Auswahl der wissenschaftlichen Literatur zum Thema „Voies de sécrétion“

L’étude de l’organisation structurale et fonctionnelle des cellules eucaryotes a révélé les compartiments membranaires ainsi que la machinerie nécessaires au trafic vésiculaire des protéines. La plupart des protéines essentielles à la communication intercellulaire contiennent une séquence signal leur permettant d’être incorporées dans la voie de sécrétion conventionnelle, par laquelle les protéines sont transportées séquentiellement dans le réticulum endoplasmique (RE) puis l’appareil de Golgi. Cependant, les cellules eucaryotes sont également dotées de voies de sécrétion alternatives ou voies de sécrétion non conventionnelles, qui mettent en jeu de nombreux acteurs susceptibles de détourner certains compartiments de leurs fonctions principales au profit de fonctions sécrétoires.

Dans cette synthèse bibliographique nous avons successivement étudié la nature des signaux sensoriels mis en jeu lors de la mise en présence des truies et du verrat, la réaction de la femelle au plan endocrinien et les facteurs de variation de l’efficacité du mâle pour accélérer la venue en puberté des femelles. Les signaux sensoriels mis en jeu sont multiples et impliquent probablement les différentes voies, olfactive, auditive, visuelle et tactile. La truie réagit à la présentation du verrat par une sécrétion accrue de cortisol, susceptible de modifier la sécrétion des hormones gonadotropes (LH et FSH). La diminution de l’âge à la puberté grâce à la mise en présence du mâle s’observe quel que soit le type génétique de la truie. Pour que l’effet soit maximal, il faut que le verrat soit mature et que les contacts physiques avec les femelles soient complets. Leur durée peut être limitée à quelques dizaines de minutes par jour. L’existence de contacts avec le mâle pendant le jeune âge (engraissement) n’altère pas l’efficacité de la mise en présence du verrat pendant la période prépubertaire.

Les progrès récents des techniques de protéomique offrent de nouvelles perspectives pour la biologie circadienne, et en particulier la possibilité d’étudier des modifications post-traductionnelles telles que la phosphorylation et l’acétylation. En utilisant la protéomique in vivo sur des extraits totaux de foie de souris ou des extraits nucléaires, nous avons pu caractériser le protéome rythmique du foie avec une résolution sans précédent, et ainsi révéler de nouveaux processus rythmiques tels que la sécrétion des protéines, la synthèse des ribosomes, la réparation de l’ADN ou la polyploïdie. De plus, l’analyse des modifications post-traductionnelles a permis de mettre en évidence les voies de signalisation impliquées et les conséquences sur le métabolisme hépatique.

L’arsenal pharmacologique est responsable de près de 25% des cas d’insuffisance rénale aigüe (AKI) survenant en réanimation [1]. Parmi les médicaments à l’origine d’AKI les traitements anti-infectieux occupent une place significative. De tous les compartiments rénaux, le tubule, situé au carrefour des voies excrétrices des agents pharmacologiques et leurs métabolites, est la cible principale de la toxicité des anti-infectieux. Le tubule contourné proximal (TCP) remplit les fonctions d’une véritable plaque tournante : capable à la fois de réabsorber les traitements filtrés depuis la lumière tubulaire ou de participer à leur élimination dans les urines. L’accumulation de ces agents survient à la fois au sein des cellules tubulaires et dans leur lumière où ils peuvent précipitent sous forme de cristal ou d’agrégat. Ils constituent alors des micro-obstructions interrompant le flux urinaire. D’autre agents anti-infectieux interfèrent avec la sécrétion tubulaire causant ainsi des « pseudo- insuffisance rénale aiguë ». Des mécanismes immuno-allergiques peuvent également survenir. Dans ce cas l’agent pharmacologique anti-infectieux déclenche une activation lymphocytaire T et une inflammation interstitielle. Enfin certains agents pharmacologiques sont susceptibles de provoquer une insuffisance rénale aiguë par un mécanisme plus indirect, en étant à l’origine d’une hémolyse ou d’une rhabdomyolyse.

Après un rappel des voies métaboliques et des flux de nutriments qui concourent à la lipogenèse mammaire, cet article est consacré aux principaux effets de l’alimentation sur la composition en acides gras (AG) du lait de ruminant, en particulier les AG polyinsaturés, les AG monoinsaturés trans et l’acide linoléique conjugué (CLA). Les principaux facteurs alimentaires étudiés sont la nature des fourrages (dont l’herbe pâturée), le suif, protégé ou non, et la supplémentation des rations avec des huiles végétales ou marines (poisson ou algues), protégées ou non. La supplémentation en suif augmente la sécrétion d’acide oléique. La teneur du lait en C18:2 est comprise entre 2 et 3 % avec les rations non supplémentées en lipides, elle n’est augmentée que de 1,5 point lors d’un apport de graines ou d’huiles riches en C18:2, en raison d’une hydrogénation ruminale poussée. Les rations à base d’herbe (riches en C18:3) augmentent légèrement (0,5 à 1 point) la proportion de C18:3 dans le lait par rapport aux rations à base d’ensilage de maïs. La graine de lin permet un accroissement d’environ 0,3 point. La teneur en C20:5 (EPA) et en C22:6 (DHA) est accrue jusqu’à 0,5 % des AG totaux par l’addition d’huiles marines à la ration. Le taux butyreux du lait peut être fortement diminué par les régimes pauvres en fibres et riches en céréales et/ou par l’administration d’huiles marines ou végétales riches en AG insaturés. Les C18:1 trans, notamment les C18:1 trans 11 et trans 10, mais aussi le trans 10, cis 12 CLA, pourraient jouer un rôle dans cette diminution en inhibant la lipogenèse mammaire. Les régimes alimentaires augmentant les proportions des CLA et des C18:1 trans dans le lait sont ceux qui apportent des précurseurs lipidiques pour la formation de ces AG, ou qui modifient l’activité microbienne associée à l’hydrogénation ruminale des AG polyinsaturés ou l’activité de la désaturase mammaire. L’influence de l’alimentation sur les différents isomères du C18:1 et du CLA du lait a été peu étudiée.

La synthèse des lipides est une composante importante de l’efficacité et de la qualité des productions animales : - des produits de qualité (viande, lait, oeufs, foie gras, ...) doivent être adaptés aux demandes - parfois contradictoires - des transformateurs et des consommateurs, tant pour leur teneur en lipides que pour la composition de ceux-ci (classes de lipides - cholestérol notamment - et leur composition en acides gras - saturés, polyinsaturés, trans...) qui peuvent modifier leurs caractéristiques technologiques, organoleptiques et diététiques ; - une production efficace suppose d’assurer une production minimale de lipides, en raison de leurs effets positifs sur la qualité, tout en évitant une production excessive qui peut nuire à la qualité et se traduire par un gaspillage énergétique du fait du dépôt ou de la sécrétion de lipides animaux peu valorisables ; - l’adaptation des animaux à des périodes de sous-nutrition physiologique (fin de gestation, début de lactation ...) ou économique (économie d’aliments coûteux) suppose que les réserves lipidiques corporelles mobilisées soient ensuite reconstituées efficacement. Compte tenu de ces enjeux importants pour les différentes filières de production et de la diversité des problématiques de recherche rencontrés pour les différentes espèces domestiques élevées en France, un programme a été mis en place à l’INRA, de 1994 à 1998, à l’initiative de F. Grosclaude et de la Direction Scientifique des Productions Animales. Outre les avancées significatives des méthodes d’étude (notamment utilisation des outils moléculaires), et des connaissances mécanistiques et pratiques qui émergent de cet ensemble de travaux, il faut souligner la dynamique induite par ce programme, avec un développement important de collaborations entre équipes travaillant dans des sites géographiques différents et sur des espèces, des situations physiologiques et des types de produits très variés. Ces travaux ont fait l’objet d’un symposium satellite "Lipogenèse chez les animaux domestiques" dans le cadre des 3èmes journées franco-britanniques de Nutrition (AFN-NS-SNDLF) qui ont eu lieu à Nancy du 30 septembre au 2 octobre 1998. Le présent ouvrage regroupe sept articles d’équipes de l’INRA, qui replacent leurs résultats récents dans le cadre des connaissances disponibles sur la lipogenèse chez huit espèces domestiques (poissons, oiseaux, mammifères monogastriques et ruminants) et onze types de production (viande, oeufs, foie gras, races spécialisées ...). En outre, un texte prospectif de synthèse préparé par R.G. Vernon et al (Hannah Research Institute, Ecosse) compare les animaux domestiques, les rongeurs et l’Homme, et présente les récentes évolutions des recherches sur les mécanismes régulant les voies lipogéniques de différents tissus (muscle, foie, tissu adipeux et glande mammaire).

Après la présentation de l’importance des sécrétions digestives pour transformer les aliments en nutriments absorbables et assimilables par l’organisme, les principes généraux de la régulation de leur synthèse et de leur libération sont décrits en soulignant la complexité des mécanismes. Des exemples sont donnés pour montrer l’effet de quelques facteurs (repas, nature des protéines, âge, digestibilité...) sur les sécrétions gastriques et pancréatiques et tenter de proposer une explication des mécanismes en cause. Quelques illustrations font état des apports possibles en nutrition et dans le domaine clinique chez l’animal et l’homme. En conclusion, les résultats récemment obtenus permettent, à l’aide des nouvelles techniques mises à notre disposition et associées à des méthodes classiques, d’ouvrir de nouvelles voies d’investigation dans le but d’intervenir sur la régulation des sécrétions pour mieux les adapter à l’aliment distribué, en tenant compte de l’environnement d’élevage.

Les psychoses majeures telles la schizophrénie sont des troubles complexes qui peuvent impliquer des interactions multiparamétriques comprenant des facteurs génétiques et environnementaux comme des infections. Des études successives ont montré une association entre la schizophrénie et les rétrovirus endogènes humains (HERV). Les HERVs sont des composants du génome humain qui représentent 8 % de l’ADN chromosomique. Depuis plus d’une décennie, une famille spécifique de HERV, HERV-W, a été associée à la schizophrénie. Or, une fois activée, l’expression HERV-W peut être à l’origine de la production d’une protéine d’enveloppe (HERV-W Env) aux propriétés pro-inflammatoires et cytopathogènes via une très haute affinité pour le toll-like receptor 4 (TLR4). Ainsi la sécrétion de cette « toxine endogène » ou sa présentation à la surface des cellules productrices, induit une forte activation des voies de signalisation TLR4 dans les cellules du système immunitaire ou du tissu cérébral (microglie, en particulier). Une transcription élevée des gènes HERV-W a été rapportée dans des études effectuées sur différentes populations de patients schizophrènes en Europe, en Amérique du Nord et en Chine. Les antigènes de capside et d’enveloppe des protéines HERV-W ont été mis en évidence dans des échantillons de sang de patients schizophrène corrélant avec le dosage de CRP (marqueur d’inflammation), ceci, dans la sous-population des patients ayant une CRP positive. Par ailleurs, on a montré que certains Herpesviridae (CMV, HSV…), le virus influenza ou le parasite Toxoplasma gondii, qui sont des facteurs positivement associés à un risque plus élevé de développer une schizophrénie, avaient la capacité d’activer des éléments de la famille HERV-W dans certaines cellules. Les études expérimentales ainsi effectuées, démontrent que des facteurs environnementaux peuvent induire une modification de l’expression de ces éléments génétiques et, ainsi, induire une production auto-entretenue de protéine pathogène codée par certaines copies HERV-W. Différentes études ont aussi montré un effet potentiel de HERV-W Env sur le développement et le fonctionnement neuronal, via la dérégulation de neurorécepteurs (NMDA/DRD3) ou de facteurs comme le BDNF. D’autres paramètres de ces interactions complexes ont aussi été mis en évidence, comme certains profils immunogénétiques (HLA/génotype TLR4 susceptibles aux infections), un faible contrôle épigénétique (infections périnatales), des toxiques (cannabis ?) ou des stress particuliers. La résultante de ces interactions multiples, peuvent permettre de relayer les effets des facteurs environnementaux au niveau d’une expression génique HERV-W anormale codant pour une protéine immuno- et neurotoxique. Ainsi, HERV-W pourrait constituer un élément pivot dans la pathogenèse de la maladie, une fois activé au niveau du génome de certaines cellules. Par conséquent, notre hypothèse est qu’un événement infectieux ou inflammatoire majeur au cours de la grossesse, peut déclencher l’activation des éléments de HERV-W dans l’embryon ou le nouveau-né. L’activation de ces HERVs qui peuvent rétrotransposer dans le génome affecté, pourrait provoquer des modifications de l’ADN telles qu’observées ultérieurement chez les malades atteints de schizophrénie (CNV, microdélétions ou réarrangements génétiques, etc.). Un remaniement du génome HERV-W et d’éléments « génétique mobiles » associés, pourrait causer une expression aberrante HERV-W et conduire à un développement neurologique anormal, dans un contexte général de neurotoxicité inflammatoire. Des conditions de stress particulières et/ou des infections secondaires avec des agents neurotropes tels que, par exemple, le cytomegalovirus (CMV) ou le virus de l’herpès simplex de type 1 (HSV-1), pourraient alors venir augmenter ou réactiver l’expression des éléments modifiés de HERV-W modifiés ou dérégulés. Ceci conduirait à atteindre un seuil d’expression qui déclencherait des épisodes neuro-inflammatoires et/ou neurotoxiques à l’origine d’une symptomatologie psychotique aiguë. L’existence d’anticorps neutralisant cette toxine endogène, dont une IgG4 humanisée est actuellement développée en phase II d’essais cliniques pour d’autres pathologies neuro-inflammatoires, suggère que des études précliniques sont nécessaires pour étayer des stratégies de traitement spécifiques analogues. Une telle approche innovante ciblant une protéine endogène qui agirait en amont de la cascade pathogénique responsable de l’évolution de la maladie schizophrénique, pourrait la neutraliser et, potentiellement, réduire puis prévenir la survenue d’épisodes psychotiques ainsi que les conséquences neuropathologiques induites.

Bien que les protéines S100A8/A9 et S100A12 exprimées par les neutrophiles ne possèdent pas de peptide signal, elles sont retrouvées dans le sérum de patients souffrant de diverses maladies inflammatoires. Les mécanismes de sécrétion de ces protéines demeurent peu connus ainsi que les agonistes qui favorisent leur sécrétion. Nous avons donc émis l´hypothèse que plusieurs voies de sécrétion alternative ainsi que plusieurs agonistes des neutrophiles pourraient participer à la libération de ces protéines. Dans un premier temps, nous avons étudié les stimuli capables de provoquer la sécrétion de la calprotectine et/ou de la S100A12. Dans une deuxième partie, nous nous sommes intéressés aux signaux et mécanismes alternatifs de sécrétion impliqués dans le relargage de ces protéines. L’ensemble de ces travaux montre la complexité des voies de sécrétion alternatives impliquées dans la sécrétion des protéines S100 et comment ces voies sont influencées par l’activation des neutrophiles par différents agonistes.
Although S100A8/A9 (calprotectin) and S100A12 proteins expressed by neutrophils lack a signal peptide, they are found in the serum of patients with various inflammatory diseases. However, the mechanisms of secretion and the agonists that promote their secretion are still unknown. We hypothesized that several alternative secretory pathways and several agonists of neutrophils may participate in the release of S100A8/A9 and S100A12 protein. Initially, we studied the stimuli inducing the secretion of calprotectin and / or S100A12. In a second part, we were interested in signals and alternative mechanisms of secretion involved in the release of the calprotectin and S100A12. In conclusion, this study shows the complexity of alternative secretion pathways involved in S100 secretion and that these pathways are influenced by the activation of neutrophils by various agonists.

L’épithélium qui tapisse les voies aériennes des patients atteints de mucoviscidose (CF) est soumis à des infections récurrentes et une inflammation continue qui génèrent des lésions. La réparation de l’épithélium pulmonaire CF est anormale et provoque à terme un remodelage tissulaire qui affecte de façon irréversible la fonction pulmonaire des patients. Une des stratégies thérapeutiques proposées pour compenser la déficience du canal chlorure (Cl-) CFTR, muté dans la mucoviscidose, consiste à activer une voie alternative de sécrétion de Cl-. En 2008, ANO1 (anoctamine 1) a été identifiée comme protéine responsable de la conductance Cl- activée par le Ca2+ (CaCC). Cette protéine n’a pas été caractérisée au niveau pulmonaire dans le contexte CF mais a été impliquée dans les mécanismes de prolifération et de migration de cellules cancéreuses. Ces observations nous ont conduits à étudier l’implication d’ANO1 dans la réparation de l’épithélium bronchique CF. Nous avons dans un premier temps confirmé le retard de réparation épithéliale bronchique CF. Nous avons ensuite mis en évidence une diminution de la conductance Cl- d’ANO1 dans les cellules CF que nous avons reliée à une diminution de son expression. Enfin, nous avons montré que l’inhibition et la surexpression d’ANO1 induisent respectivement une diminution et une augmentation de la réparation épithéliale bronchique. L’ensemble de ces résultats suggère que la dérégulation d’ANO1 participe à la réparation anormale de l’épithélium des voies aériennes CF et d’autre part, que l’utilisation d’activateurs spécifiques d’ANO1 pourrait permettre d’améliorer la réparation du tissu pulmonaire chez les patients atteints de mucoviscidose
Cystic fibrosis (CF) airway epithelium is constantly subjected to injury events due to chronic infection and inflammation. CF airway epithelium repair is abnormal and induces a tissue remodeling which contributes to the lung function decline of CF patients. To offset the CFTR chloride (Cl-) channel deficiency in CF, it has been proposed to activate an alternative route for Cl- secretion. In 2008, ANO1 (anoctamin 1) protein has been identified as responsible of Ca2+-activated Cl- conductance (CaCC). ANO1 has not been characterized in CF airways but recent evidence indicates a role for ANO1 in proliferation and migration of tumor cells. Thus, our main objectives were to study ANO1 in non-CF and CF airway and to assess ANO1 involvement in airway epithelial repair We first showed that cell proliferation and migration during repair are delayed in CF compared to non-CF bronchial epithelial cells. We then established that ANO1 Cl- channel activity was significantly decreased in CF compared to non-CF bronchial epithelial cells. To explain this decrease in CF cells, we compared ANO1 expression in non-CF and CF bronchial epithelial cell lines, primary cells, airways of wild-type and F508del mice and lung explants from non-CF and CF patients. In all these models, ANO1 expression was markedly lower in CF compared to non-CF. Finally, we established that ANO1 inhibition or overexpression were associated respectively with decreases and increases in cell proliferation and migration. Taken together, our results suggest that ANO1 dysregulation contributes to abnormal CF bronchial epithelial repair and secondly, that ANO1 correction may improve lung tissue repair in cystic fibrosis patients

Les voies aériennes transportent des sels et de l’eau pour hydrater le liquide de surface les recouvrant. Le rôle primordial du canal CFTR dans ces transports a été souligné par la découverte des mutations du gène CFTR associées à la mucoviscidose. La stimulation de canaux CL-alternatifs au CFTR, comme les CACC, est proposée dans la lutte contre cette pathologie. Mon travail de thèse a pour objectif l’étude des mécanismes de régulation de ces voies de sécrétion. Cette étude, utilisant différents modèles cellulaires de l’épithélium bronchique humain, montre le rôle clé des canaux K+SK4 dans l’établissement de la force électromotrice indispensable au processus de sécrétion. La localisation préférentielle de ces canaux à la membrane apicale des cellules caliciformes, sécrétrices de mucines, suggère une fonction spécifique de ces canaux au sein de cette population cellulaire. Le transport de NACL de l’épithélium des voies aériennes est sous le contrôle de nombreux facteurs, incluant les neurotransmetteurs et les nucléotides extracellulaires. Cette étude montre, pour la première fois, la stimulation de la sécrétion des ions CL- d’un modèle cellulaire de l’épithélium bronchique humain par les neuropeptides de la famille de l’arginine vasopressine. Les récepteurs V1 et V2 sont impliqués dans cette réponse et les effecteurs stimulés sont les canaux CFTR et SK4. La stimulation de l’activité de transporteurs basolatéraux est également supposée. Le travail souligne également l’importance du récepteur purinergique P2Y6, dont le ligand endogène est l’UDP, dans la stimulation de la sécrétion anionique de nos modèles d’étude
The airway epithelium secretes salt and fluid to maintain the optimal of the airway surface liquid. The CFTR CL-channel role in these transports is crucial as underlined by the discovery of CFTR gene mutations, which are responsible for the cystic fibrosis disease. A therapeutic approach would be to stimulate the activity of alternatives CL-channels to overcome the loss of functional CFTR. The aim of this study was to clarify the mechanisms underlying the regulation of these secretion pathways. This work shows the key role of SK4 channels in modulating airway epithelium CL-secretion. Their opening at the basolateral membrane of epithelial cells creates the driving force for CL-transport. In addition, their preferential location at the apical site of the goblet cells, which secrete mucins, suggest a specific role of these channels in this cellular population subtype. NACL transport of airways is under control of various factors such as neurotransmitters and extracellular nucleotides. This study is the first to report the stimulation of CL-seretion of a human bronchial epithelial cell line by neuropeptides belonging the arginin vasopressin family. The induced response is mediated by V1 and V2 receptors to vasopressin and the stimulated effectors are CFTR and SK4 channels. The stimulation of basolateral transporter activity us also supposed. This work also underlines the importance of purinergic P2Y6 receptors in the stimulation of anion secretion of the cellular models used in this study

La protéine FADD (Fas associated death domain) est l’adaptateur clé de la voie de signalisation apoptotique dépendante des récepteurs de mort de la famille du TNF (tumor necrosis factor). Au cours des dix dernières années, il est apparu évident qu’au-delà de son rôle majeur dans la mort cellulaire, FADD est impliqué dans d’autres processus biologiques comme le développement embryonnaire, la réponse immunitaire innée ou encore la progression du cycle cellulaire. De même, il est devenu clair que la localisation subcellulaire de FADD est déterminante pour sa fonction. Identifier les voies de régulation de l’expression de la protéine est donc d’une importance capitale. En 2008, notre équipe a mis en évidence, dans un modèle murin de la thyroϊde, un nouveau mécanisme de régulation de l’expression de la protéine via la sécrétion. En parallèle, le laboratoire a rapporté que la présence de FADD dans le sérum de patients cancéreux était corrélée à l’agressivité des tumeurs et l’inflammation. (Tourneur et al, 2012). L’objectif de ce travail de thèse était de comprendre le mécanisme par lequel FADD était sécrété, et de déterminer, le cas échéant, les modalités de sa régulation. Un troisième objectif est apparu au cours de la thèse : identifier de nouveaux modes de régulation de l’expression de FADD. Au moyen d’une lignée modèle humaine, nous avons montré que l’expression de la protéine humaine pouvait être régulée via une voie non-conventionnelle de sécrétion, tout comme dans le modèle murin. En parallèle de la caractérisation de cette sécrétion, nous avons montré que celle-ci pouvait être régulée par la kinase anti-apoptotique CK2 (casein kinase 2). Enfin, nous montrons que la CK2 régule la localisation nucléaire de FADD via une phosphorylation dépendante de la sous-unité régulatrice de la kinase et que la CK2 pourrait interagir directement avec FADD. Ces résultats constituent la première démonstration de la régulation de FADD par sécrétion par des cellules humaines et les premiers à rapporter un nouveau mode de régulation de la localisation subcellulaire de FADD par la CK2. Les conséquences de ces résultats en regard des fonctions connus de FADD sont discutées
The FADD protein (Fas associated death domain) is the key adaptor molecule of the apoptotic signaling pathway triggered by death receptors of the TNF (Tumor necrosis factor) superfamily. During the last decade, it became obvious that, in addition to its major role in cell death, the protein was also involved in other biological processes like the embryonic development, the immune response or even cell cycle progression. Evidence also showed that the protein sub-cellular localization was a key determinant to its functions. Therefore, the identification of underlying regulatory mechanisms dictating FADD expression was of significant importance. In 2008 our laboratory identified, in a thyroid murine model, a new mechanism controlling FADD expression, namely via secretion. We discovered that the loss of FADD expression from tumor cells, by secretion, could be correlated to cancer aggressiveness as well as inflammation (Tourneur 2012). The goal of this thesis work was to apprehend the mechanism by which FADD was secreted and determine, in that case, the modalities of this regulation. A third objective of this work was to identify new potential regulatory pathways of FADD expression. By means of a human cell line model, we showed that, similarly to the mouse model, the expression of human FADD could be regulated via unconventional secretion. In parallel to the characterization of the secretory process itself, we demonstrated that secretion could be negatively regulated by the anti-apoptotic kinase CK2 (casein kinase 2). Finally, we showed that CK2 could regulate FADD nuclear localization via a regulatory sub-unit-dependent phosphorylation and that FADD and CK2 could directly interact. These results are the first to demonstrate that human FADD expression could be regulated via secretion and that FADD sub-cellular localization could be modulated by CK2. The consequences of such regulation with regards to known FADD functions are discussed

Dans le but d'étudier les voies de la sécrétion on a exprimé l'amylase d'orge dans les cellules neuroendocrines AtT20. Nos recherches démontrent que le site consensus de glycosylation présent dans la structure primaire de l'amylase d'orge est fonctionnel et qu'il est facilement reconnu par la machinerie de glycosylation. Ceci est la première fois que la glycosylation de l'amylase d'orge est produite. Cette glycosylation est du type riche en mannose et l'enzyme glycosylée maintient son activité catalytique envers son substrat l'amidon. Efficacement exprimée, la glycoprotéine est sécrétée dans le milieu extracellulaire. Cependant, cette sécrétion ne répond pas à la stimulation par sécrétagogue ce qui prouve qu'elle est exclue de la voie de sécrétion régulée (grains de sécrétion matures). Curieusement, on observe une nette différence dans la proportion de la glycoforme de la protéine sécrétée et celle retenue dans la cellule. Par des études dynamiques (marquage radioactif) on a pu établir que la proportion de la glycoforme retrouvée dans la sécrétion ne dépasse pas 50 % de la protéine totale tandis qu'on retrouve une moyenne de 70 % de la glycoforme dans la cellule. On a aussi observé ce comportement de l'amylase dans les cellules pancréatiques AR42J et les cellules PC12 de la glande surrénale. Par pontage chimique on a confirmé l'association d'amylase d'orge avec une autre protéine et identifié cette dernière comme étant la calréticuline. Selon nos résultats, dans les cellules AtT20, la calréticuline normalement résidente du réticulum plasmique, se lie spécifiquement à l'amylase glycosylée et l'accompagne du réticulum endoplasmique jusqu'à un compartiment acide localisé dans une région distale du post trans -Golgi. De plus, en neutralisant le pH intracellulaire, on a démontré un changement de la distribution et de la proportion d'amylase glycosylée dans la cellule, indiquant que la dissociation du complexe calréticuline-amylase pourrait se faire suite à un changement de pH dans ce compartiment. Enfin, nos recherches mettent en évidence un changement draconien de la distribution de la calréticuline cellulaire suite à la transfection de l'amylase. Les résultats apportés démontrent que le trafic de l'amylase d'orge dans les cellules neuroendocrines pourrait se faire via la calréticuline par un mécanisme actif et hautement spécifique. Dans un deuxième volet, notre étude avait pour but d'étudier le rôle du domaine C des alpha-amylases. Ce domaine structural présent dans toutes les amylases et faiblement associé au baril catalytique n'a pas un rôle défini. Nous avons construit des mutants du domaine C manquant un ou plusieurs feuillets [beta]. Transfectées dans les cellules, ces protéines mutantes ne sont pas détectées ni dans le milieu de sécrétion ni dans la cellule. De plus, nous n'étions pas en mesure de détecter leur activité catalytique. Par contre, dans le système d'expression in vitro les mutant sont efficacement traduits et transloqués dans les microsomes. Malgré ceci, les protéines demeurent catalytiquement inactives comme observé in vivo . Selon nos résultats, le seul mutant détectable dans les cellules conserve trois des quatre feuillets [beta] faisant face au domaine A. Nos résultats démontrent qu'un domaine C entier d'une amylase de source différente pourrait remédier à l'expression de la protéine dans les cellules sans toutefois reconstituer l'activité enzymatique. Ceci nous indique qu'un domaine C intact est nécessaire pour le bon repliement de la protéine et aussi pour une activité enzymatique valide.

Les cellules de mammifères sont caractérisées par la coexistence de plusieurs voies de transport, dont le transport antérograde et rétrograde. L'appareil de Golgi joue un rôle central dans le traitement et le tri des protéines dans le trafic bidirectionnel. Le système Retention Using Selective Hooks (RUSH) permet de synchroniser le transport des protéines depuis le RE et d'analyser systématiquement les voies sécrétoires. Grâce à l'interaction entre la streptavidine (Str) et un peptide de liaison à la streptavidine (Streptatividin Bioding Peptide, SBP), la protéine rapporteur peut être retenue dans le RE et ensuite libérée par l'ajout de biotine. Cependant, la biotine a une grande affinité pour la streptavidine, ce qui nuit à la réversibilité du test RUSH. Grâce aux ligands artificiels de la streptavidine (ALiS), le transport rétrograde du Golgi vers le RE peut être analysé à l'aide de l’outil RUSH après lab-vage de ALiS.Le test RUSH réversible a d'abord été mis en place pour étudier deux mécanismes de transport rétrograde depuis Golgi vers le RE, notamment la voie médiée par le motif KDEL et la voie de recyclage des enzymes de glycosylation. Str-KDEL ou Ii-Str ont été utilisées comme protéines d’ancrage et les enzymes golgiennes ManII* (Mannosidase II)-SBP-EGFP ou ST* (Sialyltransférase)-SBP-GFP ont été utilisées comme rapporteurs RUSH. Notre analyse cinétique a montré que le transport de l’appareil de Golgi vers le RE de ManII* et de ST* est plus lent par la voie de recyclage des enzymes de glycosylation que par la voie induite par le motif KDEL. Pour caractériser le rôle des facteurs de régulation dans le transport rétrograde médié par le motif KDEL, nous avons réalisé des expériences d'ARNi ciblant COG3 et Rab6. Nos données montrent que la déplétion de COG3 entraîne un retard dans le transport rétrograde de ManII* et ST* et que la déplétion de Rab6 entraîne une altération du trafic de ST*, ce qui est cohérent avec les études précédentes. Nos données confirment l’existence et la différence de cinétique du transport rétrograde Golgi-RE dépendant du motif KDEL et le recyclage des enzymes golgiennes de glycosylation.Enfin, nous avons synchronisé le transport des enzymes golgiennes de glycosylation endogènes en utilisant des approches de knock-in CRISPR-Cas9 ou CRISPaint et l’outil RUSH. La distribution subcellulaire de ManIIEN-SBP-mNeonGreen, GalNAc-T1EN-SBP-mNeonGreen et B4GalT1EN-SBP-EGFP a été détectée dans le Golgi, et nous avons pu synchroniser leur transport bidirectionnel grâce à l'expression de Str-KDEL
Mammalian cells are characterized by the co-existence of multiple pathways, including anterograde and retrograde transport. The Golgi apparatus has a central role in processing and sorting cargos in the bi-directional trafficking. The Retention Using Selective Hooks (RUSH) system allows to synchronize the transport of cargos from the ER to downstream compartments and to systematically analyze the secretory routes. Owing to the interaction of streptavidin (Str) and streptavidin-binding peptide (SBP), the reporter protein can be retained in the ER and then released by the addition of biotin. However, biotin has a high affinity to streptavidin, impairing reversibility of the RUSH assay. With the Artificial Ligands of Streptavidin (ALiS), Golgi-to-ER retrograde transport can be monitored using RUSH upon their washout.The reversible RUSH assay was firstly set up to study two mechanisms of Golgi-to-ER retrograde transport, including the KDEL-mediated retrieval pathway and the glycosylation enzyme recycling pathway. Core streptavidin fused with the ER-retention signal (Str-KDEL), or with the invariant chain (Ii-Str) were used as hooks. Golgi-resident enzymes, ManII* (Mannosidase II)-SBP-EGFP or ST* (Sialyltransferase)-SBP-GFP served as Golgi-targeted RUSH reporters. Our kinetic analysis showed that the Golgi-to-ER transport of ManII* and ST* are both slower through the glycosylation enzyme recycling pathway than the KDEL-meditated retrieval pathway. To characterize the role of putative regulatory factors in KDEL-mediated retrograde transport, we performed RNAi experiments targeting to COG3 and Rab6. Our data showed that knockdown of COG3 resulted in delayed retrograde transport of ManII* and ST*, and the depletion of Rab6 led to impaired trafficking of ST*, consistent with the previous studies. Our data indicated that there are two distinct pathways regulating the retrograde transport of Golgi cargos, including KDEL-mediated ER retrieval and ER recycling of Golgi glycosylation enzymes.Lastly, we have generated endogenous tagged Golgi glycosylation enzymes using CRISPR-Cas9 or CRISPaint knock-in approaches and applied the reversible RUSH assays in the selected clones. The subcellular distribution of endogenous ManIIEN-SBP-mNeonGreen, GalNAc-T1EN-SBP-mNeonGreen and B4GalT1EN-SBP-EGFP were detected in Golgi, and we were able to synchronize the bidirectional transport through the expression of Str-KDEL

Legionella pneumophila est une bactérie aquatique qui prolifère en se répliquant à l’intérieur de cellules amibiennes. Elle peut persister dans ces environnements en vivant en communauté sous forme de biofilms. L’inhalation par l’Homme d’eau contaminée, vaporisée par les réseaux d’eau chaude ou les tours aéro‐réfrigérantes, peut mener à l’infection des macrophages pulmonaires qui se traduit par une grave pneumonie appelée légionellose. Le di‐GMP cyclique (diGMPc) est impliqué, chez diverses espèces bactériennes, dans la transition entre les modes de vie mobiles et sessiles, et chez certains pathogènes, dans la régulation de la virulence. Mon travail de thèse vise à démontrer l’implication des voies de signalisation à diGMPc dans le contrôle de la virulence et de la formation de biofilms par L. pneumophila. Cette implication a été étudiée grâce à l’inactivation systématique de chacun des gènes codant les protéines du métabolisme du diGMPc chez la souche L. pneumophila Lens. Notre étude a révélé que trois de ces protéines, Lpl0780, Lpl0922 et Lpl1118, sont spécifiquement requises pour le contrôle de la virulence et, plus particulièrement, pour la survie précoce lors de l’infection de cellules‐hôtes via l’orchestration de la sécrétion de facteurs de virulence dans la cellule‐hôte. Lpl1118 participerait également à la biogénèse de la vacuole de réplication. Cinq autres de ces protéines sont impliquées dans la régulation de la formation et de l’architecture des biofilms. L’une d’elles est, plus particulièrement, requise pour la formation de biofilms en présence d’oxyde nitrique. Ces résultats contribuent à une meilleure compréhension de l’organisation complexe et spécifique des voies de signalisation à diGMPc chez L. pneumophila et pourraient permettre d’envisager une lutte plus efficace contre ce pathogène
Legionella pneumophila is a bacterium that proliferates in fresh water environments through the replication within amoebas. These bacteria can persist in these environments through biofilm formation. The inhalation of aerosolized contaminated water through hot water systems or cooling towers can induce the infection of human lungs, leading to a severe pneumonia called legionellosis. Cyclic di‐GMP (c‐di‐GMP) in involved, in various bacterial species, in the motility‐to‐sessility transition, and in some pathogens, in virulence control. My work aims to demonstrate the involvement of signaling pathways that use c‐di‐GMP in virulence control and biofilm formation of L. pneumophila. This involvement was investigated by systematically inactivating each gene encoding a c‐di‐GMP‐metabolizing enzyme in L. pneumophila Lens strain. Our work revealed that 3 of these proteins, Lpl0780, Lpl0922 and Lpl1118 are specifically involved in virulence control and, particularly, in the early survival during host cell infection through the orchestration of virulence factors secretion within host cell. Lpl1118 is particularly required for replicative vacuole biogenesis. Five other proteins, participate in the formation and architecture of biofilms. One of them is more specifically involved in biofilm formation in the presence of nitric oxide. These results help to better understand the complexity and the specificity of c‐di‐GMP signaling pathways in L. pneumophila and should allow the exploration of more effective ways to fight this pathogen

L’objectif de ce travail est de faire le point sur les manifestations buccales de la sclérose tubéreuse de Bourneville (STB) à travers le cas d’un jeune patient. Un jeune homme de 15 ans était adressée pour la mise en place de minivis orthodontique afin de fermer des espaces d’agénésies de 35 et 45. L’interrogatoire retrouvait une STB dont les manifestations épileptiques étaient traitées par de la lamotrigine 75mg/j et de la carbamazépine LP 200mg/j. L’examen clinique exo-buccal retrouvait des macules hypochromiques sur le membre inférieur droit, des angiofibromes faciaux et une malformation vasculaire jugale gauche. L’examen endo-buccal retrouvait de multiples lésions buccales sur les papilles interdentaires pouvant évoquer des fibromes ou des hamartomes. Une biopsie était réalisée et retrouvait un revêtement malpighien, discrètement hyperplasique et sans atypie cellulaire. Les faisceaux collagènes du conjonctif étaient mêlés à de nombreux fibroblastes aux noyaux réguliers, sans mitose visible. Les cellules inflammatoires, essentiellement mononuclées, étaient dispersées mais tendaient à se regrouper autour de vaisseaux nombreux et hyperplasiques. L’examen concluait à un fibrome. Aucun traitement buccal n’était proposé devant l’absence de symptôme et de demande esthétique. La STB est une maladie génétique autosomique dominante avec une incidence de 1/10 000. Elle est liée à une mutation du gène TSC1 sur le chromosome 9 ou du gène TSC2 sur le chromosome 16 qui perturbe la sécrétion d’une protéine régulant la voie mTOR. C’est une maladie multisystème avec une expression clinique variable. Les principaux symptômes sont l’épilepsie, le retard mental et la présence d’adénomes sébacés, mais la maladie est associée à un polymorphisme clinique rendant le diagnostic difficile. La conférence de consensus de 2012 a ainsi défini des critères diagnostiques majeurs (lésions cutanées, oculaires, cérébrales, cardiaques, pulmonaires, rénales,..) et mineurs dont deux sont bucco-dentaires. Le diagnostic est retenu devant deux critères majeurs ou un critères majeur et deux critères mineurs. Les signes oraux sont la présence de trois ou plus puits d’émail et deux ou plus fibromes gingivaux. Les fibromes gingivaux atteindraient 50 à 70% des patients. La région antérieure maxillaire semble la plus touchée. L’exérèse est indiquée en cas de gêne esthétique ou de saignements associés. Actuellement, les inhibiteurs de mTOR représentent une option thérapeutique proposée dans la prise en charge des patients atteints de STB. La STB est une pathologie rare. La présence de lésions buccales fait partie des critères diagnostiques.