mécanismes d'acquisition du fer dépendant de la protéine extracellulaire HasA chez les bactéries à gram négatif Serratia marcescens et Yersinia pestis." Paris 7, 2004. http://www.theses.fr/2004PA077224.
Full text
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Breton, Annick. "Études des mécanismes qui régissent la sécrétion des protéines chez une bactérie à gram négatif, Myxococcus xanthus : approche à l'aide des protéines natives et de protéines étrangères." Compiègne, 1987. http://www.theses.fr/1987COMPDE64.
Full text
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Delattre, Anne-Sophie. "Etudes fonctionnelles de FhaC de Bordetella pertussis, transporteur prototype de protéines à grande taille chez les bactéries à Gram négatif." Thesis, Lille 2, 2010. http://www.theses.fr/2010LIL2S041.
Full textAbstract:
La coqueluche est une maladie respiratoire aiguë, causée par la bactérie à Gram négatif Bordetella pertussis. L’hémagglutinine filamenteuse (FHA) est une adhésine responsable de la colonisation du tractus respiratoire de l’hôte, ainsi qu’un antigène vaccinal important. La FHA est transportée à la surface de la bactérie par une protéine de membrane externe, FhaC, selon la voie de sécrétion à deux partenaires (voie TPS). Le couple FHA/FhaC sert de modèle aux systèmes TPS. FhaC fait également partie de la superfamille de transporteurs TpsB/Omp85 qui regroupe des protéines de la membrane externe des bactéries et de certains organites eucaryotes (dont les chloroplastes et mitochondries). La structure cristallographique de FhaC est la première à avoir été obtenue parmi les protéines de cette superfamille. Le tonneau β de FhaC est composé de 16 brins anti-parallèles, reliés par des boucles extracellulaires ou périplasmiques. Le canal formé par FhaC est obstrué par une hélice amino-terminale (H1) et une boucle de surface conservée dans la superfamille repliée à l’intérieur du tonneau (L6). Le domaine périplasmique de FhaC contient deux domaines « POTRA » (pour Polypeptide Transport Associated) en tandem. Ces domaines sont conservés dans la superfamille et seraient responsables d’interactions protéine-protéine. Mon travail de thèse a consisté à appréhender, à partir de la structure de FhaC, les mécanismes moléculaires de la sécrétion de la FHA. J’ai étudié le rôle d’une tétrade de résidus conservés dans la boucle L6, puis j’ai caractérisé les déterminants d’interaction présents dans les domaines POTRA de FhaC. Nos travaux ont montré que la tétrade conservée VRGY localisée à l’extrémité de L6 est impliquée dans la fonction de FhaC. Les substitutions de l’arginine et de la tyrosine en alanine (FhaC-R450A et FhaC-Y452A) ont montré que l’arginine était essentielle à la sécrétion de la FHA. De plus, la structure cristallographique de FhaC-R450A indique que la substitution ne perturbe pas la position de L6. L’analyse des propriétés du canal de ces deux variants reconstitués en bicouche lipidique montre en revanche une perturbation des canaux de FhaC-Y452A. Les substitutions n’altèrent pas l’étape de reconnaissance de FHA par FhaC. L’arginine serait donc impliquée dans une étape tardive de la sécrétion, alors que la tyrosine semble participer au positionnement de L6 ou à la régulation de sa mobilité au cours de la sécrétion et pourrait stabiliser FhaC « au repos ». J’ai également caractérisé les déterminants d’interaction des deux domaines POTRA de FhaC et montré que des résidus de l’extrémité de POTRA1 sont impliqués dans le recrutement de la FHA, probablement par interaction électrostatique. Deux sites majeurs d’interaction ont été identifiés dans des sillons hydrophobes des POTRA1 et 2, qui seraient compatibles avec l’hypothèse que les deux protéines interagissent par « beta augmentation ». L’étude du couple FHA/FhaC est un modèle pour la voie de sécrétion TPS. Nos résultats indiquent que les motifs structuraux conservés sont impliqués dans la fonction de la protéine et apportent des précisions sur les mécanismes moléculaires de la voie TPS et des transporteurs de la superfamille TpsB/Omp85Whooping cough is an acute respiratory disease caused by the Gram-negative bacterium Bordetella pertussis. The filamentous hemagglutinin (FHA) is an adhesin involved in colonization of the host’s respiratory tract, and a major vaccine antigen. FHA is transported to the cell surface by an outer membrane protein, FhaC by the two-partner secretion (TPS) pathway. The FHA/FhaC pair is a model for TPS systems. FhaC belongs to the TpsB/Omp85 superfamily whose members are found in the outer membranes of bacteria and organelles such as chloroplasts and mitochondria. The crystal structure of FhaC has been the first in this superfamily. The β barrel of FhaC is composed of 16 anti-parallel strands, linked by extracellular loops and periplasmic turns. The FhaC channel is blocked by an amino-terminal helix (H1) and a conserved extracellular loop (L6). The periplasmic domain of FhaC has two POTRA domains (“Polypeptide Transport Associated”) that are conserved in the TpsB/Omp85 superfamily and involved in protein-protein interactions. My PhD work aimed at investigating the molecular mechanisms of FHA secretion based on the FhaC structure. I analyzed the role of a conserved tetrad in the L6 loop, and I also characterized the determinants of interaction with FHA in the POTRA domains of FhaC. Our work has shown that the conserved VRGY tetrad of L6 is involved in FhaC’s function. Substitution of arginine and tyrosine by alanine (FhaC-R450A et FhaC-Y452A) indicated that the arginine residue is essential for FHA secretion. Moreover, the crystal structure of FhaC-R450A showed that the positioning of L6 is similar to that in the wild type protein. Channel analyses of both variants reconstituted in lipid bilayers indicated that the FhaC-Y452A channels are affected. Both substitutions have no effect on the recognition step in the periplasm. The arginine residue is thus most likely involved in a late step of FHA secretion, while the tyrosine residue might participate in the positioning of L6 positioning or the regulation of its mobility in the course of secretion; it could stabilize FhaC in its “resting state”. I also characterized the determinants of interaction with FHA of the POTRA domains of FhaC and showed that residues at the extremity of POTRA1 might be involved in FHA recruitment, probably by electrostatic interactions. Two major sites of interactions were identified in hydrophobic grooves in both POTRA1 and 2, which are in agreement with a model of interaction between the 2 proteins by “beta augmentation”. The FHA/FhaC pair is a model for the TPS pathway. Our results indicate that conserved structural motifs of FhaC are involved in the function of the protein and give new insights into the molecular mechanisms of the TPS pathway and of transporters of the TpsB/Omp85 superfamily
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Hodak, Hélène. "Les partenaires et interactions périplasmiques au cours de la sécrétion de l'hémagglutinine filamenteuse par la voie à deux partenaires chez Bordetella pertussis." Lille 2, 2007. http://www.theses.fr/2007LIL2S005.
Full textAbstract:
Bordetella pertussis est une bactérie à Gram négatif. Son enveloppe est formée par une membrane cytoplasmique et une membrane externe, les deux étant séparées par le compartiment périplasmique aqueux. Ce sont autant d'obstacles que doit franchir la FHA pour se retrouver dans le milieu extérieur. La FHA est sécrétée par l'une des six voies de sécrétion connues chez les bactéries à Gram négatif, la sécrétion à deux partenaires ou TPS (« two- partner secretion »). La voie TPS est classiquement associée à la sécrétion de protéines de virulence chez de nombreux pathogènes, notamment Haemophilus influenza, Erwinia chrysanthemi, Yersinia pestis, etc. Le premier partenaire de cette voie est la protéine sécrétée, de la famille TpsA, ici la FHA. Le protéines TpsA sont très grandes en taille, supérieure à 100 kDa, et ce sont en général des adhésines ou hémolysines. Elles possèdent toutes un domaine N-terminal caractéristique d'environ 300 résidus appelé le « domaine TPS ». Ce domaine est essentiel à la sécrétion et chez plusieurs protéines TpsA, on y a trouvé des résidus importants pour la sécrétion. Chaque protéine TpsA possède un transporteur dédié, de la famille TpsB, dont les membres formeraient des canaux dans la membrane externe. Il n'est toujours pas clairement établi si la sécrétion se fait par le pore individuel de la protéine TpsB, ou bien s'il se produit une oligomérisation de TpsB et la protéine TpsA passerait par le canal central ainsi formé. Le partenaire TpsB de la FHA est appelé FhaC. La FHA est produite dans le cytoplasme sous forme d'un très grand précurseur de 360 kDa, appelé FhaB. Grâce à son peptide signal N-terminal, FhaB est reconnu et exporté dans le périplasme par la machinerie Sec, où une signal-peptidase de type Lep clive le peptide signal. Une fois dans le périplasme, FhaB semble conserver une conformation non repliée puisque dans les extraits périplasmiques, le précurseur est retrouvé dans la fraction insoluble. Le passage de la membrane externe se fait via FhaC qui vraisemblablement reconnaît FHA au niveau de la face périplasmique de la membrane externe et assure ensuite sa translocation vers l'extérieur. A la surface de la bactérie, la protéase SphB1 clive FhaB en libérant ainsi dans le milieu la FHA mature de 220 kDa. La plus petite portion sécrétable de la FHA, qui contient donc le signal de sécrétion au complet, correspond aux 30 kDa du côté N-terminal et a été nommée Fha30. Cette région correspond principalement au domaine TPS. Nous avons entamé une analyse plus approfondie du domaine TPS pour identifier le signal de sécrétion de la FHA afin d'établir un modèle qui pourrait servir pour toute la famille de protéines TpsA. Nous avons obtenu en 2004 la première structure cristalline d'une protéine de la famille TpsA, celle de Fha30. Cette structure nous a permis de voir que le domaine TPS formait une hélice beta droite à section transversale triangulaire avec quatre brins beta anti-parallèles extra-helicaux. Etant donné que les prédictions de structure secondaire indiquent que la FHA contient tout le long une série de répétitions prédits en brins beta, l'hélice beta observée sur Fha30 se prolonge vraisemblablement dans la partie centrale de la FHA. La structure nous a permis de voir que le domaine TPS s'étendait environ 100 résidus plus loin que ce que l'on croyait jusque là, ce qui nous a amené à élargir notre zone de recherche pour l'identification du signal de sécrétion de la FHA. Le domaine TPS est composé d'une alternance de régions non conservées et conservées LC1-C1-LC2-C1 (pour « conserved » et « less conserved ») qui s'étendent jusqu'à 250 résidus environ du N-terminus. Pour trouver les résidus faisant partie du signal de sécrétion, un grand nombre de mutations ponctuelles ou de délétions correspondant aux brins ne faisant pas partie de l'hélice beta, ont été introduites dans le domaine TPS et leur effet sur la sécrétion a été testé chez B. Pertussis. Nous avons utilisé Fha30 comme modèle de la protéine complète, puisqu'elle comporte vraisemblablement le signal de sécrétion entier. Un certain nombre de mutations dispersées dans le domaine TPS a permis d'abolir ou de diminuer la sécrétion, y compris les deux délétions. Pour pouvoir attribuer cet affet à un problème d'interaction avec le transporteur, nous avons mis au point un test d'interaction. Par la technique de co-précipitation (« pull down ») on observe cette interaction, mais uniquement lorsque Fha30 se trouvait dans une conformation non repliée. Pour ensuite identifier les résidus du domaine TPS impliqués dans la reconnaissance par FhaC et pouvoir tester un nombre élevé de mutants du domaine TPS, j'ai mis au point des conditions pour observer l'interaction avec FhaC par une technique d'interaction sur membrane (« far-western blotting » ou overlay). Les formes mutées de Fha30 produites dans le cytoplasme (qui n'ont donc pas encore vu le trasporteur) étaient non solubles, indiquant leur état non natif, donc semblable à celui de l'état supposé de la FHA dans le périplasme. Grâce au far-western blot, j'ai pu identifier plusieurs résidues capables de réduire l'efficacité de reconnaissance de Fha30 par FhaC. Le signal de sécrétion de FHA est composite puisque certains résidus sont conservés entre les protéines TpsA et d'autres ne le sont pas, ce qui peut rendre compte de la spécificité entre chaque transporteur TpsB et sa protéine TpsA. De plus, certains résidus lorsqu'ils étaient mutés étaient capables d'abolir la sécrétion de FHA alors qu'ils n'étaient pas impliqués dans l'interaction avec FhaC. Nous pensons qu'ils auraient plutôt un rôle structural, c'est à dire dans le repliement et/ou dans la stabilisation de la structure native de la FHA. Ainsi, le domaine TPS aurait deux fonctions : interaction avec FhaC et rôle structural important. Etant donné la conformation périplasmique non native de la FHA, nous avons émis l'hypothèse que des protéines telles que des chaperons périplasmiques pourraient protéger l'intermédiaire périplasmique contre la dégradation avant que la translocation via FhaC n'ait lieu. Plusieurs candidats ont été identifiés et ils ont la capacité d'empêcher l'agrégation de la Fha30 in vitro. L'un de ces candidats est une chaperon-protéase qui est essentielle à la sécrétion de la FHA. De plus, c'est uniquement son activité chaperon qui est importante pour la sécrétion de la FHA. Alors que la partie N-terminale de FhaC est importante pour l'interaction avec la FHA, des études de conductance sur FhaC, effectués avec Albano Méli au CBS de Montpellier, sur une série de mutants de FhaC ont montré que FhaC formait un canal perméable aux ions, et que sa partie C-terminale est suffisante pour former ce canal. Il existe une certaine corrélation entre l'activité de sécrétion de la FHA et les propriétés canal de FhaC, ce qui pourrait indiquer que la FHA emprunterait le canal présent dans le monomère FhaC pour traverser la membrane.
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Jneid, Bakhos. "Evaluation de l’effet protecteur de protéines du système de sécrétion de type III de bactéries entéropathogènes pour la vaccination et l’immunothérapie." Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2016. http://www.theses.fr/2016SACLS578/document.
Full textAbstract:
Les bactéries entéropathogènes du genre Salmonella et Shigella sont transmises par les aliments ou l’eau et sont responsables de nombreuses infections entériques chez les animaux et les humains. Ces maladies infectieuses restent une cause importante de morbidité et de mortalité dans les pays en voie de développement. L’existence de multiples sérotypes de Salmonella et de Shigella ainsi que l’émergence de souches résistantes aux antibiotiques, nécessite le développement de vaccins efficaces et large spectre. Ces bactéries utilisent un système d’injection de leurs protéines effectrices, appelé injectisome ou encore Système de Sécrétion de Type III (SST3), nécessaire à leur pathogénicité. Alors que les protéines effectrices injectées au moyen de cet injectisome sont variées et dépendent essentiellement du type cellulaire cible et donc de la spécificité du pathogène, certaines des protéines structurales composant l’injectisome sont relativement bien conservées parmi les différentes bactéries pathogènes, notamment les protéines de l’aiguille : PrgI et MxiH, et celles de la coiffe de l’aiguille : SipD et IpaD, respectivement de Salmonella et Shigella. Ces protéines, fortement impliquées dans la virulence des bactéries, semblent donc être des cibles de choix pour lutter contre des infections opportunistes impliquant ces bactéries pathogènes.Le premier objectif de cette thèse était d’évaluer l’immunogénicité et l’effet protecteur des protéines structurales de l’injectisome citées précédemment contre les infections à Salmonella et Shigella. Les protéines recombinantes préparées et produites au laboratoire ont été utilisées de façon séparée ou en combinaison pour immuniser des souris par différentes routes. Ensuite, les réponses immunitaires des souris ainsi immunisées ont été analysées par des tests immunométriques. Enfin, le potentiel immunogène et vaccinant de ces protéines structurales a été évalué en infectant les souris immunisées avec 100 DL50 de Salmonella par voie orale ou de Shigella par voie intranasale. Le meilleur résultat a été obtenu en utilisant la voie intra-gastrique pour les immunisations avec environ 70% de protection. Cette stratégie a permis également d’évaluer la pertinence de cette approche vaccinale dans un modèle murin de protection croisée (entre 25 et 60%). Le deuxième objectif de cette thèse était d’évaluer le pouvoir protecteur d’anticorps monoclonaux murins reconnaissant les régions conservées des protéines SipD et IpaD. Les anticorps obtenus ont été caractérisés et leur pouvoir neutralisant a été évalué in vivo dans un modèle murin d’infection avec Salmonella ou Shigella (jusqu’à 60% de protection).L’ensemble de ces travaux montre que l’utilisation de certaines protéines structurales conservées de l’injectisome de bactéries entéropathogènes présente un intérêt vaccinal et immunothérapeutique pour aider au traitement de certaines salmonelloses et shigellosesSalmonella and Shigella species are food and water borne pathogens that are responsible for enteric infections in both humans and animals. These infectious diseases are still the major cause of morbidity and mortality in the emerging countries. The existence of multiple Salmonella and Shigella serotypes as well as the emergence of antibio- resistant strains, require the development of protective and broad-spectrum vaccines. All these bacteria utilize a system for injection of their effectors, called injectisome or Type III Secretion System (T3SS), necessary for their pathogenicity. While effector proteins are varied and depend essentially on the cellular target and thus on the specificity of the pathogen, the structural proteins that form the injectisome are common to all virulent Salmonella and Shigella spp., particularly the needle proteins PrgI and MxiH and the needle-tip proteins SipD and IpaD of Salmonella and Shigella respectively. These proteins, strongly involved in the virulence of the bacteria, appear to be ideal candidate antigens for a subunit-based, broad spectrum vaccine.The first aim of my PhD was to evaluate the immunogenicity and protective efficacy of structural proteins of the above-mentioned injectisome against Salmonella and Shigella infections. The recombinant proteins were prepared and produced in the laboratory and were used alone or in combination to immunize mice using different routes. The immune responses of immunized mice were then analyzed by immunometric assays. Finally, the protective efficacy was evaluated in a mouse model of intestinal (Salmonella) or pulmonary (Shigella) challenge. The best result was obtained by orogastric immunization with 70% of protection. This strategy also allowed to estimate the relevance of this approach in a mouse model of crossed protection (from 25 to 60%). The second objective of my PhD was to evaluate the protective efficacy of murine monoclonal antibodies recognizing conserved regions of SipD and IpaD proteins. The obtained antibodies were characterized and their therapeutic effect was evaluated in vivo with a Salmonella and Shigella infection murine model (up to 60% of protection).To conclude, this work showed that some conserved structural proteins composing the injectisome of enteropathogenic bacteria is of interest for treatment of enteric diseases caused by Salmonella and Shigella
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Flaugnatti, Nicolas. "Le système de sécrétion de type VI : caractérisation et mécanisme de transport de Tle1, un effecteur antibactérien de type phospholipase." Thesis, Aix-Marseille, 2018. http://www.theses.fr/2018AIXM0204.
Full textAbstract:
Dans l’environnement les bactéries ne vivent pas seules. Elles coopèrent, mais se mènent également une guerre pour la survie. Le système de sécrétion de type VI (T6SS) est l’un des acteurs principaux dans cette guerre antimicrobienne. Il permet la sécrétion, directement dans les cellules compétitrices, d’effecteurs antibactériens. Le T6SS est une structure macromoléculaire comprenant un complexe membranaire (MC) ancré à la membrane qui recrute et assemble une structure tubulaire contractile. Le tube interne est enfermé dans un fourreau contractile. Au sommet de cette structure se trouve la pointe perforatrice du système formée par un trimère de la protéine VgrG. Au contact d’une bactérie cible, le fourreau se contracte, entrainant la propulsion du tube interne, de la pointe perforatrice et des toxines dans la cellule cible. L’objectif de ma thèse était d’identifier les toxines sécrétées par le T6SS d’Escherichia coli entéro-agrégatif (EAEC) et de comprendre leur mécanisme de sécrétion. Nous avons caractérisé Tle1, un effecteur de type phospholipase A1, responsable de l’activité antibactérienne du T6SS-1 d’EAEC. Les cellules productrices se protègent de l’activité toxique de cet effecteur en produisant une protéine d’immunité, Tli1, qui est une lipoprotéine de membrane externe. Nous avons ensuite montré que Tle1 interagit directement avec l’extension C-terminale de la protéine VgrG. Cette interaction permet de sécréter Tle1 directement dans les bactéries cibles. Enfin, nous avons purifié et caractérisé ce complexe, déterminé les régions nécessaires à cette interaction et résolu la structure du complexe à basse résolution par microscopie électroniqueBacteria do not live alone in their environment; they cooperate but also compete for niches and resources. The Type VI secretion system (T6SS) is one of the key players in the bacterial warfare by delivering anti-bacterial effectors directly into competitor cells. The T6SS is a macromolecular structure: A membrane complex (MC) anchored in the envelope recruits an assembly platform for a contractile tail structure. The tail is a tube wrapped by a sheath and topped by a needle spike called VgrG. The tail assembles in an elongated conformation. Upon contact with a target cell, the contraction of the sheath propels the inner tube, the spike and the toxins toward target cells. The goal of my PhD work was to identify T6SS toxins and to understand how they are selected by the EAEC T6SS. We have characterized Tle1, an antibacterial effector with phospholipase A1 (PLA1) activity, responsible for the antibacterial activity of EAEC T6SS. Self-protection of the producing cell is assured by an outer membrane lipoprotein, Tli1. We further showed that Tle1 interacts directly with the C-terminal extension domain of VgrG to allow subsequent delivery into target bacteria. We succeeded to purify the complex and obtain a 3D model at low resolution of the complex by electron microscopy after negative staining. The toxin interacts with the tip of the needle spike to be transported from the producing cell to the target cell
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Varela, Chavez Carolina. "Caractérisation fonctionnelle d’une cyclomoduline pro-apoptotique nommée Cif (Cycle Inhibiting Factor) chez les bactéries entomopathogènes du genre Photorhabdus." Montpellier 2, 2009. http://www.theses.fr/2009MON20183.
Full text
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Pinaud, Laurie. "Shigella pathogenicity beyond cell invasion : the new kiss-and-run paradigm." Thesis, Sorbonne Paris Cité, 2016. http://www.theses.fr/2016USPCC189.
Full textAbstract:
L’invasion de la muqueuse du côlon humain par les entérobactéries à Gram négatif du genre Shigella aboutit à une rectocolite aigue appelée dysenterie bacillaire qui reste un problème de santé publique majeur. Shigella possède un Système de Sécrétion de Type Trois (SST3) codé par un plasmide de virulence qui permet la translocation d’effecteurs bactériens dans le cytoplasme des cellules eucaryotes pour manipuler leurs fonctions. Ces effecteurs détournent les cellules épithéliales pour constituer une niche de réplication intracellulaire et interagissent avec les cellules immunes pour affecter l’initiation de la réponse immune adaptative. En conséquence, plusieurs épisodes infectieux sont nécessaires afin d’établir une protection immunitaire humorale qui est toutefois de courte durée. Ces travaux de thèse avaient pour but (i) d’approfondir les connaissances sur l’interaction de Shigella avec l’hôte en se concentrant sur les mécanismes dépendant du SST3 interférant avec les lymphocytes et (ii) de déterminer si des effecteurs du SST3 non encore identifiés sont codés par le plasmide de virulence. Nos résultats démontrent que la translocation d’effecteur du SST3 peut être découplée de l’invasion cellulaire, conduisant à des cellules « injectées-seulement ». Nous rapportons que Shigella induit l’apoptose des lymphocytes B par un mécanisme dépendant de la protéine située à l’extrémité du SST3 mais indépendant de la translocation d’effecteurs. Ces résultats établissent un nouveau paradigme concernant la pathogénicité de Shigella au-delà de l’invasion cellulaire, basé sur des mécanismes de type « touché-coulé » qui sont au cœur des interactions entre ce pathogène et les cellules immunes. Par ailleurs, nous décrivons la capacité de Shigella jusque-là inconnue d’interférer avec la sécrétion d’anticorps par les lymphocytes B, ce qui pourrait contribuer à moduler la réponse spécifique humorale de l’hôte. Enfin, nous avons identifié cinq nouveaux effecteurs potentiels de Shigella codés par le plasmide de virulence et injectés par le SST3 dans les cellules eucaryotes. Ces travaux de thèse apportent donc de nouveaux éléments concernant la pathogénicité de Shigella par la découverte de nouveaux mécanismes ciblant les cellules immunes et l’identification de nouvelles protéines bactériennes injectées dans le cytoplasme des cellules de l’hôteInvasion of the human colonic mucosa by the Gram-negative enterobacteria Shigella spp. results in an acute recto-colitis named bacillary dysentery that still remains a major public health concern. Shigella expresses a Type Three Secretion System (T3SS) encoded on a virulence plasmid and mediating translocation of bacterial effectors into eukaryotic cell cytoplasm to manipulate their functions. These effectors hijack epithelial cells to create a bacterial intracellular replicative niche and also interact with immune cells to affect the priming of the adaptive immune response. As a result, several episodes of infection are required to mount a protective humoral immunity that is nevertheless of short-duration. This thesis work aimed at (i) further documenting Shigella cross-talks with its host, with a particular focus on T3SS-mediated mechanisms towards lymphocytes and (ii) investigating if the Shigella virulence plasmid encodes for yet unidentified T3SS-effectors. We report that translocation of Shigella T3SS-effectors into lymphocytes can be uncoupled from cellular invasion, resulting in “injected-only” cells. We demonstrate that Shigella mediates B lymphocyte apoptosis through a mechanism depending on the secretion apparatus needle tip protein but independent from effectors translocation. These findings set up a new paradigm for Shigella pathogenicity beyond cellular invasion, with “kiss-and-run” mechanisms proposed to be at the core of the interactions between this pathogen and immune cells. In addition, we describe a so far not known capacity of Shigella to interfere with B lymphocyte antibody secretion that could contribute to divert Shigella- specific humoral immunity. We also identify five new putative Shigella effectors encoded by the virulence plasmid and translocated by the T3SS into eukaryotic cells. Thus, this thesis work brings new insights into Shigella pathogenicity by unraveling novel mechanisms towards host immune cells and identifying new bacterial proteins that might constitute additional molecular weapons for this pathogen
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Trinh, Thi Trang Nhung. "Structural studies of type IX and type II secretion systems." Thesis, Aix-Marseille, 2019. http://www.theses.fr/2019AIXM0089.
Full textAbstract:
Les protéines synthétisées et sécrétées par les bactéries jouent des rôles importants pour leur survie. Les bactéries à Gram négatif ont développé des voies de sécrétion en tant qu'armes principales pour transporter des facteurs de virulence dans l'environnement extracellulaire ou dans des cellules hôte. L'un de ces systèmes, le T9SS a été principalement étudié chez l'agent pathogène oral Porphyromonas gingivalis et chez la bactérie mobile Flavobacterium johnsoniae. Un autre complexe, le T2SS est le principal déterminant de la virulence de la bactérie Pseudomonas aeruginosa, un agent pathogène de la fibrose kystique. Dans le cadre de ma thèse, j'ai résolu la structure atomique de plusieurs composants centraux du T9SS et du T2SS. Concernant le projet T9SS, j'ai essayé de cristalliser le domaine cytoplasmique de GldL de F. johnsoniae. La co-cristallisation de GldL avec des Nbs a été réalisée sans succès. Néanmoins, les structures cristallines de deux nanobody contre GldL ont été résolues par remplacement moléculaire. De plus, j'ai également travaillé sur la protéine PG1058 de P. gingivalis. J'ai résolu sa structure par diffraction anomale à la longueur d’onde du selenium. Concernant le projet T2SS, je me suis concentré sur la partie N-terminale de XcpQ, une sous-unité de la sécrétine. J'ai résolu la structure cristalline de XcpQN012 seul et en complexe avec le nanobody vhh04 à une résolution de 2,98 Å et de 2,9 Å, respectivement. Enfin, j'ai participé à la détermination structurale de TssK, un composant de plaque de base du système de T6SS et déterminer la structure cristalline d'un nanobody contre le domaine périplasmique de PorMProteins synthesized and secreted by bacteria serve many important roles in their survival. In particular, Gram-negative bacteria have evolved secretion pathways as the main weapons for transporting virulence factors into target cells or into the extracellular environment. One of these systems, the type IX secretion system (T9SS) or the Por secretion system, has been studied mainly in the oral pathogen Porphyromonas gingivalis and the gliding bacterium Flavobacterium johnsoniae. Another complex, the type II secretion system (T2SS) is the main determinant of the virulence of Pseudomonas aeruginosa, a cystic fibrosis pathogen. In my PhD thesis, I solved the atomic structure of several core components of both T9SS and T2SS.For the T9SS project, I tried to crystallize the cytoplasmic domain of GldL from F. johnsoniae. The co-crystallization of GldL with Nbs was unsuccessfull. The crystal structures of two nanobodies against GldL were solved by molecular replacement. I also worked on the PG1058 protein of P. gingivalis. I obtained crystals of the selenomethionine-derivatized PG1058 OmpA_C-like domain that diffracted up to 1.55 Å, and solved its structure by single-wavelength anomalous diffraction. For the T2SS project, I focused on the N-terminal part of XcpQ, a subunit of the secretin. I solved the crystal structure of XcpQN012 alone and in complex with nanobody vhh04 at a resolution of 2.98 Å and 2.9 Å, respectively. In addition, I also took part in the structural determination of the base plate component TssK of the T6SS and determined the crystal structure of one nanobody (vhh19) against the periplasmic domain of PorM
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Sapriel, Guillaume. "Etude du rôle des protéines chaperon dans la sécrétion des protéines par la voie ABC (ATP-Binding Cassette) chez les bactéries à gram-négatif." Paris 7, 2002. http://www.theses.fr/2002PA077222.
Full text
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Delevoye, Cédric. "Identification de protéines sécrétées par Chlamydia et étude fonctionnelle d'une protéine insérée dans la membrane de la vacuole, à l'interface entre les bactéries et leur hôte." Paris 11, 2006. http://www.theses.fr/2006PA112017.
Full textAbstract:
Les Chlamydia sont des bactéries intracellulaires strictes dont trois espèces sont pathogènes pour l'Homme. Elles sont responsables, selon les souches, d'infections oculaires et génitales et d'infections respiratoires. Après avoir induit leur propre entrée, les bactéries se développent dans un compartiment délimité par une membrane, appelé inclusion. Au cours du cycle infectieux, les bactéries transloquent, par leur appareil de sécrétion de type trois (STT), des protéines dont certaines s'ancrent dans la membrane de l'inclusion où elles sont en contact avec le cytosol de la cellule hôte, les protéines Inc. Mon travail de thèse a porté sur les protéines bactériennes sécrétées, au cours du cycle infectieux, dans la cellule hôte. Une approche globale nous a permis d'identifier de 24 nouvelles protéines de Chlamydia sécrétées par l'appareil de STT. Ce travail a ouvert la voie à l'étude fonctionnelle de ces protéines bactériennes qui sont en contact avec l'hôte. De manière plus spécifique, nous avons étudié la fonction d'une protéine de l'inclusion, IncA, au cours du cycle infectieux. Nous avons montré que IncA présente des similitudes structurales et fonctionnelles avec les protéines eucaryotes, les SNAREs, facteurs essentiels de la fusion des membranes cellulaires. IncA interagit dans un modèle cellulaire, et in vitro, avec certaines SNAREs. De plus, dans des expériences de fusion de liposomes in vitro, la fusion membranaire induite par un complexe SNARE des endosomes tardifs est inhibée par IncA. Ce travail a permis de proposer que IncA puisse mimer les SNAREs et participer au détournement du trafic intracellulaire induit par ChlamydiaChlamydiae are obligate intracellular pathogens of humans and animals. Depending on the species, they are responsible for ocular and genital infections, and respiratory diseases. After inducing their own entry, the bacteria develop in a membrane-bound compartment, called the inclusion. During the infectious cycle, they translocate a subset of proteins via a type three secretion (TTS) apparatus into the host cytosol. Among these, the Inc proteins remain anchored in the inclusion membrane where they face the host cytosol. My work has focused on bacterial proteins secreted into the host cell. By a global approach, we have identified 24 new proteins secreted by the TTS apparatus of Chlamydia. This work has opened the functional studies of these bacterial proteins that are in contact with the host cell cytosol. More specifically, we have studied the function of an inclusion protein, IncA. We have shown that IncA, from different chlamydial species, share structural and functional homologies with the SNARE family of eukaryotic proteins, which are essential factors for cellular membrane fusion events. We have shown that IncA interact with SNAREs in both a cellular and an in vitro model. Moreover, in liposome fusion assays, IncA inhibit membrane fusion induced by a cognate SNARE complex specific from the late endosomal compartment. We propose that IncA, by mimicking SNAREs proteins, participate in the control of the interactions between the inclusion membrane and intracellular compartments of the host cell
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Zoued, Abdelrahim. "Biogenesis and membrane anchoring of the Type VI secretion contractile tail." Thesis, Aix-Marseille, 2015. http://www.theses.fr/2015AIXM4090.
Full textAbstract:
Récemment, le système de sécrétion de type VI (SST6) a été identifié comme un nouvel acteur clé dans la compétition inter-bactérienne parmi le large arsenal dont dispose les bactéries. L’une des particularités du SST6 est de cibler à la fois des cellules eucaryotes et procaryotes. Le T6SS est un complexe protéique formé par l’assemblage de deux ‘sous-complexes’. Le premier sert à l’ancrage de la machinerie au sein de l’enveloppe bactérienne et le second agit comme une arbalète moléculaire. Le mécanisme d’action du SST6 est très similaire à celui d’autres machineries contractiles telles que celui des bactériophages : la contraction d’un fourreau propulse une flèche, composée d’un tube avec une aiguille à son extrémité, directement dans la cellule cible afin de délivrer les différentes toxines. Mon projet de thèse consiste à comprendre quelles sont la structure et la biogénèse des deux différents complexes et de comprendre comment ils sont assemblés. Nous utilisons comme modèle la bactérie pathogène à Gram négatif Escherichia coli entéroagrégative. J’ai pu démontrer que le complexe membranaire est assemblé en premier, avec l’adressage de la lipoprotéine de membrane externe TssJ, puis le recrutement séquentiel de TssM et TssL, deux protéines de membrane interne. Le complexe membranaire recrute ensuite une plateforme d’assemblage, appelée ‘baseplate’. Nous avons identifié et caractérisé les composants de cette ‘baseplate’ qui sert de plateforme d’assemblage pour le recrutement du reste de la machinerie (fourreau et flèche). Enfin, nous avons identifié et déterminé le rôle de la protéine TssA, une protéine qui coordonne la polymérisation du fourreau et de la flècheAmong the broad weaponry of bacteria, the recently identified type VI secretion system (T6SS) emerges as one of the key player in bacterial competition. T6SS is a versatile machinery that targets both eukaryotic and prokaryotic cells. This molecular weapon assembles two evolutionarily different sub-assemblies. One complex anchors the machinery to the cell envelope while the second acts as a molecular crossbow. The mechanism of action of the T6SS is similar to other known contractile machineries such as bacteriophages: the contraction of a sheath propels an arrow, constituted of a tail tube capped by a cell-puncturing device, directly into the prey cell to deliver effector toxins. My Ph.D project was to provide mechanistic details on the structure and biogenesis of the two T6SS sub-complexes and to understand how they are connected, using entero-aggregative Escherichia coli as model bacterium. I have demonstrated that the membrane complex is assembled first and starts with the positioning of the outer membrane TssJ lipoprotein and proceeds inward, from the outer to the inner membrane, through the sequential recruitment of the TssM and TssL subunits. After assembly, the membrane complex recruits an assembly platform called the baseplate. We identified and characterized the components of this baseplate, which serves as assembly platform for the tail. We further demonstrated that the functional and physical interaction between the T6SS membrane complex and the baseplate is mediated by multiple contacts. Finally, we identified and deciphered the role of TssA, a protein that coordinates the polymerizations of the tail tube and sheath
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Lallemand, Mathilde. "Dissection des interactions entre les composants du système de sécrétion de type II chez la bacterie phytopathogène Erwinia chrysanthemi (Dickeya dadantii)." Phd thesis, INSA de Lyon, 2011. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00665584.
Full textAbstract:
Le système de sécrétion de type II (T2SS) est largement répandu chez les bactéries à Gram négatif. Il permet la sécrétion d'enzymes lytiques et de toxines. Chez la bactérie phytopathogène Erwinia chrysanthemi, les pectinases, sécrétées par ce système appelé Out, dégradent la pectine, provoquant les symptômes de pourriture molle. La sécrétion par le T2SS se passe en 2 étapes : les protéines traversent la membrane interne par le système Sec ou le système Tat. Une fois dans le périplasme, elles sont repliées et transloquées par le T2SS à travers la membrane externe. Le système Out est composé de 14 protéines intégrées ou associées à l'une des deux membranes. Son assemblage et son fonctionnement restent obscurs. Une plateforme serait formée dans la membrane interne par OutE, -F, -L, -M et -C. Ces trois derniers composants sont des protéines bitopiques dont la stœchiométrie et le rôle sont inconnus. Pour identifier des interactions entre ses composants, nous avons utilisé le double-hybride bactérien, basé sur la reconstitution de l'activité d'adénylate cyclase. Nous avons démontré que le domaine de type ferrédoxine, situé en C-terminus d'OutL et d'OutM, est directement impliqué dans l'homo- et l'hétérodimérisation de ces protéines. Une interaction entre les régions périplasmiques d'OutC et d'OutD a été aussi détectée (Login et al., 2010). Pour mieux analyser les multiples interactions au sein du T2SS, des expériences de triple-hybride ont été réalisées en co-exprimant différentes combinaisons des régions solubles de trois composants. Nos résultats suggèrent qu'OutL empêche l'interaction entre OutC et OutD. Par ailleurs, OutL est impliquée dans l'activation de l'ATPase OutE, le moteur du système (Camberg et al., 2007). OutL serait donc impliquée dans la transmission du signal entre le périplasme et le cytoplasme et pourrait intervenir dans la dissociation du complexe OutD/OutC. Afin d'analyser le rôle des segments transmembranaires (TMS) de composants du T2SS, nous avons adapté la technique du double-hybride. Le domaine de la protéine rapporteur Cya a été fusionné au N-terminus du TMS et BlaM au C-terminus. BlaM sert à contrôler la topologie correcte des fusions dans la membrane. Plusieurs interactions bi-partenaires entre les TMS d'OutC, OutL et OutM ont été ainsi détectées. Ce travail a été complété par une étude in vitro (pull-down) et par mutagenèse dirigée. Ces interactions TMS-TMS pourraient intervenir dans la transmission du signal du périplasme vers le cytoplasme à travers la membrane interne.
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Nguyen, Van-Son. "Caractérisation structurale de la partie trans-périplasmique et de la plaque de base du système de sécrétion de type VI de EAEC 042 sci1." Thesis, Aix-Marseille, 2016. http://www.theses.fr/2016AIXM4083.
Full textAbstract:
Chez les procaryotes, les protéines sont synthétisées dans le cytoplasme avant d'être transportés vers différentes destinations, intra- ou extra-cellulaires. Les bactéries Gram-négatives ont mis au point une grande collection de mécanismes et systèmes, appelés systèmes de sécrétion bactérienne, pour sécréter des protéines à travers leur paroi cellulaire vers l'extérieur. Le système de sécrétion de type VI, identifié dans les années 2006-2008, est une nano-machine polyvalente répandue chez les bactéries pathogènes. Il y a de nombreuses preuves que T6SS injecte des protéines toxiques (effecteurs) directement dans les cellules eucaryotes et procaryotes pour les tuer. Pour empêcher la destruction cellules provenant de la même espèce, les bactéries possédant un T6SS produisent également des protéines d'immunité qui neutralisent les effets toxiques des effecteurs de leurs congénères. Le T6SS est formé de 13 composants de coeur (nommés TssA-M) en une structure souvent comparée à un "bactériophage inversé". La queue, semblable à celle de phages, a une forme tubulaire (la gaine et le tube interne) et polymérise à partir d'une plaque basale ancrée sur un complexe membranaire trans-périplasmique. La contraction de la gaine fournit l'énergie nécessaire pour propulser le tube intérieur à travers la paroi vers les cellules proies. Dans le cadre de ma thèse, je me suis impliqué dans la détermination de la structure et la dynamique de certains composants du T6SS de la d’Escerichia coli enteroaggrégatif (EAEC). Plusieurs structures ont été déterminées et analysées. Quatre articles ont été publiés et deux autres sont en préparationIn prokaryotes, proteins are synthesized in the cytoplasm before being transported to various destinations, intra- or extra-cellular. Gram-negative bacteria have developed a large collection of mechanisms and systems, termed bacterial secretion systems, to secrete proteins through their cell wall to the exterior. The type VI secretion system, identified in years 2006-2008, is a versatile nano-machine prevalent in pathogenic bacteria. There have been many evidences that T6SS delivers toxic proteins directly into both eukaryotic and prokaryotic cells to kill them. To prevent killing of sibling cells (cells from the same species), T6SS+ cells produce also immunity proteins that neutralize the toxic effects of their cognate effectors. T6SS contains 13 core-components (TssA-M), assembling a structure often quoted as an “inverted bacteriophage”. A phage-like tubular tail (the sheath and the internal tube) polymerizes from a baseplate-like complex, anchored to the cell internal and outer membranes via a membrane anchored complex spanning the periplasm. Contraction of the sheath provides the necessary energy to propel the internal tube through the wall towards the prey cells. In the framework of my PhD, I became involved in determining the structure and dynamics of some components of the EAEC sci1 T6SS, mostly on the membrane and baseplate subcomplexes. Several structures have been determined and analysed. Four articles have been published and two other are in preparation
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Filella, Merce Isaac. "Evolution, structure, and inhibition of bacterial secretion systems." Electronic Thesis or Diss., Sorbonne université, 2022. https://accesdistant.sorbonne-universite.fr/login?url=https://theses-intra.sorbonne-universite.fr/2022SORUS066.pdf.
Full textAbstract:
L'évolution a façonné une variété de mécanismes utilisés par les pathogènes humains pour coloniser l'hôte. Chez les bactéries, cette colonisation est assistée par des systèmes de sécrétion. La modulation de ces systèmes bactériens est essentielle pour le développement de thérapies antivirulences ciblant les pathogènes antibiorésistants. Les méthodes computationnelles fournissent des stratégies rationnelles pour élucider les mécanismes qui gouvernent ces systèmes et guider la conception d'inhibiteurs.Cette thèse explore plusieurs aspects de deux systèmes bactériens, les systèmes de sécrétion de type 6 et le système de sécrétion de type 2 (SST6 et SST2). La structure, l'inhibition et l'évolution de ces deux systèmes ont été étudiées en combinant des méthodes d'analyse de séquences et de modélisation moléculaire. Tout d'abord, j'ai conçu un inhibiteur de l'assemblage du SST6, qui a été validé expérimentalement. Deuxièmement, j'ai examiné un SST6 non canonique via la cooccurrence de gènes, et la modélisation de protéines. Troisièmement, j'ai modélisé un filament SST2 complet pour étudier son mécanisme de sécrétion. Quatrièmement, j'ai analysé le réseau d'interaction p-p obtenu à partir de cellules bactériennes entières. Enfin, pour étudier l'évolution des systèmes de sécrétion, j'ai introduit SOMseq, une nouvelle méthode qui permet de visualiser l'évolution des gènes dans un graphique en trois dimensions et estimer la coévolution des gènes. En conclusion, ces résultats montrent comment la synergie entre les efforts informatiques et expérimentaux est utile pour comprendre la complexité des systèmes bactériens et pour concevoir des thérapies de façon efficaceEvolution has shaped a variety of mechanisms employed by pathogens to colonize the host. In bacteria, this colonization is assisted by secretion systems, which are composite machines that translocate virulence factors to the extracellular space or directly into target cells. Regulating these bacterial systems is essential for developing antivirulence therapeutics to respond against antibiotic-resistant pathogens. Computational methods provide rational strategies to decipher the detailed mechanisms governing these systems and guide the design of inhibitors.This thesis explores several aspects of two bacterial systems, the type 6 and the type 2 secretion systems (T6SS and T2SS). The structure, inhibition, and evolution of these two systems were studied by combining sequence analysis and molecular modeling methods. First, based on the accumulated structural information on T6SS, I designed an inhibitor for the complex assembly, which was experimentally validated. Second, I examined a non-canonical T6SS via genes co-occurrence, sequence motif analysis, and protein modeling. Third, I modeled a complete T2SS filament to study its secretion mechanism. Fourth, I analyzed the protein-protein interaction network obtained from entire bacterial cells. Finally, to study the evolution of the secretion systems, I introduced SOMseq, a novel method used to visualize gene evolution in a compact three-dimensional (3D) graph and estimate gene coevolution. In conclusion, these results show how continuous feedback between computational and experimental efforts is essential for understanding the complexity of bacterial systems and efficiently designing therapeutics
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Aschtgen, Marie-Stéphanie. "Etude du système de sécrétion de type VI chez Escherichia coli entéro-agrégatif : Caractérisation d'un sous complexe d'ancrage membranaires." Thesis, Aix-Marseille 2, 2011. http://www.theses.fr/2011AIX22129.
Full textAbstract:
Bacterial pathogenesis relies on a subset of mechanisms including adhesion to various matrices, antibiotic resistance, defence and action against surrounding microorganisms, and secretion of virulence factors. Among the secretion systems, the recently identified Type VI secretion system (T6SS) has been shown to be involved in both virulence against eukaryotic cells and inter-bacterial warfare. T6SS are composed of a minimum of 13 proteins called "core components". It is believe to form a macromolecular system that spans the envelope to assemble an extracellular structure composed of the Hcp protein with a trimer of VgrG located at the tip. This model has been built following in silico and structural analyses demonstrating the link between several T6SS subunits and bacteriophage T4 baseplate and tail elements. Other T6SS subunits include membrane proteins. Using enteroaggregative Escherichia coli as a bacterial model, the aim of my work is to understand how this system assembles in the cell envelope. I recently showed that four of these membrane proteins, SciP, SciS, SciN and SciZ make contact to form a complex [1]. These four subunits are critical components of the T6SS. I then delineated the interaction network, demonstrating that SciZ interacts with SciP, and that SciS interacts with both SciP and SciN. Further characterization of these subunits showed that SciN is a lipoprotein associated with the outer membrane [2, 4], whereas SciP and SciS are inner membrane proteins anchored through a single and three transmembrane segments respectively. SciZ is a polytopic inner membrane protein carrying a peptidoglycan-binding motif within its periplasmic domain. Mutagenesis and peptidoglycan binding experiments demonstrated that SciZ anchors the T6SS to the cell wall [1, 3]. Overall, we have identified and characterized a trans-envelope complex anchored in both membrane and to the peptidoglycan layerBacterial pathogenesis relies on a subset of mechanisms including adhesion to various matrices, antibiotic resistance, defence and action against surrounding microorganisms, and secretion of virulence factors. Among the secretion systems, the recently identified Type VI secretion system (T6SS) has been shown to be involved in both virulence against eukaryotic cells and inter-bacterial warfare. T6SS are composed of a minimum of 13 proteins called "core components". It is believe to form a macromolecular system that spans the envelope to assemble an extracellular structure composed of the Hcp protein with a trimer of VgrG located at the tip. This model has been built following in silico and structural analyses demonstrating the link between several T6SS subunits and bacteriophage T4 baseplate and tail elements. Other T6SS subunits include membrane proteins. Using enteroaggregative Escherichia coli as a bacterial model, the aim of my work is to understand how this system assembles in the cell envelope. I recently showed that four of these membrane proteins, SciP, SciS, SciN and SciZ make contact to form a complex [1]. These four subunits are critical components of the T6SS. I then delineated the interaction network, demonstrating that SciZ interacts with SciP, and that SciS interacts with both SciP and SciN. Further characterization of these subunits showed that SciN is a lipoprotein associated with the outer membrane [2, 4], whereas SciP and SciS are inner membrane proteins anchored through a single and three transmembrane segments respectively. SciZ is a polytopic inner membrane protein carrying a peptidoglycan-binding motif within its periplasmic domain. Mutagenesis and peptidoglycan binding experiments demonstrated that SciZ anchors the T6SS to the cell wall [1, 3]. Overall, we have identified and characterized a trans-envelope complex anchored in both membrane and to the peptidoglycan layer
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Favre, Karine. "Etude d'un gène impliqué dans le mécanisme de sécrétion des protéines lors de la croissance végétative et dans le cycle de développement multicellulaire chez Myxococcus xanthus." Rouen, 1996. http://www.theses.fr/1996ROUES004.
Full textAbstract:
Myxococcus xanthus, bactérie à gram-négatif, sécrète de nombreuses enzymes exocellulaires et peut entrer dans un cycle de développement multicellulaire unique chez les procaryotes. En croissance végétative, M. Xanthus présente un mécanisme de sécrétion probablement commun à la majorité des protéines sécrétées qui paraît original comparé aux mécanismes de sécrétion décrits jusqu'ici chez les bactéries à gram-négatif. Aucun mutant de sécrétion, caractérisé par l'absence totale de sécrétion d'une ou plusieurs protéines et une accumulation intracellulaire de ces protéines, n'a pu être isolé chez M. Xanthus. Les seuls mutants obtenus sont affectés dans la production globale des protéines exocellulaires et sont incapables d'entrer dans un cycle de développement multicellulaire, ceci suggérant l'existence de liens entre sécrétion et développement. Ces mutants, obtenus par insertion du transposon Tn5 ont été nommés Exc+/-. Nous avons plus particulièrement étudié l'un de ces mutants nommé excA-. Une banque chromosomique de M. Xanthus a été réalisée et la région chromosomique excA partiellement séquencée. Le gène excA, dans lequel est inséré le transposon, montre de très fortes homologies avec le gène Nuo8 qui spécifie la sous-unité fixatrice de l'ubiquinone, et appartient à l'opéron codant pour la NADH-ubiquinone oxydoréductase chez E. Coli. Il présente cependant des différences qui peuvent être intéressantes d'un point de vue phylogénétique. ExcA est exprimé de façon constante au cours de la croissance végétative tandis que son expression est régulée au cours du développement. D'autres gènes, proches de excA, présentent également des homologies avec les gènes codant pour les sous-unités formant le complexe I de la chaîne respiratoire chez la mitochondrie. Ainsi, cette région semble comporter plusieurs gènes organises en locus ou en opéron. Une modification de la force protomotrice par inhibition du complexe I peut entraîner une diminution de l'export chez E. Coli, et chez M. Xanthus une altération du cycle de développement multicellulaire. Ces observations sont en accord avec les phénotypes observés chez le mutant excA-. La phosphatase hyperacide de E. Coli, périplasmique chez son hôte d'origine, est partiellement sécrétée chez M. Xanthus lorsque le gène correspondant y est cloné, et peut constituer une bonne sonde de la perméabilité de l'enveloppe de cette bactérie. Utilisant cette sonde en croissance végétative, nous avons montré que le mutant excA- est affecté à la fois au niveau de l'accumulation périplasmique de la phosphatase (probablement au niveau de l'export) et au niveau de la perméabilité des enveloppes externes (gel périplasmique et/ou membrane externe). Chez la souche sauvage, pendant le cycle de développement, nous avons mis en évidence une diminution drastique de la perméabilité des enveloppes à la phosphatase sans que ne soit altérée la sécrétion d'activités exocellulaires spécifique du développement. Ceci suggère que les mécanismes de sécrétion mis en jeu lors de la croissance végétative et lors du développement sont différents. On peut penser également que l'altération du mécanisme de sécrétion chez le mutant n'est pas la cause de son incapacité à développer. Ce phénotype résulte plus probablement d'un dysfonctionnement au niveau de la machinerie énergétique.
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Douzi, Badreddine. "La machinerie de sécrétion de type II Xcp de Pseudomonas aeruginosa : relations structure-fonction et interactome." Thesis, Aix-Marseille 1, 2011. http://www.theses.fr/2011AIX10086.
Full textAbstract:
Les bactéries à Gram négatif sont entourées par une enveloppe cellulaire qui, contrairement aux bactéries à Gram positif, possèdent une organisation membranaire complexe composée d’une membrane interne appelée généralement membrane cytoplasmique, un espace périplasmique contenant une matrice de peptidoglycane et une membrane externe asymétrique constituée d’une monocouche de phospholipides surmontée d’une assise de lipopolysaccharide (LPS). Afin de franchir cette barrière, les bactéries à Gram négatif ont développé différentes voies de sécrétions spécifiques dédiées à l’export des protéines (effecteurs) du milieu intracellulaire vers le milieu extracellulaire. Jusqu'à présent, six systèmes de sécrétion ont été identifiés chez ces bactéries. Chez Pseudomonas aeruginosa, une bactérie pathogène opportuniste, le système de sécrétion de type II appelé aussi sécréton Xcp constitue l’un des facteurs principales de sa virulence. Le sécréton Xcp est un complexe macromoléculaire formé par 12 protéines, nommées XcpAO et XcpPC-XcpZM. Ce complexe macromoléculaire est organisé en trois sous-complexes : i) une plateforme d’assemblage ancrée dans la membrane interne formé par les protéines XcpRESFYLZM ii) un pore de sécrétion localisé dans la membrane externe formé par l’oligomérisation d’une protéine appelé la sécrétine XcpQD. Le pore de sécrétion est connecté à la plateforme de la membrane interne par une protéine appelée XcpPC iii) un pseudopilus périplasmique sous forme de fibre hélicoïdale qui est formé par la multimérisation d’une protéine appelée la pseudopiline majeure XcpTG. D’autres protéines appelées les pseudopilines mineures XcpUH-VI-WJ-XK intègrent le pseudopilus. La première partie du travail effectué au cours de cette thèse a eu pour but d’étudier et de comprendre par des approches structurales, biochimiques et biophysiques le mécanisme d’assemblage des pseudopilines en pseudopilus. La deuxième partie de ce travail a porté sur l’étude des réseaux d’interactions entre les substrats sécrétés et les composants de la machinerie Xcp. Durant cette thèse, nous avons ainsi i) identifier grâce à l’étude des interactions protéine-protéine l’existence d’un complexe quaternaire entre les pseudopilines mineures XcpUH-VI-WJ-XK localisées au sommet du pseudopilus ii) déterminer les structures de la pseudopiline majeure XcpTG par RMN et de la pseudopiline mineure XcpWJ par cristallographie aux rayons X iii) déterminer les différents éléments du sécréton qui interagissent avec les exoprotéines du sécréton. Ce réseau d’interaction nous a permis de proposer un modèle de fonctionnement du sécréton qui élucide le cheminement des exoprotéines dans le sécréton afin qu’elles soient exportées vers le milieu extracellulaireGram-negative bacteria are characterized by a complex organization of their cell envelope composed by the inner membrane (IM) called cytoplasmic membrane, the periplasmic space containing a peptidoglycan layer and the outer membrane (OM) covered by the lipopolysaccharide matrix. Gram-negative bacteria have evolved several specialized machines called secretion systems to export their effectors from the intracellular medium to the extracellular milieu or to the host cells. Up to now, at least six secretion systems have been identified. In the opportunistic pathogen Pseudomonas aeruginosa, the type II secretion system called the Xcp secreton is the major pathway for the release of virulence factors. The Xcp secreton is a macromolecular complex composed by 12 proteins called XcpAO, XcpPC-XcpZM. This machinery is organized in 3 sub-complexes: i) the assembly platform localized in the IM implicating XcpRESFYLZM proteins ii) the OM pore composed by the oligomerization of the secretin XcpQD. The connection between the assembly platform and the secretin is performed by XcpPC anchored in the IM iii) a periplasmic pseudopilus consisting of the multimerization of the so-called major pseudopilin XcpTG. The pseudopilus is a helicoidally filament spanning the periplasmic area and pushing the substrate into the secretin pore. Four other proteins, the minor pseudopilins XcpUH-VI-WJ-XK, were found in the pseudopilus. In the present work we first focused on the study of the pseudopilus components by biochemical, biophysical and structural strategies to understand their assembly. Secondly, we investigate the protein interactome between periplasmic secreton component and secreted substrates. Thus, we revealed the presence of a quaternary complex composed by XcpUH-VI-WJ-XK located at the tip of the pseudopilus. To understand at atomic scale the regulation of the pseudopilus, we determined the structure of two components of the pseudopilus XcpTG by NMR and XcpWJ by X-ray crystallography. Using systematic protein-protein interaction studies between secreton components and purified exoproteins of Pseudomonas aeruginosa, we identified 5 proteins of the secreton able to interact with exoproteins. This interaction network allowed us to propose a model for the secretion process including the sequential steps followed by exoproteins inside the secreton to leave the cell envelop
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Bensmail, Laila. "Contribution à l'étude de la régulation et de la sécrétion chez Myxococcus xanthus : utilisation comme sonde d'un gène codant une endoglucanase." Rouen, 1996. http://www.theses.fr/1996ROUES065.
Full textAbstract:
Myxococcus xanthus est une bactérie du sol non pathogène à gram-négatif, qui vit au détriment d'autres microorganismes en sécrétant dans le milieu extérieur des enzymes hydrolytiques pour dégrader sa proie. Elle a un cycle de développement multicellulaire unique chez les procaryotes. Ces caractéristiques font de M. Xanthus un modèle d'étude des mécanismes de sécrétion des protéines. L'étude de la localisation des protéines (exocellulaires chez la bactérie hôte) exprimées chez Escherichia coli a permis d'obtenir dans de nombreux cas un certain nombre de renseignements concernant le mode de sécrétion de ces protéines chez leur hôte d'origine. Ainsi pour étudier le mécanisme de sécrétion d'une protéine exocellulaire de M. Xanthus, une endoglucanase, le gène correspondant celA a été cloné dans un plasmide chez E. Coli et séquencé. Chez E. Coli, la localisation cellulaire de l'activité endoglucanase dépend d'une part de de sa structure, peptide signal potentiel et hydrophobicité, et d'autre part de la présence d'une séquence d'ADN adjacente transcrite dans le sens opposé. Ce nouveau gène codant probablement un transporteur de la famille des MFS joue manifestement un rôle important chez M. Xanthus, puisqu'il n'a pas été possible d'obtenir une inactivation de cette séquence chez cette bactérie. Le gène celA a été aussi utilisé pour étudier les 3 mutants Exc+/- de M. Xanthus qui sont des mutants affectés dans la production globale des protéines exocellulaires et notamment de l'endoglucanase. Ces mutants sont aussi incapables d'initier le cycle de développement multicellulaire. En ce qui nous concerne, nous avons montré que le gène celA est régulé au niveau transcriptionnel chez deux de ces mutants (asgA-, asgC-) et post-transcriptionnel chez le troisième (excA-) en phase végétative.
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Liu, Lulu. "Characterization of a new virulence factor secreted by the plant pathogenic bacteria Dickeya dadantii." Thesis, Lyon, 2019. http://www.theses.fr/2019LYSEI020.
Full textAbstract:
Peu de protéines nécessaires à l’infection des plantes communes aux bactéries, aux champignons et aux oomycètes ont été identifiées à part les enzymes dégradant les parois des cellules végétales. Nous avons caractérisé la structure et les propriétés d’une protéine, IbpS, sécrétée par la bactérie phytopathogène nécrotrophe Dickeya dadantii. Des homologues de cette protéine sont présents non seulement chez des bactéries à Gram+ mais aussi chez des champignons, des oomycètes et quelques animaux. Ce gène d’origine bactérienne a été transféré une fois chez les oomycètes et probablement plusieurs fois chez les champignons. IbpS peut fixer le fer et le cuivre, des métaux à activité redox. Elle a une structure en Venus Fly Trap classique mais avec des caractéristiques originales : elle forme des dimères en solution et possède un nouveau mode de fixation du métal. IbpS est impliquée dans le processus infectieux de D. dadantii et de Botrytis cinerea, un champignon phytopathogène nécrotrophe. Nous proposons qu’IbpS, une fois sécrétée, fixe le fer et le cuivre exogène, réduisant ainsi leur concentration intracellulaire et la formation de ROS dans le microorganisme. La sécrétion de cette protéine fixant les métaux semble être un mécanisme de protection contre l’oxydation requis pendant l’infection partagé par des phytopathogènes nécrotrophesFew secreted proteins involved in plant infection common to necrotrophic bacteria, fungi and oomycetes have been identified except for plant cell wall-degrading enzymes. Herein, we have characterized the structure and properties of a protein (IbpS) secreted by the plant pathogenic bacterial necrotroph Dickeya dadantii. Homologs of this protein are present in not only Gram+ bacteria but also in fungi, oomycetes, most phytopathogens, and some animals. The gene originating from bacteria was transferred once in oomycetes and most likely several times in fungi. IbpS is capable of binding the redox-active metals iron and copper and has a classical Venus Fly trap fold with some original characteristics: it forms dimers in solution and has a novel metal binding site. IbpS is involved in D. dadantii and of the Botrytis cinerea, a fungal necrotroph, infection process. We propose that secreted IbpS binds exogenous iron and copper, reducing their intracellular concentrations of these metals and ROS formation in the microorganisms. Secretion of this metal scavenging protein appears to be a common antioxidant protection mechanism shared by necrotrophic phytopathogens and required during infection
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Bertrand, Quentin. "Caractérisation de facteurs de virulence impliquant les systèmes de sécrétion bactériens." Thesis, Université Grenoble Alpes (ComUE), 2019. http://www.theses.fr/2019GREAV058.
Full textAbstract:
Pseudomonas aeruginosa est une bactérie responsable de sévères infections nosocomiales. Ces infections sont un réel problème pour la santé publique car P. aeruginosa fait partie des pathogènes ESKAPE qui ont développé des facteurs de résistance aux antibiotiques ce qui leur permet d’échapper aux traitements classiques. P. aeruginosa, en plus d’être résistante aux antibiotiques est capable d’exprimer de nombreux facteurs de virulences. Parmi ces facteurs on retrouve les systèmes de sécrétion de type V (SST5) sur lequel j’ai pu travailler durant ma thèse.Une nouvelle souche de P. aeruginosa a été découverte à Grenoble il y a quelques années. Cette souche n’exprime pas les mêmes facteurs de virulence que les souches communément étudiées mais en demeure bien plus toxique. La toxicité de cette souche est due à l’expression de deux protéines ExlB et ExlA faisant partie de la famille du SST5b et ayant un mécanisme d’action complètement nouveau car aucun homologue n’est connu. La toxine ExlA est capable de faire des pores dans les membranes des cellules eucaryotes entrainant leur mort. Le but de ma thèse était donc de comprendre à l’échelle moléculaire le fonctionnement de ExlA.Pour identifier le mécanisme d’action de cette toxine, nous l’avons divisée en deux domaines que nous avons étudiés séparément. En utilisant des techniques de RMN, de SEC-MALLS, de flottaison différentielle, de SAXS et d’AFM, nous avons pu définir que le domaine C-terminal de cette protéine était un « molten globule» en solution et était capable de faire des trous dans les membranes lipidiques reconstituées. Ce domaine semble être le domaine responsable de l’interaction d’ExlA avec les lipides. Ceci additionné à des études menées in vivo sur la toxine ExlA complète et comportant uniquement son domaine N-terminal nous a permis de définir un possible mécanisme d’action de la toxine ExlA. La somme de nos études fait l’objet d’un article en cours d’écriturePseudomonas aeruginosa is the causative agent of nosocomial infections. Those infections are a real threat to public health, considering that P. aeruginosa is a member of the ESKAPE pathogens family. Those pathogens developed numerous antibiotic resistance mechanisms that allow them to escape the lethality of common treatments. More than just resistant, P. aeruginosa is able to make use of several virulence factors, and among them, the type V secretion system, which is the main subject of my PhD.A new virulent P. aeruginosa strain was discovered in Grenoble University Hospital several years ago. This strain lacked the virulence factors of common studied cytotoxic strains but, still displayed high toxicity. This was related to the expression of two proteins, ExlB and ExlA, that are part of the T5SSb and display a complete new mechanism of action (no protein homologs are found). The ExlA toxin is able to form pores in the eukaryotic cell membrane leading to their death. The aim of my PhD was to understand on a molecular level the mechanism of ExlA toxicity.To decipher the activity of this toxin, we divided it in two domains, studied separately. Using NMR, SEC-MALLS, liposome floating assay, SAXS and AFM techniques, we were able to prove that the C-terminal domain of ExlA was a « molten globule » in solution and was able to form holes in reconstituted lipid bilayers. This domain seems to be the key to lipid interaction by the whole protein. Additional in vivo studies of the N-terminal domain and on full-length ExlA allowed us to propose a putative model of the mechanism of this novel toxin
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Jacobsen, Theis. "Structure and assembly of bacterial type IV filaments unravelled by an integrative approach." Electronic Thesis or Diss., Sorbonne université, 2022. http://www.theses.fr/2022SORUS146.
Full textAbstract:
La superfamille des filaments de type IV (TFF) est un groupe de machines moléculaires localisées dans la membrane des bactéries et des archées. Ces machines associent des polymères protéiques de manière non-covalente appelés des pili, qui s’étendent depuis la cellule pour réaliser plusieurs fonctions qui ont évolué spécifiquement pour s’adapter à des organismes hôtes différents. La superfamille TFF comprend le système de sécrétion de type II (T2SS) et les pili de type IVa (T4aP). Le T2SS induit la sécrétion de substrats chez les bactéries Gram-négatives. Ces substrats sont en général des enzymes qui dégradent les complexes carbohydrates, le peptidoglycane, les lipides, ce qui à terme entraîne la libération de nutriments. Les T4aP sont de longues fibres flexibles qui sont ancrées dans la membrane et permettent de nombreuses fonctions. Le mécanisme par lequel le T2SS et les T4aP remplissent ces différentes fonctions n’est toujours pas entièrement compris. Pour comprendre le mécanisme de sécrétion du T2SS, nous avons étudié par RMN la structure de la pseudopiline OutG, le composant majeur du pseudopilus chez Dickeya dadantii. Dans une seconde partie, nous avions pour objectif d’aborder la structure et l’assemblage des pilines mineures, des protéines qui composent le T4P d’Escherichia coli entérohémorragique. Nous avons optimisé la surexpression, la purification et le marquage de les pilines mineures pour leur étude par RMN. De plus, la modélisation des pilines et le cross-linking ont été réalisés sur les échantillons de pseudopili T4P et T2SS purifiés en tant que méthodologie pour déterminer la structure et les interactions des pilines et pseudopilines au sein du pilus natifThe type IV filament (TFF) superfamily is a group of molecular machineries located in the membrane of bacteria and archaea. These machineries assemble non-covalent protein polymers called pili extending away from the cell to perform multiple functions which have evolved specifically to adapt to different host organisms. The TFF superfamily includes the type II secretion system (T2SS) and the type IVa pili (T4aP). The T2SS promotes the secretion of substrates in Gram-negative bacteria. These substrates are in general enzymes degrading complex carbohydrates, peptidoglycan, and lipids, resulting in the release of nutrients. The T4aP are long flexible fibres anchored in the membrane and enable various functions such as twitching motility, DNA uptake and biofilm formation. The mechanism by which the T2SS and T4aP pilus fulfil their different functions is still not completely understood. To understand the mechanism of secretion by T2SS, we studied the structure of the pseudopilin OutG, the major component of the pseudopilus in Dickeya dadantii by Nuclear Magnetic Resonance (NMR). In a second part, we aimed to address the structure and the assembly of minor pilins, protein components of Enterohemorrhagic Escherichia coli T4aP. We optimised the overexpression, purification and labelling of the minor pilins for their structural study by NMR. Furthermore, molecular modelling of the minor pilins and crosslinking mass spectrometry were performed on whole T4aP and T2SS pseudopili purified samples as a methodology to determine the structure and the interactions of pilins and pseudopilins within the native pilus
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Periasamy, Mangayarkarasi. "Assemblage, fonction et dynamique du pseudopilus dans le système de sécrétion de type II." Paris 7, 2013. http://www.theses.fr/2013PA077180.
Full textAbstract:
Le système de sécrétion de type II (SST2) est une machinerie complexe permettant le transport spécifique de protéines repliées du périplasme vers la surface des bactéries à Gram-négatif. SST2 est très proche des systèmes d'assemblage des pili de type IV (PT4), qui sont des filaments fins et flexibles impliqués dans l'adhérence et la motilité des bactéries. La surproduction des composants du SST2 Pul de Klebsiella oxytoca, spécifique de la sécrétion de la pullulanase (PulA), conduit à l'assemblage de pili à la surface des bactéries cultivées sur milieu gélose. Ces pili sont composés essentiellement d'un polymère hélicoïdal de la pseudopiline majeure PulG. Selon le modèle actuel, le filament périplasmique de PulG appelé pseudopilus, agirait comme un piston pour permettre la sécrétion du substrat. Bien que l'assemblage du pseudopilus soit indispensable à la sécrétion, le lien mécanistique entre ces deux activités de SST2 est largement inconnu. A la base de la structure des pili PulG,déterminée au laboratoire, nous avons étudié plus en détail le fonctionnement et la dynamique de ce filament. Par des approches de microscopie électronique, de modélisation moléculaire et par des analyses biochimiques et fonctionnelles, nous avons montré que l'assemblage du pseudopilus et sa stabilité dépendent d'interactions distinctes. Par des approches in vivo et in vitro, nous avons identifié deux composants du SST2, PulF et PuIM qui, par interaction directe avec PulG dans la membrane, favorisent son assemblage en pili. Les résidus de PulG impliqués dans ces interactions sont indispensables à l'assemblage et à la fonction du système de sécrétion. Nous avons caractérisé ainsi les étapes précoces de l'assemblage du pseudopilus et identifié les étapes clés dans la fonction de SST2. Ces données nous ont permis de proposer un nouveau modèle d'assemblage impliquant la rotation du filament, qui pourrait s'appliquer aux autres filaments de cette superfamilleThe type II secretion system (T2SS) is a complex machinery that facilitates specific transport of folded proteins from the periplasm to the surface of Gram-negative bacteria. T2SSs are closely related to type IV pilus assembly systems (T4PS) that polymerize long thin fibers on bacterial surface involved in adhesion and motility. The Pul T2SS of Klebsiella oxytoca, dedicated to secretion of pullulanase (PulA), is one of the best-characterized models to study the mechanism of this process. When the 15 Pul system components are overproduced, the plate-grown bacteria also assemble pili on their surface, composed of the major pseudopilin, PulG. Under physiological conditions it is postulated that a periplasmic fiber, termed the pseudopilus, promotes PulA secretion. Assembly of the pseudopilus is essential for secretion. However, the mechanistic link between these two activities is largely unknown. It is currently hypothesized that pseudopilus acts in a piston-like mode to push the substrate through the large gated pore in the outer membrane. To test this model, our laboratory has determined the three-dimensional structure of the PulG pilus. This model has served as a framework to further analyze the function and dynamics of this fiber by an integrated approach. Combining EM analysis of purified PuIG fibers, flexible PulG pilus modeling and biochemical functional studies we have shown that distinct inter-protomer interfaces determine PulG pilus stability and protein secretion function. The power of this combinatorial approach has allowed us to demonstrate the rotational dynamics involved in the fiber assembly process. Further, for the first time, biochemical, mass spectrometric analysis and bacterial two-hybrid assays, have allowed capturing interactions between pseudopilins and the assembly platform members PulM and PulF. These studies have also delineated the region in the pseudopilins involved in the respective interactions. Together these results have paved way to postulate the early events in the inner membrane promoting PuIG fiber assembly. These findings have general implications for all fiber assembling nanomachines of this sort
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Pineau, Camille. "Etude du mécanisme de sécrétion des pectinases par le système de sécrétion de type II de la bactérie phytopathogène Dickeya dadantii." Thesis, Lyon, INSA, 2014. http://www.theses.fr/2014ISAL0041.
Full textAbstract:
Le système de sécrétion de type II (T2SS) est largement répandu chez les bactéries à Gram négatif et est, entre autre, exploité par de nombreux pathogènes pour sécréter des facteurs de virulence dans le milieu extérieur. Le T2SS est constitué de 12 à 15 protéines différentes s’associant en une machinerie complexe qui traverse la totalité de l’enveloppe bactérienne. Ce système assure la sécrétion de protéines repliées du périplasme au milieu extracellulaire. Le mode de fonctionnement de cette machinerie n’est toujours pas connu. Pour comprendre les mécanismes moléculaires régissant la sécrétion des protéines par le T2SS, nous avons utilisé comme modèle le T2SS de la bactérie phytopathogène Dickeya dadantii, nommé Out, qui assure la sécrétion de pectinases entrainant la pourriture molle chez de nombreux végétaux. Nous avons employé des approches de pontage disulfure, double hybride bactérien et GST-pull down afin d’étudier l’arrangement et l’organisation des composants au sein du système de sécrétion. Nous avons ainsi montré que les composants de la membrane interne et la sécrétine de la membrane externe se coordonnent entre eux grâce à un réseau d’interactions complexe et dynamique qui peut être modifié par la présence d’une protéine à sécréter. En combinant des approches génétiques, biochimiques, structurales et bioinformatiques, nous avons étudié le mécanisme de reconnaissance de la pectinase PelI, par deux composants majeurs du système, la protéine de membrane interne OutC et la sécrétine OutD qui forme le pore du T2SS dans la membrane externe. Nous avons montré que PelI interagit avec les domaines périplasmiques HR et PDZ d’OutC et N0 et N1 d’OutD. La présence de N1 renforce l’interaction PDZ/PelI suggérant que le processus de sécrétion pourrait être régi par une succession de contacts synergiques. PDZOutC reconnait une boucle de 9 résidus au sein de l’exoprotéine PelI. Cette boucle constitue un motif d’adressage spécifique contrôlant le recrutement de PelI par la machinerie de sécrétion Out. Des études in silico et in vivo ont montré l’existence de régions similaires à cette boucle au sein d’autres pectinases sécrétées par D. dadantii. Par ailleurs, l’interaction N1OutD/PelI impliquerait un contact de brins β ainsi que la région non structurée située en amont de N1. Ces travaux constituent la première démonstration expérimentale du rôle de signal de sécrétion d’un élément structural précis d’une exoprotéine sécrétée par un T2SS. Ils ont également permis pour la première fois de caractériser des sites précis d’interactions entre une protéine sécrétée et des composants du T2SS. Cette étude constitue une avancée majeure dans la compréhension des mécanismes moléculaires qui gouvernent le recrutement et la sécrétion des protéines par le système de type IIThe type II secretion system (T2SS) is widespread in Gram-negative bacteria. It is notably exploited by various pathogenic bacteria to secrete virulence factors into the extracellular milieu and host tissues. The T2SS is composed of 12 to 15 proteins that assemble together into a complex machine that spans the bacterial envelope. It allows the translocation of fully folded proteins from the periplasm across the outer membrane. The exact mode of action of this sophisticated machine is still unknown. The phytopathogenic bacterium Dickeya dadantii uses a T2SS, named Out, to secrete several plant cell-wall degrading enzymes that cause the soft rot disease of many plants. We used the Out system of this bacterium as a model to study the molecular mechanism of protein secretion by T2SS. In order to study the mutual arrangement of the different components of this machinery, we used disulfide bonding, bacterial two hybrid and GST-pull down. We showed that the components of the inner membrane platform interact together and we characterized several interfaces between the inner membrane component OutC and the outer membrane secretin OutD. These various contacts create a complex and dynamic network within the secretion machine that can be modulated by the presence of a protein to be secreted. Subsequently, we combined genetic, biochemical, structural and bioinformatics approaches to study how the pectinase PelI is recognized by the inner membrane component OutC and the pore-forming secretin OutD. We showed that PelI interacts with the periplasmic domains HR and PDZ of OutC and N0 and N1 of OutD. The presence of N1OutD positively modulates the PDZ/PelI interaction, suggesting that protein progression through the T2SS could involve a succession of synergistic contacts. The OutC PDZ domain recognizes a short loop of PelI. This loop acts as a specific secretion signal that controls exoprotein recruitment by the T2SS. Concerted in silico and in vivo approaches suggest the occurrence of equivalent secretion motifs in other exoproteins. The interaction between PelI and OutD could involve a β-strand contact and an intrinsically disordered region located upstream of N1. This work provides the first experimental evidence of molecular mechanisms that govern exoprotein recruitment by the T2SS. Notably, we identified a short structural element acting as a secretion signal and characterized for the first time the interfaces between the T2SS components and a protein to be secreted. This study provides important new mechanistic insights to understand the functioning of this secretion machine
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Bongrand, Clotilde. "Régulation de la transcription par l'activité de sécrétion chez Shigella flexneri." Paris 7, 2011. http://www.theses.fr/2011PA077084.
Full textAbstract:
Le système de sécrétion de type III de Shigella flexneri, bactérie responsable de la dysenterie bacillaire chez l'homme, est activé au contact des cellules hôtes, conduisant à la transcription des gènes codant certains effecteurs. Cette régulation implique des interactions entre un activateur transcriptionnel de la familte AraC (MxiE), un co-activateur (IpgC), deux anti-co-activateurs (IpaB et IpaC), un anti-activateur (OspDl) et un co-anti-activateur (SpalS). En condition de non sécrétion, MxiE est associé à OspDl:Spal5 et IpgC est associé séparément à IpaB et IpaC. La sécrétion de OspDl, IpaB et IpaC permet à MxiE et IpgC d'interagir pour activer la transcription des gènes cibles. Pour étudier les interactions impliquant MxiE et ses partenaires protéiques, nous avons construit des plasmides codant pour MxiE (en entier ou par domaine) fusionné à la Maltose Binding Protein et OspDl ou IpgC fusionnés à une étiquette poly-His. Des résultats de co-purification ont montré que chaque domaine de MxiE peut interagir avec IpgC et OspDl. L'état agrégé de MxiE, documenté par des études de tamisage moléculaire et de diffusion de la lumière, ne nous a pas permis de déterminer la stœchiométrie de ces complexes. Pour l'étude des régions promotrices, de la boîte MxiE et des régions 5' non traduites (5'UTR), nous avons construit des plasmides dans lesquels le gène rapporteur lacZ était sous le contrôle de ces éléments. Le dosage de l'activité β-galactosidase, en condition de sécrétion ou non, a permis de mesurer la force des promoteurs, de caractériser les nucléotides essentiels à leur activation et d'identifier des structures secondaires stabilisatrices dans certaines 5'UTRThe type III secretion System of Shigella flexneri, the bacterium responsible for bacillary dysentery in human, is activated upon contact with host cells, inducing transcription of some effector-ehcoding genes. This régulation involves interactions between an AraC family transcriptional activator (MxiE), a co-activator (IpgC), two anti-co-activators (IpaB and IpaC), an anti-activator (OspDl) and a co-anti-activator (SpalS). In condition ofnon-secretion, MxiE is associated with OspD:Spal5 and IpgC is associated independently with IpaB and IpaC. The sécrétion of OspDl, IpaB and IpaC allows MxiE and IpgC to interact and activate transcription oftarget genes. To study of interactions involving MxiE and its partners, we constructed plasmids encoding MxïE(full-length or each domain) fused to the Maltose Binding Protein and OspDl or IpgC fused to, a poly-His tag. Co-purification experiments showed that each domain of MxiE can interact with IpgC and OspDl. Aggregation of MxiE was documented by gel filtration and static or dynamic Hght scattering studies and did not allow us to détermine the stoichiometry of these complexes. For the study of the target promoter regions, the MxiE box and 5' untranslated regions (5'UTR), we constructed plasmids in which the reporter gene lacZ was under the control of these elements. Determination of β-galactosidase activity, in condition of secretion or not, allowed us to measure the strength of different promoters, to determined nucleotides essential for their activation and to identify stabilizing secondary structures in some 5'UTR
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Dumas, Emilie. "Listeria monocytogenes : Caractérisation fonctionnelle d'un mutant ferritine. Etude de la biodiversité par une approche protéomique." Phd thesis, Clermont-Ferrand 2, 2007. http://www.theses.fr/2007CLF21758.
Full textAbstract:
Listeria monocytogenes est l'agent étiologique de la listériose, une infection d'origine alimentaire peu fréquente mais avec un taux de mortalité de 25% chez l'homme. Nous avons d'abord caractérisé un mutant ferritine et montré l'importance du produit de ce gène dans la virulence, la résistance à des conditions de carence en fer et de stress thermique ou oxydatif. Nous nous sommes ensuite intéressés à la biodiversité de L. Monocytogenes, par une approche protéomique en étudiant 12 souches d'origines de sérovars et de niveaux de virulence variés. Sur la base des profils des protéines intracellulaires et sécrétées, une classification hiérarchique a montré deux groupes distincts, l'un comprenant les souches de sérovar 1/2a, l'autre les souches de sérovar 4b et 1/2b. Des spots protéiques spécifiques de chaque souche et des différents sérovars ont été identifiés par spectrométrie de masse MALDI-TOF avec pour objectif de mieux hiérarchiser et gérer le risque dû à L. Monocytogenes
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Ferrandez, Yann. "Caractérisation du second système de sécrétion de type II chez la bactérie phytopathogène Erwinia chrysanthemi." Lyon, INSA, 2008. http://theses.insa-lyon.fr/publication/2008ISAL0109/these.pdf.
Full textAbstract:
Chez les bactéries à Gram négatif, toutes les protéines destinées à la membrane externe sont synthétisées avec une séquence signal qui est clivée lors de leur acheminement. Ce clivage s’effectue lors du passage de la membrane interne, par LepB pour les protéines intégrales de la membrane externe ou par LspA pour les lipoprotéines. Les séquençage du génome de Dickeya dadantii a permis de mettre en évidence une seconde machinerie de sécrétion de type II nommée Stt (pour Second Type Two). En aval de ce système se trouve un gène dénommé pnlH dont le produit est homologue à des pectines lyases. L’étude de cette protéine a montré qu’elle est un substrat de la machinerie Stt qui permet son passage de la face interne de la membrane externe à sa face externe. En l’absence de Stt ou chez Escherichia coli, PnlH est localisée à la face interne de la membrane externe. Cet ancrage est dû à l’extrémité N-terminale de la protéine qui n’est pas clivée lors du passage de la membrane interne et contient toute l’information pour l’adressage de la protéine. En effet, la fusion des 41 premiers acides aminés de PnlH à des protéines de différents compartiments cellulaires provoque l’adressage de celle-ci à la membrane externe. L’analyse plus approfondie de cette partie N-terminale montre certaines caractéristiques d’une séquence signal Tat-dépendante, permettant le passage de la membrane interne par le système Tat. L’analyse de mutants de la séquence signal ou de la machinerie Tat a confirmé que celle-ci est nécessaire pour le transfert de PnlH à travers la membrane interne. Ainsi, l’analyse de l’adressage de PnlH à la membrane externe a permis de mettre en évidence une nouvelle voie d’acheminement de protéines à la membrane externe des bactéries. Ce nouveau mécanisme de ciblage de protéines à la membrane externe est probablement répandu puisque PnlH est aussi localisée à la membrane externe quand elle est exprimée dans le E. Coli. PnlH n’étant pas détectée comme substrat de la machinerie Tat par les programmes de prédiction, cela suggère qu’il reste à découvrir d’autres protéines de la membrane externe Tat-dépendante encore non identifiéesIn Gram negative bacteria, ali the proteins destined for the outer membrane arc synthesized with a sequence signal which is cleaved during their routing. This cleavage is perfonned during the passage of the inner membrane, by LepB for outer membrane proteins (OMPs) or by LspA for lipoproteins. The sequencing of the genome of Dickeya dadamii allowed to bring to Light a second type II secretion machinery named Stt (for Second Type Two). Downstream to this system is a gene called pnlH, the product of which has homology with pectin lyases. The study of this protein showed that it is a substrate of the Stt machinery which allows its passage from the inner face to the outer face of outer membrane. In absence of Stt or in Escherichia coli, PnlH is localized in the inner face of the outer membrane. This anchoring is due to the terminal extremity of the protein which is not cleaved during the crossing of the inner membrane and contains all the information for the addressing of the protein. Indeed, the fusion of the first 41 amino acids of PnlH with proteins of various cellular compartments allows the addressing of these hybrids to the outer membrane. A more detailed analysis of this N-tenninal part shows characteristies of a Tat-dependant sequence signal, allowing the passage of the inner membrane by the Tat system. Analysis of mutants of the sequence signal or of the machinery Tat confirmed that this one is necessary for the passage of PnlH through the inner membrane. So, the analysis of the addressing of PnlH to the outer membrane allowed the identification a new way of routing of proteins to the outer membrane of bacteria. This new mechanism of targeting of proteins in the outer membrane is probably widespread because PnlH is also localized in the outer membrane when it is expressed in E. Coli. Since PnlH is not detected as a substrate of the Tat machinery by the prediction programs this suggests that other Tat targeted outer membrane proteins remain to be identified
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Morello, Eric. "Optimisation de la production de protéines hétérologues sécrétées chez la bactérie alimentaire modèle Lactococcus lactis." Paris 11, 2006. http://www.theses.fr/2006PA112241.
Full textAbstract:
Cette thèse a eu pour but de développer l’utilisation de Lactococcus lactis, bactérie lactique alimentaire modèle, comme hôte de production de protéines recombinantes sous forme sécrétée à l’échelle industrielle pour la commercialisation de protéines. L’hôte de production L. Lactis a été optimisé en identifiant et en caractérisant des facteurs influençant l’efficacité du processus global de sécrétion de protéines au niveau de différentes phases. Concernant les phases précoces, le gène ybdD de fonction inconnue chez L. Lactis a été identifié par mutagenèse insertionnelle aléatoire. Il code un facteur limitant dans l'étape de transcription du gène codant le rapporteur sécrété utilisé. Concernant les phases intermédiaires de la sécrétion, l’introduction chez L. Lactis de la protéine SecDF de Bacillus subtilis permet d’augmenter la quantité de protéines produites et sécrétées suggérant une amélioration globale de la production et/ou de la sécrétion via une stabilisation du précurseur en cours de translocation ou une accélération de ce processus. Au cours d’une partie appliquée, les éléments identifiés au cours de la phase d’optimisation de l’hôte de production ont été combinés à un nouveaux système d’expression : le promoteur zinc (identifié et breveté au laboratoire), et des signaux de sécrétion efficaces (peptides signaux et propeptide synthétique). Ces travaux ont permis de constituer chez L. Lactis, un système intégré d’expression-sécrétion optimisé, atteignant des niveaux élevés de production, de sécrétion et de pureté de protéines hétérologues chez cette bactérieThis study aimed to develop the use of Lactococcus lactis, the model lactic acid bacteria, as host for the production of heterologous secreted proteins at the industrial scale. This host has been optimised identifying and characterising factors influencing various stages of the protein secretion process efficiency. On early secretion stage, the ybdD gene of unknown fonction has been identified by random insertional mutagenesis. This gene encode a limiting factor affecting the transcription step of our reporter gene. On intermediary secretion stage, the expression of the Bacillus subtilis SecDF protein in L. Lactis increases the production and secretion of some proteins by probably improving the global production and/or secretion processes. This effect could result from translocated precursor stabilization or translocation process enhancement. Finally, these identified secretion enhancer host factors have been combined to a newly developped expression-secretion system: the zinc promoter (identified and pattented by the laboratory), and efficient secretion signals (signal-peptides and synthetic propeptides). This work allowed to make an optimized and integrated expression/secretion system of heterologous proteins in L. Lactis reaching competitive production level in this bacterium
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Ji, Jingwei. "Etude physiologique et génétique de la sécrétion des pectate-lyases chez une bactérie phytopathogène : Erwinia Chrysanthemi." Lyon, INSA, 1988. http://www.theses.fr/1988ISAL0008.
Full textAbstract:
La porriture molle de végétaux provoquée par Erwinia cluysanthemi est due à la sécrétion dans le milieu extracellulaire d'enzymes lytiques : pectinases, cellulases, protéases. Huit mutants (outJ) dans lesquels les pectate-lyases et les cellulases ne sont plus sécrétées dans le milieu extérieur mais retenues dans le périplasme ont été isolés, par mutagenèse chimique ou par insertion de phage Mu-lac. L'étude cinétique de la sécrétion de pectate-lyasés montre que le périplasme semble être un compartiment obligatoire pour la sécrétion. Les mutations outJ sont localisées dans un même locus sur le chromosome d'E. Chrysanthemi. Dans plusieurs mutants, une protéine péri plasmique de 65 kd est absente. Par étude de fusions outJ-lac, l'expression du gène outJ est apparue constitutive. Le clonage du gène outJ a été entrepris par utilisation du plasmide RP4::mini Mu. La sélection directe de ce gène étant difficile, le transposon Tn5 a été inséré près du gène out. ! par mutagenèse avec un plasmide suicide. La sélection de clones portant le Tn5 chez E. Coli puis la réintroduction chez un mutant outJ d'E. Chrysanthemi ont permis d'obtenir un fragment d'environ 30 kb portant l'insertion du Tn5 et le gène outJ. Le plasmide R551 complémente nos 8 mutations outJ. Le sous-clonage a permis de réduire cette région à un fragment ClaI/SspI de 4 kb. Le sens de transcription de la région codante a été établi à J'aide de fusions au gène lacZ réalisées par insertion de phages mini Mu-lac. Le gène outJ semble s'étaler sur environ 2,5 kb. Les fusions de protéines obtenues avec le transposon Tn5::phoA montrent que la protéine codée possède une séquence signal et donc qu'il s'agit d'une protéine exportée.
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Épaulard, Olivier. "Immunothérapie anti-tumorale par vecteur bactérien vivant : utlisation du système de sécrétion de type III de pseudomonas aeruginosa." Université Joseph Fourier (Grenoble), 2006. http://www.theses.fr/2006GRE10146.
Full textAbstract:
Le système de sécrétion de type III (SSTT) de P. Aeruginosa est un facteur de virulence permettant à la bactérie d'injecter des toxines directement dans le cytoplasme de cellules-cibles. Nous avons étudié l'utilisation de ce système comme mode de délivrance d'antigène non bactérien aux cellules présentatrices d'antigène (dont les cellules dendritiques)(CD), dans le but de déclencher une réaction lymphocytaire T cytotoxique spécifique. En effet, un vecteur basé sur le SSTT devrait déclencher à la fois l'activation des CD du fait de la nature bactérienne du vecteur, et la présentation par les molécules de classe 1 du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH-I) du fait de la topographie de délivrance de l'antigène. Nous avons utilisé une souche de P. Aeruginosa dont les gènes des toxines du SSTT avaient fait l'objet d'une délétion. La sécrétion des antigènes d'intérêt a été obtenue par fusion transcriptionnelle de la séquence de l'antigène avec celle de la région N-terminale (non toxique) d'un effecteur du SSTT, ExoS. Des souches contrôles produisant l'antigène sans le sécréter ou incapables de le délivrer en intracellulaire ont également été élaborées. Ln vitro en modèle murin, l'interaction de CD avec la souche délivrant l'ovalbumine permet l'activation subséquente d'un clone lymphocytaire T CD8+ spécifique de l'ovalbumine par les CD. Ln vivo, l'injection sous-cutanée de la même souche est associée à la génération de lymphocytes T CD8+ anti-ovalbumine (la réaction humorale contre l'antigène vectorialisé apparaissant minime) ; et les animaux ayant reçu 2 injections sous-cutanées de cette même souche sont résistants à l'implantation d'une tumeur exprimant l'ovalbumine, le mélanome syngénique B 16OV A. Chacun de ces évènements est dépendant de la délivrance de l'antigène par le SSTT. Dans un modèle tumoral in vivo utilisant une tumeur non modifiée (le glioblastome syngénique GL26) et des antigènes tumoraux natifs (gplOO et Trp2), l'injection du vecteur délivrant la gp 100 permet une protection relative contre l'implantation de la tumeur en sous-cutanée. Lors de l'implantation intracérébrale de la tumeur GL26, la survie n'est pas modifiée; des expériences d'immunohistochimie sont en cours pour rechercher des stigmates de réaction lymphocytaire T locale. Ln vitro en modèle humain, l'interaction de cellules dendritiques avec la souche délivrant la protéine Ml du virus Influenza permet l'activation de lymphocytes T CD8+ anti-Ml. Par ailleurs, des mutants atténués (auxotrophisme pour les acides aminés aromatiques, délétion des gènes du quorum sensing) ont été élaborés afin de disposer de vecteurs à l'innocuité maximale. Ce travail fait donc la preuve du concept de l'utilisation de vecteurs bactériens vivants basés sur le SSTT en immunothérapie anti-tumoralePseudomonas aeruginosa type III secretion system (TTSS) is a virulence factor allowing direct translocation of bacterial toxins from bacteria to eukaryotic cell cytoplasm. We took advantage of TTSS to elaborate a system of non-bacterial antigen delivery to antigen-presenting cells (among them dendritic cells (DCs)) to trigger a specifie CD8+ T lymphocyte response. Indeed, a TTSS-based vector may allow 1) DCs activation (being a bacteria) and 2) major histocompatibility complex class 1 (MHC-I)-restricted antigen presentation by DCs (because of the intracytoplasmic antigen delivery). We used a P. Aeruginosa strain which TTSS toxin genes had been deleted. Antigen secretion was obtained by transcriptionnal fusion of antigen coding sequence with the TTSS effector ExoS N-terminal (non-toxic) coding sequence. TTSS negative control (producing but not delivering antigen or secreting but not translocating the antigen) were elaborated. Ln an in vitro murine model, interaction of DCs with ovalbumin-delivering vector allows DC activation and CMH-I restricted presentation by DCs of peptide originating from ovalbumin. Ln an in vivo murine model, subcutaneous injection of ovalbumin-delivering vector was associated with an elevation of splenic antiovalbumin CD8+ T lymphocytes, and a poor (if any) anti-ovalbumin antibody generation. After two injections of this vector, animais were highly resistant to a challenge with the ovalbumin-expressing melanoma 816OVA in prophylactic and curative assays. These results were not obtained using TTSS negative controls. Ln an unmodified tumor (glioblastoma GL26) murine model, injection of vector delivering GL26 spontaneous antigen (gp100 and Trp2) was associated with a partial protection against subcutaneous GL26 challenge (with gp100) but not against intracerebral GL26 challenge. Immunohistochemistry is currently performed to assess local CD8+ T lymphocyte tumoral infiltration. Ln a human in vitro model, a vector delivering Influenza virus protein M1 induces the activation by DCs of anti-M1 CD8+ T lymphocytes. Moreover, attenuated vectors (auxotrophic for aromatic aminoacids and/or lacking key quorum sensing genes) have been elaborated. This work demonstrates that TTSS-based vectors may be considered as useful in anti-tumor immunotherapy
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Viollet, Amandine. "Influence du système de sécrétion de type III bactérien dans les interactions plante-Pseudomonas spp. fluorescents non pathogènes." Phd thesis, Université de Bourgogne, 2010. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00596562.
Full textAbstract:
L'objectif de cette thèse est de contribuer à faire progresser les connaissances sur les interactions bénéfiques entre les plantes et les microorganismes en évaluant la contribution des systèmes de sécrétion de type III (SST3). Une synthèse des connaissances disponibles relatives aux SST3 chez les Pseudomonas non pathogènes, saprotrophes ou mutualistes, présentée chapitre I, montre que les SST3 ne sont pas cantonnés aux interactions parasites ou pathogènes avec les plantes. Dans l'étude expérimentale présentée chapitre II, nous avons utilisé différents génotypes de Medicago truncatula Gaertn. cv. Jemalong capables (Myc+) ou non (Myc-) d'établir une symbiose mycorhizienne. Ce travail nous a permis de montrer que les Pseudomonas spp. fluorescents possédant un SST3 (SST3+) sont préférentiellement associés aux racines mycorhizées des génotypes Myc+ de M. truncatula (J5 et TRV48) plutôt qu'aux racines du mutant Myc- (TRV25) et au sol nu. Ainsi, la plante seule n'est pas à l'origine de la présence accrue des Pseudomonas SST3+. La colonisation de la racine par les champignons mycorhizogènes à arbuscules (CMA), le développement du mycélium intraradiculaire et/ou la formation associée d'arbuscules, sont également déterminants. Dans l'étude présentée chapitre III, nous avons comparé les effets de la souche modèle promotrice de mycorhization (MHB) P. fluorescens C7R12 (SST3+) et de son mutant C7SM7 (SST3-), sur la mycorhization et la croissance de M. truncatula dans un sol non stérile. Ce travail a permis de montrer que le SST3 de C7R12 contribue à l'effet MHB de la bactérie. La promotion de la colonisation de la racine de M. truncatula par les CMA indigènes induite par le SST3 de C7R12 s'est traduite par une amélioration de la croissance de la plante. En revanche, l'inactivation du SST3 chez C7SM7 a eu un impact délétère sur la colonisation de la racine de M. truncatula par les CMA du sol étudié et sur la croissance de la plante. L'observation d'effets quantitatifs opposés entre C7R12 et C7SM7, nous a conduits à nous interroger sur l'existence d'un effet différentiel de l'inoculation de ces bactéries sur la structure et la diversité des communautés des microorganismes associés. Dans une étude présentée chapitre IV, le suivi dynamique en parallèle de la structure des communautés totales bactériennes (B-RISA) et fongiques (F-RISA) et de la colonisation de la racine par les CMA a été réalisée. Aucun effet de l'inoculation n'a été observé sur la structure des communautés fongiques de la rhizosphère ou des racines. En revanche, la structure des communautés bactériennes a varié selon que les plantes aient été inoculées ou non et selon la souche inoculée. Néanmoins, ces différences ont été observées plusieurs semaines après les effets de l'inoculation de C7R12 ou de C7SM7 sur la colonisation de la racine par les CMA. Ce décalage dans le temps, suggère que les différences observées dans la structure des communautés bactériennes pourraient être une conséquence plutôt qu'une cause des variations observées sur la mycorhization de M. truncatula. Nos résultats n'ont pas permis de mettre en évidence d'effets de l'inoculation sur la diversité des populations des bactéries fixatrices d'azote présentes dans les nodosités de M. truncatula. L'analyse des séquences de la grande sous-unité de l'ADN ribosomique (LSU rDNA) amplifiées à partir d'ADN extrait des racines, a montré pour les plantes inoculées et non inoculées, que les populations de CMA étaient majoritairement apparentées à Glomus intraradices. Un groupe d'isolats spécifiquement associé aux racines inoculées avec C7R12 et apparenté à G. claroideum a été décrit. Le groupe spécifique pourrait être associé à l'amélioration de la mycorhization observée dans les racines inoculées avec C7R12. Néanmoins, compte tenu de sa faible représentation numérique (8%), il semble probable que l'inoculation de C7R12 ait aussi un effet quantitatif sur la colonisation de la racine de M. truncatula par les CMA. etc
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Henriques, Gabriela. "Towards the understanding of the function and regulation of a membrane protein complex involving SppA and YteJ in Bacillus subtilis." Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2019. http://www.theses.fr/2019SACLS191.
Full textAbstract:
Chez Bacillus subtilis nous avons identifié un complexe protéique membranaire impliquant une protéine inconnue, YteJ, et une autre protéine membranaire, SppA, une signal peptide peptidase également impliquée dans la résistance aux peptides antibactériens de la famille des lantibiotiques. Après délétion des gènes correspondant, nous avons montré que les deux protéines sont impliquées dans cette résistance. Dans la souche ΔsppA, la surexpression ectopique de SppA a non seulement restauré la résistance, mais elle a également induit la formation de cellules allongées, un phénotype supprimé par la surexpression simultanée de YteJ. L'expression de versions tronquées de YteJ a mis en évidence le rôle inhibiteur d'un domaine spécifique de YteJ. Enfin, des études biochimiques in vitro ont confirmé que l'activité de la protéase SppA était fortement réduite par la présence de YteJ, confirmant l'hypothèse d'une inhibition par YteJ. Nos études in vivo et in vitro ont montré que YteJ, via l'un de ses domaines, agit comme régulateur négatif de l'activité protéase de SppA dans ce complexe. En conclusion, nous avons montré que le complexe SppA/YteJ est impliqué dans la résistance aux lantibiotiques à travers l’activité protéase de SppA, elle-même régulée par YteJWe have identified a membrane protein complex of Bacillus subtilis involving an unknown protein, YteJ, and SppA, a membrane protein first described as a signal peptide peptidase and later shown to be also involved in the resistance to antibacterial peptides of the lantibiotic family. Using deletion mutant strains, we showed that both proteins are involved in this resistance. In the ΔsppA strain, the ectopic overexpression of SppA not only restored the resistance, it also induced the formation of elongated cells, a phenotype suppressed by the simultaneous overexpression of YteJ. Furthermore, the expression of truncated versions of YteJ pinpointed the inhibitory role of a specific domain of YteJ. Finally, in vitro biochemical studies showed that SppA protease activity was strongly reduced by the presence of YteJ, supporting the hypothesis of an inhibition by YteJ. Our in vivo and in vitro studies showed that YteJ, via one of its domain, acts as a negative regulator of the protease activity of SppA in this complex. In conclusion, we have shown that SppA/YteJ complex is involved in lantibiotic resistance through the protease activity of SppA, which is regulated by YteJ
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Rancès, Edwige. "Étude des déterminants génétiques bactériens impliqués dans les interactions Wolbachia-hôtes : analyse fonctionnelle du système de sécrétion de type IV." Lyon 1, 2008. http://www.theses.fr/2008LYO10132.
Full textAbstract:
Wolbachia est une bactérie intra-cellulaire stricte qui infecte certains nématodes filaires et un grand nombre d'arthropodes. Chez la plupart des insectes, Wolbachia est considérée comme parasite de la reproduction. Néanmoins, chez l'hyménoptère Asobara tabida, la bactérie est devenue obligatoire à l'accomplissement de l'ovogenèse. Malgré l'intétêt scientifique porté à Wolbachia, les mécanismes moléculaires impliqués dans les interactions avec ses hôtes peu connus. Le séquençage des génomes de souches Wolbachia a mis en évidence la présence des gènes codant le système de sécrétion de type IV ( SST4) souvent engagé dans le dialogue bactéries-hôtes. Dans ce contexte, le travail de cette thèse consistait à développer des outils permettant la manipulation de la bactérie puis à étudier la fonctionnalité du SST4 chez Wolbachia. Un anticorps ciblant la protéine VirB6 du SST4 a été produit et a permis de confirmer la fontionnalité du translocon in cellulo et in insectaWolbachia is a strict intracellular bacterium which infects certain filarial nematodes and a great number of arthropods. For the marjority of insects, Wolbachia is considered a reproductive parasite. Nevertheless, in hymenoptera Asobara tabida, the bacterium became obligatory for insect oogenesis. Despite the scientific interest carried with Wolbachia, the molecular mechanisms implied in the interactions with its hosts are poorly knwn. The sequencing Wolbachia genomes highlighted the presence of genes encoding the type IV secretion system ( T4SS) often involved in the dialogue between bacteria and hosts. In the context, this study consisted in developing tools to handle the bacterium, then to decipher the functionality of the T4SS in Wolbachia. Polyclonal antibodies raised against the VirB6 protein was produced and confirmed the functionality of the T4SS translocon in cellulo and in insecta
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Cunnac, Sébastien. "Identification à l'échelle génomique des effecteurs dépendant du système de sécrétion de type III de la bactérie phytopathogène Ralstonia solanacearum." Toulouse 3, 2004. http://www.theses.fr/2004TOU30197.
Full textAbstract:
La bactérie phytopathogène Ralstonia solanacearum est l'agent causal du flétrissement bactérien des solanées. Les gènes hrp codent pour un appareil de sécrétion de protéines, dit de type III, qui permet l'injection d'effecteurs du pouvoir pathogène à l'intérieur des cellules végétales hôtes. Le gène régulateur hrpB contrôle l'expression des composants de la machinerie Hrp et des substrats qui l'empruntent. La caractérisation du mécanisme d'action de HrpB a permis de définir un motif cis-opérateur conservé, la boite hrpII, indispensable à l'activité des promoteurs du régulon. Une liste de 114 gènes candidats a été constituée suite à la recherche de ce motif sur la séquence du génome de R. Solanacearum GMI1000. Dans un deuxième temps, l'analyse fonctionnelle des candidats identifiés par les approches in silico a été entreprise : 48 de ces gènes font partie du régulon hrpB. Neuf brg (gènes hrpB-régulés) sont homologues à des effecteurs de type III précédemment décrits chez d'autres bactéries phytopathogènes. Les 31 brg restants codent pour des protéines originales qui arborent un signal d'injection potentiel. La translocation hrp-dépendante de cinq protéines candidates dans des cellules végétales a été confirmée. L'étude du pouvoir pathogène des mutants d'insertion générés vis-à-vis de deux espèces hôtes indique que l'interaction n'est modifiée que pour un petit nombre d'entre eux. Finalement, nous avons caractérisé le gène avrA, qui conditionne l'aptitude de la bactérie à déclencher une réponse hypersensible sur différentes espèces de Nicotiana. L'ensemble de ces travaux suggère que le génome de R. Solanacearum héberge un répertoire d'effecteurs de type III considérable (50 à 70). La compréhension de leur contribution respective au pouvoir pathogène de R. Solanaceraum nécessitera l'élucidation de leur activité moléculaire sur le métabolisme de la cellule végétaleRalstonia solanacearum is the causal agent of bacterial wilt disease. Hrp genes encode a type III protein secretion apparatus that allows virulence effectors injection into the host plant cell. The regulatory gene hrpB controls expression of the structural components of the secretion machinery as well as its substrates. Characterization of the mode of action of HrpB allowed the definition of the hrpII box, a conserved cis-operator motif required for activity of the promoters belonging to this regulon. A search for this motif on R. Solanacearum GMI1000 genome sequence produced a list of 114 candidate genes. The next step involved the functional analysis of a group of these candidate genes : 48 of them were shown to belong to the hrpB regulon. Nine brg (hrpB-regulated genes) are homologous to known type III effectors from other plant pathogenic bacteria. The remaining 31 brg encode unknown or hypothetical proteins harbouring a putative type III-translocation signal. Hrp-dependent translocation into plant cells was confirmed for five candidate proteins. Only a few of the insertion mutants generated displayed an altered virulence when tested onto two host species. Finally, we identified and characterized the avrA gene which is necessary for elicitation of the hypersensitive response on some Nicotiana species. Altogether, these data suggest that R. Solanacearum genome contains a large type III effector repertory (50 to 70). Understanding their relative contribution to R. Solanacearum pathogenicity will await future elucidation of their molecular activity on the plant cell metabolism
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Nothelfer, Katharina. "Manipulation of the adaptive immune response by Shigella : Induction of B cell apoptosis dependent on the IpaD virulence factor." Paris 7, 2012. http://www.theses.fr/2012PA077159.
Full textAbstract:
Shigella, une bactérie à Gram-négatif, est l'agent responsable de la dysentrie bacillaire, une rectocolite aigüe caractérisée par l'invasion de la muqueuse colo-rectale et l'induction d'une inflammation aigüe accompagnée d'une destruction tissulaire massive. L'immunité naturelle, de courte durée, est médiée par des anticorps et requiert plusieurs infections pour être initiée. L'objectif de ce travail était d'analyser si le ciblage direct des lymphocytes par Shigella pouvait avoir un impact sur l'induction de la réponse spécifique. Nous rapportons ici que Shigella cible les lymphocytes B requis pour la mise en place de l'immunité protectrice. Dans un modèle d'infection ex vivo de tissu colique humain, nous montrons que Shigella interagit avec les cellules B et occasionnellement les envahit. In vitro et in vivo, nous observons une réduction de la population de lymphocytes B suite à l'infection par Shigella, et ce, de façon dépendante du système de secretion de type III (SST3). Cette réduction est liée à l'apoptose des cellules B, qui curieusement est indépendante de la translocation d'effecteurs du SST3 dans les lymphocytes B mais requiert le contact extracellulaire avec la protéine de virulence IpaD présente à l'extrémité de l'aiguille composant le SST3. En parallèle de ces résultats qui révèlent un nouveau mécanisme d'action du SST3 de type "touché-coulé", nous montrons que Shigella grâce à l'injection d'un effecteur via le SST3 cible aussi les lymphocytes T et inhibe leur migration. Ces résultats révèlent de nouveaux mécanismes développés par les bactéries pathogènes pour manipuler la réponse immune de l'hôte et limiter la mise en place d'une immunité protectriceShigellla is a Gram-negative bacterium responsible for bacillary dysentery, an acute recto-colitis reflecting invasion of the colonic and rectal mucosa that results in inflammation and massive tissue destruction. Antibody-mediated immunity to Shigella requires several episodes of infection to get primed and is short-lasting. The aim of this work was to investigate whether direct targeting of lymphocytes by Shigella could impair the priming of the specific response. We describe that Shigella targets B lymphocytes, the lymphocyte population that confers antibody-mediated protection against Shigella. In an ex vivo human colonic infection model wild-type (WT) Shigella, but not the Type Three Secretion System (T3SS) mutant, interacts with an occasionally invades B cells. In in vitro approaches, as well as in an in vivo murine infection model, we observe that the B cell pool is significantly reduced upon WT Shigella infection. Moreover, despite low invasion rates, Shigella induces apoptotic B cell death in a T3SS-dependent manner. Intriguingly, B cell apoptosis is not dependent on the translocation of virulence effectors into the host cell, but rather on the extracellular exposure of B cells to the Shigella virulence protein IpaD that is present at the tip of the T3SS needle. Additionally to these findings, which demonstrate a new "kiss and kill" mechanism of T3SS action, we describe an "injection-only" mechanism, by which Shigella targets T lymphocytes and inhibits their migration by injection of one of its T3SS effectors. These findings reveal novel mechanisms for pathogenic bacteria to undermine the host and impair the mounting of an effective protective immune response
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Lonjon, Fabien. "Contrôle post-traductionnel de la sécrétion de Type III chez la bactérie phytopathogène Ralstonia solanacearum : chaperonnes et protéine à domaine T3S4." Thesis, Toulouse 3, 2017. http://www.theses.fr/2017TOU30218.
Full textAbstract:
La bactérie phytopathogène Ralstonia solanacearum est lʼagent responsable du flétrissement bactérien sur plus de 200 espèces végétales, dont des espèces agronomiques, faisant de cette bactériose une des plus importantes dans le monde. Le pouvoir pathogène de la bactérie repose en grande partie sur sa capacité à injecter des protéines, appelées effecteurs de Type III (ET3), via le système de sécrétion de Type III (SST3). Chez R. solanacearum, les mécanismes de contrôle de la sécrétion au niveau post-traductionnel restent méconnus, contrairement aux mécanismes de régulation transcriptionnelle. Au cours de ces travaux, nous nous sommes intéressés à quatre protéines potentiellement impliquées dans le contrôle de la sécrétion d’ET3 au niveau post-traductionnel : les protéines chaperonnes de Type III (CT3) putatives HpaB et HpaD, la protéine à domaine LRR HpaG et la protéine à domaine T3S4 HpaP. Nous avons ainsi comparé les sécrétomes de la souche sauvage et des mutants hpa (hypersensitive response and pathogenicity associated) par spectrométrie de masse. Ces protéines ont des rôles très différents sur le contrôle de la sécrétion d’ET3. En effet, la protéine HpaG s’avère être un régulateur négatif de la sécrétion d’ET3 et est spécifiquement requise pour le développement de la maladie sur Medicago truncatula. Au contraire, la protéine HpaD contrôle la sécrétion de peu de substrats du SST3, mais est capable d’interagir avec 9 ET3. Enfin, la protéine HpaB est nécessaire à la sécrétion de la majorité des ET3 et interagit avec 10 ET3. Nos travaux nous ont permis de conclure que les protéines HpaB et HpaD sont de véritables chaperonnes de Type III de classe IB. La protéine HpaB est de plus nécessaire au pouvoir pathogène de la bactérie sur l’ensemble des hôtes testés. Nous avons montré que son homologue chez X. campestris pv. vesicatoria (Xcv) était capable de complémenter partiellement le mutant hpaB de R. solanacearum. Cela a permis d’illustrer le rôle central de la chaperonne HpaB dans la sécrétion d’ET3 chez R. solanacearum et Xcv. Concernant la protéine à domaine T3S4 HpaP, nous avons montré qu’elle contrôlait surtout la sécrétion de substrats précoces du SST3 et de très peu d’ET3. La protéine HpaP interagit physiquement avec la protéine HrpJ, composant putatif de la tige interne du SST3. Chez un mutant hpaP, la protéine HrpJ est alors spécifiquement sécrétée, transloquée in planta, puis retrouvée au sein du cytoplasme et du réticulum endoplasmique de la cellule végétale. Par des approches de génétique d’association, nous avons montré que la protéine HrpJ était capable de déclencher des réponses de type HR-like/nécrose sur certaines accessions d’A. thaliana, et que ces réponses semblaient liées à des acyl-transférases végétales. Nos travaux soulignent ainsi la complexité du réseau de régulation de la sécrétion d’ET3 chez R. solanacearum au niveau post-traductionnel, et ont permis d’avancer dans la compréhension du rôle des protéines Hpa dans ces mécanismes de régulationRalstonia solanacearum species complex, causing bacterial wilt disease, exerts its pathogenicity through more than a hundred secreted proteins, many of them depending directly on the functionality of a type 3 secretion system (T3SS). To date, only few type 3 effectors (T3Es) have been identified as individually required for bacterial pathogenicity. In order to identify sets of effectors collectively promoting disease on susceptible hosts, we investigated the role of putative post-translational regulators in the control of type 3 secretion (T3S). We identified three proteins potentially implicated in the control of T3S: the chaperones HpaB, HpaD and the LRR protein HpaG. A shotgun secretome analysis with label-free quantification using tandem mass spectrometry was performed on the GMI1000 strain. 228 proteins were identified, among which a large proportion of T3Es. A focused secretome analysis using the three hpa mutants revealed a fine secretion regulation and specific subsets of T3Es with different secretion patterns. We showed that a set of T3Es are secreted in an Hpa-independent manner, whereas others show a positive or a negative Hpa-regulation of their secretion. In parallel, to better understand how these Hpa-proteins control the regulation of the secretion, we looked for Hpa-T3E direct interactions. We screened for HpaB and HpaD interactions with 38 R. solanacearum T3Es and we highlighted a set of shared and specific T3Es. In addition, to evaluate the impact of altered T3E secretion on plant pathogenesis, the hpa mutants were assayed on several host plants and different host specificities could be observed. In parallel, we have demonstrated that HpaP, a putative type 3 secretion substrate specificity switch (T3S4) protein of R. solanacearum controls T3E secretion. Interestingly, HpaP is required for full pathogenicity on several host plants (tomato, Arabidopsis thaliana, …). To better understand the role of HpaP on R. solanacearum pathogenicity, we analyzed the secretomes of the GMI1000 wild type strain as well as the hpaP mutant using mass spectrometry experiment (LC-MS/MS). The secretomes of both strains appeared to be quite similar and highlighted the modulation of the secretion of few type 3 substrates. Interestingly, only one T3 associated protein, HrpJ (putative component of the type 3 apparatus) was identified specifically secreted by the hpaP mutant. We showed that this protein was also specifically translocated by the mutant, and confocal microscopy experiments demonstrated an in planta cytoplasmic localization. The natural diversity of A. thaliana was also explored in response to the hrpJ delivery. Interestingly HrpJ is able to trigger necrosis in some accessions of a local population of A. thaliana. This necrosis responses seem to be associated with a plant acyl-transferase. All these data providing a better view of type 3 secretion control in R. solanacearum
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Sayes, Fadel. "Etude de l'influence du Système de Sécrétion de Type VII "ESX-5" de Mycobacterium tuberculosis sur l'Immunité Anti-Mycobactérienne." Paris 7, 2013. http://www.theses.fr/2013PA077268.
Full textAbstract:
Mycobacterium tuberculosis (Mtb), l'agent étiologique de la tuberculose, est chaque année responsable de ≈ 9 millions de nouveaux cas d'infection et ≈ 1,4 millions de décès dans le monde. Le génome de Mtb comporte des régions codant pour 5 systèmes de sécrétion de type VII: ESX-1 à ESX-5. La plupart de ces régions comportent des gènes codant pour des protéines PE/PPE, nommées en raison de leurs motifs caractéristiques Proline-Acide Glutamique (PE) ou Proline-Proline-Acide Glutamique (PPE). Nous avons montré que les protéines PE/PPE associées à ESX-5 sont fortement immunogéniques pour les cellules T CD4+ et T CD8+. La sécrétion, et par conséquent l'immunogénicité, de ces protéines sont fortement contrôlées par le produit du gène eccD5, qui constitue le canal transmembranaire du système ESX-5. Nous avons montré que la souche de Mtb Δppe25-pe19, invalidée pour le segment pe/ppe d'esx-5, présente une virulence très atténuée chez la souris immunocompétente. De plus, nous avons établi que cette atténuation n'est pas due à une interférence avec l'expression des facteurs majeurs de virulence liés au ESX-1: ESAT-6 et CFP-10. Grâce à un canal EccD5 fonctionnel, la souche Δppe25-pel9 est capable d'induire des réponses Thl contre un large panel de protéines PE/PPE non-associées à esx-5, qui par leur forte réactivité croisée, reconnaissent les facteurs de virulence PE/PPE d'esx-5 absents de cette souche. Enfin, nous avons montré la capacité protectrice de la souche Δppe25-pel 9 contre l'infection par Mtb, qui est significativement supérieure à celle du BCG. Par conséquent, nos travaux ouvrent de nouvelles perspectives pour la mise au point d'un vaccin vivant atténué contre la tuberculoseMycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of human tuberculosis is responsible for ≈ 9 million new cases of infection and ≈ 1. 4 million deaths per year worldwide. The genome of Mtb encodes five potential type VII secretion systems, ESX-1 to ESX-5, most of which are associated with genes encoding PE/PPE proteins, named after their N-terminal Pro-Glu (PE) or Pro-Pro-Glu (PPE) motifs. Here, we have shown that the ESX-5-associated PE/PPE proteins are highly immunogenic for both CD4+ and CD8+ T cells. Indeed, we describe the strong T cell immunogenicity of the ESX-5-encoded PE/PPE proteins, which share a large panel of cross-reactive CD4+ T epitopes with substantial numbers of their ESX-5-nonassociated PE/PPE homologs. The immunogenicity of these numerous PE/PPE proteins is dependent on their export by a functional EccD5, the predicted trans-membrane channel of the ESX-5 secretion apparatus. The Mtb Δppe25-pe 19 mutant deleted for all ESX-5-associated pe and ppe genes, although highly attenuated in immunocompetent mice, remains able to induce immunity against the ESX-5-associated PE/PPE virulence factors, via cross-reactivity with their numerous homologs, and against the ESX-1 virulence factors ESAT-6/CFP-10. Moreover, the Mtb Δppe25-pe19 strain is as potent as WT Mtb of inducing phenotypic and functional maturation of innate immune cells. The Mtb Δppe25-pel9 strain is strongly protective against pathogenic Mtb infection in mice and represents a potential anti-tuberculosis vaccine candidate
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Wang, Yan. "Développement de l'immunothérapie anti-tumorale médiée par vecteur bactérien vivant basé sur le système de sécrétion de type III de Pseudomonas aeruginosa." Phd thesis, Université de Grenoble, 2012. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00767285.
Full textAbstract:
En raison de l'efficacité pour délivrer des antigènes directement dans le cytoplasme des CAPs in vivo, les vecteurs bactériens atténués et basés sur les propriétés du système de sécrétion de type 3 (SST3) attirent de plus en plus l'attention grâce à leur potentiel dans le développement des vaccins contre le cancer. Pseudomonas aeruginosa est un pathogène opportuniste responsable d'infections graves chez les personnes immunodéprimées, les grands brûlés et les patients atteints de la mucoviscidose. Cette pathogénicité repose sur de nombreux facteurs de virulence dont le SST3. Dans nos travaux précédents, le potentiel de souches atténuées de P. aeruginosa dans le domaine de la vaccination anti-tumorale a été démontré. Dans ce travail, nous avons optimisé des vecteurs vaccinaux basés sur le SST3 de P. aeruginosa pour des applications cliniques. Dans un premier temps, la performance de ces vecteurs bactériens a été améliorée en utilisant différents modèles de tumeurs murines. Ceci par : 1) l'ajout d'un épitope spécifique des lymphocytes CD4+ Th aux vecteurs; 2) l'application d'un modèle d'expression bi-antigénique aux vecteurs; 3) la construction de vecteurs induisant une réponse humorale. Dans un deuxième temps, la performance thérapeutique du vecteur bactérien a été optimisée par la modulation de la fréquence des injections et l'intervalle qui les sépare. Cette performance a été confirmée dans des modèles différents de tumeurs murines. Dans un troisième temps, un candidat qui pourrait être appliqué en clinique a été généré par l'adaptation d'un mutant (CHA-OAL) de P. aeruginosa totalement avirulent dans un milieu chimiquement défini. La très faible infectiosité de cette souche a été surmontée par en vaccinant à des emplacements multiples. Par la suite, le potentiel du vecteur bactérien dans l'immunothérapie humaine a été également évalué- dans un premiers temps-dans un modèle de souris humanisées (HHD). Enfin, nous avons observé qu'une immunité anti-vecteur pré-existante n'a pas d'effet sur l'efficacité de la vaccination par le vecteur bactérien. L'ensemble de nos résultats a mis en évidence le potentiel de nos vecteurs vivants et atténués de P. aeruginosa pour des applications dans des essais cliniques pertinents.
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Faize, Mohamed. "Modulation différentielle de l'interaction compatible Erwinia amylovora - pommier par des mutants HRP de régulation et de sécrétion de l'agent pathogène." Lyon 1, 2000. http://www.theses.fr/2000LYO10041.
Full textAbstract:
Le feu bactérien est une maladie des maloideae provoquée par Erwinia Amylovora. Des travaux antérieurs utilisant des inoculations par blessure ont montré que des mutants HRP d'E. Amylovora sont capables de protéger différentiellement des plantules de pommier de l'infection par une souche virulente. Notre travail examine la validité de ces résultats à l'aide de biotests n'utilisant pas de blessure et analyse le rôle de mécanismes impliqués dans la protection. Nos résultats montrnet une aptitude élevée à la protection ches les mutants altérés dans les gènes de régulation HRPS et HRPL par rapport à celle d'un mutant de sécrétion HRCV et indiquent l'existence d'une compétition entre les mutants et la souche virulente. Une étude de co-localisation in Planta du mutant HRPL et de la souche virulente, utilisant un double marquage, montre que ces deux souches inoculées simulténément se localisent au niveau de sites différents. L'analyse de la dynamique des populations bactériennes inoculées montre que la protection est liée à l'inhibition de la multiplication de la souche virulente. Cette inhibition est associée à l'activation d'enzymes de défense de la plante (PAL, POD) qui est plus rapide et plus intense après inoculation du mutant HRPS qu'après celle du mutant HRCV. L'activation de ces enzymes ainsi que celle d'une enzyme intervenant dans le stress oxydatif (GST) est induite de façon différentielle par les mutants. L'analyse des protéines bactériennes secrétées révèle des différences entre les mutants ; le rôle de ces protéines dans l'activation des défenses de la plante est discuté.
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Chaker, Hichem. "Régulation de l'adaptation de la bactérie Pseudomonas aeruginosa à son hôte : implication des métabolites du tryptophane." Phd thesis, Université de Grenoble, 2012. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00682876.
Full textAbstract:
P. aeruginosa est un pathogène opportuniste capable d'infecter un large spectre d'hôtes. Elle possède un vaste arsenal de facteurs de virulence. Le système de sécrétion de type III (SSTT) est un facteur de virulence majeur dont la régulation est complexe pour permettre une adaptation la plus précise possible de la bactérie au cours de l'infection. Nous nous sommes intéressés à déterminer le rôle potentiel de nouveaux acteurs de l'adaptation de P.aeruginosa au cours de l'infection. La porine OprF qui représente la protéine la plus abondante de la membrane externe de P. aeruginosa lui permettrait d'évaluer l'état d'activation du système immunitaire de son hôte afin d'adapter sa virulence. Chez P. aeruginosa, le tryptophane est le précurseur des kynurenines qui sont également produites par l'hôte à partir du tryptophane et qui, dans ce dernier contexte, sont des immunomodulateurs. Peu ou pas d'études ont été réalisées pour mettre en œuvre un éventuel rôle d'immunomodulation ou dans la virulence des kynurénines bactériennes. Dans un premier temps, nous nous sommes intéressés à un signal anciennement découvert au laboratoire et qui réprime l'expression du SSTT à haute densité bactérienne. Nous avons montré que ce signal exerce une régulation post-transcriptionnelle en plus d'une inhibition de la transcription des gènes du SSTT. Le métabolisme du tryptophane et de l'anthranilate semble être au cœur de ce processus de régulation. En inactivant des voies du catabolisme du tryptophane, nous avons montré que la production de ce signal dépend partiellement de la voie des kynurénines mais ne dépend pas ni des voies classiques du quorum sensing ni de l'opéron phnAB, impliqué dans la synthèse de l'anthranilate. Cependant, la voie des phénazines pourrait être impliquée dans la production de ce signal. Par CLHP couplée à la spectrométrie de masse, nous avons pu séparer des espèces moléculaires réprimant le SSTT et qui sont contenues dans ce signal, mais l'identification précise nécessite plus d'investigations. Dans un second temps, nous nous sommes intéressés aux kynurénines produites par la bactérie. Nous avons confirmé que P. aeruginosa produit des kynurénines et le gène kynA est le gène clé de la voie de synthèse de ces métabolites. En utilisant des fusions transcriptionnnelles, nous avons montré que le tryptophane et la kynurénine régulent positivement la production des kynurénines en agissant sur l'expression des gènes clés. D'autres parts, nous avons remarqué que la bactérie module l'activité de la voie métabolique des kynurénines issue du tryptophane en fonction de son état de croissance. Nous avons montré qu'au cours du dialogue interrègne bactérie/hôte, la voie des kynurénines de P. aeruginosa est stimulée par certains composants du système immunitaire. Grâce à un modèle d'infection pulmonaire aiguë, nous avons prouvé que les kynurénines produites par la bactérie sont importantes pour sa virulence. Selon notre hypothèse les kynurénines pourraient avoir une action sur la réponse immune, mais cela reste à déterminer. Dans un troisième temps, nous nous somme focalisés sur la porine OprF. Nous avons montré que la mutation ∆oprF est à l'origine d'une altération de la production mais vraisemblablement pas de la sécrétion des exotoxines du SSTT. Un ligand connu d'OprF, l'interféron gamma, module la voie des kynurénines. OprF pourrait donc avoir un rôle central dans les différents aspects de la régulation de la virulence. Nous avons donc produit des anticorps monoclonaux anti-OprF. Ces derniers se sont révélés capables de reconnaître spécifiquement la protéine OprF. Afin de vérifier l'efficacité de ces anticorps, des expériences de neutralisation de la bactérie in vitro puis in vivo seront réalisées. Mots clés : Pseudomonas aeruginosa, Système de Sécrétion de Type III, régulation, catabolisme du tryptophane, kynurénines, OprF.