Academic literature on the topic '2,5-HEXANEDIONE'

Hexane is used in many industrial processes and induces neurotoxic effects in the central and peripheral nervous system. Hexane is metabolized to 2,5-hexanedione, which is the neurotoxic agent. Continued exposure to hexane or 2,5-hexanedione results in loss of sensorial and motor function in arms and legs and to alterations in axonal neurofilament proteins. The effects of 2,5-hexanedione on different cytoskeletal proteins in different brain areas have not been studied in detail. The aim of this work was to study the effects of chronic exposure of rats to 2,5-hexanedione (1% in the drinking water) on tubulin, neurofilament NF-L, microtubule-associated protein MAP-2, and on glial fibrillary acidic protein (GFAP), in cerebellum, hippocampus and cerebral cortex. The amount of each protein was determined by immunoblotting and its distribution was analysed by immunohistochemistry. The results obtained show a regional selectivity in the 2,5-hexanedione effects on cytoskeletal proteins. NF-L content decreased in all brain areas. MAP-2 decreased in cerebellum and hippocampus and tubulin decreased only in cerebellum. GFAP decreased only in cerebral cortex, but its distribution was altered in cerebellum, with increased content in the granular layer and decreased content in the molecular layer. The area most affected was the cerebellum, where all the proteins analysed were altered. These cytoskeletal proteins alterations may impair the transfer of information involved in the regulation by the cerebellum of motor function and contribute to the altered motor performance in rats exposed to 2,5-hexanedione and humans exposed to hexane.

Brain stem auditory evoked potentials (BAEP) and somatosensory evoked potentials (SEP), recorded from subcutaneously placed electrodes in anesthetized rats, were used to detect neurotoxic effects of acrylamide and 2,5-hexanedione on the sensory nervous system. Both neurotoxicants were administered for 21 days by the intraperitoneal route, using dosages of 20 mg/kg/day for acrylamide and 350 mg/kg/day for 2,5-hexanedione. Recordings were made before and 1, 2, and 3 weeks after dosing was initiated. Both food-restricted and ad libitum-fed rats served as controls. Results demonstrated that SEP waveforms generated in rats were sufficiently variable that differences among the groups were not detected. However, BAEP latencies were longer than those seen in control rats after 3 weeks of acrylamide treatment and after both 2 and 3 weeks of 2,5-hexanedione treatment. The effects of 2,5-hexanedione were more pronounced than those of acrylamide, and increased with length of the dosing period.

A circulating production of 2,5-hexanedione from 2,5-dimethylfuran was studied. The results showed that new technology reduced the environmental pollution, the cost of production and the difficulty of product separation, simultaneously, improved the purity of product. The method requires simple equipment, mild reaction conditions, involved in the safe operation easy, suitable for industrial production, is a more reasonable and more convenient synthesis of circular economy of 2,5-hexanedione method.

Currently, there are just symptomatic treatments available for Parkinson’s disease (PD), that is the second most common neurodegenerative disease after Alzheimer’s disease and is predicted to increase in prevalence as the world population ages. Its central pathological features is the selective degeneration of dopaminergic neurons in the Substantia nigra (SN) pars compacta projecting to the Corpus striatum (CS), leading to a striatal dopamine deficiency resulting in the typical movement disorders of parkinsonism. Even though the majority of PD cases are sporadic, mutations in a number of genes have been associated with familial PD. It’s also known that parkinsonism can be induced by exposure to environmental toxins such as pesticide, chemical compounds and hydrocarbon solvents, including 2,5-hexanedione (2,5-HD), the toxic metabolite of n-hexane. 2,5-HD has been shown to induce parkinsonism in animals and humans and to affect directly the cytoskeletal proteins. In particular, microtubules (MTs) have been found to interact with some of the proteins mutated in PD, such as α-synuclein, LRRK2 and parkin, and to be affected by the action of some PD toxins like MPP+ and rotenone. Therefore, in the last years, the MT dysfunction has become an emerging hypothesis in PD pathogenesis. In this scenario, our goal was to investigate the MT dysfunction in neuronal cells, primary skin fibroblasts from PD patients and transgenic mice, taking advantage of both a gene- (using PARK2 mutations) and toxin- (using 2,5-HD) based models of PD neurodegeneration. In the first part of the project, nerve growth factor (NGF)-differentiated PC12 cell line has been used as a model of dopaminergic neurons in culture using three different concentrations of toxin (0,2 mM; 2 mM and 20 mM 2,5-HD) for 24 hours, in order to study the early events of neurodegeneration. Thus, the characterization of the effects of 2,5-HD on cytoskeleton has been carried out through both western blot analysis and immunofluorescence techniques, revealing an impact on all its components (actin, neurofilaments and MTs). Subsequently, I focused on MT system through the analysis of different post-translational modified forms of α-tubulin, showing significative MT stabilizing effects of 2,5-HD in both levels and distribution, in particular it could increase the levels of stable MTs that appeared fragmented or accumulated in the cell body. In accordance with these results, the analysis of tubulin polymerization in cell revealed a higher content of MT mass caused by 2,5-HD. On the contrary, from our in vitro data no significant effects of 2,5-HD emerged in the tested conditions and also the ultrastructure of MTs obtained in the presence of toxin resulted conventional. Interestingly, the first signs of mitochondrial damage, in our experimental conditions, seemed to be induced only at the highest concentration of 2,5-HD, while strong effects on cytoskeleton came up earlier at lower doses in our cellular model. Following, the effect of 2,5-HD has been tested on skin fibroblasts, obtained from healthy donors and PD patients carrying mutation in PARK2 gene, since it encodes for parkin, an E3 ubiquitin ligase that is supposed to bind and stabilize MTs. Cell viability was not affected by 2,5-HD whereas cell morphology appeared significantly modified just in PD patient fibroblasts. Moreover, we found that cytoskeletal organization and stability were affected, with a consequent alteration of cell morphology and behaviour, in PD patient cells already at baseline conditions without the addition of any stressor: all parkinsonian fibroblasts showed a reduced MT mass and displayed significant changes in MT stability-related signalling pathways, without any activation of autophagy or apoptosis. This shows for the first time that MT dysfunction occurs in patients and not only in experimental models of PD. The PD fibroblasts were also much more susceptible to 2,5-HD effects than healthy controls, suggesting that the genetic background may really make the difference in MT susceptibility to environmental factors. Consistent with this hypothesis, we observed the increase of fragmentation of stable MTs in PARK2 patient-derived ventral midbrain neurons. The second part of the project has been dedicated to in vivo experiments in wild type and PARK2 heterozygous (PARK2+/-) mice. In fact, although PARK2 mutations are responsible for a familial early-onset autosomal recessive form of PD, some individuals carrying heterozygous mutations, usually asymptomatic, have been found to present nigrostriatal abnormalities, making PARK2 haploinsufficiency a possible risk factor for developing the late-onset disease or other neurological disorder. Biochemical analysis of the cytoskeletal protein level in lysates from SN and CS and confocal microscopy on immunostained brain slices have revealed that the MT system is more dynamic in PARK+/- mice respect to wt ones. In addition, we evaluated the motor behaviour of these mice using a video-tracking system mounted above open field cages. Surprisingly, we found the heterozygous mice were significantly more active than wt ones. Finally, we have found no cell loss in both genetic backgrounds or terminal loss in the CS after treatment. The imbalance of post-translationally modified tubulins, that are associated with differences in MT stability, occurs also in PARK2 knockout mice and precedes the block of mitochondrial transport. Our data showed that PARK2 mutations or haploinsufficiency impacts MT system in vivo, unravelling parkin as a regulator of MT stability in neurons and suggesting a key role for MT dysfunction in the PD selectively dopaminergic neurodegeneration.

Several industrial and environmental chemicals cause distal and/or central neuropathy among other diverse toxic effects. Spague-Dawley derived rats were fed doses of 2,5-hexanedione, acrylamide, tri-o-tolyl phosphate, leptophos and methylmercury via gavage. The dose levels and administration periods were established in previous experiments designed to assess clinical neuropathy using rats trained to walk on a rotorod apparatus fitted with an electrode floor. After intravenous injections of 3H-Tryptophan, whole rat brain homogenates were analyzed using liquid scintillation and spectrofluorometric techniques for levels of tryptophan, serotonin and 5-hydroxyindoleacetic acid. Serotonin turnover rates were calculated using the specific activities of tryptophan and serotonin at two different time periods. The levels of serotonin as well as the serotonin turnover rates were unaffected by dosages of 5 to 50 mg acrylamide/kg given daily doses, while whole brain concentrations of 5-hydroxyindoleacetic acid increased significantly in a dose-dependent manner. the rise in 5-hydroxyindoleacetic acid levels coupled with no effects on the other levels in acrylamide and 2,5-hexanedione-fed animals suggests a possible inhibition of the energy-dependent 5-hydroxyindoleacetic acid efflux system in the brain. Animals given five doses of Leptophos (4.5 to 45 mg/kg) or six doses from 30 to 300 mg/kg tri-o-tolyl phosphate, administered every third day, showed slightly eleveated, non-significant, serotonin turnover rates while levels of serotonin and tryptophan remained unchanged with a slight decrease in 5-hydroxyindoleacetic acid levels at the highest dosages. Levels of endogenous indole compounds in methylmercury treated rats showed no significant differences from control values; however, the turnover rates and levels of serotonin were slightly lower in the two lower treatment levels, while the highest dose level had no apparent effect on turnover rates or concentrations. Further studies involving longer treatment periods, alternate species or examination of discrete brain areas, may further clarify the effects of these chemicals on brain biochemistry.

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Humana e Ambiente). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2014
n-Hexane is a solvent that has many uses, either in pure form or as a component of the commercial mixture hexane. Highly purified n-hexane is primarily used as a reagent, frequently used in the chemical and food industries, in the formulation of glues and paints and as a degreasing agent and extract solvent. It is well known that this solvent presents neurotoxic effects, thus, it is very important to study biomarkers, of exposure and/ or effect, as tools of human biomonitoring, acting as indicators of exposure, as well as predictive biomarkers to prevent the occurrence of neurotoxic effects. In this context, it is imperative to understand the mechanism of n-hexane toxicity and identify endpoints that may be selected as predictive biomarkers of neurotoxicity. The principal aim of this work was to develop accurate procedures to quantify biomarkers in urine of rats exposed to 2,5-hexanedione (2,5-HD), the main metabolite responsible for n-hexane neurotoxicity. This γ-diketone reacts with primary amines of lysine in protein neurofilaments, yielding the formation of pyrrole compounds. However, the formed pyrroles may oxidize and react to other protein nucleophiles, inducing the cross-linking between proteins and causing damage to cellular proteins. The most sensitive proteins to this damage are neurofilaments and other cytoskeletal proteins. In fact, the altered cross-linked proteins aggregate in the distal axon, often just proximal to a node of Ranvier, disrupting the normal physiological cellular activities and causing the neurotoxic effect. To accomplish the goal of this dissertation, 2,5-HD was administrated in rats during 12 dosages and the pyrrole concentrations were measured, to assess if there were any difference between the control group and exposed rats. Simultaneously, was studied the role of N-acetylcysteine (NAC) as a possible protective agent of neurotoxic effects evaluating a group of co-exposed rats (2,5-HD+NAC) and a NAC exposed group.
A Toxicologia é uma ciência que estuda, entre outros factores, os mecanismos de ação e possíveis efeitos que podem advir da exposição humana a agentes químicos (tóxicos), provocando alterações biológicas no organismo. Esta exposição pode ocorrer através do ar, água, comida, objectos, interferindo diretamente com o ambiente e com o Homem. Neste sentido, o ramo da Saúde Pública aumentou a sua intervenção nesta área, tornando a avaliação da exposição a esses agentes num aspeto de alta importância e prioridade na sua ação, com o intuito de prevenir e/ou minimizar os possíveis riscos/ efeitos na saúde humana, através da criação de protocolos de monitorização biológica ambiental e do estabelecimento de limites (mínimos e máximos) de exposição. O objetivo destes dois tipos de protocolo é aumentar a área de atuação, conjugando a identificação e quantificação dos agentes presentes no local de exposição com a quantificação em diferentes amostras biológicas, para que a avaliação do risco de exposição seja o mais correta possível. Um dos grupos alvo desse estudo são os solventes orgânicos, principalmente devido às características volatilidade e lipofilicidade que intervêm no mecanismo de absorção e deposição destes solventes no organismo humano. Após a exposição, ocorre a absorção destes químicos que são, imediatamente, transportados pelo sangue, até aos órgãos onde ocorre a sua metabolização (principalmente o fígado), dando origem a metabolitos que, posteriormente, serão degradados e excretados do organismo, provocando o aparecimento de alguns sintomas físicos, tais como dormência, perda de sensibilidade. A gravidade destes sintomas/ efeitos está principalmente associada à via de absorção, sendo as alterações neurológicas as mais frequentes (como por exemplo neuropatias, axonopatias, mielinopatias). O n-Hexano é um solvente orgânico, altamente volátil e lipofílico, que tem várias aplicações, seja sob a forma pura ou enquanto componente de uma mistura comercial de hexano. A sua forma altamente purificada é primeiramente usada como reagente, sendo as misturas utilizadas nas indústrias químicas e alimentares, na formação de colas e tintas, como desengordurante e solvente de extração. Da literatura e de estudos anteriores, sabe-se que este solvente é responsável pelo aparecimento de efeitos neurotóxicos (maioritariamente alterações neurológicas), principalmente devido à sua capacidade de acumulação no organismo, sendo, por isso, de grande importância a ação da Saúde Pública na criação/ parametrização de protocolos de controlo e monitorização. Dentro destes protocolos, surgem os estudos realizados com biomarcadores, de exposição e/ ou de efeito, estando os biomarcadores de exposição associados à quantificação do agente químico e respetivos metabolitos e os biomarcadores de efeito associados à avaliação do potencial dos efeitos resultantes da exposição. Ambos poderão ser utilizados como ferramentas de monitorização humana, que atuem tanto como indicadores de exposição ou como biomarcadores preditivos da ocorrência desses efeitos neurotóxicos. O grau de severidade dos efeitos causados está relacionado com a via de exposição, tempo e grau de exposição, podendo afetar várias partes do corpo, como pele, mucosas das membranas, sistema respiratório, fígado, sangue, sistema reprodutivo e sistema nervoso. Assim, com base no referido anteriormente, percebe-se que é fundamental o conhecimento do mecanismo de toxicidade dos agentes e identificação de endpoints que possam ser escolhidos para utilização enquanto biomarcadores de previsão da neurotoxicidade desses agentes. No caso concreto desta dissertação, o agente em causa é o n-hexano que, após ser metabolizado no fígado dos organismos, origina vários metabolitos, sendo a 2,5-Hexanodiona (2,5-HD) um deles e o principal responsável pelos efeitos adversos que decorrem da exposição ao n-hexano. Posteriormente, esta γ-dicetona é distribuída por vários órgãos/ zonas no organismo, reagindo com os vários componentes lá existentes, dos quais se destacam as proteínas associadas ao funcionamento do sistema nervoso. Esta interação é feita através das aminas primárias do aminoácido lisina nas proteínas (dos neurofilamentos dos neurónios), conduzindo à formação dos aductos pirrólicos, que irão desnaturar a proteína o que, consequentemente, a fará perder a sua função, provocando alterações neurológicas e electrofisiológicas. Por outro lado, os pirróis formados podem também oxidar e reagir com outras proteínas nucleofílicas, induzindo a ligação cruzada entre agregados de proteínas no axónio distal, normalmente próximo de um nódulo de Ranvier, o que também irá interferir com o normal funcionamento das atividades celulares fisiológicas. Todas as alterações anteriormente referidas estão associadas à acumulação da γ-dicetona em várias partes do organismo que, por métodos analíticos, pode ser quantificada através de uma reação química entre o 4-Dimetilaminobenzaldeído (componente do reagente de Ehrlich) e o anel pirrólico que se forma após contacto da dicetona com as proteínas. Face a todas estas alterações pode-se ainda falar em possíveis agentes que possam atuar na diminuição e/ ou reversão dos efeitos causados pela dicetona. De entre essas substâncias está a N-Acetilcisteína que, devido às suas propriedades antioxidantes, tem a capacidade de manter os níveis intracelulares de Glutationo (GSH), que ajuda a reduzir a concentração das Espécies Reativas de Oxigénio (ROS) responsáveis tanto por destabilizações celulares e como pela inibição/ atraso na morte celular. No caso concreto dos compostos pirrólicos, parece atuar reduzindo/ impedindo a oxidação do anel pirrólico, que é o passo determinante na formação dos pirróis, na medida em que provoca rutura e alteração das biomoléculas e células do organismo humano. Assim, com o intuito de perceber a extensão das alterações causadas pela exposição do organismo à 2,5-HD, através da quantificação dos pirróis, foram estipulados quatro objetivos para esta dissertação: i) desenvolvimento de procedimentos analíticos que permitissem determinar qual o reagente de Ehrlich e respetivas condições de reação (nomeadamente a temperatura de reação) que apresentassem maior sensibilidade na determinação e quantificação dos pirróis; ii) validação do método previamente escolhido como o mais sensível/ adequado, de acordo com normas e parâmetros já definidos na literatura; iii) determinação da influência da administração (por injeção) de 2,5-HD na concentração dos pirróis, em amostra de urina de ratos Wistar e iv) teste do efeito de proteção da NAC face à formação dos aductos pirrólicos, enquanto agente antioxidante que atua na redução e/ou eliminação dos efeitos resultantes da exposição ao metabolito 2,5-HD. Para o primeiro objetivo, utilizou-se um método espectrofotométrico para quantificação dos pirróis, com base numa reação colorimétrica entre soluções-padrão, de concentrações conhecidas, e o reagente de EH. Experimentalmente foram comparados dois reagentes diferentes, um preparado com trifluoreto de boro e outro com ácido clorídrico, à temperatura ambiente e a 45ºC. Estes estudos foram realizados com o intuito de perceber qual o reagente de EH e a temperatura que permitia uma maior sensibilidade do método e, consequentemente, uma melhor aproximação da verdadeira concentração dos pirróis nas amostras de urina analisadas. Dos resultados obtidos, concluiu-se que o melhor método a utilizar é o reagente de EH com ácido clorídrico, à temperatura ambiente, devido à maior sensibilidade, simplicidade e menor toxicidade, estando esta última característica associada à ausência de trifluoreto de boro, uma substância bastante tóxica. Após a escolha do método a utilizar, procedeu-se à validação, seguindo parâmetros definidos para métodos internos de ensaio em análise química, tais como: linearidade, gama de trabalho, limites de deteção e quantificação, sensibilidade, precisão e exatidão. Nesta parte foi avaliada a curva de calibração determinada para o reagente de EH com ácido clorídrico à temperatura ambiente. Tanto a linearidade como a gama de trabalho são parâmetros que foram analisados estatisticamente, comparando um valor calculado utilizando os resultados obtidos com um valor já definido na literatura e, em ambos os casos, os resultados estavam bem ajustados. De acordo com os resultados obtidos, 2,4966 nmol/ mL é a menor concentração que pode ser detetada nas amostras (limite de deteção) e 3,3810 nmol/ mL a menor concentração possível de ser quantificada utilizando a curva previamente determinada. 0,01876 é um valor que está associado à capacidade do método em distinguir pequenas diferenças entre as concentrações dos analitos. Por fim, dentro da precisão temos a repetibilidade e a precisão intermédia que permitem avaliar a reprodutibilidade do método em condições de variabilidade, tais como laboratórios, analistas, equipamento, tipos de reagentes e duração. A exatidão foi o único parâmetro que não foi avaliado neste trabalho experimental por não haver nenhum valor teórico que se pudesse utilizar para comparação. O cumprimento do terceiro objetivo foi feito através da comparação da concentração dos compostos pirrólicos entre grupos de ratos expostos a diferentes doses de 2,5-HD. As doses foram injetadas por via intraperitoneal, em dias alternados, durante um total de 12 administrações (doses), das quais foram avaliadas as doses 1,4,8 e 12, que estão associadas aos dias de recolha de urina. Da comparação dos resultados obtidos, para o grupo controlo (injeção intraperitoneal de soro fisiológico) concluiu-se que a primeira dose resultou na distribuição da 2,5-HD pelos tecidos, pois os níveis deste composto na urina dos ratos expostos são bastante superiores aos níveis apresentados pelos ratos do grupo controlo. Quanto às outras doses, não foi possível observar se houve diferença significativa, pois i) existe uma grande variabilidade entre os animais, responsável por grandes desvios na análise estatística e ii) devido ao possível surgimento do estado estacionário, em que a determinada altura, a taxa de absorção se torna igual à taxa de eliminação, tornando a concentração dos pirróis constante. Para o quarto e último objetivo desta dissertação, os ratos foram co-expostos à 2,5-HD (injeção intraperitoneal) e NAC (adicionada à água de beber), com o intuito de comparar as concentrações nos dois grupos para testar o possível efeito protetor da NAC, face à injeção de 2,5-HD. Para a primeira dose administrada, foi possível observar que existe um fator protetor quando se adiciona NAC na água de beber que é dada aos ratos, pois a concentração de compostos pirrólicos do grupo co-exposto é inferior à concentração destes mesmos compostos na exposição única a 2,5-HD. Com a continuação da exposição para as restantes doses, o efeito da NAC foi-se tornando menos evidente, o que poderá estar associado ao facto da dose de NAC administrada nos ratos não ser suficiente para reduzir o efeito da exposição repetida à 2,5-HD.

2,5-hexanedione is the main metabolite of hexane and methyl butyl ketone excreted into urine and is currently used to estimate the human exposure levels to these solvents in professional environments. In Brazil, occupational exposure is regulated by a national control program (PCMSO) and applied to public and private organizations that hire your employees according to the actual Brazilian legislation. In the present work, we validated a methodology based on a gas chromatography−flame ionization detector (GC-FID) for the quantification of 2,5-hexanedione in urine to attend the new occupational limit of urinary 2,5-hexanedione, established by a recent revision of the Brazilian legislation, which reduced this limit from 5.0 to 0.5 mg/L. Before GC-FID analysis, sample treatment was based on a simple liquid-liquid extraction with dichloromethane. Considering that there is no specific validation guide for occupational purposes, the adopted validation process was performed using a “fit-for-purpose” approach based on different guides, including FDA bioanalytical method validation, European Commission Decision 2002-657-EC, and ANVISA Guidelines RDC 166/2017. After method optimization, the performance characteristics determined by the present validation study were considered satisfactory and demonstrate the method suitability for the routine analysis in the Brazilian PCMSO, including CCα and CCβ values, which are used to avoid the presentation of false-positive and false-negative results. Intra and interday reproducibility were below 2.66, and 4.08 % and analyte recoveries were above 95.4% for three evaluated levels. The limits of detection and quantification were 0.05 and 0.17, respectively. To our knowledge, this is the first application of CCα and CCβ approaches in an analytical method intended for occupational purposes, which are important to know when a sample is out or following the legislation. Then real samples were analyzed herein, and none presented 2,5-hexanedione above the required limits.