Academic literature on the topic 'Aplasies médullaires'

TP53 est un des gènes les plus étudiés du fait de son rôle primordial en tant que suppresseur de tumeurs. De manière surprenante mon laboratoire a mis en évidence qu'une suractivation de p53 pouvait aussi être délétère en créant et analysant deux modèles murins : p53Δ31, exprimant une protéine tronquée de son domaine c-terminal, et Mdm4T454M, inactivant partiellement un des principaux régulateurs négatifs de p53. Dans ces deux modèles, des traits caractéristiques de syndromes héréditaires d'insuffisance médullaire (SHIM) ont été observés comme par exemple un raccourcissement des télomères, corrélé à la répression de gènes impliqués dans la maintenance des télomères. La plupart des gènes étant réprimés par p53 via le complexe répresseur DREAM (DP, Rb-like, E2F4 and MuvB), j'ai mis en place au cours de ma thèse une approche systématique pour identifier des gènes cibles de la voie p53-DREAM impliqués dans l'hématopoïèse et le développement du cerveau qui sont des processus altérés dans les SHIMs. Des sites de fixation du complexe DREAM ont été trouvés pour 151 gènes, dont 106 sont mutés dans une maladie génétique du sang ou du cerveau. De plus, 21 sites putatifs de fixation de DREAM ont été testés et vérifiés expérimentalement comme ayant un impact sur l'expression génique, notamment pour des gènes mutés dans la dyskératose congénitale (Rtel1), l'anémie de Fanconi (Fanca), l'anémie de Diamond-Blackfan (Tsr2), la microcéphalie primaire (Casc5, Ncaph, Wdr62) ou l'hypoplasie pontocérébelleuse (Toe1). Ces résultats mettent en avant le rôle de la voie p53-DREAM dans la régulation de l'hématopoïèse et du développement cérébral, contribuent à expliquer les similitudes cliniques entre les SHIMs, et nous informent sur certains processus cancéreux, notamment dans des glioblastomes. Par ailleurs, durant ma thèse j'ai également contribué à l'étude de deux modèles murins mutés pour p53, l'un permettant d'étudier les effets de la perte d'isoformes AS de p53 (issues d'un épissage alternatif de l'ARNm de p53), et l'autre modélisant la mutation « hotspot » p53Y220C, une mutation retrouvée dans 100 000 cas de cancers humains chaque année. Ces deux modèles murins ont révélé un dimorphisme sexuel des effets de p53, un paramètre encore insuffisamment exploré
TP53 is one of the most studied genes, due to its primordial role as a tumor suppressor. Surprisingly, my laboratory has demonstrated that over-activation of p53 can also be deleterious by creating and analyzing two mouse models: p53Δ31, expressing a protein truncated from its c-terminal domain, and Mdm4T454M, partially inactivating one of p53's main negative regulators. In both models, features characteristic of hereditary bone marrow failure syndromes (BMFS) were observed, such as telomere shortening, correlated with repression of genes involved in telomere maintenance. As most genes are repressed by p53 via the DREAM repressor complex (DP, Rb-like, E2F4 and MuvB), during my thesis I set up a systematic approach to identify target genes of the p53-DREAM pathway involved in hematopoiesis and brain development, processes that are impaired in BMFS. DREAM complex binding sites were found for 151 genes, 106 of which are mutated in a blood or brain genetic disease. In addition, 21 putative DREAM binding sites were tested and experimentally verified as having an impact on gene expression, including genes mutated in dyskeratosis congenita (Rtel1), Fanconi anemia (Fanca), Diamond-Blackfan anemia (Tsr2), primary microcephaly (Casc5, Ncaph, Wdr62) or pontocerebellar hypoplasia (Toe1). These results highlight the role of the p53-DREAM pathway in the regulation of hematopoiesis and brain development, help to explain the clinical similarities between BMFS, and inform us about certain cancer processes, notably in glioblastomas. During my thesis, I also contributed to the study of two p53-mutated mouse models, one to study the effects of a loss of p53-AS isoforms (resulting from the alternative splicing of p53 mRNA), and the other to model the p53Y220C hotspot mutation, a mutation found in 100,000 cases of human cancer each year. These two mouse models revealed sexual dimorphism in the effects of p53, a parameter still insufficiently explored

Dans un premier temps, nous avons observé qu'une fraction des patients FA avait acquis une abrogation du checkpoint en phase G2 définissant un nouveau phénotype: l'atténuation. Nous avons trouvé que les cellules atténuées exprimaient très faiblement la protéine CHK1 par rapport à des cellules Fanconi classiques et que cette inhibition est corrélée à une forte expression de miR-15a (microRNA ciblant CHK1). Nous avons pu reproduire l'atténuation en utilisant siRNA et inhibiteurs chimiques dirigés contre CHK1. De plus, l'inhibition de CHK1 protège les cellules FA de la mort cellulaire. Ces résultats sont consistants avec un avantage sélectif conféré aux cellules FA atténuées pouvant alors repeupler la moelle osseuse. Néanmoins, les cellules blastiques de ces patients expriment également très faiblement CHK1 suggérant que l'atténuation pourrait participer à la progression tumorale. Deuxièmement, nous avons pu montrer que les cellules FA présentaient une forte activation de p53 en réponse aux dommages de l'ADN, induisant un arrêt du cycle cellulaire p21 dépendant en GO/G1. Les CD34+ médullaires des patients FA présentent un défaut quantitatif et qualitatif ainsi qu'une signature d'arrêt de cycle en GO/G1 et une forte expression de p21/CDKN1A. En utilisant plusieurs modèles dont un test de xénogreffe à partir de CD34+ Fanconisés et l'utilisation de souris Fancd2-/- - p53/- , on a pu montrer que l'inhibition de p53 ou de p21 restaurait les capacités (clonogénicité) des cellules FA in vitro et in vivo. Ces résultats identifient l'arrêt GO/G1 du cycle cellulairé p53/p21 dépendant en réponse aux dommages de l'ADN, comme mécanisme physiopathologique de l'aplasie médullaire du Fanconi
First, we observed that a fraction of FA patients has an abrogation of the classical G2 checkpoint arrest defining a new phenotype, namely attenuation. We found that the attenuated cells expressed lower level of the checkpoint protein CHK1 than "classical" FA cells, and that this correlated with the strong expression of miR-15a (microRNA targeting CHK1). Attenuation was recapitulated in FA cells using siRNA and chemical inhibitors targeting CHK1. Moreover, CHK1 inhibition protected FA cells from cell death, consistently with a survival advantage conferred by the checkpoint abrogation. Importantly, purified MDS/AML from FA attenuated patients expressed very low levels of CHK1, suggesting that attenuation also contributed to tumor progression. Second, we observed that FA cells had an exacerbated p53/p21-mediated GO/G1 cell cycle arrest in response to DNA damage. CD34+ counts and in vitro clonogenic activity were significantly lower in patients with FA compared to healthy bone marrow donors. Moreover these cells strongly expressed the p21/CDKN1A gene and a signature of GO/G1 cell cycle arrest. Using several functional models (xeno-transplantation of CD34+ FA-like cells; Fancd2 -/- p53-/- mite) we found that knockdown of p53 or p21 dramatically rescued clonogenic capacities of FA cells in vitro and in vivo. Altogether, these results identify for the first time an exacerbated p53/p21 mediated GO/G1 cell cycle arrest in response to replicative stress and unresolved DNA damage as a central mechanism of bone marrow failure in FA patients

Les syndromes d’insuffisance médullaire sont liés à des mutations constitutionnelles à l’origine d’une hématopoïèse déficiente chez les patients atteints. Ils représentent un groupe hétérogène de maladies syndromiques, et impliquent plusieurs familles de gènes avec des mécanismes biologiques différents conduisant à l’insuffisance médullaire. Ces maladies prédisposent à une évolution clonale somatique, avec un risque accru de développer un syndrome myélodysplasique (SMD) ou une leucémie aigüe myéloïde (LAM) au cours du temps. Nous avons séquencé et analysé l’exome d’ADN fibroblastique d’une cohorte de 179 patients ayant des insuffisances médullaires, des SMD ou des LAM, supposés d’origine constitutionnelle mais sans diagnostic établi. Ce travail a permis de porter un diagnostic moléculaire chez 86 (48%) patients, et de participer à la description de nouveaux syndromes impliquant les gènes SAMD9/SAMD9L (N=16/86, 18,6%), MECOM/EVI1 (N=6, 7%) et ERCC6L2 (N=7, 8,1%). Le suivi longitudinal des patients nous a permis de décrire un modèle d’évolution clonale particulier chez les patients ayant des mutations SAMD9/SAMD9L. Le syndrome d’insuffisance médullaire le plus fréquent est la maladie de Fanconi (AF ou FA), causée par une mutation germinale dans un des gènes de la voie de réparation FA/BRCA. Les cellules des patients FA ont une instabilité chromosomique liée à un défaut de réparation, avec une pression de sélection conduisant à une évolution clonale prototypique. Nous avons étudié une cohorte de 335 patients FA et confirmé de façon statistiquement significative l’ordre d’apparition des évènements cytogénétiques de ces patients au cours de l’évolution clonale et de la leucémogenèse : 1q+, 3q+, -7/del7q, délétion ou mutation RUNX1. L’étude moléculaire longitudinale des patients (NGS panel, WES, WGS) a confirmé un mécanisme oncogénique en rapport avec une instabilité chromosomique plus que génomique. En nous intéressant à l’anomalie cytogénétique la plus fréquente et la plus précoce : le 1q+, nous avons observé que le point de cassure péricentromérique sur ce chromosome correspondait à un site fragile, réparé ensuite par une voie de réparation alt NHEJ. La zone minimale dupliquée contenait le gène MDM4, un inhibiteur des fonctions transactivatrices de p53, qui constituait ainsi un bon candidat pour conférer aux cellules un avantage clonal et initier la leucémogenèse. Nous avons d’abord confirmé que les cellules des patients 1q+ avaient une surexpression de MDM4 et une inactivation de la voie p53 en aval (RNAseq). Puis, nous avons montré que cette surexpression permettait de restaurer les capacités fonctionnelles des progéniteurs hématopoïétiques humains FA, de façon réversible avec l’inhibition de MDM4, constituant ainsi une éventuelle cible thérapeutique. Les syndromes d’insuffisance médullaire sont des maladies rares, et nos travaux, en parallèle de ceux d’autres équipes, ont participé à la description de nouveaux gènes impliqués. L’étude de l’évolution clonale de ces syndromes représente une évolution dans la compréhension de la physiopathologie des SMD/LAM, et peut conduire à l’identification de cibles thérapeutiques chez ces patients
Inherited bone marrow failure (IBMF) syndromes are heterogeneous diseases related to germ line mutations causing deficient hematopoiesis in mutated patients. Mutations involve several families of genes with different biological pathways driving the bone marrow failure. Most germ line genetic BMF disorders are characterized by a high propensity to clonal evolution and to develop MDS or AML. We used a whole-exome sequencing (WES) comprehensive analysis on fibroblast DNA samples from 179 patients with BMF/MDS of unresolved inherited origin. We provided a molecular diagnosis for 86/179 BMF patients (48%) including several seldom-reported IBMF/MDS entities like SAMD9/SAMD9L, MECOM/EVI1, and ERCC6L2. In particular, we described a specific clonal evolution in patients having mutations in SAMD9 and SAMD9L.Fanconi anemia (FA) is the most common IBMF syndrome, caused by a germ line mutation in one gene of the FA pathway. DNA repair deficiency in patient’s FA cells leads to chromosomal instability, which sets the stage for clonal evolution with a specific pattern of chromosomal abnormalities. We used integrated clinical, next-generation genomic and functional studies on primary cells from a National cohort of 335 FA patients, including 98 with clonal evolution, to decipher the mechanisms of BM progression. While relatively few somatic point mutations were found, unbalanced translocations leading to gross chromosomal copy-number abnormalities were most prominent. Whole genome sequencing revealed an FA-specific signature in which microhomology-mediated end joining (MMEJ) or non homologous end joining (NHEJ) repair had mediated genome rearrangements, consistent with the constitutive homologous repair defect. Longitudinal studies confirmed the order of chromosomal events during FA patients oncogenesis: 1q+, 3q+, -7/del7q, del or RUNX1 mutations. A major initial step was duplication of chromosome 1q, resulting in strong expression of MDM4, a negative regulator of p53, which can be targeted by MDM4-inhibitors.IBMF are rare diseases and our study participated to describe new genetic and clinical entities. Studying the clonal evolution of IBMF syndromes can help to understand MDS and AML pathophysiology and lead to therapeutic target identification

L'objectif principal de chaque forme de vie à transmettent fidèlement aux descendants ainsi que les renseignements génétiques auto - survie. Agents endogènes et environnementales en attaque ce processus. Pour résister à ces menaces et protéger le génome intégré, les cellules ont développé des systèmes permettant de détecter leur présence et l'adn de signalisation des dommages - intérêts, la médiation leur réparation. Notre étude porte sur un patient nés de parents consanguins présentant une insuffisance médullaire précoce, les anomalies de développement (microcéphalie et longueur des télomères caractéristiques dimorphes) EBV-B fibroblastes et lignées cellulaires ont été peu sensible à la MMC, mais a montré une forte sensibilité à la phléomycine et IR, plaidant pour un défaut de réparation de l'adn dans ce patient. Cela a également été confirmé par la persistance de foyers 53BP1 après ça. L'ensemble des études et exome genome - wide association a révélé un séquençage exon 13 mutations homozygotes est hérité de l'adn codant pour la ERCC6l2 putatif du poids RAD26l hélicase. La forme de ERCC6l2 décrits dans les bases de données n'a pas compléter le phénotype cellulaire in vitro. Une analyse a révélé une alternative possible in silico isoforme de ERCC6l2 850aa contenant un complément 6 - exons codant la réalité qui était assuré par le clonage moléculaire. On appelle cette autre isoforme hebo. La sensibilité des cellules à hebo maintenant complété la phléomycine, validant ainsi les identifié la mutation. Les deux ercc6l2 courte et hebo est exprimée de façon ubiquiste, mais seulement hebo est localisée dans le noyau. Des expériences ont démontré que les micro - irradiation hebo est recruté pour des lésions de l'adn. Ni le ercc6l2 court, ni ce formulaire auquel était annexé un signal - localiser d'adn SV40 sna dommages dans ces expériences. Nous avons exploré davantage que le recrutement de hebo dépend de nbs 1
The main objective of every life form is to faithfully transmit genetic information to offspring as well as self-survival. Various endogenous and environmental agents constantly assault this process. To resist these threats and to protect the genome integrality, cells have evolved systems capable of detecting DNA damages, signaling their presence and mediating their repair. Our study focuses on a patient born from consanguineous parents presenting with early bone marrow failure (BMF), developmental anomalies (microcephaly and dimorphic features) but normal telomere length. Fibroblasts and EBV-B cell lines were slightly sensitive to MMC but showed a marked sensitivity to phleomycin and IR, arguing for a DNA repair defect in this patient. This was also confirmed by the persistence of 53BP1 foci following IR. Genome wide association studies and whole exome sequencing revealed an inherited homozygous nonsense mutation in exon 13 of ERCC6L2 coding for the putative DNA helicase Rad26L. Unexpectedly, the wt. form of ERCC6L2 described in the databases did not complement the cellular phenotype in vitro. An in silico analysis revealed a possible alternative isoform of ERCC6L2 containing additional 6 C-terminus exons encoding 850aa, the reality of which was ascertained by molecular cloning. We named this alternative isoform Hebo. The Hebo now complemented the cellular sensitivity to phleomycin, thus validating the identified mutation. Both ERCC6L2-short and Hebo are ubiquitously expressed, but only Hebo is localized into the nucleus. Micro irradiation experiments demonstrated that Hebo is recruited to DNA lesions. Neither the ERCC6L2-short, nor this form to which was appended an SV40 nls signal did localize to DNA damages in these experiments. We further explored that the recruitment of Hebo is dependent on NBS1 manner

La symptomatologie du syndrome aigu de l'irradiation est dominee dans la gamme de dose de 2 a 10 gy par le syndrome hematologique. La therapie cellulaire autologue est une nouvelle approche therapeutique de l'aplasie medullaire consecutive a une irradiation aigue accidentelle fondee sur le concept de l'heterogeneite des dommages autorisant l'epargne relative des cellules souches et progeniteurs hematopoietiques (csph). Elle consiste en la collecte et l'expansion ex vivo des csph residuels par une culture de courte duree, dans le but de produire un ou des greffons de maturites differentes capables de reduire apres reinjection la phase initiale de neutrothrombopenie, dans l'attente de la restauration spontanee. Cette approche pose le probleme de l'interference de la phase de culture avec les processus deleteres radioinduits au premier rang desquels l'apoptose. Notre etude, utilisant en premier lieu un modele d'irradiation in vitro des cellules cd34 + de primate non humain, montre que : 1/ l'apoptose radioinduite au niveau des cellules cd34 + est un processus precoce, massif pendant les 24 premieres heures, impliquant le systeme fas/fas-ligand. 2/ elle est significativement reduite (15% de survie a 24h) par un traitement precoce (<30mn apres l'irradiation ; dose 2,5 gy a 6gy) a l'aide d'une combinaison de cytokines actives aux stades precoces de l'hematopoiese (4f : scf+fl+tpo+il-3). 3/ la combinaison 4f permet une amplification (k) des cellules irradiees cultivees pendant 6 jours (2,5gy ; kcd34 + : x4,2). Nos modeles de greffe autologue de cellules saines 4-6 ou irradiees (2,5 gy) in vitro 7 montrent que : 4/ les greffons amplifies favorisent la restauration hematologique precoce granulocytaire et plaquettaire par rapport aux greffons de cellules non manipulees. 5/ l'amplification des cellules capables de reconstituer les souris nod-scid (src) par le 4f est faible (x2,2) ; ces cellules constituent le meilleur critere d'evaluation de la tranplantabilite du greffon. 6/ evaluee sur le critere de la reconstitution hematologique tardive, l'expansion permet la reduction de la taille seuil des greffons de 0,5 10 6 a 0,3 10 6 cellules cd34 +/kg. 7/ ce seuil pourrait etre abaisse par des cultures sur stroma allogenique preetabli. 8/ cependant la constitution d'un greffon de taille suffisante a partir de cellules residuelles chez des animaux irradies necessite un agent recrutant des csph d'action rapide. 9/ une cytokinotherapie antiapoptotique d'urgence appliquee a une large gamme de dose pourrait etre realisee dans le cadre des irradiations aigues accidentelles et constituer un complement de la therapie cellulaire autologue.

Au cours de leur développement, les cellules du système hématopoïétique sont très exposées aux dommages à l’ADN qui peuvent avoir une origine exogène ou endogène. Les organismes vivants ont développé de nombreux mécanismes de réparation pour y faire face, et leur dysfonctionnement est responsable de maladies rares mais sévères chez l’Homme. Un des deux mécanismes de réparation des cassures double-brin (CDB) de l’ADN joue un rôle prépondérant dans le développement du système immunitaire (SI) des mammifères. Il s’agit de la voie de réparation des extrémités non-homologues (NHEJ) qui est absolument essentiel au bon déroulement de la recombinaison V(D)J dans les progéniteurs lymphocytaires de la moelle osseuse et du thymus. En effet, la formation de CDB de l’ADN est une étape clé de ce remaniement. De même, bien que dans une moindre mesure, le NHEJ intervient pour réparer les cassures induites par AID lors de la commutation de classe des immunoglobulines (Ig- CSR). Notre équipe a précédemment identifié un nouveau facteur du NHEJ, Cernunnos (ou XLF), responsable chez l’Homme de déficit immunitaire combiné sévère (DCIS) associé à une sensibilité aux rayonnements ionisants (RI) et à une microcéphalie. Afin de mieux comprendre le rôle de Cernunnos dans le système hématopoïétique et dans le développement des lymphocytes en particulier, nous avons créé un modèle murin invalidé pour ce gène. De façon surprenante, le développement lymphocytaire se fait quasi normalement dans ces souris, le seul défaut observé est une diminution du nombre de lymphocytes. Cependant, l’analyse fine du répertoire des cellules T a permis de mettre en évidence un biais dans l’utilisation des segments variables V et J de la chaîne α du récepteur (TCRα). Ce serait là la signature d’un défaut de survie des thymocytes, passant par une activation chronique de la voie de l’apoptose dépendante de p53 en réponse à l’accumulation de dommages de l’ADN. Certaines sous- populations de lymphocytes T, comme les iNKTs et les MAITs, seraient ainsi affectées. Par ailleurs, notre équipe poursuit la caractérisation génétique et fonctionnelle de pathologies chez des patients dont le tableau clinique laisse penser qu’il existe un déficit immunitaire ou hématologique primaire associé à un défaut de réparation de l’ADN. Nous nous sommes intéressés à un patient dont le tableau clinique combinant déficit hématopoïétique et instabilité génomique suggère une origine génétique forte. Grâce aux techniques de séquençage haut- débit et à l’étude de ségrégation au sein de la famille nous avons pu isoler plusieurs mutations dont une nous a interpellé plus particulièrement
Throughout their development, hematopoietic cells are exposed to many DNA damages of either exogenous or endogenous origin. Living organisms evolved a variety of DNA repair mechanisms in order to face those threats, and their impairment leads to rare but severe diseases in human. Of the two mechanisms involved in the repair of DNA double-strand break (DSB) repair, one plays a major role in mammal’s Immune System (IS). The non-homologous end joining (NHEJ) pathway is essential for the correct proceeding of V(D)J recombination in lymphocyte progenitors from bone marrow and thymus. Indeed, the formation of DNA DSB is a key step of the rearrangement. In similar fashion, though to a lesser degree, NHEJ is involved in repair of AID induced breaks during immunoglobulin class switch recombination (Ig-CSR). Our team previously identified a new NHEJ factor, Cernunnos (or XLF), as being responsible for a human syndrome of severe combined immunodeficiency (SCID) associated with ionizing radiation (IR) sensitivity (RS-SCID) and microcephaly. To better understand Cernunnos role in the hematopoietic system and particularly in lymphocyte development, we engineered a knock-out (KO) mouse model for this gene. Surprisingly, lymphocyte development is almost normal in these mice, the only defect observed being a decrease of lymphocyte number. However, a refined analysis of T cell repertoire allowed us to uncover a bias in the use of V and J segments from the receptor’s α chain (TCRα). This is the signature of a survival defect in thymocytes, caused by chronic activation of the p53 dependent apoptosis pathway in response to DNA damage. Some discrete T cell populations, such as iNKTs and MAITS, would be affected. In the meantime, our team pursues the uncovering of genetic diseases and their functional description in patients showing signs of immune or hematopoietic deficiency combined to impaired DNA repair. We focused on a patient harboring clinical signs of genomic instability and hematopoietic defects with strong evidence for genetic cause. Thanks to high-throughput DNA sequencing technology and whole genome association study (WGAS), we identified several mutations, one of them striking us as pertinent