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Dissertationen zum Thema „Virus – Reproduction (biologie)“
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Masante, Cyril. „Les minigénomes : un nouveau modèle de la réplication du VHC : mise en place et applications“. Bordeaux 2, 2007. http://www.theses.fr/2007BOR21455.
Der volle Inhalt der QuelleAnnotation:
Le virus de l'hépatite C (VHC) affecte 170 millions de personnes dans le monde. Quatre-vingt pour cent des individus atteints vont développer une hépatite chronique voire une cirrhose puis un cancer du foie pour certains d'entre eux. Il n'existe actuellement qu'un seul traitement contre le virus, mais il n'est efficace que pour la moitié des patients. Notre projet consiste à mieux comprendre les mécanismes de réplication du virus dans le but de développer de nouveaux inhibiteurs. Au cours de ma thèse j'ai participé au développement d'un nouveau modèle de la réplication du VHC. Ce modèle cellulaire permet une étude dissociée des deux principales activités virales, ce qui est actuellement impossible avec les autres modèles utilisés. Pour cela, les protéines virales nécessaires à la réplication sont constamment produites dans des cellules. Elles s'associent en un complexe qui va répliquer une molécule d'acide nucléique contenant un gène rapporteur encadré par les séquences de reconnaissance virale. Cette molécule perpétuellement dupliquée à chaque cycle, révèle un mécanisme de réplication proche de celui utilisé par le virus. Ce modèle de la réplication du VHC a déjà permis de mettre en évidence une diminution de l'activité réplicative chez les virus de génotype 3. Sept variations nucléotidiques situées dans une région du génome viral impliquée dans la traduction et la réplication du virus en sont responsables. Cette spécificité de séquence pourrait ainsi expliquer la meilleure réponse au traitement par l'interféron observée chez les patients infectés par les virus de génotype 3. D'autre part, nous avons montré que les molécules répliquées dans ce système sont dépourvues d'une structure réputée indispensable à la synthèse du génome viral. Cette structure appelée 5BSL3. 2 est néanmoins indispensable à la prolifération du virus. La deuxième partie de mon projet de thèse a donc consisté à caractériser la 5BSL3. 2 et plus particulièrement à analyser son rôle dans la traduction des protéines viralesThe hepatitis C virus (HCV) affects around 170 million people worldwide and 3-4 million persons are infected each year. This infection will lead to death in 5-7 % of patients infected with HCV as a consequence of liver disease. The virus was first identified by Choo et al. (1989) but until recently development of new treatment for this infection has been hampered by the lack of an efficient cellular system. We established a new model to study HCV replication. In this system, the genes coding for the HCV non structural proteins are introduced in Huh7 cells (human hepatoma cell line) in order to constitutively express the HCV complex. Its activity is analysed by transfection of non-coding RNA (RNA minigenome) in the modified Huh7 cells. Those RNAs include EGFP and hygromycine genes surrounded by 5'UTR HCV non coding sequences. Those regions are included in order to be recognised by the HCV complex. The actvity of the HCV replication complex was determined by flow cytometry. Only cells able to support RNA minigenome replication could express the EGFP gene. RNA minigenome replication was detected in cells and could be maintained under hygromycine selection. I used this model to analyze the differences in replication activities between HCV genotype 1 and 3. We have identified 7 non contiguous nucleotides specific of genotype 3 in the 5'UTR, and those nucleotides are only present in this genotype, I showed these changes could be responsible for the reduced efficiency of RNA replication in the genotype 3. I also used this model to study the role of a cis-acting replication element, previously shown to be critical for the virus' replication. We have shown that this sequence is not required for the replication of our minigenome. I designed experiments to understand and explain the differences observed
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Harrus, Déborah. „Compréhension des déterminants moléculaires de l'activation de la réplication du virus de l'hépatite C par corrélation d'informations biochimiques et structurales sur sa polymérase NS5B“. Paris 11, 2010. http://www.theses.fr/2010PA114861.
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Le virus de l'hépatite C (VHC) est un virus variable classifié en génotypes, qui diffèrent par leur distribution géographique, la sévérité des dommages causés au foie, et leur réponse aux traitements. L'ARN polymérase dépendante de l'ARN NS5B est une cible de choix pour les inhibiteurs du VHC. Les structures cristallographiques décrivent son organisation en 3 domaines appelés "doigts", "paume" et "pouce", le site catalytique se situant à la jonction entre ces trois domaines. Un segment C-Terminal de 40 acides aminés appelé "connecteur" part du pouce et relie les 530 résidus N-terminaux à une ancre transmembranaire de 21 résidus. La position du connecteur, replié au sein de la crevasse catalytique, est critique pour l'initiation de la synthèse d'ARN mais inhibitrice pour le processus d'élongation puisqu'il bloque l'enzyme en forme "pouce fermé". L'objectif de ce travail a été de réunir des informations biochimiques et structurales sur NS5B afin de mieux comprendre les mécanismes de la synthèse d'ARN de novo par le VHC, et plus spécifiquement les changements de conformation qui ont lieu lors de la transition entre les étapes d'initiation de d'élongation. Nous proposons un schéma explicatif de la séquence d'événements qui permettent la synthèse d'ARN. Celle-ci débute par la reconnaissance et la fixation de NS5B sur le génome viral, suivi par la fixation des deux premiers nucléotides incorporés, puis un repositionnement du dinucléotide néo-synthétisé grâce à des changements de conformation de NS5B pour permettre la poursuite de la synthèse d'ARN. La description de ce mécanisme constitue une avancée importante dans la compréhension du fonctionnement de VHC-NS5BHepatitis C virus (HCV) is a highly varaible virus, classified in genotypes that differ in their geographical distribution, the seriousness of the liver disease they cause, and response et the available treatment. RNA-dependant RNA polymerase NS5B is a choice target for specific inhibitors of HCV. Its organization can be described as a catalytic domain comprising the 530 N-terminal residues connected by a 40-residue linker to a C-terminal 21-residue transmembrane anchor. The linker occludes the catalytic cleft in the crystal structures of NS5B, a conformation likely conducive to initiation of RNA synthesis but clearly inhibitory to elongation, both because of direct steric hindrance and because it locks NS5B in a closed conformation. The main objective of our research was the understanding of the molecular mechanisms of de novo RNA synthesis by HCV, and more specially the conformation changes that occurs during the transition between the initiation and the elongation steps. We proposed a diagram explaining the sequence of events alllowing RNA synthesis. It begins with NS5B's recognition of the viral genome, followed by the fixation of the first two incorporated nucleotides, and so this neo-synthesized dinucleotide repositioning thanks to NS5B's conformational changes to allow the further RNA elongation. This mechanism description highly improves our understanding of HCV-NS5B
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Jakubiec, Anna. „Etude du complexe de réplication du virus de la mosaïque jaune du navet (TYMV) : assemblage et régulation“. Paris 7, 2006. http://www.theses.fr/2006PA077111.
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Le virus de la mosaïque jaune du navet (ou TYMV) possède un génome constitué d'ARN de polarité positive. Il code trois protéines, dont une - la 206K - est essentielle à la replication virale. Des études in vitro et in vivo ont permis de montrer que cette protéine subit un clivage générant les produits 140K, contenant les domaines méthyltransférase (MT), protéase (PRO) et hélicase (HEL), et 66K, qui correspond à l'ARN polymérase ARN-dépendante (POL). Au cours de ma thèse j'ai étudié les interactions entre ces protéines et le déterminisme de leur adressage subcellulaire dans le but de mieux comprendre le processus d'assemblage des complexes de replication. Ces travaux ont abouti à un modèle selon lequel la 66K est recrutée dans les complexes de replication par le biais de son interaction avec le domaine PRO de la 140K, portant les déterminants d'adressage aux membranes cibles. A l'aide d'antiséra spécifiques de différents domaines du précurseur 206K nous avons pu montrer que la 140K subit in vivo au moins un clivage supplémentaire, qui donne lieu à la formation deux produits : 92K, portant les domaines MT et PRO, et 42K qui correspond au domaine HEL. Des résultats préliminaires indiquent que ce clivage n'est pas essentiel à la replication, mais qu'il contribue à son efficacité. Finalement, nous avons pu montrer que la polymérase 66K est phosphorylée in vivo et les sites de phosphorylation ont pu être caractérisés. La phosphorylation aurait au moins deux fonctions au cours du cycle viral : elle serait impliquée dans le contrôle de la stabilité de la polymérase et dans la régulation de l'équilibre entre les différents types d'ARN viraux synthétisés au cours du cycle viralTurnip yellow mosaic virus (TYMV) has a positive-stranded RNA genome encoding three proteins, one of which - the 206K -is essential for viral replication. In vitro and in vivo studies have revealed that the 206K is cleaved into two products: the 140K containing domains indicative of methyltransferase (MT), proteinase (PRO) and helicase (HEL) activities and the 66K encompassing RNA-dependent RNA polymerase. During my PhD I studied interactions between these proteins and determinants of their subcellular localisation in order to gain insight into molecular mechanisms underlying the assembly of viral replication complexes. This work supports a model wherein the 66K is recruited to the replication sites through an interaction with the PRO domain of the 140K, which is the membrane tether for viral replication complexes. Using antisera directed against different domains of the 206K precursor, we showed that the 140K was further processed in vivo into two products: 92K, containing the MT and PRO domains and 42K encompassing the HEL domain. Preliminary results indicate that the cleavage is not essential, but it is required for efficient viral replication. Eventually, we showed that the 66K polymerase was phosphorylated in vivo and several phosphorylated residues were identified by mass spectrometry analysis. Site directed mutagenesis experiments suggest two distinct functions for the 66K phosphorylation. We propose that phosphorylation in the N-terminal PEST sequence controls the metabolic stability of the 66K polymerase, while phosphorylation of its catalytic domain is involved in the regulation of viral RNA synthesis in the course of viral infection
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Germon, Stéphanie. „Utilisation du modèle de l'hépatite B du canard pour la détermination de l'activité antivirale du L-FMAU et l'étude de la biologie de mutants de résistance à la lamivudine“. Lyon 1, 1999. http://www.theses.fr/1999LYO1T274.
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Langon, Tania. „Clonage, séquençage et caractérisation des propriétés biologiques d'une souche très pathogène du virus de l'hépatite delta“. Lyon 1, 1997. http://www.theses.fr/1997LYO1T288.
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Lavedrine, Aude. „Caractérisation des protéines cellulaires sélectivement ciblées vers l’autophagie lors de l'infection par le virus de la rougeole“. Electronic Thesis or Diss., Lyon 1, 2024. http://www.theses.fr/2024LYO10227.
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L’autophagie est un processus du catabolisme lysosomal hautement conservé dans les cellules eucaryotes, permettant la dégradation d’un large spectre de composants cytosoliques. Ce mécanisme est essentiel au maintien de l’homéostasie cellulaire, notamment lors d’invasions par des pathogènes intracellulaires. Dans ce contexte, l’autophagie, désignée sous le terme de xénophagie, constitue un outil clé pour défendre la cellule et éliminer l’envahisseur. Cependant, de nombreux agents infectieux ont développé des stratégies pour échapper à la dégradation autophagique, voire pour détourner ce processus à leur avantage. Notre équipe a identifié que le virus de la rougeole induit un processus autophagique complet qui contribue à favoriser la réplication virale. Afin de comprendre comment le virus de la rougeole manipule l’autophagie, l’objectif de ce travail de thèse a été d’identifier la nature des protéines cellulaires dégradées par ce processus lors de l’infection. Dans une première étude, nous avons montré que deux récepteurs autophagiques, p62/SQSTM1 et TAX1BP1/T6BP, sont dégradés par l’autophagie viro-induite. La dégradation de ces deux protéines impacte le cycle intracellulaire de bactéries co-infectants les cellules, démontrant ainsi l’influence majeure de la modulation de l’autophagie par un agent infectieux sur la biologie de la cellule. Afin d’aller plus loin, nous avons ensuite utilisé une approche à large échelle non biaisée pour identifier l’ensemble du protéome cellulaire ciblé dans les autophagosomes lors de l’infection par le virus de la rougeole. Au-delà des 1031 protéines identifiées dans les autophagosomes des cellules infectées, l’étude protéomique et son analyse par Gene Ontology ont permis de mettre en lumière un facteur pro-viral, ILF3, qui semble inhiber le processus autophagique lors de l’infection par le virus de la rougeole. De nombreuses autres voies cellulaires ciblées vers l’autophagie lors de l’infection ont également été identifiées. Ce travail ouvre la voie à une meilleure compréhension de la relation complexe entre l’autophagie et le virus de la rougeole, et, de manière plus générale, entre l’autophagie et les micro-organismes infectieuxAutophagy is a highly conserved lysosomal catabolic process in eukaryotic cells that allows the degradation of a wide range of cytosolic components. This mechanism is essential for maintaining cellular homeostasis, particularly during invasions by intracellular pathogens. In this context, autophagy, referred to as xenophagy, serves as a key tool to defend the cell and eliminate the invader. However, many infectious agents have developed strategies to escape autophagic degradation or even hijack this process to their advantage. Our team has identified that the measles virus induces a complete autophagic process that contributes to enhancing viral replication. To understand how the measles virus manipulates autophagy, the objective of this thesis was to identify the nature of the cellular proteins degraded by this process during infection. In a first study, we demonstrated that two autophagy receptors, p62/SQSTM1 and TAX1BP1/T6BP, are degraded by virus-induced autophagy. The degradation of these two proteins impacts the intracellular cycle of bacteria co-infecting the cells, thus demonstrating the major influence of autophagy modulation by an infectious agent on cellular biology. To delve deeper, we then used a large-scale unbiased approach to identify the entire cellular proteome targeted within autophagosomes during measles virus infection. Beyond the 1031 proteins identified in the autophagosomes of infected cells, proteomic analysis and Gene Ontology highlighted a pro-viral factor, ILF3, which appears to inhibit the autophagic process during measles virus infection. Many other cellular pathways targeted toward autophagy during infection were also identified. This work paves the way for a better understanding of the complex interplay between autophagy and the measles virus, and more broadly, between autophagy and infectious microorganisms
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Mateo, Mathieu. „Etude du rôle de la protéine VP24 dans la réplication , la pathogénicité et l'adaptation du virus Ebola“. Lyon, Ecole normale supérieure, 2010. http://www.theses.fr/2010ENSL0611.
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Ces travaux de thèses mettent en évidence le rôle critique de la protéine VP24 du virus Ebola dans le développement des fièvres hémorragiques mortelles associées à l'infection par ce virus. En effet, nous avons démontré que l'acquisition de la pathogénicité du virus Ebola dans le modèle cobaye est associée à des changements de la protéine VP24. Nous avons identifié des domaines protéiques de VP24 qui permettent au virus de contrôler la réponse immunitaire innée et nous avons démontré que les mutations adaptatives n'affectent pas la fonction IFN-antagoniste de la protéine VP24. Les changements adaptatifs de la protéine VP24 ont pour effet de réduire son interaction avec la protéine cellulaire KPNA1 et d'améliorer son interaction avec les composants viraux afin d'assurer la formation de particules virales infectieuses dans les cellules primo-infectées. Nous avons par ailleurs identifié une nouvelle fonction de la protéine VP24 dans le contrôle de la réponse au stress oxydatifThis PhD work highlight the critical role of the Ebola virus VP24 protein in the development of fatal hemorrhagic fevers associated with Ebola virus infections. Indeed, we have demonstrated that the acquisition of Ebola virus pathogenicity in the guinea-pig model is associated with modifications in the VP24 protein. We have identified two domains in VP24 which allow the virus to control the innate immune system and we have demonstrated that the adaptative mutations do not affect the IFN-antagonist function of VP24. Adaptative modifications in VP24 lead to a reduced interaction with the cellular KPNA1 protein and to a better interaction with viral components, allowing the proper assembly of infectious virus particles in the primary intected cells. We also identified a new function for VP24 in the control of the oxidative stress response
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Nicot, Christophe. „Clonage d'un provirus infectieux du HTLV-1 : étude de la replication virale in vitro dans des types cellulaires de différentes origines“. Bordeaux 2, 1995. http://www.theses.fr/1995BOR28342.
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Reuse, Sophie. „Etude de la réactivation de l'expression des provirus HIV-1 latents par la prostratine en synergie avec des inhibiteurs de désacétylases: mécanismes moléculaires impliqués et potentiel thérapeutique“. Doctoral thesis, Universite Libre de Bruxelles, 2009. http://hdl.handle.net/2013/ULB-DIPOT:oai:dipot.ulb.ac.be:2013/210213.
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L’infection par HIV-1 représente un des problèmes de santé publique majeurs de notre société actuelle. Le traitement HAART (Highly Active AntiRetroviral Therapy) inhibe le cycle réplicatif viral mais ne permet pas l’éradication du HIV-1. La principale cause de cet échec thérapeutique est la persistance de réservoirs cellulaires infectés de manière latente par HIV-1, qui, lors de l’arrêt du traitement HAART, sont à l’origine d’un rebond de la charge plasmatique virale. Le défi actuel est donc de découvrir de nouvelles méthodes d’élimination des cellules réservoirs. Une des stratégies envisagées est de forcer l’expression virale dans les cellules infectées de manière latente afin d’entraîner leur destruction suite à leur détection par le système immunitaire ou suite aux effets cytopathiques viraux. Parallèlement, le traitement HAART serait maintenu afin de limiter la propagation des virions néo-synthétisés. Plusieurs éléments sont impliqués dans la répression transcriptionnelle associée à la latence post-intégrationnelle du virus HIV-1 :la nature du site d’intégration ;l’absence de facteurs cellulaires inductibles tels que NF-κB ;la structure chromatinienne du provirus et les modifications post-traductionnelles des histones ;l’absence de niveaux suffisants de la protéine trans-activatrice Tat. De plus, notre laboratoire a précédemment mis en évidence un lien entre deux de ces éléments, en démontrant, dans une lignée modèle de latence post-intégrationnelle, que la cytokine pro-inflammatoire TNFα, un activateur de la voie de signalisation NF-κB, permet une réactivation synergique de l’expression virale combinée à l’inhibiteur d’histone-désacétylases (HDACI) TSA. Cependant, l’utilisation thérapeutique du TNFα et de la TSA est inenvisageable en raison de leurs toxicités.\
Doctorat en Sciences
info:eu-repo/semantics/nonPublished
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Etienne, Loïc. „Assemblage et sécrétion du virus de l'hépatite C : identification de dix résidus de la protéïne de capside importants pour optimiser la production du virus in vitro“. Thesis, Tours, 2014. http://www.theses.fr/2014TOUR3309/document.
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La mise au point en 2005 d’un modèle de propagation sur lignée d’hépatocarcinome basé sur la souche hautement réplicative JFH-1 fut une formidable opportunité d’étudier les différentes étapes du cycle infectieux du VHC. Nous avons souhaité étudier les étapes de morphogenèse et de sécrétion du virus, des phases du cycle viral qui sont largement mal connues encore aujourd’hui, mais ou la protéine de capside joue probablement un rôle majeur. Des études comparatives des séquences de capsides de différentes souches du VHC nous ont permis de mettre en évidence 10 résidus spécifiques à la souche JFH-1 qui pourraient expliquer les déficits fonctionnels connus de cette protéine. En effet, le remplacement de ces 10 résidus par ceux plus communément retrouvés dans les souches de génotype 1 et 2 a permis une amélioration significative de l’assemblage et de la sécrétion des particules infectieuses produites. La mise au point de cette souche optimisée pour la production de virus pourrait par ailleurs permettre constituer un atout pour mieux comprendre la structure du virus par des techniques de microscopie électronique ; ce type d’étude n’ayant pas pu être véritablement menée jusqu’à présent, en raison des titres infectieux insuffisants obtenus avec la souche JFH-1 sauvageDevelopment and cloning in 2005 of the highly replicative strain JFH-1 was a great opportunity to study the different stages of the infectious cycle of HCV as this strain easily propagate in the hepatocellular carcinoma cell line. Until now, these lates phases of particles assembly remain poorly understood, although the core protein is thought to probably play a major role in initiation of these mechanisms. Comparative studies of the capsid sequences of different strains of hepatitis C have allowed us to identify 10 specific residues in the JFH-1 strain that could explain the functional deficits of this protein. Indeed, the replacement in JFH-1 strain of these 10 residues by those most commonly found in strains of genotype 1 and 2 showed improvement of the assembly and secretion of new infectious particles and new subcellular localization of core. In addition, replacement of these ten residues by most common amino acid found in patients show a great enhancement of in vitro virus production and secretion. As a perspective, development of this optimized virus could also represent a valuable model to better purify and determine viral structure, and true viral assembly site; HCV fields that remain till now largely unknown
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Ayrolles-Torro, Adeline. „Etude du mécanisme d’action des composés thiényl-pyrimidines et azines sur les prions et leur valorisation potentielle dans un test diagnostic des ESST“. Montpellier 2, 2009. http://www.theses.fr/2009MON20178.
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Les maladies à prions sont des affections neurodégénératives fatales, qui affectent aussi bien les hommes que les animaux. Aucun test de diagnostic précoce commercialisé, ni de traitement efficace n'existe. L'agent infectieux est composé principalement de la forme anormalement repliée, nommée PrPSc, de la protéine prion cellulaire, PrPC. Même si le cycle de réplication des prions n'est pas totalement connu, la majorité des stratégies thérapeutiques ciblent les formes monomériques PrPC, PrPSc, ainsi que les fibrilles amyloïdes. Des intermédiaires dimériques ou trimériques de PrPSc récemment décrits, seraient à l'origine d'un état préamyloïde instable. Nous proposons que des petites molécules pourraient interagir avec des intermédiaires préamyloïdes, afin de bloquer le cycle de réplication des prions. Dans ce but, nous avons utilisé une approche de criblage virtuel, suivie d'un criblage sur des cellules infectées par les prions. Une famille de composés thiényls pyrimidines et azines, capable de stabiliser des dimères de PrPSc a été identifiée. Les études in vivo indiquent que la pré-incubation des composés avec des extraits de cerveaux, réduit le titre infectieux, suggérant un potentiel thérapeutique. Le mécanisme d'action de ces molécules a été recherché et nous proposons que les composés interagissent avec les prions via un mécanisme d'agrégation. Les composés thiényls pyrimidines permettent de discriminer rapidement des homogénats infectés de ceux qui sont sains, par la présence des dimères de PrPSc en immunoblot et pourraient être valorisés dans le diagnostic des ESSTPrions diseases are fatal neurodegeneratives disorders, which affect both humans and animals. No early diagnosis test of prions as well as effective treatment exists. The infectious agent consists mainly of the abnormal form, named PrPSc of the cellular protein prion, PrPC. Even if the replication cycle of prions is not totally known, the majority of the therapeutic strategies target monomerics forms of PrPC, PrPSc as well as amyloid fibrils. Dimers or trimers of PrPSc were recently described and would be part of an unstable preamyloïde state. We hypothesize that the identification of small molecules interacting with those preamyloid intermediates would block the replication cycle of prions and thus would reduce their infectivity. For this purpose, we used an approach of virtual screening, followed by a cellular screening on prions infected-cells. We identified a family of thienyls pyrimidines and azines compounds, able of stabilizing dimers of PrPSc, and observable in denaturing conditions by immunoblot. In vivo studies indicate that the pre-incubation of compounds with infected brain homogenate, reduces the prion infectiosity of the inoculum, suggesting a potential therapeutic application. We also studied the mechanism of action of these molecules and we propose that these compounds could directly interact with prions via a mechanism of aggregation. We showed that thienyl pyrimidine compounds can discriminate the infected brain homogenates from healthy ones, by the presence of specific PrPSc dimers, suggesting a potential application for the development of a new diagnosis test for ESST
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Mavigner, Maud. „Réplication résiduelle du VIH-1 et homéostasie lymphocytaire T sous traitement antirétroviral efficace“. Toulouse 3, 2011. http://www.theses.fr/2011TOU30307.
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Une réplication résiduelle du HIV-1 et une déplétion des lymphocytes T CD4+ intestinaux semblent pouvoir persister chez les sujets recevant un traitement antirétroviral. D'une part, notre étude a montré que la virémie résiduelle persistant chez certains patients sous traitement, provient d'un relargage passif à partir des réservoirs cellulaires latents et d'une réplication virale active. Cette virémie résiduelle est associée au niveau d'activation lymphocytaire chez les patients présentant une faible reconstitution immunitaire et pourrait ainsi contribuer au dysfonctionnement immunitaire persistant sous traitement antirétroviral prolongé. D'autre part, nos travaux ont mis en évidence un défaut de homing des lymphocytes T CD4+ CCR9+α4ß7+ vers la muqueuse intestinale qui semble contribuer à la persistance d'une translocation de produits microbiens de la lumière intestinale vers le sang et participer ainsi au maintien d'une activation lymphocytaire néfaste à la reconstitution immunitaireHIV-1 residual replication and CD4+ T-cell depletion are likely to persist in HIV-infected patients on antiretroviral therapy. We find evidence that the residual viremia that persist in some patients despite prolonged antiretroviral therapy could be due to the release of archival virus from reservoir cells and/or ongoing virus replication. Our results also showed that the residual viremia in the poor immunological responders to antiretroviral therapy was positively correlated with the activation of their CD4+ and CD8+ T-cells. The ongoing low-level virus production despite antiretroviral therapy in some patients might thus contribute to persistent immune activation. Additionally we demonstrate persistent alteration of CCR9+α4ß7+ CD4 T-cells homing to the GALT in HIV-infected patient. This lack of recruitment of CD4+ T-cells contributes to the gut mucosal damage, microbial translocation, and systemic T cell activation and could be involved in incomplete mucosal immune reconstitution
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Vandenhoudt, Nathalie. „Etude du rôle des sites de liaison AP-1 intragéniques dans la régulation de l'expression du HIV-1 (Human Immunodeficiency Virus type 1)“. Doctoral thesis, Universite Libre de Bruxelles, 2009. http://hdl.handle.net/2013/ULB-DIPOT:oai:dipot.ulb.ac.be:2013/210317.
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La vitesse de réplication du HIV-1(Human Immunodeficiency Virus type 1), qui semble corrélée de manière directe à la vitesse de progression de la maladie vers le stade SIDA, est essentiellement contrôlée au niveau transcriptionnel. La transcription du HIV-1 est régulée par la structure chromatinienne, des éléments agissant en cis localisés dans les LTRs, des facteurs de transcription agissant en trans et par la protéine virale trans-activatrice Tat (revu dans Quivy et al. 2007, Bisgrove et al. 2005, Rohr et al. 2003, Rabson and Graves 1997). En plus de l’enhancer localisé dans le LTR5’ du HIV-1, un enhancer intragénique, localisé dans le gène pol du HIV-1, inductible par le phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) a été identifié. La localisation progressive de l’activité enhancer a permis de définir deux domaines distincts et indépendants dans cet enhancer intragénique :les fragments 5103 et 5105 localisés respectivement dans la partie centrale du gène pol et dans une région couvrant la fin du gène pol, le gène vif, le gène vpr et le premier exon codant des gènes tat et rev (Verdin et al. 1990). Les fragments 5103 et 5105 se comportent tous deux comme des enhancers inductibles par le PMA lorsqu’ils sont clonés en amont du promoteur de la thymidine kinase dans un vecteur rapporteur en cellules HeLa. Notre laboratoire a précédemment identifié trois sites de liaison pour les facteurs de transcription AP-1 dans le fragment 5103 (Van Lint et al. 1991). Au cours de notre thèse, nous avons poursuivi la caractérisation de ces sites de liaison AP-1 et avons montré que les facteurs c Fos, JunB et JunD interagissent in vitro avec ces motifs. Pour chaque site, nous avons identifié des mutations qui abolissent la liaison des facteurs AP-1 sans altérer la séquence en acides aminés sous-jacente de la transcriptase inverse. Par des expériences de transfection transitoire, nous avons démontré que les sites AP 1 intragéniques sont entièrement responsables de l’activité enhancer PMA-dépendante du fragment 5103. De plus, l’activité PMA-inductible du fragment 5103 est inhibée par le mutant dominant négatif A-Fos à condition que les sites ne soient pas mutés. A l’inverse, l’expression ectopique de dimères forcés AP-1 affecte positivement l’activité enhancer du fragment 5103. Enfin, nous avons étudié le rôle biologique des sites AP-1 intragéniques dans la réplication virale et avons montré que ces sites contribuent positivement à l’infectivité du virus.
Durant la seconde partie de notre thèse, nous avons entamé la caractérisation physique et fonctionnelle du fragment 5105. Nos résultats de transfection transitoire montrent que l’activité PMA inductible du fragment 5105 est localisée dans le dernier tiers de ce dernier :le sous fragment 5105.3. L’analyse bioinformatique de cette région a permis de mettre en évidence un site de liaison pour les facteurs AP-1 in vitro. Des mutations ponctuelles permettent d’abolir la liaison des facteurs à leur site mais altèrent la séquence en acides aminés sous-jacente codant pour les protéines Tat et Rev. Nous avons montré que ce site est impliqué dans l’activité transcriptionnelle de ce fragment. L’expression ectopique du mutant dominant négatif A-Fos inhibe l’activité transcriptionnelle PMA-inductible du fragment 5105. Une analyse bioinformatique plus large nous a ensuite permis d’identifier in vitro, par retard de migration sur gel, 5 sites de liaison pour le facteur YY1 et 2 sites de liaison pour le facteur PU.1 dont les implications pour le virus restent encore à déterminer.
Doctorat en Sciences
info:eu-repo/semantics/nonPublished
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Cha, Sang-Ho. „Evolutionary biology of porcine reproductive and respiratory syndrome virus“. [Ames, Iowa : Iowa State University], 2007.
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Short, James Roswell. „An investigation into the replication biology of Helicoverpa armigera stunt virus“. Thesis, Rhodes University, 2011. http://hdl.handle.net/10962/d1004026.
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Tetraviruses are a family of small non-enveloped positive sense RNA viruses that exclusively infect members of the order Lepidoptera. Their replication biology is poorly studied because, with the exception of Providence virus (PrV), tetraviruses are unable to replicate in tissue culture cells. The overall aim of the research described in this thesis was to develop a fundamental understanding of the replication of tetraviruses, focussing on the site of replication within host cells and in particular, the subcellular localisation of the viral replicase. Helicoverpa armigera stunt virus (HaSV, Genus: Omegatetravirus) was chosen for this study because it is the only tetravirus for which the cDNAs have been shown to be infectious. In the absence of tissue culture cell lines susceptible to HaSV infection, the approach was to use confocal fluorescence microscopy to examine the subcellular localisation of the HaSV replicase fused to enhanced green fluorescent protein (EGFP) in mammalian and insect tissue culture cells. The replicase (with EGFP fused at its C-terminus) localised to punctate structures throughout the cytoplasm of transfected HeLa and Sf9 cells. These structures were then shown – using live cell imaging and time lapse photography – to behave similarly to cellular endocytic organelles and fluorescence partially overlapped with membranes containing the late endosomal marker protein CD63. Biochemical fractionation of Sf9 cells expressing the replicase via a recombinant baculovirus (as well as transfected HeLa and Sf9 cells expressing EGFP-replicase fusion proteins) demonstrated that the replicase was strongly associated with detergentresistant membranes (DRMs) in these cells. Deletion analysis of the replicase coding sequence revealed two regions involved in the generation of the punctuate structures. Firstly, the C-terminal half of the replicase RNAdependant RNA polymerase domain was found to be essential for targeting and the tight association with DRMs while the second region, within the Nterminal 44 amino acids, enhanced localisation through a combination of secondary structural elements and sequence-specific functions. A comparative immunofluorescence study on PrV, which replicates as a persistent infection in an insect midgut cell line, showed that the PrV replicase also localised to punctate structures in the cytoplasm. Biochemical fractionation showed that the replicase was also strongly associated with DRMs. This thesis describes the development of new experimental systems for the study of tetravirus replication biology and the data lead to the conclusion that the HaSV replicase associates with DRMs derived from alternate endocytic pathway organelles.
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Gonzales, Baptiste. „Etudes des facteurs cellulaires et lipidiques déterminant la localisation du site d'assemblage et de bourgeonnement du VIH-1“. Electronic Thesis or Diss., Tours, 2019. http://www.theses.fr/2019TOUR3811.
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La formation des particules du VIH-1 résulte de l'assemblage des précurseurs Gag sur le feuillet interne de la membrane plasmique (MP) des cellules infectées. Les protéines Gag sont spécifiquement adressées à la MP grâce à des interactions entre le domaine MA et le PI(4,5)P2. Cette étude décrit le rôle des phosphadidylinosito1-4-phosphate 5-kinase de type 1 (PIP5K1alpha, beta et sigma) au cours des étapes tardives du VIH-1 dans le modèle celllulaire HeLa. Nous avons démontré que la PIP5K1alpha est l'enzyme principalement impliquée dans la production du PI(4,5P2. En suivant le trafic de Gag à la MP. Leur inhibition respective induit l'accumulation des précurseurs viraux dans les compartiments intracellulaires distincts et diminue la libération des pseudo-particules Gag dans les deux cas. L'ensemble de nos résultats démontre pour la première fois l'importance de l'activité des PIP5K1alpha et sigma dans l'assemblage et le bourgeonnement du VIH-1 et fournit de nouveaux éléments utiles à la compréhension des étapes tardives du cycle de multiplication viralThe production pocesses of HIV-1 particle of HIV-1 particles results from the assembly of Gag Precursors at the inner leaflet of the plasma membrane (PM) of infected cells. Gag proteins are specifically targeted to PM through interactions between MA domain and PI(4,5)P2. This study describes the role of phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinase type 1 (PIP5K1alpha, beta et sigma) in the late stages of HIV-1 in the context of HeLa cells. We determined that PIP5K1alpha is the principal producer of cellular PI(4,5)P2. By using a confocal microscopy approach, we followed the Gag proteins trafficking and showed that only alpha and y isoforms are required for the correct targeting of Gag to PM. Their respective inhibition leads to the accumulation of viral precursors at distinct intracellular comprtements, and decreases the release of Gag pseudoparticles in both cases. Altogether, our results highlight for the first time the crucial role PIP5K1alpha and sigma in the HIV-1 assembly and budding and provide new insights for a better understanding of the late stages of the virus replication cycle
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Cavrois, Marielle. „Expansion clonale des cellules infectées par HTLV-1 : incidences pathologiques“. Lille 1, 1997. https://pepite-depot.univ-lille.fr/LIBRE/Th_Num/1997/50376-1997-91.pdf.
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Agent de la paraparesie spastique tropicale (tsp/ham) et de la leucemie t de l'adulte (atll), le retrovirus htlv-1 est caracterise par une importante stabilite genetique et une charge provirale elevee en l'absence de malignite. L'association de ces deux caracteristiques est expliquee par le mode de replication de htlv-1 qui repose essentiellement sur l'expansion clonale, endogene, du provirus via la multiplication de la cellule hote. A l'aide de techniques d'amplification enzymatique des sites d'integration, l'expansion clonale des cellules infectees a ete analysee in vivo en phase asymptomatique ainsi qu'au cours de l'atll et de la tsp/ham. Quel que soit le statut lie a l'infection, des clones de cellules infectees ont ete detectes demontrant ainsi que l'expansion clonale est le mode privilegie de replication de htlv-1. En outre, au cours de la phase asymptomatique de l'infection, il existe une accumulation de cellules infectees en expansion au sein des clones. L'atll survient sur un fond de proliferation oligo-polyclonale. La stabilite et l'augmentation de taille des clones en circulation au cours de l'infection suggerent fortement que la premiere etape de la leucemogenese induite par htlv-1 in vivo est une accumulation progressive de cellules au sein de clones en expansion. Cette proliferation predispose a l'acquisition des lesions genetiques necessaires au developpement de l'atll. Un transport cellulaire de htlv-1 a l'etat proviral dans le liquide cephalorachidien est observe chez tous les patients atteints de tsp/ham etudies. Le passage des cellules au travers de la barriere hematoencephalique (bhe) etant etroitement lie au degre d'activation des cellules, la proliferation chronique et prolongee des cellules infectees est un moyen pour le virus htlv-1 d'atteindre le systeme nerveux central, etape indispensable au developpement de la tsp/ham
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Gerlach, Piotr. „La structure et la fonction de la polymérase d'orthobunyavirus La Crosse“. Thesis, Université Grenoble Alpes (ComUE), 2015. http://www.theses.fr/2015GREAV013/document.
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Les virus ne sont rien de plus que des particules composées de lipides et/ou de protéines qui encapsulent de l'information génétique composée d'ARN ou d'ADN. Au cours du cycle viral, les virus entrent dans la cellule hôte où ils dupliquent leur génome, puis forment de nouvelles particules virales qui ressortiront de la cellule pour se diffuser. Alors que pour produire leurs protéines virales les virus détournent la machinerie cellulaire, ils utilisent pour la plupart leur propre polymérase spécifique pour répliquer leur génome.Les Bunyaviridae sont une grande famille des virus à ARN simple brin segmenté de polarité négative. Les Arenaviridae et les Orthomyxoviridae sont les deux autres familles de ce type. Certains bunyavirus provoquent des maladies humaines graves, comme des fièvres hémorragiques, des encéphalites et des méningites. D'autres infectent des plantes et animaux, posant une menace économique sérieuse en agronomie.Les ARN polymérases ARN-dépendante de virus à ARN négatif segmenté sont des machineries multi-fonctionnelles, capables de répliquer le génome viral et de le transcrire en ARNs messagers. La réplication est effectuée de novo, en utilisant un intermédiaire d'ARN complémentaire de polarité positive, alors que la transcription est initiée par vol de coiffe d'ARN cellulaire. Chaque segment du génome viral est recouvert par des nucléoprotéines et fixé à la polymérase par ses extrémités 3' et 5' conservées. Le complexe ARN viral/nucléoprotéines/polymérase forme une ribonucléoprotéine, qui est l'unité fonctionnelle de la réplication/transcription.L'objectif de mon projet de thèse était la caractérisation structurale et fonctionnelle de la polymérase du virus La Crosse, également nommée protéine L. Ce projet était basé sur l'hypothèse que toutes les polymérases de virus à ARN négatif segmenté pourraient partager une organisation et un mode d'action similaire. Lors de la première année de ma thèse, j'ai tenté de caractériser le domaine C-terminal, que nous supposions être responsable de la fixation de coiffe. Au cours de la deuxième année, j'ai étendu mes recherches sur l'étude de l'interaction entre les extrémités de l'ARN viral et la protéine L (protéine entière et construction tronquée en C-terminal). Confronté à des difficultés pour établir des tests de réplication et de transcription in vitro, j'ai poursuivi mes recherches en troisième année avec l'étude d'interactions et de co-cristallisation entre polymérase et ARN viral. Cela a finalement conduit au résultat principal de ma thèse - la détermination de la structure par cristallographie aux rayons X de la polymérase de virus de La Crosse en complexe avec les extrémités 3' et 5' de l‘ARN viral. La structure obtenue constitue une percée dans le domaine de bunyavirus. Elle révèle – à la différence de ce qui avait été initialement proposé – que les extrémités 3' et 5' de l'ARN se lient dans deux sites séparés et conservés. La liaison de l'extrémité 5' de l'ARN viral stabilise de façon allostérique l'un des motifs catalytiques du site actif de la polymérase. La structure révèle l'existence de deux tunnels séparés pour l'ARN produit et l'ARN matrice de sortir, ce qui suggère que le brin d'ARN naissant est séparé de la matrice et quitte la polymérase comme ARN simple brin. La proximité des tunnels d'entrée et de sortie de la matrice explique comment la polymérase peut se déplacer le long de l'ARN génomique avec une perturbation minimale de la ribonucléoprotéine.En parallèle de la structure de la polymérase du virus La Crosse, les structures des polymérases hétérotrimériques de la grippe A et B en complexe avec l'ARN viral ont également été déterminées au sein du groupe du Dr. Stephen Cusack. La comparaison de l'organisation des polymérases des deux familles et de la nature de leur liaison avec l'ARN viral montre que, malgré une homologie de séquence minimale, des similitudes structurelles sont frappantes. Cela suggère fortement la présence d'un ancêtre communViruses are not more than particles composed of lipids and/or proteins with genetic information – the viral RNA or DNA genome – embedded inside. In order to be efficient, once they enter the host cell they need to multiply this genetic information, package it into new viral particles and spread out from the cell. While in order to produce viral proteins viruses highjack cellular machinery, for replicating their genome most viruses use their own, specialized polymerases.Bunyaviridae is the largest viral family of segmented negative-strand RNA viruses, comprising also Arenaviridae and Orthomyxoviridae families. Some bunyaviruses are causative agents of severe human diseases including heamorrhagic fevers, encephalitis and meningitis. Others infect a variety of plants and animals posing a significant economic threat to the crop cultivation and cattle breeding.RNA-dependent RNA polymerases of segmented negative-strand RNA viruses are multifunctional machines, able to perform both de novo genome replication via positive-strand cRNA intermediate, and viral mRNA transcription using cap-snatched host-derived mRNA primer. Viral RNA genome of bunyaviruses, arenaviruses, and orthomyxoviruses is divided into three, two, and eight segments respectively. Each segment, coated by nucleoproteins and attached through its conserved 3′ and 5′ ends to the polymerase, constitutes an individual ribonucleoprotein particle – an autonomous RNA synthesis unit.The scope of the PhD project described in this thesis was the structural and functional characterization of the La Crosse orthobunyavirus polymerase, also named the L protein. It was based on the hypothesis that all polymerases of segmented negative-strand RNA viruses share a similar domain organization and mode of action. During the 1st year attempts were made to confirm and characterize a putative C-terminal cap-binding domain. During the 2nd year project was extended to study 3′ and 5′ vRNA ends interactions with the full length and C-terminus truncated L protein. Facing difficulties to establish replication and transcription assays in vitro, vRNA binding studies and co-crystallizastion were continued during the 3rd year. This finally led to the main achievement of the thesis – the x-ray structure of La Crosse orthobunyavirus polymerase in complex with vRNA. Obtained structure is a breakthrough in the bunyavirus field. It reveals – unlike it was initially believed – conserved, sequence specific and separate binding sites for 3′ and 5′ vRNA ends located within the polymerase. The 5′ vRNA end binding allosterically structures one of the conserved catalytic motifs within the polymerase active site. The structure sheds also some new light on bunyaviral replication and transcription mechanisms. There exist two distinct product and template exit channels, suggesting that the nascent RNA strand is separated from the template and leaves the polymerase as the single-strand RNA. Close proximity of the template entry and exit channels explains how the polymerase can translocate along the genomic template with minimal disruption of the RNP.In parallel to the La Crosse polymerase structure, structures of Influenza A and B heterotrimeric polymerases in complex with vRNA were also obtained in Stephen Cusack group. This gave a great opportunity to compare the domain organization and the nature of vRNA binding by viral polymerases belonging to Bunyaviriadae and Orthomyxoviridae families, and proved that despite minimal sequence homology the structural similarities are striking. This strongly suggests an evolutionary common ancestor, which can possibly be shared with non-segmented negative-strand RNA viruses as well
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Pullen, Rebecca Royale. „Effects of porcine reproductive and respiratory syndrome virus on porcine alveolar macrophage surface protein expression“. Thesis, Manhattan, Kan. : Kansas State University, 2008. http://hdl.handle.net/2097/1123.
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Chand, Ranjni Jagdish. „Study of recombination in porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) using a novel in-vitro system“. Diss., Kansas State University, 2013. http://hdl.handle.net/2097/16926.
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Doctor of PhilosophyDepartment of Diagnostic Medicine/Pathobiology
Raymond R. R. Rowland
Mechanisms for mutations in RNA viruses include random point mutations, insertions, deletions, recombination and re-assortment. Most viruses have more than one of these mechanisms operating during their life cycle. Impact of sequence divergence is seen in the areas of evolution, epidemiology and ecology of these viruses. Immediate negative consequences of genetic diversity include failure of vaccination, resistance to anti-virals, emergence and re-emergence of novel virus isolates with increased virulence or altered tropism. To identify specific sequence features that influence recombination, a new in-vitro system was developed using an infectious cDNA clone of PRRS virus that expressed fluorescent proteins. The in-vitro experimental system involved the co-transfection of a pair of closely related PRRSV infectious clones: a fully functional non-fluorescent PRRS virus infectious clone that possessed a single mutation in a green fluorescent protein (GFP) and a second infectious clone that contained a defective fluorescent virus. The readout for successful recombination was appearance of a fully functional fluorescent virus. The model system creates the opportunity to study several aspects of recombination, including the requirement for sequence homology between viruses undergoing recombination.
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Nam, Bora. „EVOLUTION OF EQUINE ARTERITIS VIRUS DURING PERSISTENT INFECTION IN THE REPRODUCTIVE TRACT OF THE STALLION AND THE MALE DONKEY“. UKnowledge, 2017. https://uknowledge.uky.edu/gluck_etds/34.
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Equine arteritis virus (EAV) establishes persistent infection in the stallion reproductive tract, and the carrier stallion continues to shed virus in semen for weeks to years or lifelong. The objective of this study was to elucidate the intra-host evolution of EAV during persistent infection in stallions. Seven EAV seronegative stallions were experimentally infected with EAV KY84 strain and followed for 726 days post-infection, and sequential clinical samples including semen were collected for virus isolation and next-generation sequencing (NGS). In addition, archived sequential semen samples from two stallions that were naturally infected with EAV KY84 for a long-period (up to 10 years) were also sequenced by NGS. The data demonstrated genetic bottleneck event and selection during acute infection followed by intra-host quasispecies diversification during persistent infection in the stallion reproductive tract.
Also, the full-length genome of a novel EAV donkey strain from Chile and a noncytopathic bovine viral diarrhea virus-1 (ncpBVDV-1) strain contaminating rabbit kidney-13 cells were also sequenced by NGS. The EAV donkey strain was genetically distinct but antigenically cross-reacted with EAV antisera, and it was phylogenetically closely related to the South African donkey strain of EAV. Genetic and phylogenetic analyses demonstrated that ncpBVDV-1 belongs to BVDV-1b group.
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Sun, Rong. „Viral innovations to fine tune reproduction: case studies of viral cis-acting RNA elements, a virus-encoded transcription factor, and a concentration-dependent functional switch of a viral protein“. The Ohio State University, 2021. http://rave.ohiolink.edu/etdc/view?acc_num=osu1617992077464046.
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Shaan, Lakshmanappa Yashavanth. „Development and Evaluation of Efficacy of Novel Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome (PRRS) Virus Vaccine Candidates in Pigs“. The Ohio State University, 2018. http://rave.ohiolink.edu/etdc/view?acc_num=osu1532064253191032.
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Koopman, Tammy L. „Production of Porcine Single Chain Variable Fragment (SCFV) selected against a recombinant fragment of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus non structural protein 2“. Thesis, Kansas State University, 2011. http://hdl.handle.net/2097/13189.
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Master of ScienceDepartment of Diagnostic Medicine/Pathobiology
Richard 'Dick' Hesse
Carol Wyatt
Over the last two decades molecular laboratory techniques have enabled researchers to investigate the infection, replication and pathogenesis of viral disease. In the early eighties, Dr. George Smith developed a unique system of molecular selection. He showed that the fd bacteriophage genome could be manipulated to carry a sequence of DNA coding for a protein not contained in the phage genome. Infection of the recombinant bacteriophage or phagemid into a specific strain of the bacterium, Escherichia coli, produced progeny phage with the coded protein displayed as a fusion with the phage's coat protein. Antibody phage display utilizes the same technology with the DNA encoding an antibody fragment. The DNA insert can carry the information to produce either a single chain variable fragment (scFv) producing the heavy chain variable and light chain variable (VH-VL) portion or a Fab fragment which also contains the heavy chain constant 1 with the light chain constant (CH and CL) portion of an antibody. Screening an antibody phage display library has the possibility of producing an antibody not produced in the normal course of immune selection. This decade also saw the emergence of a viral disease affecting the porcine population. The Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus (PRRSV) has been one of the most costly diseases affecting the pig producer. Molecular investigations found that PRRSV is a single, positive-stranded RNA virus which codes for five structural and 12-13 nonstructural proteins producing an enveloped, icosahedral virus. An interesting characteristic of PRRSV is the ability to produce infective progeny with genomic deletions, insertions and mutations within the nonstructural protein 2 (nsp2). With this knowledge, many researchers have produced marker vaccines containing fluorescent tags with the hope of developing a DIVA (Differentiate Infected from Vaccinated Animals) vaccine. In my Master‟s studies, I studied the techniques of antibody phage display technology and how to apply these methods to producing scFvs which recognize a recombinant PRRSV nsp2 fragment protein and the native protein during infection of MARC-145 cells.
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Benoist, Romain. „Bases comportementales, physiologiques et génétiques du succès reproducteur d'un hyménoptère parasitoïde The Cotesia sesamiae story: insight into host-range evolution in a Hymenoptera parasitoid and implication for its use in biological control programs Low-cost automatic temperature monitoring system with alerts for laboratory rearing units“. Thesis, Sorbonne université, 2019. https://accesdistant.sorbonne-universite.fr/login?url=http://theses-intra.upmc.fr/modules/resources/download/theses/2019SORUS584.pdf.
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Etudier l’aptitude d’insectes parasitoïdes à se reproduire dans de nouveaux hôtes est important pour comprendre les mécanismes d’adaptation dans un contexte de lutte biologique. Cotesia typhae est un parasitoïde africain spécialisé sur le lépidoptère Sesamia nonagrioides et est un agent de lutte biologique potentiel contre ce ravageur du maïs. C. typhae appartient à un groupe d’espèces possédant un virus endosymbiotique injecté dans l’hôte lors de la ponte et contribuant à la virulence du parasitoïde. J’ai pu montrer que deux souches de C. typhae diffèrent par leur nombre de descendants et par leur virulence envers une population française de S. nonagrioides, représentant un nouvel hôte. Afin d’identifier les gènes responsables de ces variations une recherche de QTL a été entreprise (Quantitative Trait Loci). Nous avons établi une carte génétique de C. typhae, identifié quatre QTL et dressé une liste de gènes candidats. Pour expliquer la différence de virulence et du nombre de descendants, les quantités d’œufs et de virus injectés au cours de pontes successives ont été estimées. Ces expériences ont montré 1/ que les deux souches ne répartissent pas leurs œufs de la même manière entre les hôtes, 2/ que la quantité de virus injectés n’est pas corrélée à la virulence. Pour comprendre l’origine évolutive de la différence de virulence, ce trait a été estimé sur les populations hôtes naturelles. Les résultats suggèrent que l’adaptation locale pourrait être à l’origine de la pré-adaptation d’une des souches à l’hôte français. Ce travail a permis également de bien caractériser le succès reproducteur de C. typhae, essentiel pour son utilisation en lutte biologiqueStudying the ability of insect parasitoids to reproduce in novel hosts is important to understand adaptive mechanisms at play when they are used for biological control. Cotesia typhae is an African parasitoid specialized on the Lepidoptera Sesamia nonagrioides and it is a potential biological control agent against this maize pest. C. typhae belongs to a group of species harboring a symbiotic virus which is injected in the host during oviposition and which contributes to the parasitoid virulence. I have found out that two strains of C. typhae differed in their offspring number and in their virulence against a French population of S. nonagrioides, which represents a new host. A QTL analysis (Quantitative Trait Loci) has been done to identify genes involved in these variations. We have built a genetic map of C. typhae, identified four QTL and listed candidate genes. To explain the difference of virulence and offspring number, numbers of eggs and viral particles injected during successive ovipositions have been estimated. These experiments have shown that 1/ the two strains have different patterns of egg allocation among the successive hosts parasitized, 2/ the quantity of injected viral particles is not correlated to virulence. To understand to evolutionary origin of the virulence variation, this trait has been estimated for the natural host populations. The results suggest that local adaptation could explain the better pre-adaptation of one C. typhae strain to the French host population. This work also allowed an in-depth characterization of the parasitoid reproductive success, essential for its use in biological control
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Ciocchetta, Silvia. „The vector potential of the mosquito Aedes koreicus“. Thesis, Queensland University of Technology, 2018. https://eprints.qut.edu.au/119157/1/Silvia%20Ciocchetta%20Thesis.pdf.
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Despite the recent establishment and spread of Aedes koreicus mosquitoes in Europe, its natural history and its potential public health impact remain poorly described. This thesis provides the first detailed insights into the biology of Aedes koreicus and its capacity to transmit arboviral diseases. Field work in Italy evaluated a variety of surveillance techniques for this species and its propensity to bite humans. A laboratory colony established in Australia was used to characterise its reproductive biology and its ability to transmit chikungunya virus. The findings help us understand the invasion risks and the public health threat posed by Aedes koreicus
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Yanhua, Li. „Identification of PRRSV nonstructural proteins and their function in host innate immunity“. Diss., Kansas State University, 2014. http://hdl.handle.net/2097/18663.
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Doctor of PhilosophyDepartment of Diagnostic Medicine/Pathobiology
Ying Fang
Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) employs multiple functions to modulate host’s innate immune response, and several viral nonstructural proteins (nsps) are major players. In this dissertation, the research was mainly focused on identification and functional dissection of ORF1a-encoded nsps. PRRSV replicase polyproteins encoded by ORF1a region are predicted to be processed into at least ten nonstructural proteins. In chapter 2, these predictions were verified by using a panel of newly established antibodies specific to ORF1a-encoded nsps. Most predicted nsps (nsp1β, nsp2, nsp4, nsp7α, nsp7β and nsp8) were identified, and observed to be co-localized with de novo-synthesized viral RNA in the perinuclear region of the cell. Among all PRRSV proteins screened, nsp1β is the strongest type I interferon antagonist. In chapter 3, mutagenesis analysis of nsp1β was performed to knock down nsp1β’s IFN antagonist function. A highly conserved motif, GKYLQRRLQ, was determined to be critical for nsp1β’s ability to suppress IFN-β and reporter gene expression. Double mutations introduced in this motif, K130A/R134A (type 1 PRRSV) or K124A/R128A (type 2 PRRSV), improved PRRSV’s ability to stimulate the expression of IFN-α, IFN-β and ISG15. In addition to its critical roles involving in modulating host innate immune response, in the studies of Chapter 4, we demonstrated that PRRSV nsp1β functions as a transactivator to induce the -2/-1 ribosomal frameshifting in nsp2, which results in expression of two novel PRRSV proteins, nsp2TF and nsp2N. The conserved motif GKYLQRRLQ is also determined to be critical for the transactivation function of nsp1β. In chapter 5, the interferon antagonist, de-Ub and de-ISGylation activity of newly identified nsp2TF and nsp2N were evaluated. In vitro and in vivo characterization of three nsp2TF-deficient recombinant viruses indicated that all mutant viruses have improved ability to stimulate the innate immune response and provide improved protection in mutant virus-vaccinated animals. In summary, this study verified the previously predicted PRRSV pp1a processing products, further evaluated the function of nsp1β and nsp2-related proteins. These data obtained here will provide basic knowledge for future development of vaccines and control measurements.
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Sanchez, Mendoza Laura. „Decoding protein networks during porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection through proteomics“. Thesis, 2020. http://hdl.handle.net/1866/25206.
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Le virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin (VSRRP) est un pathogène de grande importance dans l'industrie porcine car il peut entraîner des pertes économiques. L'une des lignées cellulaires couramment utilisée pour la recherche et la production de vaccins est MARC-145 (cellules rénales de singe vert africain). Les interactions moléculaires entre les cellules hôtes et le virus sont essentielles pour comprendre le mécanisme par lequel le virus utilise la machinerie cellulaire pour se répliquer et infecter les cellules voisines. Notre objectif était d'analyser les changements protéomiques produits lors de l'infection par le VSRRP chez les cellules MARC-145, y compris la composition des virions et des exosomes produits par les cellules infectées. Les surnageants des cellules infectées et non infectées ont été purifiés pour obtenir les virions et exosomes des cellules hôtes. Par la suite, les protéines extraites ont été analysées par spectrométrie de masse à haute résolution quadripolaire-hybride-Orbitrap, et classées selon la fonction moléculaire et la localisation subcellulaire. Le besoin d'obtenir des données protéomiques fiables a conduit au prochain objectif : optimiser l'infection des cellules MARC-145 par le VSRRP. Pour évaluer l'efficacité de l'infection, nous avons synchronisé l'infection en utilisant un virus marqué avec une protéine fluorescente verte améliorée (eGFP) et en ajoutant des polycations à différentes concentrations pour stimuler la liaison des particules virales à la cellule. Pour vérifier le pourcentage de cellules infectées, nous avons utilisé la microscopie à fluorescence et la cytométrie en flux. Nos résultats suggèrent que les protéines cellulaires affectées au cours de l'infection par le VSRRP pourraient jouer un rôle important dans la réponse immunitaire de l'hôte et / ou le cycle de vie viral. L’efficacité de l'utilisation de polycations pour augmenter l'infection par le VSRRP a été démontrée.Porcine reproductive and respiratory virus (PRRSV) is a pathogen of high importance in the porcine industry because it can lead to significant economic losses. One of the cell lines routinely used for research and vaccine production is MARC-145 (African green monkey kidney cells). Molecular interactions between the host cells and the virus are essential to understand how the virus uses the cell machinery to replicate and infect neighbouring cells. Our goal was to analyze the proteomic changes involved during the PRRSV infection in MARC-145 cells, including the composition of the infected cells' virions and exosomes. The infected and non-infected cells' supernatants were purified to obtain the host cells' virions and exosomes. Extracted proteins were further analyzed by High-Resolution-Quadrupole-Hybrid-Orbitrap mass spectrometry and classified according to molecular function and subcellular localization. The need for obtaining reliable proteomics data led to the next goal of optimizing the infection of MARC-145 cells with PRRSV. To assess the efficiency of the infection, we synchronized the infection, used a virus tagged with an enhanced green fluorescent protein (EGFP) and added polycations at different concentrations to stimulate the binding of the viral particles to the cell. To verify the percentage of infected cells, we used fluorescence microscopy and flow cytometry. Our findings suggest the cellular proteins affected during the PRRSV infection could play important roles in host immune response and/or the viral life cycle. The efficiency of the use of polycations was demonstrated to be effective in increasing PRRSV infection.
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Hernandez, Reyes Yenney. „Characterization of Actinobacillus pleuropneumoniae antiviral effect against porcine reproductive and respiratory syndrome virus in porcine alveolar macrophages“. Thèse, 2014. http://hdl.handle.net/1866/12394.
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Pinilla, Vicente. „In vitro and in vivo effects of deoxynivalenol (DON) mycotoxin on porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) in piglets“. Thèse, 2015. http://hdl.handle.net/1866/13368.
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Les récoltes de céréales sont souvent contaminées par des moisissures qui se développent pendant la récolte et l’entreposage et produisent des métabolites secondaires appelés mycotoxines. Le porc est reconnu pour être sensible au déoxynivalénol (DON). L’infection virale la plus importante chez le porc est causée par le virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin (VSRRP). Celui-ci provoque un syndrome grippal et des troubles de reproduction. L’objectif du présent projet était de déterminer l'effet in vitro de DON sur la réplication du VSRRP dans de lignées cellulaires permissives, MARC-145 et PAM, et déterminer in vivo l'impact de DON dans des aliments naturellement contaminés sur l’infection au VSRRP chez le porcelet. Tout d’abord, les cellules ont été incubées avec des doses croissantes de DON et ont été infectées avec du VSRRP pour évaluer la viabilité et la mortalité cellulaire, la réplication virale et l’expression de cytokines. Les résultats ont montré que les concentrations de DON de 560ng/ml et plus affectaient significativement la survie des cellules MARC-145 et PAM infectées par le VSRRP. En revanche, il y avait une augmentation significative de la viabilité et une réduction de la mortalité cellulaire à des concentrations de DON de 140 à 280 ng/ml pour les cellules PAM et de 70 à 280 ng/ml pour les cellules MARC-145 avec une réduction de l'effet cytopathique provoqué parle VSRRP. Au niveau in vivo, 30 porcelets divisés en 3 groupes de 10 porcelets et nourris pendant 2 semaines avec 3 différentes diètes naturellement ont été contaminées avec DON (0; 2,5 et 3,5 mg/kg). Les porcelets ont été subdivisés en 6 groupes, 3 groupes de 6 porcelets et ont été exposés au DON pendant 2 semaines et infectés par voie intratrachéale et intramusculaire avec le virus. Les 3 autres groupes de 4 porcelets servaient de contrôle non infectés. Les signes cliniques ont été enregistrés pendant 21 jours. La virémie a été évaluée par PCR. À la fin de l’expérimentation, les porcelets ont été euthanasiés et les lésions pulmonaires ont été évaluées. Les résultats ont montré que l’ingestion de DON à 3,5 mg/kg a augmenté l’effet du VSRRP sur la sévérité des signes cliniques, les lésions pulmonaires et la mortalité. L’ingestion de DON à 2,5 mg/kg a entrainé une augmentation de la virémie au jour 3 après l’infection mais sans impact sur les signes cliniques et les lésions pulmonaires.
Mot clés: DON, VSRRP, MARC-145, PAM, effet cytopathique, cytokines, PCRCereal crops are often contaminated with moulds that grow during harvest and storage and produce secondary metabolites called mycotoxins. Pig is known to be sensitive to deoxynivalenol (DON). On the other hand, infection by porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) causes a flu-like syndrome and reproductive disorders. The objectives of this project were to determine the in vitro effect of DON on the replication of PRRSV in permissive cell lines, MARC-145 and PAM and the in vivo impact of DON-naturally contaminated feed on PRRSV infection in piglets. Firstly, cells were incubated with gradually increasing doses of DON and were infected with PRRSV to evaluate cytopathic effect and to assess cell viability, virus replication and cytokine mRNA expression on infected and uninfected cells. Results showed that DON concentrations of 560 ng/ml and higher were significantly detrimental to the survival of MARC-145 cells infected with PRRSV. In contrast, there was a significant increase of cell viability and decreased of cell mortality at DON concentrations within 140 to 280 ng/ml for PAM cells and 70 to 280 ng/ml ranges for MARC-145 showing a reduced cytopathic effect (CPE) caused by PRRSV. In vivo study was carried out on 30 piglets divided into 3 groups of 10 piglets fed naturally contaminated diets with different levels of DON; 0, 2.5 and 3.5 mg/kg. After 2 weeks, pigs were further divided into 6 subgroups, 3 subgroups of 6 piglets were infected intra tracheally and intramuscularly with PRRSV. The other 3 subgroups of 4 piglets were used as uninfected controls. Clinical signs were recorded for 21 days post-infection (p.i.). Sera were evaluated for viremia by PCR. At the end of the experiment, piglets were euthanized and pulmonary lesions were evaluated. Results showed that ingestion of diet highly contaminated with DON at 3.5 mg/kg increased the effect of PRRSV infection on the severity of clinical signs, weight loss, lung lesions and mortality. Diet with DON at 2.5 mg/kg showed an increase of viremia at day 3 but had not significant impact on clinical signs and lung lesions. Keywords: DON, PRRSV, MARC-145, PAM, cytopathic effect, cytokines, PCR
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Jian-Jun, Jia. „Identification of a new cell line permissive to porcine reproductive and resporatory syndrome virus replication“. Thèse, 2009. http://hdl.handle.net/1866/3579.
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Le syndrome reproducteur et respiratoire porcin (SRRP) est une des maladies les plus dévastatrices économiquement pour l'industrie mondiale du porc. L'agent étiologique du SRRP est le virus du SRRP (VSRRP) lequel est connu pour avoir une spécificité d'hôte très restreinte et pour sa transmission par voie aerosol. Les antigènes et les ARN du VSRRP ont été trouvés dans des cellules épithéliales du tractus respiratoire de porcs infectés par le virus. L’interaction entre les macrophages alvéolaires porcins (PAMs) et le VSRRP a été démontrée comme jouant un rôle important dans l’infection causée par le virus. Malgré cela, l’interaction prenant place entre les cellules épithéliales du tractus respiratoire porcin et le virus ne devrait pas être négligée. Jusqu’à présent, la réplication du VSRRP in vitro dans des cellules épithéliales du tractus respiratoire porcin n’a pas été conduite avec succès et les tentatives pour le faire ont échoué. Une nouvelle lignée de cellules épithéliales de poumon de porc (SJPL) est maintenant disponible et sera utilisée dans cette étude afin de déterminer si elle est permissive à la réplication du VSRRP et si elle peut être un modèle approprié pour l’étude de la pathogénèse virale du VSRRP. L’expérimentation a démontré que cette nouvelle lignée cellulaire était permissive à l’infection et à la réplication du VSRRP. Afin de corroborer ces résultats, la cinétique de réplication du virus à été effectuée avec les cellules MARC-145 et SJPL. Aucune différence significative dans la production virale totale n’a été trouvée entre les deux lignées cellulaires. Les cellules SJPL ont permis la réplication de plusieurs souches Nord-Américaines du VSRRP, quoiqu’elles sont légèrement moins efficaces que les cellules MARC-145 pour l’isolement du virus. De plus, les cellules SJPL sont phénotypiquement différentes des cellules MARC-145. Plus précisément, les cellules SJPL sont plus sensibles à l’activation par le VSRRP des pro-caspases 3/7 et plusieurs inducteurs apoptotiques. Elles ont également montré de 8 à 16 fois plus de sensibilité à l’effet antiviral causé par l’IFN-α sur la réplication du virus contrairement aux cellules MARC-145. Ces résultats démontrent que les cellules SJPL pourraient représenter un substitut intéressant aux cellules MARC-145 pour la production d’antigènes pour un vaccin anti-VSRRP. Également, dû à leurs origines (poumon de l’hôte naturel), elles pourraient s’avérer être un modèle in vitro plus approprié pour l’étude de la pathogénèse du VSRRP.Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) is one of the most economically devastating diseases for the pig industry worldwide. The etiological agent of PRRS is the PRRS virus (PRRSV), which is known to have a very restricted host specifity and to be airborne transmitted. PRRSV RNAs and antigens were found in epithelial cells of the respiratory tract of swine in PRRSV-infected pigs. Even if the interaction between porcine alveolar macrophages (PAMs) and PRRSV plays an important role in the PRRSV infection, the role of the interaction between epithelial cells of the swine respiratory tract and PRRSV should not been neglected. However, no epithelial cells of the swine respiratory tract have been demonstrated to allow PRRSV replication in vitro and attempts to generate such a cell line have failed. The goal of this study is to determine whether epithelial cells of the swine respiratory tract are permissive to PRRSV replication and are a suitable model for studying the viral pathogenesis of PRRSV. We have discovered that the SJPL cell line, an epithelial cell line of the respiratory tract of swine, is permissive to PRRSV infection and replication. To corroborate these results, PRRSV replication kinetics were evaluated in a subclone of the African green monkey kidney MA104 cells (MARC-145), which has been known to be fully permissive to PRRSV infection and replication, and in SJPL cells. No significant difference was found between the two cell lines for overall viral production. Moreover, the SJPL cells were able to permit the replication of several PRRSV North-American strains but they were slightly less efficient for virus isolation than MARC-145 cells. In addition, SJPL is phenotypically different from MARC-145. Specifically, the SJPL cells were more sensitive to procaspases 3/7 activation by PRRSV and several apoptotic inducers compared to MARC-145 cells. In addition, the SJPL cells showed 8 to 16 times more sensitivity to the antiviral effect of IFN-α against PRRSV replication than MARC-145 cells. Altogether, the SJPL cells could be an interesting substitute to MARC-145 cells for PRRSV vaccine antigen production, and could be a more relevant in vitro model, because of their origin (lung of the natural host), to study the pathogenesis of PRRSV.
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Jia, Jian Jun. „Identification of a new cell line permissive to porcine reproductive and resporatory syndrome virus replication“. Thèse, 2009. http://hdl.handle.net/1866/3579.
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Le syndrome reproducteur et respiratoire porcin (SRRP) est une des maladies les plus dévastatrices économiquement pour l'industrie mondiale du porc. L'agent étiologique du SRRP est le virus du SRRP (VSRRP) lequel est connu pour avoir une spécificité d'hôte très restreinte et pour sa transmission par voie aerosol. Les antigènes et les ARN du VSRRP ont été trouvés dans des cellules épithéliales du tractus respiratoire de porcs infectés par le virus. L’interaction entre les macrophages alvéolaires porcins (PAMs) et le VSRRP a été démontrée comme jouant un rôle important dans l’infection causée par le virus. Malgré cela, l’interaction prenant place entre les cellules épithéliales du tractus respiratoire porcin et le virus ne devrait pas être négligée. Jusqu’à présent, la réplication du VSRRP in vitro dans des cellules épithéliales du tractus respiratoire porcin n’a pas été conduite avec succès et les tentatives pour le faire ont échoué. Une nouvelle lignée de cellules épithéliales de poumon de porc (SJPL) est maintenant disponible et sera utilisée dans cette étude afin de déterminer si elle est permissive à la réplication du VSRRP et si elle peut être un modèle approprié pour l’étude de la pathogénèse virale du VSRRP. L’expérimentation a démontré que cette nouvelle lignée cellulaire était permissive à l’infection et à la réplication du VSRRP. Afin de corroborer ces résultats, la cinétique de réplication du virus à été effectuée avec les cellules MARC-145 et SJPL. Aucune différence significative dans la production virale totale n’a été trouvée entre les deux lignées cellulaires. Les cellules SJPL ont permis la réplication de plusieurs souches Nord-Américaines du VSRRP, quoiqu’elles sont légèrement moins efficaces que les cellules MARC-145 pour l’isolement du virus. De plus, les cellules SJPL sont phénotypiquement différentes des cellules MARC-145. Plus précisément, les cellules SJPL sont plus sensibles à l’activation par le VSRRP des pro-caspases 3/7 et plusieurs inducteurs apoptotiques. Elles ont également montré de 8 à 16 fois plus de sensibilité à l’effet antiviral causé par l’IFN-α sur la réplication du virus contrairement aux cellules MARC-145. Ces résultats démontrent que les cellules SJPL pourraient représenter un substitut intéressant aux cellules MARC-145 pour la production d’antigènes pour un vaccin anti-VSRRP. Également, dû à leurs origines (poumon de l’hôte naturel), elles pourraient s’avérer être un modèle in vitro plus approprié pour l’étude de la pathogénèse du VSRRP.Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) is one of the most economically devastating diseases for the pig industry worldwide. The etiological agent of PRRS is the PRRS virus (PRRSV), which is known to have a very restricted host specifity and to be airborne transmitted. PRRSV RNAs and antigens were found in epithelial cells of the respiratory tract of swine in PRRSV-infected pigs. Even if the interaction between porcine alveolar macrophages (PAMs) and PRRSV plays an important role in the PRRSV infection, the role of the interaction between epithelial cells of the swine respiratory tract and PRRSV should not been neglected. However, no epithelial cells of the swine respiratory tract have been demonstrated to allow PRRSV replication in vitro and attempts to generate such a cell line have failed. The goal of this study is to determine whether epithelial cells of the swine respiratory tract are permissive to PRRSV replication and are a suitable model for studying the viral pathogenesis of PRRSV. We have discovered that the SJPL cell line, an epithelial cell line of the respiratory tract of swine, is permissive to PRRSV infection and replication. To corroborate these results, PRRSV replication kinetics were evaluated in a subclone of the African green monkey kidney MA104 cells (MARC-145), which has been known to be fully permissive to PRRSV infection and replication, and in SJPL cells. No significant difference was found between the two cell lines for overall viral production. Moreover, the SJPL cells were able to permit the replication of several PRRSV North-American strains but they were slightly less efficient for virus isolation than MARC-145 cells. In addition, SJPL is phenotypically different from MARC-145. Specifically, the SJPL cells were more sensitive to procaspases 3/7 activation by PRRSV and several apoptotic inducers compared to MARC-145 cells. In addition, the SJPL cells showed 8 to 16 times more sensitivity to the antiviral effect of IFN-α against PRRSV replication than MARC-145 cells. Altogether, the SJPL cells could be an interesting substitute to MARC-145 cells for PRRSV vaccine antigen production, and could be a more relevant in vitro model, because of their origin (lung of the natural host), to study the pathogenesis of PRRSV.
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Alvarez, Fernando. „Création d'un modèle cellulaire des voies respiratoires du porc pour étudier les effets d'une co-infection virale au virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin et au circovirus porcin“. Thèse, 2013. http://hdl.handle.net/1866/10767.
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Le circovirus porcin de type 2 (PCV2) est un pathogène majeur pour l’industrie porcine et est associé à une longue liste de maladies associées au circovirus porcin (MACVP). Les premières tentatives pour reproduire ces maladies ont montré que le virus doit être combiné à d’autres agents pathogènes du porc ou à différents stimulants du système immunitaire. De ces agents, le virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin (VSRRP) est celui qui est le plus souvent co-isolé avec le PCV dans les fermes. Une grande partie des efforts faits pour étudier les interactions entre ces deux virus ont été menés in vivo. Les interactions in vitro ont jusqu’à maintenant été peu étudiées du fait qu’il n’existe pas de modèle cellulaire permettant la réplication efficace des deux virus. L’objectif de ce projet était donc de développer un modèle cellulaire propice à la réplication des deux virus et d’étudier leur interaction en co-infection. Une lignée cellulaire provenant de la trachée d’un porcelet nouveau-né (NPTr), permissive au PCV, a été génétiquement modifiée pour exprimer la protéine CD163, un récepteur majeur du VSRRP. Ce projet a montré que cette nouvelle lignée cellulaire (NPTr-CD163) est permissive au VSRRP ainsi qu’à plusieurs génotypes de PCV (PCV1, PCV2a, PCV2b et PCV1/2a). De plus, les résultats obtenus lors d’infections mixtes suggèrent que la réplication du VSRRP et du PCV conditionne de façon génotype-dépendante celle du PCV puisque la réplication du PCV1 est inhibée en présence de VSRRP, alors que celle du PCV2b est significativement augmentée dans les mêmes conditions. Ni la mortalité cellulaire, ni la réponse cellulaire en cytokines n’a permis d’expliquer ces résultats. La modulation de la réplication du PCV par le VSRRP serait donc liée à un mécanisme spécifique qui demeure inconnu. De plus, cet effet varierait en fonction du génotype de PCV.Porcine circovirus (PCV) type 2 (PCV2) is a major pathogen in the swine industry and has been described as the causative agent of a long list of conditions under the designation of porcine circovirus-associated diseases (PCVAD). Attempts to replicate PCVAD initially failed, as it was discovered that an immune trigger could facilitate the reproduction of clinical signs, either by co-infecting with other swine pathogens or using immune stimulants. Of these, porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) is the most frequently co-isolated agent in the field. Most effort has been made to understand this interaction in vivo since most in vitro cellular models lack the ability to efficiently replicate both viruses. To answer the lack of an in vitro model, we developed a cell line that allows the replication of both PRRSV and PCV. A neonate porcine tracheal cell line (NPTr) was genetically modified to stably express CD163 (NPTr-CD163), a major PRRSV receptor. NPTr-CD163 cells were able to replicate all PCV genotypes (PCV1, PCV1/2a, PCV2a and PCV2b) and PRRSV. A significant effect of PRRSV on PCV replication was found to be genotype dependent, as PCV1 replication was down regulated in the presence of PRRSV and PCV2b replication was up regulated in the same conditions. Neither cell mortality assays nor cytokine expression analysis were able to provide an explanation for these results. The effect of PRRSV on PCV1 and PCV2b replication is suggestive of a more specific, yet still unknown, mechanism. Furthermore, this effect is PCV-genotype dependant.
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Lalonde, Christian. „Amélioration des services de génomiques et de surveillance du virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin“. Thesis, 2020. http://hdl.handle.net/1866/24260.
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Le virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin (VSRRP) est un pathogène important,
entrainant des pertes économiques de 130 millions de dollars annuellement au Canada. La
surveillance est effectuée par séquençage Sanger du gène ORF5 mais nous croyons que le
séquençage du génome entier (SGE) du VSRRP permettrait une meilleure surveillance
épidémiologique comparé au séquençage du gène ORF5.
Pour développer une méthode efficace de SGE du VSRRP, 149 échantillons (sérums, poumons,
tissus, autres) d’animaux malades ou récoltés pour fin de surveillance ont été analysés. L'ARN viral
a été concentré par enrichissement d'ARN à queue poly (A) et le séquençage effectué sur une
plateforme Illumina. Le SGE a été efficace dans 67,11% des échantillons, réussissant dans certains
échantillons de poumons et de sérums possédant une valeur de quantification (Cq) du virus par RTqPCR
jusqu’à 26,50 et 34.13, respectivement. La méthodologie développée de SGE du VSRRP a
été 4650 fois plus sensible que les méthodes décrites précédemment.
Pour quantifier l’impact du SGE, 88 échantillons (dont le SGE a réussi) ont été utilisés pour
comparer le SGE au séquençageORF5. Deux génomes de VSRRP différents ont été trouvés dans
quatre échantillons différents (taux de coinfection de 4,55%). Six génomes de VSRRP (6,52% des
souches) ont été classés différemment par rapport à la classification ORF5. Ainsi, le SGE du
VSRRP a permis une meilleure caractérisation de 9,10% des échantillons VSRRP positifs comparé
au séquençage ORF5.
Donc, le SGE du VSRRP est à la fois sensible et plus précis que la classification par l’ORF5.Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) is an important pathogen, costing over 130 million dollars annually in Canada. Surveillance is done by Sanger sequencing of the ORF5 gene, but we hypothesized that whole genome sequencing (WGS) of PRRSV genome will allow a better epidemiological monitoring of PRRSV compared to ORF5 gene sequencing. To develop an efficient method of PRRSV WGS, 149 PRRSV samples (sera, lungs, pool of tissues and others) collected for surveillance or from sick animals were tested. Viral RNA was concentrated using a poly(A) tailed RNA enrichment method, and sequencing was done on an Illumina platform. WGS was successful in 67.11% of cases. WGS was successful in some tissues and lungs samples with RT-qPCR cycle quantification (Cq) values up to 26.50, and in some sera with Cq value up to 34.13. The developed WGS methodology was 4650 times more sensitive for PRRSV WGS than previously described methods. To quantify the impact of WGS, 88 successful samples for the WGS of PRRSV were used to compare efficiency of WGS and ORF5 sequencing. Two different full-length genomes of PRRSV were found in four of those samples (coinfection rate of 4.55%). Six full-length PRRSV genomes (6.52% of PRRSV strains) were found to cluster differently compared to ORF5 sequencing. WGS of PRRSV also enabled a better classification or characterisation of 9.10% of the PRRSV infected samples compared to ORF5 sequencing. Thus, WGS can be both sensitive and more accurate then ORF5 classification for the characterisation of PRRSV strains.
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Lévesque, Cynthia. „Modèles cellulaires pour étudier les interactions entre Actinobacillus pleuropneumoniae et le virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin“. Thèse, 2010. http://hdl.handle.net/1866/5149.
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Durant une infection pulmonaire, les porcs sont souvent infectés par plus d’un microorganisme. Actinobacillus pleuropneumoniae et le virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin (VSRRP) sont des pathogènes qui peuvent infecter de manière simultanée les porcs. L’objectif du présent projet est d’étudier l’interaction entre ces pathogènes. Les deux lignées cellulaires permissives au VSRRP utilisées sont les cellules « St-Jude porcine lung » (SJPL) et MARC-145. Les cellules ont été pré-infectées avec le VSRRP, puis infectées avec A. pleuropneumoniae. Un dosage de la lactate déshydrogénase a montré qu’une co-infection VSRRP-A. pleuropneumoniae comparée à une infection simple augmente significativement la cytotoxicité. Dans les mêmes conditions expérimentales, une pré-infection virale ne semble pas affecter l’adhérence d’A. pleuropneumoniae aux cellules. À l’aide de tests ELISA, il a été possible de démontrer la production d’IL-8 et d’INF-γ lorsqu’il y a infection des cellules. Pour ce qui est du TNF-α, d’IL-6 et d’IL-10, ces cytokines ne sont pas détectées en présence des pathogènes étudiés. Des expériences de pré-infection bactérienne suivie d’infection virale ont également été réalisées. Il a été démontré que la pré-infection avec A. pleuropneumoniae diminuait la réplication du VSRRP chez la lignée cellulaire SJPL, mais cela n’est pas observé avec la lignée cellulaire MARC-145. Les résultats préliminaires ont démontré que cette diminution de la réplication serait causée par une molécule de faible poids moléculaire sécrétée dans le surnageant bactérien et celle-ci serait résistante à la chaleur. Les lignées cellulaires SJPL et MARC-145 représentent de bons modèles pour l’étude des infections mixtes des voies respiratoires du porc.The respiratory tract of pigs is often colonized by more than one pathogen during an infection. Actinobacillus pleuropneumoniae and the porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) are pathogens that can be associated with co-infection. The objective of this project was to study interactions between A. pleuropneumoniae and PRRSV during mixed infection. The PRRSV-permissive cell lines, St-Jude porcine lung (SJPL) and MARC-145 were used. In the first part, cells were pre-infected with PPRSV followed by an infection with A. pleuropneumoniae. Results obtained with a lactate dehydrogenase test showed that a co-infection resulted in a greater cytotoxicity then the single infections. The adherence of A. pleuropneumoniae to non-infected or PRRSV-infected cells was similar. Based on ELISAs tests, it was found that the cells produced IL-8 and IFN-γ when they were infected, but TNF-α, IL-6 and IL-10 were not detected. In the second part, cells were pre-infected with A. pleuropneumoniae followed by viral infection. The results showed that a pre-infection with A. pleuropneumoniae decreased PRRSV replication in SJPL cells, whereas A. pleuropneumoniae did not impair PRRSV replication in MARC-145 cells. Preliminary results indicate that a molecule secreted by A. pleuropneumoniae is the factor impairing PRRSV replication in SJPL cells. The factor is probably a small molecular weight molecule that is heat-resistant. In conclusion, both cell lines allowed the study of A. pleuropneumoniae and PRSSV interactions during a mixed-infection and these models could be adapted to study interactions of other swine pathogens.