Dissertations / Theses on the topic 'ARN G-Quadruplexes'

Les acides nucléiques riches en guanines ou en cytosines peuvent se replier sur eux-mêmes et former des systèmes tétramériques tels que les G-quadruplexes (G4) ou les i-motifs. Ces motifs, abondamment représentés dans certaines régions du génome humain semblent contribuer à la régulation cellulaire et suscitent depuis plusieurs années un intérêt grandissant. Ils sont notamment présents dans la région télomérique, mais aussi dans les promoteurs d’oncogènes ou au sein des génomes viraux et sont impliqués dans certaines pathologies humaines. Ils représentent ainsi des cibles thérapeutiques et diagnostiques potentielles. Cependant, les G4 adoptent in-vitro des topologies variées qui compliquent le développement de ligands spécifiques et affins. Dans ce contexte, le laboratoire a développé le concept du TASQ pour ‘‘Template Assembled Synthetic G-Quadruplex’’ dans le but d'accéder à des G4 se structurant en une topologie définie.Le premier chapitre décrit l’assemblage de mimes de motifs G4 contraints en une topologie unique. En utilisant un gabarit cyclodécapeptide rigide et différentes méthodes de conjugaison, nous avons assemblé des motifs G4 ARN parallèle et hybride ADN/ARN dérivant de la séquence télomérique ainsi qu’un motif G4 d’ADN présent dans la séquence promotrice du VIH-1. L’utilisation du concept TASQ nous a également permis de préparer un motif G-triplexe (G3), intermédiaire à la formation des motifs G4. Nous avons montré une forte stabilisation de tous les édifices G4 contraints ainsi préparés.Le second chapitre concerne les études de caractérisation et de sélection de ligands vis-à-vis des motifs G4 et G3 contraints. La caractérisation repose sur l’évaluation de l’affinité et de la sélectivité de différentes familles de ligands pour ces édifices, par résonance plasmonique de surface ou par interférométrie bio-couche. La sélection de ligands a été réalisée par la méthode SELEX dans le but d’obtenir des aptamères affins et spécifiques d’un motif G4 contraint
Guanines or cytosines rich nucleic acids can fold into tetrameric G-quadruplexes (G4) or i-motifs structures. G4 motifs are found within the human genome and should contribute to cellular regulation. In particular G4 are found at telomeric region and also in promoters of oncogenes or within viral genomes. They are suspected of participating in the regulation of human pathologies and have therefore been envisioned as potential therapeutic and diagnostic targets. However, the intrinsic conformational polymorphism of G4 motifs complicates the development of specific and affine ligands. In this context, the laboratory has developed the TASQ concept for "Template Assembled Synthetic G-Quadruplex" with the aim to obtain a defined G4 topology.The first chapter reports on the assembly on the peptide template of RNA and DNA:RNA hybrid G4 structures that derive from the human telomeric sequence as well as of DNA G4 structure found within the HIV virus promoter. G-triplex (G3) motif which is supposed to be an intermediate during the formation of the G4 motifs has also been prepared. By using appropriate ligations of the oligonucleotide strands on the peptide template we were able to control the folding of G-quadruplex motifs and stabilize them.The second chapter reports the studies for the characterization and the selection of ligands against G4 and G3 motifs. The evaluation of the affinity and selectivity of different families of ligands for these constrain motifs was performed by using surface plasmon resonance or by bio-layer interferometry. The selection of ligands was carried out by the SELEX method in order to obtain affine and specific aptamers of a constrained G4 motif

Le développement du cancer et la réponse aux traitements sont associés à des variations de la régulation post-transcriptionnelle qui entraîne une modification du protéome qualitativement et/ou quantitativement. La régulation post-transcriptionnelle implique des protéines de liaison à l’ARN (RBP), interagissant avec des éléments cis comme les séquences, les modifications ou les structures de l’ARN. Parmi ces éléments cis, les structures non-canoniques nommées ARN G-Quadruplexes (RG4), et les modifications N6-Méthyladénosines (m6A), jouent un rôle critique dans le modelage post-transcriptionnel guidant l’expression des gènes du cancer, et leur ciblage est actuellement envisagé par des essais pré-cliniques. L’un des défis majeurs de ce champ de recherches repose sur la compréhension des mécanismes contrôlants la sélectivité des sites modifiés en m6A, leur reconnaissance et leur suppression, ainsi que sur l’identification des régulateurs de la structuration des RG4. Pour répondre à ces défis, la colocalisation entre les RG4 et les m6A et leur régulation mutuelle doit encore être étudiée de manière claire. Un autre objectif clé consiste à relier les interactions entre les protéines liant les RG4 dans les transcrits et leurs fonctions biologiques liées au cancer en tirant parti des prédictions de la structuration des RG4 et des données expérimentales sur les RG4 et les RBP. Mon projet de thèse aborde ces deux défis centrés sur la régulation cis- et trans- des RG4, en utilisant des approches multidisciplinaires incluant la bioinformatique, la biologie moléculaire et cellulaire. Pour cartographier et caractériser globalement les régulateurs agissant en trans sur les RG4, nous avons développé QUADRatlas (https://rg4db.cibio.unitn.it), une base de données de RG4 identifiés expérimentalement et prédits par ordinateur dans le transcriptome humain, liés à leurs fonctions biologiques et à leurs associations aux pathologies (Bourdon et al, NAR, 2023). Ce travail offre un accès à un large catalogue construit manuellement de protéines de liaison aux RG4 connues, complété par un vaste ensemble de données de sites de liaison de RBP pour découvrir de nouvelles interactions potentielles RG4-RBP. Notre étude sur l'interaction entre les RG4 et les m6A a révélé leur colocalisation dans le transcriptome codant humain. Nous avons démontré in vitro que la stabilité des RG4 n'était pas inhibée par la présence de m6A. Cependant, nous avons montré que la stabilisation des RG4 diminuait le niveau global de m6A dans les lignées cellulaires cancéreuses. Pour expliquer cet effet, nous avons étudié la capacité des RBP à se lier aux RG4, m6A ou aux RG4 contenant des m6A (RG4(m6A)). Nous avons découvert que les RG4s pouvaient agir comme des plateformes pour les protéines de liaison aux m6A et ainsi réguler leur présence sur les transcrits. Ce travail fournit des informations essentielles sur la régulation mutuelle de deux éléments cis majeurs de l'ARNm par les RBP. De futures analyses seront nécessaires pour découvrir l’effet de la colocalisation RG4(m6A) sur l’expression des gènes du cancer
Cancer development and response to treatments are associated to post-transcriptional rewiring which in turn modifies the cancer proteome qualitatively and/or quantitatively. Post-transcriptional regulation involves RNA binding proteins (RBP) interacting with cis-acting elements like RNA sequences, modifications or structures. Among the cis-regulators, non-canonical structures, called RNA G-Quadruplexes (RG4), and N6-methyladenosines modifications (m6A), play a critical role in shaping post-transcriptional expression of cancer genes and their targeting is currently investigated in pre-clinical studies. One major challenge in the field lies in understanding the mechanisms controlling selectivity in m6A deposition, reading and removal, as well as deciphering RG4 folding and regulators. Whether m6A and RG4 colocalize and regulate each other remains to be fully investigated. Another key challenge is to link RG4-protein interactions in transcripts to cancer-relevant biological functions by leveraging predictions of RG4 structuration and experimental data on RG4 and RBP.My thesis project tackled these two challenges centered on the cis- and trans- regulation of RG4s, using multidisciplinary approaches including bioinformatics, molecular and cellular biology. To globally map and characterize RG4 trans-acting regulators, we developed QUADRatlas (https://rg4db.cibio.unitn.it), a database of experimentally-derived and computationally predicted RG4 in the human transcriptome, linked with their biological function and disease associations (Bourdon et al, NAR, 2023). This work provides a broad access to a manually curated catalogue of known RG4-binding proteins, complemented with an extensive RBP binding sites dataset to discover new potential RG4-RBP interactions. Our study on the interplay between RG4 and m6A revealed their colocalization in the human coding transcriptome. We demonstrated in vitro that RG4 stability was not inhibited by m6A presence. However, we showed that the stabilisation of RG4 decreased global m6A level in cancer cell lines. To explain this effect, we studied the ability of RBP to bind RG4, m6A or RG4 containing m6A (RG4(m6A)) and found that RG4 could act as a platform for m6A binding proteins and thus regulate their presence on transcripts. This work provides insights on the co-regulation of two major mRNA cis-acting elements by RBP. Future analyses will then be needed to unravel the effect of RG4(m6A) colocalization on cancer gene expression

L’objectif de ces travaux de thèse était l’étude des interactions de petites molécules avec les multiples structures de l’ADN quadruplex via i) le développement et l’utilisation d’un test haut-débit pour l’analyse des interactions ligand-ADN quadruplex et le criblage de chimiothèques/ciblothèques et ii) la préparation de composés aux modes d’interactions multiples (empilement/sillon, covalent/non-covalent, etc.), sélectifs (quadruplex vs. duplex et intra-quadruplex) et éventuellement fonctionnalisés (biotine, fluorophore, etc.). La première partie des travaux a été centrée sur le développement du test G4-FID (G-quadruplex Fluorescent Intercalator Displacement) qui est une méthode semi-quantitative permettant l’évaluation de l’affinité et de la sélectivité de petites molécules pour l’ADN quadruplex par déplacement d’une sonde off/on, le Thiazole Orange (TO). Le test a notamment été transposé avec succès de la cuve vers la microplaque (HT-G4-FID). D’autre part, nous avons montré l’intérêt de fluorophores alternatifs, TO-PRO-3 et Hoechst 33258, aux caractéristiques spectrales complémentaires à TO. Cette méthode d’analyse a également été utilisée avec succès pour l’identification de nouveaux ligands sélectifs d’ADN quadruplex et la mise en évidence des relations structure-activité ainsi que des sélectivités structurales. La deuxième partie des travaux a été consacrée à la préparation et à l’étude de nouveaux ligands d’ADN quadruplex. Ces ligands possèdent des particularités, soit dans leur mode d’interaction (sillons, coordination) soit par leur bifonctionnalité (biotinylés, fluorescents). Nous avons ainsi préparé un ligand de quadruplex polyhétéroaryle acyclique (TOxaPy) possédant une sélectivité inattendue pour certaines structures de l’ADN quadruplex. D’autre part, nous avons montré que les complexes de dérivés de terpyridine peuvent être adaptés, en changeant le ligand organique et/ou la nature du métal, de façon à interagir avec l’ADN quadruplex par interaction covalentes et/ou non covalentes
The aim of this thesis work was to study the interactions of small molecules with multiple structures of quadruplex DNA via i) the development and use of a high-throughput test for the analysis of ligand-quadruplex DNA interactions and screening of chemical libraries and ii) the preparation of compounds with multiple binding modes (stacking/groove, covalent/non-covalent, etc..) selective (quadruplex vs. duplex and intra-quadruplex) and possibly functionalized (biotin, fluorophore, etc.). The first part of the work was focused on the development of the G4-FID (G-quadruplex Intercalator Fluorescent Displacement) assay, which is a semi-quantitative method for evaluating the affinity and selectivity of small molecules for quadruplex DNA by displacing an off/on probe, the Thiazole Orange (TO). The test has been implemented successfully with microplate (HT-G4-FID). On the other hand, we have shown the importance of alternative fluorophores, TO-PRO-3 and Hoechst 33258, with complementary spectral characteristics. This method of analysis has also been successfully used for the identification of new selective ligands of quadruplex DNA and the identification of structure-activity relationships and structural selectivities. The second part of the work was devoted to the preparation and study of new DNA quadruplex ligands. These ligands possess particular characteristics either in their mode of interaction (grooves, coordination) or by their bifunctionality (biotinylated, fluorescent). We have prepared an acyclic polyheteroaryle quadruplex ligand (TOxaPy) with an unexpected selectivity for certain structures of quadruplex DNA. Furthermore, we showed that complexes of terpyridine derivatives can be tailored by changing the organic ligand and / or the metal in order to interact with quadruplex DNA by covalent and / or non-covalent interaction

La traduction des ARNm et la production de protéines sont des phénomènes étroitement contrôlés dans la cellule. La séquence de l'ARNm et sa structure, auxquelles sont associées des protéines se liant à l'ARN, ainsi que la qualité de la protéine produite à partir de cet ARNm, évaluée notamment par la voie de contrôle qualité associée aux ribosomes, sont des éléments impliqués dans ce processus majeur pour la cellule. Dans ce domaine, le contrôle de la production de protéine EBNA1 (Epstein-Barr Nuclear Antigen 1) du virus d'Epstein -Barr est un exemple intéressant. La protéine EBNA1 est essentielle pour la survie du virus dans les cellules hôtes. Les niveaux cellulaires de protéine EBNA1 sont très faibles, bien que la protéine soit présente dans toutes les cellules infectées. Cette dernière est aussi extrêmement antigénique. Il est aujourd'hui admis que la quantité de protéine EBNA1 présente dans les cellules est suffisante pour assurer le maintien du virus dans la cellule, mais assez basse pour lui permettre d'échapper au système immunitaire de l'hôte. Un contrôle de sa production est nécessaire à cet équilibre. Des études précédentes ont montré que le domaine GAr (répétitions de glycine et alanine), présent dans la partie N-terminale de la protéine, déclenche un mécanisme conduisant à l'inhibition de l'initiation de la traduction de l'ARNm d'EBNA1 en cis, sans affecter la traduction des autres ARNm présents dans la cellule. L'équipe a montré précédemment que les structures G4s (G-quadruplex) peuvent être formées dans l'ARNm codant le GAr. De nombreuses études ont montré l'importance de ces structures secondaires de l'ARN dans la régulation de la traduction de l'ARNm d'EBNA1. La nucléoline, un facteur nucléaire, peut se lier aux G4s de l'ARNm du GAr. Cependant, il a aussi été montré que le peptide GAr, et non l'ARNm associé, est nécessaire au contrôle de la traduction de l'ARNm du GAr en cis. L'objectif principal de ma thèse est de mieux comprendre le mécanisme déclenché par l'ARNm et le polypeptide naissant conduisant au contrôle de la traduction de l'ARNm d'EBNA1 en cis. En accord avec le fait que les structures G4s de l'ARN sont extrêmement dynamiques, nous avons montré dans un premier temps que les fonctions associées au G4s de l'ARNm du GAr, à savoir la localisation de l'ARNm, sa traduction et sa capacité à se lier à certaines protéines, dépendent du contexte dans lesquelles ces structures se trouvent. Nous montrons ensuite que la traduction de l'ARNm d'EBNA1 est nécessaire à l'interaction nucléoline-ARNm, signifiant que la traduction de l'ARNm induit des changements dans les propriétés de l'ARNm. En parallèle, nous avons étudié le NACA, une sous-unité du complexe chaperon NAC (nascent polypeptide-associated complex). NACA se détache du ribosome lors de la synthèse du GAr et interagit avec le GAr. NACA est aussi capable de se lier aux ARN et est déterminant dans la suite des évènements liés à l'ARNm codant le GAr. Enfin, et de façon assez surprenante, les facteurs d'initiation de la traduction sont aussi des éléments clés dans l'inhibition de la traduction de l'ARNm d'EBNA1. Le facteur le plus impactant identifié jusqu'à maintenant est le facteur eIF4A1. Ces résultats indiquent que la séquence et structure de l'ARNm et le polypeptide naissant correspondant sont impliqués dans l'inhibition de l'initiation de la traduction de l'ARNm d'EBNA1. Cependant, cela n'enlève pas la possibilité que l'ARNm et le polypeptide naissant déclenchent chacun une voie d'inhibition de la synthèse d'EBNA1 distincte l'une de l'autre. Les virus utilisent des éléments déjà présents dans la cellule pour assurer leur maintien dans la cellule hôte. Ainsi, les principes de biologie cellulaire décrits ici peuvent apporter des indications importantes pour une meilleure compréhension d'autres pathologies en plus de celles liées au virus d'Epstein-Barr
MRNA translation and protein synthesis are tightly regulated events in the cell. Mechanisms describing these key cellular events involve the mRNA sequence and its structure with the association of RNA-binding protein to it, as well as the quality of the translation product encoded by the mRNA, assessed notably through ribosome-associated quality control. In this context, the Epstein-Barr virus EBNA1 (Epstein-Barr Nuclear Antigen 1) mRNA translation regulation is an interesting example. EBNA1 is known to be an essential protein for the virus survival in the host cells. Even though EBNA1 is present in every infected cell, its protein level is remarkably low. As EBNA1 is highly antigenic, it has been suggested that EBNA1 levels in the cells are low enough to escape the immune system of the host, but sufficient to maintain EBV infection. This balance requires a tightly controlled EBNA1 production. Further studies showed that the GAr (glycine-alanine repeat) domain, located in the N-terminal part of EBNA1, triggers an in cis mechanism leading to the inhibition of the translation initiation of its own mRNA, without affecting translation of other mRNAs in the cell. Thus, the GAr domain of EBNA1 is a unique tool to study selective mRNA translation control without affecting general protein synthesis. It was previously shown that RNA G4 (G-quadruplex) structures can be folded in the GAr-encoding mRNA. Numerous studies underlined the importance of these RNA structures in the regulation of EBNA1 mRNA translation, and the team previously showed that nucleolin can interact with these RNA G4 structures, interaction which can be competed by some G4 ligands. However, it was also formerly shown that the GAr peptide itself plays a role in controlling in cis the translation of EBNA1-encoding mRNA, rather than just the RNA sequence. The main focus of the study presented here is to shed light on how this translation event and the fate of the encoding mRNA are regulated in cis by the mRNA and the encoded nascent polypeptide. In line with the fact that RNA G4 structures are highly dynamic, we first showed that GAr RNA G4-associated functions, namely mRNA localisation, translation and ability to bind RNA-binding proteins, are dependent on the context they are in, i.e. their position in the mRNA, the structures in their surrounding or the factors binding the mRNA, such as G4 ligands. We next demonstrated that translation of the EBNA1 mRNA is necessary for nucleolin-binding to it, meaning that the translation event modifies some properties of the EBNA1 mRNA. In parallel, we showed that the NACA, a subunit of the NAC chaperone complex, is detached from the ribosome and interacts with the GAr polypeptide. Interestingly, the NACA is also an RNA binding protein in addition to its chaperone function, and is determinant for the future processing of the EBNA1 mRNA. Finally, and unexpectedly, we show that translation initiation factors are also key players in the downregulation of the EBNA1 mRNA translation, affecting also the mRNA nucleolin-binding capacity, the most effective translation initiation factor in the downregulation of EBNA1 mRNA translation identified so far being eIF4A1. These results support the idea that both the RNA sequence and structure and the corresponding nascent polypeptide are involved in the downregulation of EBNA1 mRNA translation. However, it does not rule out the possibility that both the RNA structure and the polypeptide sequence trigger also their own separated inhibitory pathway. As viruses use components already present in the cells to maintain themselves, the cellular biology elements brought out here can provide insights on many other pathologies in addition to EBV-associated diseases

Formés à partir de brins d’ADN ou d’ARN riches en guanines, les quadruplexes résultent de l’empilement de tétrades de guanines constituées chacune par l’auto-assemblage dans un même plan de quatre guanines, stabilisées entre elles par un réseau de liaisons hydrogènes. En s’inspirant de cet édifice naturel, il est présenté au long de ce manuscrit de thèse la synthèse et l’étude de molécules de type TASQ (pour template-assembled synthetic G-quartet) hydrosolubles capables de former de manière intramoléculaire une tétrade de guanines synthétique : les DOTASQ, le PorphySQ et le PNADOTASQ. La première application développée pour ces composés est le ciblage des quadruplexes d’ADN et d’ARN, présents dans des régions clefs du génome (télomères, promoteurs d’oncogènes) et du transcriptome (5’-UTR et TERRA), et dont la stabilisation par un ligand pourrait ouvrir de nouvelles perspectives en terme de thérapie antitumorale ciblée. Les résultats in vitro sont présentés et permettent de démontrer que les TASQ hydrosolubles développés sont des composés offrant une bonne sélectivité pour les quadruplexes mais surtout une excellente sélectivité grâce à un mode d’action bioinspiré basé sur une reconnaissance biomimétique. La seconde application mise au point est l’utilisation des TASQ comme catalyseurs pour des réactions de peroxydation : leur architecture même leur permet de mimer l’activité catalytique de l’ADN (ou DNAzyme) ainsi que celle de protéines (enzyme) comme la horseradish peroxidase. Ce processus est dépendant de la formation intramoléculaire de la tétrade de guanines synthétique et ouvre de nombreuses perspectives en terme d’utilisation en biologie ainsi qu’en nanotechnologie
Natural G-quartets, a cyclic and coplanar array of four guanine residues held together via Hoogsteen H-bond network, have recently received much attention due to their involvement in G-quadruplex-DNA, an alternative higher-order DNA structure strongly suspected to play important roles in key cellular events (chromosomal stability, regulation of gene expression). Besides this, synthetic G-quartets, which artificially mimic native G-quartets, have also been widely studied for their involvement in nanotechnological applications (i.e. nanowires, artificial ion channels, etc.). In contrast, intramolecular synthetic G-quartets, also named template-assembled synthetic G-quartet (TASQ), have been more sparingly investigated, despite a technological potential just as interesting.In this way, we designed and synthesized three series of innovative hydrosoluble TASQ: DOTASQ (for DOTA-Templated Synthetic G-Quartet), PorphySQ (containing a porphyrin template) and the most effective PNADOTASQ where PNA-guanine arms replace native DOTASQ alkyl-guanine arms. We report herein the results of both DNA and RNA interactions (notably their selective recognition of quadruplex-DNA according to a bioinspired process) and peroxidase-like hemin-mediated catalytic activities (either in an autonomous fashion as precatalysts for TASQzyme reactions, or in conjunction with quadruplex-DNA as enhancing agents for DNAzyme processes). These results provide a solid scientific basis for TASQ to be used as multitasking tools for bionanotechnological applications

Les lysosomes jouent un rôle clé dans divers mécanismes de résistance aux traitements anticancéreux, notamment en piégeant les médicaments à l’intérieur de leur structure et en activant des voies de stress adaptatives. Si cibler la transcription s’est révélée être une stratégie prometteuse contre les cellules cancéreuses, les mécanismes sous-jacents de résistance aux inhibiteurs de la transcription demeurent largement méconnus. Mon projet de thèse vise à explorer le rôle des lysosomes dans les mécanismes de résistance induits en réponse à deux inhibiteurs puissants de l’ARN POL I (composés A et B). Nous avons découvert que le composé A était séquestré dans les lysosomes où il induisait la perméabilisation de la membrane lysosomale (LMP). Mes résultats ont également révélé que l'induction de ce stress lysosomal entraîne l'activation à la fois du facteur de transcription TFEB et de l'autophagie, jouant des rôles cytoprotecteurs. De plus, cibler les lysosomes, en utilisant des dérivés de la chloroquine ou une excitation par lumière bleue, induit une augmentation importante de la LMP, suivie de la libération du composé A des lysosomes. D’un point de vue mécanistique, j’ai montré que l’induction de cette LMP massive amplifie à la fois l’inhibition de la transcription et la mort cellulaire induite par le composé A. Des effets similaires ont été observés quand les dérivés de la chloroquine sont combinés à l’autre inhibiteur de POL I (composé B). Enfin, nous avons confirmé l'effet bénéfique de l'association du composé A et du DC661 (un dérivé de la chloroquine) dans un modèle in vivo de xénogreffe de fibrosarcome chez des souris immunocompétentes. En conclusion, nous avons découvert des mécanismes liés aux lysosomes qui contribuent de manière inattendue à la résistance à deux inhibiteurs de la transcription médiée par la POL I (composés A et B). Cette étude suggère l'utilisation de combinaisons synergiques d'inhibiteurs de la transcription de POL I avec des agents ciblant les lysosomes tels que les dérivés de chloroquine ou avec la photothérapie pour lutter contre la résistance à ces traitements
Lysosomes have been known to contribute to the development of drug resistance through a variety of mechanisms that include the sequestration of drugs within their compartments and the activation of adaptive stress pathways. Although targeting RNA Polymerase I (POL I) has shown anticancer effects, the contribution of lysosomes to the efficacy and resistance of RNA POL I inhibitors remains largely unknown. In this study, we investigated this aspect in the context of two potent POL I transcription inhibitors (compounds A and B). We found that they were unexpectedly sequestered in lysosomes, causing lysosomal membrane permeabilization (LMP). This effect activated the transcription factor TFEB resulting in cytoprotective autophagy. Targeting lysosomes using chloroquine derivatives or blue light excitation induced substantial LMP, resulting in the liberation of the compound A from lysosomes. This effect amplified both the inhibition of DNA-to-RNA transcription and cell death induced by both POL I inhibitors. Moreover, combining compound A with the chloroquine derivative DC661 reduced the growth of fibrosarcoma established in immunocompetent mice more efficiently than did monotherapies with each agent. Altogether, our results reveal an unanticipated lysosome- related mechanism that contributes to resistance to POL I transcription inhibitors, as well as a strategy to combat this resistance

La maturation en 3' des pré-ARNm constitue une étape de régulation posttranscriptionnelle indispensable à l'expression d'un gène. Elle est composée de deux réactions : le clivage de l'extrémité 3' qui permet de libérer l'ARNm du site de transcription et l'ajout de la queue poly(A) qui contrôle à la fois l'export nucléaire, la stabilité et la traduction du transcrit mature. Plusieurs études montrent, d'une part, que la maturation en 3' est inhibée de manière globale lors de dommages à l'ADN et d'autre part, que des dérégulations de cette maturation peuvent contribuer au développement tumoral. Nos travaux se sont axés sur l'étude de la régulation de la maturation en 3' (i) du pré-ARNm de p53 lors de dommages à l'ADN (ii) du pré-ARNm de MSH6 impliqué dans le syndrome de Lynch. (i) Nos travaux ont mis en évidence que le pré-ARNm de p53 résiste à l'inhibition de la maturation en 3' due aux dommages à l'ADN, grâce au recrutement des protéines hnRNP H/F sur une structure appelée G-quadruplexe située en aval du site de clivage. (ii) Nous avons ensuite identifié une duplication des 20 nucléotides précédant le signal de polyadénylation du pré-ARNm de MSH6 dans deux familles distinctes atteintes du syndrome de Lynch. Cette duplication entraîne une diminution de l'efficacité de la maturation en 3' du pré-ARNm de MSH6 qui semble être à l'origine de la pathologie
Pre-mRNA3'-end processing is an essential post-transcriptional step. It is composed of two reactions: cleavage at the pre-mRNA 3' end that allows release of mRNA from the transcription site and addition of the poly(A) tail that controls nuclear export, stability and the translation of the mature transcript. Several studies show that 3'end processing is globally inhibited during DNA damage and that deregulation of this process may contribute to tumor development. Our work focused on 3'-end processing regulation of (i) p53 pre-mRNA during DNA damage (ii) MSH6 pre-mRNA involved in Lynch syndrome. (i) We have shown that p53 pre-mRNA resists to DNA damagedependent inhibition of 3'-end processing through the recruitment of the protein factor hnRNP H/F on a RNA structure called G-quadruplex located downstream of the cleavage site. (ii) We then identified a duplication of 20 nucleotides upstream of the polyadenylation signal at the MSH6 pre-mRNA in two distinct families with Lynch syndrome. This duplication causes a reduction of MSH6 pre-mRNA 3'-end processing efficiency and in consequence, it may be causal of Lynch syndrome

Des séquences compatibles avec la formation de G4 sont présentes au niveau de certaines régions clés du génome telles que les extrémités des chromosomes, mais également les régions de commutation de classe des immunoglobulines, les promoteurs de certains gènes dont des oncogènes et des séquences transcrites. Plus de 370 000 cibles potentielles ont été prédites lors des analyses bioinformatiques du génome humain. Cependant, ces prédictions ne sont pas exhaustives étant limitées par la formulation des algorithmes de prédiction utilisés. En effet, les séquences recherchées suivent la formule consensus suivante G3+N(1−7)G3+N(1−7)G3+N(1−7)G3+. Ainsi, en apportant plus de souplesse dans la description du quadruplex nous pourrons identifier et localiser plus de cibles potentielles. C’est pourquoi, nous proposons un nouvel algorithme G4-Hunter qui permettra l’identification la plus exhaustive possible de séquences cibles en prenant en compte la totalité de la région et non plus uniquement la cible potentielle. Par ailleurs, une étude expérimentale à grande échelle (sur une centaine de séquences cibles) a été menée afin de valider et tester la robustesse de G4-Hunter. A l’aide de ce nouvel outil, nous avons pu identifier de nouvelles séquences cibles non identifiées par les approches déjà existantes au sein des génomes humain, HIV et Dictyostelium discoideum
Biologically relevant G4 DNA structures are formed throughout the genome including immunoglobulin switch regions, promoter sequences and telomeric repeats. They can arise when single-stranded G-rich DNA or RNA sequences are exposed during replication, transcription or recombination. Computational analysis using predictive algorithms suggests that the human genome contains approximately 370 000 potential G4-forming sequences. These predictions are generally limited to the standard G3+N(1−7)G3+N(1−7)G3+N(1−7)G3+ description. However, many stable G4s defy this description and escape this consensus; this is the reason why broadening this description should allow the prediction of more G4 loci. We propose an objective score function, G4- hunter, which predicts G4 folding propensity from a linear nucleic acid sequence. The new method focus on guanines clusters and GC asymmetry, taking into account the whole genomic region rather than individual quadruplexes sequences. In parallel with this computational technique, a large scale in vitro experimental work has also been developed to validate the performance of our algorithm in silico on one hundred of different sequences. G4- hunter exhibits unprecedented accuracy and sensitivity and leads us to reevaluate significantly the number of G4-prone sequences in the human genome. G4-hunter also allowed us to predict potential G4 sequences in HIV and Dictyostelium discoideum, which could not be identified by previous computational methods

Les structures G-quadruplexes (G4) sont considérées comme des obstacles qui s’opposent à la progression du réplisome. Les séquences capables de former des G4 dans le génome humain se trouvent dans les régions d’ADN double brin au niveau des oncogènes et des proto-oncongènes et sur l’extrémité simple brin des télomères. La plupart des études biochimiques et biophysiques ont caractérisé les propriétés thermodynamiques des G4 en utilisant par exemple la température de fusion Tm pour déduire la thermodynamique de la formation/résolution du G4. Cependant, les expériences en solution donnent seulement une information indirecte concernant la dynamique du G4. Dans ce travail de thèse en molécule unique utilisant la technique des pinces magnétiques, nous avons pu caractériser la cinétique de la formation et résolution des G4s ainsi que la stabilité d’une structure G4 insérée dans une région d’ADN double brin : une situation qui ressemble aux G4 dans les promoteurs de gènes, où la séquence complémentaire est en compétition avec la formation de la structure de G4. Nous avons trouvé que le G4 télomérique a une très courte durée de vie (~20 s) et donc ce G4 se résout sans qu’une hélicase soit nécessaire. Au contraire, ce n’est pas le cas pour le G4 du c-MYC qui est très stable (~2h). Nous avons observé en temps réel la collision entre les hélicases et les polymérases et le G4 du c-MYC. Nous avons trouvé que l’hélicase Pif1 ouvre l’ADN puis résout le G4 après avoir effectué une pause et reprend l’ouverture de l’ADN, alors que l’hélicase RecQ et l’hélicase réplicative du bactériophage T4 ne peuvent pas le résoudre, mais peuvent le sauter. Nous avons aussi trouvé que la RPA ne peut pas résoudre le G4 du c-MYC. D’autre part, nous avons observé que la polyémrase du virus T4, la gp43, ainsi que la polymérase de T7, et la polymérase ε de la levure peuvent répliquer le G4 du c-MYC qui de façon étonnante ne constitue pas une barrière infranchissable
G-quadruplex (G4) structures are considered as the major impediments for the replisome progression. The putative G4 forming sequences in the human genome are mostly located in the double-stranded DNA regions of oncogenes and proto-oncogenes and on the single-stranded overhangs of telomeres. Most of the biochemical and biophysical studies have characterized the G4 thermodynamics properties using melting temperature Tm as a proxy to infer thermodynamics of G4 folding/unfolding energetic. However, these thermodynamics properties give only indirect information about G4 dynamics. In this work, using single molecule magnetic tweezers technique, we first characterize the kinetics of folding and unfolding and thus the stability of a single G4 inserted in a dsDNA: a situation that mimics the G4s in promoters, where the complementary sequence competes with the G-rich structure. We find that the lifetime of telomeric G4 is short (~20 s) and thus that this G4 unfolds without the need of a helicase. This is not the case for the very stable c-MYC G4 (~2 hr). We observe in real time how helicases or polymerases behave as they collide with the c-MYC G4 on their track. We find that the Pif1 helicase unwinds dsDNA, resolves this G4 after pausing and resume unwinding, while RecQ helicase and the bacteriophage T4 replicative helicase do not resolve the G4 but may jump it. We also find that RPA does not unfold the c-MYC G4. Besides, we find that T4 bacteriophage gp43 polymerase, T7 polymerase and Yeast Pol ε can replicate the G4 which surprisingly does not appear as a major roadblock for them

Les télomères sont des complexes nucléoprotéiques situés à lʼextrémité des chromosomes. Le rôle des télomères dans la protection du génome, et leur implication dans la sénescence et le cancer en font une cible privilégiée dans la lutte contre le cancer. Une stratégie originale consiste à bloquer lʼaccès de lʼextrémité télomérique aux protéines nécessaires à sa réplication et à sa stabilité comme par exemple la télomérase qui est activée dans 85% des cancers ou les protéines POT1 et TRF2 qui protègent lʼextrémité télomérique. A cause de la répétition en guanines du brin G, lʼextrémité des télomères peut former des structures en quadruplexes de guanines (G- quadruplexes) dont la stabilisation par des ligands spécifiques (Ligands G4) bloque la réplication des télomères et altère son intégrité. Le traitement de cellules tumorales par des ligands G4 provoque une dysfonction télomérique associée à une dissociation des protéines POT1 et TRF2 et conduit à une apoptose ou une sénescence des cellules. Lʼanalyse de la séquence terminale de lʼextrémité télomérique par la méthode STELA (Single Telomere Length Analysis) montre que la séquence terminale du brin C se termine majoritairement par la séquence ATC-5ʼ. La protéine POT1 est responsable de la résection du brin C des télomères en recrutant une exo- nucléase capable de créer le substrat simple-brin pour la télomérase. La déplétion de POT1 par ARN interférence provoque une dérégulation de la terminaison du brin C. Nous avons étudié au cours de notre travail lʼeffet de ligands G4 sur la séquence terminale du brin C télomérique au niveau des télomères du chromosome XpYp et au niveau de lʼensemble des télomères en utilisant une modification de la technique de STELA. Nos résultats montrent quʼune faible concentration des dérivés de la série des pyridines dicarboxamides provoque un effet mineur mais significatif au niveau de la séquence terminale des télomères XpYp et au niveau de lʼensemble des télo- mères dans la lignée HT1080. Au contraire, une concentration plus importante ne modifie pas la séquence terminale du brin C dans les cellules HT1080, A549 et HeLa, mais induit un stress réplicatif. Lʼeffet modeste de ces ligands sʼexplique par une activité de dissociation incomplete de la protéine POT1 des télomères comparativement à sa déplétion par ARN interférence. En effet, nous avons également montré que la déplétion quasi complète de POT1 par shARN induit une randomisation de la séquence terminale du brin C
The role of telomeres in protecting the genome, and their involvement in senescence and cancer make them a prime target in the fight against cancer. An original strategy is to block the access of proteins to the telomeric end necessary for replication and stability, such as telomerase which is activated in 85% of cancers or TRF2 and POT1, proteins that protect the telomeric end. Because of the guanine repetition on the G strand, telomeric ends can form quadruplex structures in guanine (G-quadruplexes) whose stabilization by specific ligands (G4 ligands) blocks the replication of telomeres and alters its integrity. Treatment of tumor cells with G4 ligands causes a dysfunction associated with the dissociation of telomeric proteins POT1 and TRF2 and leads to apoptosis or cell senescence. The analysis of the telomeric end terminal sequence by the STELA method (Single Telomere Length Analysis) shows that the C-terminal sequence of the strand ends mainly by the sequence ATC-5 ʼ. POT1 protein is responsible for the resection of the C strand of telomeres by recruiting an exonuclease capable of creating a single-stranded substrate for telomerase. Depletion of POT1 by RNA interference causes a deregulation of the C strand end. We studied in our work the effect of G4 ligands on the terminal sequence of the telomeric C strand at the telomere of chromosome XpYp and at all telomeres using a modification of the technique of STELA. Our results show that a low concentration of derivatives of the pyridine dicarboxamides series causes a minor but significant effect on the terminal sequence of XpYp telomeres and of all telomeres in HT1080 cell line. On the contrary, a higher concentration does not alter the C strand termination in HT1080, A549 and HeLa cells but induces a replicative stress. The modest effect of these ligands can be explained by an incomplete activity of dissociation of the protein POT1 of telomeres compared to its depletion by RNA interference. Indeed, we also showed that the nearly complete depletion of POT1 by shRNA randomizes the terminal sequence of the C strand

Le paludisme continue d'être l'une des principales causes de morbidité et de mortalité dans les pays en développement. Le développement de la résistance aux médicaments antipaludiques disponibles et la rareté des vaccins efficaces ont rendu nécessaire la recherche urgente de nouvelles cibles antipaludiques. La forme grave du paludisme est causée par Plasmodium falciparum, qui présente un cycle de vie complexe impliquant diverses formes morphologiquement et fonctionnellement distinctes chez deux hôtes différents - l'humain et le moustique anophèle. Afin de se développer dans l'environnement de deux hôtes distincts, ces parasites utilisent différents mécanismes pour réguler leur expression génétique étroitement coordonnée. Ce projet de thèse se concentre sur l'exploration de cette régulation, qui est médiée par des structures secondaires d'ADN riches en guanine, principalement des G-quadruplexes. Ces structures se trouvent dans une large gamme d'organismes et sont impliquées dans la régulation des gènes tels que la transcription, la réplication de l'ADN et la maintenance télomérique. Récemment, on a découvert qu'elles sont également impliquées dans le processus de virulence pour échapper à la réponse immunitaire de l'hôte dans de nombreux pathogènes tels que les bactéries, les protozoaires et les virus. Chez Plasmodium, les motifs formant le quadruplex-G sont enrichis dans les régions télomériques et sous-télomériques, où les gènes de virulence sont présents. L'existence de G4 dans le génome de ces parasites riches en AT indique leur rôle dans le mécanisme de régulation des gènes et de variation antigénique. Cependant, il y a un manque de preuves expérimentales pour appuyer cette hypothèse. Le but de ce projet est de fournir la première étude complète de l'interactome G4 afin de comprendre le rôle des mécanismes de régulation médiés par le G4 dans la biologie du Plasmodium. En utilisant une combinaison d'approches non biaisées (levure hybride et test d'ADN pull-down), nous avons identifié ~152 protéines interagissant potentiellement avec les motifs G4 Plasmodium falciparum. Il a été démontré que les orthologues de certaines de ces protéines interagissent avec les G4, ce qui renforce nos résultats. De plus, pour comprendre comment ces candidats contribuent aux processus de régulation médiés par les G4, nous avons sélectionné et caractérisé deux protéines (GBP2 et DNAJ) pour effectuer des études fonctionnelles après validation de leurs propriétés de liaison. Il est démontré que ces protéines jouent un rôle important dans la biologie du Plasmodium. Dans cette étude, nous avons découvert que la GBP2 est une protéine dispensable qui interagit avec la G4 sélectionnée. Même si la délétion du gène n'est pas mortelle pour les parasites, elle affecte toujours l'expression des gènes var. Alors que l'ADNJ putatif est une protéine essentielle et que sa délétion entraîne l'arrêt des parasites aux derniers stades du cycle érythrocytaire. Collectivement, cette étude fait la lumière sur ce mécanisme de régulation basé sur la structure de l'ADN, encore peu étudié, et fournit la première étude systématique de l'interactome G4. Etant donné leur rôle essentiel dans le développement des parasites, une caractérisation plus poussée des candidats obtenus permettra probablement de générer de nouvelles cibles pour les antipaludiques qui contribueront à long terme à l'éradication de la maladie
Malaria continues to be one of the major causes of morbidity and mortality in the developing countries. The development of the resistance against the available antimalarial drugs and scarcity of effective vaccines have demanded the urgent need of finding new antimalarial targets. The severe form of malaria is caused by Plasmodium falciparum, which manifests a complex life cycle involving various morphologically and functionally distinct forms within two different hosts - human and Anopheles mosquitoes. In order to thrive in two distinctive host’s environment, these parasites employ different mechanisms to regulate their tightly coordinated gene expression. This thesis project is focused on exploring the regulation, which is mediated by guanine-rich DNA secondary structures, predominantly G-quadruplexes. These structures are found in wide range of organisms and are involved in gene regulation such as transcription, DNA replication and telomeric maintenance. Recently, they are also found to be involved in the process of virulence to evade the host’s immune response in numerous pathogens such as bacteria, protozoa and viruses. In Plasmodium, the G-quadruplex forming motifs are found to be enriched in the telomeric and sub-telomeric regions, where the virulence genes are present. The G4 existence in these AT biased genome points towards their role in the mechanism of gene regulation and antigenic variation. However, there is a lack of experimental evidence to support this hypothesis. The aim of this project is to provide the first comprehensive survey of the G4-interactome in order to understand the role of G4-mediated regulatory mechanisms in Plasmodium biology. Using a combination of unbiased approaches (Yeast one-hybrid and DNA pull-down assay), we have identified ~152 putative G4 interacting proteins in Plasmodium falciparum. The orthologs of some of these proteins were shown to interact with G4s, thus strengthening our results. Furthermore, to understand how these candidates contribute to G4 mediated regulatory processes, we have selected and characterized two proteins (GBP2 and DNAJ) to perform functional studies following validation of their binding properties. These proteins are shown to play an important role in Plasmodium biology. In this study, we have found that the GBP2 is a dispensable protein that interacts with the selected G4. Even though the deletion of the gene is not lethal to the parasites, it still affects the expression of var genes. Whereas putative DNAJ is an essential protein and its deletion results into the arrest of the parasites at the late stages of erythrocytic cycle. Collectively, this study sheds light on this understudied DNA structure based regulatory mechanism and provide the first systematic survey of the G4 interactome. Given their essential role in parasite development further characterization of obtained candidates will likely generate new targets for antimalarial drugs that will in the long term contribute to the eradication of the disease

Les origines de réplication sont les sites à travers le génome où est initiée la synthèse de l’ADN. Les multiples cartographies des origines de réplication dans des cellules de vertébrés ont identifié une association entre origines de réplication et motifs G4. Les motifs G4 sont des séquences ayant le potentiel de se replier en G-quadruplexe. Des travaux menés précédemment au laboratoire ont montré que la capacité d’un motif G4 à se replier en G-quadruplexe est essentielle pour l’activité de deux origines de réplication modèles dans la lignée cellulaire de poulet DT40. Cependant, le motif G4 n’est pas suffisant pour spécifier une origine de réplication. Dans l’origine modèle βA, un élément cis de 227 pben 3’ du motif G4 est également nécessaire pour l’initiation de la réplication. L’analyse de la séquence de cet élément indique qu’il comporte plusieurs motifs connus pour être des sites de fixation de facteurs de transcription. Nous avons testé le rôle potentiel de ces motifs en évaluant l’effet de leurs délétions individuelles sur l’activité de l’origine βA. Ces travaux ont identifié les boites TATA et CCAAT, pouvant être liées par le facteur TBP (TATA Binding Protein) et NFY (Nuclear Factor Y) respectivement, comme étant les éléments cruciaux avec le motif G4 pour l’initiation de la réplication. Nous avons cherché à éclaircir de quelle manière ces éléments permettent la spécification d’une origine de réplication. A cet effet, nous avons émis l’hypothèse selon laquelle les motifs G4 qui se trouvent au niveau des origines de réplication sont ceux qui in vivo sont capables de former un G-quadruplexe. La formation du G-quadruplex dans l’origine βA dépendrait alors de la présence des boites TATA et CCAAT qui peuvent recruter des facteurs de transcription favorisant l’ouverture de la double hélice de l’ADN et le repliement du G-quadruplex. Cette hypothèse prévoit que la stabilisation d’un G-quadruplexe in vivo est nécessaire et suffisante pour former une nouvelle origine de réplication. Nous avons donc testé cette hypothèse de deux manières. D’abord, nous avons entrepris de stabiliser un G-quadruplex à une position donnée du génome en induisant la transcription d’un motif G4. Ensuite, nous avons déterminé les effets d’une stabilisation globale des G-quadruplexes à travers le génome sur la position des origines de réplication. Pour cela, nous avons cartographié les origines de réplication dans des lignées de cellules DT40 dans lesquelles des facteurs impliqués dans la linéarisation des G-quadruplexes ont été inactivés. Selon notre hypothèse, en l’absence de tels facteurs, comme l’hélicase FancJ ou l’ADN polymérase translésionnelle Rev1, davantage de motifs G4 pourraient se replier et former une origine de réplication. Les résultats obtenus avec chacune des deux approches indiquent que la stabilisation de G-quadruplexes ne permet pas de produire de nouvelles origines de réplication. L’ensemble de nos données indique que l’activité de l’origine βA dépend d’un motif G4 et des boites TATA et CCAAT. La manière par laquelle l’ensemble de ces éléments permettent l’initiation de la réplication reste à éclaircir
Replication origins are the position where DNA synthesis is initiated. Mapping of replication origins across the genome showed a link between origins and G4 motifs. G4 motifs are sequences the potential for forming G-quadruplexes. Works carried out previously in the laboratory showed that the ability to fold into G-quadruplex is critical for the activity of two model origin in the DT40 cell line. However, the G4 motif is not enough to specify a replication origin. In the βA model origin, a 227 bp cis element is required for the initiation of replication. The analysis of this sequence indicates the presence of several motifs known to be binding sites for transcription factors. We tested the potential roles of these motifs by evaluating the effect of their individual deletion on the activity of the βA origin. This work identified the TATA and CCAAT boxes who bind TBP (TATA Binding Protein) and NFY (Nuclear Factor Y) respectively as the crucial elements, with the G4 motifs, pour the initiation of replication.We endeavored to shed light on the manner by which these elements enable the specification of a replication origin. We hypothesized that the G4 motifs associated with replication origins are those able to form a G-quadruplex in vivo. The formation of the G-quadruplex of the βA origin would require the presence of the TATA and CCAAT boxes who could recruit transcription factors facilitating the opening of the double helix and G-quadruplex folding. We tested this hypothesis by two different manners. First, we undertook to stabilize a G-quadruplex at a given position in the genome by inducing the transcription of a G4 motif. Then, we observed the effects of a genome wide stabilization of G-quadruplexes on the position of replication origins. For that, we mapped replication origins in DT40 cell lines in which factors implicated in G-quadruplex linearization are inactivated. According to our hypothesis, without such factors, like the FancJ helicase of the translesional DNA polymerase Rev1, more G4 motifs could fold into G-quaduplexes and specify replication origins

Les G-quadruplexes sont des structures non canoniques des acides nucléiques formés au niveau de région riche en guanine et en présence d'ions potassium. Ces structures sont connues pour se former dans le génome humain (> 10 000) et semblent participer à la régulation de phénomènes biologiques.Le but du projet est de développer et étudier des ligands trifonctionnels pour les utiliser comme outils dans un protocole d'immunoprecipitation pour mieux comprendre l'accessibilité et la dynamique des G4s via une association covalente entre le ligand et la structure G4. Les ligands sont composés de i) un coeur PDC qui est capable d'interagir spécifiquement avec les G4s, ii) un groupe photoactivable capable de piéger covalemment les G4s, et iii) un alcyne terminal pour la fonctionnalisation post-piégeage par CuAAC.La première partie présente la synthèse et les études biophysiques et biochimiques des nouvelles familles de ligands G4 photoactivables. La conservation des propriétés du composé PDC vis à vis les G4s a été évalué par des expériences de FRET-melting et G4-FID. Leur capacité a générer une liaison covalente avec la structure G4 a été confirmée par gel d'électrophorèse en condition dénaturante, et les sites d'alkylations ont été identifiés par séquençage chimique et enzymatique.La seconde partie présente les études photochimiques réalisées en présence de prototypes. La nature des espèces réactives a été étudiée par Laser Flash Photolysis. Pour conclure, la photoréactivité a été étudiée en présence de different nucléosides et les adduits produits ont été caracterisés par RMN
G-quadruplexes (G4s) are non-canonical four-stranded nucleic acid structures generated by the folding of G-rich sequences in the presence of potassium ions. G4s have been found to form in the human genome (> 10,000) and seem to play a role in the regulation of many cellular processes.The aim of this project is to develop and study trifunctional ligands that can be used in an immunoprecipitation methodology to understand more about G4 accessibility and dynamics by means of a covalent association between the G4 ligand and the G4 structure. These ligands are composed of i) the PDC core able to interact selectively with G-quadruplexes, ii) a photoactivatable moiety (benzophenone, benzyl and aliphatic diazirine, and aryl azide) able to trap covalently G-quadruplexes, and iii) a terminal alkyne for post-covalent binding functionalisation by CuAAC reaction.The first part describes the synthesis and the biophysical and biochemical studies of the two new families of photoactivatable G4 ligands (in-line and branched compounds). The conservation of the specificity of PDC toward G4s was evaluated by FRET-melting and G4-FID assays. Their ability to generate a covalent bond with the G4 structures was assessed by denaturing gel electrophoresis and the identification of the alkylation sites determined by both chemical and enzymatic sequencing experiments.The second part describes the photochemical studies performed in the presence of mimic prototypes. The nature of the reactive intermediates was studied by Laser Flash photolysis. Finally, photoreactivity was studied in the presence of different nucleosides and generated adducts were characterised by NMR

Des structures secondaires d’acides nucléiques atypiques, les structures G-quadruplex, peuvent se former autour d’un cation (K+ ou Na+) dans les régions riches en guanines, grâce à une association de type Hoogsteen. La formation de ces structures est impliquée dans de nombreux mécanismes biologiques, comme la réplication, la transcription ou l’épissage. Elles peuvent affecter l’architecture de l’ADN jusqu’au niveau de la chromatine et provoquer une instabilité importante, tant génétique qu’épigénétique. De nombreuses méthodes ont été développées afin de détecter ces structures in vivo et de comprendre leurs implications au niveau cellulaire. Cependant, le panel d’outils moléculaires disponible actuellement ne permet pas une exploration du génome complète et sélective. Nous avons souhaité développer des outils, capables de sonder efficacement un milieu biologique complexe à la recherche de structures G-quadruplex et d’évaluer le potentiel d’une stratégie thérapeutique anti-tumorale ciblant ces structures. Nous avons mis au point un panel de composés combinant des ligands d’ADN G-quadruplex (PDC, PhenDC3 et Métal-ttpy) avec une biotine et un groupement photoactivable, permettant la capture et l’extraction de structures G-quadruplex de milieux biologiques complexes. Les ligands ont été évalués grâce aux techniques de FID et de FRET-melting, et sélectionnés pour leur affinité mais aussi pour leur affinité pour l’ADN G-quadruplex, assurant un ciblage efficace. Il a également été possible de piéger directement une séquence G-quadruplex en utilisant un complexe de platine, formant un adduit métallique avec les bases de l’ADN. Grâce ce type de ligand d’ADN G-quadruplex, la liaison de coordination métallique joue le rôle de marqueur covalent. Nous avons déterminé sur gel d’électrophorèse la localisation des adduits formés par des complexes dérivés du tolylterpyridine-platine (Pt-ttpy) et étudié la cinétique de platination de l’ADN G-quadruplex. La fonctionnalisation du complexe Pt-ttpy par des groupements photoactivables a permis de réaliser un double-ancrage covalent dans une structure d’ADN G-quadruplex. Par ailleurs, la fonctionnalisation avec un fluorophore a conduit aux premières évaluations en milieu cellulaire.Enfin, notre panel de composés a été testé dans des conditions de capture supportée d’ADN G-quadruplex. Une mise au point de la technique de capture a été réalisée en utilisant des billes magnétiques recouvertes de streptavidine. Les expériences de capture sur billes ont montré que l’efficacité de nos outils varie en fonction de la topologie de la structure G-quadruplex ciblée et du ligand utilisé. Par ailleurs, le groupement photoactivable introduit sur certains de ces outils n’a pas permis d’améliorer la capture d’ADN G-quadruplex. Cependant, il a été possible d’utiliser ces outils en présence d’ADN génomique pour capturer efficacement de fragments d’ADN télomérique, par effet G-quadruplex
Nucleic acids secondary structures may form in guanine-rich regions by Hoogsteen base-pairing around a cation (K+ or Na+) and stacking of guanine quartets. Those nucleic acid secondary structures called G-quadruplex are believed to play regulatory roles in the main functions related to DNA processing. However, although numerous sequences, potentially forming G4-structures are present in genomes, evidence concerning their in vivo formation and biological role remains limited. Primary aim of our research is to provide new chemical biology tools for evaluating the biological impacts of quadruplexes and the potential of our compounds for quadruplex-targeted anticancer therapy. We have synthetized a set of compounds equipped with biotin and cross linking moieties in order to trap and pull-down G4-structures in various cellular contexts. The G4-ligands (PDC, PhenDC3 and Metal-ttpy) were evaluated thanks to FID and FRET-melting assays, and carefully chosen to efficiently target G-quadruplexes but also to display enough selectivity for cellular assays. Direct trapping of a G-quadruplex structures can also be done by metal complexes, thanks to coordination with DNA bases. Platinum tolylterpyridine derivatives have been studied on gel electrophoresis to map the platination sites and to evaluate the kinetics of the phenomenon. By adding photo crosslinking moieties to Pt-ttpy, efficient double-anchoring has been done on DNA G-quadruplex structure. Moreover, first cellular imaging evaluations were done by adding a fluorophore to this platinum tolylterpyridine complex. To eventually probe quadruplex DNA at the genome-wide scale, full control of the trapping protocol is indeed a key step. Full development of the pull-down step has been done, using streptavidin-coated magnetic beads. On-beads experiments indicate that efficacy of trapping can vary dramatically depending on quadruplex and G4-ligand topologies. Moreover, photo crosslinking moiety, introduced on some compounds, has not shown any improvement of the trapping. However, the development of this method and the design of the capture compounds have led to an optimal isolation of telomeric G-quadruplex forming sequences, from genomic DNA

Dans ce travail de thèse, nous nous sommes intéressés à la synthèse et l'utilisation d'outils chimiques pour l'étude des interactions intermoléculaires dans le domaine des nanostructures et dans celui de la biologie.
Dans ce but, nous avons développé une famille de molécules, les triazatrinaphthylènes (TrisK), se caractérisant par un large coeur aromatique ainsi que par la diversité des chaînes latérales qui peuvent y être introduites, leur nature gouvernant le type d'application désirée.
L'introduction de chaînes lipophiles confère aux TrisKs des propriétés d'auto-assemblage sur des surfaces. Les monocouches auto-assemblées obtenues sont étudiées par microscopie à effet tunnel (STM). Ces études constituent un premier pas dans la caractérisation des TrisKs en tant qu'éventuels composants actifs dans le domaine des matériaux organiques.
La substitution des TrisKs par des chaînes aminées leur apporte de l'hydro-solubilité, les rendant particulièrement adaptés pour le ciblage d'une structure particulière d'ADN,
l'ADN G-quadruplexe. Cette structure est actuellement étudiée de manière intensive pour son rôle central dans ce qui pourrait constituer une nouvelle stratégie anti-cancéreuse. Nous avons également développé l'utilisation de complexes de platine pour interagir sélectivement avec ces structures.

Les G-quadruplexes (ou G4) sont des structures non canoniques des acides nucléiques formées à partir de séquences riches en guanines. Les G4 sont des structures stables, présentes sur l'ensemble du génome et qui peuvent adopter différentes conformations. La formation des G4 peut réguler, de façon positive ou négative, différents processus cellulaires tels que la transcription, la réplication, les transactions des ARN et les mécanismes mitochondriaux. L'ensemble de ces processus nécessite le recrutement de protéines capables de moduler la formation de ces structures. Certaines protéines, telles que les hélicases BLM, WRN ou DHX36, sont capables de dérouler les G4 alors que d'autres, comme la nucléoline (NCL), se lient aux G4 et les stabilisent. Enfin, des molécules capables de stabiliser les G4 appelées ligands de G4, peuvent impacter divers processus dans lesquels sont impliqués les G4 ; en particulier, ils peuvent entrainer la répression de l'expression d'oncogènes et mener à de l'instabilité génomique. Ainsi, les ligands de G4 sont considérés comme de potentiels agents anti-cancéreux. Mes travaux de thèses s'articulent autour de plusieurs problématiques concernant les G4 : 1/ l'amélioration des ligands de G4 et leur caractérisation ; 2/ le décryptage des mécanismes induisant de l'instabilité génomique suite à la stabilisation des G4 par des ligands ; 3/ l'identification des protéines capables de se lier aux G4 (ou GBP pour " G4 Binding Proteins "). Par des expériences biochimiques et biophysiques, j'ai participé à la caractérisation de ligands dérivés de porphyrine. Dans le cas du ligand AuMA, j'ai montré une augmentation à la fois de la capacité de stabilisation des G4 et de la spécificité envers les G4, par rapport à d'autres molécules dérivées de porphyrine. Cette molécule représente donc un meilleur potentiel thérapeutique que le TMPyP4, ligand largement étudié, dont elle est dérivée. J'ai également étudié l'instabilité génomique due à la stabilisation des G4 grâce à l'utilisation du ligand pyridostatine et du ligand CX5461, actuellement en phase II d'un essai clinique. Ces ligands induisent des cassures double brin de l'ADN (ou CDB) dépendantes de la transcription par l'ARN polymérase II et partiellement dues à la pause transcriptionnelle. Les CDB sont initiées par l'activité des Topoisomérases II, enzymes impliquées dans la résolution des stress topologiques de l'ADN dus à la transcription et à la réplication. Ces résultats montrent le rôle important de la transcription dans l'induction de l'instabilité génomique et ouvrent de nouvelles pistes thérapeutiques, dans le traitement de cancers dans lesquels ces protéines sont surexprimées ou par la combinaison avec d'autres chimiothérapies telles que l'étoposide afin d'en augmenter le potentiel cytotoxique. J'ai étudié les protéines se liant aux G4 grâce à des structures contraintes, bloquées dans une conformation particulière, en mettant au point un protocole de détection des GBP par des expériences de "Pull-Down" suivie d'une analyse par spectrométrie de masse. Ces résultats, validés par la liaison aux G4 de protéines déjà identifiées et caractérisées telles que WRN, DHX36 ou encore CNBP, ont permis l'identification de 425 GBP. Ainsi, j'ai mis en évidence de nouvelles GBP impliquées dans divers processus cellulaires tels que la réplication, la réparation de l'ADN, la transcription et le métabolisme des ARN. De façon annexe, l'étude de la protéine CNBP dans un modèle animal a permis de montrer que la régulation des G4 in vivo impacte la transcription et le développement embryonnaire, renforçant le rôle des G4 dans des organismes vivants. Mes travaux contribuent à étendre les connaissances sur les G4 et leurs ligands, particulièrement celles portant sur les mécanismes d'action des G4 pendant la transcription, et ouvrent de nouvelles perspectives thérapeutiques
G-quadruplexes (or G4) are non-canonical structures of nucleic acid formed from guanine-rich sequences. G4 are stable structures, present throughout the genome and could be folded into different conformations. G4 formation can regulate, positively or negatively, different cellular processes such as transcription, replication, RNA transactions and mitochondrial mechanisms. All these processes require the recruitment of proteins able to modulate the formation of these structures. Indeed, some proteins, such as BLM, WRN or DHX36 helicases, are able to unwind G4 while others, like nucleolin (NCL), bind to and stabilize G4. Finally, G4 ligands, small molecules stabilizing G4, can impact various processes in which G4 are involved; in particular, they can cause repression of oncogene expression and lead to genomic instability. Thus, G4 ligands are considered to be potential anti-cancer agents. My thesis work focuses on several issues concerning G4: 1/ the improvement of G4 ligands and their characterization; 2/ the deciphering of the mechanisms inducing genomic instability following G4 stabilization by ligands; 3/ the identification of proteins able to bind to G4 (or GBPs for "G4 Binding Proteins"). Through biochemical and biophysical experiments, I have participated in the characterization of porphyrin-derived ligands. In the case of the AuMA ligand, I showed an increase in both G4 stabilization capacity and G4 specificity, compared to other porphyrin-derived molecules. This molecule therefore represents a better therapeutic potential than TMPyP4, a widely characterized ligand from which it is derived. I have also studied the genomic instability due to G4 stabilization using the pyridostatin ligand and the CX5461 ligand, currently in Phase II of a clinical trial. These ligands induce DNA double-strand breaks (or DSBs) dependent on transcription by RNA polymerase II and partly due to the transcriptional pausing. DSBs are initiated by the activity of Topoisomerases II, enzymes involved in the resolution of DNA topological stresses due to transcription and replication. These results show the significant role of transcription in the induction of genomic instability and open up new therapeutic approaches in the treatment of cancers in which these proteins are overexpressed or by combining them with other chemotherapies such as etoposide to increase their cytotoxic potential. I have studied G4-binding proteins using constrained structures, blocked in a particular conformation, by developing a protocol for the detection of GBPs through Pull-Down experiments followed by mass spectrometry analysis. These results, validated by the binding to G4 of proteins already identified and characterized such as WRN, DHX36 or CNBP, allow the identification of 425 GBP. Thus, I have highlighted new GBPs involved in various cellular processes such as replication, DNA repair, transcription and RNA metabolism. Aside, the study of CNBP protein in a zebrafish model has shown that the regulation of G4 in vivo affects transcription and embryonic development, reinforcing the role of G4 in whole living organisms. My work contributes to extend the knowledge of G4 and their ligands, particularly the mechanisms of action of G4 during transcription, and is opening up new therapeutic perspectives

Les G-quadruplexes (G4) sont des structures non canoniques des acides nucléiques qui peuvent être formés dans des régions d’ADN ou d’ARN riches en guanines. Les ligands G4 (LG4), sont des molécules capables d’interagir et de stabiliser les structures G4, qui présentent de nombreuses propriétés anti-cancéreuses. Nous avons travaillé avec le LG4 20A, appartenant à la famille des triarylpyridines, qui stabilise efficacement les structures G4 in vitro. Les objectifs de ce travail ont été de déterminer les mécanismes moléculaires et cellulaires responsables des effets anti-prolifératifs du 20A dans des cellules cancéreuses. Dans cette étude, nous avons montré que le 20A induit un arrêt de la croissance cellulaire de cellules en culture et dans un modèle de xénogreffe tumorale, grâce à l’induction de la sénescence et de la mort cellulaire par apoptose. Ces réponses sont associées à l’activation de la voie des réponses aux dommages à l’ADN (DDR) via la kinase ATM, qui favorise l’autophagie (un processus catabolique) et la sénescence, tout en protégeant les cellules de l’apoptose. De plus, nous avons observé que le 20A induit un échec de la cytokinèse, conduisant à l’accumulation de cellules binucléées qui présentent une résistance à la mort cellulaire. De façon inattendue, nous avons trouvé que le 20A s’accumule dans les lysosomes, induisant une augmentation de la taille de ces derniers. La combinaison du 20A et de l’agent lysomotropique chloroquine, potentialise de façon importante la perméabilisation de la membrane lysosomale (LMP) et la mort cellulaire. En particulier, cette combinaison sensibilise de façon notable ces cellules binucléées à la mort cellulaire. L’ensemble de ces résultats révèle une relation entre les processus de mort cellulaire et de sénescence induits par le LG4 20A, et les voies de DDR et lysosomales. Ces régulations devraient être prises en considération lors de l’utilisation d’agents antiprolifératifs susceptibles d’interférer avec les fonctions lysosomales
G-quadruplexes (G4) are unusual nucleic acid structures that can be formed by guanine-rich DNA and RNA. Through their ability to stabilize G4 structures, G4 ligands (G4L) have been described to display potent anticancer properties. Here, we studied the G4L 20A belonging to the triarylpyridine family of compounds that have the ability to efficiently bind to and stabilize G4 structures in vitro. The objectives of this work were to determine the molecular and cellular mechanisms responsible for the anti-proliferative effects of 20A in cancer cells. In this study, we showed that 20A causes cancer cell growth arrest in cell culture and a mice tumour xenograft model, through induction of senescence and apoptotic cell death. These cellular responses are associated with the induction of the DNA damage response pathway (DDR), in particular ATM activation, which promotes the induction of both autophagy (a lysosomal catabolic pathway) and senescence, while protecting cells against apoptosis. Furthermore, we found that 20A induces failure of cytokinesis which results in the accumulation of binucleated cells that display marked resistance to 20A-induced cell death. Unexpectedly, we found that 20A accumulates in the lysosomal compartment and causes lysosome enlargement. The combination of a lysosomotropic agent, chloroquine, and 20A promotes a significant induction of lysosomal membrane permeabilization (LMP) and a robust cell death. In particular, this combination significantly sensitizes binucleated cells to cell death. Altogether, our results uncover the relationship of the DDR and lysosomal pathways to cell death and senescence induced by the G4L 20A. Such regulation should also be taken into account when using antiproliferative drugs susceptible to interfere with the lysosomal functions

Les G-quadruplexes (G4s) sont des structures non-canoniques d’acides nucléiques (ADN et ARN) constituées d’au moins deux quartets de guanines. L’une des propriétés importantes des G4s est leur capacité à former des complexes avec de petites molécules exogènes (ligands) et d’influencer ainsi les processus biologiques dans lesquels ils sont impliqués. Ainsi, l’interaction de petites molécules avec certaines structures G4s permettrait de diminuer l’expression de certains oncogènes, d’inhiber la télomérase ou encore d’induire des dommages à l’ADN. Ce travail vise à développer des méthodologies rapides et simples pour la synthèse et le criblage des molécules afin d’identifier des ligands sélectifs et affins de structures non-canoniques d’acides nucléiques, en particulier des G4s. Plus précisément, ce travail explore la synthèse réversible d’acylhydrazones, jusqu’ici peu appliquée pour le développement de ligands de l’ADN et de l’ARN. Dans un premier temps, une série de 20 bis(acylhydrazones), analogues des ligands PDC (360A) et PhenDC3, a été obtenue par la synthèse préparative. Les expériences de dénaturation thermique suivie par fluorescence ont démontré que certains de ces composés avaient une bonne affinité pour l’ADN G4. Ces expériences ont permis de valider le potentiel du motif acylhydrazone pour le développement de ligands des G4s. Ensuite, une méthode de chimie dynamique combinatoire (CDC) a été développée. Cette dernière consiste en génération de bibliothèques combinatoires comportant jusqu’à 20 composés, suivie par l’isolement des ligands les plus affins par la précipitation avec la cible, immobilisée sur des billes magnétiques. Ainsi, un bis(acylhydrazone) non-symétrique a été identifié comme un ligand prometteur du G4 parallèle Pu24T. Cependant, les expériences avec ses proches analogues n’ont pas confirmé son affinité aux G4 augmentée par rapport aux dérivés symétriques. Il a été supposé que les résultats d’expériences de CDC pouvaient être biaisés par des interactions non-spécifiques entre les ligands et les billes magnétiques. Pour améliorer l’analyse des bibliothèques combinatoires, une nouvelle méthode basée sur l’extraction en phase solide des ligands a été développée et appliquée à deux bibliothèques d’acylhydrazones non-symétriques. Huit hits ont été obtenus à partir de 70 composés générés in situ. Trois d’entre eux ont été sélectionnés pour la synthèse préparative et une étude de l’interaction avec l’ADN G4. En parallèle, une approche classique de chimie combinatoire a été élaborée, ce qui a conduit à la génération d’une bibliothèque combinatoire de 90 dérivés bis(acylhydrazone) sous forme de solutions 2 mM dans DMSO prêtes à l’emploi, avec une pureté moyenne de 87%. Ces échantillons ont été utilisés directement dans le criblage biophysique contre quatre G4s de l’ADN de trois topologies différentes. Les composés les plus actifs ont été synthétisés d’une manière préparative et leur interaction avec les G4s a été étudiée en détail par des méthodes biophysiques, y compris la spectrométrie de masse native. Ainsi, au moins un dérivé avec une affinité pour les G4s supérieure à celle de PhenDC3 et une sélectivité inédite pour le G4 antiparallèle a été identifié. Enfin, dans le cadre d’un projet collaboratif (M. Blondel, Université de Bretagne Occidentale), des ligands synthétisés au cours de ce travail ont été étudiés vis-à-vis de leur capacité à moduler d’évasion immune du virus d’Epstein–Barr (EBV). Il a été démontré que certains bis(acylhydrazones) interagissent in vitro avec la séquence riche en guanines de l’ARNm codante pour le domaine riche en glycine-alanine (GAr) de la protéine virale EBNA1. Deux de ces dérivés déplacent le facteur de la cellule hôte (nucléoline) de l’ARNm d’EBNA1, conduisant ainsi à la surexpression de la protéine et à la présence exacerbé de peptides antigéniques sur les cellules infectées. Cet effet représente une opportunité thérapeutique pour le traitement des cancers associés à l’EBV
G-quadruplexes (G4s) are four-stranded structures of nucleic acids (DNA or RNA) that consist of at least two coplanar guanine quartets. An important feature of G4s is their ability to form stable complexes with exogenous small molecules (ligands) and thus influence biological processes in which they are involved. G4 targeting is often associated with oncology, where G4 ligands may suppress the expression of oncogenes, inhibit telomerase, or induce DNA damage in cancer cells. This work aims to develop methodologies for rapid and simple synthesis and screening of compounds, in order to identify selective and highly affine ligands of given non-canonical structures of nucleic acids, in particular G4s. Specifically, this works exploits the chemistry of reversible synthesis of acylhydrazones, which has been barely applied for the development of DNA or RNA ligands before. First, a small library of 20 cationic bis(acylhydrazones), analogues of the previously reported G4-ligands PDC (360A) and PhenDC3, was obtained by preparative synthesis. Through fluorescence melting experiments it is demonstrated that some of compounds indeed have high affinity to G4-DNA, validating the suitability of the acylhydrazone motif as a scaffold for the development of G4 ligands. Next, a method of dynamic combinatorial chemistry (DCC), which consists in simultaneous one-pot generation of libraries of up to 20 compounds with consecutive pull-down of most affine ligands by bead-immobilized targets (i.e., G4-DNA), was developed. By using this method, a non-symmetrical bis(acylhydrazone) was identified as a promising ligand of a parallel G4-DNA Pu24T. However, biophysical experiments with its close structural analogues did not confirm their preferential binding in comparison with the symmetrically substituted compound. It is proposed that the outcome of DCC experiments may be biased by non-specific interactions of ligands with magnetic beads, leading to false-positive results. In order to improve the analysis of dynamic combinatorial libraries, a novel method based on solid-phase extraction of the G4-ligand complex was developed and applied to two libraries of non-symmetric acylhydrazones. In a few rounds of selection, 13 hits were obtained out of 70 in situ generated compounds. Three of them were selected for preparative synthesis and detailed study of interaction with G4-DNA. In parallel, a classical combinatorial chemistry approach was developed, resulting in generation of a combinatorial library of 90 individual bis(acylhydrazone) derivatives in the form of ready-to-use 2 mM solutions in DMSO, with an average purity of 87%. These samples were directly used for biophysical screening experiments towards four G4-DNA targets of three different topologies. Three most active compounds were obtained in preparative manner and their interaction with the mentioned biological targets was studied in detail by several biophysical methods, including native mass spectrometry experiments. This way, at least one derivative with a G4-DNA affinity superior to that of PhenDC3 and unprecedented selectivity towards anti-parallel G4-DNA could be identified. Finally, in the framework of a collaborative project (M. Blondel, University of Western Brittany) the ligands synthesized in this work were studied with respect to their capacity to act as modulators of the immune evasion of Epstein–Barr virus (EBV). Specifically, it was shown that several bis(acylhydrazones) bind in vitro to G4-RNA structures formed by the guanine-rich repeat sequence of mRNA encoding for the glycine-alanine rich (GAr) domain of viral genome maintenance protein EBNA1. Moreover, two derivatives were found to displace the host cell factor nucleolin from EBNA1 mRNA, leading to overexpression of EBNA1 protein and a concomitant increase of antigen presentation in EBV-infected cell cultures. This effect represents an interesting therapeutic opportunity for treatment of EBV-related cancers

Les télomères sont des structures nucléoprotéiques protégeant l’extrémité des chromosomes de la dégradation et assurant la réplication de l’ADN terminal. En effet, de nombreuses protéines de réplication sont impliquées dans le maintien de ces structures, comme le complexe RPA (Replication Protein A). Ce complexe très conservé chez les eucaryotes se fixe à l’ADN simple brin et est impliqué dans la réplication, les mécanismes de recombinaison et la réparation de l’ADN. Chez S.pombe, la mutation ponctuelle de la sous-unité RPA1 (Rpa1-D223Y) provoque le raccourcissement des télomères. Dans cette étude, nous montrons que cette mutation provoque l’accumulation de structures aberrantes de haut poids moléculaire aux télomères corrélant avec une présence persistante de Polα aux télomères suggérant une accumulation de structures sur le brin riche en G. Nous avons pu mettre en évidence que la surexpression d’hélicases de la famille Pif1 incluant S.cerevisiae Pif1 et PIF1 humain ainsi que Pfh1 (S.pombe) sont capable de restaurer une longueur de télomères sauvage dans mutant rpa1-D223Y. Ces résultats suggèrent que RPA pourrait empêcher l’accumulation de G4 au niveau du brin retardé télomérique afin de faciliter l’élongation des télomères par la télomérase. De plus, des expériences in vitro ont montré que la mutation correspondante de RPA1 humain réduisait spécifiquement l’affinité de RPA pour le simple brin télomérique humain dans les conditions ou il forme des G4.Enfin l’étude de la stabilité de séquences répétées formant des G4 (minisatellite CEB25), chez S.pombe, a permis de renforcer l’hypothèse selon laquelle RPA pourrait empêcher la formation ou aiderait à la résolution de G4
Telomeres are nucleoprotein structures that protect chromosome ends from degradation and ensure replication of the terminal DNA. In fact, many of replication proteins are involved in telomere maintenance, like RPA (Replication Protein A). RPA is a highly conserved heterotrimeric single-stranded DNA-binding protein involved in DNA replication, recombination and repair. In S. pombe a mutation in the largest RPA subunit (Rpa1-D223Y) leads to substantial telomere shortening. In this study, we found that the D223Y mutation leads to the accumulation of aberrant secondary structures at telomeres. The presence of these secondary DNA structures correlates with a high association of Polα with telomeres suggesting that this mutation impairs lagging strand (G-rich) telomere replication. Strikingly, heterologous expression of the budding yeast Pif1 known to efficiently unwind G-quadruplex, human PIF1 and Phf1 (homolog of Pif1 in S.pombe) rescue the telomeric length defects of the D223Y cells. Furthermore, in vitro data show that the identical D to Y mutation in human RPA specifically affects its ability to bind G-quadruplex. We propose that RPA prevents the formation of G-quadruplex structures at lagging strand telomeres to facilitate telomerase action at telomeres. Furthermore, the study, in S.pombe, of the stability of G-rich repeat sequences (minisatellite CEB25) as known to form G4 enforce the hypothesis that RPA can prevents the formation of G4 or helps to solve this structure

Depuis plusieurs années, on observe un intérêt grandissant envers des structures particulières de l’ADN, les quadruplexes de guanine ou G4. Ces structures, largement étudiées in vitro, sont encore peu connues in cellulo mais semblent jouer un rôle important dans la régulation de l’expression génétique. Elles ont rapidement été considérées comme des cibles thérapeutiques potentielles pour certaines maladies telles que le cancer. Le premier indice de leur existence dans les cellules n’a été obtenu qu’en 2013 par immunodétection sur des cellules fixées. Les recherches sont actuellement tournées vers le développement de nouveaux outils moléculaires qui permettraient la visualisation des G4 dans des cellules vivantes.C’est dans ce cadre que nous avons imaginé une série de complexes polyazaaromatiques de ruthéniumII à base de ligands plans étendus (heptacycle dpqp et octacycle dppqp). La combinaison des propriétés photophysiques des complexes de RuII associées à la présence d’un large plan étendu supposé interagir avec les G4, fait de ces molécules des outils potentiels pour l’étude des G4 in cellulo.La première partie de ce projet porte sur la synthèse de ces nouveaux complexes de ruthénium. Une méthode originale de "chimie sur complexe" a permis d'obtenir, entre autres, un complexe possédant le ligand dpqp, fonctionnalisé par une triple liaison. Il a également été possible, par « chimie sur complexe », de construire un cycle supplémentaire sur le ligand heptacyclique (dpqp) chélaté pour obtenir les complexes [Ru(L)2dppqp]2+. Les propriétés photophysiques des différents complexes ont été étudiées. Seuls deux complexes, [Ru(phen)2dpqp-Cl]2+ et [Ru(TAP)2dpqp-Cl]2+, présentent un comportement s’approchant de celui des complexes de référence; c’est à dire des rendements quantiques comparables à [Ru(bpy)3]2+ et des durées de vie de l’état excité de l’ordre de la centaine de nanosecondes. Les autres complexes sont non luminescents et l’hypothèse d’un quenching par transfert de proton à l’état excité a été avancée pour expliquer ce comportement.Les complexes ont aussi été évalués vis à vis de différentes structures oligonucléotidiques G4 et duplexes. Tous les complexes possèdent une affinité correcte envers les G4. Comme nous l'espérions, le complexe porteur du ligand octacyclique semble être particulièrement sélectif envers les G4 par rapport à l'ADN double brin. Il a aussi été montré que deux des complexes testés ont le potentiel d'être utilisés comme sondes moléculaires "light-switch ON" pour les structures G4 en milieu cellulaire. Certains des complexes synthétisés possèdent donc le potentiel pour devenir de bons outils moléculaires pour l’étude des G4 in cellulo.
Doctorat en Sciences
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L’acide désoxyribonucléique se structure chez les êtres vivants de différentes façons. La plus connue est sa forme double hélice mais de nombreuses autres structures secondaires existent et notamment les G-quadruplex. Il s’agit d’une structure basée sur le repliement d’un brin d’ADN possédant des répétitions de guanines. L’association de quatre guanines entre elles par liaisons hydrogène forme un plan appelé G-quartet. Ce réseau de liaisons hydrogène est appelé appariement de Hoogsteen. L’empilement d’au moins deux quartets autour d’un cation monovalent comme le potassium ou le sodium constitue la structure G-quadruplex. Ces structures ont été très étudiées lors des vingt dernières années et il a été montré qu’elles sont impliquées dans de nombreux mécanismes biologiques tels que la réplication, la transcription, la traduction et également le maintien des télomères. La présence des G-quadruplex peut provoquer une instabilité importante aussi bien génétique qu’épigénétique. C’est pourquoi de nombreuses méthodes ont été développées afin de localiser et comprendre le rôle de ces structures in vivo. Pour cela, un large panel d’outils moléculaires a été utilisé cependant il est encore difficile, à partir de ce panel, d’apporter une réponse à toutes les questions sur l’implication des G-quadruplex au niveau du génome. Lors de ce travail de thèse, nous avons alors développés de nouvelles molécules capables de cibler sélectivement les G-quadruplex au sein d’un milieu biologique complexe à partir de deux ligands PDC et PhenDC3 affins et sélectifs pour les structures G-quadruplex.Sur la base de molécules de référence que sont PhenDC3 et PDC, de nombreux ligands ont été mis au point. D’une part, des ligands fonctionnalisés avec une biotine et/ou un groupement photoactivable ont été synthétisés afin de capturer et d’extraire des structures G-quadruplex dans un milieu biologique. D’autre part, des dérivés capables d’être fonctionnalisés in cellulo par l’utilisation de chimie bioorthogonale ont également été obtenus. Ceci permet d’ajouter une fonction (fluorescente ou biotine…) après que le dérivé ait interagi avec sa cible cellulaire. L’ensemble des composés a été évalué par des techniques biophysiques, l’expérience de FRET-melting et l’expérience de FID, afin de mesurer leur affinité pour différentes structures G-quadruplex et leur sélectivité. Nous avons proposé une relation entre les deux expériences afin d’avoir un classement de ligands le plus approprié pour les G-quadruplex.Un des objectifs majeurs de ce travail était de localiser les ligands de G-quadruplex au sein de cellules cancéreuses humaines. Dans un premier temps, toute une étude au sein de cellules fixées a été réalisée en utilisant deux réactions de chimie « click », la réaction de cycloaddition d’un azoture et d’un alcyne catalysée par le cuivre (CuAAC) et la réaction de cycloaddition d’une cyclooctyne et d’un azoture (SPAAC). L’étude s’est, dans un second temps, poursuivie au sein de cellules vivantes en utilisant uniquement la réaction SPAAC à cause de la toxicité in cellulo du cuivre.Ces composés ont également été testés pour l’extraction de G-quadruplex à l’aide de billes magnétiques recouvertes d’une fonction cyclooctyne. Cependant, les résultats observés, lors de cette étude préliminaire, n’ont pas été concluants et demandent une mise au point pour optimiser le système
Deoxyribonucleic acid has different structures in human beings. The most known is the double helix but a lot of secondary structures exist and particularly G-quadruplex. It consists of guanine-rich nucleic acid sequences. The association of four guanines through hydrogen bonds forms a plan called G-quartet. This set of hydrogen bonds is called Hoogsteen base pairs. The stacking of at least two quartets around a monovalent cation like potassium or sodium establishes the G-quadruplex. These structures have been much studied over the past twenty years. They are involved in numerous biological mechanisms like replication, transcription, translation and also telomere maintenance. G-quadruplex presence can cause an important genetic as well as epigenetic instability. That is why many methods have been developed in order to localize these structures and to understand their role in vivo. To this end, a broad panel of molecular tools has been used. However, it is still difficult to bring an answer to all the questions about the involvement of G-quadruplex at the genomic level with this panel. In this thesis work, we developed new molecular tools able to target selectively G-quadruplex in a complex biological medium from two benchmark ligands, PhenDC3 and PDC, which have very good affinity and selectivity for G-quadruplex.On the one hand, functionalized ligands have been synthetized with a biotin and/or a photoactivatable group in order to trap and pull-down G-quadruplex in various cellular contexts. On the other hand, derivative compounds which are able to be functionalized in cellulo by bioorthogonal reactions have been obtained. Once the compound interacts with its cellular target, a function (fluorophore or biotin) can be added through an orthogonal reaction. The new panel of compounds has been evaluated by biophysical techniques, FRET-melting experiment and FID assay, in order to determine their affinity to G-quadruplex and their selectivity. We proposed a relation between the two biophysical experiments in order to have a good ranking of ligands for G-quadruplex structures.One of the most important objectives of this work was to localize G-quadruplex ligands in human cancer cells. First, a complete study in fixed cells has been performed using two reactions of click chemistry: reaction of copper-catalyzed-alkyne-azide-cycloaddition (CuAAC) and reaction of strain-promoted alkyne-azide cycloaddition (SPAAC). Secondly, the study has been pursued in living cells using SPAAC reaction because of the toxicity of copper in cells.These compounds have also been used to extract G-quadruplex from biological systems with cyclooctyne-coated magnetic beads. However, results obtained in this preliminary study are not decisive so it could be interesting to optimize the system before concluding

La maturation 3’ des pré-ARNm constitue une étape majeure dans la régulation post-transcriptionnelle de l’expression des gènes, indispensable à la stabilité, l’export vers le cytoplasme et la traduction des ARNm. Elle est composée de deux réactions : un clivage à l’extrémité 3’ suivie de l’addition d’une queue poly(A). Des études ont montré que la maturation en 3’ est inhibée en réponse aux dommages de l’ADN. Cependant, la cellule a mis en place des mécanismes compensatoires qui permettent à certains pré-ARNm d’être correctement maturés assurant ainsi le maintien de son intégrité. Les travaux que nous avons menés ont mis en évidence un mécanisme de résistance à l’inhibition de maturation en 3’ du pré-ARNm codant pour le suppresseur de tumeur p53. Ce mécanisme fait intervenir l’hélicase DHX36 qui déplie une structure secondaire appelée G-quadruplexe située en aval du site de clivage. Par ailleurs dans une deuxième étude, nous avons montré que la maturation en 3’ maintenue du pré-ARNm p53 en réponse aux dommages de l’ADN, est découplée du processus de transcription, contrairement au pré-ARNm TBP dont la maturation 3’ est inhibée en réponse aux dommage de l’ADN. Ce découplage a lieu grâce à un clivage co-transcriptionnelle du pré-ARNm p53 au niveau de la chromatine qui entraîne sa libération dans le nucléoplasme où il subit sa maturation en 3’. Une étude à grande échelle nous a permis de montrer que ce mécanisme de maturation en 3’ survenant dans le nucléoplasme est associé au maintien d'une maturation en 3’ efficace en réponse aux dommages de l’ADN
The 3’-end processing of pre-mRNA, a key step in the post-transcriptional gene expression regulation, is essential for mRNA stability, export and translation. This process is a two-step reaction composed of a cleavage at the 3’-end followed by the addition of a poly(A) tail. Studies have shown that pre-mRNA 3’-end processing is inhibited in response to DNA damage. However, compensatory mechanisms exist to allow some pre-mRNA to be properly processed at their 3’-end in order to maintain cell integrity. For instance, in response to DNA damage, the 3’-end processing of the pre-mRNA coding for the tumor suppressor p53 is able to escape from its inhibition. In the present work, we have shown that the underlying mechanism involves the DHX36 helicase that unwinds a secondary structure called G-quadruplex located downstream of the cleavage site of the p53 pre-mRNA. Moreover, in a second study, we have shown that the maintained p53 pre-mRNA 3’-end processing in response to DNA damage is uncoupled from the transcription process, unlike the inhibited TBP pre-mRNA 3’-end processing. This uncoupling takes place through a co-transcriptional cleavage of p53 pre-mRNA from the chromatin and its release in the nucleoplasm where it undergoes its 3’-end processing. A genome-wide study allowed us to show that the pre-mRNA 3’-end processing occurring in the nucleoplasm is associated with a maintained 3’end processing in response to DNA damage

La compréhension des mécanismes biologiques et l’implication des protéines dans ces mécanismes ont toujours été un enjeu important pour les biologistes. Les zones à risques de l’ADN impliquées dans les cancers, comme les G-quadruplex, les zones riches en Adénine-Thymine et leurs environnements proches sont particulièrement étudiés depuis de nombreuses années. L’essor des techniques d’analyses par fluorescence a permis aux scientifiques de mettre au point des sondes marquant ces domaines avec toujours plus de précision et de sensibilité. Cependant, de nombreuses interrogations existent sur la nature des interactions entre ces zones de l’ADN et les protéines. Afin de répondre à cette problématique, la synthèse d’une sonde pro-fluorescente alliant un ligand de l’ADN (conçu d’après les travaux des équipes de l’Institut Curie, UMR 176) à un piège à protéines (basé sur le squelette de l’epicocconone) a été réalisée et son efficacité biologique a été évaluée. Ces deux parties ont été assemblées en utilisant une réaction de cycloaddition 1,3 dipolaire spontanée entre un azoture et un alcyne contraint (SPAAC). De plus, au cours de ces travaux, une nouvelle bibliothèque de ligands de l’ADN a été synthétisée en utilisant une méthodologie innovante basée sur une réaction de C-H activation « on water »
Understanding biological process and proteins involved in has challenged biologists’ mind for a while. Specific DNA sequences, such as G-quadruplex and Adenine-Thymine rich sequences, have been studied for many years, especially for their involvement in genetic diseases like cancer. Scientists have also been interested in fluorescence monitoring and imaging of these specific sequences for a long time. Indeed, the huge sensitivity of these fluorescent technics and the wide scope of synthetic dyes available allowed several improvements on targeting DNA sequences responsible for genetic disorders. Nonetheless, relation between proteins and these areas remains mostly unknown. In order to answer this question, a pro-fluorescent dye built of two main parts, which are a DNA ligand (designed by Curie Institute teams, UMR 176) and a protein trap (based on epicocconone core). These parts were synthesized, coupled thanks to a Spontaneous Azoture Alkyne Cycloaddition (SPAAC) and the biological properties of the probe were evaluated. Furthermore, new ligands were synthesized using a new and innovating method of “on water” C-H activation reaction

Les acides nucléiques sont des macromolécules organiques qui résultent de la polymérisation de nucléotides. Ces molécules sont généralement considérées comme le support de l'information génétique. Deux familles d'acides nucléiques sont actuellement connues : l'ADN et l'ARN. D'un point de vue structurel, la forme la plus populaire est la double hélice d'ADN. Cependant, d'autres formes existent et parmi elles, le G-quadruplex. Il s'agit d'un repliement de l'ADN, ou de l'ARN, dans une zone riche en guanines. Celles-ci forment des quadruplex de guanines, qui sont empilées les unes sur les autres et sont stabilisées par un cation central. Les structures G-quadruplex sont de plus en plus étudiées. Ceci n'est pas surprenant puisque leur rôle biologique implique la régulation de mécanismes génétiques. Ils sont notamment impliqués dans la régulation du cycle cellulaire, mais ils jouent également un rôle dans le cancer, certaines maladies neurologiques ou virales. L'objectif de cette thèse est d'étudier les G-quadruplex en utilisant les outils de la chimie théorique. Les trois années de travail soulèvent des points très importants pour la recherche sur les G-quadruplex. Tout d'abord, la modélisation d'une structure théorique de G-quadruplex peut être réalisée par homologie de séquence et validée par les calculs d'un spectre théorique de dichroïsme circulaire. Par conséquent, il est possible d'utiliser ces outils pour proposer et utiliser une structure G-quadruplex si elle n'est pas encore résolue expérimentalement. Ensuite, le travail effectué montre que les G-quadruplex forment un repliement très stable puisqu'ils sont globalement conservés même lorsque de la 8-oxo-guanine ou des lésions de rupture de brin sont introduites au niveau des quartets. Ensuite, l'article se concentre sur l'interaction entre les G-quadruplex et les protéines. Il met en évidence le rôle important de l'ARN G-quadruplex dans l'infection du pathogène viral SARS-CoV-2. Cet ARN favorise la dimérisation de la protéine SUD du virus, qui est à son tour responsable de la perturbation du système immunitaire. Enfin, cette thèse fournit une explication structurelle de l'interaction spécifique entre la protéine DARPin 2E4 et le G-quadruplex du promoteur c-Myc
Nucleic acids are organic macromolecules that result from the polymerization of nucleotides. These molecules are generally considered as the support of the genetic information. Two families of nucleic acids are currently known: DNA and RNA. From a structural point of view, the most popular form is the double helix of DNA. However, other forms exist and among them are the G-quadruplex. This is a folding of the DNA, or RNA, in an area rich in guanines. These form quadruplex of guanines, which are stacked on top of each other and are stabilized by a central cation. G-quadruplex structures are increasingly studied. This is not surprising since their biological role involves the regulation of genetic mechanisms. They are notably involved in the regulation of the cell cycle, but they also play a role in cancer, certain neurological or viral diseases. The aim of this PhD thesis is to study G-quadruplex using theoretical chemistry tools. The three years of work raise very important points for the research on G-quadruplex. First, the modeling of a theoretical G-quadruplex structure can be achieved by sequence homology and validated by calculations of a theoretical circular dichroism spectrum. Consequently, it is possible to use these tools to propose and use a G-quadruplex structure if it is not yet experimentally solved. Then, the work done shows that G-quadruplex form a very stable folding since they are globally conserved even when 8-oxo-guanine or strand breaks lesions are introduced at the quartets. Then, the paper focuses on the interaction between G-quadruplex and proteins. It highlights the important role of G-quadruplex RNA in the infection of the viral pathogen SARS-CoV-2. This RNA promotes the dimerization of the SUD protein of the virus, which in turn is responsible for the disruption of the immune system. Finally, this thesis provides a structural explanation for the specific interaction between the DARPin 2E4 protein and the G-quadruplex of the c-Myc promoter

Des complexes salen et dipyrrophénolate de fer comportant des unités phénolatesenrichies en électron (substituants tert-butyl ou methoxy) ont été préparés. Leur chimieoxydative conduit à des espèces radicalaires dont une a été caractérisée par diffraction desRX. Les complexes dipyrrophénolate de manganèse et cuivre ont été également étésynthétisés et oxydés, engendrant des espèces radicalaires. Le premier s’est avéré efficace entermes d’oxygénation d’oléfines, le second pour l’oxydation d’alcools.La fonctionnalisation des phénols par des chaînes alkylimidazolium rend les complexeshydrosolubles. Les salophen de nickel ainsi préparés interagissent fortement avec l’ADN Gquadruplexe(KD < 1-2 mM) en s’empilant sur le dernier quartet de guanine. Ils stabilisent lesG-quadruplexes contre la dénaturation thermique et bloquent l’activité de la télomérase avecdes IC50 < 3 mM
We prepared salen and dipyrrophenolate iron complexes involving electron rich (tertbutyland methoxy substituents) phenolate moieties. Their oxidative chemistry leads to radicalspecies, one of them being characterized by X-Ray diffraction. The manganese and copperdipyrrophenolate complexes were also synthesized and oxidized, affording radical species.The first ones are efficient catalysts for the oxygenation of olefins, while the second ones areactive towards alcohol oxidation.Functionnalization of the phenols by alkylimidazolium chains makes the compoundshydrosoluble. The so-prepared nickel salophen complexes interact strongly with GquadruplexDNA (KD < 1-2 mM), mainly through p-stacking interactions over the lastguanine quartet. They stabilize the G-quadruplex structures against thermal denaturation andinhibit telomerase activity with IC50 < 3 mM

Trabalho Final de Mestrado Integrado, Ciências Farmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2016
Os ácidos nucleicos são as moléculas base dos seres vivos. Desde a mais simples bactéria até aos mamíferos mais desenvolvidos, todos os têm nas suas células, e é a partir deles que todas as proteínas são originadas. Mutações que provoquem erros na sua replicação, transcrição e tradução, se incapazes de serem corrigidos, podem dar origem à desregulação das células e consequentemente a doenças, ou até à morte dessas células. Mas há casos em que pode ser desejada a morte celular, como no caso de infeções virais, bacterianas e fúngicas, ou ainda no caso da proliferação indesejada de células, como o caso das neoplasias. Por isso, muitos fármacos que perturbam o normal funcionamento dos processos que envolvem os ácidos nucleicos, como a replicação, a transcrição e o processamento de ARN, têm sido desenvolvidos com sucesso. No entanto, a sua pouca seletividade e elevada toxicidade faz com que haja a necessidade de desenvolver novas moléculas com melhores propriedades. O desenvolvimento tecnológico dos métodos de estudo dos ácidos nucleicos é muito importante, pois faz com que se conheça melhor a sua estrutura e assim, permite que se sintetizem novos fármacos mais específicos para atuarem no ADN e ARN. Recentemente, têm sido investigadas estruturas secundárias, como o ADN triplex e os G-quadruplexes, que devido à sua localização e função no genoma pensa-se serem bons alvos terapêuticos. Nesta monografia serão abordadas as estruturas secundárias do ADN e ARN de um modo geral e posteriormente os fármacos utilizados na prática clínica. Por fim, descrever-se-ão algumas das novas moléculas que interagem com os alvos já referidos, sendo que algumas se encontram em ensaio clínico e poderão dar origem a medicamentos inovadores. No entanto, o problema da seletividade mantém-se de certo modo, já que, apesar de estas moléculas atuarem em estruturas específicas do genoma (e não em todo o genoma), essas estruturas existem tanto em células normais como em células tumorais. É, por isso, necessário que se desenvolvam moléculas específicas para uma sequência e não só para uma estrutura.
Nucleic acids are the basic molecules of all living beings. From the simplest bacteria to the most developed mammal, they all have them in their cells and it’s from them that all gels are generated. Mutations causing replication, transcription and translation errors, if not corrected may originate dysregulation of cells and consequent diseases or even death of those cells. However there are cases in which cell death might me desired such as viral, bacterial and fungi infections, but also when there is unwanted proliferation of cells such as what happens in tumors. Therefore, many drugs that disturb the normal functioning of processes involving nucleic acids such as replication, transcription and RNA processing have been developed successfully. However their low selectivity and high toxicity make it necessary for new molecules with better properties to be developed. It is also very important to develop new methodologies for the study of nucleic acids, since it enables a more comprehensive view of their structure making it possible for more specific drugs targeting DNA and RNA to be synthesized. Recently several secondary structures (like triplex DNA and G-quadruplexes) have been studied and will possibly make good targets in the future because of their locations and functions in the genome. In this review DNA and RNA secondary structures will be briefly discussed and also the drugs used in clinical practice. New molecules that target those nucleic acids and that may originate new drugs in the future will be approached later. Some of those molecules are currently in clinical trial although there are no approvals yet. The issue concerning selectivity still stands because even though these molecules target specific structures (contrary to the whole genome) the structures exist in normal and abnormal cells. Therefore it is necessary to develop novel compounds targeting (or also targeting) specific sequences instead of specific structures alone.