Dissertations / Theses on the topic 'Actine – Régulation (biologie)'

Les moteurs moléculaires sont des protéines capables de produire une force : elles transforment l'énergie chimique de l'hydrolyse de l'ATP en énergie mécanique. Cette thèse se focalise sur l'étude d'une famille de moteurs moléculaires, les myosines, qui se déplacent le long des filaments d'actine et assurent d'importantes fonctions cellulaires.La myosine VI est une myosine très particulière car elle est la seule à se déplacer vers l'extrémité négative des filaments d'actine. Elle est produite dans la cellule sous forme auto-inhibée, inactive. Dans la cellule, son activité est également régulée par plusieurs protéines interagissant avec la queue C-terminale de la myosine VI. Ces protéines, présentes à des endroits précis de la cellule, recrutent la myosine VI et dictent l'action qu'elle doit effectuer. Des analyses de SAXS, de dispersion de la lumière, de microscopie, d'interaction et de mutagénèse ont permis de mieux comprendre le mécanisme régulant l'adoption de l'état auto-inhibé, ainsi que son activation par le calcium. L'interaction avec différents partenaires a été caractérisée. GIPC1, le partenaire le plus étudié, promeut de façon indirecte la dimérisation et l'activation de la myosine VI.Pendant ma thèse, j'ai également été impliqué dans deux autres projets qui s'inscrivent dans la logique du projet de thèse et qui ont mené à la publication de quatre articles. Deux chapitres, plus brefs, sont donc dédiés à ces projets. Le deuxième chapitre porte sur la régulation de l'activité de la myosine VII par ses partenaires cellulaires. Finalement, le troisième chapitre est dédié à l'étude de la modification allostérique de l'activité des myosines par des petites molécules
Molecular motors are essential agents of force production in the cells: they convert the chemical energy released by the hydrolysis of ATP into mechanical work. This thesis focuses on myosins, a family of molecular motors responsible for actin-based motility. Myosin VI is unique among all of the myosin superfamily members in that it moves in the opposite direction of all other known myosins. Previous work revealed myosin VI tail ability to fold back, constituting a potential auto-inhibited state that prevents motor activity. Several myosin VI partners, binding to the C-terminal tail of the myosin, have been identified and shown to recruit the motor for different functions. In the first chapter of this thesis, the mechanism allowing the regulation of myosin VI activity has been studied using biochemical and biophysical analysis (SAXS, light scattering, microscopy, binding assays and mutagenesis). GIPC1, the most studied myosin VI partners, promotes myosin dimerization and activation. During my PhD, I have been also involved in two other projects, in line with my thesis project, that have led to the publication of four articles. Two shorter chapters are therefore devoted to these projects. The second chapter of my thesis explores myosin VII activity regulation by its cellular partners. Finally, the third chapter is devoted to the allosteric regulation of myosins activity by small molecules

L'ensemble de ces travaux a porte sur l'etude de la regulation de la contraction musculaire par la molecule de caldesmone. Nous avons identifie dans le muscle strie de mollusques une nouvelle proteine caldesmon-like. Apres sa purification et sa caracterisation fonctionnelle comme agent de regulation de l'interaction actine-myosine associe au filament fin d'actin, nous l'avons localisee par immunocytochimie dans les structures sarcoplasmiques a la peripherie des fibres musculaires des muscles stries de mollusques. L'etude de l'interaction de la caldesmone de muscle lisse avec le filament fin d'actine a ete abordee par des experiences de pontages chimiques intermoleculaires associees a des coupures proteolytiques. Nous avons ainsi identifie la region acide nh#2-terminale de l'actine (residus 1-12) comme site implique dans l'interaction actine-caldesmone et dans la regulation de l'actomyosine atpase par la caldesmone. Utilisant les memes approches experimentales nous avons isole et identifie au niveau de l'hydrolysat total au bromure de cyanogene de la caldesmone de muscle lisse un fragment cooh-terminal de 10 kda (residus 659-756) qui possede l'ensemble des proprietes d'interaction caldesmone-actine et caldesmone-calmoduline et se presente comme le domaine regulateur majeur de la proteine

Les moteurs moléculaires sont des protéines capables de produire une force : elles transforment l'énergie chimique de l'hydrolyse de l'ATP en énergie mécanique. Cette thèse se focalise sur l'étude d'une famille de moteurs moléculaires, les myosines, qui se déplacent le long des filaments d'actine et assurent d'importantes fonctions cellulaires.La myosine VI est une myosine très particulière car elle est la seule à se déplacer vers l'extrémité négative des filaments d'actine. Elle est produite dans la cellule sous forme auto-inhibée, inactive. Dans la cellule, son activité est également régulée par plusieurs protéines interagissant avec la queue C-terminale de la myosine VI. Ces protéines, présentes à des endroits précis de la cellule, recrutent la myosine VI et dictent l'action qu'elle doit effectuer. Des analyses de SAXS, de dispersion de la lumière, de microscopie, d'interaction et de mutagénèse ont permis de mieux comprendre le mécanisme régulant l'adoption de l'état auto-inhibé, ainsi que son activation par le calcium. L'interaction avec différents partenaires a été caractérisée. GIPC1, le partenaire le plus étudié, promeut de façon indirecte la dimérisation et l'activation de la myosine VI.Pendant ma thèse, j'ai également été impliqué dans deux autres projets qui s'inscrivent dans la logique du projet de thèse et qui ont mené à la publication de quatre articles. Deux chapitres, plus brefs, sont donc dédiés à ces projets. Le deuxième chapitre porte sur la régulation de l'activité de la myosine VII par ses partenaires cellulaires. Finalement, le troisième chapitre est dédié à l'étude de la modification allostérique de l'activité des myosines par des petites molécules
Molecular motors are essential agents of force production in the cells: they convert the chemical energy released by the hydrolysis of ATP into mechanical work. This thesis focuses on myosins, a family of molecular motors responsible for actin-based motility. Myosin VI is unique among all of the myosin superfamily members in that it moves in the opposite direction of all other known myosins. Previous work revealed myosin VI tail ability to fold back, constituting a potential auto-inhibited state that prevents motor activity. Several myosin VI partners, binding to the C-terminal tail of the myosin, have been identified and shown to recruit the motor for different functions. In the first chapter of this thesis, the mechanism allowing the regulation of myosin VI activity has been studied using biochemical and biophysical analysis (SAXS, light scattering, microscopy, binding assays and mutagenesis). GIPC1, the most studied myosin VI partners, promotes myosin dimerization and activation. During my PhD, I have been also involved in two other projects, in line with my thesis project, that have led to the publication of four articles. Two shorter chapters are therefore devoted to these projects. The second chapter of my thesis explores myosin VII activity regulation by its cellular partners. Finally, the third chapter is devoted to the allosteric regulation of myosins activity by small molecules

Les petites protéines G de la famille Rho sont des régulateurs importants de la fonction cellulaire. Elles lient les signaux extracellulaires à l'activation de diverses voies de signalisation telles que celles menant à la phagocytose, la mitogénèse, l'adhésion cellulaire, l'expression génique, Toutefois leur fonction principale est l'assemblage et l'organisation du cytosquelette d'actine. Ces GTPases fonctionnent comme des interrupteurs moléculaires, actifs lorsque liés au GTP et inactifs sous la forme liée au GDP.

Le but de notre thèse est d'investiguer, dans les cellules thyroïdiennes de chien en culture primaire, l'implication des protéines de la famille Rho et de l'organisation du cytosquelette d'actine dans les actions diverses que la TSH exerce, via l'AMPc, sur la morphologie, la prolifération, la différenciation et la fonction des thyrocytes de chien en culture primaire.

Trois cascades conduisant à la mitogénèse coexistent dans la cellule thyroïdienne de chien: la voie de l'AMPc stimulée par la TSH ou la forskoline (activateur direct de l'adénylate cyclase), la voie des facteurs de croissance (tels que l'EGF, l'HGF) activant leur récepteur à activité tyrosine kinase et la cascade dépendante de la protéine kinase C activée par les esters de phorbol (TPA). Contrairement aux voies indépendantes de l'AMPc qui répriment l'expression des caractéristiques de différenciation, la cascade de l'AMPc stimule à la fois la prolifération, l'expression des gènes de l'état différencié et la fonction (iodation, formation d'H2O2, sécrétion hormonale).

Dans la cellule thyroïdienne de chien, les agents activant les cascades dépendantes et indépendantes de l'AMPc ont des effets différents sur l'organisation du cytosquelette d'actine. La TSH/AMPc et le TPA induisent une destruction des microfilaments d'actine et un "ruffling" membranaire, tandis que les autres agents (insuline, EGF, HGF, sérum) ne modifient pas le réseau de fibres d'actine (fibres de stress) présent dans les cellules quiescentes.

Parmi les protéines de la famille Rho, RhoA, Rac1 et Cdc42 sont les premières à avoir été identifiées et sont actuellement les mieux caractérisées. Nous montrons que la TSH, via l'AMPc, induit une diminution de la concentration de la forme active des protéines Rac1, Cdc42 et RhoA. En revanche, les autres agents mitogènes, tels que l'EGF et le TPA, qui activent des voies indépendantes de l'AMPc, n'affectent pas les taux de Rac1 et Cdc42 activés, mais augmentent le taux de RhoA-GTP. L'activation ou l'inactivation des protéines RhoA, Rac1 et Cdc42 est donc un nouvel élément distinguant les voies dépendantes et indépendantes de l'AMPc.

Grâce à deux toxines bactériennes, la toxine B qui inactive les protéines Rho et la toxine CNF1 qui au contraire les active, nous montrons que, dans les thyrocytes, celles-ci jouent un rôle critique dans l'organisation du cytosquelette, dans la transition G1-S, dans l'expression des gènes de différenciation Tg, ThOXs, NIS et TPO, mais pas dans la génération d'H2O2.

En effet, l'activité d'un ou plusieurs membres de cette famille est nécessaire à l'entrée des thyrocytes en phase S et à la phosphorylation de la protéine pRb, étape pré-requise à la transition G1-S. L'activation de ces protéines n'induit cependant pas, à elle seule, la prolifération. Nous mettons également en évidence l'existence d'un nouveau mécanisme par lequel ces protéines contrôleraient l'activité des complexes cycline D3-CDK4 indépendamment de leur assemblage. Par l'utilisation de la dihydrocytochalasine B, qui comme la toxine B via l'inactivation des Rhos, désorganise le cytosquelette, nous démontrons que l'intégrité de celui-ci n'est pas requise pour la progression des thyrocytes en phases G1 et S. L'inactivation des protéines Rho est par contre nécessaire à l'induction, par l'AMPc, de l'expression des gènes de différenciation incluant Tg, ThOXs, NIS et TPO, puisque ce processus est inhibé par la toxine CNF1. De plus, l'inactivation des Rhos par la toxine B, ainsi que le désassemblage des fibres de stress et du cytosquelette induit par la dihydrocytochalasine B, suffisent à imiter l'induction dépendante de l'AMPc de Tg et ThOXs, mais pas de NIS et TPO. La toxine B et la dihydrocytochalasine B imitent aussi l’effet de la voie TSH/AMPc sur l’accumulation de p27kip1. Enfin, nous montrons que l'augmentation de la production d'H2O2, nécessaire à la synthèse des hormones thyroïdiennes, ne requiert pas l'activité de la protéine Rac (ni des autres protéines de la famille Rho) alors que celle-ci joue un rôle déterminant dans la génération d'H2O2 dans le leucocyte.

Doctorat en sciences, Spécialisation biologie moléculaire
info:eu-repo/semantics/nonPublished

La motilité cellulaire est impliquée dans plusieurs fonctions biologiques critiques, et sa dérégulation peut conduire à des maladies graves comme le cancer. Il est donc essentiel d'étudier les mécanismes moléculaires qui régissent la formation des structures impliquées dans la motilité cellulaire. La première étape de la migration cellulaire de type mésenchymateuse est la formation du lamellipode, protrusion membranaire supportée par un réseau de filaments d’actine et propulsée vers l’avant par la polymérisation de l'actine. La coordination spatio-temporelle des régulateurs de l’actine dans le lamellipode détermine la polarité, l'architecture et les mouvements du réseau de filaments d’actine. Ces régulateurs sont notamment le complexe WAVE (WRC) et le complexe Arp2/3. L'activation du WRC est l'événement moléculaire qui déclenche l'activation du complexe Arp2/3 et donc l'initiation de la formation du réseau de filaments d’actine dans le lamellipode. L'activation du WRC repose sur la libération du domaine WCA activateur du complexe Arp2/3, situé à l'extrémité C-terminale de la sous-unité WAVE. Des études in vitro montrent que deux domaines WCA sont nécessaires pour activer efficacement le complexe Arp2/3.Mais on ne sait pas comment l'organisation spatiale du WRC à l’échelle moléculaire est traduite en activation du complexe Arp2/3 déclenchant la formation du lamellipode. En d'autres termes, la stœchiométrie et la distribution spatiale requise pour traduire l'activation conformationnelle du WRC en une activation efficace du complexe Arp2/3 sont des informations essentielles manquantes.L'utilisation récente de la microscopie de super-résolution (SRM) et du suivi de particules uniques (SRM) a permis de repenser radicalement les assemblages macromoléculaires, en particulier les structures impliquées dans la migration cellulaire telle que le lamellipode. En suivant les protéines individuelles et en fournissant des images avec une résolution spatiale inférieure à la limite de diffraction de la lumière, ces techniques donnent accès à l'organisation et à la dynamique à l'échelle nanométrique des complexes protéiques dans les cellules.Pour révéler l’organisation moléculaire du WRC, nous avons utilisé le DNA-PAINT, une technique de SRM avec une résolution spatiale inférieure à 10 nm. Le DNA-PAINT est basé sur l'hybridation de brins d'ADN complémentaires, l'un situé sur la protéine cible (brin d'amarrage) et l'autre sur le fluorophore (brin d’imagerie). Le DNA-PAINT permet le comptage moléculaire des protéines (qPAINT) et l'imagerie de super-résolution multicouleurs (Ex-PAINT). Cela nous a permis d'évaluer la stœchiométrie, les colocalisations et la composition des complexes protéiques dans le lamellipode.Des expériences de qPAINT ont montré que la stœchiométrie du WRC à l'extrémité du lamellipode est de une ; tandis que l'imagerie en direct par nanoscopie RESOLFT a révélé que ces WRCs uniques forment des clusters isolés à l'extrémité du lamellipode. La SRM multicouleur du corps du WRC et de son domaine WCA a montré que l’activation conformationnelle du WRC induit une libération du domaine WCA dans un rayon de 40 nm. En utilisant des protrusions stéréotypées en forme de vague, nous avons corrélé l'organisation moléculaire du WRC avec leur vitesse de déplacement. Nous avons montré que la distance entre les WRCs individuels est inférieure au rayon de leur dépliage conformationnel dans des régions de protrusion rapide du lamellipode, augmentant la possibilité de rencontre des domaines WCA et donc l’activation du complexe Arp2/3. Ainsi, le WRC, fonctionnant comme un complexe isolé, doit être espacé d'une distance inférieure à son dépliage conformationnel pour activer efficacement le complexe Arp2/3 dans le lamellipode. Dans l'ensemble, nos résultats montrent qu'en plus de l'activation biochimique des circuits de signalisation, l'organisation spatiale des protéines est cruciale pour le contrôle de leur fonction dans les cellules
Cell motility is involved in critical biological functions, and dysregulation of adhesion, migration and of the actin cytoskeletal can lead to severe disease like cancer. Therefore, it is essential to study the molecular mechanism driving the formation of sub-cellular structures involved in cell motility. The first step in mesenchymal cell migration is the forward protrusion of the lamellipodium which is a thin sheet of membrane-enclosed actin filaments (F-Actin) networks propelled by actin polymerization. The spatiotemporal coordination of F-actin regulators in the lamellipodium determines the polarity, architecture and movements of branched F-actin networks. This includes two interacting nanomachines, the WAVE regulatory complex (WRC) and the Arp2/3 complex. WRC activation is the central molecular event triggering Arp2/3 complex activation and thus, the initiation and formation of a branched F-actin network in the lamellipodium. WRC activation relies on the exposure of the cryptic Arp2/3-activating WCA domain located at the C-terminal extremity of the WAVE subunit tail. In vitro studies showed that two WCA domains are needed to efficiently activate the Arp2/3 complex.But how the local spatial organization of WRC at the molecular level translate into activation of the Arp2/3 complex triggering the morphogenesis of the lamellipodium is unknown. In other words, the stoichiometry and the spatial distribution required to translate WRC conformational activation to an efficient activation of Arp2/3 complex are essential missing information.The recent application of super-resolution microscopy (SRM) and single particle tracking (SRM) lead to a drastic rethinking of macromolecular assemblies, in particular structures involved in cell migration, including the lamellipodium. By tracking individual proteins and delivering images with spatial resolutions below the diffraction limit of light, these techniques give access to the nanoscale organization and dynamics of protein complexes in live cells.To reveal the molecular organization of WRC, we use DNA-PAINT, a SRM technique which allows spatial resolution below 10 nm. DNA-PAINT is based on hybridization of complementary DNA strands, one located on the target protein (docking strand) and the other on the dye (imager strand). DNA-PAINT enable absolute molecular counting in protein complexes (Quantitative-PAINT) and multi-color super-resolution imaging (Exchange-PAINT). This allowed us to assess stoichiometries, colocalizations and composition of nanomachines in the lamellipodium.Using Quantitative-PAINT, we showed that the stoichiometry of WRC at the lamellipodium tip of migrating mouse melanoma cell (B16) is one; while live super-resolution imaging based on RESOLFT nanoscopy revealed that these single WRC form discrete foci at the lamellipodium tip. Multicolor Exchange-PAINT super-resolution microscopy of the WRC core and its WCA domain, showed that its conformational activation induces the release of the WCA domain in a radius of 40 nm away from its core. Using stereotyped waveform protrusions, we correlated WRC molecular organization with the rate of membrane protrusions. We showed that the spatial distribution of individual WRC is below the radius of its conformational unfolding in regions of faster lamellipodial protrusion, increasing the possibility of WCA domain dimerization and thus activation of the Arp2/3 complex. This way, the WRC, functioning as an isolated complex, must be spaced at a distance less than its conformational unfolding to activate efficiently the Arp2/3 complex in the lamellipodium. Altogether, our results show that besides biochemical activation of signaling circuitry, the spatial organization of proteins is crucial for controlling their function in cells

La bactérie Myxococcus xanthus forme des structures multicellulaires appelées corps fructifères pour résister à des conditions de carence nutritive. La formation de ces structures implique un système chimiotactique particulier, le système Frz, qui régule le changement de direction des cellules, provoqué par la relocalisation simultanée des deux appareils de motilité (A) et (S) d’un pôle à l’autre de la cellule. Au cours de ma thèse, j’ai travaillé sur la connexion entre le système chimiotactique Frz et ses protéines cibles MglAB dans le contrôle de l’inversion de la polarité. L’axe de polarité des cellules est établi par MglA, une petite protéine G de la famille Ras, qui constitue un embranchement vers la régulation des deux appareils de motilité au pôle avant, et son inhibiteur MglB localisé au pôle arrière. Nous avons montré qu’en interagissant directement et spécifiquement avec le cytosquelette, MglA contrôle l’assemblage et le désassemblage de la machinerie de motilité A. Par une approche évolutive, nous avons élucidé l’architecture modulaire du système Frz et l’implication de quatre domaines régulateurs pour connecter le système Frz aux protéines MglAB, filtrer et amplifier le signal. Nous proposons un mécanisme d’inversion de la polarité dans lequel l’action indépendante de deux RRs à chaque pôle de la cellule perturbe les interactions entre une petite protéine G et son inhibiteur apparenté pour convertir un axe de polarité stable en un oscillateur biochimique. La régulation de la direction de mouvement chez M. xanthus pourrait donc constituer un cas émergent de couplage entre des régulateurs de type procaryotes et eucaryotes
The bacterium Myxococcus xanthus forms multicellular structures called fruiting bodies to resist to starvation conditions. Fruiting body formation implies a chemosensory-like system, the Frz system which regulates directional changes through the simultaneous pole-to-pole relocalization of two motility systems, (A) and (S). During my PhD, I have worked on the connection between the Frz chemosensory-like system and the downstream regulators MglA and MglB in the control of polarity inversion. The cell polarity axis is established by (i) a Ras-like small G protein, MglA, which constitutes a branch node in the regulation of A and S motility systems at the leading cell pole, and (ii) its cognate inhibitor MglB that localizes at the lagging cell pole. We showed that MglA interacts directly and specifically with the cytoskeleton to promote assembly and disassembly of the A-motility machinery. Using an evolutionary approach, we elucidated the modular architecture of the Frz system and the implication of four regulatory domains to (i) connect the Frz system to the MglAB proteins, (ii) filter and (iii) amplify the signal. We now propose a mechanism for polarity inversion in which the independent action of two response regulators at each cell pole perturbs the interactions between a small-G-protein and its cognate inhibitor to trigger the conversion of a stable polarity axis into a biochemical oscillator. The regulation of directional movement in M. xanthus is an interesting emergent coupling between prokaryotes and eukaryotes regulators

Le noyau arqué est un noyau hypothalamique participant activement à la régulation de l'activité des neurones à gonadolibérine (GnRH). Parmi les facteurs impliqués, les neurones à proopiomélanocortine (POMC), via l'un de ses produits de clivage : la [bêta]-endorphine, jouent un rôle inhibiteur majeur sur la sécrétion de GnRH. Dans le cadre de notre thèse, nous nous sommes focalisés sur la régulation de l'activité des neurones a POMC par la galanine et le TGF[bêta], et avons étudié l'implication de ces interrelations sur le système à GnRH. Dans la première partie de ce travail, l'étape initiale a consisté à rechercher l'expression des récepteurs de la galanine par les neurones à POMC
Les ARNm codant les récepteurs GalR1 et GalR2 sont exprimés par les neurones à POMC (principalement par ceux situés dans la partie antérieure du noyau arqué) et cette expression est stimulée en présence de testostérone. Dans un second temps, nous avons étudié l'effet de la galanine sur (i) la libération de [bêta]-endorphine et (ii) les niveaux d'expression d'ARNm codant la POMC à partir de fragments d'hypothalamus médiobasaux maintenus en survie. La galanine diminue la libération spontanée de [bêta]-endorphine dès les 30-60 premières minutes d'incubation et cet effet implique l'activation de calcineurine. Une augmentation des niveaux d'ARNm codant la POMC et une accumulation de [bêta]-endorphine dans les tissus sont observées plus tardivement (60-120 minutes). Compte-tenu de cette observation, nous pouvons donc envisager que cet effet tardif de la galanine sur l'expression de l'ARNm codant la POMC puisse être consécutive à la diminution de [bêta]-endorphine dans le milieu de survie. En effet, la [bêta]-endorphine pourrait intervenir sur sa propre régulation comme le montrent nos travaux relatifs a l'expression de l'ARNm codant le récepteur [mu] par les neurones à POMC. Dans la deuxième partie de ce travail, nous avons étudié la régulation du système à POMC par un facteur astrocytaire, le TGF[bêta] 1, qui, pour agir sur sa cellule-cible, doit se fixer sur un complexe hétérodimérique formé d'un récepteur de type II et d'un récepteur de type I. Le but de notre travail a donc été de rechercher si les neurones à POMC avaient la potentialité d'exprimer ces récepteurs. Nos résultats montrent [. . . ]

La calcitonine (CT}, hormone du métabolisme phosphocalcique, est synthétisée dans les cellules C de la thyroïde. Elle est aussi le marqueur des formes héréditaires ou non du cancer médullaire humain de la thyroïde (CMT). Sa sécrétion est régulée par le calcium et un stéroïde, le 1,25-(OH)₂D₃. Nous avons étudié la régulation de la biosynthèse de la CT in vivo en quantifiant les ARNm thyroïdiens de la CT par hybridation avec une sonde ADNc spécifique ou par traduction dans un système acellulaire et en mesurant la CT plasmatique et thyroïdienne après l'administration de doses supraphysiologiques de calcium et de 1,25-(OH)₂D₃ à des rats Wistar. Le stéroïde n'a pas d'effet sur le contenu thyroïdien en CT et sur la calcémie, mais il augmente la CT plasmatique et les ARNm de la CT hybridables et traductibles en augmentant la transcription ou en stabilisant les ARNm. Avec une dose physiologique du stéroïde, un accroissement du calcium intracellulaire pourrait être impliqué dans cette régulation. Le calcium augmente rapidement (2mn) les ARNm traductibles de la CT parallèlement au calcium et à la CT plasmatiques tandis que les ARNm hybridables ne varient pas. Chez des rats Wag-Rij qui développent souvent un CMT, les ARNm traductibles de la CT ne sont pas augmentés. Chez le rat Wistar, les variations circadiennes des ARNm hybridables et traductibles sont dissociées. Ces résultats suggèrent l'existence de pools d'ARNm inertes rapidement activables par le calcium. Afin d'établir si cette action est directe ou indirecte, nous avons répété l'expérience chez des animaux prétraités à l'actinomycine D. L'antibiotique inhibe seulement l'augmentation des ARNm traductibles de la CT. Ceci suggère que le calcium active les pools inertes de CT par un mécanisme indirecte impliquant la transcription d'autre(s) gène(s) et que son action au niveau de la sécrétion de l'hormone se fait par un mécanisme distinct Ensuite le calcium pourrait augmenter la transcription du gène de la CT puisque, après 30mn et jusqu'à 4 heures, les ARNm hybridables et traductibles augmentent parallèlement. Une dose dépolarisante de potassium n'a pas d'effet sur le calcium extracellulaire mais augmente la CT plasmatique et seulement légèrement les ARNm hybridables de CT. Ainsi le calcium intracellulaire joue un rôle clé dans la régulation de la biosynthèse de la CT au niveau transcriptionnel et indirectement au niveau post-transcriptionnel par des mécanismes impliquant probablement des pools de RNP. Ces pools fluctueraient au cours du nycthémère et sont absents chez les rats développant un cancer.

La superoxyde dismutase à Manganèse (SOD Mn ou SOD2) est une enzyme importante dans la défense antioxydante, qui semble jouer un rôle mal défini dans le développement des tumeurs selon l’expression constitutive de son gène. Cependant, les mécanismes de régulation de cette expression constitutive sont mal connus, en particulier dans les cellules tumorales mammaires. Ce travail a reposé sur la mise en évidence préalable d’une protéine, appelée la Damaged DNA Binding 2 (DDB2) protein, se fixant spécifiquement sur la région promotrice du gène SOD2. La DDB2 est connue pour sa participation dans la réparation de l’ADN par excision de nucléotides. Dans un 1er temps, nous avons caractérisé la séquence d’ADN spécifiquement reconnue dans la région proximale du promoteur du gène SOD2, sur laquelle la DDB2 s’y fixe sous la forme d’un monomère, pour réguler négativement la transcription constitutive de la SOD Mn dans les cellules tumorales mammaires non métastatiques de type MCF-7. Par ailleurs, la DDB2 n’est pas impliquée dans le mécanisme d’induction du gène SOD2, lorsque les cellules MCF-7 sont exposées à des substances inductrices. En revanche, nous avons montré que l’absence de la protéine DDB2, associée à celle du facteur de transcription AP-2?, déjà connu comme répresseur du gène SOD2, entraîne une expression constitutive élevée de la SOD Mn dans les cellules tumorales mammaires métastatiques n’exprimant pas le récepteur aux œstrogènes (ER-). De plus, cette expression constitutive élevée est principalement dépendante du facteur de transcription Sp1. Dans un 2ème temps, nous avons évalué la signification biologique de la régulation de l’expression constitutive de la SOD Mn par la DDB2 dans les cellules tumorales mammaires. Nos résultats montrent que la DDB2 active la prolifération des cellules tumorales mammaires ER+, en exerçant sa régulation négative sur l’expression de la SOD Mn. Dans un 3ème temps, nous avons cherché à montrer les conséquences sur la croissance des cellules tumorales mammaires ER-, qui surexpriment naturellement la SOD Mn. Nos résultats révèlent que l’enzyme antioxydante joue un rôle important dans les mécanismes moléculaires impliqués dans le pouvoir invasif des cellules tumorales mammaires ER-. La surexpression de la SOD Mn, associée à un taux faible des enzymes éliminant l’H2O2, entraînent une augmentation du pouvoir invasif déjà élevé des cellules tumorales mammaires ER-, associée une augmentation de l’activité de la métalloprotéinase 9. L’élimination, en présence d’antioxydants, de l’H2O2 libéré par l’activité de la SOD Mn surexprimée, entraîne une inhibition à la fois de la croissance et des capacités invasives des cellules tumorales mammaires ER-. L’ensemble de ce travail contribue à mieux comprendre l’importance de la SOD Mn et du mécanisme de régulation de son gène dans la croissance et l’invasion tumorales. Ainsi ce travail révèle également la SOD Mn et la DDB2 comme de potentiels facteurs prédictifs de la progression tumorale mammaire. Enfin, la découverte de la nouvelle activité biologique de la DDB2 ouvre un vaste champ de perspectives intéressantes en cancérologie mammaire
Manganese superoxide dismutase (Mn SOD or SOD2) is an important enzyme in the antioxidizing defence, which seems to play an unclear role in the cancer development, according to the constitutive expression of its gene. However, the regulation of this constitutive expression is not totally known, particularly in the breast cancer cells. This work is based on a preliminary revealing that a protein, called Damaged DNA Binding 2 (DDB2), specifically binds the SOD2 gene promoter. The DDB2 is known for its involvement in the nucleotide excision repair. At first step, we characterized the specific DNA sequence recognized in the proximal area of the SOD2 gene promoter, on which a DDB2 monomer binds, in order to regulate negatively the Mn SOD transcription in the MCF-7 non metastatic breast cancer cells. Besides, DDB2 is not involved in the mechanism of SOD2 gene induction, when MCF-7 cells are exposed to induced substances. However, we showed that the lack of the DDB2 protein, associated with the lack of the AP-2a transcription factor, already known as a repressor of the SOD2 gene, lead to a high Mn SOD constitutive expression in the metastatic breast cancer cells. Furthermore, this high constitutive expression is mainly dependent of the Sp1 transcription factor. Secondly, we estimated the biological meaning of the regulation of the Mn SOD constitutive expression by the DDB2 in the breast cancer cells. Our results show that the DDB2 activates the positive ER breast cancer cell proliferation, by exercising its negative regulation on the Mn SOD expression. Thirdly, we tried to show the consequences on the negative ER breast cancer cell growth, which naturally and highly express the Mn SOD. Our results reveal that the antioxidizing enzyme plays an important role in the molecular mechanisms involved in the invasive capacities of the negative ER breast cancer cells. The high Mn SOD expression, associated in a decrease of the H2O2 detoxifying enzymes expression, enhance the negative ER breast cancer cell invasion and an increase of the matrix metallopeptidase-9 activity. The H2O2 elimination, with specific antioxidants, decreases both negative ER breast cancer cell growth and invasive capacities. This whole work contributes to better understand the Mn SOD importance and the mechanism of its gene regulation, in the tumoral growth and invasion. This work also reveals the Mn SOD and DDB2 as potential predictive factors of the breast cancer progress. Finally, the discovery of this new DDB2 biological activity opens a huge field of interesting perspectives in breast cancer research

L'anguille a un cycle de vie complexe avec une reproduction océanique et une croissance dans les eaux continentales. La phase de croissance se termine par une "métamorphose secondaire " ou argenture, dernier stade accessible dans les conditions naturelles. La maturation sexuelle naturelle n'a encore jamais été observée et le développement des gonades reste bloqué du fait d'un déficit en hormones gonadotropes, LH et FSH. Comprendre les mécanismes de régulation de LH et FSH chez l'anguille présente un intérêt fondamental pour l'évolution du contrôle de la puberté et un enjeu appliqué pour la maîtrise de la reproduction chez cette espèce en danger. Après avoir développé les outils moléculaires pour l'étude de l'expression des sous-unités de LH et FSH, nous montrons qu'au cours de l'argenture seul l'axe gonadotrope est activé, avec une augmentation de l'expression de FSHβ puis de LHβ, sans activation des axes thyréotrope et somatotrope, ce qui apparente l'argenture à une puberté plutôt qu'à une métamorphose. Nous observons aussi une régulation différentielle de l'expression de LHβ et FSHβ au cours de la maturation sexuelle expérimentale avec une amplification sélective de l'expression de LHβ. Grâce à l'utilisation de culture primaire de cellules hypophysaires d'anguille, nous montrons que les stéroïdes sexuels (estradiol et androgènes), les peptides gonadiques (activine/follistatine) et les facteurs métaboliques (IGF-1, cortisol) exercent des effets directs sur l'expression de LHβ ou FSHβ et peuvent être impliqués dans leur régulation différentielle.

Mise en évidence du rôle physiologique de la sérotonine dans la régulation de la stéroïdogénèse par son identification par immunofluorescence et électrochimie dans les cellules chromaffines qui pourraient stimuler la stéroïdogénèse par régulation paracrine sous contrôle orthosympathique. Rôle des prostaglandines dans les mécanismes de couplage stimulus-sécrétion: les PG de la série E et la PG I2 peuvent être considérées comme des seconds messagers potentiels de l'angiotensine II et de l'acétylcholine

La protéine Rev du HIV-1 joue un rôle essentiel dans le cycle viral en permettant l'export vers le cytoplasme des ARNm viraux non ou partiellement épissés. Dans la perspective d'inhiber cette fonction, nous avons mis au point des peptides capables de reconnaître Rev et d'inhiber sa fonction, appelés SHPR (Sumo Heptapeptide Protein transduction domain for binding Rev). Nous avons établi que ces peptides sont capables de diffuser à travers les membranes plasmiques pour atteindre ensuite le noyau, où ils induisent la dégradation de la protéine virale, principalement par la voie du protéasome. Des expériences de mutagenèse ont précisé la contribution des différents domaines des SHPR dans l'action antivirale, et ont démontré que peu d'améliorations sont possibles pour optimiser leurs propriétés. Enfin, nous avons montré que Rev n'est pas régulée par sumoylation mais qu'elle peut être modifiée par addition d'une chaîne de polyubiquitine, qui stabilise la protéine mais module son activité

La vitesse de réplication du HIV-1(Human Immunodeficiency Virus type 1), qui semble corrélée de manière directe à la vitesse de progression de la maladie vers le stade SIDA, est essentiellement contrôlée au niveau transcriptionnel. La transcription du HIV-1 est régulée par la structure chromatinienne, des éléments agissant en cis localisés dans les LTRs, des facteurs de transcription agissant en trans et par la protéine virale trans-activatrice Tat (revu dans Quivy et al. 2007, Bisgrove et al. 2005, Rohr et al. 2003, Rabson and Graves 1997). En plus de l’enhancer localisé dans le LTR5’ du HIV-1, un enhancer intragénique, localisé dans le gène pol du HIV-1, inductible par le phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) a été identifié. La localisation progressive de l’activité enhancer a permis de définir deux domaines distincts et indépendants dans cet enhancer intragénique :les fragments 5103 et 5105 localisés respectivement dans la partie centrale du gène pol et dans une région couvrant la fin du gène pol, le gène vif, le gène vpr et le premier exon codant des gènes tat et rev (Verdin et al. 1990). Les fragments 5103 et 5105 se comportent tous deux comme des enhancers inductibles par le PMA lorsqu’ils sont clonés en amont du promoteur de la thymidine kinase dans un vecteur rapporteur en cellules HeLa. Notre laboratoire a précédemment identifié trois sites de liaison pour les facteurs de transcription AP-1 dans le fragment 5103 (Van Lint et al. 1991).

Au cours de notre thèse, nous avons poursuivi la caractérisation de ces sites de liaison AP-1 et avons montré que les facteurs c Fos, JunB et JunD interagissent in vitro avec ces motifs. Pour chaque site, nous avons identifié des mutations qui abolissent la liaison des facteurs AP-1 sans altérer la séquence en acides aminés sous-jacente de la transcriptase inverse. Par des expériences de transfection transitoire, nous avons démontré que les sites AP 1 intragéniques sont entièrement responsables de l’activité enhancer PMA-dépendante du fragment 5103. De plus, l’activité PMA-inductible du fragment 5103 est inhibée par le mutant dominant négatif A-Fos à condition que les sites ne soient pas mutés. A l’inverse, l’expression ectopique de dimères forcés AP-1 affecte positivement l’activité enhancer du fragment 5103. Enfin, nous avons étudié le rôle biologique des sites AP-1 intragéniques dans la réplication virale et avons montré que ces sites contribuent positivement à l’infectivité du virus.

Durant la seconde partie de notre thèse, nous avons entamé la caractérisation physique et fonctionnelle du fragment 5105. Nos résultats de transfection transitoire montrent que l’activité PMA inductible du fragment 5105 est localisée dans le dernier tiers de ce dernier :le sous fragment 5105.3. L’analyse bioinformatique de cette région a permis de mettre en évidence un site de liaison pour les facteurs AP-1 in vitro. Des mutations ponctuelles permettent d’abolir la liaison des facteurs à leur site mais altèrent la séquence en acides aminés sous-jacente codant pour les protéines Tat et Rev. Nous avons montré que ce site est impliqué dans l’activité transcriptionnelle de ce fragment. L’expression ectopique du mutant dominant négatif A-Fos inhibe l’activité transcriptionnelle PMA-inductible du fragment 5105. Une analyse bioinformatique plus large nous a ensuite permis d’identifier in vitro, par retard de migration sur gel, 5 sites de liaison pour le facteur YY1 et 2 sites de liaison pour le facteur PU.1 dont les implications pour le virus restent encore à déterminer.

Doctorat en Sciences
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L'apoptose est un processus physiologique essentiel permettant aux organismes de maintenir leurs tissus dans des conditions fonctionnelles. Lors du traitement du cancer, les mécanismes moléculaires qui contrôlent la décision cellulaire d’engager ou d’éviter l’activation de cette voie sont mal connus, ce qui a un impact important sur le développement thérapeutique. Pour obtenir une vue globale du rôle des protéines impliquées dans la dynamique de la réponse cellulaire aux anticancéreux, une nouvelle description détaillée de la voie de l'apoptose au niveau du récepteur a été implémentée en un système d'équations différentielles ordinaires. Le modèle a été calibré sur des données expérimentale en cellule unique, de populations de cellules HeLa présentant une réponse hautement hétérogène au ligand, TRAIL. Les sensibilités des réactions apoptotiques dans notre modèle ont été évaluées en utilisant la diversité des comportements expérimentaux observés in vitro. Une série de tests et d'analyses informatiques ont été effectués avec notre modèle pour identifier les origines de l'hétérogénéité de la réponse cellulaire, faisant émerger de nouvelles caractéristiques de la voie apoptotique. Ces analyses apportent de nouvelles connaissances biologiques et soulignent l’importance de la régulation du complexe des récepteurs de la mort, éventuellement par la Caspase-10, comme le suggèrent de nouvelles découvertes expérimentales. Cette thèse offre une nouvelle approche pour découvrir des informations biologiques importantes en utilisant des données en cellule unique, de voies de signalisation à dynamiques hétérogènes
Apoptosis is an essential physiological process through which organisms are able to equilibrate their cell numbers and maintain tissues in healthy and functional conditions. Despite the recent advances in the field, little is known on the molecular mechanisms controlling individual cell decisions to either engage or avoid the activation of this pathway upon cancer treatment, which inevitably impacts on therapeutics development. To obtain a global view of the intervening proteins and their role on cell response dynamics to anticancer drugs, a new and detailed description of the apoptosis pathway at the receptor level was translated into a system of ordinary differential equations. The model was calibrated to single-cell data, from recent experiments on a population of HeLa cells exhibiting a highly heterogeneous response when exposed to the death-inducing ligand TRAIL. The sensitivities of the apoptotic reactions in our model were evaluated using the diversity of experimental behaviors observed in vitro. A series of computational tests and analyses were performed with our model to identify the origins of cell response heterogeneity. New features of the apoptotic pathway emerged from a comparison of different heterogeneity modeling approaches, detecting a set of key reactions to be further expanded. These analyses yield new biological insights and highlights the importance of refining regulation of death receptor complex activity, possibly through Caspase-10 as suggested from new experimental discoveries. This thesis offers a novel framework that can be used to uncover important biological insights using single-cell data of heterogeneous dynamical pathways