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Dissertations / Theses on the topic 'ArnB Protein'
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Gowher, Ali. "Characterization of protein factors targeting RNA into human mitochondria." Phd thesis, Université de Strasbourg, 2013. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-01071841.
Full textAbstract:
The import of yeast tRNALys (tRK1) into human mitochondria in the presence of cytosolic extract suggests that human cell possesses machinery for tRK1 import. Here, we show that precursor of mitochondrial lysyl-tRNA synthetase (preKARS2) interact with tRK1 and its derivatives containing tRK1 import determinants, and facilitates their import into isolated mitochondria and in vivo, when preKARS2 was overexpressed or downregulated. tRK1 import efficiency increased upon addition of glycolytic enzyme enolase, previously found as an actor of RNA import in yeast. We found that tRK1 and its derivatives translocate into mitochondrial matrix in polynucleotide phosphorylase (PNPase) dependent manner. Furthermore, a point mutation preventing trimerization of PNPase affect import of 5S rRNA and MRP RNA into mitochondria and subsequently mitochondrial translation. Overexpression of the wild-type PNPase induced an increase of 5S rRNA import into mitochondria and rescued translation.
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Li, Yi. "Study of Arnt-interacting proteins on Arnt-dependent signaling pathways." Scholarly Commons, 2006. https://scholarlycommons.pacific.edu/uop_etds/2786.
Full textAbstract:
In an effort to better understand the Ah receptor nuclear translocator (Arnt)-dependent signaling mechanisms, we employed a phage display system to identify Arnt-interacting peptides. Human liver cDNA library was utilized to screen for Arnt-interacting peptides using an Arnt construct fused to thioredoxin (TH-ArntCΔ418). Two clones, namely Ainp1 and Ainp2 (Arnt-interacting peptide), were identified and subsequently characterized. Ainp2 interacted with TH-ArntCΔ418 in the GST pull-down, TALON co-precipitation, and mammalian two-hybrid assays. Northern blot results revealed that Ainp2 is predominantly expressed in human liver. The putative full-length Ainp2 cDNA sequence was subsequently cloned using RACE PCR. Endogenous expression of Ainp2 was found in Jurkat cells and human fetal/adult liver medleys. Results from the transient transfection studies using a DRE- or ERE-driven reporter plasmid and the real-time QPCR experiments examining the endogenous CYP1A1 or GREB-1 expression demonstrated that Ainp2 enhances the 3MC-induced AhR signaling pathway in HepG2 cells, while suppresses the E2-induced ER signaling pathway in MCF-7 cells. These results suggested that Ainp2 plays a role in the Arnt-dependent signaling pathways. The suppressive effect of Ainp2 in the ER signaling pathway was not observed in Arnt-knockdown cells. Additionally, co-precipitation data showed that Ainp2 did not interact with ER α and ER β, suggesting that Ainp2 suppresses the ER signaling via an Arnt-mediated mechanism. The phage display technique also revealed another potential Arnt-interacting peptide Ainp1, which contains an open reading frame of 58 amino acids. The GST pull-down and mammalian two-hybrid assays showed that Ainp1 interacts with TH-ArntCΔ418. Northern blot results demonstrated that Ainp1 is ubiquitously present in all the tested tissues, including brain, placenta, skeletal muscle, heart, kidney, pancreas, liver, lung, spleen, and colon.
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Uchikawa, Emiko. "A structural approach of RNA-protein recognition and kinetics of binding in two examples : tRNA aminoacylation by arginyl-tRNA synthetase and 7SK stabilization by LaRP7." Strasbourg, 2011. http://www.theses.fr/2011STRA6052.
Full textAbstract:
Dans la cellule, les interactions ARN-protéines jouent un rôle fondamental dans divers processus impliqués dans la régulation de l'expression du message génétique. Si l'épissage de l'ARN pré-messager, la polyadénylation, le transport et l'adressage, la stabilité et la traduction sont des régulations de type post-transcriptionnel, les interactions ARN-protéines ont également un rôle-clé dans le domaine de la transcription. Effectivement, en addition aux capacités de codage, qui font de l'ADN et de l'ARN des supports de l'information génétique, la grande variabilité de structures et la flexibilité de l'ARN créent de nombreux sites uniques et le potentiel pour des régulations complexes. Les protéines se liant à l'ARN utilisent une bibliothèque de motifs structuraux pour reconnaître la séquence et la structure de leurs ARN cibles, ce qui conduit à un large éventail d'interactions, de labiles à stables. Ce manuscrit décrit nos travaux consistant à révéler les détails d'interactions RNA-protéines au niveau moléculaires, dans différents exemples concernant deux champs de la biologie cellulaire, la traduction et la transcription du code génétique. Nos cibles ont été choisies afin d'apporter des informations sur des interactions critiques pour la survie cellulaire et représentent différents modes de liaison de protéines à des ARN. Nous avions pour but d'utiliser la cristallographie aux rayons X, qui est une méthode fiable et reconnue pour la finesse des informations à l'échelle atomique que l'on peut en obtenir, et nous avons développé pour chaque cible un protocole de purification conduisant à une préparation homogène et cristallisable. Nous décrivons également les divers tests biophysiques et biochimiques ayant été utilisés pour caractériser nos échantillonsIn the cell, RNA-protein interactions are fundamental to many processes involved in the regulation of gene expression, including pre-mRNA splicing, polyadenylation, editing, transport, cytoplasmic targeting, mRNA turnove and translation. In addition to these post-transcriptional processes, RNA-prote in interactions may also play a key rôle in transcription. Indeed, in addition to its coding capacity, which makes both DNA and RNA recipients of the genetic message, the high variability and conformationnal flexibility of RNA structure creates a number of unique binding sites and the potential for complex regulation by RNA binding proteins. These use a large Iibrary of structural modules in order to recognize RNAs in a combination of sequence- or structure-dependent ways, leading to a wide range of transient to more stable interactions. This manuscript describes our endeavour to reveal the details of RNAprotein interactions at the molecular level in several examples taken in two different fields of cell biology, transcription and translation. Our targets were chosen to better understand the molecular foundation of interactions critical for the cell survival, and represent different binding modes ofproteins to RNA. Aiming to use X-ray crystallography, a well-accepted and reliable mean to analyze recognition details at atomic resolution, we developed for each target a purification protocolleading to homogeneous preparations that were used for crystallization and subjected to various anai}'ses, including functional assays and biophysical characterization
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Corsi, Flavia. "Towards the in silico reconstruction of protein interaction networks : identification of DNA- and RNA-protein interfaces, and construction of a database of multiple interactions of proteins." Electronic Thesis or Diss., Sorbonne université, 2019. https://accesdistant.sorbonne-universite.fr/login?url=https://theses-intra.sorbonne-universite.fr/2019SORUS452.pdf.
Full textAbstract:
Cette thèse porte sur la caractérisation et la prédiction des interfaces protéine-ADN et -ARN, et des comparaisons avec les interfaces protéine-protéine. Nous avons créé un ensemble non-redondant et représentatif de 187 complexes protéine-ADN à haute résolution, comprenant aussi les conformations non liées de 82 protéines. Cette base de données peut servir de référence dans le domaine. Nous avons mené une analyse exhaustive des propriétés de séquence et structurels des interfaces protéine-ADN/ARN et nous les avons comparé avec les propriétés des interfaces protéine-protéine et celles des régions protéiques non-interagissantes. Nous avons développé JET2DNA et JET2RNA, nouvelles méthodes pour la prediction des sites de liaison protéine-ADN/ARN à la surface des protéines. En combinant quatre descripteurs biologiquement pertinents, elles surpassent des méthodes par apprentissage machine. Elles permettent aussi de découvrir des sites de liaison alternatifs avec l'ADN/ARN et de déchiffrer leurs propriétés. Afin de donner un aperçu global de la plasticité des protéines interagissant avec l'ADN, nous avons construit la base de données protéine-(protéine)-ADN (P(P)DNAdb). Elle inclut les 187 complexes protéine-ADN de notre ensemble de référence, les forme libres des protéines et les structures des autres complexes où ces protéines, ou des homologues proches, sont impliqués. L'utilisateur peut accéder aux propriétés des interfaces, visualiser les changements de conformation associés à la liaison avec des partenaires différents et localiser les résidus interagissants avec l'ADN dans les autres structures de la même protéineThis thesis focuses on the characterization and prediction of DNA- and RNA-binding sites on protein structures, with some comparisons with protein-protein ones. We compiled and manually curated a non-redundant and representative set of 187 high resolution protein-DNA complexes, with the available 82 protein unbound conformations, that could be used as a reference benchmark. We conducted a comprehensive analysis of sequence- and structure-based properties of protein-DNA/RNA interfaces and compared them with respect to protein-protein interfaces and to non-interacting protein regions. We developed JET2DNA and JET2RNA, new methods for predicting DNA- and RNA-binding sites on protein surfaces. Combining four biologically meaningful descriptors, they outperform other machine-learning methods, in terms of predictive power and robustness to conformational changes. Our tools demonstrated to be instrumental in discovering alternative DNA/RNA-binding sites and in deciphering their properties. This could be very helpful for drug design and repurposing. To give a comprehensive view of plasticity of DNA-binding proteins and structural information on their multiple interactions, we constructed the Protein-(Protein)-DNA database (P(P)DNAdb). It comprises the 187 protein-DNA complexes in our benchmark, protein unbound forms and structures of other complexes where the proteins, or closed homologs, were in contact with other proteins. The user can access properties of the interfaces, visualize conformational changes associated to the binding of different partners and the location of the DNA-binding residues on the unbound structures and on the complexes with the other protein partners
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Jarrige, Domitille. "Déchiffrer le "code OPR" pour une meilleure compréhension du rôle physiologique des protéines OPR." Electronic Thesis or Diss., Sorbonne université, 2019. http://www.theses.fr/2019SORUS632.
Full textAbstract:
À la suite de l’endosymbiose, le génome chloroplastique a rétréci et dépend maintenant du génome nucléaire pour son expression. Chez Chlamydomonas reinhardtii, les protéines Octotricopeptide repeat (OPR), codées dans le noyau, contrôlent l’expression d’ARNm chloroplastiques spécifiques. La répétition OPR est un motif dégénéré de 38 acides aminés, qui forme un tandem d’hélices α antiparallèles qui lient l’ARN. Une répétition OPR est prédite pour interagir avec un nucléotide spécifique grâce à des résidus variables à des positions précises. La succession de répétitions permet aux protéines OPR de se lier à une séquence donnée. En partant d’un « code OPR » théorique, j’ai cherché à étudier cette spécificité de reconnaissance. J’ai mute in vivo les cibles chloroplastiques de facteurs OPR pour empêcher l’interaction OPR/ARN, puis j’ai tenté de la restaurer en mutant les résidus conférant la spécificité dans les répétitions correspondantes. Étonnamment, les interactions OPR/ARN sont très résilientes, ce qui a complétement changé notre vision de ces interactions in vivo. Des études fonctionnelles complémentaires que j’ai réalisées sur les facteurs OPR MDB1 and MTHI1 ont révélé que l’expression des gènes chloroplastiques dépend probablement de systèmes de facteurs nucléaires. En coopérant ces facteurs auraient une affinité combinée plus forte et seraient ainsi plus résilientsFollowing endosymbiosis, the chloroplast genome shrunk and became reliant on the host genome for its expression. In Chlamydomonas reinhardtii, Octotricopeptide repeat proteins (OPR), encoded in the nucleus, control the expression of a specific organellar mRNA. The OPR repeat is a degenerate motif of 38 amino-acids, folding into a tandem of antiparallel α-helices which can bind to RNA. An individual OPR repeat is predicted to interact with one given nucleotide thanks to specificity-conferring residues at defined positions within the repeat. OPR proteins contain tracks of successive OPR motifs, thus they can bind to a specific RNA “target” sequence and act on it. I aimed to study this specificity, called the “OPR code”, starting with a draft code based on known OPR protein/mRNA couples. I mutated in vivo the chloroplast targets of some OPR factors to disrupt the OPR/RNA interaction, and then tried to restore it by mutating the specificity-conferring residues in the corresponding repeats. Surprisingly, OPR/RNA interactions seem very resilient, challenging our view of how the specificity is established in vivo. Complementary functional studies that I performed on the OPR factors MDB1 and MTHI1 revealed that chloroplast gene expression might rely on complex networks of nuclear factors. By cooperating those putative systems would be both more specific and more resilient
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Mendler, Claudia Theresa [Verfasser], Arne [Akademischer Betreuer] [Gutachter] Skerra, and Markus [Gutachter] Schwaiger. "Protein-Engineering für die In-Vivo-Bildgebung / Claudia Theresa Mendler ; Gutachter: Markus Schwaiger, Arne Skerra ; Betreuer: Arne Skerra." München : Universitätsbibliothek der TU München, 2017. http://d-nb.info/1129874621/34.
Full text
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PARK, YOUNG CHUL. "Stabilite d'une proteine dimerique complexe : la tyrosyl-arnt synthetase." Paris 7, 1998. http://www.theses.fr/1998PA077266.
Full textAbstract:
La tyrosyl-arnt synthetase (tyrrs) de bacillus stearothermophilus comprend un domaine n-terminal (residus 1-319), qui est dimerique, forme le tyrosyl-adenylate et possede le repliement caracteristique de rossmann. Le domaine c-terminal (320-419) fixe l'anticodon de l'arnt. J'ai etudie et modelise le depliement du domaine n-terminal par l'uree a 25\c a l'equilibre dans des experiences de spectrofluorimetrie, dichroisme circulaire et chromatographie d'exclusion de taille. Les resultats ont montre l'existence d'un equilibre entre l'etat natif dimerique du domaine n-terminal, un etat monomerique intermediaire et l'etat deplie. L'intermediaire etait replie et n'etait pas en globule fondu. La variation d'energie libre deltag(h 2o) et son coefficient m de dependance vis-a-vis de la concentration en uree ont ete determines avec precision pour la dissociation du dimere natif et pour le depliement de l'intermediaire monomerique. J'ai identifie un groupement dense de 8 residus dans la tyrrs du thermophile b. Stearothermophilus dont 4 residus ne sont pas conserves dans la tyrrs du mesophile escherichia coli. J'ai construit les mutations correspondantes, t51p, i52l, m55l et l105v, et certaines mutations multiples dans la tyrrs de b. Stearothermophilus, pour etudier le role et le mode devolution de ce groupement dense. Les mutations n'affectaient pas l'activite de la tyrrs ou l'augmentaient. I52l destabilisait l'association entre les deux sous-unites du dimere de tyrrs bien que le residus ile52 soit a plus de 20 angstroms de leur interface. Au contraire, l105v destabilisait principalement l'intermediaire monomerique de depliement. Les effets des 2 mutations etaient antagonistes avec une forte compensation de la mutation l105v par i52l pour la stabilite de l'intermediaire monomerique. Le gain d'activite du a t51p se faisait au depend d'une destabilisation. Ce travail ouvre la voie a l'etude quantitative de la stabilite et du repliement des proteines dimeriques complexes.
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Takeuchi, Akiko Krol Alain Allmang-Cura Christine. "RNA-protein interaction in the selenoprotein synthesis machinery." Strasbourg : Université de Strasbourg, 2009. http://eprints-scd-ulp.u-strasbg.fr:8080/1133/01/TAKEUCHI_Akiko_2009.pdf.
Full textAbstract:
Thèse de doctorat : Sciences du Vivant. Aspects moléculaire et cellulaire de la Biologie : Strasbourg : 2009.Thèse soutenue sur un ensemble de travaux. Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. 11 p.
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Holla, Andrea Dorothee [Verfasser], Arne [Akademischer Betreuer] Skerra, and Dirk [Akademischer Betreuer] Haller. "Protein-Engineering eines Anticalins mit Bindungsspezifität für DC-SIGN / Andrea Dorothee Holla. Gutachter: Arne Skerra ; Dirk Haller. Betreuer: Arne Skerra." München : Universitätsbibliothek der TU München, 2012. http://d-nb.info/1031075763/34.
Full text
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Yavrom, Sheena. "Evidence that ARNT plays a role in the regulation of the immunoglobulin heavy chain enhancer and identification of a putative ARNT ligand." Scholarly Commons, 1998. https://scholarlycommons.pacific.edu/uop_etds/516.
Full textAbstract:
Basic helix-loop-helix (bHLH) proteins are involved in the regulation of a multitude of developmental processes including cellular differentiation, cellular proliferation and xenobiotic metabolism. Among the members of the bHLH protein family are the products of the Pan gene Pan-1, Pan-2 and ITF -1. Pan proteins have been demonstrated to be required for proper B cell development, suggesting a unique role for Pan proteins during B cell formation. In our study we tested the function of ARNT (Ah receptor nuclear translocator) at the IgH (immunoglobulin heavy chain) enhancer. We were able to determine that ARNT appears to partially down-regulate activation at the IgH enhancer by Pan-1 in transient transfection assays by cotransfection of the multimerized murine form of the IgH enhancer elements 1-1E2, !-LE3 , and 1-1ES upstream of a luciferase reporter gene, a rodent Pan-1 (human homolog E47) expression vector, and an ARNT expression vector. Furthermore, during our investigation we discovered a putative ARNT -binding ligand that increases DNA-binding activity of the ARNT homodimer. This ligand was partially characterized by UV crosslinking studies and a variety of biochemical studies using electrophoretic mobility-shift assays. Preliminary data suggests that it is hydrophilic, heat-stable, small, and non-protein.
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Takeuchi, Akiko. "RNA-protein interaction in the selenoprotein synthesis machinery." Strasbourg, 2009. http://www.theses.fr/2009STRA6054.
Full textAbstract:
La sélénocystéine est incorporée co-traductionnellement dans les sélénoprotéines en réponse à un codon UGA habituellement l’un des 3 codons stop. La protéine SBP2 joue un rôle majeur dans ce mécanisme de recodage en se liant à une structure en tige-boucle (SECIS) située dans la région 3’UTR de l’ARNm des sélénoprotéines. Nous avons isolé et caractérisé fonctionnellement SBP2 de Drosophila melanogaster. Par comparison avec SBP2 humaine, nous avons identifié un domaine de liaison à l’ARN additionnel essentiel à la liaison au SECIS et à la sous-unité ribosomique 60S et permettant une sélectivité structurale du SECIS. Des prédictions structurales et des analyses biophysiques ont établi que SBP2 était une protéine globalement désordonnée ou “Intrinsically Disordered Protein” qui ne se replie qu’en présence de partenaires. Enfin, nous avons établi que l’assemblage des mRNP de sélénoprotéines faisait appel à des facteurs communs et présentait de multiples similarités avec celui des sn/snoRNPThe 21st amino acid selenocysteine is encoded by a UGA codon that usually signifies translational termination. Selenoprotein synthesis therefore requires specialized factors. Among these is SBP2 that binds the SECIS, a stem-loop structure in the 3’UTR of selenoprotein mRNAs. In structural analyses of SBP2, we isolated and functionally characterized Drosophila melanogaster SBP2. By comparing it with human SBP2, we identified an additional RNA binding domain that is essential for SECIS and 60S ribosomal subunit binding, and also enables SECIS structure selectivity. In addition, computational and biophysical analyses established that SBP2 is globally unfolded, supporting our hypothesis that SBP2 is an Intrinsically Disordered Protein and becomes folded in the presence of partners yet to be identified. Finally, we searched for potential partners of SBP2 and our results showed that the molecular assembly of selenoprotein mRNPs has many similarities with that of sn/snoRNPs
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Mayer, Jan-Peter Andreas [Verfasser], Arne [Akademischer Betreuer] Skerra, Wolfgang [Akademischer Betreuer] Liebl, and Bernhard [Akademischer Betreuer] Küster. "Rationales und kombinatorisches Protein-Engineering mit Lipocalinen / Jan-Peter Andreas Mayer. Gutachter: Wolfgang Liebl ; Arne Skerra ; Bernhard Küster. Betreuer: Arne Skerra." München : Universitätsbibliothek der TU München, 2013. http://d-nb.info/1036262170/34.
Full text
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Le, Borgne Maïlys. "Étude in vivo de la fonction biologique de la protéine de liaison aux ARN Mex-3B." Thesis, Lyon 1, 2012. http://www.theses.fr/2012LYO10141.
Full textAbstract:
La protéine de liaison aux ARN MEX-3 est un régulateur essentiel du développement embryonnaire chez le nématode Caenorhabditis elegans. Une famille de quatre gènes homologues à hMex-3 (dénommés hMex-3A, 3B, 3C et 3D) a été identifiée chez les mammifères par notre équipe. Afin de mieux comprendre la fonction physiologique in vivo des protéines Mex-3, nous avons invalidé le gène Mex-3B chez la souris. Cette approche expérimentale a révélé que Mex-3B est un acteur majeur de la spermatogenèse. Les souris mâles nullizygotes présentent une obstruction des tubes séminifères conduisant à une réduction importante du nombre des spermatozoïdes produits. L’ablation de Mex-3B ciblée à la cellule de Sertoli, cellule somatique essentielle à la fonction de l’épithélium séminifère, a permis d’établir que le phénotype testiculaire a pour origine une perturbation des propriétés biologiques de cette cellule. En effet, les cellules de Sertoli déficientes pour Mex-3B présentent des défauts de la phagocytose qui conduisent à une élimination défectueuse des corps résiduels au cours de la spemiogenèse. L’exploration des mécanismes moléculaires impliqués a montré que Mex-3B contrôle la phagocytose via la régulation de l’activité et de la localisation membranaire de Rap1GAP, une protéine qui régule négativement la petite protéine G Rap1. En accord avec ces données, l’absence de Mex-3B provoque une déstabilisation de la barrière hémato-testiculaire due à un défaut de localisation à la membrane plasmique des molécules de jonction connexine 43 et N-Cadhérine, protéines dont la translocation et la stabilité dépendent de Rap1. En conclusion, mes travaux de thèse ont permis de mettre en évidence un rôle clé de Mex-3B dans le contrôle spatial de la voie de signalisation Rap1 au cours de la spermatogenèseThe RNA binding-protein MEX-3 is a post-transcriptional regulator involved in early embryogenesis of the nematode Caenorhabditis elegans. We have recently reported the characterization of a novel family of four mammalian genes homologous to hMex-3 (called hMex-3A, 3B, 3C and 3D). To gain insight into the biological functions of these proteins in vivo, we disrupted the Mex-3B gene in mice. Using this experimental approach, we found that Mex-3B is as a major regulator of spermatogenesis. We observed that male Mex-3B null mice hypofertile and present an obstruction of seminiferous epithelium. Phagocytic properties of Sertoli cells were impaired, thus impeding the clearance of residual bodies released during spermiogenesis. Exploration of the underlying molecular mechanisms revealed that Mex-3B regulates phagocytosis through the activation and the transport at the peripheral membrane of Rap1GAP, a protein that downregulates the small G protein Rap1. Consistently, the Rap1-dependent recruitment of the junction proteins, connexin 43 and N-Cadherin at the cell surface was compromised in Mex-3B deficient mice. In conclusion, my work highlights a key role gor Mex-3B in the spatial control of Rap1 signaling during spermatogenesis
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Kirchner, Christian Oliver [Verfasser], Arne [Akademischer Betreuer] [Gutachter] Skerra, and Wolfgang [Gutachter] Liebl. "Protein-Engineering eines Anticalins mit Bindungsspezifität für das Anthrazyklin-Zytostatikum Doxorubicin / Christian Oliver Kirchner. Betreuer: Arne Skerra. Gutachter: Wolfgang Liebl ; Arne Skerra." München : Universitätsbibliothek der TU München, 2016. http://d-nb.info/1113181958/34.
Full text
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Lindenbaum, Pierre. "Roxan, une nouvelle proteine cellulaire interagissant avec la proteine non-structurale nsp3 du rotavirus : clonelt* : un programme en ligne trouvant des strategies de clonage (doctorat : microbiologie)." Paris 11, 2000. http://www.theses.fr/2000PA114811.
Full text
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Christians, Arne [Verfasser], and Stefan [Akademischer Betreuer] Wiemann. "Funktionelle Charakterisierung des putativen Tumorsuppressors "Epithelial Membrane Protein 3" / Arne Christians ; Betreuer: Stefan Wiemann." Heidelberg : Universitätsbibliothek Heidelberg, 2014. http://d-nb.info/1180300955/34.
Full text
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Armaos, Alexandros 1989. "Computational characterization of protein-RNA interactions and implications for phase separation." Doctoral thesis, Universitat Pompeu Fabra, 2020. http://hdl.handle.net/10803/668546.
Full textAbstract:
Despite what was previously considered, the role of RNA is not only to carry the genetic
information from DNA to proteins. Indeed, RNA has proven to be implicated in more
complex cellular processes. Recent evidence suggests that transcripts have a regulatory
role on gene expression and contribute to the spatial and temporal organization of the
intracellular environment. They do so by interacting with RNA-binding proteins (RBPs)
to form complex ribonucleoprotein (RNP) networks, however the key determinants that
govern the formation of these complexes are still not well understood. In this work, I will
describe algorithms that I developed to estimate the ability of RNAs to interact with
proteins. Additionally, I will illustrate applications of computational methods to propose
an alternative model for the function of Xist lncRNA and its protein network.
Finally, I will show how computational predictions can be integrated with high
throughput approaches to elucidate the relationship between the structure of the RNA and
its ability to interact with proteins. I conclude by discussing open questions and future
opportunities for computational analysis of cell’s regulatory network.
Overall, the underlying goal of my work is to provide biologists with new insights into
the functional association between RNAs and proteins as well as with sophisticated tools
that will facilitate their investigation on the formation of RNP complexesA pesar de lo que se consideraba anteriormente, el papel del ARN no es solo transportar la información genética del ADN a las proteínas. De hecho, el ARN ha demostrado estar implicado en muchos procesos celulares más complejos. La evidencia reciente sugiere que los transcriptos tienen un papel regulador en la expresión génica y contribuyen a la organización espacial y temporal del entorno intracelular. Lo hacen interactuando con proteínas de unión a ARN (RBP) para formar redes complejas de ribonucleoproteína (RNP), sin embargo, los determinantes clave que rigen la formación de estos complejos aún no se conocen bien. En este trabajo, describiré algoritmos que he desarrollado para estimar la capacidad de los ARN de interactuar con las proteínas. Además, ilustraré aplicaciones de métodos computacionales para proponer una maquinaria alternativa para el Xist lncRNA y su red de interacciones. Finalmente, mostraré cómo las predicciones computacionales pueden integrarse con enfoques de alto rendimiento para dilucidar la relación entre la estructura del ARN y su capacidad para interactuar con las proteínas. Concluyo discutiendo preguntas abiertas y oportunidades futuras para el análisis computacional de la red reguladora de la célula. En general, el objetivo subyacente de mi trabajo es proporcionar a los biólogos nuevas ideas sobre la asociación funcional entre ARN y proteínas, así como herramientas sofisticadas que facilitarán su investigación sobre la formación de complejos RNP.
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Pintard, Lionel. "Spb1p est une méthylase de levure impliquée dans la maturation des ARNr." Montpellier 1, 2000. http://www.theses.fr/2000MON1T019.
Full text
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Barkovskiy, Mikhail [Verfasser], Arne [Akademischer Betreuer] Skerra, Arne [Gutachter] Skerra, and Kay H. [Gutachter] Schneitz. "Protein design of hapten-specific Anticalins as therapeutic antidotes and biochemical reagents / Mikhail Barkovskiy ; Gutachter: Arne Skerra, Kay H. Schneitz ; Betreuer: Arne Skerra." München : Universitätsbibliothek der TU München, 2020. http://d-nb.info/1216626367/34.
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Karlikow, Margot. "Drosophila CG4572 protein and the spread of the RNAi antiviral immune signal." Thesis, Paris 6, 2015. http://www.theses.fr/2015PA066713/document.
Full textAbstract:
Au cours d’une infection virale, la survie des cellules dépend d’informations adéquatement distribuées, reçues et traitées, permettant l’établissement d’une réponse antivirale performante. La communication cellulaire est donc essentielle pour permettre la propagation de signaux immuns protecteurs à tout l’organisme.Chez les insectes, la principale réponse antivirale est l’ARN interférent (ARNi), activé lors de la détection d’ARN double brin (ARNdb) d’origine virale. Le mécanisme antiviral de l’ARNi peut être cellulaire ou systémique. Dans la première catégorie, la régulation de l’expression génique est limitée à la cellule dans laquelle l’ARNdb est produit, alors que dans la seconde, cette même régulation s’effectue dans des cellules distinctes de celles produisant l’ARNdb. Chez les insectes, l’ARNi systémique reste très peu décrit.Ma thèse explore le rôle de la protéine de drosophile CG4572/DORA, dans les mécanismes permettant l’établissement de l’ARNi systémique. J’ai également cherché la nature des signaux déclencheurs de cette réponse antivirale. Nous montrons l’existence de deux mécanismes de communication cellulaire permettant la propagation de signaux antiviraux: des vésicules extracellulaires et des nanotubes. Nous mettons en évidence que des vésicules contenant DORA et des fragments d’ARN viraux peuvent se propager dans les mouches en leur conférant une protection antivirale spécifique. Nous montrons également pour la première fois la présence de nanotubes membranaires qui contiennent des protéines de la machinerie ARNi ainsi que DORA.Les mécanismes que nous proposons sont pour la première fois associés à la réponse antivirale chez Drosophila melanogasterDuring viral infection, cell survival will depend on adequately giving, receiving and processing information to establish an efficient antiviral immune response. Cellular communication is therefore essential to allow the propagation of immune signals that will confer protection to the entire organism.The major antiviral defense in insects is the RNA interference (RNAi) mechanism that is activated by detection of viral double-stranded RNA (dsRNA). The antiviral RNAi mechanism can be divided in cell- and non-cell- autonomous. In cell-autonomous RNAi, the silencing process is limited to the cell in which the viral dsRNA is produced. In non-cell-autonomous (systemic) RNAi, the interfering effect occurs in cells different from where the viral dsRNA was produced. In insects the systemic RNAi response remains poorly characterized. My PhD explores the role of the Drosophila CG4572/DORA protein in the establishment of systemic antiviral RNAi. It also investigates the nature of immune signals that trigger the antiviral response. I provide evidence for the existence of two different mechanisms of cell-cell communication that allow the spread of the immune signal: extracellular vesicles and tunneling nanotubes. I describe that DORA-positive extracellular vesicles carry fragments of viral RNAs that can spread and confer specific antiviral protection in flies. I also present the characterization of tunneling nanotubes (TNTs) containing components of the RNAi machinery, DORA and dsRNA and I hypothesize on the use of TNTs in the spread of the immune signal.Both mechanisms of cell-to-cell communication are coupled for the first time to the antiviral response in Drosophila melanogaster
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Chernov, Konstantin Grigorievich. "Interplay of YB-1 between tubulin and mRNA." Thesis, Evry-Val d'Essonne, 2008. http://www.theses.fr/2008EVRY0040/document.
Full textAbstract:
YB-1 est un régulateur important de l’expression des gènes dans les cellules eucaryotes. En plus de son rôle dans la transcription, YB-1 joue un rôle clé dans la traduction et la stabilisation des ARN messagers. Nous avons identifié plusieurs nouveaux partenaires de la protéine YB-1 par chromatographie d’affinité à partir de différents extraits tissulaires. Parmi ces partenaires, nous avons démontré que YB-1 interagit avec la tubuline et les microtubules et stimule fortement l'assemblage des microtubules in vitro. Les microtubules assemblés en présence de YB-1 ont une ultrastructure normale, et les données montrent que YB-1 recouvre probablement la surface extérieure des microtubules. De la même façon YB-1 stimule aussi l'assemblage de la tubuline-MAP qui est plus proche des complexes protéiques qui existent dans la cellule, et de la tubuline clivée par subtilisine ce qui suggère que son interaction avec la tubuline ne relève pas seulement d’effets électrostatiques. Nous avons enfin découvert que la tubuline interfère avec la formation des complexes ARNm:YB-1. Ces résultats suggèrent que YB-1 peut réguler l'assemblage des microtubules in vivo et que son interaction avec la tubuline peut contribuer à la régulation de la traduction des ARN messagers. En effet, in vivo, la traduction des mRNPs dépend de l’état de saturation de l’ARN messager par YB-1. Nous avons montré ici que lorsque le rapport YB-1:ARNm est faible, les complexes mRNPs possèdent des structures non-compactes, alors que les mRNPs saturés sont compacts. Ce changement structural est observé de façon parallèle à l'inhibition de la traduction des ARN messagers lorsqu’ils passent des polysomes (traduits) aux mRNPs libres (non traduits). De façon intéressante, nous avons découvert que les mRNPs saturés se lient aux microtubules via des interactions protéine:protéine et ont tendance à former des agrégats sur la surface des microtubules. Cette dernière propriété pourrait contribuer à la formation de granules de stress et à la localisation des mRNPs dans le cytoplasme. Finalement, un modèle de diffusion facilité a été développé pour expliquer l'assemblage des microtubules orchestré par les polyamines naturelles (telles que YB-1 qui sont positivement chargées dans la cellules). L’ensemble de ces données contribuent à une meilleure compréhension de processus biologiques fondamentaux concernant l’assemblage de la tubuline en microtubules et le trafic des ARN dans la cellule. Ils pourraient avoir un intérêt pour développer de nouveaux médicaments qui ciblent les microtubulesYB-1 is a major regulator of gene expression in eukaryotic cells. In addition to its role in transcription, YB-1 plays a key role in translation and stabilization of mRNAs. We identify several novels YB-1 protein partners by affinity chromatography of different tissue extracts. We observed that YB-1 interacts with tubulin and microtubules and stimulates microtubule assembly in vitro. Microtubules assembled in the presence of YB-1 exhibited a normal single wall ultrastructure where YB-1 probably coats the outer microtubule wall. Furthermore, we found that YB-1 also promotes the assembly of MAPs-tubulin and subtilisin-treated tubulin. Additionally, we demonstrated that tubulin interferes with mRNA:YB-1 complexes. These results suggest that YB-1 may regulate microtubule assembly in vivo and that its interaction with tubulin may contribute to the control of mRNA translation. The translational status of mRNPs in vivo depends on amount of YB-1 associated with mRNA. We show here that at low YB-1:mRNA ratios mRNP complexes possess an incompact structures, whereas saturated mRNPs are compact. This structural change corresponds to translation inhibition when mRNA moves from polysomal (translatable) to free (untranslatable) mRNPs. Saturated mRNPs bind to microtubules via protein:protein interactions and tend to self-aggregate on microtubule surface. This property could contribute to stress granule formation, mRNPs traffic and localization of translation apparatus within cytoplasm. Finally, the facilitated diffusion model was developed to explain enhancement of microtubule assembly by positively charged natural polyamines in living cells. Altogether our data contribute to the understanding of fundamental biological processes
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Falcon, de Longevialle Alexis. "Identification des protéines PPR impliquées dans l'épissage des ARN messagers dans les chloroplastes et les mitochondries chez Arabidopsis Thaliana." Thesis, Evry-Val d'Essonne, 2010. http://www.theses.fr/2010EVRY0015.
Full textAbstract:
Le mécanisme d’épissage dans les organites est décrit comme étant l’ancêtre du spliceosome nucléaire. Cependant même si les protéines composant ce dernier sont bien connues, seulement quelques facteurs d’épissage ont été identifiés et caractérisés dans les chloroplastes et les mitochondries. Beaucoup de protéines ayant la faculté de se lier à l’ARN ont acquis des fonctions dans l’épissage, en effet un certain nombre de protéines sans véritable lien ont un rôle essentiel, avec différents degrés de spécificité dans l’épissage de la plupart des introns chloroplastiques chez les plantes. La plus grande famille de protéines se liant à l’ARN est la famille des protéines à domaines « pentatricopetide repeat » (PPR). Ces protéines sont impliquées dans la plupart des processus post-transcriptionnels dans les organites. En 2006, parmi les centaines de protéines PPR décrites chez les plantes, seulement une PPR avait été décrite comme nécessaire à l’épissage d’un intron. Ainsi, PPR4 est absolument et spécifiquement nécessaire pour l’épissage en trans de l’intron 1 de rps12 dans les plastes (Schmitz-Linneweber et al., 2006), suggérant que d’autres protéines PPR pourraient être impliquées dans l’épissage des ARN des organites. Le sujet de cette thèse porte sur la caractérisation d’autres protéines PPR impliquées dans ce processus. En utilisant des approches de génétique inverse et des outils mis en place dans le cadre de la thèse afin de détecter des défauts d’épissage par PCR quantitative, sept nouvelles PPRs impliquées dans l’épissage d’un certain nombre d’introns dans les plastes et les mitochondries ont pu être caractérisées. Dans l’optique de rechercher si des protéines PPR, impliquées dans l’épissage mais aussi dans l’édition des ARN, interagissent avec d’autres protéines, des approches de TAP-TAG ont été réalisées et sont également présentées dans ce manuscrit. L’identification de partenaires protéiques pour 3 PPRs impliquées, nous a ainsi permis de redessiner nos modèles et d’émettre de nouvelles hypothèses. Enfin, une dernière partie est consacrée à la découverte d’isoformes d’épissage pour des gènes PPR sans introns. Phénomène qui permettrait de réguler l’expression des gènes PPR, et/ou d’augmenter la diversité des protéines PPRThe RNA splicing mechanism in organelles is described to be ancestral to that of the nuclear spliceosome. However, whereas this last complex is well known, only very few splicing factors have been identified and characterized in chloroplasts and mitochondria. Many RNA binding proteins have acquired roles in RNA splicing, and indeed a variety of often unrelated RNA binding proteins have essential functions in splicing of many plastid introns in plants, with varying degrees of specificity. The largest family of RNA binding proteins in plant organelles is the pentatricopeptide repeat (PPR) family. PPR proteins are involved in diverse post-transcriptional processes in organelles. In 2006, among hundreds of higher plant proteins of this family, only one was described as being required for a splicing event - PPR4 was shown to be absolutely and specifically required for the trans-splicing of the rps12 intron 1 in plastids (Schmitz-Linneweber et al., 2006). The main purpose of this PhD thesis was to characterize other PPR proteins involved in this process. By using a reverse genetics approach and by developing tools for the detection of splicing defects, seven new PPR proteins involved in RNA splicing of a subset of chloroplast or mitochondria introns have been characterized. In parallel, in order to characterize proteins involved in PPR-containing complexes, a TAP-TAG approach has been carried out on a few PPR proteins involved in splicing or editing of organellar RNA. The identification of partner proteins of 3 PPR proteins allows us to draw new mechanistic models and new hypotheses. Finally, the final part of the manuscript describes the discovery of splicing isoforms of PPR-encoding mRNAs. Alternative splicing may be involved in regulation of PPR gene expression and/or in increasing the diversity of the PPR protein family
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Soicke, Arne [Verfasser]. "Stereoselektive Synthese neuartiger Prolin- und Pseudoprolin-Dipeptidmimetika zur Modulation von Peptid-Protein-Wechselwirkungen / Arne Soicke." München : Verlag Dr. Hut, 2014. http://d-nb.info/1067707913/34.
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Manival, Xavier. "Etude fonctionnelle et structurale de l'interaction de la protéine antiterminatrice SacY avec son ARN cible chez Bacillus subtilis : mise en évidence d'un nouveau type de domaine protéique de liaison à l'ARN." Montpellier 1, 1997. http://www.theses.fr/1997MON1T010.
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Rall, Nils Arne [Verfasser], Heinz [Akademischer Betreuer] Neumann, and Henning [Akademischer Betreuer] Urlaub. "A Method for the Quantitative Analysis of Protein-Protein Interactions In Vivo / Nils Arne Rall. Betreuer: Heinz Neumann. Gutachter: Heinz Neumann ; Henning Urlaub." Göttingen : Niedersächsische Staats- und Universitätsbibliothek Göttingen, 2016. http://d-nb.info/1096752069/34.
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Stefani, Arno Gert [Verfasser], and Johannes [Gutachter] Huber. "Nonparametric and Nonasymptotic Confidence Intervals for Estimation of Mutual Information with Applications in Protein-Protein Docking Analysis / Arno Gert Stefani ; Gutachter: Johannes Huber." Erlangen : Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU), 2018. http://d-nb.info/115500616X/34.
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Nguyen, Chi Mai. "Post-transcriptional regulation during spermatogenesis : Role of the RNA-binding protein hu." Toulouse 3, 2008. http://thesesups.ups-tlse.fr/365/.
Full textAbstract:
La spermatogenèse est un processus élaboré permettant d'une part le maintien de cellules souches par divisions mitotiques et d'autre part la production de spermatozoïdes par différenciation. Au cours des dernières étapes de la différenciation, la chromatine se compacte, ne laissant plus à la cellule la possibilité de transcrire ses gènes. Du fait de l'arrêt brutal de la transcription, bien avant la fin du processus de différenciation, la cellule germinale utilise le stock d'ARN messagers (ARNm) préexistants pour finaliser sa différenciation. Ce phénomène repose sur la régulation fine du stockage et de la traduction des ARNm au cours du temps, deux régulations post-transcriptionnelles encore très peu documentées dans les cellules germinales. Au cours de ma thèse je me suis intéressée au rôle potentiel de deux protéines de liaison à l'ARN exprimées dans le testicule de souris: HuR/ELAVL1 et AUF1/hnRNP D. Dans les cellules somatiques, ces protéines lient les séquences riches en adénines et uridines (AU-rich element ou ARE) localisées dans la région 3' non codante de certains ARNm (ARN à ARE). HuR protége de la dégradation ses ARN à ARE cibles et favorise leur traduction, alors qu'AUF1 induit leur dégradation. Afin d'étudier la contribution d'HuR et d'AUF1 aux mécanismes post-transcriptionnels indispensables au bon déroulement de la spermatogénèse, nous avons dans un premier temps examiné leur patron d'expression. Nous avons montré que l'expression d'HuR est étroitement régulée au cours de la spermatogénèse, alors que celle d'AUF1 est ubiquitaire. Dans un second temps, nous avons utilisé des lignées de souris transgéniques surexprimant HuR (HuRtg) ou AUF1 (AUF1tg) établies au laboratoire et montré que la surexpression d'HuR et non celle d'AUF1 altère la spermatogenèse, entraînant leur stérilité dans 25% des cas (Sertoli Cells Only syndrome). Par la suite, nous avons mis évidence que de nombreux ARN à ARE, naturellement abondamment exprimés dans le testicule, sont dérégulés dans les cellules germinales HuRtg et AUF1tg. Une étude approfondie des ARN cibles d'HuR et d'AUF1, a révélé que ces deux protéines ont une activité différente car elles s'associent à des ARN différents dans les cellules germinales. .Spermatogenesis, the elaborate process by which sperm are produced, is marked by dramatic proliferation and differentiation. During the late steps of spermatogenesis, transcription suddenly ceases prior the end of differentiation, because of drastic epigenetic modifications that result in chromatin compaction. Thus, haploid germ cells make use of extensive temporal mRNA storage and translation regulation to ensure stage-specific protein synthesis. Factors and cellular compartments involved in these post-transcriptional controls are still poorly understood. During my PhD, I hypothesized that the two RNA binding proteins HuR/ELAVL1 and AUF1/hnRNP D, might play a role in these controls. They bind AU-rich element-containing mRNAs (ARE-mRNAs) in somatic cells and regulate their stability and translation: HuR protects ARE-mRNAs from degradation and favours their translation, whereas AUF1 usually induces their degradation. First, to investigate the contribution of HuR and AUF1 to the post-transcriptional mechanisms occurring in germ cells, I used transgenic mice derived in our laboratory overexpressing HuR (HuRtg) and AUF1 (AUF1tg) in their testes. Strikingly, whereas spermatogenesis proceeded normally in AUF1tg mice, HuR overexpression impaired spermatogenesis, revealing the importance of a regulated expression of HuR to fulfill male germ cell differentiation. The comparative analysis of AU-transcriptome of pre-pubertal wild type testes with that of HuRtg and AUF1tg testes, combined with computational analyses and RNA/Protein immunoprecipitation experiments, revealed that these two proteins regulate different targets mRNAs and thus exhibit different activities. .
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Schreiber, Arne [Verfasser]. "Bildungsmechanismus und physiologische Relevanz supramolekularer Proteincluster des Amyloid Precursor Protein APP in der Zellmembran / Arne Schreiber." Bonn : Universitäts- und Landesbibliothek Bonn, 2013. http://d-nb.info/104486785X/34.
Full text
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BESSE, LAURENT. "Mise au point d'un reactif chimique permettant l'etude des interactions proteine-proteine. Application aux arn polymerases de levure." Paris 11, 1996. http://www.theses.fr/1996PA112232.
Full textAbstract:
Les methodes classiques d'etude de la structure quaternaire de proteines permettent difficilement, a l'heure actuelle, d'obtenir des informations structurales sur les complexes multimeriques de haut poids moleculaire. Nous avons donc concu et synthetise un reactif bifonctionnel, permettant l'etude des interactions entre les differentes sous-unites constituant ces proteines oligomeriques. Ce reactif comporte, a l'une de ses extremites, un complexe organique du ruthenium(ii) capable de se lier de maniere specifique a une sequence poly-histidines introduite par genie genetique sur une sous-unite donnee et, a l'autre extremite, un groupement photoactivable radioactif. Ces deux fonctionnalites sont reliees par une chaine carbonee hydrolysable. En premier lieu, nous avons montre a travers l'etude d'un compose modele - le carbonatobis(2,2'-bipyridine)ruthenium(ii) - qu'une fonction carbonate porte par le ruthenium permet au metal de se fixer sur des histidines en milieu aqueux tamponne et a temperature ambiante, conditions requises par l'emploi du reactif sur des proteines. Nous avons ensuite toujours grace a ce complexe modele, demontre la complexation des histidines sur des peptides synthetiques. Cette etude a de plus ete realisee par rmn du proton et par modelisation moleculaire. Dans un deuxieme temps, la synthese des complexes bifonctionnels comportant les proprietes fonctionnelles requises pour l'etude des interactions entre proteines a ete mise au point. Les systemes biologiques auxquels nous nous sommes interesses sont les arn polymerases i, ii et iii de la levure saccharomyces cerevisiae. Les premiers resultats ont ete obtenus sur ces macromolecules biologiques. En conclusion, les resultats encourageants nous permettent d'envisager l'etude de l'agencement des sous-unites les unes par rapport aux autres afin d'obtenir des informations structurales sur les proteines multimeriques
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Rouhana, Jad. "Etude et modulation des interactions protéine-protéine : l’activation de la petite protéine G Arf1 par son facteur d’échange Arno." Thesis, Montpellier 1, 2013. http://www.theses.fr/2013MON13507/document.
Full textAbstract:
Arf1 est une petite protéine G (pG), essentiellement impliquée dans le trafic vésiculaire. Arf1 oscille entre deux conformations, l'une active liée au GTP et l'autre inactive associée au GDP. Arno est un des facteurs d'échange (GEF) capable d'activer Arf1 en stimulant l'échange GDP/GTP. Suractivée dans les cellules invasives du cancer du sein, Arf1 joue un rôle important dans la migration et la prolifération des cellules cancéreuses.Le but de ma thèse s'inscrit dans l'étude et la modulation de l'interaction pG-GEF, et plus spécifiquement, le couple Arf1-Arno. Mon travail a été planifié autour de deux axes: (1) L'étude fine de l'interaction entre Arf1 et Arno, et sa modulation avec un inhibiteur connu la Bréféldine A (BFA). (2) La mise en place d'une stratégie de conception d'inhibiteurs de l'interaction protéine-protéine du couple Arf1-Arno.Dans un premier temps, nous avons mis en place une méthode basée sur la résonance plasmonique de surface (SPR) permettant la détermination des paramètres cinétiques de l'interaction entre Arf1 et Arno. Nous avons précisé aussi les conséquences des partenaires allostériques (GDP, GTP, et Mg2+) et de la BFA sur les paramètres cinétiques de l'interaction. Ceci a permis une analyse fine de la régulation allostérique et du mode d'action de la BFA. Appliquée à d'autres inhibiteurs, cette méthode permettra d'examiner leur mécanisme d'inhibition.Dans la deuxième partie j'expose, la stratégie que nous avons utilisé pour la conception rationnelle d'inhibiteur de l'interaction entre Arf1 et Arno. Elle est basée sur le criblage virtuel de fragments au niveau des résidus clé « hotspots » de l'interaction, la validation des molécules-touches par des techniques biophysiques, et l'élimination de molécules artefacts. Les structures des complexes fragments-Arno ont été résolues, ce qui confirme la validité de cette stratégie ouvrant la voie vers l'optimisation moléculaire pour obtenir des inhibiteurs plus efficacesArf1 is a small GTPases, essentially involved in the vesicular traffic. Arf1 switch between two conformations, an active form bound to GTP and an inactive form bound to GDP. Arno is one of the exchange factors (GEF) that can activate Arf1, through its catalytic Sec7 domain, promoting the exchange of GDP by GTP. Activated in breast cancer cells, Arf1 plays an important role in the migration and proliferation of cancer cells.The aim of my thesis was the study and the modulation of the interaction between small G proteins and their GEFs, more precisely the Arf1-Arno interaction. My work has been planned around two axes: (1) the study of the interaction between Arf1 and Arno, and its modulation with a known inhibitor Brefeldin A (BFA). (2) The development of a rational strategy for designing inhibitors of protein-protein interaction for the Arf1-Arno complex.In the first part of my PhD work, we set up a Surface Plasmon Resonance (SPR) method allowing to determine the kinetic parameters of the interaction between Arf1 and Arno. We also studied the effects of allosteric partners such as GDP, GTP and Mg2+ as well as the known uncompetitive inhibitor (Brefeldin A). This SPR approach allowed a very informative analysis at qualitative and quantitative levels of the various complexes taking place during the exchange reaction that should help to solve the inhibitory mechanism for the known inhibitors reported in the literature. In the second part of my thesis, we propose a strategy for targeting the interaction between Arf1and Arno. This approach is based on virtual screening of fragments at hotspot regions. Using biophysical techniques such fluorescence techniques, SPR, NMR and X-Ray crystallography, we identified and validated Hits, showing by crystallographic structural data their modes of interaction with the target protein Arno. A fluorescence polarization test was also developed to identify false positive fragments to eliminate promiscuous aggregators. Taken together, our work proposes a method based on SPR allowing the study of known inhibitors of GEFs, understanding at molecular level their mode of action. We also propose a general strategy for finding Hit fragments that designing competitive inhibitor of the interaction small G protein with its GEFs, that can be the scaffold for designing more powerful inhibitors
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Sharma, Kamal Kant. "Molecular mechanism of the hepatitis C virus core protein chaperone properties : Physicochemical investigation by fluorescence and surface plasmon resonance." Strasbourg, 2011. https://publication-theses.unistra.fr/public/theses_doctorat/2011/SHARMA_Kamal_Kant_2011.pdf.
Full textAbstract:
La protéine core de virus de l’hépatite C (HCV) est l’une des dix protéines codées par l’ARN génomique de 9. 6kb du virus. C’est une protéine chaperonne multifonctionnelle impliquée dans plusieurs processus viraux comme la prolifération cellulaire, la différentiation, l’encapsidation de l’ARN, la formation de la nucléocapside, et la variabilité génétique. Grâce à ses propriétés de chaperonne, le domaine D1 dimérise la région 3’ non traduite (3’UTR) de l’ARN génomique. Cependant le mécanisme de cette activité chaperonne ainsi que l’interaction entre la protéine Core et différents oligonucléotides de la partie 3’ de l’ARN restent inconnus. Dans ce but, nous avons utilisé différentes approches de fluorescence et la résonance plasmonique de surface. Ainsi, en utilisant le peptide D1, correspondant à un fragment de la protéine core, ainsi que plusieurs dérivés de ce peptide nous avons caractérisé les paramètres de l’interaction et montré que la protéine core se lie spécifiquement aux oligonucléotides en tige-boucle de la partie 3’. Ensuite, nous avons suivi la conformation de ces oligonucléotides et montré que la protéine core n’est pas capable de déstabiliser leur structure secondaire. Enfin, nous avons décrit au niveau moléculaire le mécanisme permettant à la protéine core d’hybrider des oligonucléotides complémentaires et montré que la cinétique d’hybridation repose sur une réaction à deux étapes impliquant un contact boucle-boucle. Ce travail devrait nous permettre de mieux comprendre le rôle de la protéine core lors de l’encapsidation et la transcription de l’ARN et notamment dans les mécanismes de recombinaison expliquant les variations génétiques du virusOpen reading frame (ORF) of 9. 6kb HCV genomic RNA encodes at least 10 proteins, 4 structural and 6 non-structural, during translation process. The core is one of those 4 structural proteins and considered as a multifunctional chaperone involving in several viral processes like cell proliferation, differentiation, RNA packaging, nucleocapsid formation and recombinant genetic variability. With the virtue of its chaperone properties, Domain D1 dimerises the 3’ untranslated region (3’ UTR) of the genomic RNA. However, the mechanism of the core chaperone activity in the dimerisation of the genomic RNA and in binding with its target nucleic acids are still unknown and were investigated in this present project. To reach this objective, we used fluorescence and surface plasmon resonance (SPR) techniques. By using the native D1 domain and peptides derived from this domain, we first characterized the binding parameters and the conformational changes associated with the binding of these peptides to the native and mutated sequences from HCV 3’ UTR sequences. Next, we investigated the destabilization of model and HCV ODNs secondary structure by the D1 domain and its mutants and found that core peptides only marginally destabilise the secondary structures of ODNs. In a last step, we described the molecular mechanisms of the core chaperone properties based on the hybridization kinetics of various HCV and model oligonucleotides. These chaperone properties of core are thought to intervene in processes like the encapsidation, the synthesis of the complementary strand of the genomic RNA and the recombination mechanisms participating to the genetic variability of the virus
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Collet, Axelle. "Caractérisation des enzymes de formation de la coiffe du virus du Nil Occidental et du métapneumovirus humain." Thesis, Aix-Marseille, 2015. http://www.theses.fr/2015AIXM4087.
Full textAbstract:
Ma thèse a porté sur l’étude des activités enzymatiques impliquées dans la formation de la coiffe de deux virus à ARN: le virus du Nil Occidental (WNV) et le métapneumovirus humain (hMPV). Ces virus codent pour des enzymes assurant l’ajout de la coiffe de type-1 (m7GpppN2’Om) à l’extrémité 5’ de leur ARNm.Le domaine N-terminal de la protéine NS5 (NS5MTase) du WNV porte les activités N7- et 2’O-méthyltransférases (N7- et 2’O-MTases) et il a été proposé que NS5MTase puisse également porter l’activité guanylyltransférase (GTase). J’ai identifié in vitro des résidus clés impliqués dans l’interaction entre NS5MTase et des ARN substrats de chaque activité MTase. Nos résultats démontrent que le site de fixation de la coiffe est nécessaire lors de la 2’O-méthylation et ne l’est pas pour la N7-méthylation. En parallèle, j’ai recherché des résidus catalytiques de la GTase par la méthode de génétique inverse. Des résultats préliminaires indiquent que la mutation K29A induit un défaut de réplication. Ce résidu pourrait donc être impliqué dans l’activité GTase de NS5MTase.Concernant hMPV, j’ai effectué une analyse fonctionnelle du domaine CR-VI+ de la protéine L. J’ai démontré que CR-VI+ possède les activités N7- et 2’O-MTases et j’ai identifié les résidus impliqués dans le recrutement de l’ARNm. L’ordre de méthylation est non canonique avec la 2’O-méthylation qui précède la N7-méthylation. Enfin, j’ai également démontré que CR-VI+ possède une activité d’hydrolyse du GTP.Ce travail démontre que ces MTases possèdent 2 voire 3 des activités enzymatiques nécessaires à la formation de la coiffe, et représentent donc une cible de choix pour le développement d’inhibiteursMy PhD project is focus on the study of the enzymatic activities involved in the RNA capping pathway of two RNA viruses: the West Nile Virus (WNV) and the human metapneumovirus (hMPV). These viruses encode for enzymes allowing the addition of a cap-1 structure (m7GpppN2’Om) to their mRNA 5’ ends. The NS5 N-terminal domain (NS5MTase) of WNV harbours the N7- and 2’O-methyltransferase activities (N7- and 2’O-MTase); and it has been proposed that NS5MTase also bears a guanylyltransferase activity (GTase). I have identified residues involved in the NS5MTase interaction sites with their RNAs substrate. My assays demonstrate the importance of the cap-binding site for the 2’O-methylation but not for the N7-methylation. In parallel, I have tried to identify putative catalytic residues of the GTase activity by reverse genetics. Preliminary results suggest that NS5MTase K29 could be a catalytic residue.Concerning hMPV, I performed a functional analysis of CR-VI+ domain of the protein L. I demonstrated that the CR-VI+ domain harbours the N7- and 2’O-MTase activities and identified the residues involved in the mRNA recruitment. I showed that the methylation order is not canonical with the 2’O-methylation preceding the N7-methylation. Finally, I showed that the domain harbours an additional GTP hydrolysis activity, representing the first step of RNA cap formation for Mononegavirales.This work demonstrates that this MTase domains harbour 2 or 3 of the enzymatic activities required for viral RNA cap synthesis and represent attractive targets for the development of antivirals
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Lopes, Anne. "Evolution dirigée de deux aminoacyl-ARNt synthétases : Mise en place et applications d'une méthode de 'protein design'." Phd thesis, Ecole Polytechnique X, 2008. http://pastel.archives-ouvertes.fr/pastel-00003713.
Full textAbstract:
La conception des protéines ou ‘protein design' a pour but de développer des protéines possédant de nouvelles caractéristiques structurales et/ou fonctionnelles. Le principe consiste à identifier parmi toutes les séquences compatibles avec le repliement d'intérêt, celles qui vont conférer à la protéine, la fonction désirée. La procédure générale est réalisée en deux étapes. La première consiste à calculer une matrice d'énergie contenant les énergies d'interactions entre toutes les paires de résidus de la protéine en autorisant successivement tous les types d'acides aminés dans toutes leurs conformations possibles. La seconde étape, ou ‘phase d'optimisation', consiste à explorer simultanément l'espace des séquences et des conformations afin de déterminer la combinaison optimale d'acides aminés étant donné le repliement de départ. Ensuite, différents filtres peuvent être appliqués pour sélectionner les séquences fonctionnelles (étant donné le repliement d'intérêt) des non fonctionnelles. La première étape a consisté au développement de la procédure de ‘protein design', en particulier, à la mise en place et à l'optimisation de la fonction d'énergie ainsi qu'à l'implémentation de l'algorithme d'optimisation. Nous avons montré que notre procédure est robuste puisqu'elle a fait ses preuves dans des applications très diverses telles que la prédiction de l'orientation des chaînes latérales, la prédiction des changements de stabilité ou d'affinité associés à des mutations ponctuelles, ou encore la production de séquences de type natif pour un jeu de protéines globulaires. Pour l'ensemble de ces applications, la qualité des résultats obtenus est comparable à celle observée chez d'autres groupes. Ensuite, nous avons appliqué notre procédure à des systèmes plus complexes tels que les systèmes protéine:ligand. Nous nous sommes intéressés à l'aspartyl-ARNt synthétase (AspRS) et l'asparaginyl-ARNt synthétase (AsnRS). Ces enzymes jouent un rôle crucial dans la traduction du code génétique. Les synthétases fixent leur acide aminé spécifique sur leur ARNt correspondant établissant ainsi l'intégrité du code génétique. Tout d'abord nous avons réalisé le ‘design' des sites actifs d'AspRS et d'AsnRS en présence de leur ligand natif et non natif afin d'évaluer les performances de notre procédure. La qualité des séquences prédites est comparable à celle observée pour les protéines globulaires entières. Par ailleurs, nous avons montré que notre procédure était sensible à la nature du ligand présent dans la poche. Enfin, nous avons réalisé le ‘design' d'un nombre limité de positions dans le site actif de l'AsnRS de façon à ce qu'elle lie préférentiellement l'aspartate au détriment de l'asparagine. Un jeu de mutants prometteurs fut retenu. Leur stabilité et affinité pour les ligands natifs et non natifs est actuellement analysé par des simulations de dynamique moléculaire.
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BERAUD, DUFOUR SOPHIE. "Mecanisme d'activation de la protein g, arf1 : role coordonne des membranes lipidiques et du facteur d'echange, arno." Nice, 1999. http://www.theses.fr/1999NICE5305.
Full textAbstract:
Arf1 est une petite proteine g impliquee dans le transport vesiculaire. Comme toutes les proteines g, elle existe sous 2 etats conformationnels differents : un etat inactif lie au gdp et un etat actif lie au gtp. Nous avons confirme qu'arf1 g d p interagit faiblement avec les membranes via des interactions electrostatiques et l'insertion de son myristate dans la bicouche lipidique. Nous avons montre qu'arf1 g t p est fortement lie aux membranes grace a l'insertion de son myristate et de residus de l'helice n-terminale, suite a la bascule de celle-ci. L'echange gdp-gtp d'arf1 est fortement active par le domaine sec7 du facteur d'echange nucleotidique arno. Arno possede egalement un domaine coiled-coil et un domaine ph, responsable de son recrutement a la membrane. L'interaction entre ces deux proteines a ete etudiee en solution en utilisant le domaine sec7 d'arno et une proteine arf1 tronquee de son helice, arf117. La resolution de la structure et des etudes de mutagenese nous ont permis de montrer que la gorge hydrophobe d'arno-sec7 est le siege de l'interaction avec arf1. Nous avons decouvert, grace a des mesures d'activite et des experiences de gel filtration, les sites d'interaction d'arf1 avec arno-sec7 : l'insertion de la region switch i d'arf1 dans la gorge hydrophobe du domaine sec7 et la formation d'une paire ionique entre la lysine 73 de la region switch ii d'arf1 et l'aspartate 183 de la gorge du domaine sec7. Nous avons egalement montre que le glutamate 156 du domaine sec7 est essentiel a la catalyse de l'echange nucleotidique car il vient destabiliser le magnesium et le phosphate du nucleotide. Nous avons donc appele ce residu le glutamic finger. Puis nous avons suivi la bascule de l'helice n-terminale suite a l'interaction d'arf1 avec arno-sec7 ce qui nous a permis de degager un modele dans lequel l'helice d'arf1 a bascule avant l'interaction avec arno-sec7 et ou arno-sec7 vient empecher la rebascule de l'helice.
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Ducongé, Frédéric. "Sélection in vitro d'aptamères ARN pouvant interagir avec la structure ARN TAR du VIH-1." Bordeaux 2, 1999. http://www.theses.fr/1999BOR28671.
Full text
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Ribeiro, Diogo. "Discovery of the role of protein-RNA interactions in protein multifunctionality and cellular complexity." Thesis, Aix-Marseille, 2018. http://www.theses.fr/2018AIXM0449/document.
Full textAbstract:
Au fil du temps, la vie a évolué pour produire des organismes remarquablement complexes. Pour faire face à cette complexité, les organismes ont développé une pléthore de mécanismes régulateurs. Par exemple, les mammifères transcrivent des milliers d'ARN longs non codants (ARNlnc), accroissant ainsi la capacité régulatrice de leurs cellules. Un concept émergent est que les ARNlnc peuvent servir d'échafaudages aux complexes protéiques, mais la prévalence de ce mécanisme n'a pas encore été démontrée. De plus, pour chaque ARN messager, plusieurs régions 3’ non traduites (3’UTRs) sont souvent présentes. Ces 3’UTRs pourraient réguler la fonction de la protéine en cours de traduction, en participant à la formation des complexes protéiques dans lesquels elle est impliquée. Néanmoins, la fréquence et l’importance ce mécanisme reste à aborder.Cette thèse a pour objectif de découvrir et comprendre systématiquement ces deux mécanismes de régulation méconnus. Concrètement, l'assemblage de complexes protéiques promus par les ARNlnc et les 3'UTRs est étudié avec des données d’interactions protéines-protéines et protéines-ARN à grande échelle. Ceci a permis (i) de prédire le rôle de plusieurs centaines d'ARNlnc comme molécules d'échafaudage pour plus de la moitié des complexes protéiques connus, ainsi que (ii) d’inférer plus d’un millier de complexes 3'UTR-protéines, dont certains cas pourraient réguler post-traductionnellement des protéines moonlighting aux fonctions multiples et distinctes. Ces résultats indiquent qu'une proportion élevée d'ARNlnc et de 3'UTRs pourrait réguler la fonction des protéines en augmentant ainsi la complexité du vivantOver time, life has evolved to produce remarkably complex organisms. To cope with this complexity, organisms have evolved a plethora of regulatory mechanisms. For instance, thousands of long non-coding RNAs (lncRNAs) are transcribed by mammalian genomes, presumably expanding their regulatory capacity. An emerging concept is that lncRNAs can serve as protein scaffolds, bringing proteins in proximity, but the prevalence of this mechanism is yet to be demonstrated. In addition, for every messenger RNA encoding a protein, regulatory 3’ untranslated regions (3’UTRs) are also present. Recently, 3’UTRs were shown to form protein complexes during translation, affecting the function of the protein under synthesis. However, the extent and importance of these 3’UTR-protein complexes in cells remains to be assessed.This thesis aims to systematically discover and provide insights into two ill-known regulatory mechanisms involving the non-coding portion of the human transcriptome. Concretely, the assembly of protein complexes promoted by lncRNAs and 3’UTRs is investigated using large-scale datasets of protein-protein and protein-RNA interactions. This enabled to (i) predict hundreds of lncRNAs as possible scaffolding molecules for more than half of the known protein complexes, as well as (ii) infer more than a thousand distinct 3’UTR-protein complexes, including cases likely to post-translationally regulate moonlighting proteins, proteins that perform multiple unrelated functions. These results indicate that a high proportion of lncRNAs and 3’UTRs may be employed in regulating protein function, potentially playing a role both as regulators and as components of complexity
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Cid, Samper Fernando 1991. "Computational approaches to characterize RNP granules." Doctoral thesis, Universitat Pompeu Fabra, 2020. http://hdl.handle.net/10803/668449.
Full textAbstract:
Ribonucleoprotein granules (RNP granules) are liquid-liquid phase separated
complexes composed mainly by proteins and RNA. They are responsible of many
processes involved in RNA regulation. Alterations in the dynamics of these proteinRNA complexes are associated with the appearance of several neurodegenerative
disorders such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ALS or Fragile X Tremor Ataxia
Syndrome FXTAS. Yet, many aspects of their organization as well as the specific
roles of the RNA on the formation and function of these complexes are still unknown.
In order to study RNP granules structure and formation, we integrated several state of
the art high-throughput datasets. This includes protein and RNA composition obtained
from RNP pull-downs, protein-RNA interaction data from eCLIP experiments and
transcriptome-wide secondary structure information (produced by PARS). We used
network analysis and clustering algorithms to understand the fundamental properties
of granule RNAs. By integrating these properties, we produced a model to identify
scaffolding RNA. Scaffolding RNAs are able to recruit many protein components into
RNP granules. We found that the main protein components of stress granules (a kind
of RNP granules) are connected through protein-RNA interactions. We also analyzed
the contribution of RNA-RNA interactions and RNA post-transcriptional
modifications on the granule internal organization.
We applied these findings to understand the biochemical pathophysiology of FXTAS
disease, employing as well some novel experimental data. In FXTAS, a mutation on
the FMR1 gene produces a 5´microsatellite repetition that enhances its scaffolding
ability. This mutated mRNA is able to sequester some important proteins into nuclear
RNP granules, such as TRA2A (i.e. a splicing factor), impeding their normal function
and therefore producing some symptoms associated with the progress of the disease.
The better understanding of the principles governing granules formation and structure
will enable to develop novel therapies (e.g. aptamers) to mitigate the development of
several neurodegenerative diseases.Los gránulos ribonucleoproteicos (gránulos RNP, por sus siglas en inglés) son complejos producidos mediante separación líquido-líquido y están constituidos principalmente por proteínas y ARN. Son responsables de numerosos procesos involucrados con la regulación del ARN. Alteraciones en la dinámica de estos complejos de proteínas y ARN están asociadas con la aparición de diversas enfermedades neurodegenerativas como el ELA o FXTAS. Sin embargo, todavía se desconocen muchos aspectos relativos a su organización interna así como las contribuciones específicas del RNA en la formación y funcionamiento de estos complejos. A fin de estudiar la estructura y formación de los gránulos RNP, hemos integrado varias bases de datos de alto rendimiento de reciente aparición. Esto incluye datos sobre la composición proteica y en ARN de los RNP, sobre la interacción de proteínas y ARN extraída de experimentos de eCLIP y sobre la estructura secundaria del transcriptoma (producida mediante PARS). Todos estos datos han sido procesados para comprender las propiedades fundamentales de los ARNs que integran los gránulos, mediante el empleo de métodos computacionales como el análisis de redes o algoritmos de agrupamiento. De esta manera, hemos producido un modelo que integra varias de estas propiedades e identifica candidatos denominados ARNs de andamiaje. Definimos ARNs de andamiaje como moléculas de ARN con una alta propensión a formar gránulos y reclutar un gran número de componentes proteicos a los gránulos RNP. También hemos encontrado que las interacciones proteína-ARN conectan los principales componentes proteicos de consenso de los gránulos de estrés (un tipo específico de gránulos RNP). También hemos estudiado la contribución de las interacciones ARN-ARN y las modificaciones post-transcriptionales del RNA en la organización interna del gránulo. Hemos aplicado estos resultados para la comprensión de la fisiopatología molecular de FXTAS, empleando también algunos datos experimentales originales. En FXTAS, una mutación en el gen FMR1 produce una repetición de microsatélite en 5´ que incrementa su capacidad como ARN de andamiaje. Este mARN mutado es capaz de secuestrar algunas proteínas importantes como TRA2A (un factor de ayuste alternativo) en gránulos RNP nucleares, impidiendo su normal funcionamiento y por consiguiente produciendo algunos síntomas asociados con el progreso de la enfermedad. Una mejor comprensión de los principios que gobiernan la formación y estructura de los gránulos puede permitir desarrollar nuevas terapias (ej: aptámeros) para mitigar el desarrollo de diversas enfermedades neurodegenerativas.
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Orelle, Béatrice. "Pancreatitis associated protein (PAP) : clonage, séquençage et expression de l'ARN messager chez le rat et l'homme." Lyon 1, 1991. http://www.theses.fr/1991LYO10069.
Full textAbstract:
La pancreatitis associated protein ou pap est une proteine secretoire mise en evidence au cours de la pancreatite aigue experimentale chez le rat. Le clonage et le sequencage de son adnc ont permis de mieux caracteriser sa structure et d'etudier l'expression de son gene. Cette expression est tres faible dans le pancreas sain et augmente considerablement (environ 300 fois) au cours de l'inflammation, alors que celle des enzymes digestives diminue. L'adnc de la pap de rat nous a permis de cloner l'adnc de la pap humaine. La sequence en acide amine deduite de la proteine presente 69% d'homologie avec la pap de rat. L'expression du gene de la pap humaine est tres importante lors d'une pancreatite necro-hemorrhagique severe. Son expression est beaucoup plus faible dans les pancreatites obstructives et chroniques, et reste indetectable chez les individus sains, dans les adenocarcinomes du pancreas et dans les tumeurs endocrines. L'expression de la pap semble correlee avec la reponse a l'inflammation. Son induction possede les caracteristiques de l'expression des proteines de stress dans d'autres tissus: elle est rapide, intense et transitoire. La pap pourrait donc etre un marqueur specifique de l'inflammation pancreatique. Son role est pour l'instant inconnu. L'analogie structurale de la pap avec les lectines de types c, calcium dependantes, suggere cependant que la proteine agirait en se fixant a un sucre specifique
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Cirillo, Davide. "Prediction of protein and nucleic acid interactions." Doctoral thesis, Universitat Pompeu Fabra, 2016. http://hdl.handle.net/10803/403537.
Full textAbstract:
The purpose of my doctoral studies has been the development of bioinformatics methods to quantitatively evaluate associations between proteins and nucleic acids (NAs). This thesis aims at providing insights into molecular features and still relatively unknown mechanisms of protein-NAs associations, such as RNA-binding proteins and long noncoding RNAs as well as transcription factors and regulatory DNA elements. In this work, I present two algorithms, catRAPID omics express and PAnDA, for the prediction of RNA- and DNA-protein interaction respectively. Those computational methods offer the possibility to address experimental problems and guide new approaches largely facilitating experimental design and proceduresMis estudios de doctorado han tenido como propósito principal el desarrollo de herramientas bioinformáticas para la evaluación de interacciones entre proteínas y ácidos nucleicos (ANs) de forma cuantitativa. Por consiguiente, esta tesis apunta a proporcionar conocimientos sobre características moleculares y mecanismos de asociación proteína-AN aún relativamente desconocidos; concretamente, la asociación de proteínas a ARNs y ARNs no codificantes, a la vez que factores de transcripción y elementos de regulación del ADN. En este proyecto presento dos algoritmos: catRAPIDomics express y PAnDA, cuyas finalidades son las de predecir interacciones proteína-ARN y proteína-ADN respectivamente. Dichos métodos computacionales ofrecen la posibilidad de abordar problemas experimentales, así como de guiar el diseño y procedimiento de nuevas estrategias para su resolución.
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Bourdeau-Julien, Isabelle. "ALS-associated RNA-binding protein FUS and mRNA translation regulation." Master's thesis, Université Laval, 2020. http://hdl.handle.net/20.500.11794/68742.
Full textAbstract:
Des mutations dans plusieurs gènes ont été liés à la sclérose latérale amyotrophique (SLA),en particulier dans celui codant pour la protéine Fused in Sarcoma (FUS). Les mutations sont retrouvées dans la partie codant pour le signal de localisation nucléaire, rendant la protéine anormalement abondante dans le cytoplasme. Combiné à d’autres observations, ça suggère qu’un gain de fonction toxique de FUS dans le cytoplasme serait à l’origine de la neurodégénérescence. La SLA est une maladie neurodégénérative qui affecte les neurones moteurs et cause une paralysie progressive. Les mécanismes moléculaires causant la maladies ont toujours inconnus. Une des pistes serait la perturbation de la traduction locale desARNm, qui permet aux synapses de répondre rapidement et indépendamment du corps cellulaire. Une traduction locale insuffisante pour soutenir l’activité synaptique à long terme mènerait à la perte des synapses et à la neurodégénérescence. Mon objectif est donc de déterminer le rôle de FUS dans régulation de la traduction des ARNm en caractérisant son interaction avec les composantes traductionnelles et d’évaluer sa fonction dans une condition reproduisant les caractéristiques de la SLA. J’ai montré que FUS s’associe aux polyribosomes inactifs, ce qui suggère que FUS jouerait un rôle dans la régulation de la traduction des ARNm en interagissant avec le cœur de la traduction. Il est également possible d’observer une augmentation de la présence de FUS dans le cytoplasme et de son interaction avec les polyribosomes suite à une inhibition de la traduction par mTOR, suggérant son rôle de régulateur négatif. De plus, les mutations liées à la SLA amplifient la fonction inhibitrice de FUS en rendant FUS cytoplasmique et en réduisant la synthèse des protéines. Mes résultats montrent que la protéine FUS aurait un rôle d’inhibiteur de la traduction quand celle-ci est cytoplasmique. Par conséquent, l’augmentation de la présence de FUS dans le cytoplasme dans la SLA entrainerait une inhibition de la traduction importante, à un niveau insuffisant pour soutenir l’activité synaptique.Mutations in several genes have been linked to amyotrophic lateral sclerosis (ALS),particularly in the gene coding for the Fused in Sarcoma protein (FUS). Those mutations are found in the part encoding for the nuclear localization signal, making the protein abnormallyabundant in the cytoplasm. Combined with other observations, it suggests that a toxic gainof function of FUS in the cytoplasm would be the cause of the neurodegeneration. ALS is a neurodegenerative disease that affects motor neurons and causes progressive paralysis. The molecular mechanisms causing the disease are still unknown. One of the hypotheses is the disruption of local translation of mRNAs, which allows synapses to respond quickly and independently from the cell body. Insufficient local translation to support long-term synapticactivity would lead to synaptic loss and neurodegeneration. Thereby, the objective of mystudy is to determine the role of FUS in the regulation of mRNA translation by characterizing its interaction with translational components and evaluate its function in an ALS-linked condition. I have shown that FUS is associated with stalled polyribosomes, which suggests that it plays a role in regulating mRNA translation by interacting with the core of translation.There is also an increase in the presence of FUS in the cytoplasm and in its interaction with polyribosomes following inhibition of translation through mTOR, suggesting its role as anegative regulator. In addition, ALS-related mutations amplify FUS inhibitory function bymaking FUS cytoplasmic and reducing protein synthesis. My results show that the FUSprotein would have a role as a translation inhibitor when it is cytoplasmic. There fore, increasing the presence of FUS in the cytoplasm in ALS would result in significant translation inhibition, at a level insufficient to support synaptic activity.
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Kapps, Delphine. "Rôle de l'import des ARN de transfert de l'hôte dans le développement Plasmodium." Thesis, Strasbourg, 2016. http://www.theses.fr/2016STRAJ054/document.
Full textAbstract:
La protéine tRip de Plasmodium, l’agent du paludisme, fait l’objet de mon travail de thèse. Identifiée au laboratoire, elle est localisée à la membrane plasmique de P. berghei, le modèle murin étudié in vivo. Elle permet l’import d’ARNt exogènes à l’intérieur du parasite. La génération et l’étude d’une souche P. berghei tRip-KO m’ont permis d’explorer l’importance de ce mécanisme et l’implication de tRip dans un complexe multiprotéique. J’ai démontré que la multiplication de P. berghei est très réduite lors du stade sanguin chez la souche tRip-KO. Par protéomique, j’ai montré qu’en l’absence de tRip, de nombreuses protéines sont sous-exprimées, en particulier celles riches en asparagines. Enfin, j’ai identifié trois partenaires protéiques de tRip, dont le substrat est l’ARNt. Ces résultats suggèrent que les ARNt importés par Plasmodium via tRip pourraient être substrat de protéines plasmodiales et acteurs de la synthèse protéique du parasite. Le transport d’ARNt étrangers dans une cellule est un mécanisme inconnu en dehors de cette étude. Il révèle une interaction inédite entre un hôte et son parasite intracellulaire, propice au développement de ce dernierThe organism studied in this work is Plasmodium, the malaria parasite. The laboratory identified a membrane protein, called tRip for tRNA import protein, displaying a tRNA binding domain exposed outside of the parasite. In vivo, in P. berghei which is the murine model used, tRip mediates the import of exogenous tRNAs into the parasite cytosol. My PhD work begun with the construction of a tRip-KO strain of P. berghei to investigate the role of tRNA import and the putative involvement of tRip within a proteic complex. The phenotype of the tRip-KO strain is significantly modified compared to the wild-type parasite during the blood stage: its rate of multiplication is much lower. By proteomic analyses, I showed that many proteins are under-regulated in the tRip-KO strain, especially those very rich in asparagines. Moreover, I dentified three protein partners for tRip, being tRNA aminoacylation or modification enzymes. These results suggest that host imported tRNAs could be taken in charge by parasitic enzymes and take part to Plasmodium protein synthesis. This work reveals a new host pathogen interaction and is the first example showing exogenous tRNA import into a cell
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Pérez, Cano Laura. "Structural prediction and characterization of protein-RNA interactions / Predicción y caracterización estructural de interacciones proteína-ARN." Doctoral thesis, Universitat de Barcelona, 2013. http://hdl.handle.net/10803/120481.
Full textAbstract:
Computational methods are increasingly important to help to predict and characterize protein interactions. However, most of the efforts so far have focused on protein-protein and protein-ligand interactions, and few computer methods are available for modeling and characterizing protein-RNA interactions, in spite of their biological and biomedical importance. Given the difficulties and resource limitations of experimental procedures, developing computer methods for studying protein-RNA interactions is essential in order to get a better understanding of gene expression and cellular function. In this context, the main purpose of this thesis has been the development and application of computational methods for the structural prediction and characterization of protein-RNA complexes.
This Doctoral thesis has fulfilled all the expected objectives. A more detailed summary is given below.
In 2008 it was proposed the first protein-RNA docking case by the CAPRI (Critical Assessment of Prediction of Interactions) communitywide experiment. We devised a new protocol for this new challenge, based on our previous protein-protein docking programs, and obtained excellent results, generating the second best model among all participants. This experiment showed for the first time the potential of our new approach and the possibilities for further improvements.
The next step was the extraction of statistical potentials to be applied for protein-RNA docking and interface prediction. For that purpose, we compiled the largest structural set of non-redundant protein-RNA complexes reported so far in order to derive individual and pairwise propensities of ribonucleotides and amino acid residues to be located at the binding interfaces. We found that the most significantly populated residues at protein-RNA interfaces were Arg, Lys and His, while the less favoured were Asp, Glu, Cys, Val, Leu and Ile. On the other hand, we did not observe a significant preference among the four types of ribonucleotides to be at protein-RNA interfaces. In the same line, pairwise propensities showed similar propensity values for the different types of ribonucleotides.
We then developed the OPRA method to identify regions on protein surface with global preference to bind RNA. This method was tested with an independent set of known protein-RNA structures and showed to have a high positive predictive value for the prediction of residues involved in RNA binding. In addition, we found that this method was able to identify RNA-binding proteins.
The next objective was the application of pairwise statistical potentials to the scoring of protein-RNA docking solutions. Unexpectedly, the statistical potentials showed worse predictive success rates than the FTDock scoring function (highly related to structural complementarity), although the results improved when both scoring terms were combined. However, we still needed more test cases in order to extract more reliable and general conclusions.
Therefore, the next objective was to build a benchmark that could be used for the optimization and development of protein-RNA docking methods. For this, we collected as many non-redundant protein-RNA cases as possible with known complex structure and known or modeled structure for at least one of the subunits. This was the first publicly available protein-RNA docking benchmark and was composed of 106 cases, with 71 cases with at least the available unbound coordinates for one of the molecules, and 35 cases in which at least one of the molecules was built by homology modelling. One of the conclusions that emerged from the analysis of this set of structures is that protein-RNA complexes are much more flexible than protein-protein and even protein-DNA complexes.
We then performed a docking study over the full protein-RNA docking benchmark which showed that the use of pairwise statistical potentials for identifying protein-RNA near-native solutions is noisy. The results confirmed that the best docking success determinant is structural interface complementarity as defined by parameters such as the FTDock score or the van der Waals energy. The combination of these efficient terms with electrostatics yields a scoring function that is able to identify high quality models in most of the cases when the bound coordinates of the interacting molecules are used. However, its efficiency in a more realistic scenario (using the unbound coordinates of the molecules) is highly dependent on the capability of sampling methods to generate high quality docking solutions. Results also underlined important differences with protein-protein interactions.
The experience acquired during these more methodological parts of this PhD thesis has facilitated the application of computational methods to the study of translin, a highly conserved nucleic acid-binding protein of significant biomedical interest. By combining computational tools with experimental techniques, we contributed to the elucidation of the translin multimerization interfaces and nucleic acids binding sites and provided a first structural and dynamic picture of the functions carried out by the protein.La caracterización estructural de complejos proteína-ARN es esencial para lograr una mayor comprensión en el campo de la biología molecular y la regulación celular. Los métodos computacionales de predicción estructural representan una alternativa rápida y poco costosa para la detección y caracterización de complejos biológicos. No obstante, en contraste con la gran variedad de métodos computacionales orientados a la predicción estructural de las interacciones proteína-proteína, existen muy pocos métodos enfocados al estudio de complejos proteína-ARN. En este contexto, el propósito principal de este proyecto de tesis ha sido el desarrollo y aplicación de métodos computacionales para el análisis, caracterización y predicción estructural de complejos proteína-ARN. Con este objetivo, en la primera fase de esta tesis doctoral, se han desarrollado nuevos protocolos para la predicción estructural de este tipo de complejos a partir de métodos de docking entre proteínas previamente descritos, y se han generado potenciales estadísticos por residuo, nucleótido y por pares residuo-nucleótido a partir de estructuras conocidas de complejos proteína-ARN. Dichos potenciales estadísticos por residuo se han aplicado al desarrollo de un método para la predicción de sitios de unión a ARN en proteínas y la identificación de proteínas que unen ARN. Por otro lado, se ha construido un conjunto de pruebas de complejos proteína-ARN para la evaluación de métodos de docking. Usando dicho conjunto de pruebas, se ha estudiado el poder predictivo de los potenciales estadísticos de pares residuo-nucleótido, así como otros términos energéticos, para la evaluación de soluciones de docking de complejos proteína-ARN y se ha desarrollado una nueva función de evaluación de posibles orientaciones de docking en complejos proteína-ARN, integrando aquellos términos energéticos más efectivos a nivel individual. La experiencia acumulada durante las fases iniciales de la tesis permitió la aplicación de técnicas de modelado computacional, en combinación con técnicas experimentales llevadas a cabo por colaboradores, al estudio de translin, una proteína de unión a ácidos nucleicos de gran interés biológico. Así pues, durante la fase final de este proyecto de tesis doctoral se contribuyó a la identificación de los sitios de multimerización y de unión a ácidos nucleicos en translin, y se propuso una primera aproximación estructural y dinámica de las funciones llevadas a cabo por la proteína, contribuyendo a resolver aspectos tan fundamentales como los determinantes estructurales de la unión a ARN.
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Fournier, Cécile. "Caractérisation de la fixation de la protéine NEF du virus HIV-1 à l'ARN et mise en évidence de son rôle dans la rétrotranscription." Montpellier 1, 2000. http://www.theses.fr/2000MON1T015.
Full text
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Hazra, Ditipriya. "Insights into the control of mRNA decay by YTH proteins during the transition from meiosis to mitosis in yeasts." Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2019. http://www.theses.fr/2019SACLX041.
Full textAbstract:
Aperçu du contrôle de la dégradation des ARNm par les protéines YTHpendant la transition de la méiose à la mitose chez les levures.Le cycle cellulaire est contrôlé par des processus complexes et interconnectés. Un gène est transcrit en ARNm qui est traduit en protéines mais de nombreux processus de régulation travaillent pour contrôler chaque étape de ce processus apparemment simple. Parmi ces points de contrôle, la régulation post-transcriptionnelle est importante, et la formation d'un complexe protéine-ARN peut diriger le destin cellulaire. Parmi ces protéines de liaison à l'ARN, les protéines contenant des domaines YTH n’ont été découvertes qu’à la fin des années 90. Les protéines contenant des domaines YTH sont abondantes chez les eucaryotes et absentes chez les procaryotes. Elles constituent la majorité des protéines « readers » capables de reconnaître spécifiquement la modification m6A. L’Homme possède cinq protéines YTH, YTHDF1-3, YTHDC1,2 (Hazra, D., C. Chapat, et Graille, M. (2019). Destin de l'ARNm de m6A : enchaînés au rythme par les protéines contenant de la YTH. , 10 (1), 49.). Bien qu'il soit évident que ces protéines contrôlent le destin cellulaire, la fonction de chaque protéine et son réseau d’interaction restent à élucider. Chez les levures, une seule protéine YTH est présente: Pho92 chez Saccharomyces cerevisiae et Mmi1 chez Schizosaccharomyces pombe. Hormis le domaine YTH, il n'y a pas d'homologie de séquence entre ces deux protéines mais leur fonction cellulaire est similaire.Il est bien établi que Mmi1 est responsable de la dégradation des transcrits spécifiques de la méiose au cours de la croissance végétative des cellules chez la levure S. pombe. Mmi1 forme un complexe stable avec une petite protéine, Erh1 (complexe Erh1-Mmi1 ou EMC). Le complexe EMC peut physiquement interagir avec la sous-unité Not1 du complexe CCR4-Not et la recruter pour la dégradation des ARNm contenant des motifs DSR (déterminant de l'élimination sélective). L'action de Mmi1 est à son tour régulée par une protéine possédant un domaine RRM, Mei2. Au cours de la méiose, Mei2, avec l’aide d’un lncRNA meiRNA, séquestre Mmi1 dans un point nucléaire, le rendant inactif et assurant la continuité de la méiose. Ces trois protéines, Mmi1-Erh1-Mei2, jouent un rôle clé dans la transition de la mitose vers la méiose.Chez S. cerevisiae, Pho92 est impliquée dans la dégradation des transcrits de PHO4, contribuant à la voie du métabolisme du phosphate, pendant la privation en phosphate et participe également à la dégradation des ARNm contenant les marques épitranscriptomiques de N6-méthyladénosine (m6A). Comme pour S. pombe Mmi1, Pho92 recrute le complexe CCR4-Not via une interaction physique avec Not1.Au cours de ma thèse, j'ai tenté d'élucider le rôle de ces deux protéines du domaine YTH de deux organismes modèles, S. cerevisiae et S. pombe, dans la dégradation de l'ARNm et la régulation du cycle cellulaire par des approches biochimiques et structurales.Pho92 de S. cerevisiae interagit physiquement avec Not1 du complexe CCR4-Not, nous avons pu déterminer les limites des domaines impliqués dans cette interaction. L’interaction entre ces deux protéines a été étudiée par anisotropie de fluorescence. Le complexe protéique a été purifié avec succès et des essais de cristallisation sont en cours.Chez S. pombe, la structure de Mei2-RRM3 a été résolue avec et sans ARN. Les propriétés de liaison à l'ARN de Mei2-RRM3 ont été étudiées par ITC. La structure de Erh1 a également été résolue révélant une organisation en homodimere. Nous avons montré que la formation de cet homodimere est important pour la fonction biologique de Mmi1. Des essais de co-cristallisation ont été réalisés avec de l'ARN et les protéines Mmi1 et Mei2, mais sans succès et nous avons obtenu des cristaux de Mmi1Insights into the control of mRNA decay by YTH proteinsduring the transition from meiosis to mitosis in yeasts.Keywords: Epitranscriptomics, mRNA decay, meiosis, multi-protein complexes, YTH domainCell cycle is controlled by multi-layered processes. A gene is transcribed in mRNA which is translated in proteins but innumerable regulation processes are working to control every step of this apparently simple process. Among these regulatory check points, post-transcriptional regulation is an important one, where formation of a protein-RNA complex may direct the cellular fate. Among these RNA binding proteins, YTH domain proteins are most novel, discovered in late 90s. YTH domain proteins are abundant in eukaryotes and absent in prokaryotes. YTH domain proteins constitute the majority of reader proteins that can specifically identify m6A modification. Human beings have five YTH domain proteins YTHDF1-3, YTHDC1-2 (Hazra, D., Chapat, C., & Graille, M. (2019). m6A mRNA Destiny: Chained to the rhYTHm by the YTH-Containing Proteins. Genes, 10(1), 49.). Although it is evident that these proteins are controlling cellular fate, the function of each protein and their network is yet to be elucidated. In yeast, there is only one YTH domain protein present: Pho92 in Saccharomyces cerevisiae and Mmi1 in Schizosaccharomyces pombe. Apart from the YTH domain there is no sequence homology between these two proteins but their cellular function is similar.It is well established that Mmi1 is responsible for degradation of meiosis specific transcripts during vegetative growth of the cell. Mmi1 forms a tight complex with a small protein, Erh1 (Erh1-Mmi1 complex or EMC). EMC can physically interact with Not1 of CCR4-Not complex and recruit it for degradation of DSR (determinant of selective removal) containing RNAs. The action of Mmi1 is in turn regulated by an RRM domain protein, Mei2. During meiosis, Mei2, along with a lncRNA meiRNA sequesters Mmi1 in a nuclear dot, rendering it inactive and ensuring smooth continuance of meiosis. These three proteins, Mmi1-Erh1-Mei2 play a key role in mitosis to meiosis switch.In S. cerevisiae, Pho92 is involved in the degradation of PHO4 transcripts contributing to phosphate metabolism pathway, during phosphate starvation and also participates in the degradation of mRNAs containing the N6-methyladenosine (m6A) epitranscriptomics marks. Similarly, to S. pombe Mmi1, Pho92 recruits CCR4-Not complex by physical interaction with Not1.During my PhD, I have tried to elucidate the role of these two YTH domain proteins from two model organisms, S. cerevisiae and S. pombe, in mRNA degradation and cell cycle regulation using biochemical and structural approaches.Pho92 of S. cerevisiae physically interacts with Not1 of CCR4-Not complex, we were able to determine the boundaries of this interaction. The interaction between these two proteins was studied by Fluorescence anisotropy. The protein complex was successfully purified and crystallization trials are ongoing.From S. pombe, structure of Mei2-RRM3 was solved with and without an RNA. RNA binding properties of Mei2-RRM3 was studied by ITC. The structure of Erh1 was also solved and we tried to elucidate its importance for biological function of Mmi1. A co-crystallization trial was performed with Mmi1-Mei2-RNA but it was unsuccessful and we ended up with Mmi1 crystals
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Bisaglia, Marco. "Etude fonctionnelle et structurale de deux protéines impliquées dans le métabolisme des ARN messagers." Palaiseau, Ecole polytechnique, 2002. http://www.theses.fr/2002EPXX0018.
Full text
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Khoury, Georges. "Étude des mécanismes moléculaires régulant l'expression de la protéine TAT du virus de l'immunodéficience humaine, au niveau de la production de ses ARN messagers et de leur traduction." Thesis, Université de Lorraine, 2012. http://www.theses.fr/2012LORR0251.
Full textAbstract:
La protéine Tat du VIH-1 est essentielle à la multiplication virale. Elle permet la transactivation de la transcription et, par ses propriétés apoptotiques, elle participe à la pathologie SIDA. D'où l'importance d'étudier les mécanismes régulant sa production. L'épissage alternatif de l'ARN du VIH-1, en particulier, l'utilisation des sites accepteurs d'épissage A3 et A7 est nécessaire pour la production des ARNm tat. L'utilisation du site A3 est fortement régulée par des éléments agissant en cis contenus dans une structure tige-boucle SLS3A3 située en aval du site A3. En purifiant les complexes RNP formés en extrait nucléaire sur un segment de l'ARN viral renfermant le site A3, et en analysant par spectrométrie de masse les protéines contenues dans ces complexes, nous avons pu mettre en évidence la fixation d'une protéine inhibitrice de l'utilisation du site A3, la protéine DAZAP1. Sur la base d'un ensemble de données antérieures du laboratoire et de nouvelles données que j'ai obtenues, nous avons montré que la protéine SRSF7, sans doute en synergie avec SRSF1, limite la fixation de DAZAP1 et active l'épissage au site A3. Nous avons aussi montré que la protéine virale Tat exerce un rétro-contrôle négatif au niveau de la production de l?ARNm tat, ceci en limitant l'activation du site A3 par SRSF7. La partie apicale de la structure tige-boucle SLS3A3 (motif B) est très conservée dans les souches de VIH-1. L'équipe d'E Guittet a déterminé sa structure 3D par RMN. La conformation de sa boucle terminale est caractéristique des structures tige-boucle reconnues par les protéines à domaines dsRBD (double stranded RNA Binding Domain). J'ai pu confirmer cette hypothèse en purifiant les complexes formés par le motif B en extrait nucléaire. Nous avons ainsi pu montrer que la protéine kinase PKR, qui joue chez l'Homme un rôle majeur dans la réponse à une infection virale, est un partenaire du motif B. Par utilisation de sondes chimiques de la structure 2D de l'ARN, j'ai pu montrer que la structure tige-boucle SLS3A3, contenant le codon d'initiation de l'ORF Tat, est présente dans l'ARNm tat1. Nous avons alors développé un système visant à étudier les mécanismes de régulation de l'initiation de la traduction de la protéine Tat. Par l'emploi d'une construction bicistronique, j'ai pu confirmer l'existence d'une activité IRES dans la région 5'UTRtat1 de l'ARNm tat1 et définir deux segments ayant cette activité. Des résultats préliminaires obtenus avec une construction bicistronique, nous ont permis de commencer à tester l'effet de différentes protéines SR et hnRNP sur l'activité de ces IRESHIV-1 Tat protein is essential for viral replication. It allows the transcription of full-length viral RNAs, and due to its apoptotic properties it contributes to the AIDS disease. Hence, it is important to study the mechanisms regulating its production. Alternative splicing of the HIV-1 RNA, in particular, the use of acceptor sites A3 and A7 is required for tat mRNA production. Splicing at site A3 is highly regulated by cis-acting elements contained in a stem-loop structure SLS3A3, located downstream from site A3. By purifying RNP complexes formed in nuclear extract on a segment of the viral RNA containing site A3 followed by mass spectrometry analysis, we were able to highlight the binding of a new inhibitory protein, DAZAP1. Based on a set of ancient laboratory data and new results that I obtained, we have shown that SRSF7 protein, probably in synergy with SRSF1, limits the binding of DAZAP1 and splicing activation at site A3. We also showed that the viral protein Tat exerts a negative feedback control on tat mRNA production by restricting splicing activation of site A3 by SRSF7. The apical part of the stem-loop structure SLS3A3 (B motif) is highly conserved among HIV-1 strains. E Guittet team determined its 3D structure by NMR. The conformation of this apical loop is characteristic of stem-loop structures recognized by dsRBD proteins (double-stranded RNA binding domain). I was able to confirm this hypothesis by purifying RNP complexes formed by the B motif in nuclear extract. Thus, we have shown that the RNA dependent protein kinase (PKR), which plays in humans a major role in response to viral infection, is a partner of the B motif. By using chemical probes specific of the 2D structure of RNAs, I showed that the stem-loop structure SLS3A3 that contains the initiation codon of Tat is present in tat1 mRNA. We then developed a system to study the mechanisms regulating the initiation of translation of Tat protein. By using a bicistronic construct, I was able to confirm the existence of IRES activity in the 5?UTRtat1 region of tat1 mRNA, and define two segments that contain this activity. Preliminary results obtained with a bicistronic construct allowed us to begin testing the effect of different SR and hnRNP proteins on the activity of the IRES
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Rushing, Stacy Renée. "Proteins that interact with and mediate the activity of the aryl hydrocarbon receptor and its partner ARNT /." For electronic version search Digital dissertations database. Restricted to UC campuses. Access is free to UC campus dissertations, 2002. http://uclibs.org/PID/11984.
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Sterz, Kai Raphael [Verfasser], Arnd [Akademischer Betreuer] Kieser, and Bernhard [Akademischer Betreuer] Küster. "A Systematical Analysis of the Signal Transduction Pathways Induced by the Latent Membrane Protein 1 (LMP1) of Epstein-Barr Virus / Kai Raphael Sterz. Gutachter: Bernhard Küster ; Arnd Kieser. Betreuer: Arnd Kieser." München : Universitätsbibliothek der TU München, 2014. http://d-nb.info/1061125955/34.
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Laporte, Philippe. "Rôle des ARN non-codants pour des protéines (npcRNAs) dans la régulation de l'architecture de la racine." Paris 11, 2008. http://www.theses.fr/2008PA112135.
Full textAbstract:
Les plantes font varier l’architecture de leurs racines pour s’adapter aux conditions environnementales. Les Légumineuses forment en outre 2 types d’organes, les racines latérales et les nodosités. Ces dernières fixent l’azote via une interaction mutualiste avec les bactéries Rhizobium. Récemment, des ARN ne codant pas de protéines ont été révélés comme régulateurs du développement, ils incluent des petits ARN (mi/tasiRNA) et des classes d’ARN aux mécanismes d’action inexplorés. Lors de ce travail de Thèse, nous avons exploré le rôle et les mécanismes d’action de npcARN dans l’architecture racinaire chez Medicago truncatula. D’abord, nous avons identifié et caractérisé le précurseur du MIR166, contenant 2 copies en tandem du MIR166 au sein d’une unité transcriptionnelle. La surexpression de ce précurseur dans des racines de M. Truncatula affecte la genèse des tissus vasculaires et des organes latéraux. Deuxièmement, nous avons analysé les partenaires protéiques pouvant interagir avec le npcRNA Enod40, impliqué dans l’organogenèse des nodosités chez M. Truncatula. Ces travaux ont abouti à l’identification d’une famille de peptides, les SNARP (Small Nodulin Acidic RNA-binding Protein). SNARP2 est capable de se lier aux ARN simple brin et une approche fonctionnelle par ARN interférent a révélé un rôle dans la régulation de l’invasion des nodosités par Rhizobium. Finalement, j’ai participé à la recherche de npcARN chez Arabidopsis, et nombre de ces gènes se sont révélés régulés au niveau des racines lors de stress abiotiques. En définitive, ces résultats révèlent de nouveaux rôles des npcRNA et de leurs partenaires protéiques dans le contrôle de l’architecture de la racinePlants are able to modulate their root architecture in order to adapt them to the Abiotic and biotic constraints in soil environment, modifying primary root growth and lateral root organogenesis. Leguminous plants form two types of lateral root organs, lateral roots and nodules. The latter are able to fix nitrogen via the interaction with symbiotic bacteria Rhizobium. In the last years, several non-protein coding RNAs have emerged as new regulators of development, they include small RNAs (mi/tasiRNAs) but also other classes whose mechanisms are unexplored. During this PhD, we explored the role and mechanism of action of npcRNAs in root architecture in Medicago truncatula. First, we identified and characterised the MtMIR166a precursor, containing two tandem copies of MIR166 in a single transcriptional unit. Overexpression of this precursor in M. Truncatula roots affected vascular tissue and both lateral root organogeneses. Secondly, we analysed protein-partners of npcRNA Enod40, a gene involved in M. Truncatula nodule organogenesis. This led to the identification of a novel peptide family, the SNARP genes (for Small Nodulin Acidic RNA-binding Protein). The purified SNARP2 could bind single-stranded RNA and a functional approach based on RNAi revealed a role in the regulation of nodule invasion. The relevance of the Enod40 RNA-SNARP2 interaction was analysed in vitro and in vivo. Finally, I participated in an effort to search for npcRNAs from Arabidopsis thaliana. Several of these novel genes were regulated by abiotic stresses in roots. Altogether, these results contribute to reveal novel roles of npcRNAs and their protein interactors in the control of root architecture
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Schelcher, Cédric. "Détermination du mode d'action et des substrats de RNases P protéiques chez Arabidopsis thaliana." Thesis, Strasbourg, 2017. http://www.theses.fr/2017STRAJ044/document.
Full textAbstract:
L’activité RNase P est l'activité essentielle qui élimine les séquences 5' supplémentaires des précurseurs d'ARN de transfert. "PRORP" (PROteinaceous RNase P) définit une nouvelle catégorie de RNase P uniquement protéique. Avant la caractérisation de PRORP, on pensait que les enzymes RNase P étaient universellement conservées sous forme de ribonucléoprotéines (RNP). La caractérisation de PRORP a révélé une enzyme avec deux domaines principaux, un domaine N-terminal contenant plusieurs motifs PPR et un domaine NYN C-terminal portant l’activité catalytique. Nous avons utilisé une combinaison d'approches biochimiques et biophysiques pour caractériser le complexe PRORP / ARNt. La structure du complexe en solution a été déterminée par diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS) et les Kd des interactions de différents mutants de PRORP avec l’ARNt ont été déterminées par ultracentrifugation analytique. Notre analyse révèle un cas intéressant d'évolution convergente. Il suggère que PRORP a développé un processus de reconnaissance de l'ARN similaire à celui des RNase P RNP. Par ailleurs, nous avons mis en place une approche de co-immunoprécipitation de PRORP avec l’ARN afin de définir le spectre de substrats des RNase P protéiquesRNase P is the essential activity that removes 5'-leader sequences from transfer RNA precursors. “PRORP” (PROteinaceous RNase P) defines a novel category of protein only RNase P. Before the characterization of PRORP, RNase P enzymes were thought to occur universally as ribonucleoproteins (RNP). The characterization of PRORP revealed an enzyme with two main domains, an N-terminal domain containing multiple PPR motifs and a C-terminal NYN domain holding catalytic activity. We used a combination of biochemical and biophysical approaches to characterize the PRORP / tRNA complex. The structure of the complex in solution was determined by small angle X-ray scattering and Kd values of the PRORP / tRNA interaction were determined by analytical ultracentrifugation. We also analyzed direct interaction of a collection of PPR mutants with tRNA in order to determine the relative importance of individual PPR motifs for RNA binding. This reveals to what extent PRORP target recognition process conforms to the mode of action of PPR proteins interacting with linear RNA. Altogether, our analysis reveals an interesting case of convergent evolution. It suggests that PRORP has evolved an RNA recognition process similar to that of RNP RNase P. Moreover, we also implemented a PRORP-RNA co-immunoprecipitation approach to determine the full extent of PRORP substrates