Dissertationen zum Thema „Ubiquitine ligases“

La GTPase Rac1 est une protéine de signalisation intracellulaire qui joue notamment un rôle clé dans la prolifération cellulaire. Notre laboratoire a montré que la toxine CNF1, produite par les Escherichia coli pathogènes, catalyse l’activation de Rac1. Nous avons également identifié le rôle de la E3 ubiquitine-ligase HACE1, un suppresseur de tumeur avéré, dans la régulation par ubiquitylation de Rac1 actif. S’il est prouvé que la forme activée de Rac1 est une cible d’HACE1, le mode d’interaction de ces deux protéines reste à définir ainsi que le rôle de ces interactions dans l’infection et le cancer. L’objectif de mon travail a été de caractériser les interactions moléculaires entre HACE1 et Rac1. Nous avons testé l’hypothèse que des mutations ponctuelles d’HACE1 identifiées dans les cancers pourraient interférer avec son interaction avec Rac1 et sa capacité de contrôle de la croissance cellulaire. J’ai ainsi pu mettre en évidence que 13 mutations somatiques d’HACE1 issues de tumeurs séquencées altèrent sa fonction de contrôle de la croissance cellulaire. De plus, l’étude de ces mutations nous a permis d’identifier un groupe d’acides aminés, situés sur les ankyrin-repeats 5 à 7 d’HACE1, qui contrôle l’interaction d’HACE1 avec Rac1 et de ce fait son ubiquitylation. Enfin dans cette étude nous précisons le rôle du domaine intermédiaire d’HACE1 (MID) dans la spécificité d’interaction de la ligase avec la forme active de Rac1. In fine, la caractérisation de mutants d’interaction entre HACE1 et Rac1 ainsi que l’effet de la toxine CNF1 sur cet axe de signalisation doit nous renseigner sur l’importance de cette voie de régulation dans le cancer et l’infection<br>The small GTPase Rac1 plays a key role in various intracellular signaling pathways including cell proliferation. Our laboratory has shown that the CNF1 toxin, produced by pathogenic Escherichia coli, catalyzes the activation of Rac1. We also identified the role of the E3 ubiquitin-ligase HACE1, a tumor suppressor, in the regulation by ubiquitylation of active Rac1. If the activated form of Rac1 is proved to be a target of HACE1, the mode of interaction between these two proteins remains to be define as well as the role of these interactions in infection and cancer. The aim of my work was to characterize the molecular interactions between HACE1 and Rac1. We tested the hypothesis that HACE1 point mutations identified in cancers could interfere with its interaction with Rac1 and its ability to control cell growth. We showed that 13 cancer-associated somatic mutations of HACE1, led to a defective control of cell proliferation. Moreover, the study of these mutations allowed us to identify a group of amino acids, located on the ankyrin-repeats 5 to 7 of HACE1, which controls the interaction of HACE1 with Rac1 and thus its ubiquitylation. We also identified a role for the intermediate domain of HACE1 (MID) in conferring the specificity of association of HACE1 to the active form of Rac1. Ultimately, the characterization of interaction mutants between HACE1 and Rac1 as well as the effect of the CNF1 toxin on this signaling axis will give us more insight on this regulatory pathway in cancer and infection

Le norovirus, un virus non-enveloppé à ARN simple brin positif (+) de la famille des Caliciviridae est très contagieux et résistant. Un important effort de recherche est mené pour comprendre les mécanismes de la pathogenèse norovirale. Le système immunitaire inné est principalement activé lors des infections à norovirus. L'ubiquitination est un processus post-traductionnel ATP-dépendant, qui régule de nombreuses étapes de cette réponse immunitaire en catalysant l’ajout de différents types de chaînes de polyubiquitine sur certains résidus lysine de protéines cibles de manière à réguler leur sort.Il est à noter que des niveaux accrus de polyubiquitination peuvent être mesurés dans des cultures de macrophages après infection avec la souche de norovirus murin S99 (MNoV_S99). Dans une première étude, nous avons évalué comment l'altération de la formation des chaînes de polyubiquitine pouvait affecter le cycle de vie de MNoV_S99. En utilisant la lignée cellulaire de macrophage Raw264.7, plusieurs lignées cellulaires stables ont été générées en surexprimant les constructions YFP-Ubiquitin_WT, _K29R, _K48R ou_K63R. Toutes les constructions non-WT codent une protéine de fusion d'ubiquitine dont une lysine a été mutée en un résidu arginine, empêchant ainsi la formation des chaînes de polyubiquitine correspondantes. Une expression significativement réduite de plusieurs marqueurs viraux ainsi qu’une diminution significative des titres viraux a pu être mesurée seulement dans les cellules K48R. Cette régulation négative n’était pas liée à une entrée virale perturbée, mais plutôt par une hypersécrétion constitutive de la cytokine pro-inflammatoire TNF générant ainsi un environnement hostile à la propagation du MNoV_S99. L’ajout de chaînes de polyubiquitine K48 sur un substrat entraîne généralement celui-ci vers la dégradation protéasomale. Nos données sont les premières à suggérer que le MNoV_S99 bénéficie de la régulation à la baisse d’un ou plusieurs composants cytosoliques anti-viraux, encore non identifiés, vraisemblablement sensibles à la dégradation protéasomale. Les E3-ubiquitine ligases jouent un rôle central dans le processus d'ubiquitination en sélectionnant les substrats à ubiquitiner. Il a été démontré que SMURF1, une ubiquitine ligase à domaine HECT, atténue la demi-vie de plusieurs agents pathogènes par le biais de l'ubiquitination K48.Dans la seconde étude présentée dans ce manuscrit, nous avons analysé le rôle joué par SMURF1 dans la propagation du MNoV_S99. Tout d’abord, nous avons identifié l’interaction de SMURF1 avec la principale protéine de capside norovirale VP1. Mais cette interaction n'est pas associée à l'ubiquitination de la capside virale, ce qui suggère que le virus lui-même n'est pas ciblé par la dégradation protéasomale. En effet, lorsque des macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMDM), de souris, où Smurf1 est inactivé par rapport à des souris sauvages, ont été infectés par le MNoV_S99, nous avons mesuré une diminution significative de l'expression de plusieurs marqueurs viraux. De même, les titres viraux dans les cultures Smurf1-/-étaient significativement inférieurs à ceux des BMDM WT. Ceci suggère un rôle bénéfique de SMURF1 et de l'ubiquitination K48-dépendante dans le cycle de vie des norovirus. Ceci a été confirmé par le fait que les BMDM WT traités avec l'inhibiteur de protéasome MG132 ont montré une production de MNoV_S99 significativement réduite.Dans l'ensemble, nos données permettent de mettre en lumière un rôle bénéfique de l'activité protéasomale dans le maintien d'un environnement permissif dans la propagation de la souche S99 du norovirus murin<br>The Norovirus, a small non-enveloped single stranded positive-sense RNA virus, that belongs to the Caliciviridae family, is highly contagious and resistant and is a major causal agent of viral gastroenteritis resulting in a high human and socioeconomic cost. Due to a lack of approved therapy options, intensive research effort is on going to better understand the mechanisms of noroviral pathogenesis.Viral entry is known to trigger signals that activate the innate immune system in order to neutralize the pathogen. Ubiquitination is an ATP-dependent multistep posttranslational process, involved in the regulation of the immune response, in which a ubiquitin moiety is added to a substrate. Interestingly, we have measured increased levels of polyubiquitination following mouse norovirus (MNoV) infection in macrophages. Different types of polyubiquitin chains can be formed on a given target’s lysine residue which determines the fate of those proteins. In a first study we have evaluated how the alteration of polyubiquitin chain formation could affect the noroviral life cycle. Using the macrophage cell line Raw264.7, several stable cell lines were generated by overexpressing YFP-Ubiquitin_WT, _K29R, _K48Ror_K63R constructs. All non-WT constructs encode a ubiquitin fusion protein with one lysine mutated into an arginine residue, thus preventing the formation of their respective polyubiquitin chains. Upon infection with the murine norovirus S99 (MNoV_S99) strain, we measured a significantly reduced expression of the viral markers VP1, NS5 and double-stranded RNA in cells where the formation of polyubiquitin chains via lysine 48 was abrogated. The TCID50 titration method further confirmed the drop of norovirus production in these cells. This negative regulation could not be explained by perturbed viral entry, however, a constitutive hypersecretion of the pro-inflammatory cytokine TNF and downstream upregulation of IκBαphosphorylation followed by NF-κB nuclear translocation was found which could potentially impose a non-permissive environment for MNoV_S99 replication and propagation.Additionally, since K48-polyubiquitin chain formation is well described to target proteins toward proteasomal degradation, our data are the first to suggest that the MNoV_S99benefits from the down regulation of unidentified cytosolic component(s) that are cleared via the proteasome.E3-ubiquitin ligases play a central role in the ubiquitination process by selecting which substrates go through ubiquitination. SMURF1, a HECT domain ubiquitin ligase, wasshown to mitigate, via K48-ubiquitination, the half-life of several pathogens. In the second study presented in this manuscript, we have investigated the role played bySMURF1 in MNoV_S99 propagation. Interestingly, we have identified that SMURF1 can bind to the main noroviral capsid protein Vp1. But this interaction was not associated with ubiquitination of the viral capsid, suggesting that the virus itself is not targeted towards proteasomal degradation. Indeed, when bone marrow derived macrophages (BMDM), established from Smurf1 knock-out mice in comparison with WT mice, were infected with MNoV_S99 we measured significantly decreased expression of several viral markers. Similarly, viral titres in Smurf1-/- cultures were significantly lower than WT BMDMs. This hints at a beneficial role of SMURF1 and K48-dependent ubiquitination in the noroviral lifecycle. This was further confirmed when WT BMDMs treated with the proteasome inhibitor MG132 showed significantly reduced MNoV_S99 production.Taken together, our data shed light on a beneficial role of the proteasomal activity in maintaining a permissive environment for the propagation of the S99 mouse norovirus strain

Les courts ARN non codants tels que les microARN, les piARN et les siARN sont de petites molécules d’ARN de 20 à 30 nucléotides de long qui sont très bien conservées au cours de l’évolution. Elles s’associent à des protéines Argonautes afin de former un complexe effecteur appelé RISC (RNA induced silencing complex). Ces courtes séquences, ne codant pour aucune protéine, agissent comme de puissants régulateurs de l’expression des gènes. De nombreuses évidences supportent qu’une dérégulation du niveau d’expression de ces courts ARN non codants contribue au développement et au maintien de nombreuses pathologies telles que le cancer. De ce fait, il est essentiel pour la cellule de contrôler la stabilité des courts ARN non codants. Le contrôle de la maturation et de la stabilité de ces courts ARN non codants sont des mécanismes peu connus. L’objectif principal de mon doctorat a donc été de mieux comprendre comment le niveau des courts ARN non codants est contrôlé. Afin d’étudier plus en détail comment le niveau des microARN est régulé, nous avons identifié la phosphatase PPM-2 (PP2Cα chez l’humain) et l’E3 ubiquitine ligase HECD-1 (HectD1 chez l’humain) comme étant de nouveaux interacteurs du complexe de dégradation des microARN. Nous avons utilisé des approches de génétique et de biologie moléculaire chez le nématode C. elegans, pour étudier le rôle de la perte de fonction de ppm-2 et d’hecd1 dans la voie des courts ARN non codants. Nos travaux ont montré que la perte de fonction de ppm-2 induit des défauts développementaux qui sont associés à des défauts de la voie des microARN. De plus, l’absence de ppm-2 exacerbe les phénotypes développementaux observés dans des animaux où la voie des microARN est altérée. De manière intéressante, chez le mutant ppm-2, nous avons constaté que d’autres voies de courts ARN non codants, telles que la voie des piARN et celle de l’endosiARN nucléaire, sont affectées. Du point de vue moléculaire, nous avons observé une déstabilisation du niveau d’expression de plusieurs protéines Argonautes dans le mutant ppm-2. En effet, ces dernières sont envoyées à la dégradation par la voie du protéasome seulement chez des animaux mutés pour ppm-2. Concernant l’étude de HECD1, nous avons remarqué que la perte de fonction de cette ubiquitine ligase entrainait une diminution de la progéniture et une létalité embryonnaire attribuable à des défauts dans la gamétogénèse. De plus, nous avons observé une accumulation de miARN fonctionnels chez des animaux mutés pour hecd-1. L’ubiquitine ligase HECD-1 pourrait être impliquée dans la transcription ou la dégradation des miARN. En conclusion, nos résultats suggèrent que PPM-2 permet de contrôler la stabilité des protéines Argonautes en les dirigeant dans une voie alternative de dégradation et que l’ubiquitine ligase HECD-1 pourrait être impliquée dans la régulation des miARN en modulant leur transcription ou leur dégradation. Mes travaux de doctorat nous ont permis de mettre en lumière un nouveau modulateur des courts ARN non codants, PPM-2, qui agit via le contrôle de la régulation des Argonautes. Les avancées de la recherche dans le domaine des courts ARN non codants pourra permettre le développement de nouvelles thérapies.<br>Les courts ARN non codants tels que les microARN, les piARN et les siARN sont de petites molécules d’ARN de 20 à 30 nucléotides de long qui sont très bien conservées au cours de l’évolution. Elles s’associent à des protéines Argonautes afin de former un complexe effecteur appelé RISC (RNA induced silencing complex). Ces courtes séquences, ne codant pour aucune protéine, agissent comme de puissants régulateurs de l’expression des gènes. De nombreuses évidences supportent qu’une dérégulation du niveau d’expression de ces courts ARN non codants contribue au développement et au maintien de nombreuses pathologies telles que le cancer. De ce fait, il est essentiel pour la cellule de contrôler la stabilité des courts ARN non codants. Le contrôle de la maturation et de la stabilité de ces courts ARN non codants sont des mécanismes peu connus. L’objectif principal de mon doctorat a donc été de mieux comprendre comment le niveau des courts ARN non codants est contrôlé. Afin d’étudier plus en détail comment le niveau des microARN est régulé, nous avons identifié la phosphatase PPM-2 (PP2Cα chez l’humain) et l’E3 ubiquitine ligase HECD-1 (HectD1 chez l’humain) comme étant de nouveaux interacteurs du complexe de dégradation des microARN. Nous avons utilisé des approches de génétique et de biologie moléculaire chez le nématode C. elegans, pour étudier le rôle de la perte de fonction de ppm-2 et d’hecd1 dans la voie des courts ARN non codants. Nos travaux ont montré que la perte de fonction de ppm-2 induit des défauts développementaux qui sont associés à des défauts de la voie des microARN. De plus, l’absence de ppm-2 exacerbe les phénotypes développementaux observés dans des animaux où la voie des microARN est altérée. De manière intéressante, chez le mutant ppm-2, nous avons constaté que d’autres voies de courts ARN non codants, telles que la voie des piARN et celle de l’endosiARN nucléaire, sont affectées. Du point de vue moléculaire, nous avons observé une déstabilisation du niveau d’expression de plusieurs protéines Argonautes dans le mutant ppm-2. En effet, ces dernières sont envoyées à la dégradation par la voie du protéasome seulement chez des animaux mutés pour ppm-2. Concernant l’étude de HECD1, nous avons remarqué que la perte de fonction de cette ubiquitine ligase entrainait une diminution de la progéniture et une létalité embryonnaire attribuable à des défauts dans la gamétogénèse. De plus, nous avons observé une accumulation de miARN fonctionnels chez des animaux mutés pour hecd-1. L’ubiquitine ligase HECD-1 pourrait être impliquée dans la transcription ou la dégradation des miARN. En conclusion, nos résultats suggèrent que PPM-2 permet de contrôler la stabilité des protéines Argonautes en les dirigeant dans une voie alternative de dégradation et que l’ubiquitine ligase HECD-1 pourrait être impliquée dans la régulation des miARN en modulant leur transcription ou leur dégradation. Mes travaux de doctorat nous ont permis de mettre en lumière un nouveau modulateur des courts ARN non codants, PPM-2, qui agit via le contrôle de la régulation des Argonautes. Les avancées de la recherche dans le domaine des courts ARN non codants pourra permettre le développement de nouvelles thérapies.<br>Small non-coding RNAs, like microRNAs, piRNAs or siRNAs, are small RNA molecules, 20 to 30 nucleotides long that are conserved during evolution. They form an induced silencing complex (RISC) in association with Argonaute proteins to regulate gene expression. Small non-coding RNAs are involved in the regulation of genes implicated in cell proliferation, differentiation and development. Many evidences support that deregulation of the expression level of those small non-coding RNAs contribute to the development of pathologies such as cancer. It is therefore essential for cells to control small non-coding RNA stability. The control of maturation and stability of those small molecules are poorly understood. The main objective of my doctorate was to better understand how the stability of small non-coding RNAs is controlled. In order to study in more detail how miRNAs are regulated, we identified two factors involved in miRNA turnover in C. elegans. We found that the phosphatase PPM-2 (PP2Cα in human) and the E3 ubiquitin ligase HECD-1 (HectD1 in human) are new components of the miRNA degradation complex. Using the power of the nematode C. elegans and molecular biology, we characterized the role of the loss of function of PPM-2 and HECD-1 in small non-coding RNA pathways. Loss of this phosphatase induces developmental defects which are associated with a defect in the miRNA pathway. Genetically, the phosphatase mutant exacerbates the phenotypes that are observed in animals where the miRNA pathway is affected. Interestingly, we further observed that the loss of the phosphatase affects other small non-coding RNA pathways like the piRNA and the siRNA pathways. At the molecular level, we observed a decrease in the expression level of many Argonaute proteins in phosphatase mutant animals. Upon blocking proteasomal degradation with MG132, we noticed that Argonaute proteins are sent to proteasomal degradation in phosphatase mutant animals. Concerning HECD-1, we noticed that the loss of function of the E3 ubiquitin ligase leads to the decrease of progeny and embryonic lethality due to defects in gametogenesis. Moreover, we observed an accumulation of functional miRNAs. This protein can be implicated in transcription or turnover of miRNAs. VIIn conclusion, our data suggest that PPM-2 controls the stability of Argonaute proteins by sending them through an alternative degradation pathway and that HECD-1 could be implicated in miRNA regulation by modulating their transcription or degradation. My doctoral work helped to highlight a new modulator of small non-coding RNAs, PPM-2, which acts through the regulation of Argonaute protein. A better understanding of the mechanisms controlling the stability and the function of these strong regulators will be useful to develop new therapies.<br>Small non-coding RNAs, like microRNAs, piRNAs or siRNAs, are small RNA molecules, 20 to 30 nucleotides long that are conserved during evolution. They form an induced silencing complex (RISC) in association with Argonaute proteins to regulate gene expression. Small non-coding RNAs are involved in the regulation of genes implicated in cell proliferation, differentiation and development. Many evidences support that deregulation of the expression level of those small non-coding RNAs contribute to the development of pathologies such as cancer. It is therefore essential for cells to control small non-coding RNA stability. The control of maturation and stability of those small molecules are poorly understood. The main objective of my doctorate was to better understand how the stability of small non-coding RNAs is controlled. In order to study in more detail how miRNAs are regulated, we identified two factors involved in miRNA turnover in C. elegans. We found that the phosphatase PPM-2 (PP2Cα in human) and the E3 ubiquitin ligase HECD-1 (HectD1 in human) are new components of the miRNA degradation complex. Using the power of the nematode C. elegans and molecular biology, we characterized the role of the loss of function of PPM-2 and HECD-1 in small non-coding RNA pathways. Loss of this phosphatase induces developmental defects which are associated with a defect in the miRNA pathway. Genetically, the phosphatase mutant exacerbates the phenotypes that are observed in animals where the miRNA pathway is affected. Interestingly, we further observed that the loss of the phosphatase affects other small non-coding RNA pathways like the piRNA and the siRNA pathways. At the molecular level, we observed a decrease in the expression level of many Argonaute proteins in phosphatase mutant animals. Upon blocking proteasomal degradation with MG132, we noticed that Argonaute proteins are sent to proteasomal degradation in phosphatase mutant animals. Concerning HECD-1, we noticed that the loss of function of the E3 ubiquitin ligase leads to the decrease of progeny and embryonic lethality due to defects in gametogenesis. Moreover, we observed an accumulation of functional miRNAs. This protein can be implicated in transcription or turnover of miRNAs. VIIn conclusion, our data suggest that PPM-2 controls the stability of Argonaute proteins by sending them through an alternative degradation pathway and that HECD-1 could be implicated in miRNA regulation by modulating their transcription or degradation. My doctoral work helped to highlight a new modulator of small non-coding RNAs, PPM-2, which acts through the regulation of Argonaute protein. A better understanding of the mechanisms controlling the stability and the function of these strong regulators will be useful to develop new therapies.

L'ubiquitination joue un rôle clé dans le maintien de l'homéostasie cellulaire en régulant la fonction et/ou la dégradation des protéines. Les E3 ubiquitine ligases sont les acteurs clés du mécanisme d'ubiquitination en transférant la molécule d'ubiquitine sur le substrat. Parmi les E3 ubiquitine ligases, WWP1 est fréquemment amplifiée dans de nombreux cancers, notamment les cancers mammaires, et est associée à un mauvais pronostic. En accord avec ces observations, WWP1 favorise la survie et la prolifération cellulaire et inhibe l'apoptose. Mes travaux de thèse ont permis d'identifier la protéine CYYR1, qui n'avait jusqu'à ce jour pas de fonction cellulaire connue, comme étant un nouveau régulateur de la E3 ubiquitine ligase WWP1. Nous montrons que CYYR1 interagit avec WWP1 de façon PY/WW-dépendante au niveau des endosomes tardifs, et que cette interaction conduit à l'induction de l'auto-polyubiquitination en chaîne K63 de WWP1 et à sa dégradation lysosomale. Par ailleurs, nous observons que la protéine à domaine UIM, ANKRD13A, lie CYYR1 et la forme polyubiquitinée de WWP1 et est impliquée dans la dégradation de WWP1 induite par CYYR1. De plus, nous montrons que l'expression de CYYR1 limite la croissance des cellules cancéreuses mammaires dépendante et indépendante d'ancrage via ses motifs PY. Enfin, nous observons que l'expression de CYYR1 est diminuée dans les cancers mammaires et associée à un pronostic favorable. Ensemble, mes travaux de thèse ont permis de mettre en évidence un nouveau mécanisme de régulation de la E3 ubiquitine ligase WWP1 impliquée dans la tumorigenèse<br>Ubiquitination plays a crutial role in cellular homeostasis by regulating the function and/or the degradation of proteins. E3 ubiquitin ligases are key component of the ubiquitination reaction by transferring the ubiquitin molecule on the substrate. Among E3 ubiquitin ligases, WWP1 is frequently amplified in numerous cancers, such as breast cancers, and associated with poor prognosis. Consistent with these observations, WWP1 stimulates cell proliferation and survival and inhibits apoptosis. My thesis works led to identify the protein CYYR1, which as to date no know cellular function, as a novel regulator for the E3 ubiquitin ligase WWP1. We show that CYYR1 interacts with WWP1 in a PY/WW-dependent manner at late endosomes and that this interaction leads to induce the K63-linked auto-polyubiquitination of WWP1 resulting to its lysosomal degradation. Furthermore, we observe that the UIM-containing protein ANKRD13A binds CYYR1 and the polyubiquitinated form of WWP1 and is implicated in CYYR1-mediated WWP1 degradation. Moreover, we show that CYYR1 limits breast cancer anchorage-dependent an independent cell growth via its PY motifs. Finally, we highlight that CYYR1 expression is decreased in breast cancer and is associated with beneficial clinical outcome. Taken together, my thesis works describe a novel mechanism of regulation for the E3 ubiquitin ligase WWP1 implicated in tumorigenesis

Les facteurs de transcription NFAT (facteur nucléaire des cellules T activées) jouent un rôle physiologique important dans le développement et le fonctionnement de nombreux organes, notamment dans le système immunitaire et le système nerveux. Par conséquent, leur dérégulation a été impliquée dans diverses maladies humaines telles que le cancer, les maladies neurodégénératives et les maladies auto-immunes. La régulation de l'activité de NFAT par translocation nucléo-cytoplasmique a été largement étudiée. En revanche, la régulation du niveau protéique de NFAT par le système ubiquitine-protéasome est encore mal comprise. Pourtant, les protéines NFAT ont une durée de vie courte et la régulation de leur stabilité est donc essentielle pour le contrôle de leur activité.Dans une étude précédente, mon groupe a montré que l'E3 ubiquitine-ligase Trim17 se lie à NFATc3 mais ne favorise pas son ubiquitination et tend plutôt à stabiliser la protéine. Les résultats préliminaires obtenus suggéraient que Trim39, un partenaire de Trim17, pourrait être une E3 ubiquitine-ligase pour NFATc3 et que la SUMOylation de NFATc3 modulait sa stabilité. L'objectif de ma thèse était donc de comprendre les mécanismes par lesquels Trim39, Trim17 et SUMO régulent la stabilité de NFATc3.Au cours de ma thèse, j'ai caractérisé Trim39 comme une E3 ubiquitine-ligase de NFATc3. En effet, mes résultats indiquent que la surexpression de Trim39, mais pas de son mutant inactif, induit l'ubiquitination de NFATc3 dans les cellules. En revanche, la déplétion de Trim39 endogène diminue le niveau d'ubiquitination de NFATc3. La protéine Trim39 recombinante induit directement l'ubiquitination de NFATc3 in vitro. De plus, la surexpression de Trim39 diminue les niveaux protéiques de NFATc3 alors que la déplétion de Trim39 les augmente. J'ai également montré que Trim17 inhibe l'ubiquitination de NFATc3 induite par Trim39, à la fois dans les cellules et in vitro. Trim17 agit à la fois en réduisant l'activité E3 ubiquitine-ligase intrinsèque de Trim39 et en empêchant l'interaction entre NFATc3 et Trim39. En outre, j'ai montré qu'un mutant de NFATc3 ne pouvant être SUMOylé est moins ubiquitiné et plus stable que la forme sauvage de NFATc3, ce qui suggère que la SUMOylation de NFATc3 est importante pour son ubiquitination et sa dégradation. En outre, j'ai identifié un motif d'interaction à SUMO (SIM) dans la séquence de Trim39, par lequel Trim39 lie les polymères de SUMO2. La mutation de ce SIM dans Trim39 ou des sites consensus de SUMOylation dans NFATc3 diminue l'interaction entre Trim39 et NFATc3, et l'ubiquitination de NFATc3 induite par Trim39. Ces résultats suggèrent fortement que Trim39 reconnaît et ubiquitine préférentiellement les formes SUMOylées de NFATc3 et agit donc comme une « E3 ubiquitine-ligase guidée par SUMO » (STUbL) pour NFATc3. Enfin, nous avons mesuré l'impact de ces mécanismes sur la fonction physiologique de NFATc3. J'ai tout d'abord montré que Trim39 diminue l'activité transcriptionnelle de NFATc3. En outre, à l'aide de cultures primaires de neurones granulaires du cervelet, nous avons montré que la mutation des sites de SUMOylation de NFATc3 et la déplétion de Trim39 endogène aggravent l'apoptose neuronale, probablement en stabilisant la protéine NFATc3. En conclusion, l’ensemble de mes données indiquent que Trim39 module l'apoptose neuronale en agissant comme une STUbL pour NFATc3 et en contrôlant sa stabilité<br>NFAT (Nuclear factor of activated T cells) transcription factors play important physiological roles in the development and function of many organs, notably in the immune system and nervous system. As a consequence, their dysregulation has been implicated in various human diseases such as cancer, neurodegenerative diseases, and auto-immune diseases. The regulation of NFAT activity by calcium-dependent nuclear-cytoplasmic shuttling has been extensively studied. In contrast, the regulation of NFAT protein level by the ubiquitin-proteasome system is still poorly understood. However, NFATs are short-lived proteins and regulation of their stability is critical for controlling their activity.In a previous study, my group has shown that the E3 ubiquitin-ligase Trim17 binds NFATc3 but does not promote its ubiquitination and rather stabilizes it. Preliminary results suggested that Trim39, a partner of Trim17, might be an E3 ubiquitin-ligase for NFATc3 and that SUMOylation of NFATc3 might modulate its stability. Therefore, the goal of my PhD was to understand the mechanisms through which Trim39, Trim17, and SUMO regulate the stability of NFATc3.During my PhD, I have characterized Trim39 as an E3 ubiquitin-ligase of NFATc3. Indeed, my results indicate that overexpression of Trim39, but not its inactive mutant, induces the ubiquitination of NFATc3 in cells. In contrast, silencing of endogenous Trim39 decreases the ubiquitination level of NFATc3. Recombinant Trim39 directly induces the ubiquitination of NFATc3 in vitro. Moreover, overexpression of Trim39 decreases the protein levels of NFATc3 whereas the silencing of Trim39 increases it. I have also shown that Trim17, which can bind Trim39, inhibits Trim39-mediated ubiquitination of NFATc3, both in cells and in vitro. Trim17 acts by both reducing the intrinsic E3 ubiquitin-ligase activity of Trim39 and by preventing the interaction between NFATc3 and Trim39. Furthermore, I found that a SUMOylation-deficient mutant of NFATc3 is less ubiquitinated and more stable than the wild type NFATc3, suggesting that SUMOylation of NFATc3 is important for its ubiquitination and degradation. Importantly, I identified one SUMO interacting motif (SIM) in the sequence of Trim39 through which Trim39 binds SUMO2 polymers via one of these SIMs. Mutation of this SIM in Trim39 or SUMOylation consensus sites in NFATc3 decreased the interaction between Trim39 and NFATc3, and the ubiquitination of NFATc3 mediated by Trim39. These results strongly suggest that Trim39 binds and ubiquitinates preferentially the SUMOylated forms of NFATc3 and therefore acts as a SUMO-targeted E3 ubiquitin-ligase (STUbL) for NFATc3. Finally, we have measured the impact of these mechanisms on the physiological function of NFATc3. I first found that Trim39 decreases the transcriptional activity of NFATc3. Furthermore, using primary cultures of cerebellar granule neurons as a model, we have shown that the mutation of the SUMOylation sites of NFATc3 and silencing of endogenous Trim39 enhances neuronal apoptosis, probably by stabilizing the NFATc3 protein. Taken together, these data indicate that Trim39 modulates neuronal apoptosis by acting as a STUbL for NFATc3 and by controlling its stability

La division cellulaire est l’un des processus cellulaires les plus complexes. Pour que cette division se déroule correctement, la cellule doit répliquer de manière fiable l’intégralité de son génome. Durant ce processus, la réplication de l’ADN est initiée a des sites prédéfinis du génome, appelés « origines de réplication ». Vu qu’un dysfonctionnement de l'activité des origines est lié à plusieurs pathologies humaines, leur activation doit être hautement régulée. Plusieurs protéines ont été trouvées aux origines de la réplication, mais aucune n’explique comment ces origines sont reconnues et sélectionnées pour l’activation. Notre groupe de recherche vise à comprendre comment les origines de réplication sont régulées dans les cellules de métazoaires. Dans ce but, une approche protéomique a été réalisée pour définir l'interactome des origines de réplication humaine, dans l’objectif d'identifier de nouveaux facteurs qui pourraient être impliqués dans la régulation des origines. À l'aide de cette approche, une nouvelle ubiquitine ligase, nommée OBI1 (ORC-ubiquitine-ligase-1), a été identifiée avant mon arrivée au laboratoire. OBI1 se lie au complexe de reconnaissance des origines (complexe ORC) et mon projet vise à mieux caractériser le rôle de cette nouvelle protéine dans la réplication de l'ADN. Notre stratégie expérimentale est basée sur deux modèles différents: un modèle in vivo de cellules humaines en culture et un système de réplication de l'ADN in vitro dérivé d'œufs de Xénope.Nos analyses sur des cellules humaines ont d’abord révélé qu’OBI1 était crucial pour la prolifération cellulaire. Cette observation a été ensuite attribuée à son rôle dans la réplication de l’ADN et plus précisément dans l’activation des origines de réplication. En effet, la déplétion d’OBI1 a montré une diminution de recrutement à la chromatine de facteurs impliqués dans l’activation des origines. De plus, une analyse fonctionnelle a montré qu'OBI1 multiubiquitine ORC3 et ORC5, deux sous-unités du complexe ORC. Cette ubiquitination a été ensuite liée au rôle d’OBI1 dans l’activation des origines de réplication, après que la surexpression des mutants ORC3 / 5 non-ubiquitinables ait donné des résultats similaires à ceux observés lors de la déplétion d’OBI1. Dans l’ensemble, nos résultats ont démontré qu’OBI1 est une protéine essentielle à l’activation des origines et nous ont permis de mettre en place une hypothèse suggérant qu’en ubiquitinant ORC3/5, OBI1 pourrait jouer un rôle dans la sélection des origines destinées à l’activation, parmi toutes les origines définies antérieurement. Après cette étude, maintenant publiée, nous avons voulu aborder le rôle de la multiubiquitination des ORC dans l’activation des origines. Nos expériences préliminaires suggèrent un rôle de l'histone acétyl-transférase (HAT) GCN5 / KAT2A.Dans la deuxième partie de mon projet, nous avons utilisé le système in vitro, basé sur des extraits d'œufs de xénope, pour étudier le rôle de l'OBI1 et de l'ubiquitination dans l'activation des origines de réplication. Nos analyses ont confirmé la conservation d’OBI1 chez Xenopus Laevis et son recrutement a la chromatine lors de la réplication. Nous avons montré que l'ubiquitination se produit sur la chromatine lors de l'activation de l'origine. De plus, en utilisant des inhibiteurs de E1, nous avons constaté que l’ubiquitination est importante pour l’activation des origines. De façon intéressante, la déplétion de OBI1 dans ce système embryonnaire a suggéré un rôle diffèrent d’OBI1 dans l’activation des origines dans le système embryonnaire comparé aux conditions plus somatiques.Finalement, la découverte de ce nouveau facteur d'initiation a fourni des informations essentielles sur le rôle de l'ubiquitination et d’OBI1 dans l'activation et la sélection des origines de réplication. Une telle sélection pourrait également participer à la régulation du « timing » de la réplication de l'ADN<br>Cell division is one of the most complex processes a cell undergoes. For this to happen properly, the genetic material stored in a cell must be faithfully copied or replicated. During this process, DNA replication is initiated at pre-defined sites in the genome, called "origins of replication". The activation of these origins is highly regulated, as a dysfunction in origin activity is linked to several human pathologies. Several proteins have been found at replication origins, but none of them explain how to be activated origins are recognized and selected. Our research group aims to understand how DNA replication origins are regulated in metazoan cells, to this aim, a proteomic approach was performed to define the interactome of human replication origins. Our goal was to identify new factors that could be involved in replication origin regulation. Using this methodology, a novel E3 ubiquitin ligase, named OBI1 (for ORC-ubiquitin-ligase-1), was identified prior to my arrival in the laboratory. OBI1 binds the origin recognition complex (ORC complex) and my project aimed at further characterizing the role of this new protein in DNA replication. Our experimental strategy used two different model systems: an in-vivo model based on human cells in culture, and an in-vitro DNA replication system derived from Xenopus eggs.Our analyses in human cells revealed that OBI1 was a crucial gene involved in cellular proliferation, this observation was later attributed to OBI1’s role in DNA replication and more specifically, to replication origin activation. Indeed, OBI1 knockdown resulted in a deficient origin firing and a decrease in the chromatin recruitment of factors involved in origin firing. A further functional analysis showed that OBI1 multiubiquitylates two subunits of the ORC complex, ORC3 and ORC5. This ubiquitylation was directly linked to OBI1’s role in origin firing, after the over-expression of non-ubiquitylable ORC3/5 mutants yielded similar results to OBI1’s knock down. Altogether, our results demonstrated that OBI1 encoded for a protein essential for origin activation, and allowed us to propose its main role: by multiubiquitylating a subset of the ORC complex, OBI1 could select the replication origins to be activated amongst all the potential replication origins set in G1 phase of the cell cycle. After this set of experiments, now published, we wanted to address the mechanistic impact of the multiubiquitylation of ORC on origin activation. Our preliminary experiments suggest a role of the histone acetyl-transferase (HAT) GCN5/KAT2A in the “OBI1 pathway”In the second part of my project, we used the in vitro DNA replication system, based on Xenopus laevis egg extracts, to study the role of OBI1 and ubiquitylation in origin activation. Our in-vitro analyses confirmed the conservation of OBI1 in Xenopus Laevis and its recruitment to the chromatin during DNA replication. We showed that de novo ubiquitylation takes place on chromatin during origin activation. Moreover, using E1 inhibitors, we found that active ubiquitylation is important for efficient origin firing. Interestingly, our loss of function experiments suggested that OBI1’s impact on origin activation could defer in early development when compared to somatic-like conditions.Taken together, the discovery of this new replication initiation factor provided key information on the role of ubiquitylation in general and OBI1 in particular on origin activation and selection. Such selection could participate as well in the regulation of the timing of DNA replication

Les modifications post-traductionnelles des protéines (phosphorylation, l'acétylation ou l'ubiquitinylation) permettent de réguler leur activité, stabilité, localisation ou interactions avec d'autres facteurs. Les complexes permettant la modification par l'ubiquitine ou Sumo bien que d'organisation similaire sont composés de protéines différentes : une ligase El qui active le résidu, une ligase E2 permettant le transfert de l'ubiquitine sur le substrat et une ligase E3 qui assure la spécificité de reconnaissance du substrat. Plusieurs familles de ligases E3 ont été décrites mais seule la famille de protéines à domaine RING Finger présente des membres impliqués dans les complexes de la sumoylation et de l'ubiquitinylation. Afin de caractériser de nouveaux partenaires des ligases à domaine RING Finger hSIAHl et hSIAH2 (human Seven In Absentia homolog), nous avons développé une expérience de double-hybride chez la levure en utilisant hSIAH2 pour appât. La caractérisation des partenaires ainsi isolés a fait l'objet de mon projet de thèse. J'ai mis en évidence des protéines impliquées dans l'ubiquitinylation (Ubiquitine, Ubc5 ou hSIAH) et la sumoylation (PIAS, SUMO et Ubc9). J'ai ainsi démontré que hSIAH2 est capable de former des homodimères et des hétérodimères avec hSIAH et que cette dimérisation permet de réguler la propre stabilité des deux protéines. D'autre part, j'ai montré que hSIAH2 catalyse l'ubiquitinylation de PIAS et sa dégradation par le protéasome. L'ensemble de ce travail a mis en évidence le rôle spécifique de hSIAH2 dans la régulation de la stabilité d'intermédiaires essentiels, à la fois, aux complexes d'ubiquitinylation et de sumoylation<br>After synthesis, proteins are targeted to post-translational modifications such as acetylation, phosphorylation or ubiquitination. These mechanisms regulate their function, stability, localization or interaction with partners. Modification process by ubiquitin or sumo named ubiquitination or sumoylation respectively involve complexes with similar organization but compose of different enzymes. Their organization relies on Sumo or ubiquitin activating El enzyme, transferring E2-ligase and E3-ligase or sub-complex conferring the substrate specific récognition. El-ligase is unique for each complex, whereas E2 and E3-ligases are multiple. Among E3-ligase families, RING Finger protein family only has been involved in both modifications complexes. Two human homologs of Drosophila Seven In Absentia (hSIAHl et hSIAH2), belong to RING Finger E3-ligase family. In a yeast two hybrid assay, we have identified new SIAH interacting proteins. Their characterization has been the purpose of my PhD project. We have characterized partners implicated in both ubiquitination (ubiquitin, Ubc5 or hSIAH) and sumoylation (Sumo, Ubc9 and PIAS) pathways. In a first attempt, I have demonstrated that hSIAH proteins can form homo- or hetero-dimers. Dimerization régulates their stability via a proteasome dependent degradation. I have also demonstrated that hSIAH2 catalyzes the proteasome dependent degradation of PIAS1, a sumo E3-ligase. Altogether this study evidences an important rôle for hSIAH2 in the regulation of the stability of ubiquitination and sumolation complexes

La GTPase Rac1 est une protéine de signalisation intracellulaire qui joue notamment un rôle clé dans la prolifération cellulaire. Notre laboratoire a montré que la toxine CNF1, produite par les Escherichia coli pathogènes, catalyse l’activation de Rac1. Nous avons également identifié le rôle de la E3 ubiquitine-ligase HACE1, un suppresseur de tumeur avéré, dans la régulation par ubiquitylation de Rac1 actif. S’il est prouvé que la forme activée de Rac1 est une cible d’HACE1, le mode d’interaction de ces deux protéines reste à définir ainsi que le rôle de ces interactions dans l’infection et le cancer. L’objectif de mon travail a été de caractériser les interactions moléculaires entre HACE1 et Rac1. Nous avons testé l’hypothèse que des mutations ponctuelles d’HACE1 identifiées dans les cancers pourraient interférer avec son interaction avec Rac1 et sa capacité de contrôle de la croissance cellulaire. J’ai ainsi pu mettre en évidence que 13 mutations somatiques d’HACE1 issues de tumeurs séquencées altèrent sa fonction de contrôle de la croissance cellulaire. De plus, l’étude de ces mutations nous a permis d’identifier un groupe d’acides aminés, situés sur les ankyrin-repeats 5 à 7 d’HACE1, qui contrôle l’interaction d’HACE1 avec Rac1 et de ce fait son ubiquitylation. Enfin dans cette étude nous précisons le rôle du domaine intermédiaire d’HACE1 (MID) dans la spécificité d’interaction de la ligase avec la forme active de Rac1. In fine, la caractérisation de mutants d’interaction entre HACE1 et Rac1 ainsi que l’effet de la toxine CNF1 sur cet axe de signalisation doit nous renseigner sur l’importance de cette voie de régulation dans le cancer et l’infection<br>The small GTPase Rac1 plays a key role in various intracellular signaling pathways including cell proliferation. Our laboratory has shown that the CNF1 toxin, produced by pathogenic Escherichia coli, catalyzes the activation of Rac1. We also identified the role of the E3 ubiquitin-ligase HACE1, a tumor suppressor, in the regulation by ubiquitylation of active Rac1. If the activated form of Rac1 is proved to be a target of HACE1, the mode of interaction between these two proteins remains to be define as well as the role of these interactions in infection and cancer. The aim of my work was to characterize the molecular interactions between HACE1 and Rac1. We tested the hypothesis that HACE1 point mutations identified in cancers could interfere with its interaction with Rac1 and its ability to control cell growth. We showed that 13 cancer-associated somatic mutations of HACE1, led to a defective control of cell proliferation. Moreover, the study of these mutations allowed us to identify a group of amino acids, located on the ankyrin-repeats 5 to 7 of HACE1, which controls the interaction of HACE1 with Rac1 and thus its ubiquitylation. We also identified a role for the intermediate domain of HACE1 (MID) in conferring the specificity of association of HACE1 to the active form of Rac1. Ultimately, the characterization of interaction mutants between HACE1 and Rac1 as well as the effect of the CNF1 toxin on this signaling axis will give us more insight on this regulatory pathway in cancer and infection

L’incidence du mélanome a augmenté de façon considérable lors des trente dernières années avec un doublement tous les dix ans. Le mélanome ne représente que 5% des cancers cutanés mais entraîne 80% de décès, ce qui constitue un problème majeur de santé publique. En effet, cette tumeur est extrêmement agressive et possède un fort potentiel métastatique. Dès l’apparition de métastases, le pronostic vital devient fortement défavorable. Malgré des avancées thérapeutiques majeures, de nombreux patients sont encore réfractaires à ces nouveaux traitements. La compréhension des mécanismes impliqués dans le développement de cette tumeur reste donc un enjeu de premier ordre. Le séquençage d'exomes a conduit à l'identification d'une mutation dans le gène RAC1 (la mutation P29S) constituant une des mutations somatiques les plus fréquentes dans le mélanome (après les mutations BRAFV600, NRASQ61 et NF1). RAC1 est une petite GTPase qui fonctionne dans plusieurs processus cellulaires. Dans des conditions physiologiques, l'activité de RAC1 est principalement contrôlée par des protéines activatrices de l'activité GTPase (GAPs) et des facteurs d'échange Nucléotidique (GEF). GAPs et GEFs contrôlent le niveau de RAC1-GTP et régulent donc son activité. L'activité de RAC1 est aussi dépendante de son niveau d'expression protéique qui est contrôlé par des E3 ubiquitine ligases, parmi lesquelles HACE1. HACE1 est considérée comme un suppresseur de tumeur. De façon inattendue, les données obtenues montrent clairement que HACE1 favorise les propriétés migratoires et tumorigéniques des cellules de mélanome<br>Melanoma incidence has considerably increased over the last thirty years, with a doubling every ten years. Melanoma accounts for only 5% of cutaneous cancers but causes more than 80% of deaths, which is a major public health problem. Indeed, this tumor is extremely aggressive and has a high metastatic potential. After the onset of metastases, the prognosis becomes highly unfavorable. Despite major therapeutic advances, many patients are still refractory to these new treatments. Understanding the mechanisms involved in the development of this tumor and the identification of new therapies remain a major issue. The sequencing of exomes led to the identification of a mutation in the RAC1 gene (P29S) constituting one of the most frequent somatic mutations in melanoma (after the BRAFV600, NRASQ61 and NF1 mutations). RAC1 is a small GTPase that is involved in several key cellular processes. Under physiological conditions, the activity of RAC1 is mainly controlled by GTPase activating proteins (GAPs) and Nucleotide Exchange (GEF) exchange factors. GAPs and GEFs control the level of RAC1- GTP and thus regulate its activity. The activity of RAC1 is also dependent on its protein level of expression which is controlled by E3 ubiquitin ligases, including HACE1. HACE1 is considered a tumor suppressor. Unexpectedly, our data clearly show that HACE1 promotes migratory and tumorigenic properties of melanoma cells. Indeed, inhibition of HACE1 alters migration of melanoma cells in vitro, as well as in vivo pulmonary colonization in mice. Transcriptomic analysis of 4 melanoma cell lines demonstrated that HACE1 suppression inhibits ITGAV and ITGB1 expression

Les cellules différenciées peuvent changer de destin cellulaire de manière induite ou naturelle. Afin de comprendre et connaître les acteurs et mécanismes contrôlant les processus de reprogrammation, notre laboratoire étudie le changement d'identité (ou transdifférenciation, Td) naturel d’une cellule épithéliale rectale (nommée Y) en motoneurone (nommé PDA) chez Caenorhabditis elegans. Les travaux préliminaires ont montré qu’il existe une synergie entre les modifications d’histone (jmjd-3.1 et wdr-5.1) et l’ubiquitination (sel-10). SEL-10 est une ubiquitine ligase E3 possédant un domaine Fbox et une répétition de domaines WD40. Dans cette étude, nous avons pu mettre en évidence : i) une implication du domaine Fbox, des indications sur la localisation intracellulaire de SEL-10 et un rôle inattendu du protéasome au sein de la Td. ii) un rôle de SEL-10 dans la robustesse de la Td (résistance aux stress environnementaux). iii) sel-10, jmjd-3.1 et wdr-5.1 agissent sur la transcription de gènes impliqués dans la transdifférenciation (testé par smFISH). Ainsi qu’une caractérisation du motif d’expression marqueur de Td cog-1 au cours de la redifférenciation<br>Differentiated cells can change their cellular fate induced or naturally. In order to understand the mechanisms controlling reprogramming processes, our laboratory is studying the natural change in identity (or transdifferentiation, Td) of a rectal epithelial cell (named Y) and motor neuron (named PDA) in Caenorhabditis elegans.Preliminary work has shown that there is a synergy between histone modifications (jmjd-3.1 and wdr-5.1) and ubiquitination (sel-10). SEL-10 is an E3 ubiquitin ligase with a Fbox domain and WD40 repeat domain.In this study, we highlight: i) the Fbox domain involvement in the Td, indications about the intracellular localization of SEL-10 and an unexpected role of the proteasome within TD. ii) a role of SEL-10 in the robustness of the Td. iii) sel-10, jmjd-3.1 and wdr-5.1 act on gene transcription in transdifferentiation. This one was tested by smFISH and allowed the characterization of the cog-1 transdifferentiation marker expression pattern during redifferentiation

La dégradation des protéines dépendante de l'ubiquitine est une voie de protéolyse contrôlée cruciale chez les Eucaryotes dont la spécificité est apportée par les E3 ubiquitine ligases impliquées dans la reconnaissance des protéines à polyubiquitinyler et donc dégradées par le protéasome. Au cours de ma thèse, j'ai développé une nouvelle stratégie d'identification de substrats d'E3 ubiquitine ligases par protéomique quantitative sans marquage, appliquée à l'étude d'ASB2alpha. La protéine ASB2alpha est la sous-unité de spécificité d'une E3 ubiquitine ligase exprimée dans les cellules hématopoïétiques capable d'induire la polyubiquitylation et donc la dégradation des filamines A et B (FLNa et FLNb). Après avoir démontré la pertinence de cette approche, nous avons mis en évidence la dégradation du troisième membre de la famille filamine, la FLNc. Cette nouvelle stratégie applicable à toutes les E3 ubiquitine ligases ciblant ses substrats au protéasome présente l'avantage d'être applicable à différents contextes physiologiques et de s'affranchir des difficultés rencontrées lors de l'utilisation des méthodes d'identification dites classiques. Par ailleurs, nous avons montré qu'ASB2alpha en induisant la dégradation des filamines, était un régulateur de la motilité cellulaire. De plus, nous avons établi les bases moléculaires de la reconnaissance de la FLNa par ASB2alpha. L'identification de leurs substrats et la caractérisation des mécanismes de leur reconnaissance apparaissent comme essentiels pour la compréhension de nombreux processus cellulaires et pathologiques<br>The ubiquitin-proteasome system is a central mechanism for controlled proteolysis that regulates numerous cellular processes in eukaryotes. E3 ubiquitin ligases are responsible for the specificity of this system. They provide platforms for binding specific substrates thereby coordinating their ubiquitination and subsequent degradation by the proteasome. We have developed a global proteomic strategy to identified E3 ubiquitin ligase substrates targeted to proteasomal degradation. The proof of principle of this strategy is provided by our results highlighting FLNa and FLNb as substrates of the ASB2alpha E3 ubiquitin ligase that is involved in hematopoiesis. Furthermore, we have shown that FLNc, the third member of the filamin family, is also a target of ASB2alpha. This study provides a new strategy for the identification of E3 ubiquitin ligase substrates that have to be degraded in physiologically relevant settings. We have also demonstrated that ASB2alpha, through degradation of FLNs, can regulate integrin-dependent cell motility. Moreover, structural and cell biology studies have unraveled the domain of ASB2α that is involved in the recruitment of its substrate, FLNa. This study has provided an original strategy to identify E3 ubiquitin ligase substrates targeted to degradation. Furthermore, our work has contributed to the understanding of the function and mechanisms of action of ASB2α in hematopoietic cells

Implication de ROQUIN dans la physiopathologie du lymphome T angio-immunoblastique. Le T-LAI est un lymphome T périphérique qui de part sa rareté bénéficie de peu d'études contrairement aux lymphomes B. En France, le T-LAI est le PTCL le plus fréquemment rencontré. Malgré une évolution clinique variable, le T-LAI reste une tumeur agressive dont la survie globale est inférieure à 3 ans. Un des objectifs de notre équipe est donc de mieux comprendre la physiopathologie de ce lymphome et d'identifier des évènements oncogéniques conduisant à son développement. Dans le cadre de ce projet, notre étude s'est portée sur le gène ROQUIN qui code une E3 ubiquitine ligase de la famille RING et dont la mutation est associée à l'apparition d'un syndrome proche du T-LAI chez la souris sanroque.Bien que nous n'ayons détecté aucune mutation dans la séquence codante de ROQUIN nous avons identifié un nouveau transcrit alternatif appelé ROQUIN ØE17. Celui-ci code une protéine qui, comme la forme sauvage, se localise dans les granules de stress et les corps P et interagit avec certains ARNm et micro-ARN. Néanmoins il est le seul à inhiber l'expression de la molécule de costimulation ICOS. ROQUIN ØE17, qui est présent en concentrations variables dans les différentes populations lymphocytaires T n'est quasiment pas exprimé dans les T-LAI. De ce fait, la perte du transcrit ROQUIN ØE17 pourrait participer à la genèse et/ou développement de ce lymphome<br>Implication of ROQUIN in the physiopathology of angio-immunoblastic T cell lymphoma. AITL is a peripheral T cell lymphoma, poorly studied compared to B cell lymphomas due to its rarity. In France, AITL is the PTCL the most frequently encountered. Despite a variable clinical course, AITL is an aggressive tumor with an overall survival lower than 3 years. One of our goal is to better understand the physiopathology of this lymphoma and identify oncogenic events that lead to its development. In this project, our study was focused on ROQUIN gene that encodes a RING E3 ubiquitin ligase and whose mutation induces an AITL-like syndrom in sanroque mice.Although we did not detect any mutation in ROQUIN coding sequence, we identified a novel alternative transcript referred as ROQUIN ØE17. It encodes a protein that, like wild type protein, localizes to stress granules and P bodies and interacts with mRNAs and microRNAs. However, only ROQUIN ØE17 inhibits the expression of the costimulatory molecule ICOS. This transcript, whose expression varies between T cell populations, is hardly expressed in AITL. Consequently, the loss of ROQUIN ØE17 could be involved in the genesis and/or development of this lymphoma

Une famille de petites protéines, appelée famille des molécules d'ubiquitine (Ubls), joue un rôle essentiel dans de nombreux aspects de la réponse au stress. Des défauts dans les composants de la famille de l'ubiquitine sont souvent retrouvés dans les pathologies, notamment dans certain type de cancer et les maladies neurodégénératives.L'une des Ubls qui présente le plus d'identité et de similarité avec l'Ubiquitine est NEDD8. NEDD8 fonctionne de manière similaire à Ub mais utilise un mécanisme de conjugaison distinct. La modification de NEDD8 est essentielle au maintien de l'homéostasie de la cellule car elle joue un rôle majeur dans la régulation de la viabilité, de la croissance et du développement. Pour cette raison, de nombreux composants de NEDD8 ont été dérégulés dans de nombreux cancers. NEDD8 peut modifier un large éventail de substrat protéique, et peut également s’auto-modifier entrainant la création de chaînes polyNEDD8. Récemment, la présence de chaînes polyNEDD8 a été liée à la régulation de la mort cellulaire - apoptose et parthanatos. De plus, il a été récemment rapporté que NEDD8 pendant un stress protéotoxique peut être employé par la machinerie de conjugaison Ub. Cela aboutit à la création de chaînes NEDD8 hybrides tels que NEDD8-Ub et NEDD8-SUMO. En effet, des articles récents ont montré que NEDD8 a non seulement la capacité de modifier Ub mais également SUMO-2. La présence des chaînes hybrides NEDD8 a été liée à la création d'agrégats nucléaires formés pendant le stress protéotoxique, ce qui peut jouer un rôle protecteur pendant l'exposition au stress.Connaissant l'importance de la régulation des protéines par la NEDDylation, nous étions également conscients du manque de connaissances sur le mécanisme qui joue un rôle dans la création et la déconjugaison des différentes entités NEDD8. Jusqu'à présent, deux enzymes déNEDDylantes ont été signalées, mais aucune enzyme n'a été testée pour sa capacité à reconnaître et à traiter les chaînes hybrides NEDD8. De plus, nos connaissances sur les ligases E3 responsables de la NEDDylation du substrat, bien qu'en expansion, sont encore très limitées. De plus, étant donné que NEDD8 peut s’auto-modifier via l’utilisation de l’une de ses dix lysines, elle peut générer une très large gamme de signaux par la formation de chaînes polyNEDD8 et hybrides NEDD8. Ces chaines peuvent être reconnues de la même manière que les chaînes polyUb, mais aucune étude ne s'est concentrée sur la détermination de leurs interacteurs jusqu'à présent.Dans ce travail, nous nous sommes concentrés sur l'exploration de ces mécanismes inconnus de conjugaison et de déconjugaison de NEDD8 mentionnées précédemment. En utilisant des approches de biologie chimique, nous avons testé une variété d'enzymes et déterminé que les chaînes polyNEDD8 sont exclusivement traitées par l'enzyme NEDP1. Cependant, la déconjugaison des chaînes hybrides NEDD8 nécessite l'action coordonnée de différentes enzymes de déconjugaison avec une spécificité distincte pour Ub ou SUMO. Nous avons également utilisé des dimères NEDD8-NEDD8 et NEDD8-Ub synthétisés chimiquement afin de rechercher leurs interacteurs et utiliser les données recueillies pour approfondir nos connaissances sur la biologie des chaînes hybrides NEDD8 dans les agrégats nucléaires. En utilisant les sondes NEDD8-Dha, nous avons identifié un groupe de protéines qui sont potentiellement impliquées dans la machinerie de NEDDylation. Par la confirmation biologique des résultats obtenus, nous avons montré que les ARNt ligases - GARS et SARS fonctionnent comme des ligases E3 de NEDD8. De plus, RNF20 fonctionne également comme une NEDD8 E3 ligase responsable de la NEDDylation de l'histone H2B mais aussi de PARP1 - une des protéines acteurs clés dans la formation des SG<br>Understanding how organisms respond to environmental stress has critical implications both on quality of life and treatment of diseases. Organisms have developed a series of sophisticated processes to detect and repair such damages. A family of small proteins called the family of Ubiquitin molecules (Ubls), play a critical role in many aspects of the stress response. Defects in components of the Ubiquitin family are often found in pathologic conditions including cancer and neurodegenerative diseases. Understanding how the ubiquitin family is involved in the cellular stress response is an important step in the understanding of this process and can lead to the development of novel therapeutic approaches to treat diseases caused by malfunction of this system.One of the Ubls that has the highest identity and similarity to Ubiquitin is NEDD8. NEDD8 works in a similar manner to Ub, using a distinct conjugation machinery. NEDD8 modification is essential for maintaining the homeostasis of the cell as it plays a major role in the regulation of viability, growth, and development. Because of that, many components of NEDD8 have been found deregulated in many cancers. NEDD8 can modify a wide range of substrate proteins, including itself, which results in the creation of polyNEDD8 chains. Recently the presence of polyNEDD8 chains has been linked to the regulation of cell death – apoptosis and parthanatos. Moreover, it has been recently reported that NEDD8 during proteotoxic stress can be employed by the Ub conjugation machinery. This results in the creation of hybrid NEDD8 chains where except for NEDD8, we can also find Ub and SUMO, as recent papers have shown that NEDD8 has the ability to modify Ub and SUMO-2. The presence of the hybrid NEDD8 chains was linked with the creation of nuclear aggregates formed during proteotoxic stress, which can play a potential protective role during stress exposure.Knowing how important the regulation of proteins through NEDDylation is, we were also aware of the lack of knowledge about the machinery that plays a role in the creation and deconjugation of different NEDD8 entities. So far two deNEDDylating enzymes were reported but no enzyme was tested for its ability to recognise and process the hybrid NEDD8 chains. Moreover, our knowledge about E3 ligases that are responsible for substrate NEDDylation, even though expanding, is still very limited. Additionally, NEDD8 having ten lysines through which it can modify itself, can generate a very broad range of signals through polyNEDD8 and hybrid NEDD8 chain formation, which can be recognised similarly to polyUb chains, yet no studies have focused on determining their interactors so far.In this work, we focused on exploring the beforementioned unknown elements of the NEDD8 conjugation and deconjugation machineries. Using chemical biology approaches we tested a variety of enzymes and determined that polyNEDD8 chains are exclusively processed by the NEDP1 enzyme, however, deconjugation of hybrid NEDD8 chains requires the coordinated action of different deconjugating enzymes with distinct specificity for Ub or SUMO. We also employed chemically synthesized NEDD8-NEDD8 and NEDD8-Ub dimers in order to look for their interactors and used the gathered data to deepen our knowledge about the biology of hybrid NEDD8 chains in nuclear aggregates. Using NEDD8-Dha probes we identified a group of proteins that are potentially involved in the NEDDylation machinery. Through biological confirmation of obtained results we have shown that tRNA ligases – GARS and SARS are working as NEDD8 E3 ligases. Moreover, RNF20 is also working as a NEDD8 E3 ligase responsible for NEDDylation of histone H2B but also PARP1 – one of the proteins that are key players in the formation of SG

L'ubiquitylation des protéines est une modification post-traductionnelle qui joue un rôle capital dans la régulation des nombreuses fonctions cellulaires, y compris la croissance cellulaire et la prolifération. Les dysfonctionnements de ce mécanisme sont à l'origine de diverses maladies telles que le cancer par exemple. Le processus d'ubiquitylation implique une série des réactions enzymatiques en cascade, catalysées par une famille des enzymes, structuralement très proches. Cette famille est composée des enzymes activateurs d'ubiquitine (E1s), des enzymes de conjugaison d'ubiquitine (E2s) et des ligases d'ubiquitine (E3s). Les interactions entre E2s et E3s sont dans le centre de la cascade d'ubiquitylation. Une combinaison particulière des pairs E2/E3 va déterminer le type de chaînes d'ubiquitine qui seront attachées à la protéine d'intérêt pour ensuite déterminer la fonction régulatrice de la voie d'ubiquitylation. A ce jour, seulement une petite fraction de paires possibles entre E2 et E3 a été investiguée par des approches biochimiques et in vitro. Cependant ces approches ne reflètent pas forcément des conditions qu'on trouve dans une cellule vivante. Prenant ceci en considération, les principales objectives de ma thèse seront comme suit : identifier et optimiser une méthode de détection et de quantification des interactions E2/E3 dans une cellule vivante de la levure de boulanger (Saccharomyces cerevisiae) ; construire une bibliothèque de souches de la levure qui permettrait d'établir des interactions entre E2 et E3 ; chercher de nouvelles potentielles paires E2/E3 ; caractériser fonctionnellement une potentielle paire E2/E2. Il est difficile de trouver une méthodologie appropriée afin d'étudier les interactions entre E2 et E3 parce qu'ils sont relativement faibles et transitoires. Leurs études nécessitent donc des techniques de détection avec une grande sensibilité. Parmi différentes techniques nous avons testé et choisi la complémentation bimoléculaire de la fluorescence, BiFC. Kurtosis, une mesure permettant localiser et quantifier la fluorescence BiFC-spécifique. Nos résultats nous nous avons permis à identifier 117 putatives paires E2/E3 parmi quels, 23 paires ont été déjà décrit dans la littérature. Parmi 94 nouvelles paires, certains E3s interagissent avec seulement une seule E2 ou d'autres donnent un signal BiFC avec plusieurs E2s. Ubc13, Ubc1 et Ubc4 sont les E2s qui interagissent le plus souvent. Nous avons identifié aussi une interaction entre les protéines Asi1 et Asi3 et les enzymes de conjugaison d'ubiquitine Ubc6 et Ubc7. Asi1 et 3 sont connus de former un complexe Asi1/3 sur la membrane intérieure du noyau impliqué dans la réponse de la cellule aux acides aminés extracellulaires. Ces protéines contiennent un domaine RING caractéristique pour les ligases d'ubiquitine mais cette activité n'était pas démontrée auparavant<br>Protein ubiquitylation is a post-translational modification that plays a crucial role in regulating many cellular functions, including cell growth and proliferation. Defects in this control mechanism cause cancer and other diseases. The ubiquitylation process involves a cascade of enzymatic reactions catalyzed by a family of structurally-related enzymes, namely ubiquitin activating enzymes (E1s), ubiquitin conjugating enzymes (E2s) and ubiquitin ligases (E3s). Interactions between E2s and E3s are in the centre of ubiquitylation cascade and it is a combination of particular E2/E3 pairs that determine what types of ubiquitin chains are made, thus determining the regulatory functions of the ubiquitin pathway. To date, only a small fraction of all possible E2/E3 pairs have been investigated, mainly using biochemical and in vitro approaches that may not accurately reflect the conditions that occur in living cells. We aimed to develop a method capable of detecting specific E2-E3 interactions under physiological conditions. Using budding yeast as a model organism, we found that the Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) enables sensitive detection of the well described Ubc4-Ufd4 pair under endogenous conditions. The assay is specific since the interaction signal is lost in yeasts expressing Ubc4 mutants truncated in its E3 interaction domain. We then used this system to further analyze the physiological network of E2 and E3 enzymes in living yeast. We performed a microscopy screen to assay all interactions between eleven E2s and 56 E3s. Our results show that approximately 20% of all E2/E3 combinations give a detectable BiFC signal. Few E3s interacted only with a single E2, whereas most E3s produced a BiFC signal with multiple E2s. Ubc13, Ubc1 and Ubc4 were found to be the most frequently interacting E2s. Our results match many examples from current literature but we also detected 94 new E2/E3 interactions, in particular we identified an interaction between the proteins Asi1 and Asi3 and E2s Ubc6 and Ubc7. Asi1 and Asi3 are known to form a complex (the Asi1/3 complex) at the inner nuclear membrane and are involved in the regulation of the response to extracellular amino acids. The Asi1/3 complex was suspected to function as a ubiquitin ligases because they contain a RING domain, but this has previously not been demonstrated. We therefore further characterized them functionally

HACE1 est une E3 ubiquitine ligase qui contrôle notamment l’activité de la petite GTPase Rac1 en catalysant son ubiquitination dégradative. Rac1 contrôle de nombreux processus cellulaires tels que l’adhérence, la migration et la prolifération. Aussi, la perte d’expression d’HACE1 dues à des altérations génétiques ou épigénétiques est associée à des pathologies humaines tels que le cancer, des syndromes neurodégénératifs et des maladies développementales. Pourtant, malgré l’importance de HACE1 en physiopathologie, rien n’est connu sur la régulation post-traductionnelle de son activité. Au cours de ce travail, nous avons montré que la serine 385 de HACE1 est phosphorylée par les kinases PAKs de groupe I en réponse à l’activation de Rac1 et de Cdc42. Nous montrons que le mutant phospho-mimetic HACE1(S385E) présente une activité réduite d’ubiquitination de Rac1. De plus, nous mettons en évidence un rôle centrale de la régulation de la Ser-385 par phosphorylation dans l’oligomérisation de HACE1, définissant ainsi les bases moléculaires de la relation entre structure et fonction de HACE1. En parallèle, nous avons déterminé que la perte d’expression d’HACE1 altère la cohésion des jonctions entre cellules épithéliales. Cet effet de dissociation s’apparente à une transition épithelio-mésenchymateuse (EMT) caractérisée par un échange d’expression de la E-cadhérine par la N-cadhérine régulé au niveau transcriptionnel. L’ensemble de ce travail a donc permis de mettre en évidence un mode inédit de régulation par phosphorylation de l’activité de HACE1 contrôlée par les kinases PAK du groupe I, ainsi qu’un rôle majeur de HACE1 dans la régulation de la cohésion cellulaire et l’EMT<br>The E3 ubiquitin ligase HACE1 is a key regulator of cellular homeostasis best-characterized for its ability to control the activity of the Rho GTPase Rac1. This GTPase is encoded by an essential gene whose product controls a wide array of cellular processes such as cell adhesion, migration and proliferation. Accordingly, the repression of HACE1 expression due to genetic and epigenetic alterations has been associated with numerous pathologies, including cancer, neurodegenerative and developmental diseases. However, nothing is known about the posttranslational regulation of HACE1 activity. Here, we unveiled that HACE1 gets phosphorylated at serine Ser-385 by Group-I Pak kinases in response to Rac1/Cdc42 activation. Mechanistically, we define that the phospho-mimetic mutant HACE1(S385E) displays a lower capacity to ubiquitinate Rac1 in cells. In addition, our work attributes to the phosphorylation of Ser-385 a pivotal role in the state of HACE1 oligomerization, which sets the basis for deciphering the relationship between HACE1 structure and activity. In parallel, we have found that the loss of HACE1 expression leads to the disruption of epithelial monolayer cohesion characterized by disrupted of cell-cell junctions. Accordingly, we determined that loss of HACE1 results in the acquisition of epithelial-mesenchymal transition (EMT) features, including a transcriptionally regulated switch of expression between E-cadherin and N-cadherin. Altogether, this work reveals a phospho-mediated regulation of HACE1 activity that is under the control of Group I PAKs and implicates HACE1 in the balance between epithelium integrity versus EMT

La plupart des êtres vivants possèdent une horloge circadienne (période de 24heures). Elle leur permet notamment d’anticiper les changements quotidiens (lumière,température) imposés par la rotation de la terre et d’y adapter leur comportement et leurphysiologie. L’horloge est présente dans la plupart des cellules et repose sur deux boucles derégulation transcriptionnelle négative qui génèrent des oscillations d’ARNm des gènesd’horloge. Un délai entre l’accumulation des ARNm et celle des protéines assure lefonctionnement de la boucle de rétroaction. Ce délai est dû à des modifications posttraductionnellesdes protéines PERIOD et TIMELESS. Les oscillations protéiques sontnotamment contrôlées par leur phosphorylation, l’ubiquitination et la dégradation via leprotéasome. L’ubiquitine ligase SCFSlmb induit la dégradation circadienne de PER et de TIM.SCFJetlag contrôle la dégradation de TIM par la lumière, cette dernière intervenant dans lasynchronisation de l’oscillateur.Au cours de notre étude, nous avons identifié une nouvelle ubiquitine ligase, uncomplexe Cul-3, qui contrôle principalement la stabilité de TIM. Nos résultats indiquent queCul-3 contrôle surtout la stabilité de TIM peu phosphorylé, de façon indépendante de PER,tandis que Slmb contrôle principalement la stabilité de TIM phosphorylé. Nous proposons unmodèle dans l'oscillation de TIM régie par deux systèmes d'ubiquitination: Cul-3 pourretarder l'accumulation nocturne de la protéine, et Slmb pour précipiter sa disparition en finde nuit<br>Most living organisms possess a circadian clock (24 hours period). This internal clockallows them to anticipate the daily changes (light, temperature) due to the rotation of theearth and consequently adapt their behavior and physiology. The molecular clock relies ontwo negative feedback loops that generate oscillations of the clock gene mRNA. A delaybetween the accumulation of the mRNAs and the proteins is required for the feedback loop,and is generated by post-translational modifications of PERIOD and TIMELESS. The proteinoscillations are controlled by their phosphorylation, ubiquitination and proteasomedependentdegradation. The ubiquitin ligase SCFSlmb induces the circadian degradation ofPER and TIM. SCFJetlag controls the light-dependent degradation of TIM, which is involved inthe resetting of the clock.In our study, we have identified Cul-3, as a new clock ubiquitin ligase that controlsTIM stability. Our results indicate that Cul-3 mostly controls the stability ofhypophosphorylated TIM, independently of PER, whereas SLMB controls the stability ofphosphorylated TIM. We propose a model where TIM oscillations are regulated by twoubiquitination process. Cul-3 delays the night accumulation of TIM, whereas Slmbprecipitates its degradation at the end of the night

Le système ubiquitine protéasome (UPS), régule un grand nombre de processus cellulaires, en catalysant l’ubiquitination des protéines. Les virus exploitent l'UPS pour favoriser l’infection, et échapper à la réponse immunitaire de l'hôte. Nous nous sommes concentrés sur l'interaction entre la protéine PB2 de la polymérase du virus de l'influenza A (IAV) et des enzymes E3 ubiquitine ligases à cullin 4 (CRL4), en particulier les facteurs les protéines DDB1, DCAF11 et DCAF12L1 les composant. Nous avons montré que deux CRL4s sont des régulateurs positifs de l'infection virale, et qu’ils catalysent l’ubiquitination de la protéine PB2 pendant l'infection. Cette ubiquitination, constituée par des chaînes poly-ubiquitine K29, n’induit pas la dégradation de PB2. Les CRL4s peuvent interagir avec PB2 lorsqu’elle est engagée dans le complexe de polymérase virale, mais n’affectent ni la transcription ni la réplication des segments viraux. Les CRL4 catalysent l'ubiquitination de différentes lysines sur PB2, qui pourraient supporter des fonctions distinctes de PB2. Nos travaux fournissent la première caractérisation d'une PTM non protéolytique de PB2, qui semble être nécessaire à l’infection optimale par les IAV. De plus, en utilisant la purification par affinité suivie d'une spectrométrie de masse (AP/MS), nous avons identifié des ensembles distincts de facteurs cellulaires se liant aux CRL4s pendant l'infection. Ces résultats pointent vers une modification du protéome cellulaire ciblé par ces CRL4 E3 ligases pro-virales pendant l'infection par les IAV<br>The ubiquitin proteasome system regulates numerous cell processes, through ubiquitination of proteins. A vast interplay between viral proteins and host UPS exists, to promote successful infection and escape host’s immune response. We focused on the interaction between influenza A virus (IAV) polymerase protein PB2 and factors of the multi-components E3 ubiquitin ligase complex based on cullin 4 (CRL4) namely DDB1, DCAF11 and DCAF12L1 (designated as CRL4s). We found that PB2 undergoes a non-proteolytic ubiquitination, catalyzed by two CRL4s during infection. These CRL4s are positive regulators of viral infection, required for an optimal virions production and normal progression of viral cycle. We identified K29-linked ubiquitin chains as the main components of the non-proteolytic PB2 ubiquitination mediated by the CRL4s, thereby providing the first example of the role of this atypical ubiquitin linkage in the regulation of a viral infection. Although CRL4 E3 ligases are able to bind to PB2 when engaged in the viral polymerase complex, they did not affect the transcription and replication of viral segments. The two CRL4 ligases catalyzed the ubiquitination of different lysines on PB2, which might support distinct functions of PB2. Our work provides the first characterization of a non-proteolytic PTM of PB2, which might be essential for the successful outcome of an IAV infection. Furthermore, using affinity-purification followed by mass spectrometry (AP/MS) we identified distinct sets of cellular factors binding to the CRL4s during IAV infection. These results point towards the rewiring of cellular proteome targeted by the pro-viral CRL4 E3 ligases during IAV infection

L’incidence du mélanome a augmenté de façon considérable lors des trente dernières années avec un doublement tous les dix ans. Le mélanome ne représente que 5% des cancers cutanés mais entraîne 80% de décès, ce qui constitue un problème majeur de santé publique. En effet, cette tumeur est extrêmement agressive et possède un fort potentiel métastatique. Dès l’apparition de métastases, le pronostic vital devient fortement défavorable. Malgré des avancées thérapeutiques majeures, de nombreux patients sont encore réfractaires à ces nouveaux traitements. La compréhension des mécanismes impliqués dans le développement de cette tumeur reste donc un enjeu de premier ordre. Le séquençage d'exomes a conduit à l'identification d'une mutation dans le gène RAC1 (la mutation P29S) constituant une des mutations somatiques les plus fréquentes dans le mélanome (après les mutations BRAFV600, NRASQ61 et NF1). RAC1 est une petite GTPase qui fonctionne dans plusieurs processus cellulaires. Dans des conditions physiologiques, l'activité de RAC1 est principalement contrôlée par des protéines activatrices de l'activité GTPase (GAPs) et des facteurs d'échange Nucléotidique (GEF). GAPs et GEFs contrôlent le niveau de RAC1-GTP et régulent donc son activité. L'activité de RAC1 est aussi dépendante de son niveau d'expression protéique qui est contrôlé par des E3 ubiquitine ligases, parmi lesquelles HACE1. HACE1 est considérée comme un suppresseur de tumeur. De façon inattendue, les données obtenues montrent clairement que HACE1 favorise les propriétés migratoires et tumorigéniques des cellules de mélanome<br>Melanoma incidence has considerably increased over the last thirty years, with a doubling every ten years. Melanoma accounts for only 5% of cutaneous cancers but causes more than 80% of deaths, which is a major public health problem. Indeed, this tumor is extremely aggressive and has a high metastatic potential. After the onset of metastases, the prognosis becomes highly unfavorable. Despite major therapeutic advances, many patients are still refractory to these new treatments. Understanding the mechanisms involved in the development of this tumor and the identification of new therapies remain a major issue. The sequencing of exomes led to the identification of a mutation in the RAC1 gene (P29S) constituting one of the most frequent somatic mutations in melanoma (after the BRAFV600, NRASQ61 and NF1 mutations). RAC1 is a small GTPase that is involved in several key cellular processes. Under physiological conditions, the activity of RAC1 is mainly controlled by GTPase activating proteins (GAPs) and Nucleotide Exchange (GEF) exchange factors. GAPs and GEFs control the level of RAC1- GTP and thus regulate its activity. The activity of RAC1 is also dependent on its protein level of expression which is controlled by E3 ubiquitin ligases, including HACE1. HACE1 is considered a tumor suppressor. Unexpectedly, our data clearly show that HACE1 promotes migratory and tumorigenic properties of melanoma cells. Indeed, inhibition of HACE1 alters migration of melanoma cells in vitro, as well as in vivo pulmonary colonization in mice. Transcriptomic analysis of 4 melanoma cell lines demonstrated that HACE1 suppression inhibits ITGAV and ITGB1 expression

HACE1 est une E3 ubiquitine ligase qui contrôle notamment l’activité de la petite GTPase Rac1 en catalysant son ubiquitination dégradative. Rac1 contrôle de nombreux processus cellulaires tels que l’adhérence, la migration et la prolifération. Aussi, la perte d’expression d’HACE1 dues à des altérations génétiques ou épigénétiques est associée à des pathologies humaines tels que le cancer, des syndromes neurodégénératifs et des maladies développementales. Pourtant, malgré l’importance de HACE1 en physiopathologie, rien n’est connu sur la régulation post-traductionnelle de son activité. Au cours de ce travail, nous avons montré que la serine 385 de HACE1 est phosphorylée par les kinases PAKs de groupe I en réponse à l’activation de Rac1 et de Cdc42. Nous montrons que le mutant phospho-mimetic HACE1(S385E) présente une activité réduite d’ubiquitination de Rac1. De plus, nous mettons en évidence un rôle centrale de la régulation de la Ser-385 par phosphorylation dans l’oligomérisation de HACE1, définissant ainsi les bases moléculaires de la relation entre structure et fonction de HACE1. En parallèle, nous avons déterminé que la perte d’expression d’HACE1 altère la cohésion des jonctions entre cellules épithéliales. Cet effet de dissociation s’apparente à une transition épithelio-mésenchymateuse (EMT) caractérisée par un échange d’expression de la E-cadhérine par la N-cadhérine régulé au niveau transcriptionnel. L’ensemble de ce travail a donc permis de mettre en évidence un mode inédit de régulation par phosphorylation de l’activité de HACE1 contrôlée par les kinases PAK du groupe I, ainsi qu’un rôle majeur de HACE1 dans la régulation de la cohésion cellulaire et l’EMT<br>The E3 ubiquitin ligase HACE1 is a key regulator of cellular homeostasis best-characterized for its ability to control the activity of the Rho GTPase Rac1. This GTPase is encoded by an essential gene whose product controls a wide array of cellular processes such as cell adhesion, migration and proliferation. Accordingly, the repression of HACE1 expression due to genetic and epigenetic alterations has been associated with numerous pathologies, including cancer, neurodegenerative and developmental diseases. However, nothing is known about the posttranslational regulation of HACE1 activity. Here, we unveiled that HACE1 gets phosphorylated at serine Ser-385 by Group-I Pak kinases in response to Rac1/Cdc42 activation. Mechanistically, we define that the phospho-mimetic mutant HACE1(S385E) displays a lower capacity to ubiquitinate Rac1 in cells. In addition, our work attributes to the phosphorylation of Ser-385 a pivotal role in the state of HACE1 oligomerization, which sets the basis for deciphering the relationship between HACE1 structure and activity. In parallel, we have found that the loss of HACE1 expression leads to the disruption of epithelial monolayer cohesion characterized by disrupted of cell-cell junctions. Accordingly, we determined that loss of HACE1 results in the acquisition of epithelial-mesenchymal transition (EMT) features, including a transcriptionally regulated switch of expression between E-cadherin and N-cadherin. Altogether, this work reveals a phospho-mediated regulation of HACE1 activity that is under the control of Group I PAKs and implicates HACE1 in the balance between epithelium integrity versus EMT

Le virus HIV code pour des protéines auxiliaires essentielles à l'infection in vivo. Parmi ces protéines auxiliaires, la protéine Vpr reste une énigme : aucune fonction lors de l'infection n'a pu lui être attribuée lors de l'infection malgré son importance pour l'établissement de la maladie. De ses multiples activités décrites in vitro, la mieux caractérisée est sans doute sa capacité à induire un arrêt de la progression du cycle cellulaire à la transition G2/M avec pour conséquence la mort des cellules par apoptose. La mise en évidence de la nécessité du recrutement de l'E3 ligase CUL4ADDB1 par Vpr pour cette activité a permis de proposer un modèle où Vpr détourne cette E3 ligase pour induire la dégradation d'un facteur cellulaire nécessaire à la transition G2/M : « la cible de l'arrêt G2 ». Nous avons montré que le recrutement de la cible de l'arrêt G2 par la protéine Vpr nécessite un motif SRIG conservé dans la queue C-terminale de Vpr. Nous avons aussi pu mettre en évidence une deuxième activité apoptotique de Vpr, indépendante de l'arrêt G25 mais nécessitant le recrutement de l'E3 ligase CUL4ADDB1. Nous proposons donc un nouveau modèle d'action de Vpr où la protéine virale induit la dégradation, en détournant une E3 ligase, non pas d'un mais de deux facteurs cellulaires nécessaires à la croissance et la viabilité cellulaire. Nous avons mis au point une purification de la protéine Vpr par affinité en tandem pour identifier ces facteurs cellulaires. L'identification des facteurs cellulaires inactivés par la protéine Vpr devrait permettre d'élucider la fonction de cette protéine lors de l'infection par le virus HIV<br>HIV encodes for auxiliary proteins that are essential for the infection in vivo. Among the auxiliary proteins of HIV, Vpr protein remains an enigma: so far, no function during the infection could be assigned to this protein despite its importance for the establishment of the disease. Amongst its many activities described in vitro, the best characterized is probably its ability to induce a cell cycle arrest at the G2/M transition leading to cell death by apoptosis. The demonstration that Vpr needs to recruit the E3 ligase CUL4ADDB1 to induce cell cycle arrest allowed us to propose a model in which Vpr hijacks this E3 ligase to induce the degradation of a cellular factor required for the G2/M transition, hereafter referred to as the G2 target. We have shown that the recruitment of the G2 target by Vpr requires a SRIG motif that is conserved in the C-terminal tail of Vpr. We were also able to identify a second apoptotic activity of Vpr, independent of the G2 arrest activity, but relying on the recruitment of E3 ligase CUL4ADDB1. Therefore, we propose a new model of action of Vpr where the viral protein induces the degradation, by hacking an E3 ligase, of not one but two cellular factors required for cell growth and viability. We have developed a purification strategy of the Vpr protein by tandem affinity to identify these cellular factors. The identification of the cellular factors inactivated by the Vpr protein will certainly allow the elucidation of the functions of this protein during HIV infection

Previously it has been shown that Rsp5p, a member of Nedd4 ubiquitin ligases in yeast, is modified by the ubiquitin-like protein SUMO and that this modification is performed by Siz1p, a member of PIAS SUMO ligases that are in turn substrates of Rsp5p-dependent ubiquitylation, thus defining a previously unidentified system of crosstalk between the ubiquitin and SUMO systems in yeast. This project aims to identify whether similar crosstalk pattern exists in human cells. In vitro ubiquitylation assays showed that some of the human Nedd4 family members (Nedd4.1, Nedd4.2, WWP1) are capable of ubiquitylating the human SUMO ligase PIAS3, while in contrast, Smurf2 does not appear to be able to modify this protein. This modification is partially WW-PY-motif-dependent as ubiquitylation level of PIAS3 mutants with altered PY motifs conducted by Nedd4.1 or Nedd4.2 was reduced, but not completely disrupted. Interestingly, in vitro SUMOylation assay revealed that Nedd4.1 is SUMOylated even in the absence of SUMO E3 ligases and an apparent interaction between the SUMO E2 (Ubc9) and Nedd4.1 was observed both in vitro and in vivo. I show that auto- SUMOylation of Nedd4.1 is accompanied with the formation of thioester-linked conjugates between Nedd4.1 and SUMO, but these do not involve cysteine residues (C867, C778, and C627) within the HECT domain itself and is not occurring at a predicted SUMOylation consensus site (K357). Furthermore, I have shown that Nedd4.1 and SUMO1/2 colocalize in HeLa cells, and that overexpression of epitope tagged Nedd4 and SUMO1/2, followed by denaturing pull-downs demonstrates that both Nedd4.1 and Nedd4.2 can be SUMOylated in vivo. Meanwhile, I have generated a SUMO trap based on SUMO interacting motifs (SIMs) and confirmed its ability of capturing SUMOylated proteins both in vivo and in vitro. Its use reveals that Nedd4 SUMO conjugates could be captured by SUMO trap when Nedd4 and SUMO were co-expressed in HeLa cells, again confirming Nedd4.1 as a substrate for SUMO1 or SUMO2. In conclusion, I show that SUMOylation of Nedd4.1 does exist in HeLa cells, and on the other hand, some of Nedd4 family members are responsible for PIAS3 ubiquitylation in vitro, providing evidence of a crosstalk between Nedd4 family of ubiquitin ligases and PIAS family of SUMO ligases in mammals.

La morphogenèse est le processus qui définit la forme d'un organisme (ou d'une partie d'un organisme) nécessaire à son bon fonctionnement. Au cours de l'embryogenèse, la morphogenèse d'un organe nécessite des processus incluant la division cellulaire, les mouvements cellulaires et la différenciation cellulaire. Cependant, on sait peu de choses sur la façon dont ces différents processus sont coordonnés au cours de la morphogenèse d'un organe. Au cours de ma thèse, j'ai étudié deux voies de signalisation cellulaire différentes qui régulent la morphogenèse au cours de l'embryogenèse du poisson zèbre. Mon étude a révélé que la voie de signalisation Notch et la voie PCP (Polarité Cellulaire Planaire) contrôlée par Mib1 régulent respectivement la morphogenèse du tube neural et l'extension de l'axe embryonnaire.Au cours de la première partie de ma thèse, j'ai étudié le rôle de la signalisation de Notch dans la morphogenèse du tube neural du poisson zèbre. La signalisation Notch a déjà été bien étudiée pour son rôle dans la régulation de la neurogenèse lors du développement du poisson zèbre. Cependant, on ne sait pas si et comment la signalisation Notch régule la morphogenèse du tube neural du poisson zèbre. L'épithélialisation et la c-division sont des événements importants au cours de la morphogenèse du tube neural du poisson zèbre. Nos résultats montrent que, en plus de synchroniser la spécification des cellules neuronales, la suppression de la neurogenèse induite par Notch est essentielle pour l’acquisition de l’architecture neuroépithéliale et pour la réalisation de c-division. Ainsi, la signalisation Notch permet de former la moelle épinière de poisson zèbre.Les observations de la première partie de ma thèse ont conduit à l'identification du rôle de Mindbomb1 (Mib1) dans la signalisation PCP. Mib1, une ligase ubiquitine-E3 nécessaire à l'activation de Notch, régule les mouvements d'extension convergence (CE) nécessaires à l'élongation de l'axe de l'embryon au cours de la gastrulation du poisson zèbre. De manière intéressante, nous avons montré que Mib1, indépendamment de sa fonction dans la signalisation Notch, agit dans la voie PCP pour réguler l’extension de l’axe de l’embryon. Dans la voie de la PCP, Mib1 agit comme une ligase ubiquitine-E3 et régule l'endocytose du composant de la PCP Ryk afin d'assurer la médiation de la CE lors de la gastrulation. Ainsi, notre étude a révélé que, indépendamment de son rôle dans la signalisation Delta / Notch, Mib1 est important pour la voie PCP lors de la gastrulation du poisson zèbre<br>During my PhD, I studied two different cell signaling pathways that regulate morphogenesis during zebrafish development. I found that the Notch signaling pathway and Mib1 mediated Planar Cell Polarity (PCP) pathway regulate neural tube morphogenesis and embryonic axis extension respectively.During the first part of my PhD, I addressed the role of Notch signaling in zebrafish neural tube morphogenesis. Notch signaling has been well studied for its role in regulating neurogenesis during zebrafish development. However, whether and how it regulates morphogenesis of the zebrafish neural tube is unknown. Epithelialization and c-division are important events during zebrafish neural tube morphogenesis. Our findings show that, in addition to regulating the timing and identity of neuronal cell fate specification, Notch mediated suppression of neurogenesis is essential for the acquisition of polarized neuroepithelial tissue architecture and the execution specific morphogenetic movements called c-divisions, in order to properly shape the zebrafish spinal cord. Observations from the first part of my PhD led to the identification of the role of Mindbomb1(Mib1) in PCP signaling. Mib1, an E3-ubiquitin ligase required for Notch activation, regulates convergent extension (CE) movements during zebrafish gastrulation, that are required for the axis elongation of the embryo. Interestingly, I found that Mib1, independent of its function in Notch signaling, act in the PCP pathway to regulate axis extension. In the PCP pathway, Mib1 acts as an E3-ubiquitin ligase and regulates endocytosis of the PCP component Ryk to mediate CE during gastrulation. Thus, my study discovered that independent of its role in Delta/Notch signaling, Mib1 is important for the PCP pathway during zebrafish gastrulation

During vertebrate development and in human pathology the regulation of the level and duration of TGFp signalling is important in controlling cell plasticity, migration, proliferation and apoptosis. My work has focused on Arkadia (Akd) which is a nuclear RING-H2 domain E3 ubiquitin-ligase that enhances Smad2/3-mediated TGFp sign!llling and is essential in mammalian development. Akd has recently been shown to destroy inhibitory (I)-Smads, sensitising cells to TGFp ligands. Here I describe data that demonstrates a second more important mechanism by which Akd enhances and terminates Smad2/3 signalling in which phosphorylated(P)Smad2 and Smad3 are the targets for Akd. I have employed reporter' analyses to investigate the Akd protein domains required for ubiquitination, and highlight�· the requirement ofP-Smad2/3-interaction to activate Smad2/3-mediated signalling. This has lead to the hypothesis that the primary pathway of Akd is through ubiquitination of PSmad2/ 3s, which many co-operate with the function of Akd to destroy I-Smads. Furthermore, I have isolated a second Akd gene (Akd2) in mouse and human, and shown its function is complementary to enhance Smad2/3 signalling in reporter analyses. Moreover, I confirmed the importance of Akd in TGFp signalling by isolating a functional Akd homologue in the invertebrate drosophila melanogaster (termed dAkd). Akd and certain isoforms of Akd2 are ubiquitpusly expressed. I have employed reporter analyses to address the regulation of Akd genes post-transcriptionally and engineered tools to analyse these mechanisms in the�· embryo. My data strongly implicates post-translational regulation of Akd genes to fine-tune TGFp signalling in vivo. My study confirms the central role of the Akd family in regulation of TGFpsignals and highlights the importance of post-transcriptional control ofAkd genes. These data will be important in understanding how the alternate cellular interpretation of TGFp ligands is achieved in many important biological processes.

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is a process by which epithelial cells acquire a mesenchymal phenotype. It is characterized by the down-regulation of the adherens junction protein E-cadherin, and it is important during embryonic development. Snail1 expression is sufficient to trigger EMT in cultured cells and is found up-regulated in some cancers. Snail1 is stabilized both at mRNA and protein levels and in this project we analyzed the action of ubiquitin ligases affecting protein half-life. Apart from the already described β-Trcp1, that degrades Snail1 in a GSK-3β phosphorylation-dependent manner, we found the F-box proteins FBXL14 and FBXL5 as novel E3 ubiquitin ligases for Snail1. FBXL14 is a cytoplasmic ubiquitin ligase that is down-regulated in hypoxia through a transcriptional mechanism. FBXL5 is nuclear and modulates Snail1 binding to the DNA and nuclear ubiquitination. FBXL5 protein is destabilized after γ-irradiation, inducing high levels of Snail1. Together, these ligases keep a tight control of Snail1 cellular levels, maintaining them low in normal conditions.<br>La transició epiteli-mesènquima (per l’acrònim en anglès de: “epithelial to mesenchymal transition”, EMT) és un procés durant el qual cèl•lules epitelials adquireixen un fenotip mesenquimal. Està caracteritzat per la baixada de l’E-caderina, una proteïna de les unions adherents, i és important en el desenvolupament embrionari. L’expressió de Snail1 és suficient per desencadenar la EMT en cèl•lules en cultiu i s’ha trobat sobre-expressada en alguns càncers. Snail1 s’estabilitza tant a nivell de mRNA com de proteïna i en aquest projecte hem analitzat l’acció de les lligases d’ubiquitina que afecten els nivells de la proteïna. Apart de la ja descrita β-Trcp1, que degrada Snail1 de manera depenent a la fosforilació de Snail1 per GSK-3β, hem trobat les proteïnes F-box FBXL14 i FBXL5 con a noves lligases d’ubiquitina E3 que degraden Snail1. La FBXL14 és citoplasmàtica i els seus nivells disminueixen en hipòxia a través d’un mecanisme transcripcional. La FBXL5 és nuclear i modula tant la unió de Snail1 al DNA com la seva ubiquitinació nuclear. La proteïna FBXL5 es desestabilitza degut a la radiació gamma (γ) induint els nivells de Snail1.

In ubiquitin (Ub) system, E3 ligases have a central role in mediating substrate ubiquitination and triggering substrate degradation or other signalling transductions. RING E3s are the largest family of E3s and they promote direct Ub transfer from E2’s active site to substrate. Some RING E3s require dimerization for their activity, but structural evidence on the importance of dimerization and the mechanism of Ub transfer are lacking. I report the structure of the human dimeric RING domain from BIRC7 (also called MLIAP or Livin) in complex with the E2 UbcH5B covalently linked to Ub (UbcH5B~Ub; ~ refers to thioester or oxyester linkage). This 2.18 Å complex structure reveals extensive Ub interactions with UbcH5B and both subunits of the RING domain dimer that stabilize the globular body and C-terminal tail of Ub. Mutations that disrupt these noncovalent interactions or RING dimerization reduce E2~Ub binding affinity and ubiquitination activity. My results provide structural insights into how dimeric RING E3s recruit E2~Ub and optimize the donor Ub configuration for transfer. CBL family proteins (CBLs) are monomeric RING E3s that negatively regulate receptor tyrosine kinase (RTK) signalling pathway. Precise control of CBLs E3 activity is crucial for many cellular functions. My structural and biochemical data show that the RING domain of c-CBL adopts an autoinhibited conformation, where the E2-binding surface of the RING domain is blocked by the tyrosine kinase-binding domain (TKBD). CBLs can be activated by phosphorylation of a conserved tyrosine residue on the linker helix region (LHR; Tyr371 in c-CBL and Tyr363 in CBL-B). This activation is required for RTK ubiquitination. I report a crystal structure of Tyr363-phosphorylated human CBL-B, bound to a stabilized Ub-linked E2 (UbcH5B–Ub; – is used to separate componets of a complex, in this case, also refers to isopeptide linkage). This 2.21 Å complex structure reveals that the pTyr363 of CBL-B contacts Ub’s Ile36 surface. Using kinetic analyses, I demonstrate that this interaction is crucial in Ub transfer. Together, my results suggest that both monomeric and dimeric RING E3s use a similar mechanism in optimizing the Ub conformation and activating E2~Ub thioester for transfer, although the Ub-stabilizing components may vary in different RING E3s.

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is a process by which epithelial cells acquire a mesenchymal phenotype. It is characterized by the down-regulation of the adherens junction protein E-cadherin, and it is important during embryonic development. Snail1 expression is sufficient to trigger EMT in cultured cells and is found up-regulated in some cancers. Snail1 is stabilized both at mRNA and protein levels and in this project we analyzed the action of ubiquitin ligases affecting protein half-life. Apart from the already described β-Trcp1, that degrades Snail1 in a GSK-3β phosphorylation-dependent manner, we found the F-box proteins FBXL14 and FBXL5 as novel E3 ubiquitin ligases for Snail1. FBXL14 is a cytoplasmic ubiquitin ligase that is down-regulated in hypoxia through a transcriptional mechanism. FBXL5 is nuclear and modulates Snail1 binding to the DNA and nuclear ubiquitination. FBXL5 protein is destabilized after γ-irradiation, inducing high levels of Snail1. Together, these ligases keep a tight control of Snail1 cellular levels, maintaining them low in normal conditions.<br>La transició epiteli-mesènquima (per l’acrònim en anglès de: “epithelial to mesenchymal transition”, EMT) és un procés durant el qual cèl•lules epitelials adquireixen un fenotip mesenquimal. Està caracteritzat per la baixada de l’E-caderina, una proteïna de les unions adherents, i és important en el desenvolupament embrionari. L’expressió de Snail1 és suficient per desencadenar la EMT en cèl•lules en cultiu i s’ha trobat sobre-expressada en alguns càncers. Snail1 s’estabilitza tant a nivell de mRNA com de proteïna i en aquest projecte hem analitzat l’acció de les lligases d’ubiquitina que afecten els nivells de la proteïna. Apart de la ja descrita β-Trcp1, que degrada Snail1 de manera depenent a la fosforilació de Snail1 per GSK-3β, hem trobat les proteïnes F-box FBXL14 i FBXL5 con a noves lligases d’ubiquitina E3 que degraden Snail1. La FBXL14 és citoplasmàtica i els seus nivells disminueixen en hipòxia a través d’un mecanisme transcripcional. La FBXL5 és nuclear i modula tant la unió de Snail1 al DNA com la seva ubiquitinació nuclear. La proteïna FBXL5 es desestabilitza degut a la radiació gamma (γ) induint els nivells de Snail1.

E3 ubiquitin ligases are key regulatory enzymes of the ubiquitination pathway as they are responsible for substrate specificity. This thesis aimed at deciphering the molecular mechanisms through which two different E3 ligases, Nedd4 and Rabex-5, exert their activity. Nedd4 is the prototype for HECT-E3 ligase while Rabex-5, containing an A20 zinc finger domain (ZnF_A20) instead of a canonical RING, could be defined as an atypical RING-E3 ligase. In the case of Nedd4, we provided the first crystal structure of the catalytic intermediate of HECTNedd4~Ub in complex with Ub non-covalently bound to the UBD present in the N-lobe of HECTNedd4. Our structure represents the next step of the transfer of UbD from the catalytic cysteine of E2 to the one of E3 in which the UbD C-terminal tail is in an extended conformation primed for catalysis. Our data strongly supports the sequential addition model proposed for HECT proteins. Within this study we also clarified some aspects of Rabex-5 as E3 ligase. By yeast-two-hybrid, GST-pull-down assays and ITC analysis, we identified specific E2 partners, Ube2D and Ube2E families, that bind Rabex-5 only when in their active Ub-loaded state. Performing in vitro auto-ubiquitination assay and disulfide stability assay we confirmed that ZnF_A20 is the minimal domain responsible for the catalytic activity. To obtain the structure of the Rabex-51-74:E2-Ub complex, we tested, unfortunately without success, crystallization trials and SAXS analysis with various samples. We also analyzed Rabex-5 catalytic activity towards on H-Ras, which is the unique substrate of Rabex-5 so far identified, and we disproved that H-Ras is a Rabex-5 substrate. To identify candidate substrates we profiled 20.000 human proteins using a microarray-based ubiquitination screening. A list of 67 proteins represent the most statistically stringent and conservative estimate for Rabex-5 substrates that we are going to validate in the nearest future, starting from the ones involved in the endocytic pathway.

Ubiquitin is a highly conserved 8 kDa protein whose many cellular functions are mediated by its covalent ligation to other proteins. Conjugation of ubiquitin is a multistep process involving a ubiquitin-activating enzyme (E1), ubiquitin-conjugating enzymes (UBCs or E2s), and ubiquitin protein ligases (E3s). The multi-ubiquitination of substrates marks them for degradation by the 26S proteasome.<br>Previously, rat UBC4 isoforms homologous to S. cerevisiae UBC4/UBC5 were cloned and characterized (Wing and Jain, 1995) (Wing et al., 1996). The UBC4-1 isoform is highly expressed in the testis, and the UBC4-testis isoform is induced in round spermatids. This thesis describes the identification and characterization of E3s interacting with these UBC4 isoforms expressed in the rat testis.<br>First, the isolation and characterization of a novel E3 from rat testis extracts, E3Histone, is described. E3Histone mediates conjugation of ubiquitin to histones in a UBC4-dependent manner. Interestingly, E3Histone was immunodepleted by antibodies against Cdc27, a subunit of the a&barbelow;naphase-p&barbelow;romoting c&barbelow;omplex (APC), an E3 which plays a critical role in the regulation of the cell cycle. However, E3Histone and the APC are distinct complexes. Gel filtration resolved the 600 kDa E3Histone from the 1500 kDa APC. E3Histone interacts preferentially with UBC4, whereas the APC interacts preferentially with UbcH10 and shows specificity for the substrate cyclin. E3Histone and the APC may be members of a newly-recognized family of combinatorial E3s that share some common core subunits, such as CDC27, yet possess distinct subunits that confer upon them their respective E2 and substrate specificities. In addition, E3Histone activity was detected in extracts from various purified germ cells. Induction of UBC4 may lead to the increased ubiquitination of histories and together with E3 Histone may play a role in the chromatin condensation that occurs during spermatid maturation.<br>Secondly, the characterization of a HECT domain E3, Rat100, is described. UBC4-1 and UBC4-testis were found to transfer ubiquitin to Rat100 in vitro. Immunoblotting showed that Rat100 has a molecular weight of 300 kDa, and that the developmental and cell-specific expression of Rat100 correlates with that of UBC4. The induction of Rat 100 may playa role in the activation of ubiquitin-dependent proteolysis during spermatogenesis.

The anaphase promoting complex (APC/C) is an ubiquitin ligase that is an essential regulator of multiple steps in the cell cycle. The complex consists of at least 12 subunits with a catalytic core formed by a scaffold protein, APC2, and a RING-H2 protein, APC11. The Parapoxvirus, Orf virus (OV), encodes a RING-H2 protein, B5L, with clear sequence similarities to APC11. The disruption of APC/C function leads to pre-mature entry into S phase and a delayed M phase exit and, potentially, apoptosis. This investigation explored the functional significance of the similarity between B5L and APC11 and specifically sought to determine if B5L manipulates cell cycle regulation by targeting APC/C function. Co-immunoprecipitation experiments from lysates of cells expressing a range of constructs revealed an interaction between B5L and APC2 in the same manner as seen with APC11. Furthermore, B5L was found to associate with endogenous APC/C. However, although APC11 promoted the formation of polyubiquitin chains in substrate-independent in vitro assays, B5L was inactive in this assay. Bioinformatics comparisons of APC11 and other known RING ubiquitin ligases with B5L and its poxviral homologues revealed some subtle differences. In particular a domain of APC11 (amino acids 61-74), that is essential for its ubiquitin ligase activity is not conserved in B5L or its homologues. When this APC11 domain was incorporated in place of the corresponding region of B5L (amino acids 59-67), the mutated B5L acquired ubiquitin ligase activity. On the other hand, APC11 protein in which the domain was replaced with that of B5L lost ubiquitin ligase activity. Stable cell lines expressing B5L showed an increased number of cells in G2/M phase (30�4%) compared with cell lines expressing APC11 (11�2%, n=3, p<0.05, ANOVA, Tukey�s), consistent with impaired APC/C function. APC/C substrates such as cyclin A, cyclin B and the thymidine kinase were stablized in B5L-expressing cells compared with control cells. Furthermore, transient hyper-expression of B5L induced apoptosis in 25�2% (n=3, p<0.05) of the cell population compared with only 6�1% apoptotic cells when APC11 was hyper-expressed. Analysis of the DNA content of OV-infected cells revealed enhanced DNA synthesis compared with cells infected with a B5L knockout OV. These observations indicate that B5L is a non-functional mimic of APC11. It associates with APC/C, but lacks ubiquitin ligase activity, and hence disrupts APC/C function. These abilities may enable OV to induce a cellular environment that enhances viral replication.

TRIP12 est une E3 ubiquitine ligase de la famille HECT (Homologous to the E6-AP Carboxyl Terminus). TRIP12 a plusieurs cibles connues qu'elle adresse au protéasome par polyubiquitination. Parmi ces cibles, plusieurs protéines ont des rôles importants dans la réponse aux dommages à l'ADN, le remodelage de la chromatine et la voie d'activation de p53. Des résultats non publiés de mon équipe d'accueil ont montré une surexpression de la protéine TRIP12 dans le cancer du pancréas et les lésions pré-néoplasiques. Le groupe a mis en évidence que TRIP12 polyubiquitine et provoque la dégradation du facteur de transcription PTF1a (Pancreas Transcription Factor 1a), décrivant pour la première fois un mécanisme de régulation post-traductionnelle de PTF1a. PTF1a est essentiel au développement et à l'homéostasie du pancréas. Il est capable d'inhiber la prolifération de cellules cancéreuses pancréatiques et est considéré comme un gène suppresseur de tumeur. Bien qu'ayant pour substrats des protéines intervenant dans des processus finement régulés au cours du cycle cellulaire et altérés dans les cancers, la régulation de l'expression et les fonctions de TRIP12 au cours du cycle cellulaire n'étaient pas connues au début de mes travaux de thèse. J'ai démontré que l'expression et la localisation nucléaire de TRIP12 varient au cours du cycle cellulaire. J'ai identifié un domaine intrinsèquement désordonné dans la partie N-terminale de TRIP12 qui lui permet d'interagir avec l'euchromatine. J'ai montré que TRIP12 est impliqué dans l'entrée en mitose en contrôlant la durée de la réplication de l'ADN indépendamment de son activité catalytique. TRIP12 est également indispensable pour une bonne progression en mitose et la stabilité chromosomique. Mes résultats proposent TRIP12 comme une nouvelle protéine associée à la chromatine, essentielle à la progression dans le cycle cellulaire et au maintien de l'intégrité du génome. A terme, ce travail de thèse servira de base pour comprendre la surexpression de TRIP12 dans le cancer du pancréas et son impact dans la carcinogénèse<br>TRIP12 is an E3 ubiquitin ligase that belongs to the HECT (Homologous to the E6-AP Carboxyl Terminus) family. Several proteins are targeted by TRIP12 polyubiquitination which triggers their proteasomal degradation. Among its targets, several proteins are involved in DNA damage responses, chromatin remodelling and p53 pathway activation. Unpublished results of my team showed an increased expression of TRIP12 in pancreatic cancer and pre-neoplastic lesions. My group revealed that TRIP12 polyubiquitinates and provokes the degradation of the transcription factor PTF1a (Pancreas Transcription Factor 1a) stability. Describing for the first time a post-translational regulation of PTF1a. PTF1a is essential in pancreatic development and homeostasis. It inhibits the proliferation of pancreatic cells and is considered as a tumour suppressor gene and. Even if several TRIP12 targets are involved in cellular processes that are tightly cell cycle regulated, the regulation of TRIP12 expression and its functions during the cell cycle was unknown at the beginning of my thesis. I showed that TRIP12 expression and nuclear localization are regulated throughout the cell cycle. I identified an intrinsically disordered domain within the N-terminal region of TRIP12 that permits its interaction to euchromatin. I demonstrated TRIP12 implication in mitosis entry by controlling DNA replication timing Independently of its catalytic activity. TRIP12 is also required for maintaining a correct mitotic progression and chromosomes stability. My results propose TRIP12 as a new chromatin-associated protein that is essential for cell cycle progression and to preserve genome integrity. In the end, my studies will be fundamental to explain the increased expression of TRIP12 protein observed in pancreatic cancer and its impact in carcinogenesis

Le facteur de transcription NF-κB régule l’expression d’une pléthore de gènes impliqués dans divers processus physiologiques notamment la prolifération et la survie cellulaires, l’inflammation ainsi que les réponses immunes. Il intervient également dans de nombreux processus pathologiques à l’exemple de certains cancers et maladies auto-immunes.L’activation de NF-κB suite à l’engagement de différents immunorécepteurs requiert la mise en place de larges signalosomes formés suite au recrutement de différents adaptateurs au niveau des immunorécepteurs engagés. Ces adaptateurs subissent des ubiquitinations non-dégradatives nécessaires pour la transduction du signal. Nous avons démontré dans un précédent travail que ces protéines ubiquitinylées s’accumulent au niveau de la membrane du réticulum endoplasmique (RE) via la protéine réticulaire Métadhérine (MTDH). De plus, nos résultats suggèrent que l’ubiquitination est un prérequis nécessaire à l’adressage de ces protéines au RE. Afin d’évaluer la contribution des E3 ubiquitine ligases en charge de relayer NF-κB au niveau des organites, nous avons effectué le crible d’une banque de siRNAs dirigés contre les 46 E3 ligases transmembranaires en utilisant comme modèle la signalisation du TNF récepteur. Ce crible nous a permis d’identifier l’E3 ligase RNF121 comme régulateur positif de NF-κB. Bien que le mécanisme d’action de RNF121 ne soit pas complètement élucidé, nos données suggèrent qu’il agirait au niveau de la régulation de l’inhibiteur de NF-κB « IκBα ».Durant la deuxième partie de cette thèse, je me suis intéressée à la dynamique mitochondriale. Les mitochondries sont des organites dynamiques, dont la forme est maintenue grâce à une balance entre deux processus antagonistes appelés : fission et fusion. Il a été rapporté qu’en présence de certains stress modérés, les mitochondries hyperfusent, ce processus est appelé SIMH (Stress-Induced Mitochondrial Hyperfusion). Nous avons pu démontrer que la SIMH s’accompagne de l’activation de la voie canonique du facteur de transcription NF-κB via l’E3 ubiquitine ligase mitochondriale MULAN. Nos résultats suggèrent que durant le SIMH, MULAN forme un complexe avec TRAF2 et module son ubiquitination. Ces résultats suggèrent que la mitochondrie, de part sa dynamique, convertie un signal de stress en un signal de survie via l’activation de NF-κB. Pris dans leur ensemble, nos résultats illustrent la complexité de la régulation de NF-κB par ubiquitination et attribuent aux organites un nouveau rôle dans la transduction de la signalisation<br>The transcription factor NF-κB regulates the expression of several genes implicated in various physiological processes such as cell proliferation and survival, inflammation and immune responses. Dysregulation of its activation is involved in diverse pathologies such as cancer and auto-immune diseases. Following the engagement of immunoreceptors, NF-κB signaling requires a large signalosome assembly containing different adaptor proteins. These adaptors undergo poly-ubiquitinylation in a non-degradative manner, which is essential for signal transduction. We demonstrated in previous work that these ubiquitinylated proteins accumulate at the surface of the endoplasmic reticulum (ER) via a reticular protein called “Methaderin” (MTDH). Furthermore, our results suggest that ubiquitinylation is a necessary prerequisite for protein addressing to the ER. To evaluate the contribution of E3 ubiquitin ligases in this process we performed a screen of a siRNA bank, targeting the 46 human transmembrane E3 ligases, using the TNF receptor signaling as a model. This screen enabled the identification of RNF121, a Golgi E3 ligase, as a positive regulator of NF-κB. Although the mechanism by witch RNF121 acts is not yet elucidated, our data suggest that it acts on the regulation of NF-κB inhibitor (IκBα). In the second part of this thesis, we investigated mitochondrial dynamics. Mitochondria are dynamic organelles; their shape is maintained due to a balance between two antagonist processes called: fusion and fission. It is known that moderate stress triggers mitochondrial hyperfusion, this process is called: SIMH (Stress-Induced Mitochondrial Hyperfusion). During this thesis, we demonstrated that SIMH is accompanied by NF-κB activation through the mitochondrial E3 ubiquitin ligase MULAN. Our results suggest that during SIMH, MULAN forms a complex with the protein TRAF2 and modulates its ubiquitinylation to allow NF-κB signaling transduction. This work shows that, through their dynamics, mitochondria convert stress signals into a prosurvival response via NF-κB activation.In summary, our results illustrate the complexity of the ubiquitin-dependant regulation of NF-κB and attribute a new role in signaling transduction to the organelles

Thesis (Ph. D.)--University of California, San Diego, 2007.<br>Title from first page of PDF file (viewed March 9, 2007). Available via ProQuest Digital Dissertations. Vita. Includes bibliographical references.

Addenda pasted into back end-paper. Bibliography: leaves 107-147. The studies presented in this thesis have identified Nedd4 as a key protein involved in Na+-dependent downregulation of the epithelial Na+ channel (ENaC). These studies have aided in the molecular understanding of the familial hypertensive disorder, Liddle's syndrome, and the regulation of blood pressure in general.

I have identified Sina-Homologue (SinaH) as a novel <i>Drosophila </i>protein that is homologous to the E3 ubiquitin ligase Sina, but has different expression patterns throughout development. In this thesis I investigate the biochemical mechanisms of SinaH directed degradation in cells, and the physiological role of SinaH in <i>Drosophila</i>. I<i> </i>show that SinaH can direct the degradation of the transcriptional repressor Tramtrack using two different mechanisms. One is similar to Sina and requires the adaptor Phyllopod (Phyl), and the other is a novel mechanism of recognition. This novel mode of targeting for degradation is specific for the Tramtrack isoform, Ttk69. Ttk69 contains a region that is required for binding of SinaH and for SinaH directed degradation. This region contains an AxVxP motif, which is the consensus sequence found in substrates of the mammalian Sina like proteins. These results suggest that degradation directed by SinaH is more similar to that found in higher eukaryotes. In order to identify novel SinaH substrates and potential adaptor proteins, a yeast 2-hybrid screen was carried out. As well as others, this identified Numb as a potential substrate, and the protein Bruce as an E2 ligase and adaptor molecule. GST pulldown assays and coimmunoprecipitation experiments were used to verify some of these interactors, and Numb was found to be directed for degradation in cells. Flies that were deficient in <i>SinaH </i>and in <i>Sina </i>and <i>SinaH </i>were created using homogolous recombination. The genetic data, cell degradation assays and expression profiles together suggest that Sina and SinaH have distinct functions.

Post-translational modification of proteins by ubiquitin is a central regulatory process in all eukaryotic cells. Substrate selection and type of modification are events catalyzed by the E3 ligase, a component of the ubiquitin pathway. Several ubiquitin E3 ligases are implicated in cancer and other disease states, underlying the need for mechanistic insight of these enzymes. Parkinson’s disease is a neurodegenerative disorder characterised by the loss of dopaminergic neurons from the substantia nigra, the presence of Lewy Bodies, and pathogenic aggregates rich in ubiquitin. Autosomal Recessive Juvenile Parkinsonism (AR-JP), which is one of the most common familial forms of the disease, is directly linked to mutations in the Parkin gene (PARK2). Parkin is a RING E3 and catalyses a range of ubiquitination events (mono, multi mono, K48- and K63- linked poly) in concert with several E2s on a variety of substrates, including itself. Furthermore, Parkin is capable of binding the 26S proteasome and mediates selective degradation of target substrates. The data presented will demonstrate that the Ubiquitin-like domain (UblD) of Parkin functions to inhibit its auto-ubiquitination via a novel mechanism. Pathogenic Parkin mutations disrupt this inhibition and result in a constitutively active molecule. The inhibition is mediated by an intra-molecular interaction between UblD and the C-terminus of Parkin, and Lysine 48 on UblD participates in this interaction. The study also uncovered unique UblD/Ubiquitin Binding Regions (UBRs) on the C-terminus of Parkin that play a novel role in its RING E3 ligase activity. The observations provide critical mechanistic insights into the myriad functions of Parkin and the underlying basis of Parkinson’s disease.

Ubiquitination is one of the most abundant and versatile post-translation modifications in eukaryotes that affects many biological processes by modifying protein activity, interactions, localization and stability of substrates. E3 ligases have a key function in the process, acting as molecular ubiquitin-substrate matchmakers and providing specificity to the reaction. In this thesis, we aimed at characterizing the physiological and pathological functions of the human HECW1, a poorly studied E3 ligase which belongs to the NEDD4 family. HECW1 is preferentially expressed in the central nervous system (CNS) and it has been linked to neurodegeneration, in particular to the familial form of Amyotrophic Lateral Sclerosis (fALS). The Drosophila orthologue Hecw, that we recently identified and functionally characterized, is similarly enriched in the CNS and is involved in the dynamic regulation of RNPs required for neuronal health. The Hecw/HECW1 interactome is enriched in proteins involved in the autophagy/endolysosomal pathway and RNPs dynamics, whose dysfunction promote neurodegenerative diseases. Together these data suggest a protective role of HECW1 in neuronal homeostasis. To investigate into HECW1 physiological and disease-relevant neuronal function, we optimized a protocol to directly differentiate neurons from human iPSCs and we generated HECW1-KO iPSCs. We found that HECW1 expression in neurons is upregulated during differentiation and downregulated with aging, a typical behavior of components of the ubiquitin proteasome and autophagy pathways. Unbiased proteomic analysis showed deregulation of proteins involved in vesicle traffic and kinase activity in HECW-KO neurons. Targeted immunofluorescence, morphological and EM analysis revealed an accumulation of enlarged organelles positive for the autophagic and endo-lysosomal marker LAMP1 and of endolysosomal/autophagic compartments structures along filaments and in distal axons of HECW1-depleted neurons. Moreover, distal tips of HECW1-KO neurons showed the accumulation of abnormal, static WGA-aggregates, indicating an impairment in endosomal traffic. A second category of enriched HECW1 interactors is related to RNA metabolism. Co-immunoprecipitation analysis confirmed HECW1 interaction with the SG protein FMRP and the PB component EDC3. We also measured an increase number of constitutive PBs in HECW1-depleted neurons, suggesting a possible regulatory role of HECW1 in constitutive PB formation or clearance. The two phenotypes observed in HECW1-depleted neurons could be functionally linked, considering the involvement of autophagy in the clearance of persistent RNPs arising from chronic stress or disease mutations. Taken together, our results have uncovered an involvement of HECW1 in the regulation of the autophagy/endolysosomal pathway in neurons and a possible contribution in controlling the homeostasis of ribonucleoprotein particles. Future studies in motor neurons would help to understand the implications of these results for ASL, a disease where dysregulation of RNA metabolism, cytoplasmic mislocalization of RNA binding proteins and dysfunction in RNP dynamics, along with autophagy impairments appear to be at the basis of the pathogenesis.