Dissertations / Theses on the topic 'Bacitracin'

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior<br>A bacitracina é um dos mais importantes antibióticos polipeptídicos, produzido por Bacillus licheniformis e Bacillus subtilis, funcionando como inibidor da biossíntese da parede celular. O soro de leite é um rejeito da fabricação de queijos de alto valor nutricional, sendo considerado um poluente extremamente problemático devido à elevada carga orgânica e grande volume gerado. O presente trabalho teve como objetivo estudar o potencial biotecnológico de B. licheniformis UCP1 01 O, isolada de solo contaminado por petróleo, na produção de bacitracina, utilizando meios formulados à base de soro de leite, em substituição ao ácido glutâmico e utilizando glicose como fonte adicional de carbono. Foi empregado um planejamento fatorial 23, variando as condições de temperatura, concentrações de glicose e de soro de leite, tendo como variável resposta o diâmetro do halo produzido pelo microorganismo. A produção foi detectada através do teste de difusão em disco, utilizando Micrococcus flavus como micro-organismo teste. Os resultados obtidos evidenciaram a presença de halos com diâmetros variando entre 11 mm e 27mm, em todas as temperaturas estudadas. No entanto, a melhor produção ocorreu a 37C, em pH alcalino, após 72h de crescimento microbiano. De acordo com o planejamento fatorial utilizado, os ensaios realizados nas condições do ponto central apresentaram melhor potencial para produção de bacitracina. Tal fato indica que as concentrações de soro de leite 40% (v/v) e de glicose 20g/L mostraram-se mais eficientes para a produção do antibiótico. Assim, pode-se concluir que o micro- organismo estudado possui potencial para produção de antibióticos utilizando soro de leite como substrato, evitando que esse resíduo seja descartado no meio ambiente

Resistance to the antibiotic bacitracin in Enterococcus faecalis strain AR01/DGVS is conferred by the genes bcrABD that are under the control of the regulatory protein BcrR. The N-terminal domain of BcrR has similarity to the helix-turn-helix motif of DNA-binding proteins and topological modelling predicts that the C-terminal domain contains four transmembrane α-helices. These data have led to the hypothesis that BcrR is a novel transmembrane transcriptional regulator which acts to both sense bacitracin and initiate transcription of bcrABD. The transcription of bcrABD in the presence of bacitracin results in the expression of a putative ABC transporter, BcrAB, that may function by the efflux of bacitracin from the cell membrane. The aim of this study was to further characterise the mechanism of bacitracin resistance in E. faecalis and to conduct structural and functional studies with BcrR. A series of bcrA-lacZ transcriptional fusions were created to investigate the regulation of bcrABD transcription by BcrR and map the bcrABD promoter. We determined that BcrR activates bcrA-lacZ expression in response to bacitracin directly and not indirectly via the build-up of cell wall stress or cell wall precursors. A 69-bp region of the bcrABD promoter was required for activation of bcrA-lacZ expression. The introduction of mutations into this sequence demonstrated that two inverted repeat regions (viz. 5�-CTGACA(N)₆GTGTC-3�) were required for bcrA-lacZ expression. Furthermore, the creation of a bcrR::kan insertion mutant and a bcrR-lacZ transcriptional fusion revealed that bcrR is required for high-level bacitracin resistance in AR01/DGVS and that BcrR does not act to auto-regulate bcrR-lacZ expression. To study BcrR function, we overproduced BcrR with a C-terminal hexa-histidine tag in Escherichia coli membranes, extracted the protein with n-dodecyl-β-D-maltoside, and subsequently purified it via Ni�⁺-NTA affinity and gel filtration chromatography to apparent homogeneity. Purified BcrR was reconstituted into liposomes and BcrR binding to bcrABD promoter DNA was analysed using gel-shift assays. We demonstrated that BcrR binds the bcrABD promoter in both the absence and presence of Zn�⁺-bacitracin and that the presence of the inverted repeat regions is necessary for binding. Purification of BcrR has also enabled us to commence structural studies toward obtaining the three dimensional structure of BcrR. We obtained crystals of BcrR that diffracted poorly to a resolution of 19 Å. To characterise the function of the putative ABC type transporter (exporter) of bacitracin, BcrAB, we conducted transport assays with purified bacitracin A, fluorescently labelled FITC-bacitracin A, and radioactive ⁶�Ni�⁺-bacitracin. Transport assays conducted with radioactive ⁶�Ni�⁺-bacitracin and inverted membrane vesicles of E. coli, in which BcrABD had been recombinantly overproduced, displayed uptake of ⁶�Ni�⁺-bacitracin, suggesting that BcrAB functions as a transporter of bacitracin. We conclude that BcrR is a transmembrane DNA-binding protein that functions as both a bacitracin sensor and regulator of bcrABD expression. We propose that BcrR binds to inverted repeat regions in bcrABD promoter to regulate bcrABD expression. Expression of bcrABD results in the production of BcrAB, which appears to be capable of bacitracin efflux (i.e. uptake in inverted membrane vesicles), conferring high-level bacitracin resistance to E. faecalis.

Elicitation, a successful strategy for overproduction of secondary metabolites has been reported in plant, fungal and filamentous bacteria. Based on this evidence, elicitation was assessed for its potential to enhance antibiotic production in Bacillus cultures. This work reports, for the first time, the effect of oligosaccharide elicitors, concentration and addition time through optimisation studies for the enhancement of bacitracin A production by Bacillus licheniformis cultures. The optimal elicitor type, addition time and concentration was 100 mg L-1 of oligoguluronate (OG) at 24 hours. Different carbohydrate- based elicitors were used to investigate their effect on reactive oxygen species (ROS) and catalase production in B. licheniformis. Changes in ROS levels were observed when cells were challenged with OG and MO (mannan oligosaccharides) at 24 h and 72 h. Catalase activities were 50% and 43% higher in OG and MO supplemented cultures respectively compared to the control cultures. The effect of optimal single (OG: 100 mg L-1 , 24 h) and multiple (OG: 100 mg L-1 , 0 h; MO: 200 mg L-1 , 24 h) elicitor addition to enhance bacitracin A production in B. licheniformis cultures was studied. HPLC results demonstrated an increase of 37% and 23% in bacitracin A production in multiple and single elicitor addition respectively compared to control cultures. The effect of elicitors was also investigated at the transcriptional level for bacitracin biosynthetic bacABC and ABC transporter bcrABC genes. Absolute real-time PCR results revealed higher transcript levels of bacABC and bcrABC in elicitor-added cultures compared to control cultures. A relationship between the enhanced bacitracin A production and the increased bacABC and bcrABC transcript copy numbers was found. Stirred tank reactor fermentation with controlled pH (7.0), increased the production of bacitracin A by 30% compared to fermentations without pH regulation. The addition of the oligosaccharides to the cultures caused increases in carbon dioxide evolution rate, oxygen uptake rate, ATP levels, L-glutamic acid consumption rate and bacitracin A production compared to the control cultures. Intracellular calcium levels in bacterial cultures were measured by the use of aequorin technology. Addition of OG and MO caused 11 and 7 fold increases in cytosolic calcium levels in Escherichia coli. Fold increases of 10 and 3 were also observed with OG and MO supplementation to B. subtilis cultures, respectively. Addition of different elicitors also resulted in different calcium signatures which could be used to transmit specific signals inside the cell. Measurement of intracellular calcium levels in B. licheniformis cultures was unsuccessful and awaits further studies. Events involved in the elicitation of B. licheniformis cultures were presented and put together to bring forward the elucidation of the mechanism of elicitation in bacterial cultures. Understanding of the mechanism of elicitation would help in its application in other microbial systems, potentially providing economical benefits to biotechnological industries.

Metal ions are ubiquitously found in all living systems and play vital roles in supporting life forms by performing an array of biological activities. Such biological activities include binding and transforming organic molecules, and also acting as active centers and cofactors for catalysis of various acid-base and redox reactions in biological system. The main focus in bioinorganic chemistry is to elucidate the structural and functional roles of metals in biological systems. Among all transition metal ions, Cu2+ and Fe3+ are especially versatile and important due to their abilities to go through redox efficiently. This dissertation can be divided into four main chapters. The bioinorganic chemistry of Cu- and Fe-containing proteins were briefly discussed in Chapter one. The next chapter focuses on bacitracin, a cyclic peptide-based antibiotic produced by soil bacteria Bacillus subtilis. Bacitracin is a metalloantibiotics that can coordinate with many transition metal ions and exhibit different biological activities. In the first part of Chapter two, the aim is to explore the chemicals interactions in soil micro-ecology by investigating the interactions of different flavonoids and Cu(II)-bacitracin complex. The second part of chapter two demonstrated the binding and oxidation activity of iron(III)-bacitracin. Metal-mediated oxidative stress plays a crucial role in the development of different neurodegenerative diseases. In chapter 3, various synthetic and natural compounds were used to inhibit the oxidation chemistry mediated by Cu(II)-beta-amyloid complex associated with Alzheimer’s disease. Many proteins incorporate copper ions at their active sites for different functions, and among all of the chemistry copper-containing-proteins can perform, one of the most interesting aspect is the ability to bind and activate O2. Therefore, the biomimetic of two different Cu(II) complexes were investigated. In all studies, a combination of kinetic and different spectroscopic methods (UV-vis, NMR and resonance Raman spectroscopy) were used to study their metal binding and activity.

Several types of antibiotics (roxarsone, virginiamycin, and bacitracin) are widely included in poultry feed to improve animal growth yields. Most of the antibiotics are excreted in manure which is subsequently applied to soils. One concern with this practice is that antibiotics may affect several microbially-mediated nutrient cycling reactions in soils that influence crop productivity and water quality. The main objectives of this study were to determine the effects of livestock antibiotics on nitrification, denitrification, and microbial community composition in soils along a topographic gradient. These objectives were addressed in a series of lab experiments by monitoring changes in inorganic N species and ester-linked fatty acid methyl ester profiles after exposing soil microorganisms collected from different topographic positions to increasing levels of antibiotics. It was discovered that roxarsone and virginiamycin inhibited nitrification and soil microbial growth and also influenced microbial community composition, but only at levels that were much higher than expected in poultry litter-applied soils. Bacitracin did not affect nitrification, microbial growth, or microbial community composition at any concentration tested. None of the antibiotics had a strong affect on denitrification. Thus, it is unlikely that soil, water, or air quality would be significantly impacted by the antibiotics contained in poultry litter.

Os ensaios microbiológicos são utilizados para avaliar a atividade antimicrobiana desde a descoberta do uso dos antibióticos. Apesar dos ensaios microbiológicos serem amplamente empregados para determinação da potência de antibióticos em formas farmacêuticas, uma vez que fornecem a medida da atividade biológica, apresentam limitações quanto a baixa reprodutibilidade e tempo de análise. O objetivo deste trabalho foi desenvolver, otimizar e validar ensaio colorimétrico rápido em microplaca para determinar a potência da neomicina e bacitracina em produtos farmacêuticos. Metodologias de análise fatorial e análise de superfície de resposta foram utilizadas no desenvolvimento e otimização da escolha do microrganismo, da composição do meio de cultura, da proporção de inóculo, e das concentrações de cloreto de trifeniltetrazólio e dos antibióticos. Os métodos otimizados foram validados pela avaliação da linearidade, precisão, exatidão e robustez. Análise estatística mostrou equivalência entre o método de difusão em ágar e o método colorimétrico rápido em microplaca para ambos antibióticos. Além disso, o ensaio em microplaca apresentou vantagens em relação à reprodutibilidade, sensibilidade, tempo de incubação e quantidades necessárias de meio de cultura e soluções para ambos os antibióticos.<br>Microbiological assays have been used to evaluate antimicrobial activity since the discovery of the first antibiotics. Despite of microbiological assays have been widely employed to determine antibiotic potency of pharmaceutical dosage forms, once they provide a measure of biological activity, they have limitations regarding the low reproducibility and increased time of analysis. The aim of this work is to develop, optimize and validate a rapid colorimetric microplate bioassay for the potency of neomycin and bacitracin in pharmaceutical drug products. Factorial and response surface methodologies were used in the development and optimization of the choice of microorganism, culture medium composition, amount of inoculum, triphenyltetrazolium chloride (TTC) concentration and antibiotic concentration. The optimized bioassays methods were validated by the assessment of linearity, precision, accuracy, and robustness. Statistical analysis showed equivalency between agar diffusion microbiological assays and rapid colorimetric microplate bioassays. In addition, microplate bioassay had advantages concerning the reproducibility, sensitivity of response, time of incubation, and amount of culture medium and solutions required.

A presença de antibióticos no ecossistema representa um sério risco à saúde humana e animal em virtude do desenvolvimento crescente de resistência bacteriana. Uma vez que a maioria dos antibióticos é persistente à degradação biológica, os processos oxidativos avançados são apontados como uma das tecnologias mais efetivas para decompor esses compostos em águas residuárias. A bacitracina zíncica (Bc-Zn) é um potente antibiótico constituído por uma mistura complexa de peptídeos não-biodegradáveis, conjugados ao zinco. Apesar de ser um antibiótico amplamente consumido na medicina humana e animal, é preocupante a escassez de estudos que investigam sua degradação e destino ambiental. O presente trabalho analisou a degradação da Bc-Zn através dos processos de fotólise direta e UV/H2O2 em diferentes condições de radiação UVC e concentração inicial de H2O2. Os parâmetros cinéticos rendimento quântico da fotólise, constantes cinéticas de pseudo-primeira ordem e constante cinéticas de segunda ordem foram satisfatoriamente estimados pela modelagem do sistema fotoquímico experimental. Os resultados revelaram que a fotólise direta permitiu degradar todos os congêneres da mistura de Bc-Zn nas maiores doses de radiação UVC empregadas. No entanto, não houve remoção de TOC após 120 minutos de irradiação. A adição de H2O2 acelerou substancialmente a fotodegradação do antibiótico, apresentando constantes cinéticas de pseudo-primeira ordem uma ordem de grandeza superiores às obtidas por fotólise direta. Além disso, remoção considerável de até 71% do TOC foi alcançada. A análise estatística demonstrou que a radiação UV foi um fator bem mais significativo para a fotodegradação da Bc-Zn em relação à concentração inicial de H2O2, sendo as melhores condições do processo alcançadas para a maior taxa específica de emissão de fótons (1,11×10-5 Einstein L-1 s-1). Ensaios biológicos com soluções tratadas por fotólise direta e UV/H2O2 indicaram remoção completa da atividade antimicrobiana residual, ainda que os produtos da fotodegradação tenham se mostrado não-biodegradáveis. Análises de toxicidade indicaram que o metal zinco presente no antibiótico é responsável pela a toxicidade no micro-organismo-teste Vibrio fischeri. Estudos adicionais devem ser realizados para identificar os sub-produtos formados, bem como para investigar a degradação da Bc-Zn em efluentes industriais reais.<br>The presence of antibiotics in ecosystems represents a serious risk to human and animal health, caused by the increase in bacterial resistance. Since most antibiotics resist to biological degradation, advanced oxidation processes are pointed out as the most effective technologies for degrading these compounds in wastewater. Zinc bacitracin (Bc-Zn) is a potent antibiotic with a complex mixture of non-biodegradable peptides conjugated to zinc. Despite being a widely used antibiotic in human and animal medicine, the scarcity of studies dealing with its degradation and environmental fate is a matter of concern. In this work, Bc-Zn degradation by direct photolysis and the UV/H2O2 process was investigated for different UVC radiation conditions and initial H2O2 concentrations. Kinetic parameters, namely the photolysis quantum yield, pseudo-first order kinetic constants and second-order kinetic constants, were satisfactorily estimated from experimental data by modeling the photochemical system. The results showed that all the congeners of the Bc-Zn mixture were photolyzed at the highest UVC doses applied, while no TOC removal was observed after 120 minutes of irradiation. The addition of H2O2 substantially accelerated Bc-Zn photodegradation, with pseudo-first order kinetic constants of one order of magnitude higher than those observed under direct photolysis. In addition, a remarkable removal of up to 71% of TOC was achieved. Statistical analyses showed that UV radiation had a much more important effect on Bc-Zn photodegradation in comparison with initial H2O2 concentration, with the best process conditions achieved for the highest specific photon emission rate (1.11×10-5 Einstein L-1 s-1). Biological assays carried out with the solutions treated by direct photolysis and UV/H2O2 revealed no residual antimicrobial activity, though photodegradation products remained non-biodegradable. In addition, toxicity analyses indicated that the zinc metal present in the antibiotic is responsible for the toxic effect on the test microorganism Vibrio fischeri. Finally, further studies should be performed to identify the by-products formed and to investigate Bc-Zn degradation in real industrial wastewater.

L'enveloppe bactérienne est une cible majeure d'un grand nombre d'antibiotiques naturels. Certains provoquent d'importantes perturbations de la membrane cytoplasmique, d'autres ciblent spécifiquement les différentes étapes enzymatiques de la voie de biosynthèse du peptidoglycane, constituant majeur de la paroi. Pour contrer l'action de ces antibiotiques, les bactéries ont développé divers systèmes de résistance leur conférant un avantage sélectif dans leur niche écologique. Le rejet de l'antibiotique est un des principaux mécanismes de résistance rencontré chez les bactéries. Il implique parfois des transporteurs membranaires de type ABC (pour ATP Binding Cassette) pouvant hydrolyser l'ATP pour exporter ou importer un allocrite. Les bactéries possèdent également divers systèmes leur permettant, d'une part, de détecter un signal environnemental (antibiotique ou stress de la paroi qu'il engendre), et, d'autre part, d'assurer la transduction du signal qui aboutit à une réponse adaptée. Deux types de systèmes sont impliqués dans les réponses aux stress de la paroi : les phosphorelais et les facteurs sigma à fonction extracytoplasmique.<br /><br />Le groupe des Firmicutes, dont la bactérie modèle est Bacillus subtilis, est un groupe ubiquitaire producteur d'antibiotiques et contenant de nombreux organismes pathogènes. Les analyses effectuées au laboratoire ont permis d'identifier chez les Firmicutes des systèmes associant un phosphorelais et un transporteur ABC. Dans chacun des cas, les gènes codant les différents partenaires du système sont à proximité sur le chromosome et le phosphorelais régule l'expression des gènes codant le transporteur ABC. On trouve trois de ces systèmes chez B. subtilis nommés BceRSAB (anciennement YtsABCD), YvcPQRS et YxdJKLM. L'objectif de notre étude était de tester l'hypothèse selon laquelle ces systèmes pouvaient être impliqués dans la résistance aux antibiotiques ciblant l'enveloppe bactérienne.<br /><br />La bacitracine est un antibiotique qui se complexe à l'undécaprényl pyrophosphate (UPP) et inhibe la dernière étape de la biosynthèse du peptidoglycane : la régénération de l'undécaprényl phosphate (UP). Nos résultats indiquent que le système BceRSAB est le composant majeur de la résistance à la bacitracine chez B. subtilis. L'expression de l'opéron bceAB est activée, en présence de bacitracine, par le phosphorelais BceRS. Nous avons également identifié une protéine, nommée BcrC, qui participe à la résistance à la bacitracine chez B. subtilis. Nous avons démontré que cette dernière est une UPP phosphatase impliquée dans la régénération de l'UP et s'oppose ainsi à l'action de la bacitracine. L'expression du gène bcrC ne dépend pas du phosphorelais BceRS mais de trois facteurs sigma à fonction extracytoplasmique. En conclusion, B. subtilis possède deux types de systèmes de résistance à la bacitracine indépendants et complémentaires.<br />Nous avons par la suite analysé le mécanisme de régulation de l'induction du système BceRSAB par la bacitracine. Nos résultats sont surprenants et montrent clairement que le transporteur ABC BceAB participe à l'activation de l'expression de ses propres gènes de structure avec le phosphorelais BceRS. De plus, lorsque le pool cellulaire d'UPP diminue (lorsque la phosphatase BcrC est surproduite), et en présence de bacitracine, l'expression du gène bceA diminue également. Ceci montre que l'UPP participe, avec la bacitracine, au stimulus du système BceRSAB. Notre hypothèse de travail est que le transporteur ABC, prédit comme étant un exporteur, prend en charge le complexe UPP/bacitracine et agit comme une flippase pour créer une dissymétrie membranaire ressentie par le senseur BceS. Il n'est pas exclu, qu'en présence de bacitracine, le transporteur BceAB puisse interagir avec le senseur BceS pour permettre l'activation du système.<br /><br />La majeure partie des bactéries du groupe des Firmicutes possède, d'une part, des protéines similaires à BcrC, et, d'autre part, des systèmes similaires au système BceRSAB. Toutes les protéines « BcrC-like » ont un motif caractéristique permettant de les classer dans la famille des phosphatases de type PAP2. Il est tentant de penser qu'elles sont toutes des UPP phosphatases assurant une des étapes clés de la synthèse du peptidoglycane. <br />Par ailleurs, les deux autres systèmes « Bce-like » de B. subtilis, YvcPQRS et YxdJKLM, sont également activés en présence d'antibiotiques ciblant l'enveloppe bactérienne et nous savons que le transporteur ABC YvcRS est aussi impliqué dans le mécanisme de régulation. Nous proposons donc que les systèmes « Bce-like » des Firmicutes sont tous des systèmes de détoxification dirigés contre des antibiotiques ciblant l'enveloppe bactérienne.

L’enveloppe bactérienne est une cible majeure d’un grand nombre d’antibiotiques naturels. Certains provoquent d’importantes perturbations de la membrane cytoplasmique, d’autres ciblent spécifiquement les différentes étapes enzymatiques de la voie de biosynthèse du peptidoglycane, constituant majeur de la paroi. Pour contrer l’action de ces antibiotiques, les bactéries ont développé divers systèmes de résistance leur conférant un avantage sélectif dans leur niche écologique. Le rejet de l’antibiotique est un des principaux mécanismes de résistance rencontré chez les bactéries. Il implique parfois des transporteurs membranaires de type ABC (pour ATP Binding Cassette) pouvant hydrolyser l’ATP pour exporter ou importer un allocrite. Les bactéries possèdent également divers systèmes leur permettant, d’une part, de détecter un signal environnemental (antibiotique ou stress de la paroi qu’il engendre), et, d’autre part, d’assurer la transduction du signal qui aboutit à une réponse adaptée. Deux types de systèmes sont impliqués dans les réponses aux stress de la paroi : les phosphorelais et les facteurs sigma à fonction extracytoplasmique. Le groupe des Firmicutes, dont la bactérie modèle est Bacillus subtilis, est un groupe ubiquitaire producteur d’antibiotiques et contenant de nombreux organismes pathogènes. Les analyses effectuées au laboratoire ont permis d’identifier chez les Firmicutes des systèmes associant un phosphorelais et un transporteur ABC. Dans chacun des cas, les gènes codant les différents partenaires du système sont à proximité sur le chromosome et le phosphorelais régule l’expression des gènes codant le transporteur ABC. On trouve trois de ces systèmes chez B. Subtilis nommés BceRSAB (anciennement YtsABCD), YvcPQRS et YxdJKLM. L’objectif de notre étude était de tester l’hypothèse selon laquelle ces systèmes pouvaient être impliqués dans la résistance aux antibiotiques ciblant l’enveloppe bactérienne. La bacitracine est un antibiotique qui se complexe à l’undécaprényl pyrophosphate (UPP) et inhibe la dernière étape de la biosynthèse du peptidoglycane : la régénération de l’undécaprényl phosphate (UP). Nos résultats indiquent que le système BceRSAB est le composant majeur de la résistance à la bacitracine chez B. Subtilis. L’expression de l’opéron bceAB est activée, en présence de bacitracine, par le phosphorelais BceRS. Nous avons également identifié une protéine, nommée BcrC, qui participe à la résistance à la bacitracine chez B. Subtilis. Nous avons démontré que cette dernière est une UPP phosphatase impliquée dans la régénération de l’UP et s’oppose ainsi à l’action de la bacitracine. L’expression du gène bcrC ne dépend pas du phosphorelais BceRS mais de trois facteurs sigma à fonction extracytoplasmique. En conclusion, B. Subtilis possède deux types de systèmes de résistance à la bacitracine indépendants et complémentaires. Nous avons par la suite analysé le mécanisme de régulation de l’induction du système BceRSAB par la bacitracine. Nos résultats sont surprenants et montrent clairement que le transporteur ABC BceAB participe à l’activation de l’expression de ses propres gènes de structure avec le phosphorelais BceRS. De plus, lorsque le pool cellulaire d’UPP diminue (lorsque la phosphatase BcrC est surproduite), et en présence de bacitracine, l’expression du gène bceA diminue également. Ceci montre que l’UPP participe, avec la bacitracine, au stimulus du système BceRSAB. Notre hypothèse de travail est que le transporteur ABC, prédit comme étant un exporteur, prend en charge le complexe UPP/bacitracine et agit comme une flippase pour créer une dissymétrie membranaire ressentie par le senseur BceS. Il n’est pas exclu, qu’en présence de bacitracine, le transporteur BceAB puisse interagir avec le senseur BceS pour permettre l’activation du système. La majeure partie des bactéries du groupe des Firmicutes possède, d’une part, des protéines similaires à BcrC, et, d’autre part, des systèmes similaires au système BceRSAB. Toutes les protéines « BcrClike » ont un motif caractéristique permettant de les classer dans la famille des phosphatases de type PAP2. Il est tentant de penser qu’elles sont toutes des UPP phosphatases assurant une des étapes clés de la synthèse du peptidoglycane. Par ailleurs, les deux autres systèmes « Bce-like » de B. Subtilis, YvcPQRS et YxdJKLM, sont également activés en présence d’antibiotiques ciblant l’enveloppe bactérienne et nous savons que le transporteur ABC YvcRS est aussi impliqué dans le mécanisme de régulation. Nous proposons donc que les systèmes « Bce-like » des Firmicutes sont tous des systèmes de détoxification dirigés contre des antibiotiques ciblant l’enveloppe bactérienne.

La valoración microbiológica de los antibióticos es un parámetro fundamental para asegurar un alto nivel de efectividad y eficiencia en los productos farmacéuticos. En el presente trabajo se desarrolla y valida un método analítico microbiológico para la valoración del antibiótico bacitracina 50 000 UI/100g en productos farmacéuticos de uso tópico. El procedimiento incluye el uso del medio N°11 (pH 6,5) como agar base, a Micrococcus luteus ATCC 10240 como microorganismo testigo y al método de difusión en agar como el diseño de valoración elegido. Se describe el proceso de validación del método analítico microbiológico para la valoración del antibiótico bacitracina 50 000 UI/100g en productos terminados, incluyendo los requisitos exigidos en la determinación de los parámetros analíticos de linealidad, exactitud y precisión expresadas en sus dos formas: repetibilidad y precisión intermedia, así como, especificidad e intervalo. Los resultados y análisis estadísticos permitieron demostrar que el método analítico propuesto para la valoración del antibiótico bacitracina es lineal (r2 = 0,968 linealidad del estándar y r2 = 0,962 linealidad de la muestra), exacto (sesgo < 3% y texp < ttab), preciso (CV < 5%, tolerancia < 30%) y específico (placebo y blanco sin formación de halos) para el respectivo intervalo especificado. Se establece que las características de desempeño analítico cumplen con los requisitos para la aplicación analítica propuesta siendo un método efectivo, reproducible y confiable para ser utilizado en la comprobación de las especificaciones de calidad.<br>Tesis

Chez les bactéries l’undécaprényl-phosphate (C55-P) est un transporteur lipidique essentiel impliqué dans la translocation des motifs monomériques disaccharides-pentapeptide du peptidoglycane au travers de la membrane cytoplasmique. Pourtant le métabolisme de C55-P restait une « boîte noire » non encore élucidée. Un gène, nommé bacA, a été identifié par criblage d’une banque d’ADN de E. Coli sur la base de résistance à la bacitracine. Nous avons démontré que bacA code pour une C55-PP phosphatase. Le caractère non essentiel du gène bacA a cependant été démontré. Ce résultat surprenant nous a conduit à la découverte de plusieurs autres gènes codant pour des protéines ayant la capacité de déphosphoryler le C55-PP. Chez E. Coli, ces gènes sont pgpB, yeiU et ybjG. La surproduction de ces protéines est corrélée à une augmentation de l’activité C55-PP phosphatase. L’inactivation concomitante des gènes bacA, ybjG et pgpB est létale<br>In bacterium, undecaprenyl-phosphate (C55-P) is an essential carrier lipid involved in the translocation of peptidoglycan hydrophylic precursors through the hydrophobic environment of the cytoplasmic membrane. A gene, named bacA, was previously shown to confer resistance towards bacitracin when overexpressed. We demonstrated that bacA gene encodes an integral membrane protein with C55-PP phosphatase activity. We showed that the inactivation of the chromosomal bacA gene was not lethal even though it led to significant depletion of undecaprenyl pyrophosphate phosphatase activity suggesting that others proteins exist to account for the residual activity and viability of the mutant strain. We found three genes encoding membranes proteins with C55-PP phosphatase activity, namely PgpB, YeiU and YbjG. The overproduction of each of these proteins was correlated with a significant increase of C55-PP phosphatase activity and conferred resistance towards bacitracin

Es accidents vasculaires cérébraux (AVC) représentent, dans nos contrées, une cause importante de handicap et de mortalité. Les approches thérapeutiques restent toutefois relativement impuissantes face à ce problème de santé publique. Elles reposent essentiellement sur la prévention ou la suppression de facteurs de risques tels que le tabagisme, l'hypertension ou encore l'hypercholestérolémie. L'AVC peut être hémorragique, mais dans 80% des cas son origine vasculaire est obstructive. Son traitement aigu peut dans ce cas bénéficier d'agents thrombolytiques dont l'administration est cependant soumise à une fenêtre d'intervention immédiate relativement étroite. L'efficacité d'agents neuroprotecteurs, dont la finalité est de protéger le cerveau des conséquences délétères de l'ischémie/reperfusion cérébrale inhérente à l'AVC (lésions irréversibles et handicap), reste aujourd'hui assez décevante. La recherche de nouvelles cibles thérapeutiques s'impose dès lors plus que jamais dans ce domaine. S'intéressant aux protéines dont la concentration peut varier au cours du temps, une étude protéomique préliminaire a mis en évidence l'augmentation de la protéine disulfure isomérase (PDI) au cours de l'ischémie reperfusion cérébrale (IRC), un résultat en accord avec les données de la littérature (Tanaka, S. , Uehara, T. , Nomura, Y. , 2000, J. Biol. Chem. 275, 10388-10393). La PDI est une protéine chaperonne dotée d'une activité oxydoréductase/isomérase et est principalement localisée dans le réticulum endoplasmique. Elle assiste le repliement des protéines par la formation ou le déplacement de ponts disulfures. Les agents modulateurs de la PDI incluent l'alcool 4-hydroxybenzylique (4-HBA) et la bacitracine, respectivement inducteur et inhibiteur de cette protéine. Pour déterminer le rôle potentiellement bénéfique ou délétère de la PDI dans l'IRC, l'impact cérébral des modulateurs précités a été étudié dans un modèle murin d'IRC basé sur l'occlusion unilatérale et transitoire de l'artère cérébrale moyenne chez la souris. Dans ce modèle expérimental, le 4-HBA réduit significativement (respectivement de 22 et 55%). La taille de l'infarctus cérébral touchant le cortex et le striatum. L'implication de la PDI dans cette protection cérébrale est confirmée par la suppression de l'effet protecteur du 4-HBA par la bacitracine, le 4-HBA ne manifestant par ailleurs aucune propriété anti-oedémateuse dans le modèle expérimental d'IRC. L'induction de la PDI par le 4-HBA a elle été démontrée sur le cerveau sain de souris, la protéine étant quantifiée par immuno-chemiluminescence après migration électrophorétique (Western blots). Différents isomères de position (alcool 2-hydroxybenzylique et alcool 3-hydroxybenzylique) ainsi que des analogues aliphatiques (1,4-butanediol et 1,5-pentanediol) du 4-HBA se sont avérés, à l'inverse du dernier, incapables de réduire la taille des lésions cérébrales dans le modèle expérimental d'IRC et d'induire la PDI cérébrale. Le potentiel neuroprotecteur du 4-HBA a été étudié dans un autre modèle d'évaluation, à savoir celui des crises audiogènes chez la souris déficiente en magnésium, connu pour sa réponse aux agents anticonvulsivants mais aussi aux composés antioxydants (Vamecq, J. , Maurois, P. , Bac, P. , Bailly, F. , Bernier, J. L. , Stables, J. P. , Husson, I. ,Gressens, P. , 2003, Eur. J. Neurosci. 18, 1110-1120). La dose de 4-HBA protégeant 50% des animaux vis-à-vis de la crise audiogène était de 25 mg/kg contre 35mg/kg pour la 6-hydroxyflavanone (6-HFN), une flavone de référence active dans ce test. Ces résultats suggérant un potentiel antioxydant similaire des deux composés ont conduit à une étude comparative de leurs effets protecteurs dans le modèle murin d'IRC. Cette étude tout en confirmant la protection offerte par le 4-HBA dans l'IRC expérimentale a révélé l'incapacité du 6-HFN d'induire une protection significative dans ce modèle. A l'inverse du 4-HBA, le 6-HFN n'induisait pas la PDI cérébrale murine, confortant ici l'hypothèse que la protection du 4-HBA vis-à-vis de l'IRC résulte plus de sa capacité à induire la PDI que d'autres de ses propriétés parmi lesquelles son potentiel antioxydant. Finalement, le 4-HBA, à des doses atteignant 200 mg/kg, s'est avéré dénué de toxicité dans le test de la barre tournante. En conclusion, le 4-HBA représente un agent neuroprotecteur actif dans plusieurs modèles d'évaluation. Son efficacité vis-à-vis des lésions induites par l'IRC semble étroitement liée à sa capacité à induire la PDI cérébrale, faisant dès lors de cette protéine une cible pharmacologique prometteuse pour le développement pharmacologique de composés actifs dans l'AVC

Publicación a texto completo no autorizada por el autor<br>Evalúa el efecto del rendimiento productivo de pollos de engorde suplementados con un fitogénico (aceites esenciales) más un probiótico (Enterococcus faecium, Pediococcus acidilactici, Bifidiobacterium animalis, Lactobacillus salivarius y Lactobacillus reuteri) versus un antibiótico (Zinc bacitracina). Se usaron 333 aves divididas en tres tratamientos de 111 animales con 3 repeticiones por tratamiento: 1, control; 2, antibiótico; y 3, fitogénico más probiótico. El diseño experimental es el irrestricto al azar. El trabajo tevo un tiempo de duración de 42 días y los parámetros ha evaluar serán: peso corporal, consumo de alimento, conversión alimenticia (ICA), porcentaje de mortalidad y el índice de eficiencia productiva (IEP).<br>Tesis

Orientador: Angela Maria Moraes<br>Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica<br>Made available in DSpace on 2018-08-11T09:35:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rodrigues_AnaPaula_D.pdf: 12266653 bytes, checksum: 0091b801b742b9245223c7939d5484c2 (MD5) Previous issue date: 2008<br>Resumo: As membranas poliméricas destinadas ao tratamento de lesões cutâneas ou internas podem ser constituídas por vários tipos de polímeros, sendo a quitosana e o alginato compostos freqüentemente empregados para tal finalidade. Enquanto a quitosana é um aminopolissacarídeo derivado da quitina, o alginato é um polissacarídeo extraído de algas. Ambos são atóxicos, biocompatíveis e facilitam a cicatrização de feridas. Frente a isto, a obtenção de membranas de quitosana-alginato para serem utilizadas na terapia de lesões, como curativos, mostra-se de grande relevância. Neste contexto, este trabalho visou o desenvolvimento de metodologia escalonável de preparação e a caracterização de membranas de quitosana e alginato (contendo ou não bacitracina), empregando distintas condições controladas de vazão e agitação durante a mistura dos polissacarídeos. Em adição, o efeito da utilização do plastificante glicerol na preparação das membranas de quitosana-alginato, bem como a comparação das propriedades das mesmas às daquelas constituídas somente por quitosana, foi realizado. As membranas foram caracterizadas quanto à espessura, à capacidade máxima de absorção de diferentes soluções aquosas, à capacidade de drenagem de água, à perda de massa quando estocadas em água e em outros solventes, à resistência mecânica, à permeabilidade ao oxigênio e ao vapor d¿água, à eficácia na proteção contra permeação de bactérias, à eficiência de incorporação de bacitracina, à morfologia de superfície antes e após a exposição à bacitracina, ao desempenho quanto à formação de halo de inibição antes e após a incorporação do fármaco e quanto ao desempenho in vivo. Os resultados mostraram que membranas de quitosanaalginato isentas de glicerol, capazes de absorver em torno de 19,2 g H2O/g membrana seca, com capacidade de drenagem de água de até 14.343 g/m2-dia, resistência à tração em torno de 30 MPa, eficazes contra a permeação de bactérias, com permeabilidade ao vapor d_ água de 2.678 g/m2-dia, eficiência de incorporação de bacitracina de até 25% e desempenho adequado in vivo foram obtidas pelo procedimento proposto, sugerindo assim, que as membranas de quitosana-alginato obtidas neste trabalho apresentam bom potencial para serem utilizadas como curativos temporários na terapia de lesões<br>Abstract: Polymeric membranes developed to treat cutaneous or internal lesions can be constituted by several types of polymers, being chitosan and alginate frequently employed for this purpose. While chitosan is a deacetylated derivative of chitin, alginate is a natural linear polysaccharide obtained from seaweed. Both polysaccharides are nontoxic, biodegradable and biocompatible, and in addition, show healing properties. In this way, the production of chitosan-alginate membranes designed to be used on lesion terapy, as wound dressings, is particularly relevant. In this context, this work focused the development of a reproducible and easy to scale up methodology to prepare and characterize chitosan-alginate membranes (containing or not bacitracin). Different controlled conditions of flow rate and stirring rate were employed during the mixture of both polysaccharides. In addition, the effects of glycerol utilization on chitosan-alginate membrane characteristics, as well as the comparison of the properties of the obtained membranes to those of membranes containing only of chitosan, was performed. The membranes were characterized regarding thickness, maximum uptake capacity of different aqueous solutions, water drainage ability, percentage of mass loss when stored in water and in other solvents, tensile strength and strain at break, permeability to water vapor and oxygen, effectiveness of protection against bacterial permeation, bacitracin incorporation efficiency, morphology before and after exposure to bacitracin, formation of inhibition zone before and after bacitracin incorporation and in vivo performance. The results obtained showed that glycerol-free chitosan-alginate membranes, able to absorb around 19.2 g H2O/g membrane, with water drainage ability up to 14,343 g/m2-day, tensile strength around 30 MPa, effective against bacterial penetration, with water vapor permeability around 2,678 g/m2-day, bacitracin incorporation up to 25% and adequate performance in vivo can be obtained by the proposed procedure, suggesting that the chitosan-alginate membranes obtained in this work have good potential to be used as temporary dressings on lesions terapy<br>Doutorado<br>Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos<br>Doutor em Engenharia Química

Dissertação de mestrado em Tecnologias do Medicamento, apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra<br>Gels have consistently been studied for their role in topical and transdermal drug delivery systems as a non-invasive technique, for pharmaceutical and cosmetics application. These formulations are semi-solid three-dimensional structures, porous, with unique characteristics, such as rigidity and elasticity at the same time. Because of their high aqueous phase content, gels permit a greater dissolution of drugs through the skin and enhance skin hydration by retaining a significant amount of transepidermal water, in contrast to creams and ointments. Conventionally, gels are differentiated into two different types according to the nature of their liquid phase: hydrogels, which contain a polar solvent (water) and organogels, which contain an organic/non-polar solvent, as external phase. Hydrogels consist of polymeric materials that exhibit the ability to swell and retain a large amount of water or other biofluids in its structures. Despite its great affinity for water, they only possess a swelling behavior without dissolving in water. This proves its high flexibility, similar to natural tissue. Organogels consist of a network of self-assembled molecules which forms a thermally reversible gel upon cooling, immobilizing a non-aqueous liquid. They are mainly composed by lipids (organic phase), so they easily interact with the lipid skin surface and enhance the drug permeation through the skin. The most widely used lipids are based in edible oils due to their high biocompatibility, such as soybean oil, sunflower oil, sesame seed oil or olive oil. Organogels form viscoelastic structures through non-covalent associations with gelling agents in low concentrations. The commonly used organogelators include sorbitan monostearate or sorbitan monopalmitate. These superstructures, often long fibers or needle-shaped structures, which entangle or form pseudocrystalline regions, immobilizing the liquid largely by surface tension and forming a gel of variable consistency. Lecithin organogels are a special type of organogels that do not require addition of any additional surfactant or penetration enhancer, as lecithin serves both the purposes. Recent studies have reported other types of gels for dermal drug application, such as proniosomal gels, emulgels, bigels and aerogels, combining features of conventional hydrogels and organogels. In conclusion, further studies in gel technologies are essentials to overcome the drawbacks of each gel system and for developing cost effective delivery systems for transdermal applications.

Clostridium perfringens est ubiquitaire dans l’environnement. Ce microorganisme peut être retrouvé dans la flore normale du tractus gastro-intestinal des mammifères et peut également causer une variété d’infections intestinales. Le phénotype de résistance à la bacitracine a déjà été rapporté chez C. perfringens mais les gènes associés n’ont pas été caractérisés. Dans cette étude, 24 des 99 isolats de C. perfringens aviaires testés ont démontré une résistance à la bacitracine. Les analyses ont révélé la présence d’un transporteur ABC ainsi que d’une undécaprénol kinase surproduite. Ces deux mécanismes semblent être codés par l’opéron bcrABDR. En amont et en aval des gènes bcr, un élément IS1216-like a été identifié, celui-ci pouvant jouer un rôle dans la dissémination de la résistance à la bacitracine. Des analyses d’hybridation sur ADN ont révélé que les gènes bcrABDR étaient localisés sur le chromosome. De plus, il a été démontré que les gènes bcr étaient exprimés en présence de bacitracine. Plusieurs études ont associé la tolérance aux antibiotiques et aux désinfectants à la formation de biofilm. Dans la littérature, peu d’informations sont disponibles sur le biofilm de C. perfringens. La majorité des isolats testés dans cette étude ont démontré la formation d’un biofilm. L’analyse de la matrice a démontré que celle-ci contenait des protéines, de l’ADN extracellulaire ainsi que des polysaccharides liés en bêta-1,4. Une meilleure survie des cellules en biofilm a été observée suite à une exposition à de fortes concentrations d’antibiotiques. Une exposition à de faibles doses de certains antibiotiques semblait diminuer le biofilm formé alors que pour d’autres, le biofilm semblait augmenter. Dans la présente étude, la susceptibilité des biofilms de C. perfringens à la désinfection a été également analysée. Les résultats ont démontré que la formation de biofilm protégeait les cellules de l’action du monopersulfate de potassium, des ammoniums quaternaires, du peroxyde d’hydrogène et du glutéraldéhyde. Toutefois, l’hypochlorite de sodium a été démontré comme étant efficace contre le biofilm de C. perfringens. Il a été démontré que les biofilms mixtes de C. perfringens cultivés en présence de Staphylococcus aureus ou d’Escherichia coli étaient plus résistants à la désinfection en comparaison aux biofilms simples de S. aureus ou d’E. coli. Toutefois, le biofilm simple de C. perfringens était plus résistant à la désinfection que les biofilms mixtes. Finalement, les profils de transcription entre les populations planctoniques et en biofilm ont été analysés par séquençage d’ARN. L’analyse transcriptomique du biofilm a identifié 238 gènes différentiellement exprimés entre les deux conditions. Les gènes négativement régulés sont impliqués dans la virulence, la production d’énergie, le métabolisme des sucres ainsi que dans la biosynthèse des acides gras et des acides aminés alors que les gènes induits sont impliqués dans la réponse au stress et au stress oxydatif, dans la biosynthèse d’acides gras et de phospholipides ainsi que dans la virulence. Cette étude décrit pour la première fois la découverte des gènes associés à la résistance à la bacitracine chez C. perfringens. Elle rapporte également de nouvelles données sur la matrice du biofilm, la tolérance aux antibiotiques et aux désinfectants ainsi que sur le transcriptome du biofilm de C. perfringens.<br>Clostridium perfringens is ubiquitous in the environment. This microorganism can be found in the intestinal tract of mammals as normal flora and can also cause many gastrointestinal infections. Phenotypic bacitracin resistance has been reported in the literature for C. perfringens but the genes responsible for this resistance have not yet been characterized. In this study, twenty-four of the 99 poultry isolates tested showed bacitracin resistance. Analysis revealed putative genes encoding for both an ABC transporter and an overproduced undecaprenol kinase. These two mechanisms were shown to be both encoded by the putative bcrABDR operon. An IS1216-like element was found upstream and downstream from the bcr cluster, which may play a role in the dissemination of this resistance determinant. DNA hybridization analyses revealed that the bacitracin resistance genes bcrABDR were located on the chromosome. Moreover, this gene cluster has been showed to be expressed under bacitracin stress. Many studies have associated tolerance to antibiotics and disinfectants to biofilm. In the literature, very little is known on the biofilm formation by C. perfringens. Most of the C. perfringens isolates tested in this study were able to form biofilms. Matrix composition analysis revealed the presence of proteins, extracellular DNA and beta-1,4 linked polysaccharides. Biofilm could also protect C. perfringens bacterial cells from an exposition to high concentrations of antibiotics. Exposition to low doses of antibiotics tended to lead to a diminution of the biofilm formed but for few isolates, the biofilm formation was increased. In the present study, susceptibilities of C. perfringens biofilms to disinfectants were also analysed. Results showed that biofilms can protect the bacterial cells from the action of potassium monopersulfate, quaternary ammonium chlorides, hydrogen peroxide and gluteraldehyde solutions. However, sodium hypochlorite solution was shown to be effective on C. perfringens biofilms. Our investigation of dual-species biofilms of C. perfringens with the addition of Staphylococcus aureus or Escherichia coli demonstrated that these dual-species biofilms were more tolerant to disinfection with sodium hypochlorite than the mono-species biofilms of S. aureus or E. coli. However, further disinfection studies using sodium hypochlorite suggest that the mono-species biofilms formed by C. perfringens is more tolerant to this disinfectant than the dual-species biofilms of C. perfringens with S. aureus or E. coli. Finally, the differential gene expression patterns between planktonic populations and biofilms of C. perfringens were investigated by RNA sequencing. The transcriptomic analysis identified 238 genes that were significantly differentially expressed between both conditions. Genes that were down-regulated in biofilm cells, relative to planktonic cells, included those involved in virulence, energy production, carbohydrate metabolism, fatty acids and amino acids biosynthesis. On the other hand, genes up-regulated in biofilm cells were involved in oxidative and stress responses, fatty acids and phospholipids biosynthesis and few genes were involved in virulence. This study reports on the discovery of genes associated to bacitracin resistance of C. perfringens. Our work brings also new data on matrix cohesion of the biofilm, tolerance to antibiotics and disinfectants, and on the transcriptome of the biofilm of C. perfringens.

碩士<br>國立中正大學<br>化學暨生物化學研究所<br>105<br>Biological membranes mostly composed of phospholipid molecules and proteins form a barrier between intra and extra-cellular environments and be able to control the material enters and exit the cell. Both in vivo and in vitro membrane destabilization can usually be induced by external agents such as bio molecules (i.e., proteins and peptides). Fast field cycling nuclear magnetic resonance relaxometry can provide valuable information because of it is sensitivity to dynamic process that occur over a broad time scale. Recorded the data for the large unilamellar liposome which compose of POPG (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol) and POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) with addition of bacitracin and Ca2+. By analysis of the data recorded, the result shown that the influence of the bacitracin depends on its concentration. Bacitracin mainly affected the order fluctuation of the membrane, diffusional motion and rotational correlation time liposome. Moreover, the P/L ratio with higher concentration caused weaker surface charge and less shielding effect of the liposome. Key word : NMRD, bacitracin, phospholipid membrane.

In mehrfaktoriellen 2 x 2 x 4 Untersuchungen im Zeitraum vom 7. - 28. Lebenstag und in Bilanzversuchen vom 15. - 20. Lebenstag mit männlichen Broilerküken (Cobb 500) wurden die Effekte der Versuchsfaktoren Zerkleinerung (Hammermühle vs. Walzenstuhl), thermische Behandlung (Konditionierung bei 70°C vs. Konditionierung/Expandierung 100°C) und Zusätze von Zink-Bacitracin bzw. Roxazym G2 (ohne Zusatz, mit Zink-Bacitracin 50 mg, mit Roxayzm G2 150 ppm und deren Zusatzkombination A+E) sowie die Interaktionen untersucht. Als Kriterien dienten die Parameter Futterverzehr, Lebendmassezunahme, Futteraufwand, Nährstoffansatz und -verwertung, ileale Verdaulichkeit von ausgewählten Aminosäuren, Proteinverwertung/Proteinqualität und Umsetzbarkeit der Energie. Die Versuchstiere erhielten ab dem 7. Lebenstag die entsprechenden Versuchsmischungen. Der Gehalt an XP und MEn aller Versuchsmischungen war einheitlich (XP 21,7% und MEn 12,3 MJ/kg Futter). Die Lysinversorgung wurde auf 90 % unter der optimalen Bedarfsdeckung in allen Futtermischungen limitiert. Die Auswirkungen der Versuchsfaktoren lassen sich wie folgt zusammenfassen: - Zerkleinerung : Die Zerkleinerungstechnologie mit dem Walzenstuhl übte einen signifikanten Einfluss auf den Futterverzehr (-3,5 %) und Futteraufwand (-2,8 %) gegenüber der Zerkleinerung mit der Hammermühle aus. Die Nährstoffverwertung (XP und Energie) zeigten durch Walzenstuhl-Zerkleinerung tendenzielle Verbesserungen. Die ileale Lysinverdaulichkeit blieb unverändert, die ileale Verdaulichkeit von Threonin und Met+Cys wurde signifikant erhöht. Die Walzenstuhl-Zerkleinerung führte zu einer besseren Futterstruktur und zu einer höheren Nährstoffdichte in den Pellets. Das wird deutlich durch die höhere N-Aufnahme bzw. N-Bilanz sowie durch gesteigerte N-Verwertungsparameter und einen erhöhten Gehalt an N-korrigierter umsetzbarer Energie (MEn). - Thermische Behandlung : Durch erhöhte Hitzeapplikation mit dem Expander konnten in der vorliegenden Arbeit hinsichtlich der Leistungsparameter, Nährstoffansatz und -verwertung keine Unterschiede gegenüber der Konditionierung festgestellt werden. Die Expandierung führte zu einer signifikant erhöhten ilealen Lysinverdaulichkeit, die durch die gemessene Lysinwirksamkeit im Bilanzversuch jedoch nicht widergespiegelt wurde. Auch signifikant niedrigere N-Bilanz und physiologische Proteinnutzwerte (PNu) sowie die tendenzielle Verringerung der N-Verdaulichkeit und des Gehaltes an umsetzbarer Energie deuten auf eine negative Wirkung der intensiveren thermischen Behandlung durch Expandieren hin. Hierzu sind weitere klärende Untersuchungen notwendig. - Futterzusätze: Durch die alleinige Supplementierung mit dem Antibiotikum Zink-Bacitracin oder NSP-spaltenden Enzym Roxazym G2 bzw. deren Kombination reagierten Mastleistung und Futterverwertung signifikant positiv. Während der Effekt der Enzymzulagen bei Nährstoffverwertung und ilealer Verdaulichkeit ausgewählter Aminosäure signifikant höher gegenüber der unsupplementierten Gruppe war, blieb ein Effekt von Zink-Bacitracin hinsichtlich dieser Parameter aus. Der Effekt der Zusatzkombination war bei Mastleistung, Nährstoffansatz und -verwertung und bei der ilealen Verdaulichkeit der ausgewählten Aminosäuren gegenüber der Kontrolle oder dem alleinigen Zusatz signifikant höher. Das deutet auf einen synergistischen Effekt der gleichzeitigen Applikation der beiden Additive hin. Die N-Verwertung einschließlich des Gehalts an N-korrigierter scheinbar umsetzbarer Energie lag nach alleiniger Applikation von Zink-Bacitracin unerwartet signifikant niedriger gegenüber den anderen Zusätzen bzw. tendenziell gegenüber der Kontrolle. Die Gehalte an scheinbar umsetzbarer Energie (AMEn) waren deutlich durch den Enzymzusatz allein oder in Kombination mit Zink-Bacitracin erhöht. -Interaktionen: Die Abhängigkeit der Versuchsfaktoren voneinander im Mastversuch war nicht stark ausgeprägt. Die Zerkleinerung in Verbindung mit anschließender thermischer Behandlung führte zur Beeinflussung der Futterverzehrsdaten. Danach verbesserten die Verfahrenskombinationen Hammermühle x Konditionierung oder Walzenstuhl x Expandierung bedingt durch einen erhöhten Futterverzehr die Lebendmassezunahme und den Nährstoffansatz signifikant. Hinsichtlich der ilealen Aminosäurenverdaulichkeit zeigten die Futterzusätze eine Abhängigkeit von der Behandlung bzw. Zerkleinerung und Behandlung. Die Enzymzulage allein oder in Kombination mit Zink-Bacitracin zeigte stärkere Effektivität in Verbindung mit der thermischen Behandlung durch Expandieren.

O número de infeções bacterianas nos últimos anos tem vindo a aumentar acentuadamente devido a uma subida brusca na quantidade de bactérias multirresistentes. Todos os anos, um número estimado de dois milhões de pessoas sofre de infecções provenientes de agentes bacterianos. Entre estas, cerca de vinte e três mil morrem devido a complicações resultantes da resistência bacteriana. Deste modo, a procura e desenvolvimento de novos agentes antibacterianos tem vindo a tornar-se uma prioridade. No contexto desta busca, a bacitracina surge como uma alternativa. Um antibiótico esquecido e com enorme potencial no combate a infecções bacterianas resistentes a outros antibióticos, a bacitracina é um fármaco hidrofílico polipeptídico com ação antibiótica, principalmente em bactérias Gram positivas, como Staphylococcus aureus. É utilizada na forma de pomada no tratamento de infeções oculares e de infeções localizadas na pele. Por outro lado, a bacitracina é um antibiótico com um elevado nível de nefrotoxicidade, tendo vindo a ser substituída por outros antibióticos menos tóxicos. Desta forma, as nanopartículas lipídicas múltiplas (MLN) surgem como forma de contornar esta situação. Estas permitem criar sistemas de libertação controlada de fármacos, tornando possível ultrapassar alguns dos problemas que se encontram nos fármacos usados de modo dito convencional. Assim, a presente dissertação tem como objetivo principal o desenvolvimento de uma nova formulação de bacitracina baseada em nanopartículas lipídicas do tipo MLN, para administração tópica.<br>In recent years, the number of bacterial infections has increased due to a sharp rise in the amount of multi-resistant bacteria. Last year, approximately two million people were infected with bacterial agents. Among these, about twenty-three thousand died due to complications caused by bacterial resistance. Therefore, the research and development of new antibacterial agents has become a priority. In the context of this search, bacitracin comes in as an alternative. A long-forgotten antibiotic with enormous potential to fight antibiotic-resistant bacterial infections, bacitracin is a hydrophilic polypeptidic drug with antibiotic action, mainly in Gram-positive bacteria, such as Staphylococcus aureus. It is used in the form of ointment to treat eye and localized skin infections. On the other hand, bacitracin is a highly nephrotoxic antibiotic, which has often been replaced by other less toxic antibiotics. Multiple lipid nanoparticles (MLN) appear as a way to get around this situation. These allow the creation of controlled drug delivery systems, which allow to overcome some of the problems that can occur with usage of drugs in a so-called conventional fashion. Thus, this dissertation has as its main goal the development of a new application of bacitracin applied in multiple lipid nanoparticles, for topical administration.