Dissertationen zum Thema „Tribologie orale in vitro“

L’étude de la lubrification orale devient une problématique actuelle pour l’industrie agroalimentaire. Les analyses quantitatives permettent de comprendre et d’anticiper des mécanismes physiologiques, tels que la prédiction des phénomènes d’astringence des produits alimentaires. L’astringence se manifeste par une diminution de la lubrification de la muqueuse orale après la consommation de produits d’origine végétale. Cependant, les recherches actuelles sur la lubrification orale s’appuient sur des matériaux synthétiques qui représentent mal les tissus buccaux. Elles négligent les interactions entre les protéines salivaires sécrétées et les protéines transmembranaires, limitant ainsi la compréhension des mécanismes de lubrification.Cette thèse s’inscrit dans le projet MACARON qui vise à étudier le rôle de la muqueuse orale dans la perception sensorielle. Des modèles in vitro de muqueuse orale qui expriment la protéine transmembranaire MUC1 ont été développés pour simuler les interactions fondamentales entre MUC1 et les protéines salivaires. Ces interactions sont responsables de la lubrification et de l’hydratation des tissus. Par ailleurs, un tribomètre a été conçu pour effectuer des tests tribologiques in vitro sur ces modèles d’épithélium afin de suivre leur état de lubrification.Cette thèse se concentre ainsi sur l’étude des mécanismes moléculaires de la lubrification orale à travers une approche tribologique in vitro, en utilisant des paramètres physiques macro et micrométriques. Ce manuscrit propose en premier lieu une étude sur le rôle crucial de la mucine MUC1 et de sa structure dans la lubrification orale. La présence de MUC1 améliore la lubrification grâce à une meilleure rétention des protéines salivaires à la surface cellulaire. Ensuite, le manuscrit présente une exploration des mécanismes moléculaires de l’astringence. Les essais tribologiques in vitro en présence de composés astringents montrent que ces substances forment des agrégations à la surface épithéliale qui diminuent la lubrification orale. Parallèlement, nos travaux montrent que des mécanismes de protection, notamment la dissociation de MUC1 et l’interaction des protéines riches en proline avec les tanins, atténuent ces effets néfastes sur la lubrification.À travers une étude complémentaire, des corrélations entre la perception sensorielle et nos propriétés physiques mesurées sont établies, démontrant la capacité de notre méthodologie à classer des individus selon leur sensibilité à l’astringence. Enfin, la dernière étude présente le développement d’un nouveau modèle de muqueuse orale visant à reproduire les propriétés mécaniques et physico-chimiques de la muqueuse in vivo.Cette thèse propose une méthodologie innovante pour l’étude de la lubrification orale, en particulier en s’intéressant à des mécanismes responsables de la sensation d’astringence grâce à l’utilisation de modèles de muqueuse toujours plus proches des tissus oraux physiologiques
The study of oral lubrication has become a current concern for the food industry. Quantitative analyses allow for understanding and anticipating physiological mechanisms, such as predicting astringency phenomena in food products. Astringency is characterized by a decrease in oral mucosa lubrication following the consumption of plant-based products. However, current research on oral lubrication relies on synthetic materials that poorly represent oral tissues, neglecting interactions between secreted salivary proteins and transmembrane proteins, thus limiting the understanding of lubrication mechanisms. This thesis is part of the MACARON project, which aims to investigate the role of oral mucosa in sensory perception. In vitro models of oral mucosa expressing the transmembrane protein MUC1 have been developed to simulate fundamental interactions between MUC1 and salivary proteins responsible for tissue lubrication and hydration. Additionally, a tribometer has been designed to perform in vitro tribological tests on these epithelial models to monitor their lubrication state. Thus, this thesis focuses on studying the molecular mechanisms of oral lubrication through an in vitro tribological approach, using macro- and micrometric physical parameters. Firstly, this manuscript provides a study on the crucial role of MUC1 mucin and its structure in oral lubrication. The presence of MUC1 enhances lubrication by improving the retention of salivary proteins on the cell surface. Secondly, the manuscript explores molecular mechanisms of astringency. In vitro tribological tests in the presence of astringent compounds show that these substances form aggregations on the epithelial surface, reducing oral lubrication. Concurrently, our work demonstrates protective mechanisms, including the dissociation of MUC1 and the interaction of proline-rich proteins with tannins, mitigating these adverse effects on lubrication. Through additional study, correlations between sensory perception and our measured physical properties are established, demonstrating the ability of our methodology to classify individuals based on their sensitivity to astringency. Finally, the last study presents the development of a new oral mucosa model aiming to reproduce mechanical and physicochemical properties of in vivo mucosa. This thesis proposes an innovative methodology for studying oral lubrication, particularly focusing on mechanisms responsible for astringency sensation through the use of mucosa models increasingly closer to physiological oral tissues

Nell’ultimo decennio il mercato clandestino delle droghe d’abuso ha visto la nascita, prima, e l’affermazione, poi, di sostanze sintetiche molto più pericolose delle droghe tradizionali. Nel 2012 la Commission on Narcotic Drugs le ha classificate con il termine di NPS o “Nuove Sostanze Psicoattive”, legalmente commercializzate come profumatori ambientali denominati “Spice”. Risultati chimico-tossicologici hanno evidenziato la presenza, in questi prodotti, di cannabinoidi sintetici particolarmente affini ai recettori dei cannabinoidi CB1. Obiettivo della Ricerca è stato quello di valutare la stabilità strutturale di queste molecole quando sottoposte ad un cambiamento dello stato fisico dovuto alle alte temperature raggiunte durante il processo di fumo. L’attenzione è stata richiamata dalla saliva, matrice biologica immediatamente interessata nel processo di fumo, caratterizzata da prelievo non invasivo e che ha permesso l’ottenimento di dati certi e ripetibili in spettrometria di massa ad alta risoluzione. La struttura altamente lipofilica delle molecole impone l’uso di contenitori in vetro, al fine di evitarne l’adsorbimento sulla superficie delle provette in polipropilene, mentre la temperatura di conservazione a cui è sottoposta la matrice biologica influisce sulla potenziale degradazione dei cannabinoidi sintetici ad opera degli enzimi salivari e/o microbici. I risultati ottenuti evidenziano una stabilità strutturale certa delle molecole sottoposte ad indagine, ma il dato analitico ottenuto, utilizzabile sia in ambito clinico che forense, deve rispettare un rigido protocollo analitico/strumentale.
In the last decade the illegal drug market has seen the birth, first, and the affirmation, then, of synthetic substances much more dangerous than traditional drugs. In 2012 the Commission on Narcotic Drugs classified them under the term NPS or "New Psychoactive Substances", legally marketed as environmental fragrances named "Spice". Chemical-toxicological results have highlighted the presence, in this products, of synthetic cannabinoids particularly affine to CB1 cannabinoid receptors. The aim of the research was to evaluate the structural stability of these molecules when subjected to a change of the physical state due to the high temperatures reached during the smoking process. The attention was drawn to saliva, the biological matrix immediately involved in the smoking process, characterized by non-invasive sampling and which allowed obtaining reliable and repeatable data in high-resolution mass spectrometry. The highly lipophilic structure of the molecules requires the use of glass containers, in order to avoid adsorption on the surface of polypropylene tubes, while the storage temperature to which the biological matrix is subjected influences the potential degradation of synthetic cannabinoids by salivary and/or microbial enzymes. The results obtained show a certain structural stability of the molecules under investigation, but the analytical data obtained, usable both in the clinical and forensic field, must comply with a strict analytical/instrumental protocol.

La performance du couple prothétique tête fémorale/cupule impacte fortement la durée de vie d’une prothèse totale de hanche. Les céramiques affichent une excellente combinaison de propriétés de biocompatibilité, mécaniques et tribologiques. Les composites ZTA formés d’une matrice d’alumine renforcée en zircone sont optimisés pour offrir le meilleur compromis de dureté, stabilité chimique, ténacité et résistance mécanique. La prédiction de la performance de ces matériaux doit prendre en compte les trois principaux modes de dégradation identifiés en configuration céramique/céramique (CoC) : le choc avec décoaptation, le frottement et le vieillissement à basse température. Ces modes sont susceptibles d’être simulés in vitro à partir de tests expérimentaux, respectivement, sur une machine de chocs, un simulateur de marche et en autoclave. L’objectif de ce projet est de combiner ces tests afin de mieux résoudre l’équation in vitro = in vivo. Les chocs dominent les processus de dégradation avec la formation de bandes d’usure. Le matériau testé a montré une excellente résistance au vieillissement. La dégradation induite par le test d’usure standard sur simulateur de marche est négligeable et pose la question de la pertinence de ce test pour les couples CoC. L’importance de la prise en compte des chocs dans les tests expérimentaux a été confortée grâce à une analyse d’explants. Une transformation de phase de la zircone a été mécaniquement induite dans les bandes d’usure créées in vitro et in vivo. Un mécanisme de dégradation a été suggéré au sein de ces bandes. La réponse du matériau est en partie déterminée par la force appliquée au cours des chocs
The performance of the prosthetic couple (femoral head/cup) influences strongly the lifetime of a total hip prosthesis. Ceramics exhibit an excellent combination of biocompatibility, mechanical resistance and tribological properties. Zirconia toughened alumina (ZTA) composites are made of an alumina matrix and well dispersed zirconia particles. They are tailored in order to offer the best compromise of hardness, chemical stability, toughness and mechanical resistance. The prediction of the performance of such materials must take into consideration the three main sources of degradation identified for Ceramic-on-Ceramic (CoC) bearings: shocks due to micro-separation, friction and low temperature degradation (LTD). Experimental tests on a shock machine, a hip-walking simulator and in an autoclave are able to simulate in vitro each of these sources of degradation, respectively. The aim of the project is to combine these tests in order to solve better the equation in vitro = in vivo. Shocks dominate the processes of degradation with the formation of wear stripes. The tested material showed an excellent resistance to LTD. The damage induced by the standard wear test on a hip-walking simulator is negligible, which raises the question about the relevance of this test for CoC couplings. An analysis of explants confirmed the decisive role of shocks in experimental tests. Zirconia phase transformation was mechanically induced within both in vitro and in vivo wear stripes. A degradation mechanism was suggested within the stripes. The material response is partly determined by the force applied during shocks

Negli ultimi anni, sono stati proposti nuovi composti/strumenti per mantenere la salute orale e/o per trattare diversi problemi dentali/parodontali. Come è noto, la carie dentale si pone tra le infezioni più diffuse ed una sua gestione impropria comporta lo sviluppo di malattie rilevanti ed eventualmente all'estrazione dell’elemento dentale. Una vasta letteratura documenta il ruolo patogenetico di diversi microorganismi che sono in grado di persistere nel cavo orale, in quanto capaci di organizzandosi come comunità microbica eterogenea (comprendente batteri, virus e funghi), adesa alle diverse superfici, strettamente racchiusa in una matrice polimerica di origine polisaccaridica. Tale comunità sessile, che se adesa ai denti è detta placca dentale, è notoriamente refrattaria non solo alle comuni procedure di pulizia con collutori e dentifrici/spazzolini, ma anche ai farmaci antimicrobici e alle difese immunitarie dell'ospite. Questo scenario si complica ulteriormente considerando che l’ampio uso di attacchi fissi o rimovibili nei trattamenti ortodontici espande la problematica e la conseguente sfida clinica, essendo tali dispositivi un ulteriore habitat utile per l'adesione microbica, la crescita e la formazione di biofilm. In misura simile, i pazienti con impianti dentali possono sviluppare localmente malattie legate alla produzione di biofilm impianto-associato, consentendo la progressione clinica verso quadri di perimucosite o perimplantite infettiva. Da qui, sorge la necessità di strumenti/composti innovativi per facilitare la rimozione di microrganismi potenzialmente patogeni e il mantenimento dell'omeostasi del cavo orale. Oltre ai patogeni orali più noti, tra cui il gruppo Streptococcus mutans e il "complesso rosso" dei bacilli anaerobi Gram-negativi, anche Candida albicans (C. albicans), Staphylococcus aureus (S. aureus) e Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) possono essere agenti eziologici di malattie orali. Il primo germe, spesso ospitato come commensale delle mucose sane, è il principale patogeno fungino coinvolto nella mucosite orale. Gli altri due sono patogeni molto subdoli, responsabili di malattie ad ampio spettro; considerati i loro numerosi fattori di virulenza e l’ampia farmaco-resistenza, S. aureus e P. aeruginosa sono ampiamente utilizzati per studi in vitro come preziosi prototipi di patogeni Gram-positivi e Gram-negativi. Lo scopo della presente tesi era di valutare in vitro ed ex vivo l'efficacia antimicrobica e antibiofilm di approcci innovativi contro i patogeni orali. Questa tesi ha fornito prove in vitro ed ex vivo sull'efficacia antimicrobica di composti nuovi e tradizionali per la cura e l’igiene del cavo orale, da cui possono derivare in prospettiva scelte più razionali e consapevoli. Ad esempio, un nuovo utilizzo del prodotto endodontico Cupral potrebbe essere proposto nelle pratiche di igiene quotidiana, così come potrebbe essere privilegiato il trattamento delle peri-implantiti con il sistema Bic-40, vista la sua particolare efficacia nella pulizia e nella decontaminazione di superfici lisce e ruvide in titanio, senza influire sulla vitalità delle cellule staminali dell’ospite. Inoltre, il nostro lavoro ha aggiunto nuove conoscenze sulle proprietà antimicrobiche di un composto naturale come la propoli e sui suoi possibili meccanismi d'azione, offrendo nuove opportunità nella ricerca di molecole antimicrobiche alternative. Infine, abbiamo dimostrato che il dentifricio e la gomma Biorepair Peribioma possono influenzare profondamente il comportamento dei microorganismi del cavo orale, a favore di condizioni utili al mantenimento dello stato di salute di questo distretto anatomico. Questo lavoro ha fornito nuove evidenze su come contrastare i patogeni, particolarmente se produttori di biofilm; facilitando il disegno di strategie mirate per la prevenzione e/o il trattamento delle infezioni dentali e orali associate al biofilm.
During recent years, novel compounds/tools are being proposed to maintain oral health and/or to treat dental/periodontal problems. As well known, dental caries are among the most diffused infections and their improper management turns towards relevant disease(s) and eventually tooth extraction. Extensive literature documents the pathogenic role of certain microorganisms and their ability to persist in the oral cavity, as a complex microbial community, including bacteria, viruses and fungi, tightly enclosed in a polymeric matrix of polysaccharide origin. Such sessile community, and particularly dental plaque, the first deeply studied human-associated biofilm, is notoriously refractory not only to common cleaning procedures by mouthwashes and tooth-pastes/brushes, but also to antimicrobial drugs and host immune defenses. This scenario becomes further complicated considering that the widely diffused orthodontic treatments, with fixed or removal brackets, extend the clinical challenge, being such devices an additional good habitat for microbial adhesion, growth and biofilm formation. To a similar extent, patients with dental implants may locally develop biofilm-related diseases, allowing clinical progression toward pathogen-related peri-mucositis or peri-implantitis. From here, the need arises for innovative tools/compounds to facilitate microbial removal and maintenance of oral cavity homeostasis. Besides the most investigated oral pathogens, including Streptococcus mutans-group and the “red complex” Gram-negative anaerobe bacilli, also Candida albicans (C. albicans), Staphylococcus aureus (S. aureus) and Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) may occur as causative agent of oral diseases. The first, often harbored as commensal of healthy mucosae, is the main fungal pathogen involved in oral mucositis. The latter two are subtle pathogens, responsible of wide-spectrum diseases; they are being extensively used for in vitro studies, because of their numerous virulence factors and wide-spectrum antimicrobial resistance. The aim of the present thesis was to evaluate in vitro and ex vivo, the antimicrobial and antibiofilm efficacy of innovative approaches against oral pathogens. Our data provided in vitro and ex vivo evidence on the antimicrobial efficacy of several dental-care compounds. A novel use of the endodontic product Cupral could be proposed in daily hygiene practices. The Bic-40 treatment was shown as the best approach in cleaning smooth and rough titanium surfaces (without altering their properties); importantly, its device-decontamination efficacy did not affect the biological properties of reparative stem cells. Furthermore, our work added new insights on the anti-microbial properties of a natural compound, such as propolis, and on its possible mechanisms of action. At last, we showed that the Biorepair Peribioma toothpaste and gum deeply affected oral microorganisms’ behavior, drastically impairing their ability to contaminate and produce plaque onto orthodontic devices; interestingly, replacement by beneficial microorganisms was observed. The overall take-home message from this research is that basic science may greatly increase our knowledge on how to counteract biofilm-producing pathogens; in turn, this will facilitate prevention and/or treatment of dental and oral biofilm-associated infections, making a huge difference in terms of health promotion.

Le but de ce travail a été de valider in vitro et in vivo une formulation d’insuline administrable par voie orale. Afin de permettre à l’insuline de franchir les barrières chimiques gastrointestinales (pH, enzymes) et physiques (épithélium intestinal), nous avons développé un système de double encapsulation. La première encapsulation permettant le passage de la barrière intestinale est réalisé à partir d’acide poly(lactique-co-glycolique) afin d’obtenir des nanoparticules par la méthode de double émulsion eau/huile/eau. La seconde encapsulation a consisté à intégrer ces nanoparticules dans une gélule gastrorésistante enrobée d’Eudragit® L100-55. Les nanoparticules (NP) synthétisées ont une taille moyenne de 165 ±4nm et un taux d’encapsulation de l’insuline de 95%. La toxicité a été évaluée par un test de viabilité sur une lignée de cellules intestinales, les Caco-2, en utilisant des concentrations de nanoparticules de 0 à 80 mg de PLGA/mL /cm2. Une toxicité apparaît mais à des doses supraphysiologiques. L’absorption des nanoparticules par les Caco-2 a été quantifiée par cytométrie en flux et visualisée par microscopie confocale. Il a été ainsi démontré que l’absorption des nanoparticules se fait selon un mécanisme clathrine-dépendant. Des rats diabétiques (STZ) ont reçu des NP par gavage sans qu’il y ait d’effet sur la glycémie, ce qui atteste que ces NP ne sont pas gastrorésistants, d’où la nécessité de la gélule entérique. Les administrations d’insuline en solution, faites par voie intraduodénale, n’ont aucun effet sur la glycémie, en revanche, l’insuline encapsulée administrée de la même façon induit une normoglycémie au bout de 8h. La biofonctionnalité intestinale des NP a été évaluée en administrant de l’insuline par voie intrapéritonéale et de l’insuline encapsulée par voie intraduodénale à des rats diabétiques et la biodisponibilité après administration par ces mêmes voies de peptide-C. La biofonctionnalité est d’au moins 20% et la biodisponibilité de 6,3%. La lyophilisation et le compactage des nanoparticules ont permis de les inclure dans les gélules entériques et de débuter des tests de glycémie après administration orale. Les procédures de synthèse utilisées permettent d’obtenir des NP absorbables par un épithélium intestinal in vitro et qui sont biofonctionnelles après administration intraduodénale. Cette nouvelle formulation de l’insuline semble être une approche prometteuse pour l’administration d’insuline administrable par voie orale
The purpose of this study was to develop a new formulation of oral insulin. Normally, peptide hormones like insulin are given by parenteral injections routes because they are destroyed by the acid and proteolytic enzymes in stomach and intestine. Our project focuses on insulin double encapsulation for oral administration. The first system of encapsulation of insulin is based on Poly(Lactide-co-Glycolide) Acid (PLGA) nanoparticles. This should allow the uptake and the transport across mucosal intestinal barrier. These nanoparticles are put in a gastroresistant capsule made of Eudragit® L100-55. After synthesis, the size of nanoparticles is 165 ±4 nm and the rate of encapsulation is around 95%. In vitro, the absorption has been quantify by flow cytometry and visualized by confocal microscopy. A clathrin dependant endocytosis pathway mechanism has been demonstrated. In vivo, the biofunctionnality of the nanoparticles was evaluated after subcutaneous injections. After nanoparticles gastric force feeding no effect was seen on the glycemia because nanoparticles are not gastroresistant. We measured the kinetic of the glycemia and the biofunctionnality of NP in streptozotocin-induced diabetic rats after intra-duodenal injections of insulin nanoparticles and intraperitoneal injections of insulin. The bioavaibility was evaluated after quantification of the C-peptidemia after intra-peritoneal injections of C-peptide and after intraduodenal injections of the same quantity of encapsulated C-peptide. Intraduodenal injections of insulin nanoparticles induce a significant decrease of glycemia 8h after injection. In comparison with intra-peritoneal injections, results showed that nanoparticles’ biofunctionnality is at less 20% and the biodisponibility is 6,3%. PLGA insulin-loaded nanoparticles are efficient and the biological effect of insulin is preserved. These polymeric particles allow the absorption of insulin through intestinal mucosa into the bloodstream. Thus this new delivery insulin formulation seems to be an interesting approach

Les archaea constituent l'un des quatre domaines connus du vivant. Contrairement à ce que leur nom laisse supposer, elles ont colonisé tous les écosystèmes et les microbiotes de certains hôtes dont l'Homme. Chez l'homme, certaines espèces d'archaea méthanogènes ont été associées aux muqueuses orale, intestinale et vaginale. Ces archaea méthanogènes sont des procaryotes anaérobies stricts et leurs conditions de culture restent fastidieuses et très mal connues. Quatre archaea methanogènes seulement ont été isolées à partir de prélèvements humains y compris dans le microbiote digestif Methanobrevibacter smithii détectée dans 95,7% des individus, Methanosphaera stadtmanae retrouvée chez environ un tiers des individus et plus récemment dans notre laboratoire Methanomassilicoccus luminyensis détectée en moyenne chez 4% des individus avec une prévalence liée à l'âge ; et dans le microbiote orale Methanobrevibacter oralis isolée à partir de la plaque dentaire
Archaea is one of four known domains of life. Unlike what their name suggests, they some species of methanogenic archaea have been associated with oral, vaginal and intestinal mucosa. These methanogenic archaea are obligate anaerobic prokaryotes and their culture conditions are fastidious and very poorly known. Only four methanogenic archaea have been isolated from human samples including the digestive microbiota; Methanobrevibacter smithii detected in 95.7% of individuals Methanosphaera stadtmanae found in approximately one third of individuals and more recently in our laboratory Methanomassilicoccus luminyensis detected on average in 4% of individuals with a prevalence of age-related, and in the oral microbiota Methanobrevibacter oralis isolated from dental plaque

This thesis studies how to increase the expected satiating ability in dairy products analyzing the effect of the incorporation of certain ingredients. The study of food reformulation with high expected satiating ability contributes to moderate size meal choice and to regulate food intake. In this thesis, two factors influencing the satiating ability perception of semi-solid foods have been mainly studied: a) the increase in oral processing time that produces prolonged orosensory signals, and b) the increase in protein content. The increase in oral processing time is produced by, for example, higher consistencies, mouth-coating or creaminess sensations. These features can be modified by the addition of hydrocolloids. Native starch, modified starch, ¿-carrageenan and guar gum were added to increase the viscosity and consistency of milkshakes. Rheological characterization of the products revealed very different behavior patterns depending on the type of hydrocolloid. The addition of saliva in the studies showed modified sensory perceptions, so its inclusion is desirable and more realistic. The addition of hydroxypropyl methylcellulose (HPMC) and the effect of milk solids and cream in milk-based desserts was also studied. In addition to HPMC dominant effect on the temporality of perceptions, the presence of fat globules or milk solids modulated such perceptions. Yogurt was selected to increase protein content, adding twice the original amount of protein from different milk fractions, and starch. Yogurt with milk powder addition was the most accepted sample and it was closer to the 'ideal' characteristics of a satiating yogurt according to consumers, with a series of sensory attributes that contribute to the feeling of expected satiety. On the other hand, in vitro oral digestion showed that physically modified starch granules remain unchanged after the attack of ¿-amylase, and would be responsible for its consistency and creaminess. In addition, it was found that the sensation of astringency was undesirable; tribological studies allowed to interpret yogurt sensory characteristics. The lubricity of some samples did not reflect the difference in astringency between samples indicating that this was not a purely tactile perception caused by an increase in friction. The addition of physically modified starch significantly reduced friction coefficients values due to soluble starch polymers and starch granules preservation. All the strategies allowed to gain understanding on how to reformulate food increasing its satiating ability perception. Such strategies could be extrapolated to other food categories, what broadens the scope of the results obtained in this thesis.
La presente tesis estudia cómo aumentar las expectativas de la capacidad saciante en productos lácteos analizando el efecto de la incorporación de determinados ingredientes. El estudio de la reformulación de alimentos con alta expectativa sobre su capacidad saciante contribuye a moderar la elección de las raciones de alimentos y a regular la ingesta. En la presente tesis se han estudiado principalmente dos de los factores que más influyen en la percepción de capacidad saciante de alimentos semisólidos: a) el aumento en el tiempo de procesado oral que produce saciedad debido a una prolongación de las señales orosensoriales, y b) el alto contenido en proteínas. El aumento del tiempo de procesado oral lo producen, por ejemplo, mayores consistencias, recubrimiento oral o sensaciones de cremosidad, que son características que se pueden modificar por adición de hidrocoloides. Se emplearon almidón nativo y modificado, goma guar y ¿-carragenato para aumentar la viscosidad y consistencia de batidos lácteos. La caracterización reológica de los productos reveló patrones de comportamiento muy diferentes dependiendo del tipo de hidrocoloide. La adición de la saliva en los estudios demostró modificar las percepciones sensoriales, por lo que su inclusión resulta recomendable y más realista. Se estudió también la adición de hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC) y el efecto de dos componentes normales en productos lácteos (sólidos lácteos y nata). Además del efecto dominante del HPMC en la temporalidad de las percepciones, la presencia de glóbulos de grasa o sólidos de la leche modularon dichas percepciones. Para aumentar el contenido en proteína se seleccionó como alimento el yogur, al que se añadió el doble de la cantidad de proteína de distintas fracciones lácteas y almidón. El yogur con el doble de leche en polvo fue globalmente el más aceptado y más cercano a las características "ideales" según los consumidores, con una serie de atributos sensoriales que contribuyen a la sensación de saciedad esperada. Por otro lado, la digestión oral in vitro mostró que los gránulos de almidón procedentes de almidón físicamente modificado permanecen inalterados después del ataque de la ¿-amilasa de la saliva, y serían los responsables de la mayor consistencia y cremosidad. Adicionalmente, se encontró que la sensación de astringencia resultaba negativa; los estudios tribológicos permitieron interpretar las características sensoriales. Las propiedades lubricantes de algunas muestras no reflejaron la diferencia de astringencia sensorial indicando que ésta no era una percepción puramente táctil causada por un aumento en la fricción. La adición de almidón modificado físicamente redujo significativamente los valores de los coeficientes de fricción relacionados con los polímeros de almidón solubles y la conservación de gránulos en el almidón. Todas las estrategias abordadas permitieron comprender y ahondar en los conocimientos que conducen a cómo reformular un alimento para aumentar la percepción de saciedad. Dichas estrategias son extrapolables a otras categorías de alimentos lo que amplía el alcance de los resultados obtenidos en la presente tesis.
La present tesi estudia com augmentar les expectatives de la capacitat saciant en productes lactis analitzant l'efecte de la incorporació de determinats ingredients. L'estudi de la reformulació d'aliments amb alta expectativa sobre la seua capacitat saciant contribueix a moderar l'elecció de les racions d'aliments i a regular la ingesta. En la present tesi s'han estudiat principalment dos dels factors que més influeixen en la percepció de capacitat saciant d'aliments semisòlids: a) l'augment en el temps de processat oral que produeix sacietat a causa d'una prolongació dels senyals orosensorials, i b) l'alt contingut en proteïnes. L'augment del temps de processat oral el produeixen, per exemple, majors consistències, recobriment oral o sensacions de cremositat, que són característiques que es poden modificar per addició d'hidrocol·loïdes. S'emprà midó natiu i modificat, goma guar i ¿-carragenat per augmentar la viscositat i consistència de batuts lactis. La caracterització reològica dels productes revelà patrons de comportament molt diferents depenent del tipus d'hidrocol·loïde. L'addició de la saliva en els estudis demostrà modificar les percepcions sensorials, per la qual cosa la seua inclusió resulta recomanable i més realista. S'estudià també l'addició d'hidroxipropilmetilcel·lulosa (HPMC) i l'efecte de dos components normals en productes lactis (sòlids lactis i nata). A més de l'efecte dominant del HPMC en la temporalitat de les percepcions, la presència de glòbuls de greix o sòlids de la llet van modular les citades percepcions. Per augmentar el contingut en proteïna es va seleccionar com a aliment el iogurt, a què s'afegí el doble de la quantitat de proteïna de diverses fraccions làcties i midó. El iogurt amb el doble de llet en pols fou globalment el més acceptat i més pròxim a les característiques "ideals" segons els consumidors, amb una sèrie d'atributs sensorials que contribueixen a la sensació de sacietat esperada. D'altra banda, la digestió oral in vitro mostrà que els grànuls de midó procedents de midó físicament modificat romanen inalterats després de l'atac de l'¿-amilasa de la saliva, i serien els responsables de la major consistència i cremositat. Addicionalment, es trobà que la sensació d'astringència resultava negativa; els estudis tribològics permeteren interpretar les característiques sensorials. Les propietats lubricants d'algunes mostres no reflectiren la diferència d'astringència sensorial indicant que esta no era una percepció purament tàctil causada per un augment en la fricció. L'addició de midó modificat físicament reduí significativament els valors dels coeficients de fricció relacionats amb els polímers de midó solubles i la conservació de grànuls en el midó. Totes les estratègies abordades permeteren comprendre i aprofundir en els coneixements que condueixen a com reformular un aliment per augmentar la percepció de sacietat. Les citades estratègies són extrapolables a altres categories d'aliments, cosa que amplia l'abast dels resultats obtinguts en la present tesi.
Morell Esteve, P. (2017). Diseño de alimentos lácteos con capacidad saciante. Relación entre estructura, procesamiento oral y percepción [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/89093
TESIS

2009/2010
La Palitossina (PLTX), una delle biotossine marine più tossiche finora note, è saltata agli onori della cronaca in seguito al suo frequente rilevamento in campioni di una microalga tropicale, Ostreopsis ovata, ormai diffusa anche in Mar Mediterraneo, dove sono stati segnalati più volte problemi respiratori in concomitanza alla sua presenza. La tossina è stata rilevata anche in molluschi ed altri prodotti ittici, che possono fungere da vettori per l’ultimo anello della catena alimentare, l’uomo. Poiché in paesi tropicali sono stati segnalati casi di intossicazione gravi, anche letali, in seguito all’ingestione di pesci e crostacei contaminati con PLTXs, si rende necessario monitorare la presenza di questi composti nei prodotti ittici e/o nelle microalghe produttrici, anche in assenza di una legislazione in merito. All’inizio di questo lavoro erano disponibili solo pochi dati relativi alla tossicità acuta di questo composto, spesso purificato con protocolli non perfezionati. Poiché anche i dati clinici disponibili non permettevano un’esatta definizione dell’Acute Reference Dose (ARfD), necessaria per determinare i livelli massimi di tossina ammissibili nei prodotti ittici, si è deciso inizialmente di studiare la tossicità acuta della PLTX (e di un analogo 42-OH-PLTX) dopo somministrazione orale nel topo. I sintomi e le analisi cliniche condotte sui topi hanno indicato un coinvolgimento del sistema neuromuscolare. Questo studio, insieme ad altri pubblicati nel frattempo, hanno permesso agli esperti dell’EFSA di definire la concentrazione di 30 μg di tossina per Kg di polpa di molluschi quale livello al di sopra del quale si possano manifestare effetti tossici nell’uomo. Si è proceduto poi alla messa a punto di due saggi per la determinazione di questi composti: un saggio strutturale di tipo ELISA ed uno funzionale, il saggio emolitico. Il saggio ELISA (sandwich indiretto) è stato messo a punto utilizzando l’anticorpo monoclonale 73D3, e un anticorpo policlonale di coniglio prodotto presso l’Università di Trieste. Il saggio rileva la PLTX in un range di concentrazioni che vanno da 1,25 a 40 ng/ml ed è in grado di quantificare con la stessa sensibilità anche la 42-OH-PLTX, isolata e caratterizzata dal punto di vista chimico durante questo periodo di dottorato dal gruppo del prof. E. Fattorusso (Università di Napoli Federico II), in un campione di palitossina gentilmente fornitoci dal dr. M. Poli (Maryland, USA). Il saggio ELISA è in grado di rilevare anche l’Ostreocina-d, un altro analogo della PLTX, ma a concentrazioni maggiori rispetto a quelle della PLTX (³40 ng/ml). Il mancato rilevamento di acido okadaico, acido domoico, brevetossina-3, saxitossina e yessotossina (tossine che possono essere presenti insieme alla PLTX nei prodotti ittici contaminati) indica la specificità del saggio. Siamo poi passati alla messa a punto del saggio emolitico, ampiamente usato in letteratura per il rilevamento di PLTX e di composti palitossino-simili. Questo saggio sfrutta la capacità della tossina di indurre emolisi tardiva probabilmente tramite l’alterazione della Na+/K+-ATPAasi (NAKA). In letteratura, però, non è disponibile un protocollo standardizzato e la variabilità dei risultati riportati è notevole. Si è pertanto proceduto a realizzare il saggio emolitico, esplorando le variabili che ne influenzano la performance, ottenendo una EC50 = 13,2 pM per la PLTX. Gli anticorpi monoclonale e policlonale anti-PLTX hanno inibito con equa potenza l’emolisi indotta da PLTX e possono quindi essere usati per verificare la specificità dell’emolisi in campioni incogniti. Dopo aver verificato che anche la 42-OH-PLTX condividesse lo stesso recettore della PLTX mediante un saggio di binding indiretto alla NAKA (EC50 di 28.2 nM e 29.4 nM rispettivamente per 42-OH-PLTX e PLTX), è stato eseguito il saggio emolitico anche sulla 42-OH-PLTX, ottenendo dei risultati analoghi (EC50 = 7.6 pM) a quelli della PLTX. Nell’ottica di un utilizzo di questo saggio in situazioni di monitoraggio si è valutata la possibilità di ridurre i suoi tempi di esecuzione e in tal senso, cambiando la concentrazione salina della soluzione tampone al 62 % di quella normale, si è riusciti a ridurre il tempo di incubazione di 4 volte (1 h anziché 4 h). La curva concentrazione-risposta ottenuta dopo incubazione di 1 h con la PLTX in tampone al 62 % è risultata perfettamente sovrapponibile a quella ottenuta dopo 4 h di incubazione della tossina in tampone 100%. Al contrario, nessuna delle concentrazioni di PLTX testate ha dato emolisi dopo incubazione di 1 h della tossina in tampone 100%. Questo aspetto è particolarmente interessante perché permetterebbe di distinguere l’emolisi dovuta a palitossina da una emolisi aspecifica, semplicemente conducendo il saggio in 1 ora in parallelo nei due tamponi 62 % e 100 %, evitando l’uso di anticorpi anti-PLTX. In particolare, nel caso di un campione ignoto che dia emolisi in PBS al 62 % e non in PBS al 100 %, il risultato fornirebbe un primo indizio della presenza di palitossina, da confermare con metodi di riferimento (LC-MS). Se invece l’emolisi avviene ad entrambe le concentrazioni di PBS, dopo incubazione per 1 ora, essa potrebbe dipendere da un’azione aspecifica non imputabile alla sola palitossina. La presenza di una proliferazione massiccia (6.700.000 di cellule/litro) di Ostreospis cf. ovata nel Golfo di Trieste, ci ha permesso di utilizzare gli anticorpi monoclonale e policlonale per la localizzazione immunocitochimica delle tossine nelle singole cellule di microalghe. Per la prima volta è stata così visualizzata la presenza delle palitossine in cellule di Ostreopsis cf. ovata, che risultano distribuite in tutto il citoplasma. La positività per le tossine è stata verificata in tutte le cellule di Ostreopsis analizzate, mentre nessuna cellule di Coolia monotis osservate è risultata positiva, a conferma della specificità verso la PLTX del segnale degli anticorpi. L’analisi HR LCMS ha evidenziato la presenza di ovatossine-a, -b, -c, -d/-e, con una forte prevalenza di ovatossinaa (circa 80%, 45-64 pg/cellula), mentre per la prima volta in un campione naturale non è stata rilevata la presenza di PLTX. Questi risultati ci hanno permesso di concludere che entrambi gli anticorpi utilizzati sono in grado di riconoscere anche le ovatossine, analoghi della palitossina preponderanti nel Mar Mediterraneo. Inoltre, la tecnica immunocitochimica eseguita direttamente sulle microalghe potrebbe permettere un’allerta precoce della presenza di palitossine, ad esempio prima del loro ingresso/accumulo nella catena alimentare, evitando eventuali problemi per la salute pubblica. Un altro approccio per il rilevamento della tossina è stato fatto utilizzando la spettroscopia Raman. La palitossina (il cui spettro Raman è stato qui registrato per la prima volta) è stata ricercata in singole cellule di Ostreospis, depigmentate con acetone-esano 1:1. Non sono stati riscontrati segnali univocamente attribuibili alle palitossine negli spettri Raman di Ostreopsis, probabilmente a causa della loro uniforme diffusione citoplasmatica, come visualizzato in immunocitochimica. Nelle cellule non depigmentate con acetone:esano 1:1 è stata confermata le presenza del carotenoide peridinina. L’analisi Raman di cellule in coltura di Ostreopsis cf. ovata nelle diverse fasi di crescita ha evidenziato forti segnali associabili ad acidi grassi polinsaturi, già riscontrati in Ostreopsis cf. ovata con altre tecniche. L’analisi HR LC-MS delle cellule in coltura nelle varie fasi di crescita ha mostrato, analogamente alle relative popolazioni naturali, un elevato contenuto di ovatossina-a (circa 55%, 7.5–19.7 pg/cellula) e minori quantità di altre ovatossine, con la palitossina presente in tracce (< 0,1 pg/cellula). Si è osservato che il contenuto di tossine aumenta con l’età della coltura, con le cellule in fase senescente (giorno 25 dall’avvio della coltura) contenenti circa il doppio di tossina delle cellule in fase stazionaria (giorno 18). Quindi, analogamente a quanto si verifica per altri metaboliti secondari negli organismi vegetali, l’accumulo di queste tossine raggiunge il massimo generalmente verso la fine del ciclo vitale.
XXIII Ciclo
1983

La miltéfosine (hexadecylphosphocholine, HePC) est une nouvelle molécule disponible pour le traitement de la leishmaniose viscérale. Elle a comme particularité et avantage majeur d'être active après une administration par voie orale. La voie orale est une voie d'administration de choix: elle est non invasive, souvent de faible coût et favorise l'observance du traitement. Le passage de la miltéfosine à travers la barrière intestinale est très peu décrit dans la littérature. Ce travail de thèse a donc comme objectif d'étudier les effets de la miltéfosine sur l'épithélium intestinal et de déterminer les mécanismes mis en jeu lors de sa capture et de son transport sur un modèle in vitro composé de cellules épithéliales Caco-2 en culture. Ces données ont été exploitées pour développer une bithérapie antileishmanienne administrée par voie orale: la potentialité de la miltéfosine à améliorer la biodisponibilité orale de l'amphotéricine B, un autre agent antileishmanien, a été évaluée
Miltefosine (hexadecylphosphocholine, HePC) has recently been developed for the treatment of visceral leishmaniasis. It has the particular advantage of being active after oral administration. The oral route is preferable because it is non invasive, is often less expensive and favours compliance with treatment. There is not much information in the literature about the passage of miltefosine across the intestinal barrier. Therefore, the aims of this thesis were to study the effects of miltefosine on the intestinal epithelium and to determine the mechanisms involved in its uptake and transport, using a model of Caco-2 cells in culture. The results were applied to the development of antileishmanial bitherapy by the oral route: the ability of miltefosine to improve the oral bioavailability of another antileishmanial agent, amphotericin B, was evaluated

Le caprate de sodium (C₁₀) et le salcaprozate de sodium (SNAC) sont des promoteurs d’absorption (PE) inclus comme composants clés dans les formulations développées pour la délivrance orale de peptides. Plus de 20 essais cliniques réalisés chez l’Homme ont évalués ces formes pharmaceutiques comprenant en quantité majoritaire SNAC ou C₁₀. Cependant, plusieurs propriétés de ces promoteurs font encore débats et sont explorées et comparées dans cette thèse, notamment : (i) leurs interactions avec la molécule active, (ii) leur cytotoxicité, (iii) leur capacité d'amélioration de la perméabilité intestinale et (iv) l'impact sur le mucus intestinal. Les interactions biophysiques entre SNAC ou C₁₀ et l’exénatide se révèlent être de nature similaires, faibles et impactées par l’organisation supramoléculaire individuelle des PEs. Les tests de cytotoxicités combinés au l’High Content Analysis révèlent que SNAC et C₁₀ fluidifient initialement la membrane plasmique des cellules Caco-2. Ils perturbent ensuite l’homéostasie cellulaire générale mais de façon différente. Dans les études de perméabilité, le SNAC diffère du C₁₀ car il n’améliore pas le passage du marqueur FD4 au travers des monocouches de Caco-2. Pour les deux PE, l’augmentation de la perméabilité de marqueurs paracellulaires est confirmée au travers de tissus intestinaux isolés de rat (colon, jéjunum) et de sacs intestinaux non inversés. Seul le SNAC augmente cette perméabilité au travers du tissu gastrique de rat. Des mesures de rhéologie indiquent que la structure gélifiée du mucus intestinal de porc est préservée au contact des PEs. En conclusion, cette thèse révèle de nombreuses similarités entre SNAC et C₁₀ avec de subtiles différences. C₁₀ démontre une puissance légèrement supérieure au SNAC mais ils obtiennent une efficacité et un profil cytotoxique similaire
Sodium caprate ((C₁₀) and salcaprozate sodium (SNAC) are permeation enhancers (PEs) included as key components in advanced oral peptide formulations. More than 20 clinical trials have evaluated oral peptide formulations comprising high quantities of SNAC or C₁₀. However, there is still debate concerning the comparative mechanistic properties of SNAC and C₁₀, which are studied in this thesis notably: (i) interactions with payloads, (ii) potential cytotoxicity, (iii) intestinal permeability enhancement capacity and (iv) effects on intestinal mucus. A head to head comparison between SNAC and C₁₀ would assist a decision to opt for one over the other in an oral peptide formulation.Biophysical interactions between SNAC or C₁₀ and a model peptide, exenatide, were similar, dominated by non-covalent weak interactions resulting from supramolecular organization. Cytotoxicity assays combined with High Content Analysis revealed that SNAC and C₁₀ initially fluidized Caco-2 cell apical plasma membranes. Intracellular parameters consequently varied, but with different patterns for each PEs. In transport studies, SNAC differed from C₁₀, as only the latter enhanced FD4 fluxes across Caco-2 monolayers. However, permeation enhancing effects of both PEs was confirmed using rat intestinal tissue mucosae and non-everted gut sacs from jejunum and colon. Although a specific enhancing effect was measured for SNAC and not C₁₀ across isolated rat gastric mucosae stomach. Rheological studies indicate that the gel-like structure of intestinal porcine mucus was preserved when in contact with these PEs. In conclusion, this thesis has revealed the common mechanistic features of surfactants between C₁₀ and SNAC along with subtle differences. C₁₀ had a somewhat higher potency as a PE than SNAC, but efficacy and cytotoxicity profiles were similar

Des microparticules d’héparine de bas poids moléculaire (HBPM) ont été fabriquées suivant la méthode de la double émulsion à partir d’un polymère non biodégradable polycationique (Eudragit® RS) utilisé seul ou en mélange à différents pourcentages avec un polymère biodégradable (acide poly(lactique-co-glycolique)). Deux HBPM aux rapports anti-Xa/anti-IIa différents ont été testées : la nadroparine (3,6) et la tinzaparine (1,8). Les microparticules d’HBPM favorisent i) l’encapsulation des chaines longues actives (ACL) d’héparine par rapport aux chaines courtes actives (BCL) (diminution du rapport anti-Xa/anti-IIa) ii) la libération in vitro des chaines BCL (augmentation du rapport anti-Xa/anti-IIa), les chaines ACL étant fortement retenues au sein des microparticules. Cependant, la proportion de chaine BCL libérées par rapport à celle d’ACL est dépendante (cas de la nadroparine) ou non (cas de la tinzaparine) de la composition polymérique. Cette différence de comportement s’explique principalement par la capacité de l’Eudragit® RS à retenir les chaines ACL de nadroparine. Suite à l’administration orale de microparticules de nadroparine chez le lapin, une absorption des chaines ACL et BCL a été mise en évidence avec certaines formulations : dans ce cas, des rapports anti-Xa/anti-IIa plasmatique similaires à ceux résultant de l’injection sous-cutanée ont été obtenus, témoignant ainsi du potentiel de ces microparticules à remplacer la forme commerciale injectable. Lors d’études de localisation par microscopie confocale, le site d’absorption intestinal n’a pas été identifié. En revanche, des études de passage sur un épithélium issu de la culture cellulaire (Caco-2) semblent démontrer, contrairement aux résultats in vivo, que seules les chaines BCL de nadroparine seraient absorbées. Cependant, le mécanisme responsable du passage cellulaire reste à identifier
Microparticles of low molecular weight heparin (LMWH) were prepared according to the double emulsion and extraction method using a non biodegradable polycationic polymer (Eudragit® RS) alone or blended according to different ratios with a biodegradable polymer (poly(lactic-co-glycolic) acid). Two LMWH presenting different anti-Xa/anti-IIa ratios were tested: nadroparin (3.6) and tinzaparin (1.8). LMWH microparticles facilitate i) the encapsulation of heparin active long chains (ACL) compared to active short chains (BCL) (anti-Xa/anti-IIa ratio decreased) ii) the in vitro release of short chains (anti-Xa/anti-IIa ratio increased) whereas long chains are held inside the microparticles. Nevertheless, when compared to ACL chains, the relative amount of BCL chains released is dependent (case of nadroparine) or not (case of tinzaparin) on the polymeric composition. This difference can be mainly due to the properties of Eudragit® RS to hold ACL chains of nadroparin. After an oral administration in rabbits of nadroparin microparticles, some formulations exhibited absorption of ACL and BCL chains: in this case, plasmatic anti-Xa/anti-IIa ratios in the same range than those observed following the subcutaneous injection were obtained. Such a result shows the potential of microparticles to be a good substitute of the commercial injectable dosage form, if the oral absorption is confirmed in human. During gastro-intestinal studies by confocal microscopy, the absorption site was not identified. Nevertheless, contrary to in vivo results, permeation studies on a cell cultured epithelium (Caco-2) demonstrated that BCL heparin chains were absorbed whereas ACL chains were not. However, the mechanism responsible of the cell permeation is still to be identified

Die orale Aufnahme von Salmonellen stellt den natürlichen Infektionsweg für Mensch und Tier dar. Gelingt es den Salmonellen vom Darmlumen über das Darmepithel in den Organismus zu gelangen, können sie eine systemische Infektion hervorrufen (Septikämie, Typhus). Die Darmwand stellt die entscheidende Barriere dar, deren Abwehrfunktion bei Salmonelleninfektion im Rahmen dieser Arbeit charakterisiert werden sollte. Die Peyerschen Platten (PP), die in die Darmwand eingelagert sind und an den Bereich der M-Zellen angrenzen, stellen Lymphfollikel dar. In dem Grenzbereich zwischen M-Zellen und PP befinden sich viele Makrophagen und Dendritische Zellen. Diese Zellen sind als „antigen-presenting cells“ (APCs) besonders gut in der Lage, transloziertes Antigen aufzunehmen, es zu prozessieren und in Verbindung mit MHC-Komplexen auf ihrer Oberfläche zu präsentieren, um Effektorzellen des Immunsystems zu aktivieren. Es wurden Nachweismethoden für Salmonellenantigen und Salmonellen etabliert. Mit Hilfe eines spezifischen Antiserums konnte Salmonellenantigen über immunhistochemische und durchflusszytometrische Methoden nachgewiesen werden. Lebende Salmonellen wurden über die Ausplattierung auf XLD-Agarplatten detektiert. Isolierte Einzelzellen aus den PP wurden über Dichtegradientenzentrifugation in die Fraktion der phagozytierenden Zellen und in die Fraktion der B- und T-Zellen separiert und analysiert. Nach In-vitro-Infektion isolierter Dendritischer Zellen konnten über elektronen-mikroskopische Analyse Salmonellen in den Dendritischen Zellen nachgewiesen werden. 12 Stunden nach oraler Infektion der BALB/c-WT-Mäuse wurden über Ausplattierung Salmonellen in der Fraktion der phagozytierenden Zellen sowie der B-und T-Zellen der PP nachgewiesen. Der Anteil der infizierten Zellen war jedoch sehr niedrig. 4 Stunden nach oraler Infektion der Mäuse war ein ebenso großer Anteil der Salmonellen in den PP intrazellulär wie extrazellulär vorhanden. Salmonellenantigentragende Zellen wurden mit Hilfe der Durchflusszytometrie erfasst. So zeigte sich, dass bereits vier Stunden nach oraler Infektion ca. 0,09 % bis zu 0,61 % der Zellen aus Milz und den PP mit Salmonellenantigen beladen waren. Dies ist ein äußerst niedriger Anteil von Zellen, doch dieser niedrige Prozentsatz der antigenpräsentierenden Zellen reicht aus, um eine effektive Immunantwort zu induzieren. Histologische Untersuchungen auf Entzündungsreaktionen ergaben vier Stunden p.i. keinen Hinweis auf eine Entzündung. Mit elektronenmikroskopischen Untersuchungen konnten keine Salmonellen in den PP nachgewiesen werden. Der Vergleich der Organkeimlasten der PP der Mäuse mit und ohne Interleukin 12 (IL-12) zeigte signifikante Unterschiede. Während die Gesamtkeimzahl zweier PP in den Wildtypmäusen nur 7 Salmonellen betrug, konnten in den IL-12-defizienten Mäusen 28 bzw. 34 Salmonellen nachgewiesen werden. Das IL-12 wird als Reaktion auf einen entzündlichen Reiz gebildet, liegt aber auch in membrangebundener Form konstitutiv auf Makrophagen und Dendritischen Zellen vor. IL-12 spielt eine wichtige Rolle in der Aktivierung von Bakterizidiemechanismen. Deshalb ist es möglich, dass das IL-12 in den Wildtypmäusen zu einer verbesserten Abtötung der Bakterien führte. In den IL-12-defizienten Mäusen trug die Abwesenheit von IL-12 dazu bei, dass ein höherer Anteil der eingedrungenen Bakterien am Leben blieb
The oral-faecal route is the general way for Salmonella to infect humans and animals. If Salmonella is able to reach the distal ileum and caecum, it can invade the mucosa and cause systemic diseases (septikemia, thyphoid fever). The gut mucosa is the most important barrier, which defense function will be characterised in this work. The PeyerŽs patches are lymphoid tissues and are located in the gut mucosa. They are colocalized with the M-cells in the gut epithelium. In this border region between epithelium and PeyerŽs patches reside a lot of macrophages and dendritic cells. These are antigen presenting cells and they can phagocytize antigen (bacteria), process antigen and present antigen in the lymphoid tissue to naive T-cells to activate them for a specific immune response. We established methods to detect Salmonella antigen and live Salmonellae. With a Salmonella-specific antiserum we could find Salmonella antigen by immunhistological and flow cytometric methods. Live Salmonellae were detected by plating on selective agar plates. Single cells were isolated from PeyerŽs patches and separated in phagocytic cells and B and T cells and analysed by several methods. After in vitro infection of isolated dendritic cells we detected Salmonellae in dendritic cells by electron microscopy. Therefore, Salmonellae are able to infect dendritic cells. 12 hours after oral infection Salmonellae could be detected in phagocytic cells and B and T cells isolated from PeyerŽs patches. The number of infected cells was very low in all cases. Four hours post infection there was about the same frequency of extracellular and intracellular Salmonellae. Salmonella antigen bearing cells were detected by single cell analysis four hours post infection. The analysis showed 0,09 % to 0,61 % cells of PeyerŽs patches or spleen positive for Salmonella antigen. This is only a low number of antigen-presenting cells, but it seems to be enough to induce an effective immune response. The bacterial burden in the PeyerŽs patches was different between mice with and without IL 12. While the bacterial burden of two PeyerŽs patches out of wild-type mice was only seven Salmonellae, two PeyerŽs patches of IL-12 knock out mice carried 28 to 34 Salmonellae. The number of infected cells was the same in wild-type and IL-12 knockout mice. IL-12 is produced during inflammatory responses to pathogens, but it is also available as a membrane-bound pool on macrophages and dendritic cells. It does not influence the phagocytic mechanisms, but has a very important role in inducing bactericidal activity. Therefore, it is possible that IL-12 in wild-type mice allows for a better killing of Salmonellae, while the lack of IL-12 in knockout mice leads to a reduced killing of Salmonellae

A l'heure actuelle les recherches de nouvelles apatites thermiquement plus stables se développent. Ainsi desdépôts à base de fluoroapatite (Ca10(PO4)6F2) ou de fluorhydroxyapatite fournissent des dépôts plus stables etplus adhérents que l'hydroxyaptite tout en étant biocompatibles. La fluoroapatite (Fap) présente non seulement despropriétés physicochimiques semblables à celles de l'os naturel mais également une bonne résistance à lacorrosion dans le milieu physiologique. La Fap et l'hydroxyapatite (Hap) sont utilisées soit sous forme de dépôt surles parties métalliques de prothèses soit toutefois comme matériaux de comblement osseux. L'utilisation de cesbiocéramiques pose quelques problèmes en raison de leur faible tenue mécanique. L'alumine a été proposée ainsipour ses bonnes propriétés mécaniques et pour sa forte affinité pour le fluor avec lequel elle donne des composéstrès stables. Des dépôts composites Al2O3-Fap et Hap-Fap ont été réalisés par projection thermique. Nous avonsfait varier dans ces composites le pourcentage de fluor. Les résultats obtenus montrent que l'ajout de Fap améliorela résistance mécanique et les propriétés tribologiques de l'Hap et contribue à l'adhésion et à la prolifération descellules osseuses pour les dépôts d'alumine
A considerable amount of research already focused on ceramic biomaterials given their chemical stabilityand high mechanical strength. On the one hand, Fluorapatite (Fa) has recently attracted some attention as analternative to pure hydroxyapatite (Hap) as coating on metallic implants, given its chemical composition which issimilar to the bone mineral and therefore its excellent biocompatibility. On the other hand, alumina is known for itsexcellent bioinertia and is also one of the most widely investigated bioceramics. In this frame, the aim of our workwas to investigate Al2O3-Fap and Hap-Fap composite coatings deposited on stainless steel substrates usingSpraying processes (APS and SHVOF). The mechanical, micro-structural, tribological and biological (in Vitro and inVivo tests) properties of these composite coatings are determined and analysed in order to determine their possibleuse as surigical implant materials

Scuola di Dottorato “Pitagora” in Scienze Ingegneristiche, Dottorato di Ricerca in Ingegneria Meccanica XXI Ciclo a.a. 2007-2008
This thesis describes the development of a 3D scanning system based on an active vision technique that uses structured light to obtain the impression of the dental arch. Currently to realize a dental prosthesis a special doughy sticky material is adopted to impress the patient’s dental arch. This imprinting may be scanned and then analyzed and modified by C.A.D. software. All this process is sometimes too long, and it may take several weeks to obtain the final prosthesis. At that moment, there are only few works that use techniques to shorten the processing times and produce a three dimensional model of a dental arch, but often they don’t allow to obtain optimal results due to a low resolution and a slow acquisition rate. Among all the studies described on literature, it results that the structured light is a relatively simple technique that allows for a relative high resolution. In the last years, the development of all these systems, has draw the attention to those devices able to obtain a structure of patient’s dental arch as a C.A.D. model. The device developed and described in this thesis is a novel kind of optical scanner that allows for a total elaboration time, for the realization of a three dimensional model, which is lower than those of the systems described in literature. The new optical scanner consists of four digital camera, a multimedia DLP mini-projector and a software to manage the hardware and process the images. It is actuated by step motors on an 2D guide, which is held rigidly fixed to the denture of the patient by a self balanced kinematic chain, that allows for small motions of the patient’s head. This system designed allows the relief and automatic reconstruction through the use of structured light with a particular Gray-Code method. This work is mainly divided in two main parts: 1. The study of the optical system calibration 2. The study of the reconstruction of dental arch The technique used relies on a new version of Gray-Code method; which allows to solve the so called “correspondences problems”. The structured light is produced by a mini-projector, which has to undertake a calibration phase as well as the camera used for image acquisition. The second part of this study is related to the analysis and marge of the acquired images. This problem involves the alignement of the cloud of points obtained from the automatic scanning process by each camera. In this phase, all the errors involved in the whole procedure are also investigated.
Università della Calabria

Les amidons non modifiées et modifiés représentent un groupe d’excipients biodégradables et abondants particulièrement intéressant. Ils ont été largement utilisés en tant qu’excipients à des fins diverses dans des formulations de comprimés, tels que liants et/ou agents de délitement. Le carboxyméthylamidon sodique à haute teneur en amylose atomisé (SD HASCA) a été récemment proposé comme un excipient hydrophile à libération prolongée innovant dans les formes posologiques orales solides. Le carboxyméthylamidon sodique à haute teneur en amylose amorphe (HASCA) a d'abord été produit par l'éthérification de l'amidon de maïs à haute teneur en amylose avec le chloroacétate. HASCA a été par la suite séché par atomisation pour obtenir le SD HASCA. Ce nouvel excipient a montré des propriétés présentant certains avantages dans la production de formes galéniques à libération prolongée. Les comprimés matriciels produits à partir de SD HASCA sont peu coûteux, simples à formuler et faciles à produire par compression directe. Le principal objectif de cette recherche était de poursuivre le développement et l'optimisation des comprimés matriciels utilisant SD HASCA comme excipient pour des formulations orales à libération prolongée. A cet effet, des tests de dissolution simulant les conditions physiologiques du tractus gastro-intestinal les plus pertinentes, en tenant compte de la nature du polymère à l’étude, ont été utilisés pour évaluer les caractéristiques à libération prolongée et démontrer la performance des formulations SD HASCA. Une étude clinique exploratoire a également été réalisée pour évaluer les propriétés de libération prolongée de cette nouvelle forme galénique dans le tractus gastro-intestinal. Le premier article présenté dans cette thèse a évalué les propriétés de libération prolongée et l'intégrité physique de formulations contenant un mélange comprimé de principe actif, de chlorure de sodium et de SD HASCA, dans des milieux de dissolution biologiquement pertinentes. L'influence de différentes valeurs de pH acide et de temps de séjour dans le milieu acide a été étudiée. Le profil de libération prolongée du principe actif à partir d'une formulation de SD HASCA optimisée n'a pas été significativement affecté ni par la valeur de pH acide ni par le temps de séjour dans le milieu acide. Ces résultats suggèrent une influence limitée de la variabilité intra et interindividuelle du pH gastrique sur la cinétique de libération à partir de matrices de SD HASCA. De plus, la formulation optimisée a gardé son intégrité pendant toute la durée des tests de dissolution. L’étude in vivo exploratoire a démontré une absorption prolongée du principe actif après administration orale des comprimés matriciels de SD HASCA et a montré que les comprimés ne se sont pas désintégrés en passant par l'estomac et qu’ils ont résisté à l’hydrolyse par les α-amylases dans l'intestin. Le deuxième article présente le développement de comprimés SD HASCA pour une administration orale une fois par jour et deux fois par jour contenant du chlorhydrate de tramadol (100 mg et 200 mg). Ces formulations à libération prolongée ont présenté des valeurs de dureté élevées sans nécessiter l'ajout de liants, ce qui facilite la production et la manipulation des comprimés au niveau industriel. La force de compression appliquée pour produire les comprimés n'a pas d'incidence significative sur les profils de libération du principe actif. Le temps de libération totale à partir de comprimés SD HASCA a augmenté de manière significative avec le poids du comprimé et peut, de ce fait, être utilisé pour moduler le temps de libération à partir de ces formulations. Lorsque les comprimés ont été exposés à un gradient de pH et à un milieu à 40% d'éthanol, un gel très rigide s’est formé progressivement sur leur surface amenant à la libération prolongée du principe actif. Ces propriétés ont indiqué que SD HASCA est un excipient robuste pour la production de formes galéniques orales à libération prolongée, pouvant réduire la probabilité d’une libération massive de principe actif et, en conséquence, des effets secondaires, même dans le cas de co-administration avec une forte dose d'alcool. Le troisième article a étudié l'effet de α-amylase sur la libération de principe actif à partir de comprimés SD HASCA contenant de l’acétaminophène et du chlorhydrate de tramadol qui ont été développés dans les premières étapes de cette recherche (Acetaminophen SR et Tramadol SR). La modélisation mathématique a montré qu'une augmentation de la concentration d’α-amylase a entraîné une augmentation de l'érosion de polymère par rapport à la diffusion de principe actif comme étant le principal mécanisme contrôlant la libération de principe actif, pour les deux formulations et les deux temps de résidence en milieu acide. Cependant, même si le mécanisme de libération peut être affecté, des concentrations d’α-amylase allant de 0 UI/L à 20000 UI/L n'ont pas eu d'incidence significative sur les profils de libération prolongée à partir de comprimés SD HASCA, indépendamment de la durée de séjour en milieu acide, le principe actif utilisé, la teneur en polymère et la différente composition de chaque formulation. Le travail présenté dans cette thèse démontre clairement l'utilité de SD HASCA en tant qu'un excipient à libération prolongée efficace.
Unmodified and modified starches represent a particularly interesting group of biodegradable and abundant excipients. They have been widely used as excipients for various purposes in tablet formulations, such as binders and/or disintegrants. Spray-dried high-amylose sodium carboxymethyl starch (SD HASCA) was recently proposed as an innovating hydrophilic excipient for sustained-release (SR) in solid oral dosage forms. Amorphous high-amylose sodium carboxymethyl starch (HASCA) was first produced by the etherification of high-amylose corn starch with chloroacetate. HASCA was then spray dried to obtain SD HASCA. This new excipient has shown advantageous and effective properties in the production of SR delivery systems. SR matrix tablets prepared from SD HASCA are inexpensive, simple to formulate and easy to produce by direct compression. The main objective of the present research was to continue the development and optimization of matrix tablets using SD HASCA as the retarding excipient in view of their ultimate application as sustained drug-release delivery systems for oral administration. For this purpose, dissolution tests simulating some of the most relevant physiological conditions of the gastrointestinal tract, taking into account the nature of the polymer under investigation, were employed to evaluate the drug-release characteristics and demonstrate the performance of SD HASCA SR formulations. An exploratory clinical study was also carried out to evaluate the SR properties of this new drug delivery system in the gastrointestinal tract. The first article presented in this thesis evaluated the drug-release characteristics and the physical integrity of formulations containing a compressed blend of drug, sodium chloride and SD HASCA in biorelevant media. The influence of different acidic pH values and residence times was investigated. The SR profile from an optimized SD HASCA formulation was not significantly affected by both the acidic pH value and the residence time in the acidic medium. These results suggest a limited influence of intra- and inter-subject variability of gastric pH on the release kinetics from SD HASCA matrices. In addition, the optimized formulation maintained its integrity throughout the duration of the dissolution tests. The exploratory in vivo study demonstrated extended drug absorption after oral administration of SD HASCA matrix tablets and that the matrix tablets did not disintegrate while passing through the stomach and resisted hydrolysis by α-amylase in the intestine. The second article reports the development of once-daily and twice-daily SD HASCA tablets containing tramadol hydrochloride (100 mg and 200 mg). These SR formulations presented high crushing strengths without requiring the addition of binders, which facilitates tablet processing and handling. The compression force (CF) applied to produce the tablets did not significantly affect the drug-release profiles. The total release time from SD HASCA tablets increased significantly in function of the tablet weight and can be used to modulate the total release time from theses formulations. When exposed to a pH gradient and to a 40% ethanol medium, a very rigid gel formed progressively on the surface of the tablets providing controlled drug-release properties. These properties indicated that SD HASCA is a robust excipient for oral, sustained drug-release, likely to minimize the possibility of dose dumping and consequent adverse effects, even when co-administered with high doses of alcohol. The third article investigated the effect of α-amylase on drug-release from previously developed SD HASCA tablets containing acetaminophen and tramadol hydrochloride (Acetaminophen SR and Tramadol SR). Mathematical modeling showed that an increase in α-amylase concentration resulted in an increase of polymer erosion over drug diffusion as the main mechanism controlling drug-release, for both formulations and both residence times in acidic medium. However, even if the mechanism of release was affected, α-amylase concentrations ranging from 0 IU/L to 20000 IU/L did not significantly affect the drug-release profiles from SD HASCA SR tablets, regardless of the residence time in acidic medium, the drug used, the polymer content and the different composition of each formulation. The work presented in this thesis clearly demonstrates the value of SD HASCA as an efficient SR excipient.

La chair de poisson et de mammifères marins constitue une source importante de protéines et de bons nutriments, tels que le sélénium (Se), la vitamine E et les acides gras polyinsaturés à longues chaînes. Cependant, la chair de ces animaux peut aussi bioaccumuler la forme organique de mercure (Hg), le méthylmercure (MeHg). Ce contaminant a fait l’objet de plusieurs études épidémiologiques, notamment en raison de sa neurotoxicité résultant d’une exposition in utero, étroitement reliée à l’ingestion de poissons fortement contaminés en MeHg. En réponse à ce risque toxicologique, les autorités sanitaires ont émis des lignes directrices quant à la consommation de poissons dans le but de protéger la population. Cependant, ces recommandations présentent certaines limites qui sont liées aux prémisses et aux omissions de l’équation déterministe utilisée pour évaluer l’exposition au MeHg par Santé Canada: (1) elles considèrent que 100% du Hg présent dans la chair de poisson est sous forme de MeHg, (2) elles supposent que le MeHg est distribué de façon homogène à l’intérieur de la chair de poisson, (3) elles prennent pour acquis que 100% du MeHg sera absorbé par le consommateur et (4) par l’utilisation d’une approche déterministe, elles omettent la potentielle incertitude et variabilité intra-populationnelle au niveau des données. L’objectif de cette thèse visait à explorer ces limites, afin de mieux comprendre l’exposition du consommateur au MeHg. Nous avons tout d’abord évalué la distribution du MeHg, du Se (antagoniste du MeHg) et de l’arsenic (As : antagoniste du Se) à l’intérieur de l’appareil musculaire d’un même poisson, en fonction de sa composition en biomolécules (protéines et lipides). Nos résultats démontrent que la présence concomitante de muscles rouges et blancs induit un gradient important de biomolécules à l’intérieur de l’appareil musculaire d’un même individu, provoquant par le fait même une variation moyenne de 2.2 fois quant à la distribution des métal(loide)s, qui se distribuent en fonction de leurs affinités biochimiques. Ces résultats confirment que le MeHg peut se distribuer de façon hétérogène à l’intérieur du muscle de poisson, ce qui pourrait mener à une sous- ou surestimation de l’exposition au MeHg pour le consommateur, en fonction de la partie du poisson qui est consommée. Par la suite, nous nous sommes attardés à l’hypothèse stipulant que 100% du MeHg est absorbé par le consommateur. Une des méthodes utilisées pour estimer la fraction de MeHg qui serait disponible à être absorbée par la paroi intestinale consiste à mesurer la bioaccessibilité, c’est-à-dire la fraction soluble de MeHg, à l’aide d’un modèle de digestion in vitro. Plusieurs études ayant utilisé cette approche observent que la cuisson de la chair de poisson diminue significativement la bioaccessibilité du MeHg, ce qui diminuerait sa potentielle absorption intestinale. Nous avons donc conduit une expérience in vivo en utilisant un modèle porcin et en parallèle, nous avons utilisé un modèle de digestion in vitro. Selon les profils sanguins porcins, la biodisponibilité orale du MeHg provenant de la chair de thon cuite n’est pas moins élevée que celle mesurée avec la chair de thon crue. En contraste, nous avons obtenu une bioaccessibilité de MeHg moins élevée avec la chair de thon cuite. Nos résultats démontrent que les modèles de digestion in vitro actuels ne sont pas suffisamment optimisés pour être utilisés directement dans les calculs d’exposition au MeHg, tels que proposés récemment dans la littérature. Finalement, nous avons testé l’impact d’ajout de variables supplémentaires dans l’équation déterministe actuellement utilisée par Santé Canada pour évaluer l’exposition du consommateur au MeHg, en conduisant une évaluation probabiliste du risque. Notamment, nous avons considéré (1) la proportion de Hg méthylée par rapport à la quantité de Hg, (2) la bioaccessibilité et (3) l’augmentation de la concentration du MeHg suite à la cuisson de la chair de poisson, créée par la perte d’humidité. Nos résultats sont clairs : chaque ajout de variable indépendante augmente ou diminue significativement l’exposition calculée, soulignant la sensibilité de l’équation utilisée pour évaluer l’exposition au MeHg. Ceci suggère que de plus amples recherches devront être conduites avant d’effectuer une quelconque modification dans l’équation de l’exposition au MeHg, par souci de ne pas sous-estimer celle-ci. Cette thèse illustre que les recommandations sont difficilement généralisables puisque la chair de poisson et de mammifères présente des propriétés différentes, en fonction de l’espèce animale considérée. Cette thèse démontre que l’équation déterministe utilisée par Santé Canada dans l’évaluation de l’exposition au MeHg devrait être mieux approfondie par la sphère scientifique, particulièrement dans le cas des mammifères marins.
Fish flesh and marine mammals is an important source of proteins and nutrients, such as selenium (Se), vitamin E and long chain polyunsaturated fatty acids. However, flesh of those animals may bioaccumulate the organic form of mercury (Hg), methylmercury (MeHg). This contaminant has been the subject of various epidemiological studies, namely because of its neurotoxicity through in utero exposure, closely related to highly MeHg contaminated fish consumption. In response to this toxicological risk, health authorities have set fish consumption guidelines in order to protect the population. Still, those guidelines present limits that are related to premises and omissions of the determinist equation used by Health Canada in order to assess the exposure to MeHg: (1) it considers that 100% of Hg in fish flesh is MeHg, (2) it supposes that MeHg is homogeneously distributed within fish flesh, (3) it takes for granted that 100% of MeHg will be absorbed by the consumer and (4) by using a determinist approach, they omit the potential uncertainty and intra-population variability in the data. The aim of this thesis was to address these limits, in order to better understand the exposure of MeHg for consumers. We first assessed the distribution of MeHg, Se (MeHg antagonist) and arsenic (As, Se antagonist) within fish musculature, as a function of its biomolecule composition (proteins and lipids). Our results demonstrated that the concomitant presence of white and red muscle induces a large gradient of protein and lipid within the muscular apparatus of the same individual. This in turn causes on average a variation by 2.2-fold regarding MeHg, Se and As bioaccumulation, which are distributed according to their biochemical affinity. Those results confirmed that MeHg can distribute heterogeneously within fish muscle, which could lead to an under- or overestimation of MeHg exposure for consumers, as function of the part of the fish consumed. Subsequently, we focused on the hypothesis stipulating that 100% of MeHg is absorbed by the consumer. A method used to assess the fraction of MeHg that would be available to be further absorbed by the gut wall consists of measuring the bioaccessibility, i.e. the soluble fraction of MeHg, using an in vitro digestion model. Several studies that assessed the bioaccessibility of cooked fish flesh observed a decreased of MeHg solubility, that would potentially diminish its intestinal absorption. However, those results have not been yet validated in vivo. To that end, we conducted an in vivo experience using the pig model and, in parallel, we used an in vitro digestion model. According to the pig’s blood profile, the oral bioavailability of MeHg from cooked tuna flesh is not less bioavailable than the MeHg from the raw tuna. Contrasting results have been found with the in vitro model, with a decrease of MeHg bioaccessibility observed when fish flesh is cooked. Our results demonstrated that in vitro digestion models are not optimized to be directly used in MeHg exposure calculus as recently proposed in the literature. Finally, we tested the impact of adding variables to the deterministic equation currently used by Health Canada to assess consumer exposure to MeHg, by conducting a probabilistic risk assessment. We considered (1) the proportion of Hg that is MeHg, (2) the MeHg bioaccessibility and (3) the increased of MeHg level after the cooking of fish flesh due to moisture loss. Our results showed that each individual variable significantly increases or decreases the calculated exposure. Thereby, it highlights the sensitivity of the equation used to assess the exposure of MeHg. It strongly suggests that more research is needed to improve Hg exposure calculation to avoid underestimating the potential health risks of MeHg exposure. This thesis presents important results regarding the exposure of MeHg through fish and marine mammals’ consumption. This thesis shows that the recommendations are difficult to generalize since the flesh of fish and mammals has different properties, depending on the animal species considered. The conclusions of this thesis demonstrate that the premises and omissions of the deterministic equation used by Health Canada in the assessment of exposure to Hg should be better investigated by the scientific sphere, especially in the case of marine mammals.

Die orale Aufnahme von Salmonellen stellt den natürlichen Infektionsweg für Mensch und Tier dar. Gelingt es den Salmonellen vom Darmlumen über das Darmepithel in den Organismus zu gelangen, können sie eine systemische Infektion hervorrufen (Septikämie, Typhus). Die Darmwand stellt die entscheidende Barriere dar, deren Abwehrfunktion bei Salmonelleninfektion im Rahmen dieser Arbeit charakterisiert werden sollte. Die Peyerschen Platten (PP), die in die Darmwand eingelagert sind und an den Bereich der M-Zellen angrenzen, stellen Lymphfollikel dar. In dem Grenzbereich zwischen M-Zellen und PP befinden sich viele Makrophagen und Dendritische Zellen. Diese Zellen sind als „antigen-presenting cells“ (APCs) besonders gut in der Lage, transloziertes Antigen aufzunehmen, es zu prozessieren und in Verbindung mit MHC-Komplexen auf ihrer Oberfläche zu präsentieren, um Effektorzellen des Immunsystems zu aktivieren. Es wurden Nachweismethoden für Salmonellenantigen und Salmonellen etabliert. Mit Hilfe eines spezifischen Antiserums konnte Salmonellenantigen über immunhistochemische und durchflusszytometrische Methoden nachgewiesen werden. Lebende Salmonellen wurden über die Ausplattierung auf XLD-Agarplatten detektiert. Isolierte Einzelzellen aus den PP wurden über Dichtegradientenzentrifugation in die Fraktion der phagozytierenden Zellen und in die Fraktion der B- und T-Zellen separiert und analysiert. Nach In-vitro-Infektion isolierter Dendritischer Zellen konnten über elektronen-mikroskopische Analyse Salmonellen in den Dendritischen Zellen nachgewiesen werden. 12 Stunden nach oraler Infektion der BALB/c-WT-Mäuse wurden über Ausplattierung Salmonellen in der Fraktion der phagozytierenden Zellen sowie der B-und T-Zellen der PP nachgewiesen. Der Anteil der infizierten Zellen war jedoch sehr niedrig. 4 Stunden nach oraler Infektion der Mäuse war ein ebenso großer Anteil der Salmonellen in den PP intrazellulär wie extrazellulär vorhanden. Salmonellenantigentragende Zellen wurden mit Hilfe der Durchflusszytometrie erfasst. So zeigte sich, dass bereits vier Stunden nach oraler Infektion ca. 0,09 % bis zu 0,61 % der Zellen aus Milz und den PP mit Salmonellenantigen beladen waren. Dies ist ein äußerst niedriger Anteil von Zellen, doch dieser niedrige Prozentsatz der antigenpräsentierenden Zellen reicht aus, um eine effektive Immunantwort zu induzieren. Histologische Untersuchungen auf Entzündungsreaktionen ergaben vier Stunden p.i. keinen Hinweis auf eine Entzündung. Mit elektronenmikroskopischen Untersuchungen konnten keine Salmonellen in den PP nachgewiesen werden. Der Vergleich der Organkeimlasten der PP der Mäuse mit und ohne Interleukin 12 (IL-12) zeigte signifikante Unterschiede. Während die Gesamtkeimzahl zweier PP in den Wildtypmäusen nur 7 Salmonellen betrug, konnten in den IL-12-defizienten Mäusen 28 bzw. 34 Salmonellen nachgewiesen werden. Das IL-12 wird als Reaktion auf einen entzündlichen Reiz gebildet, liegt aber auch in membrangebundener Form konstitutiv auf Makrophagen und Dendritischen Zellen vor. IL-12 spielt eine wichtige Rolle in der Aktivierung von Bakterizidiemechanismen. Deshalb ist es möglich, dass das IL-12 in den Wildtypmäusen zu einer verbesserten Abtötung der Bakterien führte. In den IL-12-defizienten Mäusen trug die Abwesenheit von IL-12 dazu bei, dass ein höherer Anteil der eingedrungenen Bakterien am Leben blieb.
The oral-faecal route is the general way for Salmonella to infect humans and animals. If Salmonella is able to reach the distal ileum and caecum, it can invade the mucosa and cause systemic diseases (septikemia, thyphoid fever). The gut mucosa is the most important barrier, which defense function will be characterised in this work. The PeyerŽs patches are lymphoid tissues and are located in the gut mucosa. They are colocalized with the M-cells in the gut epithelium. In this border region between epithelium and PeyerŽs patches reside a lot of macrophages and dendritic cells. These are antigen presenting cells and they can phagocytize antigen (bacteria), process antigen and present antigen in the lymphoid tissue to naive T-cells to activate them for a specific immune response. We established methods to detect Salmonella antigen and live Salmonellae. With a Salmonella-specific antiserum we could find Salmonella antigen by immunhistological and flow cytometric methods. Live Salmonellae were detected by plating on selective agar plates. Single cells were isolated from PeyerŽs patches and separated in phagocytic cells and B and T cells and analysed by several methods. After in vitro infection of isolated dendritic cells we detected Salmonellae in dendritic cells by electron microscopy. Therefore, Salmonellae are able to infect dendritic cells. 12 hours after oral infection Salmonellae could be detected in phagocytic cells and B and T cells isolated from PeyerŽs patches. The number of infected cells was very low in all cases. Four hours post infection there was about the same frequency of extracellular and intracellular Salmonellae. Salmonella antigen bearing cells were detected by single cell analysis four hours post infection. The analysis showed 0,09 % to 0,61 % cells of PeyerŽs patches or spleen positive for Salmonella antigen. This is only a low number of antigen-presenting cells, but it seems to be enough to induce an effective immune response. The bacterial burden in the PeyerŽs patches was different between mice with and without IL 12. While the bacterial burden of two PeyerŽs patches out of wild-type mice was only seven Salmonellae, two PeyerŽs patches of IL-12 knock out mice carried 28 to 34 Salmonellae. The number of infected cells was the same in wild-type and IL-12 knockout mice. IL-12 is produced during inflammatory responses to pathogens, but it is also available as a membrane-bound pool on macrophages and dendritic cells. It does not influence the phagocytic mechanisms, but has a very important role in inducing bactericidal activity. Therefore, it is possible that IL-12 in wild-type mice allows for a better killing of Salmonellae, while the lack of IL-12 in knockout mice leads to a reduced killing of Salmonellae.

Hypothèse : Le nanobroyage d'une suspension de nystatine augmentera son efficacité antifongique in vitro et in vivo. Méthode : Une nanosupension de nystatine a été obtenue en utilisant le broyage humide. Elle a été caractérisée pour sa distribution de taille des particules et pour sa teneur en principe actif. L'activité in vitro a été évaluée contre les souches de C. albicans SC5314 et LAM-1 aux concentrations 12.5 μg/mL jusqu'à 5000 μg/mL. L'efficacité in vivo a été évaluée en utilisant un modèle murin de candidose oropharyngée. Résultats : La taille médiane des particules de la nanosuspension de nystatine a été réduite de 6577 nm à 137 nm. L'analyse CLHP a demontré une teneur de 98.7 ± 0.8%. L'activité in vitro de la nanosuspension était supérieure à la suspension aux concentrations 100 μg/mL à 5000 μg/mL. La charge fongique orale était inférieure dans le groupe traité par la nanosuspension comparativement aux autres groupes. La survie des souris était aussi supérieure.
Hypothesis : Nanomilling of a nystatin suspension will increase its antifungal efficacy in vitro and in vivo. Methods: A nystatin nanosuspension was obtained using wet bead milling. It was characterized for its particle size distribution and for its drug content. In vitro activity was evaluted against C. albicans strains SC5314 and LAM-1 at concentrations of 12.5 μg/mL up to 5000 μg/mL. The in vivo efficacy was evaluated using a murine model of oropharyngeal candidiasis. Results: Median particle size of the nystatin nanosuspension was reduced from 6577 nm to 137 nm. HPLC analysis demonstrated a content assay of 98.7 ± 0.8%. In vitro activity of the nanosuspension was superior to the suspension’s at concentrations ranging from 100 μg/mL to 5000 μg/mL. Oral fungal burdens were inferor in the nanosuspension group compared to the suspension and saline groups. Mice survival was also superior in the nanosuspension group.