Dissertations / Theses on the topic 'Apoptose mitochondriale'

Les maladies mitochondriales sont liées à un déficit de la chaîne respiratoire mitochondriale. Ces maladies posent des problèmes de diagnostic, dans leurs relations phénotype/génotype et dans leurs mécanismes physiopathologiques. L'étude longitudinale d'un cas de déficit en ubiquinone a démontré les limites de la supplémentation thérapeutique. L'analyse de l’histoire naturelle et des caractéristiques moléculaires de 69 patients porteurs de délétion de l’ADN mitochondrial a permis d'établir une nouvelle classification clinique et des facteurs pronostiques. L’efficacité de l’immortalisation par le gène de la télomérase a été démontrée dans les fibroblastes déficitaires. Nous avons montré la présence d’apoptose dans le muscle de patients avec mutations de l'ADN mitochondrial. Les difficultés de la démonstration du pouvoir délétère des mutations homoplasmiques de l’ADN mitochondrial ont été abordées à travers l'étude de familles portant la même mutation de l'ARN de transfert de la proline.

La morphologie mitochondriale résulte d'un équilibre dynamique entre des évènements de fission et de fusion des membranes mitochondriales. Des données dans la littérature indiquent une relation étroite entre la dynamique mitochondriale et l'activation de la voie mitochondriale de l'apoptose qui consiste, via l'action des protéines de la famille de Bcl-2, en la perméabilisation de la membrane externe mitochondriale et au relargage de molécules apoptogènes, dont le cytochrome c, de l'espace inter-membranaire vers le cytoplasme. Ces dernières années, nos travaux nous ont conduit à isoler Opa1, une protéine indispensable à la fusion de la membrane interne mitochondriale. L'oligomérisation de cette dynamine a plus récemment été impliquée dans le contrôle de la conformation des crêtes mitochondriales, structures renfermant la majeure partie du cytochrome c. Afin de mieux appréhender ces deux fonctions de la protéine, une recherche de partenaires a été réalisée, au laboratoire, par une approche de double hybride chez la levure. Mon travail de thèse s'est focalisé sur la caractérisation physique et fonctionnelle de l'interaction entre Opa1 et l'un de ses partenaires, Bnip3, un membre pro-apoptotique de la famille de Bcl-2. Cette étude apporte des éléments déterminants pour la compréhension de la relation entre dynamique mitochondriale et apoptose et pourrait à terme être capital dans l'élucidation des mécanismes physiopathologiques de l'atrophie optique dominante de type 1, causée par des mutations du gène codant pour Opa1
Mitochondria are highly dynamic organelles that continually fuse and divide. Several studies suggest a link between mitochondrial dynamics and the intrinsic pathway of apoptosis, mediated by members of the Bcl-2 family, leading to the release of apoptogenic proteins, including cytochrome c, from the mitochondrial intermembrane space into the cytosol. We have previously identified Opa1 a dynamin of the inner membrane that regulates mitochondrial fusion. More recently, Opa1 has also been proposed to control, during apoptosis, cytochrome c redistribution through its capacity to locally form oligomers at mitochondrial cristae junctions. In this study, we identified Bnip3, a mitochondrial pro-apoptotic BH3-only protein of the Bcl-2 family, as a physical and functional partner of Opa1. Overall, our results give some insight into the relationship between mitochondrial dynamics and apoptosis and, in the future, may help to understand the aetiology of autosomal dominant optic atrophy, caused by Opa1 mutations

Les nucléosides diphosphate kinases (NDPK) sont essentielles pour la génération des nucléosides triphosphates (NTPs) en utilisant l’ATP et des NDPs. L’isoforme mitochondriale de NDPK (NDPK-D), située dans l’espace intermembranaire des mitochondries, possède deux modes de fonctionnement. Dans le premier mode (« phosphotransfert »), la protéine a une activité de kinase comme les autres enzymes NDPK. Dans ce mode de fonctionnement, NDPK-D produit du GTP pour la protéine optique atrophy 1 (OPA1), une GTPase impliquée dans la fusion des mitochondries, et de l’ADP pour le translocateur à adénine (ANT) et l’ATPase mitochondriale pour la régénération d’ATP. Le second mode de fonctionnement est appelé « transfert de lipide » et est lié à la capacité de la protéine à se lier aux phospholipides anioniques, particulièrement la cardiolipine (CL). Dans ce mode NDPK-D peut réticuler les deux membranes mitochondriales et transférer CL de la membrane interne vers la membrane externe des mitochondries, pouvant servir de signal pour la mitophagie et l’apoptose. Ce travail a pour objectif d’étudier plus en détails ces différentes fonctions de NDPK-D. En utilisant des cellules HeLa exprimant de façon stable la protéine sauvage, kinase inactive (mutation H151N) ou incapable de se lier aux lipides (mutation R90D) et des cellules épithéliales de poumons de souris, nous montrons (i) une grande proximité entre NDPK-D et OPA1 qui conduit au channeling de GTP par NDPK-D pour OPA1, (ii) le rôle essentiel de NDPK-D pour l’externalisation de CL vers la surface des mitochondries pendant la mitophagie, servant de signal de reconnaissance pour le complexe LC3-II-autophagosomes afin d’éliminer les mitochondries endommagées, (iii) la possible inhibition de l’externalisation de CL par la présence de complexes NDPK-D/OPA1, et (iv) un phénotype pro-métastatique des cellules HeLa exprimant la NDPK-D mutée (H151N ou R90D), caractérisé par un fort potentiel invasif et migratoire, un profil protéique altéré, et des modifications au niveau structural et fonctionnel du réseau mitochondrial. Finalement, une première stratégie d’expression et de purification de la protéine OPA1 entière a été établie pour de futures études in vitro des complexes NDPK-D/OPA1
The nucleoside diphosphate kinases (NDPK) are essential for generation of nucleoside triphosphates (NTPs) using ATP and NDPs. The mitochondrial NDPK isoform (NDPK-D) located in the mitochondrial intermembrane space is found to have two modes of function. First, the phosphotransfer mode in which the protein has a kinase activity like other NDPK enzymes. In this mode, NDPK-D produces GTP for the optic atrophy 1 protein (OPA1), a GTPase involved in mitochondrial fusion, and ADP for the adenylate translocator (ANT) and the mitochondrial ATPase for ATP regeneration. The second mode of function is called lipid transfer and is related to the capacity of NDPK-D to bind anionic phospholipids, especially cardiolipin (CL). In this mode, the protein can cross-link the two mitochondrial membranes and transfer CL from the inner to the outer mitochondrial membrane, which can serve as a signal for mitophagy and apoptosis. This work aims to study these NDPK-D functions in more detail. With the use of HeLa cells stably expressing the wild-type, kinase inactive (H151N mutation) or lipid binding deficient (R90D mutation) NDPK-D and mouse lung epithelial cells, we show (i) the close proximity between NDPK-D and OPA1 that leads to GTP channeling from NDPK-D to OPA1, (ii) the essential role of NDPK-D for CL externalization to the mitochondrial surface during mitophagy, serving as a recognition signal for LC3-II-autophagosomes to eliminate damaged mitochondria, (iii) the possible inhibition of CL externalization due to the presence of NDPK-D/OPA1 complexes, and (iv) a pro-metastatic phenotype of HeLa cells expressing either of the NDPK-D mutants (H151N or R90D), characterized by high invasive and migratory potential, altered proteomic profile and changed mitochondrial network structure and function. Finally, a first bacterial expression and purification strategy for full-length OPA1 has been established for future in vitro studies of NDPK-D/OPA1 complexes

Les mitochondries sont des organelles impliqués dans la production d'énergie et participent au à la mort cellulaire programmée ou apoptose. La structure et la dynamique de ces organelles à double membrane sont régulées par fusion ou fission membranaire. La fusion et la fission de la membrane externe sont respectivement assurées par la GTPase Fzo1/Mfn1-2 et la dynamine Dnm1/DRP. La dynamique de la membrane interne mitochondriale n'est pas encore connue. Toutefois, chez S. Cerevisiae, Mgm1p, et chez S. Pombe, Msp1 sont impliquées dans la dynamique du réseau mitochondrial. Leur localisation intra-mitochondriale suggère un rôle dans la dynamique de la membrane interne. OPA1, homologue humain de Msp1/Mgm1p, complémente la délétion du gène msp1 chez S. Pombe. Par une combinaison d'approches cytologiques et biochimiques nous avons montré en outre qu'OPA1 est une protéine fortement associée à la membrane interne mitochondriale, faisant face à l'espace inter-membranaire. J'ai analysé l'effet de l'inhibition de l'expression de OPA1 par interférence ARN. L'invalidation d'OPA1 provoque une fragmentation du réseau mitochondrial, une dissipation du potentiel de membrane DYm et est suivie de la mort des cellules par apoptose par relargage du cytochrome c. Par des approches de surexpression ou d'interférence ARN sélective des variant d'épissage d'OPA1, j'ai pu montrer que l'épissage alternatif permet de dissocier les fonctions d'OPA1 impliquées dans la morphologie du réseau mitochondrial de celles responsables de la mort cellulaire. Des mutations du gène codant pour OPA1 sont responsables de l'atrophie optique dominante de type 1 (ADOA, MIM 165500) conduisant à une neuro-dégénérescence des cellules ganglionnaires de la rétine (RGC) suivie d'une atrophie du nerf optique aboutissant à la cécité. J'ai caractérisé deux mutants pathogènes d'OPA1, et montré que la pathogénicité associée aux mutations d'OPA1 pourrait résulter aussi bien d'effets dominants négatifs que d'haplo-insuffisance
Mitochondria are essential organelles that provide energy to the cell and act as reservoirs of apoptogenic molecules. Mitochondrial morphology and dynamics are crucial for their function and their transmission, and drastically change during apoptosis. To explain the dynamic of the mitochondrial network morphology, a model conserved from yeast to human proposes that two antagonistic forces, fission versus fusion, are monitored by proteins localized on the mitochondrial outer membrane, such as Dnm1/DRP-1 or Fzo1/Mfn1-2. Conversely, dynamic of the inner membrane is largely unknown. Data on the large GTPase Msp1 in S. Pombe, OPA1 in human, and Mgm1 in S. Cerevisiae suggest that this dynamin related protein is involved in the inner-membrane structure and dynamic. We have isolated the OPA1 gene sequence encoding a human dynamin. Moreover, we have shown that OPA1 gene is mutated in patients suffering from an hereditary optic neuropathy leading to blindness (ADOA: Autosomal Dominant Optic Atrophy, OMIM 165500) My thesis project was to characterize OPA1 function in order to understand its dysfunction, impact on mitochondrial dynamics and function, and especially answer some questions about the pathological process of the ADOA. Orthology between OPA1 and Msp1 was confirmed by showing that OPA1 complements the lethal msp1 gene deletion in fission yeast. Using both biochemical and cytological approaches we have precisely localized OPA1 strongly associated with the inner membrane of the mitochondria, facing the innermembrane space. To investigate OPA1 dynamin function, we used total or selective downregulation or over-expression of wild type OPA1 variants or mutant, and showed that OPA1 could function in the inner-membrane dynamics and could have a role in structuring the cristae membrane. This later structural role suggests that OPA1 could be a key regulator of the mobilization of cytochrome c by remodeling the cristae membrane

Bien que les statines forment la classe d'hypolipidémiants la plus utilisée, une toxicité musculaire a été reportée, pouvant ainsi provoquer l’apparition d’une myopathie. Dans la première partie, nous avons montré chez l’Homme et l’animal que les statines inhibent directement la chaine respiratoire mitochondriale, et induisent la production de radicaux libres dérivés de l’oxygène (RLO), qui active les voies apoptotiques dans les muscles glycolytiques, alors que les muscles oxydatifs ne sont pas atteints. Nous avons ensuite montré in vitro que le stress réducteur peut engendrer une oxydation mitochondriale, pouvant conduire à une activation de la voie de biogenèse mitochondriale. De plus l’augmentation du contenu mitochondrial induite a permis de protéger les cellules contre l’apoptose induite par les statines. Enfin, nous avons montré in vivo que l’induction des voies de biogenèse mitochondriale est nécessaire à la tolérance des statines dans les muscles oxydatifs. En conclusion, le phénotype mitochondrial, tant au niveau quantitatif que qualitatif, semble être un facteur clé dans l’apparition de la myopathie aux statines
Although statins are the most prescribed class of lipid-lowering agents, adverse muscular toxicity has been reported, which can lead to the appearance of a myopathy. In the first part, we showed in Humans and animals that statins inhibit directly the mitochondrial respiratory chain, and induce the production of reactive oxygen species (ROS), that trigger apoptotic pathways in glycolytic skeletal muscles, whereas oxidative muscles are not impaired. We then showed in vitro that reductive stress can provoke mitochondrial oxidation, that could lead to an activation of mitochondrial biogenesis pathways. Moreover, the consequent increase in mitochondrial content enabled to protect cells against statin-induced apoptosis. Finally, we showed in vivo that the induction of mitochondrial biogenesis is necessary for statin tolerance in oxidative skeletal muscles. In conclusion, mitochondrial phenotype, both quantitatively and qualitatively, seems to be a key factor in the appearance of statin myopathy

Les maladies neurodégénératives constituent un enjeu humain, sociétal et économique majeur, dont l'importance croît avec le vieillissement des populations. Cette dénomination regroupe un grand nombre de maladies neurologiques, comme les maladies d'Alzheimer, de Parkinson ou la sclérose latérale amyotrophique (SLA). L'étiologie de ces maladies est complexe et reste encore mal comprise. Néanmoins, elles résultent vraisemblablement d'une combinaison de facteurs génétiques et environnementaux et se caractérisent toutes par la dégénérescence d'une population neuronale spécifique. Les mitochondries jouent un rôle primordial dans l'apport énergétique, la régulation calcique ou la gestion du stress cellulaire et sont directement impliquées dans le déclenchement de la mort cellulaire programmée (ou apoptose). L'implication centrale de cet organite dans les pathologies neurodégénératives a logiquement suscité un ciblage croissant des fonctions mitochondriales dans les nouvelles approches thérapeutiques envisagées ces dernières années. Des curcuminoïdes ont par exemple été testés pour contrer les effets dus au stress oxydatif, mais les résultats restent encore à être améliorés. L'utilisation de facteurs anti-apoptotiques dérivés de virus représente une piste très prometteuse. En effet, l'apoptose des cellules infectées représente la "première ligne" de défense de l'hôte contre une invasion virale. En réponse à ce mécanisme de défense, de nombreux virus expriment divers facteurs (protéines, ARN ...) dont la fonction est de bloquer le processus apoptotique, en particulier en ciblant la mitochondrie, favorisant ainsi la réplication virale au sein de la cellule. Dans ce contexte, notre équipe a établi que la protéine X du Bornavirus possède de remarquables propriétés neuroprotectrices. Si le potentiel thérapeutique de cette protéine virale est maintenant démontré, les mécanismes moléculaires à l'origine de cet effet neuroprotecteur étaient à ce jour inconnus. Au cours de ma thèse, nous avons contribué à une meilleure compréhension de la biologie de cette protéine au sein de la cellule et en particulier dans les mitochondries. Nous avons déterminé ses séquences d'adressages intracellulaires ainsi que son impact sur la dynamique mitochondriale et sur certains paramètres de la bioénergétique mitochondriale tels que le potentiel de membrane mitochondrial, la respiration cellulaire et la production d'ATP (énergie de nos cellules). L'ensemble de ces connaissances devrait nous permettre d'améliorer sa capacité neuroprotectrice
Bornavirus, a non-cytolytic RNA virus establishes a long-lasting persistence in the central nervous system of infected animals. Viral persistence is facilitated by the expression of the non-structural X protein, which is addressed both to nucleus and mitochondria, where it interferes both with cellular antiviral responses and the initiation of apoptosis. Our team recently reported that the singled-out expression of the X protein could protect neurons against toxins of the mitochondrial respiratory chain, both in vitro and in a mouse model of Parkinson's disease (PD). During my Ph.D., we further demonstrated that the X protein triggered enhanced filamentation of the mitochondrial network, in physiological as well as in oxidative stress conditions. This effect is particularly interesting when considering the importance of mitochondrial dynamics in the pathophysiology of neurodegenerative diseases. Even if the therapeutic potential of this viral protein is now well established, the underlying molecular and cellular mechanisms are far from being elucidated. It is however clear that neuroprotection conferred by the X protein is strictly dependent on its mitochondrial localization. In this context, the goal of my Ph.D. project was to clarify the molecular mechanisms whereby the X protein is targeted to mitochondria and/or to the nucleus, in link with its protective capabilities. We focused on the amino terminal residues of X, by performing fusion proteins of various forms of these residues with GFP and by analyzing their cellular localization. We demonstrated that this region contains overlapping and interdependent signals for nuclear localization, nuclear export and mitochondrial targeting of the X protein. We also identified a point mutation or deletion leading to an almost exclusively mitochondrial localization of the X protein. As a consequence, these X mutants exhibited a better neuroprotective function. In order to get further insight into X-mediated neuroprotection, we also searched for the cellular partners of X in mitochondria. We revealed a direct and specific interaction of the X protein with the chaperone Hspa9, a protein that was recently shown to be involved in neurodegenerative diseases, notably in PD's patients. We observed that the down-regulation of Hspa9 triggered by mitochondrial toxins was attenuated by the coexpression of X, suggesting a functional link between these two proteins. We also demonstrated that Hspa9 overexpression could protect neurons from mitochondrial dysfunctions, similarly to the X protein. Altogether, these results have contributed to a better understanding of the mechanisms underlying the neuroprotective potential of the X protein, which may favor the development of novel therapeutic strategies

La stéatose hépatique non-alcoolique consiste en une accumulation de lipides dans le cytoplasme des hépatocytes. Longtemps considérée comme une pathologie bénigne, elle peut être à l’origine du développement d’un stade plus sévère : la stéatohépatite non alcoolique (NASH). La NASH s’accompagne de lésions sévères du foie liées à la genèse d’un stress oxydant, d’une inflammation et de la mort cellulaire. Le rôle de la mitochondrie est au centre de cette maladie, bien que les connaissances sur la dysfonction mitochondriale et ses conséquences sur l’apoptose soient encore insuffisantes. En effet, la mitochondrie est responsable de la dégradation des lipides par -oxydation et elle agit comme un centre intégrateur des signaux apoptotiques en déclenchant une perméabilisation des membranes mitochondriales (PMM) aboutissant à la libération de facteurs apoptogènes. Ce processus est considéré comme le point de non-retour de la voie mitochondriale de l’apoptose. Nos travaux ont porté sur la compréhension des mécanismes moléculaires liant l’apoptose hépatocytaire mitochondriale et la stéatose. La combinaison de quatre modèles expérimentaux de stéatose (biopsies de patients, mitochondries isolées de souris obèses ob/ob ou recevant un régime hypercalorique, et lignées cellulaires) a permis de montrer, dans le foie stéatosique, une sensibilité accrue à l’induction de la PMM et une augmentation de la perméabilité de VDAC (voltage-dependent anion channel), protéine formant un canal dans la membrane externe mitochondriale. Ces observations sont associées à une diminution de la phosphorylation de VDAC sur un résidu thréonine et sa perte d’interaction avec la protéine anti-apoptotique Bcl-XL et la kinase GSK3, révélant ainsi une nouvelle voie de signalisation par les lipides. Cette découverte s’est notamment appuyée sur l’utilisation de tests fonctionnels en mitochondries isolées que nous avions développés et validés dans plusieurs études aux stratégies expérimentales variées. En conclusion, notre étude permet de mieux comprendre la fragilité mitochondriale lipo-induite, stade précédant l’apoptose hépatocytaire, et ouvre des perspectives à visée biomédicale
Non-alcoholic steatosis is a liver disease characterized by lipid accumulation in the cytoplasm of hepatocytes. For a long time, it has been considered as a benign condition. Now it is known that it can precede the development of a severe stage, non-alcoholic steatohepatitis (NASH). NASH is accompanied by severe dammages of the liver linked to the genesis of oxidative stress, inflammation and cell death. Mitochondrion is a central player of this disease; however, the knowledge of mitochondrial dysfunction and its consequences on apoptosis is still insufficient. Indeed, mitochondria are responsible for lipid degradation by -oxidation. Mitochondria act as a central integrator of apoptotic signals by triggering the mitochondrial membrane permeabilization (MMP) leading to the release of apoptogenic factors. This process is considered as the point of no return of the mitochondrial pathway of apoptosis. We aimed to better understand the molecular mechanisms linking mitochondrial liver apoptosis and steatosis. Combination of four experimental models of steatosis (human biopsies, isolated mitochondria from ob/ob obese mice, high fat diet-fed mice or hepatic cell lines) displayed, in steatotic livers, increased sensitivity to MMP induction and permeability of VDAC (Voltage dependent anion channel), a protein which forms a channel in the outer mitochondrial membrane. These findings are associated with the hypo-phosphorylation of VDAC on a threonine residue and the loss of its interaction with the anti-apoptotic Bcl-XL and GSK3 kinase, thus revealing a new lipid-induced signaling pathway. Our work is based on the use of functional assays on isolated mitochondria that we have developed and validated in several studies involving various strategies. To conclude, our study increases the knowledge on the lipid-induced mitochondrial weakness preceding hepatic apoptosis and opens perspectives in biomedical applications

La forme des mitochondries change continuellement grâce aux actions combinées d'événements de fission et de fusion rendant le réseau mitochondrial très dynamique. Les processus mitochondriaux de fission et de fusion sont finement régulés par des GTPases de la famille des dynamines qui sont bien conservées entre les espèces. Chez C. elegans, la fission est régulée par DRP-1, la fusion de la membrane interne par EAT-3, homologue d’OPA1, et la fusion de la membrane externe par FZO-1, homologue de MFN1. Dans les cellules musculaires du nématode sauvage, les mitochondries tubulaires et circulaires sont dans des proportions égales et organisées le long du sarcomère. Cependant, durant la dégénérescence musculaire dystrophine-dépendante, une fragmentation du réseau mitochondrial dans les cellules musculaires apparaît. Or le rôle des acteurs de la dynamique mitochondriale dans les mécanismes moléculaires menant à la dégénérescence musculaire dystrophine-dépendante reste encore incompris. Nous avons trouvé que: (i) la dégénérescence musculaire dystrophine-dépendante s'accompagnait d'une augmentation drastique de la fragmentation mitochondriale qui peut être sauvée par des manipulations génétiques de la dynamique mitochondriale (ii) la perte de fonction du gène de fission drp-1 ou la surexpression des gènes de fusion eat-3 et fzo-1 provoquent une réduction de la dégénérescence musculaire et une mobilité améliorée des mutants dystrophiques (iii) les fonctions de DRP-1 dans l'apoptose et d’autres acteurs de l’apoptose sont importants pour la mort des cellules musculaires déficientes en dystrophine (iv) L’implication de DRP-1 dans l’apoptose est également importante pour la dégénérescence musculaire liée au vieillissement. En conclusion, nos résultats pointent vers un mécanisme impliquant la dynamique mitochondriale pour impacter la dégénérescence musculaire via l’apoptose chez Caenorhabditis elegans
Mitochondrial shape is continually changing thanks to the combined actions of fission and fusion events making the mitochondrial network very dynamic. The mitochondrial fission and fusion processes are finely regulated by GTPases of the family of dynamins that are well conserved between species. In C. elegans, fission is regulated by DRP-1, fusion of the inner membrane by EAT-3, homologue of OPA1, and fusion of the outer membrane by FZO-1, homologue of MFN1. In the muscle cells of wild nematode, tubular and circular mitochondria are in equal proportions and organized along the sarcomere. However, during dystrophin-dependent muscle degeneration, fragmentation of the mitochondrial network in muscle cells occurs. But the role of the actors of mitochondrial dynamics in the molecular mechanisms leading to dystrophin-dependent muscle degeneration is still misunderstood. We found that: (i) dystrophin-dependent muscle degeneration was accompanied by a drastic increase in mitochondrial fragmentation that can be saved by genetic manipulation of mitochondrial dynamics (ii) loss of function of the fission gene drp-1 or overexpression of the eat-3 and fzo-1 fusion genes causes a reduction in muscle degeneration and improved mobility of dystrophic mutants (iii) DRP-1 functions in apoptosis and other are important for the death of dystrophin-deficient muscle cells (iv) The involvement of DRP-1 in apoptosis is also important for age-dépendant muscle degeneration. In conclusion, our results point toward a mechanism involving mitochondrial dynamics to impact muscle degeneration via apoptosis in Caenorhabditis elegans

Dans ce travail, nous avons montré qu'un effet cardioprotecteur peut être obtenu en inhibant l'ouverture du pore de transition de permeabilité mitochondrial au cours de l'ischémie-reperfusion myocardique, soit directement en agissant sur le recepteur périphérique aux benzodiazépines, soit indirectement en inactivant la GSK-3beta, ces deux stratégies ayant potentiellement en commun un effet antioxydant indispensable à la protection du cardiomyocyte
Myocradial ischemia-reperfusion injuries require cardiprotective approaches to improve the repermeabilization of coronaries arteries. So in this work we looked at the mitochondrial permeability transition pore (mPTP) inhibition as this pore is implicated in ischemia-reperfusion injury. We used two pharmalogical strategies to inhibit it. (i) the first one targeted a mitonchondrial outer membrane receptor, the peripheral benzodiazepine (PBR), which is a putative component of mPTP. The cardioprotectio, mediated by PBR was evaluated by 4'-chlorodiazépam (CDZ) a specific PBR ligand. We used a model of global ischemia-reperfusion in isolated rat hearts and a model of regional myocardial ischemia-reperfusion in anaestheized rat. We showed that CDZ reduced infarct size afetr ischemia-reperfusion, improved mitochondrial funcions and decreased apotosis. We observed a reduction of cytochrome C and apoptosis inducing factors (AIF) release with a limitation of membrane permeability and with mPTP inhibition. We also demonstrated that this effect was related to a modification of the balance of the Bel-2 family proteins at the level of the mitochondrial outer member. Indeed, DCZ stabilized the association of bel-2 with the mitochondrial membrane and reduced the interaction of Bax. (ii) The second strategy aimed at stimulation the reperfusion injury salavage kinase (RISK), an endogenous protection cascade implied in pre and postconditioning, asthe cardioprotective effect mediated by RISK was suggested to be linked to mPTP inhibition. We used morphine a well-known cardioprotective opioid ligand which was shown to activated the RISK pathway and to inihibit glycogen synthase kinase -3beta (GSK-3beta). We showed that morphine reduced infarct size in a model of regional myocardial ischemia-reperfusion in rats improved mitochondrials functions. This cardioprotective effect was confirmed in isolated adult rat cardiomyocytes subjected to anoxia-reoxygenation as morphine delayed mPTP opening and increased cell survival. The protection afforded by morphine in vitro and in vivo was mimicked by the GSK-3Beta inhibitor SB16763, and was abolished by mortmannine a PI3K inhibitor. These results confirmed the involvement of the RISK pathway in the cardioprotective effect of both morphine and SB216763 and demonstrated a link between this pathway and mPTP inhibition. In a last part we showed that these two strategies had in common an antioxydant effect which appears necessary ti inhibit mPTP and to protect cardiomyocytes. Taken together these results demonstrate and pharmacological strategy limiting the mitochondrial permeability acting on mPTP is essential to protect the myocardium

La signalisation du BCR présente une dualité fonctionnelle, dépendante de l'état de différenciation des lymphocytes B. L'activité pro-apoptotique de la protéine Bad et son trafic intracellulaire sont modulés par phosphorylation/déphosphorylation. Aucun travail n'a mis en évidence la modulation de la phosphorylation de Bad au cours de l'apoptose induite par le BCR, ni établit une connexion avec la phase mitochondriale initiatrice de mort. Nous montrons par cytométrie en flux, immunoprécipitation, Western Blot et microscopie confocale que : (i) l'activation de Bad (déphosphorylation) est impliquée dans l'apoptose des lymphocytes B immatures induite par le BCR (ii) la régulation de l'état de phosphorylation de Bad pourrait être au centre de la dualité fonctionnelle du BCR (survie/apoptose) (iii) la capacité différente à séquestrer Bad dans certains compartiments subcellulaires (rafts) pourrait contribuer à la plus grande susceptibilité des lymphocytes B immatures à l'apoptose
BCR signaling presents differential functional responses, dependent of B cell stage of differentiation. The pro-apoptotic activity of Bad protein and its intracellular traffic are regulated by phosphorylation and dephosphorylation. Modulation of Bad phosphorylation during BCR-induced apoptosis and correlation with cell death mitochondrial pathway are not fully characterized. We show by flow cytometry, immunoprecipitation, Western Blotting and confocal microscopy that : (i) Bad activation (dephosphorylation) is implicated in BCR-induced apoptosis of immature B lymphocytes (ii) regulation of Bad phosphorylation status may contribute to BCR functional duality (survival/apoptosis) (iii) differential subcellular compartmentalization of Bad (in particular in rafts) may contribute to sensitize immature B cells to apoptosis

La mort du cardiomyocyte par nécrose ou apoptose, est l'une des causes pouvant expliquer l'altération du greffon cardiaque après transplantation. Au cours de ce travail de thèse, nous avons conjointement utilisé un modèle expérimental de transplantation cardiaque et d'ischémie-reperfusion in vivo, afin d'étudier le rôle de la transition de perméabilité mitochondriale dans l'activation de l'apoptose. Bien que cette mort cellulaire puisse être induite par différentes voies, nous avons montré que la voie mitochondriale jouait un rôle prépondérant dans cette activation

La mitochondrie a longtemps été considérée comme un simple producteur d’énergie cellulaire. Cependant, son implication dans la régulation de l’apoptose en tant qu’intégrateur des voies de mort cellulaire et exécuteur de la sentence létale est désormais établie. En effet, de nombreuses molècules pro-apoptotiques agissent sur la mitochondrie et induisent la perméabilisation des membranes mitochondriales (PMM). L’altération de la perméabilité des membranes mitochondriales représentent le point de non-retour dans la cascade évènementielle du processus de mort cellulaire. Cette PMM impliquerait l’ouverture d’un complexe polyprotéique mitochondrial appelé pore de transition de perméabilité (PTPC). Le translocateur de nucléotides à adénine (ANT) est un des constituant dans la voie mitochondriale de l’apoptose. Nous avons développé des test de criblage basés sur la reconstitution en liposomes d’ANT purifié, afin d’étudier sa fonctionnalité et son implication dans la perméabilisation des membranes. Nous avons ainsi montré que l’ANT se comporte comme une protéine bi-fonctionnelle régulée par les oncogènes de la famille de Bax/Bcl-2 : celle-ci assure, d’une part, une étape cruciales du métabolisme oxydatif, la translocation d’ADP/ATP, et d’autre part, peut être convertie en pore non spécifique proapoptose. De plus, l’ANT est la cible de multiples inducteurs endogènes ou exogènes d’apoptose et semble donc constituer une cible thérapeutique potentielle dans le traitement des diverses pathologies consécutives à des dérèglements d’apoptose.

L'exposition de la phosphatidylserine (PS) à la surface des plaquettes et cellules activées joue un rôle important dans la coagulation. En effet, la PS exposée catalyse l'assemblage et l'activation des facteurs de la coagulation à la surface membranaire. Un défaut d'exposition de la PS peut générer des événements hémorragiques, comme dans le syndrome de Scott, alors qu'un excès conduit à des événements thrombotiques. L'exposition de la PS caractérise aussi les cellules en apoptose, et est essentielle à leur élimination par les phagocytes. Le but de ce travail est d'identifier, dans les cellules hématopoïétiques (plaquettes et lignées de lymphocytes), les mécanismes moléculaires contrôlant l'exposition rapide, dépendante du calcium (Ca²⁺), de la PS. La connaissance de ce mécanisme est essentielle pour moduler le degré d'exposition de la PS dans les pathologies thrombotiques. Dans ce travail, l'implication dans l'exposition de la PS des voies des MAPK/ERK1/2, et l'hypothèse que le processus soit un phénomène d'apoptose rapide dépendant de la chute du potentiel membranaire mitochondrial (ΔΨm), ont été examinées. Les résultats montrent que, bien que pouvant avoir lieu en même temps, ni l'activation de la voie des MAPK/ERK, ni la chute du ΔΨm ne contrôlent l'exposition rapide de la PS procoagulante. Les résultats soulignent de plus le rôle clef d'un influx massif de Ca²⁺. Ainsi, l'importance d'autres éléments associés à (et dépendants de) l'influx du Ca²⁺ doit être analysée, tels que l'activation de canaux ioniques (K⁺, Na⁺. . . ) membranaires, qui influencent la réorganisation des phospholipides membranaires dans divers modèles cellulaires
Phosphatidylserine (PS) exposure at the surface of activated platelets or cells is important in coagulation. Indeed, exposed PS can promote assembly and activation of the coagulation factors. Impaired PS exposure can be responsible for bleeding events, as in Scott syndrome, while excessive PS exposure leads to thrombotic events. PS exposure also occurs at the membrane of apoptotic cells, and is essential for their clearance by phagocytes. The aim of this work was to identify in hematopoietic cells (platelets and lymphocytic cell lines) the molecular mechanisms controlling the rapid Ca²⁺-dependent PS exposure. Understanding this mechanism is essential to modulate PS exposure in thrombotic disorders. In this work, the involvement in PS exposure of the MAPK/ERK pathway, and the hypohesis that the process is a rapid apoptotic phenomenon controlled by loss of mitochondrial transmembrane potential (ΔΨm) were examined. The results show that although they may occur concurrently, neither the MAPK/ERK pathway activation, nor the loss of A\|/m control the rapid procoagulant PS exposure. The data also highlight the key role of an increase in intracellular Ca²⁺ brought about by a massive influx in the process. Therefore, the importance of other factors associated to (and dependent on) Ca²⁺ influx must be analyzed, such as activation of membrane ion channels (K⁺, Na⁺. . . ), which has been shown to influence phospholipid membrane remodelling in different cells models

La fonte musculaire observée dans de nombreuses situations physiopathologiques (vieillissement, cancers, SIDA, etc) peut, à long terme, réduire l'efficacité du système immunitaire et des traitements mis en place, augmentant ainsi les taux de morbidité et de mortalité. L'affaiblissement des individus engendré peut conduire à l'alitement, ce qui constitue un facteur aggravant de l'atrophie musculaire. Les processus protéolytiques et apoptotiques jouent un rôle important dans l'établissement de la fonte musculaire. Par contre, leur rôle pendant les phases de récupération n'a pas été clairement défini. L'objectif de ma thèse était de mieux caractériser ces mécanismes pendant la perte et la récupération de protéines musculaires suite à une immobilisation. Des rats adultes ont donc été soumis à une immobilisation unilatérale de la patte arrière par plâtrage pendant 8 jours et placés en récupération jusqu'à 40 jours. La patte contra latérale a servi de témoin dans l'ensemble des expérimentations menées. Nous avons montré que l'apoptose mitochondriale dépendante des caspases est activée conjointement à la protéolyse ubiquitine(ub)-protéasome-dépendante pendant l'atrophie musculaire consécutive à l'immobilisation par plâtrage chez le rat. Ces 2 processus sont ensuite séquentiellement normalisés pendant la récupération musculaire. En effet, la protéolyse ub-protéasome-dépendante se normalise quand l'atrophie musculaire se stabilise alors que l'apoptose mitochondriale est réprimée puis normalisée pendant l'accrétion musculaire. Enfin, l'administration quotidienne de curcumin (doté de propriétés anti-oxydantes et anti-inflammatoires) a permis d'anticiper la récupération musculaire en accélérant la normalisation de ces 2 processus. En conclusion, mon travail de thèse a donc permis de démontrer l'importance de l'apoptose mitochondriale dépendante des caspases dans l'établissement de l'atrophie musculaire dans le modèle d'immobilisation par plâtrage. Il a également montré que la protéolyse ub-protéasome-dépendante et l'apoptose mitochondriale sont régulées selon des cinétiques différentes pendant la récupération musculaire. Enfin, mes travaux sur les effets bénéfiques du curcumin indiquent que des stratégies nutritionnelles adaptées aux différentes phases de récupération musculaire sont envisageables afin de favoriser l'accrétion musculaire
Uncontrolled and sustained muscle wasting observed in various catabolic situations (e. G. Aging, cancers, AIDS) may reduce the response to therapies and the efficiency of immune system, thus increasing morbidity and mortality. The subsequent weakness impairs human movement and ultimately can lead bed-rest, which is a worsening factor of muscle atrophy. Proteolytic and apoptotic pathways play a crucial role in the establishment of muscle atrophy. However, their respective role during recovery periods is not clearly defined. The purpose of my Ph. D. Thesis was to better characterize these mechanisms during muscle loss and the recovery following immobilization. Adult rats were subjected to unilateral hindlimb casting for 8 days and allowed to recover up to 40 days. The controlateral leg served as control in all experiments. We showed that the mitochondria-associated apoptotic pathway was up-regulated concomitantly to the ubiquitin(ub)-proteasome-dependent system during immobilization induced-muscle atrophy. We also demonstrate that these pathways are sequentially normalized during skeletal muscle recovery. Indeed, ub-proteasome-dependent proteolysis is normalized when muscle atrophy stabilized whereas the mitochondria-associated apoptotic pathway is later sequentially down-regulated and normalized when muscle mass increased. Finally, the daily administration of curcumin, which exhibit anti-oxydant and anti-inflammatory properties, speeded up muscle mass recovery by furthering the normalization of these two processes. In conclusion, my Ph. D. Thesis work demonstrated the crucial role of the mitochondria-associated apoptotic pathway during the casting induced-muscle atrophy. It further demonstrated that the ub-proteasome-dependent proteolytic and the mitochondria-associated apoptotic pathways are regulated according to different kinetics during muscle recovery. Finally, the study of the beneficial effects of curcumin indicated that nutritional strategies adapted to different stages of muscle recovery are conceivable to improve muscle mass accretion

L’apoptose est un processus physiologique de mort cellulaire essentiel à la survie des organismes pluricellulaires. L’objectif de ce travail a été d’étudier les effets de deux molécules : le facteur de survie FGF1 et l’inhibiteur des caspases zVAD-fmk sur l’apoptose dépendante de p53, un oncosuppresseur, régulateur clé de l’apoptose. Dans un premier temps, nous nous sommes intéressés à l’effet du FGF1 sur l’apoptose dépendante de p53 dans un modèle de cellules neuronales : les cellules PC12. Les résultats obtenus lors de ma thèse montrent que : (1) les FGF1 exogène et endogène (intracellulaire et nucléaire) inhibent l’apoptose dans les cellules PC12 en diminuant la phosphorylation et la stabilisation de p53, (2) la protéine FGF1 inhibe l’activité transcriptionnelle de p53 vis-à-vis de ses gènes cibles pro-apoptotiques puma et noxa, (3) le FGF1 inhibe l’activation de la caspase-3, effecteur de l’apoptose (4) pour la majorité des activités du FGF1 endogène, la présence de sa séquence de nucléarisation est déterminante. Dans un second temps, nous avons étudié l’effet de l’inhibiteur de caspases zVAD-fmk sur la voie mitochondriale de l’apoptose dans des fibroblastes embryonnaires de rongeurs. Les résultats obtenus montrent que : (1) le zVAD-fmk accélère l’apoptose dépendante de p53 et du TNF dans ces cellules, (2) les protéines Bax et Bak et la dépolarisation des membranes mitochondriales sont nécessaires pour cette accélération, (3) le zVAD-fmk inhibe classiquement les caspases executrices-3/7 et (4) de façon surprenante, le zVAD-fmk induit une augmentation du clivage et de l’activité de la caspase-9 et ne semble pas inhiber la caspase-8
Apoptosis is a physiological cell death in multicellular organisms that is required for embryogenesis, metamorphosis, homeostasis and elimination of cells that are potentially detrimental to organism. Deregulations of apoptosis have been implicated in many pathologies. The main aim of this work is the study of the Fibroblasts Growth Factor I (FGFI) and the caspase inhibitor zVAD-fmk effects in p53-dependent apoptosis. First, we study the effect of FGF1 in p53-dependent apoptosis. As both factors have been involved in neuronal apoptosis, we realized our study in PC12 cells, a neuronal cellular model. Our results show that: (1) exogenous and endogenous (intracellular and nuclear) FGF1 inhibit p53 phosphorylation and stabilization and thus p53-dependent apoptosis, (2) FGF1 inhibits puma and noxa trans-activation induced by p53, (3) FGF1 inhibits caspases-3 cleavage and (4) the nuclear localization of endogenous FGF1 is required for its anti-apoptotic activities. Second, we study the effect of pancaspase inhibitor zVAD-fmk in mitochondrial apoptosis in rodent embryonic fibroblasts. Our results show that: (1) zVAD-fmk increases p53- and TNF-dependent apoptosis, (2) this acceleration of apoptosis by zVAD-fmk involved mitochondrial events (3) Bax and/or Bak are required for p53- and TNF-dependent apoptosis and for zVAD-fmk induced apoptosis acceleration, (4) zVAD-fmk inhibits caspases-3/7 activity and (5) surprisingly, zVAD-fmk increases caspases-9 cleavage and activity and does not seems to inhibit caspases-8

Le gène rb est le premier suppresseur de tumeur découvert chez l’homme. Il prévient l’apparition de tumeurs notamment en régulant négativement le cycle cellulaire. Le rôle de pRb dans le contrôle de l’apoptose est plus complexe et les mécanismes moléculaires contrôlés par ce facteur de transcription ne sont pas complétement élucidés. Il existe un homologue de rb chez la drosophile : rbf1. J’ai contribué à caractériser les évènements mitochondriaux induits au cours de l’activation de l’apoptose par Rbf1 dans le disque imaginal d'aile, un tissu en prolifération de la larve de drosophile. Dans cette voie d’apoptose, la protéine Debcl, seule membre pro-apoptotique de la famille Bcl-2 chez la drosophile, est activée et induit le recrutement et l’oligomérisation de Drp1, protéine effectrice principale de la fission mitochondriale. C’est ainsi qu’est déclenchée la fragmentation mitochondriale et l’accumulation d’espèces activées de l’oxygène (EAOs) mitochondriales. Ces deux évènements participent à la transmission du signal apoptotique. J’ai par ailleurs pu mettre en évidence l’implication de facteurs participant au maintien du contrôle qualité mitochondriale. Celui-ci s’assure de l’intégrité des mitochondries et, le cas échéant, déclenche la digestion des éléments défaillants par mitophagie. Enfin, j’ai contribué à l’étude des liens entre la traduction et l’apoptose induite par Rbf1. Dans cette étude, nous montrons que la poly-A binding protein (PABP) peut supprimer le phénotype d’encoche induit par Rbf1 chez l’adulte alors que la mort cellulaire induite au cours du stade larvaire n’est pas inhibée mais augmentée. Ces résultats nous ont poussé à étudier les mécanismes de compensation induits par l’appareil traductionnel, ce qui nous a permis de montrer qu'une modulation de la traduction pourrait permettre de compenser la perte de tissu consécutive à l'apoptose induite par Rbf1 sans impliquer une inhibition de l'apoptose
The gene rb is the first tumor suppressor discovered in humans. Its prevents the appearance of tumors by regulating negatively the cell cycle. The role of pRb in apoptosis is more complex and the molecular mechanisms triggered by this transcription factor are not completely elucidated. There is a rb homologue in drosophila: rbf1. I participated in the characterization of mitochondrial events induced during activation of apoptosis by Rbf1 in a proliferating tissue of this model organism, the wing disc. In this apoptosis pathway, the Debcl protein, the only drosophila pro-apoptotic member of the Bcl-2 family, is activated and induces recruitment and oligomerization of Drp1, the main effector of mitochondrial fission. This triggers the mitochondrial fragmentation and the accumulation of mitochondrial reactive oxygen species (ROS). Both events participate to the transmission of the apoptotic signal. I have also been able to highlight the implication of factors involved in maintaining mitochondrial quality control which ensures the integrity of the mitochondria and, if necessary, triggers the degradation of damaged elements by mitophagy. Finally, I have contributed to the study of the links between translation and apoptosis induced by Rbf1. In this study, we show that the Poly-A Binding Protein (PABP) can suppress the Rbf1-induced notch phenotype in adults while cell death induced during larval stage was not inhibited but increased. These results prompted us to study the compensation mechanisms induced by the translational apparatus, which allowed us to show that a mRNA translation-related mechanism could counteract the loss of tissue resulting from Rbf1-induced apoptosis independently of apoptosis inhibition

La résistance tumorale à la chimiothérapie constitue un obstacle majeur au traitement des cancers colorectaux. Celle thèse a pour objectif l'identification de mécanismes cellulaires-clés conduisant à la résistance à l'oxaliplatine des cancers colorectaux. Pour cela, nous avons développé des modèles cellulaires de résistance, par exposition de plusieurs lignées cellulaires humaines de cancer colorectal, à des concentrations croissantes d'oxaliplatine. Ces travaux ont permis de mettre en évidence une association entre résistance à l'oxaliplatine et résistance à l'apoptose de type mitochondrial, d’abord dans le modèle HCT116 puis dans le modèle SW620. L’état de résistance à l’oxaliplatine a ainsi pu être associé à des altérations fonctionnelles de la voie apoptotique mitochondriale (résistance croisée à des inducteurs apoptotiques agissant directement au niveau de la mitochondrie). Dans certain nombre de cas, les altérations de l'apoptose ont pu être associées à une dérégulation de la protéine pro-apoptotique Bax au niveau génétique (mutation de Bax), transcriptionnel (sous-expression des transcrits de Bax) et/ou protéique (sous expression ou perte totale d'expression de la protéine Bax). L'identification de telles altérations de l'apoptose en relation avec l'acquisition de résistance à l'oxaliplatine ouvre deux champs d'application clinique qui sont : (i) la mise en œuvre d 'une méthode de diagnostic de la résistance à l'oxaliplatine basée sur la définition de marqueurs d’altérations de l 'apoptose de type mitochondrial des cellules tumorales, (ii) la conception d'une stratégie visant à augmenter l'efficacité de l'oxaliplatine par l'association à une substance modulatrice des phénomènes de résistance à l 'apoptose de type mitochondrial
Tumor resistance to chemotherapy limits considerably the efficacy of colorectal cancer treatment. The aim of this thesis was to identify major cellular mechanisms leading to oxaliplatin resistance of colorectal cancers. For this purpose, we developed cellular models to study resistance, submitting several human colorectal cell lines to increasing concentrations of oxaliplatin. In this study, oxaliplatin resistance was found to be associated with a mitochondrial apoptosis defect, first in the HCT116 cellular model and then in a second cellular model: SW620. Indeed, oxaliplatin resistance was found to be associated with functional alterations in the mitochondrial apoptotic pathway (cross-resistance to apoptosis inducers acting directly on the mitochondria). In some cases, apoptosis alterations were found to be associated with a dysregulation of the pro-apoptotic protein Bax at several levels: genetic (Bax mutation), transcriptional (over-expression of Bax transcripts) and/or proteomic ( dawn-expression or complete loss of expression of Bax protein). Identification of these alterations in the mitochondrial apoptotic pathway in relation to acquisition of oxaliplatin resistance opens new clinical horizons among which are:(i) the development of a method to predict oxaliplatin resistance, based on the identification of tumor markers of mitochondrial apoptosis defects, and (ii) the conception of a therapeutic strategy designed to increase oxaliplatin efficacy by addition of a substance able to modulate phenomena of mitochondria-mediated apoptosis resistance

L'apoptose est une mort cellulaire programmée permettant l'élimination physiologique des cellules au cours du développement ainsi que l'élimination des cellules endommagées dans les organismes pluricellulaires. Ce processus sophistiqué est associé à des modifications au niveau des membranes mitochondriales impliquant, entre autres, de nombreux acteurs contrôlant le réseau mitochondrial (fusion, fission) ou le contrôle qualité mitochondriale (mitophagie). Plusieurs liens existent entre ces processus. Certains membres de la famille Bcl-2 (B cell Lymphoma 2), identifiés comme acteurs majeurs de l'apoptose, sont capables de moduler la fission et la fusion mitochondriales. De plus, des régulateurs de la mitophagie, nécessaires au maintien de l'intégrité mitochondriale, telle que PINK1 (PTEN Induces Kinase 1) et BNIP3 (BCL2 interacting protein 3) peuvent moduler l'activité apoptotique de certaines protéines de la famille Bcl-2 (BAX, BAK,…). Les relations entre mitophagie et apoptose restent cependant complexes. La capacité de PINK1 à protéger contre l'apoptose est aujourd'hui controversée dans certains tissus. BNIP3, quant à lui, présente un rôle double pro-apoptose et pro-mitophagie.Nos résultats, dans le modèle drosophile, suggèrent un rôle régulateur positif pour PINK1 et négatif pour BNIP3, dans l'apoptose induite par rbf1 (l'homologue du gène de susceptibilité au rétinoblastome) ou par Debcl (un pro-apoptotique de la famille Bcl-2). Ce processus apoptotique s'accompagne de mitophagie qui semble, dans le cas de Rbf1, impliquer la protéine PINK1. Cela renforce l'idée d'un lien étroit entre les acteurs de l'apoptose et la mitophagie et nous pousse à nous interroger sur le rôle moins connu de PINK1 dans le processus apoptotique
Apoptosis is a programmed cell death, allowing the physiological elimination of cells during development and that of damaged cells in multicellular organisms. This sophisticated process is associated with modifications at the level of the mitochondrial membranes involving, among others, numerous actors controlling the mitochondrial network (fusion, fission) or mitochondrial quality control (mitophagy). Several links exist between these processes. Certain members of the Bcl-2 family (B cell Lymphoma 2), identified as significant players in apoptosis, can modulate mitochondrial fission and fusion. In addition, mitophagy regulators necessary for maintaining mitochondrial integrity, such as PINK1 (PTEN Induces Kinase 1) and BNIP3 (BCL2 interacting protein 3), can modulate the apoptotic activity of specific proteins of the Bcl-2 family (BAX, BAK,…). However, the relationship between mitophagy and apoptosis remains complex. PINK1 ability to protect against apoptosis is challenged in some tissues. For its part, BNIP3 has a dual function: pro-apoptosis and pro-mitophagy.In the Drosophila model, our results show a positive regulatory role of PINK1 and a negative one for BNIP3 in apoptosis induced by rbf1 (the homolog of the retinoblastoma susceptibility gene). This apoptotic process accompanies mitophagy, which seems, in the case of RBF-1, independent of the PINK1 protein. This observation reinforces the idea of a close link between apoptosis and mitophagy and prompts us to question the role of PINK1 in this process. This project should make it possible to better understand the consequences of PINK1 deregulation according to the tissue types, neuronal or subject to renewal

L’apoptose est un événèment clef dans le maintien de l’intégrité de l’organisme et peut être impliqué dans des pathologies humaines. La compréhension des mécanismes de contrôle et l’identification de nouveaux régulateurs peut être essentiel au developpemment de nouvelle statégies thérapeutiques. L’objectif de cette thèse a été d’identifier de nouveaux régulateurs de l’étape mitochondriale de l’apoptose. Trois axes de recherche ont été explorés :(i) L’etude de la cytotoxicité de Bax chez la levure. La surexpression de la protéine pro-apoptotique Bax induit la mort des cellules et une perméabilisation de la membrane externe mitochondriale (PMM). Une approche génétique chez la levure a permis de mettre en évidence l’implication du processus de l’autophagie dans la cytotoxicité induite par Bax. (ii) L’identification de la cible cellulaire du nelfinavir (NFV). Cet inhibiteur de la protéase du virus de l’immunodéficience humaine (VIH) présente également un effet anti-apoptotique. L’approche in cellulo et biochimique a permis d’identifier la cible du NFV comme étant le translocateur à adénine, un des constituants du pore de transition de perméabilité. (iii) L’étude de la fonction pro-poptotique de la glycéraldéhyde 3 phosphate deshydrogenase (GAPDH). La GAPDH est une protéine glycolitique également décrite pour intervenir dans l’apoptose. Dans ce contexte, nous avons montré qu’une augmentation de la GAPDH dans les mitochondries pouvait induire une activation de la PMM en intéragissant avec la porine VDAC. L’utilisation de ces différentes approches a permis de caractériser des régulateurs exogènes et endogènes de la phase mitochondriale de l’apoptose
Apoptosis is a key event for the organism intergrity throughout life. This process is frequently implied in human diseases. Understanding of the mechanisms involved in apoptosis control and characterization of new regulators are essential for development of therapeutic strategies. The objectives of my thesis deal with identification of regulators of the mitochondrial step of apoptosis. Three research orientations have been explored: (i) Study of Bax cytotoxicity in yeast model. Surexpression of the pro-apoptotic protein Bax induces cell death and itochondrial membranes permeabilization. This genetic approach in yeast highlighted the involvment of autophagy pathway in Bax’s death. (ii) Identification of nelfinavir (NFV) cellular target. This protease inhibitor of the Human Immunodeficiency Virus also presents an antiapoptotic effect, whose regulation can be a key role in apoptosis control in HIV syndrome. The biochemical and in cellulo approach we developed lead to identification of the Adenine Nucleotide Translocator (ANT), one of the components of permeability transition pore, as a target of NFV. (iii) investigation of proapoptotic function of glyceraldehyde 3 phosphate deshydrogenase (GAPDH). GAPDH is a well known protein, involved into glycolysis, but can also play a role into apoptosis. In this context, we have shown that an increase in the mitochondrial GAPDH induces the activation of the mitochondrial permeability transition, through its interaction with the porine VDAC. Using different but complementary approaches during this work allowed us to characterize one exogenous (NFV) and two endogenous (Bax, GAPDH) regulators of mitochondrial step of cell death

La protéine proapoptotique Bax joue un rôle fondamental au cours de la voie intrinsèque de l’apoptose. Elle participe au déclenchement de la mort en permettant la libération de facteurs apoptogéniques mitochondriaux vers le cytosol. Un des points-clé de la fonction de Bax est son activation, caractérisée par la transition entre une forme cytosolique, globulaire et inactive de la protéine et une conformation mitochondriale, membranaire et active. Les différentes étapes de l’activation de Bax sont relativement bien connues, toutefois un grand nombre de questions reste en suspens quant-à leur régulation.Ce travail s’est focalisé sur la régulation de l’activation de Bax par les kinases Akt et GSK-3β ainsi que par la protéine antiapoptotique Bcl-xL . Ces régulations ont été caractérisées en exprimant la protéine Bax humaine chez la levure Saccharomyces cerevisiae, un paradigme d’étude simplifié qui permet d’accéder aux composantes individuelles des mécanismes d’activation de Bax.Les données obtenues suggèrent qu’il existe deux étapes régulées indépendamment au cours de l’activation de Bax. Nous avons montré que la protéine kinase GSK-3β favorise l’adressage de Bax vers la mitochondrie mais qu’elle n’entraîne pas un changement de conformation suffisant à son activation complète et à la perméabilisation de la membrane mitochondriale externe. Des changements de conformations complémentaires de Bax sont requis pour conduire à une forme capable d’entraîner la libération des facteurs apoptogéniques mitochondriaux. La protéine kinase Akt est impliquée dans le contrôle de Bax via la phosphorylation de la sérine 184 et participe à l’inhibition de l’apoptose. Nous avons mis en évidence qu’une mutation phosphomimétique de la sérine 184 ou l’expression d’Akt, en l’absence de partenaires antiapoptotiques, stimulent un changement de conformation de Bax vers une forme active. Akt semble donc plus jouer un rôle sur la conformation de Bax qu’entraîner une inhibition directe. La présence de protéines antiapoptotiques serait ainsi requise pour l’inhibition de Bax en présence d’Akt.D’autre part, nous nous sommmes intéressés aux mécanismes d’action de la protéine antiapoptotique Bcl-xL . Nous avons déterminé que Bcl-xL pouvait favoriser l’adressage de Bax vers la membrane mitochondriale tout en exerçant un rôle antiapoptotique. Ceci suggère que Bcl-xL intervienne dans le contrôle des étapes tardives de l’activation de Bax. Ce contrôle est dépendant d’une interaction stable entre les deux protéines. Inversement, un variant de Bcl-xL n’interagissant que de façon transitoire avec Bax (Bcl-xL ∆C) entraîne l’activation de Bax. Cette observation est en faveur d’un modèle d’activation indirecte de Bax consécutive à la rupture de l’interaction avec Bcl-xL et dans lequel les protéines à BH3-seulement telles que Bad joueraient un rôle crucial
Proapoptotic protein Bax plays a major role during apoptosis intrinsic pathway. Bax promotes cell death by inducing the release of apoptogenic factors from mitochondria to cytosol. Bax activation is a key step of its function which involves a change from a globular, cytosolic and inactive conformation to an active mitochondrial, membrane inserted conformation. Bax activation substeps are rather well known, however their regulation remains to be characterized.This work focuses on the study of the regulation of Bax activation by kinases Akt and GSK-3β and by antiapoptotic protein Bcl-xL . Human Bax regulations have been studied by expressing the protein in yeast Saccharomyces cerevisiae which represents a simplified paradigm for the understanding of the individual components of Bax activation mecha- nisms.Our data suggest that there are two independently regulated steps during Bax activation. We showed that GSK-3β expression led to Bax addressing to mitochondria but was not sufficent to promote a complete activation and mitochondrial outer membrane premeabilization. Further conformational changes are required to promote Bax full activation and the release of mitochondrial apoptotic factors. Protein kinase Akt is involved in Bax activation control through the phosphorylation of serine 184 and contributes to apoptosis inhibition. We observed that either a phosphomimetic mutation of serine 184 or coexpression of Akt, in the absence of antiapoptotic partners, were responsible of Bax conformational change into an active form. By itself Akt did not inhibit Bax but appeared more likely to control its conformational change. Thus, implication of antiapoptotic proteins seems to be critical in a model of Bax inhibition by Akt.Furthermore, we tried to understand the molecular mechanisms of antiapoptotic protein Bcl-xL inhibition on Bax. We determined that Bcl-xL could increase Bax mitochondrial localization while leading to its inhibition suggesting that Bcl-xL controled Bax late activation steps. Bax inhibition was dependent on a stable interaction with Bcl-xL . Conversely, a variant of Bcl-xL having a transitory interaction with Bax (Bcl-xL ∆C) was able to promote Bax activation. This supports a model of Bax indirect activation following the rupture of interaction with Bcl-xL in which BH3-only proteins like Bad would play an important role

Les dommages tissulaires associés à l'ischémie/reperfusion ont été largement étudiés. Plusieurs études ont montré que des dysfonctionnements mitochondriaux sont responsables de la survenue de ces dommages, et que la transition de perméabilité pourrait y être impliquée. Cette transition de perméabilité est médiée par l'ouverture du pore de transition de perméabilité (PTP). Cette ouverture du PTP pourrait survenir pendant la phase d'ischémie ou pendant la phase de reperfusion. L'objectif de ce travail était de visualiser l'ouverture du PTP dans des conditions d'ischémie/reperfusion sur cellules intactes (HMEC-1 et INS-1) et d'étudier son implication dans ce phénomène. Nous avons pu visualiser pour la première fois l'ouverture du PTP par le suivi des dommages qu'elle engendre (sortie du NADH et la chute du ΔΨ) induits par une ischémie/reperfusion. Nous avons constaté que l'activation du PTP a lieu pendant la phase d'ischémie tant dans les cellules HMEC-1 que dans les cellules INS-1. Cette induction a été prévenue dans les deux modèles cellulaires par la cyclosporine A. Nos résultats suggèrent également que le complexe I pourrait être impliqué dans la prévention de la chute du ΔΨ et de la sortie du NADH. Nous avons aussi montré que la capacité de rétention calcique des cellules perméabilisées diminue à l'ischémie et que cette diminution disparait après 60 minutes de reperfusion. Ainsi, la visualisation de l'ouverture du PTP dans un modèle d'ischémie/reperfusion constituerait une piste intéressante qui apporterait plus de certitude quant à l'implication du PTP dans ce phénomène. De plus, l'étude du phénomène d'ischémie in vitro, apporterait plus de réponses quant à l'implication des modifications du fonctionnement cellulaire dans les dommages tissulaires.

Dans nos sociétés modernes, la presbyacousie, perte de l'audition liée au vieillissement, prend une place de plus en plus importante. Outre le vieillissement de la population, la prévalence de la presbyacousie est accentuée par l'exposition à des bruits toujours plus forts (concerts, baladeurs, environnement de travail, ...) et la prise de médicaments ototoxiques (cisplatine, aminoglycosides, ...). À ce jour, le lien entre l'endommagement de l'ADN, le stress oxydant et l'inflammation avec l'apparition précoce de certaines maladies liées au vieillissement (Alzheimer, démence, Parkinson, …) a été démontré. Cependant, il n'existe aucune donnée concernant le rôle des dommages de l'ADN dans la dégénérescence des cellules cochléaires et trop peu d'études témoignent de l'existence d'un stress oxydant dans la presbyacousie.Le premier objet de ce travail a donc été d'élucider le rôle des dommages de l'ADN dans la dégénérescence des cellules cochléaires. Pour ce faire, nous avons utilisé des approches de biologie moléculaire et cellulaire pour identifier des voies de signalisation associées aux lésions de l'ADN dans des explants cochléaires issus de souris âgées de 3 jours traités au cisplatine (CDDP). Cet antinéoplasique tire sa cytotoxicité de sa capacité à causer directement des dommages dans l'ADN et est connu pour ses effets nocifs sur l'audition en induisant la dégénérescence des cellules cochléaires. Enfin, nous avons étudié l'implication de p53, un des effecteurs clés de signalisation des dommages de l'ADN, in vivo en traitant avec le CDDP des souris dont le gène codant pour ce facteur de transcription a été invalidé. Nos résultats montrent que le CDDP induit des cassures double brin dans l'ADN des cellules ciliées qui sont à l'origine de l'activation de la voie ATM/DNA¬PK-Chk2-p53, de la formation de foyers βH2AX et 53BP1 et, in fine, de la mort de ces cellules par apoptose. Les cellules ciliées internes, plus résistantes au CDDP que les cellules ciliées externes, présentent une signalisation moins intense et un nombre inférieur de cassures double brin, un phénomène qui pourrait expliquer leur plus faible sensibilité. Nous avons également montré que l'absence de p53 in vivo prévient les pertes d'audition et la dégénérescence des cellules ciliées externes après injection intrapéritonéale de CDDP. Le second objectif a porté sur l'étude des effets délétères du vieillissement sur l'audition et les mécanismes moléculaires associés à cette pathologie. Pour ce faire, nous avons choisi les souris SAMP8 (senescence accelerated mice prone 8), un modèle bien établi de sénescence précoce et des maladies liées au vieillissement. Nous avons combiné des approches fonctionnelles, morphologiques, moléculaires et cellulaires pour phénotyper ces souris et identifier l'origine de l'atteinte de leur audition au cours du vieillissement. L'étude des souris SAMP8 nous a permis de montrer qu'elles sont un excellent modèle de presbyacousie mixte (atteinte de la strie vasculaire, de l'organe de Corti et du ganglion spiral), résumant la pathologie humaine. La dégénérescence des structures cochléaires que nous avons observée chez ces souris provient d'une profonde dysfonction mitochondriale, de l'augmentation du stress oxydant et des processus inflammatoires, d'un stress autophagique et de l'endommagement de l'ADN. Les mécanismes moléculaires aboutissant à la perte des cellules cochléaires constituent autant de cibles thérapeutiques à explorer dans l'avenir afin de tenter de prévenir les troubles de l'audition imputables à l'exposition au bruit ou aux médicaments ototoxiques et au vieillissement
Our modern society is confronted with a dramatic increase in the number of patients suffering from presbycusis or age related hearing loss. Besides aging, presbycusis prevalence increases with exposition to loud noise (concerts, Walkman, work environment …) and ototoxic drugs (cisplatin, aminoglycosides …). It was reported that the early onset of some aging related diseases (Alzheimer, dementia, Parkinson …) are linked mechanistically to DNA damage, oxidative stress and inflammation. However, the role of DNA damages in cochlear cells degeneration is totally unknown and only few studies have investigated the implication of oxidative stress in presbycusis.The first goal of this study consisted in clarifying the role of DNA damage in cochlear cell degeneration. For this purpose, we used molecular and cellular biology approaches to identify the activation of DNA damage response pathways in cisplatin (CDDP) treated 3 days postnatal mouse cochlear explants in culture. Indeed, the cytotoxicity of CDDP arises from its capacity to directly damage DNA. It is also well known that one of the major dose limiting side effects of CDDP is its ototoxicity. Finally, we investigated the role of p53, a key effector of the DNA damage response pathway, in vivo by treating p53 knockout mice with CDDP. Our results show that CDDP induces double strand breaks leading to the activation of ATM-/DNA PK¬ Chk2 p53 pathway, βH2AX and 53BP1 foci formation and, in fine, apoptotic cell death. Inner hair cells, which are more resistant to CDDP treatment than outer hair cells, show a less intense signaling and fewer double strand breaks. This phenomenon could explain their weaker sensitivity to CDDP treatment. In vivo, p53 deletion prevents hearing loss and outer hair cells degeneration induced bay intraperitoneal injection of CDDP.The second goal consisted in studying the deleterious effects of aging on hearing and the molecular mechanisms involved in this pathology. Here, we studied the mechanism of presbycusis using the senescence-accelerated mouse prone 8 (SAMP8) which is a useful model to probe the effects of aging on biological processes. Based on complementary approaches combining functional, morphological, biochemistry, cellular and molecular biology, we found that the SAMP8 strain displays premature hearing loss and cochlear degeneration recapitulating the processes observed in human presbycusis (i.e. strial, sensory and neural degeneration). The molecular mechanisms associated with premature presbycusis in SAMP8 mice involve oxidative stress, mitochondrial dysfunction, chronic inflammation, autophagic stress and DNA damages. Molecular mechanisms leading to cochlear cells loss represent therapeutic targets of interest to explore in the future in order to prevent hearing impairments due to loud sound or ototoxic drugs exposure and due to aging

L’inactivation du gène de susceptibilité au rétinoblastome (rb) est une étape préalable au développement de nombreux cancers. De façon cohérente avec son rôle de suppresseur de tumeur, pRb inhibe la prolifération cellulaire. Le rôle de pRb dans le contrôle de l’apoptose est plus complexe et les mécanismes moléculaires sous-jacents à ces fonctions sont peu décrits.La drosophile possède un homologue de rb, appelé rbf1. Au cours de ma thèse, j’ai caractérisé la voie d’apoptose induite par Rbf1 dans un tissu prolifératif. J’ai pu montrer que Rbf1 coopère avec le facteur de transcription dE2F2 et le complexe dREAM pour stimuler la transcription du gène how codant pour une protéine de liaison aux ARN capable d’induire la dégradation des transcrits de l’inhibiteur de caspases diap1. Par ailleurs, ces protéines répriment la transcription du gène buffy (gène anti apoptotique de la famille Bcl 2) et ainsi déclenchent une voie de mort mitochondriale dépendante de debcl (gène pro apoptotique de la famille Bcl 2). La fragmentation du réseau mitochondrial, dépendante de la protéine pro-fission Drp1, favorise l’accumulation d’espèces activées de l’oxygène, à l'origine de l'activation de la voie JNK et in fine de l’apoptose. Ces travaux précisent le mode d'action des protéines de la famille Bcl-2 de drosophile. Ils apportent de nouvelles données concernant le rôle pro-apoptotique de Rbf1 et devraient permettre de mieux comprendre l'activité suppresseur de tumeur de pRb. Enfin, j’ai pu montrer que l’apoptose induite par Rbf1 conduit à un mécanisme de prolifération compensatoire et caractériser pour la première fois des acteurs spécifiques de la voie JNK impliqués dans ce mécanisme
The inactivation of the retinoblastoma susceptibility gene (rb) is a preliminary step in the development of many cancers. Consistent with its role of tumor suppressor, pRb inhibits cell proliferation. The role of pRb in apoptosis control is more complex and the molecular mechanisms underlying these functions are poorly described.rbf1 is the rb Drosophila homologue. During my PhD, I characterized the apoptosis pathway induced by Rbf1 in a proliferative tissue. I showed that Rbf1 cooperates with the dE2F2 transcription factor and with the dREAM complex to stimulate the transcription of how gene coding for a RNA binding protein able to induce the degradation of diap1 caspase inhibitor transcripts. Furthermore, Rbf1/dE2F2 proteins repress the transcription of buffy (anti-apoptotic gene of Bcl-2 family) and thus trigger a mitochondrial death pathway dependent of debcl (pro-apoptotic gene of Bcl-2 family). A mitochondrial fragmentation dependent of the Drp1 pro-fission protein promotes the accumulation of reactive oxygen species, which in turn causes JNK pathway activation, leading ultimately to apoptosis. This work clarifies the mechanism of action of Bcl-2 proteins in drosophila. It brings new data about Rbf1 pro-apoptotic function and should provide a better understanding of pRb tumor suppressor activity. Finally, I showed that Rbf1-induced apoptosis leads to compensatory proliferation and defined for the first time specific actors of the JNK pathway involved in this proliferation

Les Glycosaminoglycannes (GAGs) sont une famille de polysaccharides principalement localisés au niveau de la matrice extracellulaire et de la membrane plasmique. Ils peuvent interagir avec des facteurs de croissance et des cytokines pour réguler leurs activités, participer à des transports protéiques à travers la membrane cellulaire, moduler les activités de certaines enzymes telles que les cathepsines (enzymes lysosomales). Toutes ces activités démontrent que les GAGs jouent des rôles primordiaux dans la régulation de la croissance, la différenciation, l'adhésion, l'inflammation et la mort cellulaire.L'implication de ces polysaccharides dans la régulation de l'apoptose via la voie mitochondriale n'a toujours pas été déterminée. Ici, nous démontrons dans un modèle cellulaire de fibroblastes de peau en culture primaire, soumis à un stress oxydatif par de l'H2O2, qu'un mimétique des GAGs, l'OTR4120, est capable de protéger la membrane du lysosome, de réduire le taux de ROS intracellulaires et d'inhiber la chute du potentiel de membrane mitochondrial et ainsi d'empêcher la libération du cytochrome c et l'activation des activités caspases-9 et -3 sans affecter la voie extrinsèque de l'apoptose. Les héparanes sulfates et les chondroïtines sulfates au contraire de l'héparine, ont montré un effet protecteur de l'apoptose en inhibant les protéines clefs de ce processus de mort cellulaire. Ainsi, les GAGs naturels et l'OTR4120 sont capables s'opposer à l'apoptose, en inhibant l'activité de la cathepsine D libérée dans le cytosol, empêchant ainsi l'activation de la voie intrinsèque de l'apoptose via la mitochondrie. Ces résultats ouvrent de nouveaux horizons notamment dans certaines maladies où le stress oxydatif est impliqué comme c'est le cas de certaines maladies neurodégénératives comme la maladie de Parkinson.La cause de la maladie de Parkinson (MP) qui affecte les neurones dopaminergiques demeure encore mystérieuse, bien que différentes preuves soutiennent les hypothèses impliquant des dysfonctionnements mitochondriaux et une accumulation d'α-synucléine comme étant les événements majeurs dans cette physiopathologie. Récemment, la cathepsine D a été impliquée dans des processus de mort cellulaire et montrée comme étant surexprimée dans des modèles de la MP. De plus, apparait être l'une des principales enzymes responsables de la dégradation de l'α-synucléine. Puisque les glycosaminoglycannes (GAGs) sont capables de réguler l'activité de la cathepsine D dans des cellules en culture dans une condition de stress, nous avons cherché à démontrer si GAGs pouvaient être localisés à un niveau intracellulaire, où ils pourraient interagir avec la cathepsine D et s'ils étaient capables de réguler l'accumulation/dégradation de l'α-synucléine. Ainsi nous avons mis en place un modèle cellulaire de la MP induit par le MPP+. Nous avons observé que l'expression génétique des enzymes de la biosynthèse des GAGs (HS2ST, HS6ST et CHST8) a été modifiée dans les cellules stressées par la neurotoxine et que leurs taux mesurés par leurs sulfates étaient augmentés plus précisément au niveau des HS. Au contraire, l'absence de GAGs sulfatés induit par le chlorate de sodium, un inhibiteur de la PAPs (donneur de sulfates), a permis d'augmenter l'activité de l'activité cathepsine D et également d'inhiber l'accumulation ou d'induire la dégradation de l'α-synucléine. Pour la première fois, il a été montré que les GAGs sont capables d'agir sur l'activité cathepsine D à l'intérieur de la cellule et de réguler l'accumulation/dégradation de l'α-synucléine
Pas de résumé anglais

La greffe de foie est un traitement de dernier recours contre les maladies hépatiques aigue͏̈s ou chroniques. Elle implique une ischémie hypothermique suivie d'une reperfusion normothermique délétère pour l'organe à implanter, car elle cause des lésions aux mitochondries. Or, ces organites jouent un rôle décisif dans la mort cellulaire par nécrose et par apoptose par induction du pore de transition de perméabilité. Le but de cette thèse est d'étudier l'implication de ce pore dans les lésions provoquées au cours d'une ischémie-reperfusion et de déterminer si il constitue une cible pharmacologique pertinente pour protéger l'organe lors de ces épisodes. Ce travail montre que le pore s'ouvre lors de la reperfusion, ce qui est corrélé avec des lésions mitochondriales et cellulaires. Une inhibition directe de l'ouverture du pore géant par la cyclosporine A, ou indirecte par le resvératrol, permet de limiter les lésions mitochondriales, de diminuer de façon dose-dépendante l'apoptose, mais reste sans effet sur la nécrose
Liver transplantation is the last resort treatment for end-stage liver diseases. But the cold ischemia followed by the warm reoxygenation required by the surgery can cause damages to mitochondria. This organelle could be involved in hepatocyte cell death since opening of the permeability transition pore (PTP) can lead to necrosis and apoptosis. The purpose of this work was to study the involvement of PTP in ischemia-reperfusion damages and to determine if PTP represents a relevant pharmacologic target to protect liver during these episodes. Results show that PTP opening occured during reperfusion and that it was correlated with mitochondrial and cellular damages. Direct or indirect PTP inhibition by cyclosporine A or resveratrol, respectively, protected partially mitochondria, limited apoptosis in a concentration-dependent manner, but had no effect on necrosis

Mitochondria exist in a dynamic network regulated by the opposing processes of mitochondrial fusion and fission. Regulation of mitochondrial morphology is critical for metabolism, quality control and cell survival, among other cellular processes. Large GTPases are responsible for shaping the mitochondrial network. Mitofusins 1 and 2 and Opa1 regulate outer and inner mitochondrial membrane fusion, respectively. Conversely, Drp1 is recruited to mitochondria to carry out fission. Although many proteins have been implicated in these processes, there are still many unknowns. We sought to identify novel regulators of mitochondrial morphology and conducted a genome-wide RNAi screen to identify candidate genes. We identified Reactive Oxygen species Modulator 1 (ROMO1) as a novel regulator of mitochondrial fusion and cristae integrity. In the absence of ROMO1, the mitochondrial network fragments and cristae are lost. These defects lead to impaired mitochondrial respiration and sensitization to cytochrome c release and downstream apoptosis. ROMO1 is regulated by mitochondrial REDOX at 4 cysteine residues that couple REDOX signaling to mitochondrial morphology. We have characterized ROMO1 as an interactor with the MINOS complex, required for cristae junction maintenance, and the inner mitochondrial membrane fusion GTPase OPA1. Through these interactions ROMO1 couples cristae junction security to mitochondrial fusion.

L’apoptose est une mort cellulaire programmée nécessaire à l’homéostasie tissulaireau cours du développement. Les cellules cancéreuses acquièrent la capacité à échapper àl’apoptose. Restaurer la capacité des cellules tumorales à mourir est une stratégiethérapeutique qui permettrait de lutter contre le cancer. Il est donc important d’identifier denouvelles cibles au sein de la signalisation apoptotique et de tester de nouvelles molécules.La mitochondrie, intégrateur central des signaux de mort cellulaire et actrice de l’exécution de l’apoptose, est une cible de choix pour développer des thérapies anti-tumorales.L’ANT (Adenine Nucleotide Translocase) est la protéine majoritaire de la membrane internemitochondriale. Elle est possède une fonction de transporteur ATP/ADP, en conditionphysiologique, et suite à un stimulus apoptotique, acquiert une activité de pore létal. Ainsi, ilest intéressant d’inhiber la fonction transporteur et d’activer la fonction pore d’ANT pourinduire l’apoptose. Il existe quatre isoformes d’ANT : ANT1, 2, 3 et 4. Nous avons étudié lerôle d’ANT4, récemment identifiée, dans la signalisation apoptotique. Notre étude montre lerôle anti-apoptotique d’ANT4 dans des cellules cancéreuses et l’intérêt d’ANT comme ciblethérapeutique anti-cancéreuse.Une augmentation de l’expression de protéines anti-apoptotiques, l’adaptation auxstress cellulaires et l’activation de voies de survie sont les mécanismes les plus fréquemmentdécrits pour expliquer la chimiorésistance du mélanome. A l’aide de modèles cellulaires, nousavons étudié la capacité de deux nouvelles molécules : Withaférine A (WFA) et Plumbagine(PBG) à stimuler l’apoptose et déterminé les mécanismes moléculaires impliqués. Nous avonsmontré la capacité de WFA à induire spécifiquement la voie mitochondriale de l’apoptose decellules de mélanome par un mécanisme dépendant de la production d’espèces activées del’oxygène (EAO) qui déclenchent la voie mitochondriale et de la diminution du niveaud’expression de la protéine anti-apoptotique Bcl-2. En revanche, PBG induit une mortapoptotique et une mort nécrotique des cellules de mélanomes. Dans les deux cas, PBG agitpar l’augmentation des EAO suite au déclenchement d’un stress du reticulum endoplasmique.WFA et PBG sont donc deux molécules pro-oxydantes capables d’induire la mort des cellulesde mélanome en tirant partie de leur vulnérabilité au stress oxydant.Nos travaux ont participé à la mise en évidence d’une cible thérapeutique anticancéreusepotentielle et de deux agents capables d’induire la mort cellulaire dans un contextede chimiorésistance
Apoptosis is a programmed cell death process necessary for tissue homeostasis duringdevelopment. Cancer cells acquire the capacity to evade apoptosis. Restoring tumor cellsability to die is a therapeutic strategy against cancer. It is therefore important to identify newtherapeutic targets within the apoptotic signaling and to test new molecules.Mitochondrion being a central integrator of cell death signals and a key player inapoptosis execution, it is a target of choice to develop new anticancer therapies. ANT(Adenine Nucleotide Translocase) is the main protein of the inner mitochondrial membrane. Itpresents a ADP/ATP transporter function in physiological conditions and acquire a lethal poreactivity upon apoptotic stimulus. It is thus interesting to inhibit the transporter function and- 6 -activate ANT pore function in order to induce apoptosis. There are four isoforms: ANT1, 2, 3and 4. We studied the role of the recently discovered ANT4 in apoptotic signaling. Our studyemphasize ANT4 anti-apoptotic role in cancer cells and ANT potential as an anticancertherapeutic target.Increase in anti-apoptotic proteins, adaptation to cellular stress and activation ofsurvival pathways are the main mechanisms responsible for chemoresistance. Using cellularmodels we studied the ability of two molecules: Withaferin A (WFA) and Plumbagin (PBG)to stimulate apoptosis and determined the molecular mechanisms involved. We showed WFAcapacity to specifically induce the mitochondrial pathway of apoptosis in melanoma cellsthrough reactive oxygen species (ROS) generation leading to mitochondrial pathwayactivation and the decrease in anti-apoptotic protein Bcl-2 expression level. However, PBG isresponsible for apoptosis and necrosis induction in melanoma cells. In both cases PBG actsthrough an increase in ROS following endoplasmic reticulum stress. WFA and PBG are thustwo pro-oxidant molecules able to induce the death of melanoma cells by taking advantage oftheir vulnerability to oxidative stress.Our work took part in the demonstration of a potential anticancer target and two agentsable to induce cell death in a context of chemoresistance

Thesis (Ph. D.)--University of California, San Diego, 2007.
Title from first page of PDF file (viewed August 31, 2007). Available via ProQuest Digital Dissertations. Vita. Includes bibliographical references (p. 129-140).

Mitochondria are essential organelles for life and death of the cell: they produce most of the cellular ATP (Danial et al., 2003), regulate cytosolic Ca2+ signalling (Rizzuto et al., 2000), and integrate and amplify different apoptotic stimuli (Green and Kroemer, 2004). Such a functional versatility is matched by a complex and dynamic morphology, both at the ultrastructural and at the cellular level (Griparic and van der Bliek). At the ultrastructural level, the mitochondrial cristae constitute a separate compartment connected to the thin intermembrane space by narrow tubular junctions (Frey and Mannella, 2000). In the cytosol, mitochondria are organized in a network of individual organelles that dynamically fuse and divide. Mitochondrial morphology results from the equilibrium between fusion and fission processes, controlled by a family of "mitochondria-shaping" proteins, many of which are dynamin-related proteins initially identified by genetic screens in buddying yeast (Dimmer et al., 2002; Shaw and Nunnari, 2002). Dynamins are ubiquitous mechano-enzymes that hydrolyze GTP to regulate fusion, fission, tubulation and elongation of cellular membranes (McNiven et al., 2000). In mammalians, mitochondrial fission is controlled by a cytosolic dynamin related protein DRP-1 (Smirnova et al., 2001) that translocates to sites of mitochondrial fragmentation where it binds to FIS1, its adapter in the outer membrane (Yoon et al., 2003) (James et al., 2003). Fusion is controlled by mitofusin-1 (MFN1) and-2 (MFN2), two large GTPases of the outer mitochondrial membrane, orthologues of S. cerevisiae Fzo1p (Rapaport et al., 1998). OPA1, the mammalian homologue of S. cerevisiae Mgm1p, is the only dynamin-related protein of the inner mitochondrial membrane (Olichon et al., 2002). Loss-of-function or dominant-negative mutations in Opa1 are associated with autosomal dominant optic atrophy (DOA), the leading cause of inherited optic neuropathy, characterized by retinal ganglion cells degeneration followed by ascending atrophy of the optic nerve (Alexander et al., 2000; Delettre et al., 2000). The aim of my PhD has been to generate, use and analyze genetic models in order to unravel the biological function of OPA1 as well as its regulation. In order to dissect the biological function of OPA1, we undertook a combination of genetics and imaging to address its role in regulating mitochondrial fusion/fission equilibrium. Imaging of wild type mouse embryonic fibroblasts (MEFs) cotransfected with a mitochondrially targeted cyan fluorescent protein (mtCFP) showed mitochondria as individual organelles, rod or round-shaped, with an average length of 3±0.34 µm along their major axis. Morphometric analysis confirmed that only 23% of the analyzed cells displayed elongated mitochondria, i.e. cells with axial length >5 µm and roundness index <0.5 in more than 50% of mitochondria. Cotransfection of OPA1 with mtCFP induced visible changes in the shape of the mitochondrial reticulum. The rod-shaped mitochondria appeared now to be interconnected in a branched network. Morphometric analysis confirmed this mitochondria-shaping effect of OPA1, with more than 50% of the cells analyzed showing elongated mitochondria. Furthermore, we analyzed the effect of pathogenic mutations of OPA1 on its ability to elongate mitochondria. A missense mutation in the GTPase domain (K301A) that reduces the GTPase activity of more than 80%, as well as a truncative one in the coiled coil domain (R905stop), which eliminates the C-terminal coiled-coil domain required in protein-protein interactions, abolished the ability of OPA1 to elongate mitochondria, indicating that it requires a functional GTPase and coiled-coil domain. To address the effect of reduced OPA1 levels on mitochondrial morphology we turned to stable, plasmid-generated RNA interference (RNAi). In cell clones where OPA1 was ablated, mitochondria appeared globular and fragmented as opposed to the rod, elongated organelles of the control clones. Tubulation induced by OPA1 is not the results of simple juxtaposition of mitochondria, but it represents the steady state appearance of increased mitochondrial fusion events, as substantiated by assays of mitochondrial fusion in polykarions induced by PEG treatment. Expression of OPA1 significantly speeded up mixing of matricial content, whereas its downregulation reduced mitochondrial fusion. In yeast, the pro-fusion activity of Mgm1p, the orthologue of OPA1, depends on the outer membrane mitochondria-shaping protein Fzo1p. We therefore wished to ascertain whether this paradigm was maintained in higher eukaryotes. We turned to a genetic approach, testing the ability of overexpressed OPA1 to promote mitochondrial tubulation in MEFs deficient for either Mfn1 or Mfn2. Expression of OPA1 induced mitochondrial tabulation and fusion in wt and in Mfn2-/- but not in Mfn1-/- cells. This defect was complemented by re-introduction of MFN1 but not MFN2, unequivocally identifying outer membrane MFN1 as an essential functional partner of OPA1. Moreover, MFN1 was unable to promote mitochondrial elongation if OPA1 had been ablated. Thus, OPA1 and MFN1 appear to functionally depend one on each other. To address whether Mfn1-/- MEFs displayed any defect in the preparatory events of mitochondrial juxtaposition and docking, we performed 4D-imaging of mitochondria, i.e. time series of z-stacks of mitochondrial images. The total number of contacts between mitochondria was not affected by OPA1 overexpression or by MFN deficiency. OPA1 facilitated fusion following contacts between wt and Mfn2-/- but not Mfn1-/- mitochondria. Taken together, our results suggested that OPA1 requires MFN1 to fuse the membranes of two juxtaposed mitochondria and not to produce inter-mitochondrial contacts. Our genetic analysis provided the first evidence of a functional diversity between MFN1 and MFN2, suggesting a functional axis between OPA1 and MFN1 (Cipolat et al., 2004). The discovery that OPA1 is a pro-fusion protein raised the question of whether this protein participated in the regulation of apoptosis, during which fusion is impaired. We therefore decided to genetically dissect the role of OPA1 in fusion and apoptosis. We could demonstrate that OPA1 has an antiapoptotic activity, controlling the cristae remodelling pathway of apoptosis, independently of mitochondrial fusion. OPA1 did not interfere with the activation of the core mitochondrial apoptotic pathway of BAX and BAK activation. Yet OPA1 inhibited the release of cytochrome c by preventing the remodelling of the cristae and the intramitochondrial redistribution of cytochrome c. Inactivating mutations in the GTPase domain of OPA1 impaired its anti-apoptotic activity, enhancing susceptibility to apoptosis induced by stimuli that recruit the mitochondrial pathway. While our results contributed to clarify the biological function of OPA1, they left open a number of questions. In particular, if the pro-fusion activity of OPA1 was dispensable for the inhibition of apoptosis, how was this function controlled? In yeast Mgm1p is processed by the inner mitochondrial membrane rhomboid protease Rbd1/Pcp1 into a short active form, responsible for the effects of Mgm1p on mitochondrial morphology (Herlan et al., 2003; McQuibban et al., 2003). The mammalian orthologue of Rbd1p, PARL, could similarly play a role in the regulation of one of the two biological functions we ascribed to OPA1, i.e. its effect in mitochondrial fusion and its anti-apoptotic activity. In order to address this issue, we decided to analyze the phenotype of a mouse model of Parl deletion. Parl-/- mice were born with normal Mendelian frequency and developed normally up to 4 weeks. From then on, mice displayed severe growth retardation and progressive atrophy in multiple tissues, leading to cachexia and death. The atrophy of Parl-/- tymi, spleens and muscular tissues was caused by an increased apoptosis of double-positive (CD4+CD8+) thymic lymphocytes, splenic B lymphocytes (B220+) and myoblasts, respectively. We investigated to what extent mitochondrial dysfunction and morphology dysregulation contributed to this multisystemic atrophy. PARL was not required for normal mitochondrial function: Parl-/- mitochondria did not display primary respiratory defects or latent mitochondrial dysfunction in hepatocytes, MEFs, primary myocytes and myotubes. Mitochondrial dysfunction therefore did not explain Parl-/- muscular atrophy and multisystem failure. Moreover Parl was not required for maintenance of mitochondrial shape and fusion, even in tissues severely affected by Parl ablation like muscle, and Parl was dispensable for regulation of mitochondrial dynamics by OPA1. We therefore investigated whether PARL regulates mitochondrial apoptotic machinery by analyzing apoptosis in MEFs treated with different intrinsic mitochondria utilizing stimuli. Parl-/- MEFs were more sensitive to all the stimuli tested as compared to their wt counterparts. Reintroduction of a catalytically active PARL showed that the defect was specific. PARL exerted its antiapoptotic effect at the mitochondrial level, since cytochrome c release and mitochondrial dysfunction following treatment with an apoptotic stimulus occurred faster in Parl-/- fibroblasts than in their relative wt counterparts. PARL did not regulate activation of the core BAX, BAK dependent apoptotic pathway, but it was required to keep in check the cristae remodelling pathway and to prevent mobilization of the cristae stores of cytochrome c during apoptosis. Since these results pointed to a role for PARL in the cristae remodelling pathway, regulated by OPA1, we ought to understand whether OPA1 required PARL to regulate apoptosis. OPA1 protected wt but not Parl-/- MEFs from apoptosis; furthermore, expression of OPA1 in Parl-/- MEFs did not reduce cytochrome c release, or mitochondrial depolarization following intrinsic stimuli. When Opa1 was silenced by siRNA in Parl-/- cells, they were no longer rescued by re-expression of PARL, demonstrating that PARL is genetically positioned upstream of OPA1. This genetic interaction was confirmed at multiple levels, since PARL and OPA1 interacted in a yeast two-hybrid and co-immunoprecipitation assays. PARL participated in the production of a soluble, IMS located, "anti-apoptotic" form of OPA1. The catalytic activity of PARL was required for the efficient production of soluble OPA1 and the re-introduction of a form of OPA1 in the IMS rescued the pro-apoptotic phenotype of Parl-/- cells. Thus, this IMS form resulted pivotal in controlling the pathway of cristae remodelling and cytocrome c redistribution. IMS and integral IM OPA1 indeed were both found to participate in the assembly of OPA1-containing oligomers that are early targets during cristae remodelling and greatly reduced in Parl /- mitochondria. The reduced level of OPA1 oligomers could account for the faster remodelling and cytochrome c mobilization observed in the absence of PARL. OPA1 affects complex cellular functions other than apoptosis, as substantiated in overexpression studies showing a role for this protein in movement of leukocytes (Campello et al., 2006) and formation of dendritic spines (Li et al., 2004). Furthermore, Opa1 knockout mice demonstrated that OPA1 is required for embryonic development. Homozygous mutant mice die in uterus at 13.5 dpc, with first notable developmental delay at E8.5 (Alavi et al., 2007). We therefore reasoned that levels of OPA1 are likely to affect development and function of multiple organs, by regulating mitochondrial fusion or apoptosis. In the last part of this Thesis, we therefore decided to study whether ablation of OPA1 influences differentiation of embryonic stem (ES) cells in vitro using a hanging-drop differentiation system. To this end, we analyzed an ES cell line where Opa1 had been gene trapped (Opa1gt), resulting in an Opa1+/- genotype. We compared the differentiation potential into cardiomyocytes and neurons of this Opa1gt ES cell line to its relative wt ES cell line. Opa1gt ES cells displayed a decreased capacity to differentiate into beating cardiomyocytes, while they retained a normal neuronal differentiation potential. These preliminary results indicate that OPA1 is a good candidate to regulate differentiation of ES cells in vitro. We now aim at understanding the molecular mechanism by which levels of OPA1 influence differentiation into cardiomyocytes. In conclusion, the data presented in this Thesis demonstrate genetically distinct roles of the mitochondrial dynamin related protein OPA1 in the regulation of organellar shape and apoptosis. The individuation that the functional axis between OPA1 and MFN1 (that regulates mitochondrial fusion) and the regulatory IMM network comprised of the couple substrate-protease Parl-Opa1 could perhaps even control embryonic differentiation opens novel, unexpected avenues to investigate the role of mitochondria in life and death of the cell.

Menschliche Mitochondrien enthalten etwa 1500 bis 2000 Proteine. Die meisten dieser Proteine werden im Zellkern kodiert und im Zytoplasma synthetisiert, und müssen daher über eine spezielle Maschinerie in die Mitochondrien transportiert werden. Obwohl mittlerweile viele Details über die Wirkungsweise dieser Proteinschleusen bekannt sind, wurden einige wichtige Aspekte des Proteinimports noch nicht ausreichend untersucht. Zum einen ist nicht bekannt, ob die einzelnen Importkomplexe einen Einfluss auf die mitochondrienvermittelte Apoptose haben. Weiterhin ist offen, welche genaue Rolle der Mitochondrienimport in der Pathogenese von Neisseria gonorrhoeae spielt. Außerdem ist unklar, ob Faktoren des Importapparates für die Aufrechterhaltung der mitochondrialen Morphologie notwendig sind. Um diese Fragestellungen zu untersuchen, wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit permanente Zelllinien hergestellt, in denen die Expression einzelner am Mitochondrienimport beteiligter Proteine mittels RNA-Interferenz (RNAi) inhibiert werden kann. Mithilfe dieser Zelllinien wurde getestet, ob die proapoptotischen Proteine Bax und Bak die Importmaschinerie benötigen, um in die äußere Mitochondrienmembran zu gelangen. Die Präsenz der beiden proapoptotischen Proteine in Mitochondrien während der Apoptose ist sehr entscheidend, da Bax und Bak in den Mitochondrien oligomerisieren und damit weitere Schritte der Apoptose einleiten. Im Widerspruch zu früheren Publikationen konnte hier gezeigt werden, dass die Translokation von Bax und Bak in die äußere Mitochondrienmembran unabhängig von Proteinimportfaktoren erfolgt. Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit dem Einfluss mitochondrialer Importproteine auf die Pathogenese von Neisseria gonorrhoeae. Das Neisserienprotein PorB transloziert während der Infektion in die Mitochondrien der Wirtszelle und induziert Apoptose. Aufgrund der strukturellen Ähnlichkeit von PorB zu bestimmten Proteinen der äußeren Mitochondrienmembran wurde bisher angenommen, dass PorB diesen endogenen Proteinen auf ihrem Importweg in die äußere Mitochondrienmembran folgt. Überraschenderweise wurde im Rahmen dieser Arbeit entdeckt, dass PorB nicht von allen Komplexen der Importmaschinerie in den Mitochondrien erkannt wird. Infolgedessen transloziert es in die innere Mitochondrienmembran und wirkt dadurch toxisch auf die Wirtszelle. In einem weiteren Projekt wurde untersucht, welche Rolle die Proteinimportkomplexe der äußeren mitochondrialen Membran in der Aufrechterhaltung der Mitochondrienmorphologie spielen. Unter Verwendung der beschriebenen Zelllinien wurde entdeckt, dass in Abwesenheit des SAM (sorting and assembly) Importkomplexes die Struktur der inneren Mitochondrienmembran derangiert ist. Es wurden zudem Hinweise darauf gefunden, dass die Ursache für diesen Befund in einer Unterbrechung von Kontaktstellen zwischen den beiden Mitochondrienmembranen liegen könnte, für deren Aufrechterhaltung möglicherweise der SAM-Komplex verantwortlich ist. Die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse erlauben neue Einblicke in verschiedene Aspekte des Proteinimports in Mitochondrien. Zudem wurde mit der Entwicklung der stabilen Zelllinien ein neues Model geschaffen, anhand dessen in Zukunft weitere Detail des mitochondrialen Proteinimports erforscht werden können.
Human mitochondria comprise about 1500 to 2000 proteins. While only 13 proteins are encoded by the mitochondrial DNA the vast majority of mitochondrial proteins is encoded in the nucleus, synthesized in the cytosol, and translocated into mitochondria by a special protein import machinery. Although many details are now known about its function several important aspects of protein import in mitochondria were not unraveled yet. To begin with, the influence of the different mitochondrial import complexes on apoptosis is not known. Further, the exact role of the protein import machineries in mitochondria in the pathogenesis of Neisseria gonorrhoeae has not been clarified yet. Moreover, the question whether factors involved in protein import are required for the maintenance of the mitochondrial morphology is still unsolved. In order to address these open issues, permanent cell lines were generated within the frame of the present thesis in which the expression of single proteins implicated in mitochondrial import can be inhibited via RNA interference (RNAi). Using these cell lines, it was investigated whether the proapoptotic proteins Bax and Bak require the import machinery in order to gain access to the outer mitochondrial membrane. The presence of both proapoptotic proteins in mitochondria is essential during apoptosis as Bax and Bak oligomerize in the outer mitochondrial membrane leading to the execution of apoptosis. In contrast to earlier publications, results presented here prove that the translocation of Bax and Bak into the outer mitochondrial membrane occurs independent of its import machineries. The second part of this thesis explores the influence of mitochondrial import proteins on the pathogenesis of Neisseria gonorrhoeae. The neisserial protein PorB translocates into the mitochondria of host cells during infection and induces apoptosis. Because of structural similarities of PorB to a certain class of proteins in the outer mitochondrial membrane, it was assumed that PorB would follow the import pathway of these endogenous proteins into the outer mitochondrial membrane. Surprisingly, it was found within the present study that PorB is not recognized by all complexes implicated in this import pathway. As a consequence, it translocates into the inner mitochondrial membrane to exert its toxic effect on the host cell. In a further project, the role of import complexes of the outer mitochondrial membrane in the maintenance of the mitochondrial morphology was investigated. Using the described cell lines, it was found that in the absence of the SAM (sorting and assembly) import device, the structure of the inner mitochondrial membrane was disrupted. Further, evidence was found that the reason for this phenotype could be an interruption of contact sites between the two mitochondrial membranes, whose preservation possibly requires the SAM complex. The results presented here allow new insights into different aspects of mitochondrial protein import. Further, with the development of the stable cell lines a new model was generated that will allow future investigations on details about mitochondrial protein import.

Mitochondria are essential organelles for the life of the cells since it is the major source of ATP, key molecule for many endoergonic reaction. Recently it has been demonstrated that mitochondrial play a key role in many other cellular processes like Ca2+ signaling and programmed cell death. Following an apoptotic insult mitochondria release cytochrome c and other proteins required in the cytosol for the activation of the effector caspases required for cell demise. What is remarkable about cytochrome c release is that is fast, complete and usually is not associated with mitochondrial swelling. Thanks to the advances in 3D electron microscopy it has been demonstrated that cristae are not just invagination of the inner mitochondrial membrane (IMM) as previously depicted by Palade (Palade, 1952) but rather distinct compartments of it, separated from the inter membrane space (IMS) by tubular narrow cristae junctions. The majority of cytochrome c and the other respiratory chain components are restricted in this compartment. To reach a complete cytochrome c release in the absence of mitochondrial swelling mitochondria remodel their internal structure: individual cristae fuse and tubular narrow cristae junctions widen; this process, defined cristae remodeling is associated with the mobilization of cytochrome c towards the IMS for its subsequent release across the outer mitochondrial membrane (OMM) (Scorrano et al., 2002). The molecular mechanism beyond this dynamic process is not well understood and in the laboratory where I did my doctoral Thesis it has been hypothesized that OPA1, the only dynamin related protein of the IMM (Alexander et al., 2000; Delettre et al., 2000) could control cristae remodeling. Dynamin related proteins are regulators of mitochondrial morphology promoting mitochondrial fusion and fission. To this family belong Mitofusins (MFN) 1 and 2 in the OMM and OPA1 that resides in the IMM. OPA1 is a large GTPase anchored in the IMM, facing the IMS (Olichon et al., 2002; Satoh et al., 2003); it has been shown that in yeast, its orhologue Mgm1p is required for fusion competent mitochondria by the cooperation with a protein of the same family on the OMM called Fzo1p. In our laboratory it has been demonstrated that in mammalian cells OPA1 promotes mitochondrial fusion through one of the two mammaliam orthologue of Fzo1p called MFN1. In 2000 two distinct laboratories demonstrated that mutations in OPA1 gene are the cause of dominant optic atrophy (ADOA), the leading case of inherited blindness in human, characterized by selective death of retinal ganglion cell (RGC) (Alexander et al., 2000; Delettre et al., 2000). The fact the mutation in a mitochondrial protein involved in mitochondrial morphology caused cell death opened a new scenario that corroborates the central position of mitochondria in regulating apoptotic signaling. The aim of my thesis was to analyze the role of OPA1 in mitochondria-dependent apoptosis. We started with a brute force approach by overexpressing OPA1 in murine embryonic fibroblasts (MEFs) and measuring cells viability in response to intrinsic apoptotic stimuli that specifically trigger apoptosis through the mitochondrial pathway. Overexpression of wt OPA1 but not of mutant in the GTPase domain (OPA1K301A) or a truncated mutant in the coiled coil domain (OPAR905*) is able to prevent from apoptosis induced by hydrogen peroxide, staurosporine, etoposide and overexpression of tBID, a BH3 only protein of the Bcl-2 family that promotes cristae remodeling. To confirm that OPA1 antiapoptotic activity was exerted at the mitochondrial level we analyzed two aspects of the mitochondrial dysfunction: cytochrome c release and mitochondrial depolarization. To this aim we overexpressed a mitochondrially targeted red fluorescent protein (mtRFP) as marker of the mitochondrial network and then we immunodecorated cytochrome c with a FITC-conjugated secondary antibody. OPA1 overexpression prevented cytochrome c release in response to intrinsic stimuli while its inactive mutant OPAK301A aggravated cytochrome c release kinetic. We then analyzed another aspect of the mitochondrial dysfunction: mitochondrial depolarization, taking advantage of the potentiometric probe tetramethylrhodamine-methyl ester (TMRM) which mitochondrial fluorescence is proportional to mitochondrial potential. Overexpression of OPA1, but not of its inactive K301A mutant, prevented mitochondrial depolarization induced by intrinsic stimuli, confirming that OPA may prevent from apoptosis at the mitochondrial level by reducing cytochrome c release and mitochondrial depolarization. How can a dynamin related protein prevent from apoptosis? We asked this because when our study was ongoing an intriguing hypotesys emerged: during apoptosis mitochondrial network undergoes irreversible massive fragmentation; this event and apoptotic cristae remodeling are required for complete cytochrome c release. In principle, OPA1 could prevent apoptosis at both of these levels either counteracting mitochondrial fragmentation thanks to its pro-fusion activity or by the regulation of cristae remodeling. To understand at which of these levels OPA1 was exerting its antiapototic activity, we started a genetic approach, overexpressing OPA1 in Mfn1-/-, where OPA1 pro-fusion activity was prejudiced. Overexpression of OPA1 in these cells prevented from apoptosis induced by intrinsic stimuli; in view of the fact that a residual pro-fusion activity of OPA1 could be mediated by the presence of MFN2 we repeated the same experiments in cells in which both mitofusins were ablated (DMF). Also in this conditions OPA1 prevented from apoptosis at the mitochondrial level, slowing down cytochrome c release kinetic. OPA1 has an antiapoptotica function that is independent of its pro-fusion activity on the mitochondrial network. At this point we asked whether OPA1 may have a role on apoptotic cristae remodeling. We generated stable cell lines that stably overexpressed OPA1 and its K301A mutant both in wt and in Mfn1-/- cells and a cell line depleted of OPA1 by short hairpin RNA interference (shOPA1RNAi). We then isolated mitochondria and measured cytochrome c release induced by recombinant caspase 8 cleaved BID (cBID) using a specific ELISA immunoassay. Stable overexpression of OPA1 is able to prevent cytochrome c relase independently of MFN1 while its downregulation dramatically increases its release. Using a specific assay we observed that OPA1 is also able to prevent cytochrome c mobilization from the cristae independently of MFN. These results were confirmed by the fact that overexpression of the OPA1K301A mutant increased cytochrome c mobilization that was almost complete when OPA1 levels were depleted by RNAi. A thorough morphometric analysis of isolated mitochondria from these cell lines, associated with 3D reconstruction of electron microscopy tomography, showed that OPA1 controls cristae morphology and prevents cristae junction widening in response to cBID. To better understand the molecular mechanism through which OPA1 controls cristae remodeling and cristae junctions diameter we based our hypothesis on the possible analogy with vesciculation processes regulated by cytosolic dynamin, where GTPase activity of it mediated mechanoenzimatic constriction of the vesicle collar. Despite this analogy, we should mention that OPA1, unlike dynamin, is located on the inner side of the membrane to be constricted and not on the outside as dynamin complicating the model. First, we analyzed biochemical characteristic of OPA1: gel filtration studies showed that OPA1 is eluted at very high molecular weight fractions (>600 KDa) and in response to cBID incubation it is retrieved in low molecular weight fractions. Parallel studies in our laboratory demonstrated that OPA1 is processed by a rhomboid protease, PARL, into a short form found soluble in the IMS that is responsible for the antiapototic but not of the pro-fusion activity of OPA1. We therefore reasoned that OPA1 could organize into high molecular weight complexes made up at least by the PARL generated soluble form and the membrane bound form of OPA1. To confirm this hypothesis we crosslinked this complex and confirmed the presence of a high molecular weight immunoreactive band for OPA1 that disappear following the mechanical expansion of the cristae induced by osmotic swelling. These crosslinker-stabilized oligomers contain both the soluble and the membrane bound forms of OPA1 as demonstrated by their immunoreactivity for properly tagged and co-expressed forms. The OPA1-containing oligomers is targeted by cBID in a time dependent manner and OPA1 overexpression stabilizes these complexes. We can conclude that OPA1 controls cytochrome c mobilization and cristae remodeling that occurs during apoptosis. This function of OPA1 is independent of MFNs and is correlated to the formation of high molecular weight complexes. The data collected so far on OPA1 antiapoptotic function open a new scenario. First we need to investigate on the molecular composition of these complexes in normal and apoptotic conditions. To this aim we started a biochemical study on OPA1-containing complexes in mitochondria isolated from different genetic background in normal and apoptotic conditions. The proteomic analysis of the proteins eventually found in complex with OPA1 will allow us to comprehend the function and regulation of OPA1 oligomers before and after cell death induction. OPA1 appears as a crucial protein in the apoptotic process; as a confirmation of this, it has been found that OPA1 is highly overexpressed in some lung cancer (Dean Fennel, personal communication); we then asked whether OPA1 could be a target for the development of new drugs that enhance apoptosis in tumor cells. To this aim, we started a collaboration with Stefano Moro from the Department of Medicinal Chemistry of the University of Padova, to generate a library of candidate inhibitors of OPA1 performing a virtual screening of compounds targeted to the GTPase pocket of OPA1 obtained following an homology modeling on the Dyctiostelium Discoideum GTPase domain of Dynamin A. In conclusion, the data presented in this doctoral thesis show that mitochondrial protein OPA1 participates in the regulation of cytochrome c mobilization and cristae remodeling during apoptosis. We demonstrated that OPA1 organizes into high molecular weight complexes which disruption correlates with cristae junction widening. This function is distinct from its role in mitochondrial morphology and this suggest a bifurcation and specialization of OPA1 function during evolution.

Ce travail a porté sur une nouvelle protéine impliquée dans l’apoptose, la mitogaligine, et plus particulièrement sur le fragment interne [31-53] responsable de son adressage à la mitochondrie. L’objectif général du projet est de comprendre au niveau atomique son mécanisme d’action sur les membranes mitochondriales. Le fragment d’adressage est à lui seul cytotoxique. C’est pourquoi j’ai concentré l’essentiel de mon travail de thèse sur son étude. Nous avons défini sa toxicité sur des cellules humaines et montré qu’il perturbait l’intégrité membranaire, excluant certaines protéines de la mitochondrie. Ce phénomène concorde avec le relargage de cytochrome c, à l’origine du déclenchement de l’apoptose par la voie mitochondriale. Pour mieux comprendre le mode d’action du fragment d’adressage et le rôle joué par la cardiolipine, lipide caractéristique des membranes mitochondriales, j’ai étudié par différentes techniques biophysiques complémentaires l’effet du milieu membranaire sur la structuration du peptide et l’effet du peptide sur la membrane. Le peptide a une très forte affinité (13nM) pour des membranes contenant de la cardiolipine. Il se place à plat sur la membrane, s’enfouissant dans l’interface, sans induire d’organisation particulière des lipides. De plus, nous avons mis en évidence que le peptide était capable d’induire une courbure positive de la membrane, ce qui va interférer avec de nombreux processus vitaux pour la cellule. Enfin, pour réaliser les études structurales et fonctionnelles de la protéine entière, j’ai participé aux premières étapes de production de mitogaligine, qui s’est avéré très délicate aussi bien par voie d’expression que par synthèse chimique
This work is about a new protein of apoptosis, mitogaligin, and more particularly about the internal fragment [31-53] responsible for its mitochondrial targeting. General aim of the project is to understand at the atomic scale its mechanism of action on mitochondrial membranes. The addressing fragment is cytotoxic by itself. That is the reason why I focused the main part of my work on this peptide. We defined its toxicity on human cells and showed that it was capable of disrupting the membrane integrity, excluding some proteins from mitochondrion. This phenomenon agrees with the release of cytochrom c, which induces apoptosis by the mitochondrial pathway. In order to better understand the mode of action of the addressing fragment and the role played by Cardiolipin, a specific lipid of mitochondrial membranes, I studied by various and complementary biophysics techniques the effect of membrane environments on the peptide structuration and the effect of the peptide on the membrane. The peptide has a very high affinity (13nM) for cardiolipin-containing membranes. It takes place parallel to the membrane, standing at the interface, without leading to a particular lipids organization. Furthermore, we highlighted that the peptide was capable of inducing a positive curvature of the membrane, what is going to interfere with numerous vital processes for the cell. Finally, to realize the structural and functional studies of the whole protein, I was involved in the first stages of mitogaligin’s production, which has proved to be very tricky either by recombinant pathway or by chemical synthesis

O processo de morte por apoptose pode ser dividido em duas vias: intrínseca e extrínseca. A sinalização via FAS (extrínseca) pode ocorrer independente (células Tipo I) ou dependente da mitocôndria (células Tipo II). É importante considerar que: 1) Resultados prévios mostraram que doses subletais de CHX foram capazes de sensibilizar células Tipo I e Tipo II à apoptose e de converter células Tipo II em Tipo I; 2) Um dos mecanismos envolvidos pode ser o recrutamento de FAS para as \"balsas lipídicas\"; 3) A PGE2 ativa PKA pelo aumento de cAMP via EP2 e EP4, que fosforila ezrina, envolvida nesse processo; 4) A PGE2 pode induzir apoptose em linhagens celulares e sensibilizá-las a esse processo. Assim, formulamos a hipótese de que a PGE2 poderia, assim como a CHX, sensibilizar certas células à apoptose e converter células Tipo II em Tipo I. Esse efeito não foi observado em células DO11.10 nas quais a apoptose foi induzida por CD95L solúvel e em células Tipo I e Tipo II, nas quais a apoptose foi induzida pelo anticorpo agonista anti-FAS.
The death process by apoptosis can be divided into two pathways: intrinsic and extrinsic. The signaling by FAS (extrinsic) may occur in a mitochondrial independent (Type I cells) or dependent (Type II cells) manner. It is important to consider that: 1) Previous results demonstrated that sub-lethal doses of CHX were able to sensitize type I and type II cells to apoptosis and to convert type II cells into type I; 2) One of the mechanisms involved can be FAS recruitment to \"lipid rafts\"; 3) PGE2 activates PKA by increasing cAMP via EP2 and EP4, which phosphorylates of Ezrin, involved in this process; 4) PGE2 can induces apoptosis in cell lines and can to sensitize them to this process. So, we hypothesized that PGE2 could, similarly to CHX, sensitize certain cells to apoptosis and convert type II cells into type I. This effect was not observed in DO11.10 cells in which apoptosis was induced by soluble CD95L and in type I and type II cells, in which apoptosis was induced by agonist anti-FAS antibody.

The GTPase activity of OPA1, a dynamin-related mitochondrial protein upregulated in several tumors, controls cristae remodeling, cytochrome c release and apoptosis. To pharmacologically target OPA1 in cancer, we setup and iterated a high-throughput screening of a diversity based chemical library of 10,000 drug-like small molecules for recombinant purified OPA1 GTPase activity inhibition, identifying 8 candidates that were confirmed in a secondary screen. The most promising hit (MYLS22) was highly specific, as it could bind to recombinant OPA1 GTPase and did not inhibit recombinant Dynamin 1 GTPase activity. MYLS22 was not mitochondriotoxic, but it increased OPA1 oligomers disassembly and cytochrome c release in response to the proapoptotic stimulus BID in purified mitochondria and to hydrogen peroxide in cells, where MYLS22 caused the expected mitochondrial fragmentation. MYLS22 also phenocopied the inhibition of breast cancer cells migration caused by OPA1 silencing. Thus, we identified a first-in-kind OPA1 inhibitor with potential anti-cancer properties.

Les mitochondries sont des organites essentiels qui fusionnent et fissionnent en permanence. Cette dynamique est régulée par différentes GTPase, notamment OPA1 qui est impliquée dans la fusion mitochondriale. OPA1 possède également une fonction anti-apoptotique, régulée par BNIP3, un membre pro-apoptotique de la famille Bcl-2. En conditions de stress, comme l'hypoxie, la protéine BNIP3 est induite et inhibe OPA1, ce qui conduit à une fragmentation des mitochondries et à l'apoptose. En plus de sa fonction pro-apoptotique, BNIP3 a récemment été impliquée dans l'autophagie et la mitophagie, une forme d'autophagie sélective des mitochondries qui assure le contrôle qualité de l'organite. Mon travail de thèse a visé à étudier l'implication des protéines BNIP3 et OPA1 dans la balance entre survie par autophagie-mitophagie et mort par apoptose dans les neurones. La protéine BNIP3 a été induite ou surexprimée en utilisant, respectivement, un mimétique de l'hypoxie ou des lentivirus, dans des neurones en culture primaire. Par des analyses biochimiques et de microscopie nous avons étudié les effets de cette induction/surexpression sur la morphologie mitochondriale, l'autophagie-mitophagie et l'apoptose, ainsi que l'impact d'OPA1 sur ces processus. Nous avons montré que l'induction de BNIP3 provoque une séquence d'évènements qui débute par la fragmentation du réseau mitochondrial, est suivie par un processus d'autophagie-mitophagie de survie et se termine par la mort des neurones. Alors que la surexpression d'OPA1 diminue la fragmentation des mitochondries et la mort des neurones, elle n'affecte pas l'autophagie-mitophagie dans nos conditions. Les mutations du gène d'OPA1 sont responsables d'une maladie neurodégénérative, l'Atrophie Optique Dominante Autosomale de type 1 (ADOA1), qui se traduit par une atrophie du nerf optique, pouvant conduire à la cécité, et des atteintes neurologiques extra-oculaires variées. Nous avons démontré dans des modèles in vitro et in vivo de l'ADOA1 que le taux de protéine BNIP3 basal est réduit. Ceci s'accompagne in vitro d'une diminution de l'autophagie-mitophagie qui pourrait contribuer à sensibiliser les neurones haploinsuffisants en protéine OPA1 à différents stress. BNIP3 participerait donc, de concert avec son partenaire OPA1, au contrôle du destin des neurones, favorisant la survie cellulaire grâce à son activité pro-autophagique et mitophagique lors de dommages modérés, mais entraînant la mort quand les dommages sont trop conséquents. La découverte d'une modulation de l'expression de BNIP3 dans des modèles d'ADOA1 permet de proposer un rôle de la protéine dans l'étiologie de la maladie
Mitochondria are essential organelles that constantly fuse and divide. These dynamic processes are controlled by various GTPases, such as OPA1, which is involved in mitochondrial fusion. OPA1 has also an anti-apoptotic function, which is regulated by BNIP3, a pro-apoptotic member of the Bcl-2 family. Upon stresses, such as hypoxia, BNIP3 is induced and inactivates OPA1, leading to mitochondrial fragmentation and apoptosis. Besides its pro-apoptotic function, BNIP3 was recently shown to be involved in autophagy and mitophagy, a selective autophagy of mitochondria that ensures their quality control. This study aims to decipher the role of BNIP3 and its partner OPA1 in the balance between survival by autophagy-mitophagy and death by apoptosis in neurons. BNIP3 induction or overexpression was achieved, respectively, using a mimetic of hypoxia or lentiviruses, in primarily cultured neurons. Various microscopy and biochemistry approaches were used to analyse the impact of this induction/overexpression on mitochondrial morphology, autophagy-mitophagy and apoptosis. We showed that BNIP3 induction led to a sequence of events that started with mitochondrial network fragmentation, followed by pro-survival autophagic and mitophagic processes, and ended by cell death. OPA1 mutations lead to a neurodegenerative condition: Autosomal Dominant Optic Atrophy type 1 (ADOA1). ADOA1 patients suffer from optic nerve atrophy leading to blindness and various extra-ocular neurological defects. We evidenced in in vitro and in vivo ADOA1 models a lowered BNIP3 basal level. This decrease is associated in vitro with a reduction of autophagy-mitophagy that could lead to increased susceptibility to various stresses. BNIP3 thus controls, together with its partner OPA1, the fate of neurons, favoring cell survival upon moderate damages thanks to its pro-autophagic and mitophagic activity, or leading to cell death upon extensive damages. Having demonstrated that BNIP3 expression is affected in ADOA1 models, we propose a role of the protein in the etiology of the disease

Non-canonical bioenergetics concerns with those physiological and pathophysiological situations under which ATP synthesis is suppressed. This thesis brings an outcome of three types of studies within the field of the non-canonical bioenergetics, investigating specific bioenergetic phenotypes of cancer cells, on one hand; and a role of mitochondrial uncoupling proteins as deduced from their transcript distribution in various tissues and organs; plus a role of a novel and likely pro-apoptotic factor CIDEa in mitochondria. Cancer cells generally present abnormal bioenergetic properties including an elevated glucose uptake, a high glycolysis and a poorly efficient oxidative phosphorylation system. However, the determinants of cancer cells metabolic reprogramming remain unknown. The main question in this project was how environmental conditions in vivo can influence functioning of mitochondrial OXPHOS, because details of mitochondrial bioenergetics of cancer cells is poorly documented. We have combined two conditions, namely glucose and oxygen deprivation, to measure their potential interaction. We examined the impact of glucose deprivation and oxygen deprivation on cell survival, overall bioenergetics and OXPHOS protein expression. As a model, we have chosen a human breast carcinoma (HTB-126) and appropriate control (HTB-125) cultured cells, as large fraction of breast malignancies exhibit hypoxic tumor regions with low oxygen concentrations and poor glucose delivery. The results demonstrate that glucose presence or absence largely influence functioning of mitochochondrial oxidative phosphorylation. The level of mitochondrial respiration capacity is regulated by glucose; by Crabtree effect, by energy substrate channeling towards anabolic pathways that support cell growth and by mitochondrial biogenesis pathways. Both oxygen deprivation and glucose deprivation can remodel the OXPHOS system, albeit in opposite directions. As an adaptative response to hypoxia, glucose inhibits mitochondrial oxidative phosphorylation to the larger extent than in normoxia. We concluded that the energy profile of cancer cells can be determined by specific balance between two main environmental stresses, glucose and oxygen deprivation. Thus, variability of intratumoral environment might explain the variability of cancer cells´ bioenergetic profile. Mitochondrial uncoupling proteins are proteins of inner mitochondrial membrane that uncouple respiration from ATP synthesis by their protonophoric activity. Originally determined tissue distribution seems to be invalid, since novel findings show that UCP1 is not restricted exclusively to brown fat and that originally considered brain-specific isoforms UCP4 and UCP5 might have wider tissue distribution. Hence, in second part of this thesis, I discuss consequences of findings of UCPn transcripts in the studied mouse and rat tissues. We have shown that mRNA of UCPn varies up to four orders of magnitude in rat and mouse tissues with highest expression in rat spleen, rat and mouse lung, and rat heart. Levels of the same order of magnitude were found for UCP3 mRNA in rat 100 and mouse skeletal muscle, for UCP4 and UCP5 mRNA in mouse brain, and for UCP2 and UCP5 mRNA in mouse white adipose tissue. Further, we have shown that expression pattern of UCPn varies between animal species, rat versus mouse, such as the dominance of UCP3/UCP5 vs. UCP2 transcript in mouse heart and vice versa in rat heart; or UCP2 (UCP5) dominance in rat brain contrary to 10-fold higher UCP4 and UCP5 dominance in mouse brain. spontaneous apoptosis due to CIDEa overexpression in HeLa cells, adapted for a tetracycline-inducible CIDEa expression, a portion of mitochondria-localized CIDEa molecules migrates to cytosol or nucleus
Résumé non disponible

Estudos realizados com zigotos bovinos submetidos a uma diminuição de cerca de 50% do conteúdo mitocondrial não apresentaram efeito deletério ao desenvolvimento embrionário in vitro. Este modelo foi desenvolvido pela centrifugação de zigotos após a fecundação in vitro (FIV), retirada do extrato citoplasmático rico em mitocôndrias (ECRM) e posterior introdução de 20-30% de ooplasto (FERREIRA, 2006). Sabendo-se que esse modelo biológico permite o desenvolvimento embrionário em condição de depleção mitocondrial, o objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da remoção e da suplementação mitocondrial em estádio de zigoto visando compreender a importância da organela no processo de desenvolvimento e morte celular programada (MCP). Este trabalho descreve a transferência de mitocôndrias entre zigotos bovinos. Para tanto, foi desenvolvido um sistema de reconstrução de embriões bovinos capaz de gerar indivíduos depletados e suplementados de mitocôndrias. O extrato citoplasmático rico em mitocôndrias (ECRM) dos zigotos centrifugados foi retirado do oócito doador, para gerar um zigoto depletado (D). Posteriormente, foi retirado um volume citoplasmático de aproximadamente 7,1% para gerar um embrião receptor. Com a quantidade retirada do zigoto depletado (doadores), foi realizada a suplementação de zigotos biopsados (receptores), formando assim, o grupo suplementado (S). A depleção mitocondrial causou uma diminuição na quantidade de DNAmt que foi recuperada antes das 72 horas de cultivo possivelmente, devido a um aumento na expressão de mtTFA. Os genes anti-apoptóticos BCL2 e PI3K tiveram sua expressão aumentada nos embriões depletados. A suplementação e depleção mitocondrial resultaram em uma diminuição na taxa de desenvolvimento embrionário até o estádio de 8 células e na formação de blastocistos. A técnica suplementação mitocondrial por meio de micromanipulação não apresentou efeito sobre a quantidade de DNAmt e atividade mitocondrial estimada pelo potencial de membrana interna mitocondrial (Ψmm), apresentando um aumento no Ψmm apenas às 168 horas em conseqüência do aumento da expressão de COXI e mtTFA. A suplementação e a depleção geraram efeitos negativos na quantidade de núcleos totais e os embriões suplementados apresentaram uma maior taxa de fragmentação de núcleos provavelmente, por um desbalanço de fatores pró e anti-apoptóticos.
Studies developed with bovine zygotes submitted to a decrease of about 50% of the mitochondrial content did not present a deleterious effect on in vitro embryonic development. This model was developed by the centrifugation of zygotes after in vitro fertilization (IVF), removal of the mitochondria enriched cytoplast fraction (MECF) and posterior introduction of 20-30% ooplast (FERREIRA, 2006). Knowing that this biological model allows the development of embryos with mitochondrial depletion, the objective of this study was to evaluate the effect of the mitochondrial removal and supplementation in zygotes aiming to understand the organelle importance in the development and programmed cellular death process (PCD). Therefore, we developed a reconstruction model capable to generate mitochondrial depleted and supplemented embryos. The MECF of the centrifuged zygotes was removed from the donor\'s oocyte (depleted group-D). To prepare the supplemented group (S), a biopsy of approximately 7.1% of the cytoplasm was removed from the recipient zygote for the supplementation with MECF derived from the donor. Mitochondrial depletion caused a decrease of DNAmt amount that was replenished before 72 hours possibly due to an increase of mtTFA, BCL2 and PI3K expression and no effects in Ψmm. The technique of mitochondrial supplementation by micromanipulation showed no effect on the mitochondria DNA amount and activity estimated by mitochondrial membrane potential (Ψmm). The Ψmm increased at 168ha in consequence of an increase in COXI and mtTFA expression. Mitochondrial depletion and supplementation caused a decrease in embryonic development in the 8-cells stage, on blastocyst production and total cell number. The supplementation resulted in increased rates of fragmented nuclei possibly due to an imbalance between pro- and anti-apoptotic factors.

Orientador: Tereza Cristina Cardoso da Silva
Resumo: Coronavirus são RNA vírus sentido positivo, envelopados, comumente associados a infecções brandas em aves e mamíferos. A infecção por CCoV é comum em cães jovens, principalmente em animais que vivem em canis e abrigos, associada à ocorrência de diarreia branda e autolimitante, causada pela infecção das células das vilosidades do intestino delgado. São conhecidos dois genótipos: CCoV-I e CCoV-II, o qual é subdividido em CCoV-IIa e CCoV-IIb. O CCoV-IIa, é uma variante altamente patogênica associada à doença sistêmica e acentuada linfopenia. Diferentemente de outros CCoV realiza viremia e, assim, determina a disseminação do vírus para diversos órgãos, incluindo tecidos linfóides. Nesse sentido, o envolvimento da infecção de macrófagos correlacionada à gravidade da doença e linfopenia, vem sendo sugerido. Este trabalho teve por objetivo promover a infecção de macrófagos caninos derivados de monócitos sanguíneos e avaliar a replicação viral, despolarização da membrana mitocondrial e os complexos da cadeia respiratória mitocondrial às 6, 12, 18 e 24 horas pós-infecção. A estatística descritiva incluiu média ± desvio padrão (s.d.). As médias foram comparadas através da análise de variância, ANOVA. Foi possível observar que a infecção por CCoV induziu a liberação de novas partículas virais entre 18 e 24 horas pós-infecção. Ainda, a infecção viral esteve associada à despolarização e disfunção da membrana mitocondrial, afetando o complexo III da cadeia respiratória. Desse modo, acredit... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)
Abstract: Coronaviruses are enveloped positive-sense RNA viruses commonly associated with mild infections in birds and mammals. CCoV infection is common in young dogs, especially kennel and shelter animals, associated with the occurrence of mild, self-limiting diarrhea caused by infection of small intestinal villus cells. Two genotypes are known: CCoV-I and CCoV-II, which is subdivided into CCoV-IIa and CCoV-IIb. CCoV-IIa is a highly pathogenic variant associated with systemic disease and marked lymphopenia. Unlike other CCoV it carries viremia and thus determines the spread of the virus to various organs including lymphoid tissues. In this sense, the involvement of macrophage infection correlated with disease severity and lymphopenia has been suggested. This study aimed to promote the infection of canine macrophages derived from blood monocytes and to evaluate viral replication, mitochondrial membrane depolarization and mitochondrial respiratory chain complexes at 6, 12, 18 and 24 hours post-infection. Descriptive statistics included mean ± standard deviation (s.d.). Means were compared by analysis of variance, ANOVA. It was observed that CCoV infection induced the release of new viral particles between 18 and 24 hours after infection. Moreover, viral infection was associated with depolarization and mitochondrial membrane dysfunction, affecting respiratory chain complex III. Thus, CCoV is believed to induce mitochondrial bioenergetic failure, acting as a decoupler of the respiratory c... (Complete abstract click electronic access below)
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