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Dissertationen zum Thema „Transport intracellulaire des protéines“
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Fayadat, Laurence. „Maturation et transport intracellulaire de la thyropéroxydase humaine“. Aix-Marseille 2, 1999. http://theses.univ-amu.fr.lama.univ-amu.fr/1999AIX20662.pdf.
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La thyropéroxydase (TPO) est l'enzyme clé impliquée dans la synthèse des hormones thyroïdiennes. Bien que la TPO catalyse l'iodation de la thyroglobuline et le couplage de certains résidus iodotyrosines au niveau de la membrane apicale des cellules thyroïdiennes, la majorité des protéines sont retenues au niveau du réticulum endoplasmique et seules 15% des molécules accèdent à la surface cellulaire. Afin de mieux comprendre la maturation et le transport intracellulaire de la TPO humaine (hTPO), nous avons transfecté l'ADNc de la hTPO dans des cellules CHO. Dans les cellules CHO seules 15% à 20% des molécules de hTPO sont capables d'acquérir une structure tridimensionnelle reconnue par le mAb15 (anticorps qui reconnaît une structure conformationnelle) alors que la majorité des molécules (80 à 85%) est retenue dans le RE puis dégradée (demi-vie: 2-4h) par le protéasome cytosolique. Parmi les molécules reconnues par la mAb15, seules 20% sont capables d'atteindre la surface cellulaire alors que les 80% restantes sont dégradées (demi-vie :7-11h) par des protéases à sérine et à cystéine localisées au niveau de la membrane du RE. Nous avons donc montré que dans les cellules CHO, seules 2% des molécules de hTPO sont capables de gagner la surface cellulaire et que d'après son état de repliement (formes incorrectement repliées ou partiellement repliées reconnues par le mAb15), la hTPO est dégradé par deux systèmes différents au niveau du RE. Nous avons d'autre part montré que l'incorporation de l'hème au niveau de la hTPO était importante pour la sortie de la protéine du RE. Nous avons aussi mis en évidence un nouveau rôle pour l'H2O2 synthétisée à la surface des cellules thyroïdiennes et impliquée dans l'hormonosynthèse thyroïdienne. En présence d'H2O2, l'hème se lie de manière covalente à la hTPO et ceci par un phénomène de modification autocatalytique de l'hème. Nous avons d'autre part montré que la N-glycosylation est nécessaire à la prise de structure tridimensionnelle reconnue par le mAb15. Au niveau du RE, la hTPO interagit avec la calnexine et la calréticuline. Ces deux protéines chaperons, impliquées dans le contrôle de qualité du RE, ont une importance cruciale pour les premières étapes de repliement de la hTPO mais ne sont pas suffisantes pour la maturation complète de la protéine. Nous avons, par ailleurs, étudié le transport intracellulaire de la hTP02, une isoforme obtenue après épissage alternatif de l'ARNm de la hTPO et avons montré que cette isoforme est enzymatiquement inactive, n'accède jamais à la surface cellulaire et est très rapidement dégradée.
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Parent, Audrey. „Découverte de nouveaux complexes protéiques impliqués dans la synthèse et le transport intracellulaire des récepteurs couplés aux protéines G“. Thèse, Université de Sherbrooke, 2010. http://savoirs.usherbrooke.ca/handle/11143/4304.
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Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) constituent la plus grande famille de récepteurs membranaires et sont impliqués dans le contrôle de la majorité des processus physiologiques. Dans le modèle classique, la signalisation par les RCPGs se résumait à l'activation de protéines G hétérotrimériques capables de moduler l'activité d'effecteurs, qui, à leur tour, contrôlent la concentration intracellulaire de seconds messagers tels que l'AMPc ou le calcium. Cette vision classique de la signalisation s'est par contre complexifiée au fil des années et l'on sait maintenant que les RCPGs interagissent avec une multitude d'autres protéines afin de transmettre de façon spécifique les signaux extracellulaires. Ainsi, pour bien comprendre comment est régulé un RCPG, il devient primordial de connaître les protéines interagissant avec celui-ci. Nous avons donc entrepris d'identifier de nouveaux partenaires d'interaction pour les récepteurs DP (récepteur de la prostaglandine D[indice inférieur 2]), TP[bêta] (récepteur du thromboxane A[indice inférieur 2]) et [bêta][indice inférieur 2]-adrénergique, puis, de déterminer le rôle de ces complexes protéiques dans la fonction des récepteurs. Lors d'un criblage par double-hybride visant à identifier de nouveaux partenaires d'interaction pour DP, nous avons identifié la protéine ankyrin repeat domain-containing protein 13C (ANKRD13C), une protéine n'ayant pas encore été caractérisée jusqu'à maintenant. Des études de localisation ont montré qu'ANKRD13C est associée à la membrane du réticulum endoplasmique (RE), où elle interagit avec DP. Cette interaction facilite d'abord la biogenèse du récepteur en ralentissant la dégradation des récepteurs nouvellement synthétisés. Elle régule aussi le transport de DP vers la membrane plasmique en induisant la rétention dans le RE des formes immatures du récepteur. Elle facilite finalement la dégradation par le protéasome des formes de récepteurs retenues dans le RE. Ces expériences suggèrent donc un rôle de chaperonne pour ANKRD13C dans la biogenèse du récepteur DP. La protéine adaptatrice RACK1 (Receptor for Activated C-Kinase 1) a ensuite été identifiée comme nouveau partenaire d'interaction pour l'isoforme [bêta] du récepteur du thromboxane A[indice inférieur 2] (TP[bêta]).Les résultats présentés dans cette étude montrent que les deux protéines interagissent directement et qu'elles forment un complexe au niveau du RE. L'interaction entre TP[bêta] et RACK1 s'est d'ailleurs avérée essentielle pour que le récepteur puisse être exporté du RE vers la membrane plasmique. Ces travaux ont donc révélé un rôle majeur de RACK1 dans la fonction de TP[bêta], plus précisément au niveau de son transport vers la surface cellulaire. Finalement, une nouvelle interaction entre le récepteur [bêta][indice inférieur 2]-adrénergique ([bêta][indice inférieur2]-AR) et la petite protéine G Rab11 a été caractérisée.Les expériences réalisées démontrent que les deux protéines s'associent en cellules via une interaction directe. Une construction du [bêta][indice inférieur 2]-AR où les sites d'interaction avec Rab11 sont mutés a été générée. La mise en évidence d'un défaut de recyclage de ce mutant suite à une stimulation avec un agoniste spécifique a permis d'établir que l'interaction directe avec Rab11 est essentielle pour que le [bêta][indice inférieur 2]-AR puisse recycler de façon adéquate.Les résultats présentés dans cette thèse illustrent le rôle joué par trois nouveaux complexes protéiques dans la synthèse, l'export et le recyclage de RCPGs. L'identification et la caractérisation de ces nouvelles interactions permettra de mieux comprendre comment sont régulés les récepteurs DP, TP[bêta] et [bêta][indice inférieur 2]-adrénergique, et permettra éventuellement d'améliorer les connaissances quant à la régulation de l'ensemble des récepteurs couplés aux protéines G.
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Desfarges, Sébastien. „Transport intracellulaire et intégration du VIH-1 : implication de l'intégrase rétrovirale“. Bordeaux 2, 2007. http://www.theses.fr/2007BOR21485.
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L'intégrase (IN) du VIH-1 est une enzyme clé catalysant l'insertion de l'ADN proviral par une réaction d'intégration. Dans cette étude, nous avons montré que cette enzyme exprimée en tant que seule protéine rétrovirale dans la levure S. Cerevisiae est suffisante pour réaliser une intégration complète de l'ADN contenant deux extrémités LTR virales dans le génome nucléaire. Grâce à ce modèle, nous avons montré que RAD51 impliquée dans le processus de recombinaison homologue (HR) inhibe l'activité d'intégration catalysée par l'IN autant in vitro que dans la levure. De plus, les bases moléculaires du transport intracellulaire du complexe de transcription inverse (RTC) sont peu connues. Dans la levure, nous avons montré que l"IN s'accumule au niveau du centre organisateur des microtubules (MTOC) avant d'être importée dans le noyau. Une analyse cinétique des mouvements de l'IN montrent que l'IN et Stu2p, une protéine associée aux microtubules, migrent ensemble vers la périphérie du noyau suivie de son import nucléaire. La dépolymérisation des microtubules par du nocodazole ou l'expression de l'IN dans une souche déficiente de Dyn2p (chaîne légère de la dynéine, homologue de LC8 humain) empêche l'accumulation de l'IN à proximité de l'enveloppe nucléaire, inhibe son import nucléaire et son activité d'intégration. Nous avons par la suite confirmé que le mécanisme de transport de l'IN retrouvé dans les cellules humaines T, cellules cibles du VIH-1 est similaire à celui observé dans la levure. Ce résultat suggère que l'IN pourrait jouer un rôle important dans le transport du RTC viral. Pour vérifier cette hypothèse dans un contexte viral, nous avons infecté des cellules HeLa exprimant le récepteur CD4 avec des pseudo-virus VIH fluorescents soit avec l'IN sauvage soit avec l'IN mutée. En comparant le transport du RTC vers la périphérie du noyau, nous avons pu conclure que l'IN est impliqué dans ce processus de transportHIV-1 integrase (IN) is the key enzyme catalyzing the proviral DNA integration step. In this study, we have shown that HIV-1 IN expressed as the sole retroviral protein in budding yeast S. Cerevisiae was sufficient to catalyze the complete integration of a DNA containing two viral LTRs into the nuclear genome. IUsing this model, we demonstrated the RAD51 dependent pathway of homologous recombination (HR) down regulates the integration activities catalyzed by IN both in vitro and in yeast. Moreover, the molecular bases of the HIV-1 retrotranscription complex (RTC) intracellular trafficking are still poorly understood. We report in yeast that IN accumulates at the Microtubule Organization Center (MTOC) before being imported into the nucleus A kinetic of IN movement in cells revealed that IN and Stu2p, a microtubule associated protein, co-migrated towards the nuclear periphery followed its nuclear import. Microtubules depolymerisation by nocodazole or IN expression in a Dyn2p deficient strain (dynein light chain 2, homologue to human LC8) prevented accumulation of IN near the nuclear envelope, inhibited its transport into the nucleus thereby blocking integration activity. Then, we confirmed that the transport mechanism of IN in human T cells, an HIV-1 permissive cell line, and yeast are very similar. Further these findings suggest that IN may play a role in the intracellular translocation of the RTC. To verify the obtained results in the viral context, we infected CD4-expressing HeLa cells with fluorescently labelled HIV pseudo-viruses. We used HIV pseudo-viruses either with wt IN or with mutated IN. Comparing the transport of the RTC toward the nuclear periphery we showed that IN mediated this translocation
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Chabrillat, Marion. „Etude du mouvement des mélanosomes sur les filaments d' actine : rôle des protéines Rab8 et myosine VI“. Paris 6, 2005. http://www.theses.fr/2005PA066391.
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Ecard, Jason. „Mécanismes de tri et voies de transport intracellulaire des protéines de la membrane du lysosome“. Electronic Thesis or Diss., Sorbonne université, 2019. https://accesdistant.sorbonne-universite.fr/login?url=https://theses-intra.sorbonne-universite.fr/2019SORUS094.pdf.
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Plus d’une soixantaine de protéines différentes sont insérées dans la membrane du lysosome et participent aux différentes fonctions de cet organite. Mais les voies de transport intracellulaire qui mènent les protéines membranaires lysosomales (LMP) jusqu’à cet organite ne sont pas bien comprises. De façon intéressante, certaines LMP présentent des localisations intracellulaires anormales dans certains cancers. C’est notamment le cas de la glycoprotéine LAMP1 qui s’avère surexposée à la surface cellulaire dans plusieurs cancers, où elle y joue plusieurs rôles dans l’agressivité tumorale. Grâce au système RUSH (pour Retention Using Selective Hooks), permettant la synchronisation du transport le long de la voie de sécrétion, nous avons montré que LAMP1, après néosynthèse, passe par la membrane plasmique avant d’accéder aux endosomes. La comparaison des voies empruntées par différentes LMP a aussi permis de révéler que LAMP1 et LIMP2 sont triées au niveau de l’appareil de Golgi, LIMP2 étant concentrée dans des structures vésiculaires caractéristiques et dépourvues de clathrine. Nous avons aussi montré que, de façon surprenante, ce tri au niveau de l’appareil de Golgi est indépendant des signaux de recrutement d’adaptateurs à la clathrine portés dans les queues C-terminales de ces deux LMP. Afin d’étudier quels mécanismes pourraient être impliqués dans la surexposition de LAMP1 à la surface cellulaire de certains cancers, nous avons aussi réalisé un criblage d’inactivation de gènes basé sur la technologie CRISPR-Cas9. Nous avons sélectionné les gènes dont l’inactivation affectait les niveaux de LAMP1 en surface et nous avons obtenu de nombreux gènes candidats qui sont à l’étudeMore than sixty different proteins are inserted into the membrane of the lysosome, participating in the various functions of this organelle. But the intracellular trafficking pathways that lead lysosomal membrane proteins (LMPs) to this organelle are not well understood. Interestingly, some LMPs exhibit abnormal intracellular localisations in some cancers. This is the case of the glycoprotein LAMP1 which is overexpressed at the cell surface in several cancers, from where it plays several roles in tumour aggressiveness. Thanks to the Retention Using Selective Hooks (RUSH) system, allowing the synchronisation of the transport along the secretory pathway, we have shown that neosynthesized LAMP1 reaches the plasma membrane before entering endosomes. Comparing the routes followed by different LMPs also revealed that LAMP1 and LIMP2 are sorted at the Golgi apparatus, LIMP2 being concentrated in characteristic vesicular and clathrin-free structures. We have also shown that, surprisingly, this sorting at the level of the Golgi apparatus is independent of clathrin adapters recruitment signals carried in the C-terminal tails of these two LMPs. To investigate what mechanisms might be involved in the overexposure of LAMP1 at the cell surface of certain cancers, we also performed a gene knock-out screen based on CRISPR-Cas9 technology. We selected genes whose inactivation affected LAMP1 levels at the surface and obtained many candidate genes that are under study
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Dauloudet, Olivier. „Étude théorique des phénomènes de transport intracellulaire hors-équilibre thermodynamique : rôle du couplage entre transport actif et diffusif en volume confiné“. Thesis, Montpellier, 2015. http://www.theses.fr/2015MONTS166/document.
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Comment les cellules eucaryotes remodèlent constamment leur espace intracellulaire est l'un des phénomènes auto-organisés les plus étonnants dans la nature. Pour ce faire, ces cellules exploitent la diffusion brownienne des macromolécules et cargos sur de petites échelles d’espace combinée avec des phénomènes de transport actif le long des filaments du cytosquelette entraînées par des protéines motrices.Malgré l'effort important de la communauté physico-mathématique sur ces problématiques biologiques, il est encore très difficile de rationaliser le mouvement des organites (et en général de la matière) à l'intérieur de la cellule.Dans cette thèse, nous abordons ce problème en généralisant l'analyse théorique d'un modèle physico-mathématique paradigmatique du transport hors-équilibre de protéines motrices (appelé TASEP) afin d'étudier l'impact d'un volume fini et d’une concentration finie de moteurs sur leur distribution dans le cytosol et le long du cytosquelette. En particulier, cela nécessite d'inventer une nouvelle méthodologie afin de résoudre ce problème où le mouvement de diffusion des moteurs dans le cytoplasme est couplé avec le transport collectif et dirigé de ces mêmes moteurs le long d'un ou plusieurs filaments du cytosquelette. De nouveaux phénomènes et régimes intéressants apparaissent par rapport aux études récentes apparus dans la littérature. En outre, la méthodologie développée ici, permet une analyse rapide et efficace des comportements de ces systèmes complexes pour lesquels la simulation numérique peut être longue en temps.La thèse est organisée comme suit. Le premier chapitre est consacré à l’introduction au sujet et à la définition des notions biologiques et physiques nécessaires pour le travail de recherche présenté ensuite.Le deuxième chapitre aborde une solution approchée pour le cas de transport réalisé sur un seul filament cytosquelettique plongé dans le cytosol, où le volume fini et la concentration finie de moteurs modifient qualitativement et quantitativement les diagrammes de phase décrivant la densité moyenne et le flux de moteurs le long du filament. Nous discutons ensuite les conditions physiques pour lesquels cette solution approchée n’est plus valable. Pour surmonter cette difficulté, dans le chapitre trois, nous décrivons une nouvelle méthode, inspirée par la « méthode des images » pour calculer les solutions de l'équation de Poisson en électrostatique, qui permet pour la première fois (à notre connaissance) de calculer analytiquement la distribution de moteurs qui diffusent en volume, c.à.d. le cytosol, sans aucune hypothèse d’approximation. En particulier, le procédé peut être facilement généralisé à tout type de distribution ou réseau de filaments et à plusieurs mécanismes de transport collectif le long des filaments. Cela permet d’explorer ainsi des régimes et des phénomènes nouveaux qui peuvent difficilement être étudiées par des simulations stochastiques en raison de la complexité des processus et de l'extension spatiale du système. Le chapitre quatre se concentre sur cette méthodologie innovante de calcul. Le chapitre cinq discute d’une variété de problèmes ouverts ainsi que d’ouvertures liées au thème étudié. Nous terminons cette thèse avec des conclusions générales se concentrant sur les implications physiques, biophysiques et biologiques de l’étude effectué.Les nombreux résultats obtenus ont un impact sur notre compréhension générale des processus de transport complexe, collectif et non-linéaire dans des phénomènes et situations où les moteurs peuvent se déplacer parmi des espaces avec des différentes dimensions physiques, avec des implications intéressantes pour la biologie, la mécanique statistique des systèmes hors-équilibre thermodynamique, de la théorie physico-mathématique du trafic et de la logistiqueHow cells constantly remodel their intracellular space is one of the most astonishing self-organized phenomena in Nature. In order to do that, eukaryotic cells exploit the Brownian diffusion of macromolecules or organelles on small scales combined with active transport phenomena along cytoskeletal filament driven by motor proteins. Despite the important effort in the physico-mathematical community working on these biological issues, it is still very difficult to rationalize the motion of organelles (and in general of matter) inside the cell. In this thesis, we approach this problem by generalizing the theoretical analysis of a paradigmatic physico-mathematical model of non-equilibrium transport of motor proteins (called TASEP) to study the impact that a finite volume and a finite concentration of transporters have on their distribution in the cytosol and along the cytoskeleton. In particular, this requires inventing a new methodology in order to solve the problem where diffusive motion or transporters in the cytoplasm is coupled with directed collective transport along one or many cytoskeletal filaments. New interesting phenomena and regimes appear with respect to recent studies in literature. Moreover, the methodology developed so far, allow a fast and efficient investigation of complex systems behaviors for which numerical simulation can result very time consuming.The thesis is organized as follows. The first chapter is dedicated to an introduction on the topic and to the definition of biological and physical notions necessary for the research work presented. The second chapter tackles an approximate solution for the case of directed transport on a single cytoskeletal filament embedded in the cytosol, where the finite volume and the finite concentration of particles modify qualitatively and quantitatively the phase diagrams describing the average density and flux of transporters along the filament. We then discuss the physical conditions for which this approximated solution is no more valid. In order to overcome this difficulty, in chapter three we describe a novel method, inspired by the “images-method” to compute solutions of the Poisson equation in electrostatics, which allows for the first time (at our knowledge) to compute analytically the distribution of transporters in volume, i.e. the cytosol, without any approximated assumption. Importantly, the method can be easily generalized to any kind distribution or network of filaments and to other mechanisms of collective transport along the filaments. This makes possible to explore stationary regimes and new phenomena that can be hardly studied by stochastic simulations due to the complexity of the processes and the spatial extension of the system. Chapter four focuses on the innovative methodology of computation. Chapter five discusses miscellanea of problems and openings related to the topic studied. We end this thesis with general conclusions focusing on physical, biophysical and biological implications.The various results obtained have an impact on our general understanding on complex, collective and non-linear transport processes in situations and phenomena where transporters can move in spaces with different physical dimensions with interesting implications for biology, non-equilibrium statistical mechanics and the physico-mathematical theory of traffic and logistics
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Gomord, Véronique. „Contrôle de l'adressage de la sporamine dans la cellule végétale“. Rouen, 1994. http://www.theses.fr/1994ROUES054.
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Le système endomembranaire ou système de sécrétion est constitué de compartiments spécifiques et distincts et de vésicules qui assurent le transport entre ces différents compartiments. Les protéines sécrétées, solubles ou membranaires, sont introduites de façon co-traductionnelle dans le réticulum endoplasmique (RE). Du RE, ces protéines sont transportées tout au long du système endomembranaire de sécrétion jusqu'à leur compartiment cible: l'appareil de Golgi, la vacuole le tonoplaste, la membrane plasmique ou le compartiment extracellulaire. Des travaux récents ont permis d'identifier des signaux spécifiques d'adressage et de rétention qui par leur interaction avec des récepteurs, permettent le transport de certaines protéines vers leur localisation finale. Nos travaux font appel aux approches de la biologie cellulaire et moléculaire pour l'étude du transport et de l'adressage des protéines dans le système endomembranaire de sécrétion chez les plantes. Nous avons modifié par mutagénèse dirigée les signaux d'adressage d'une protéine recombinante modèle, la sporamine. De plus nous avons développé un système d'expression stable de ces protéines recombinantes dans des cellules de tabac (nicotiana tabacum CV BY2). Nous avons ainsi obtenu des cellules transgéniques exprimant fortement une même protéine modèle transportée vers la vacuole (sporamine), vers le milieu extracellulaire (dpro-sporamine) ou retenue dans la fraction microsomale (SpoHDEL ou dproHDEL). L'étude de la localisation intracellulaire de SpoHDEL a permis de montrer l'accumulation de cette protéine dans un compartiment présentant une activité IDPase
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Poisson, Nicolas. „Les protéines issues du gène de la phosphoprotéine rabique : étude du trafic intracellulaire et identification de partenaires cellulaires“. Paris 6, 2003. http://www.theses.fr/2003PA066261.
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Saint-Jean, Bruno. „Etude de la voie de transport assurée par le récepteur d’adressage vacuolaire BP80“. Rouen, 2006. http://www.theses.fr/2006ROUES037.
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Le récepteur d’adressage vacuolaire BP80 assure le transport des préprotéases solubles à destination de la vacuole lytique. BP80 reconnaît son ligand au niveau du TGN. Le complexe formé est empaqueté dans des vésicules de transport puis transporté jusqu’au compartiment prévacuolaire (PVC). Le ligand transite jusqu’à la vacuole lytique alors que le récepteur recycle jusqu’au TGN. Nous avons initié une approche de microscopie confocale pour étudier BP80. Nous avons créé une chimère correspondant à la fusion entre la GFP et les domaines transmembranaire et cytosolique de BP80 nommée GFP-PS1. Cette chimère GFP-PS1 reproduit parfaitement le trafic de BP80. Nous avons réalisé différentes protéines chimériques dérivant toutes du reporter GFP-PS1 et portant une ou deux mutation(s ) sur des signaux de tri potentiels présents sur la portion cytosolique de BP80. Par cette approche, nous avons identifié deux signaux importants qui participent à des événements de recyclage et d’endocytose de BP80BP80 is a vacuolar receptor responsible for sorting proaleurain from the trans-Golgi network. The complex receptor-ligand is packed into shuttle vesicles that are directed and fused to a prevacuolar compartment where the lower pH induces the dissociation between the receptor and the proaleurain. This latter matured and released in the lytic vacuole. Beside the fact that BP80 uses clathrin coated vesicles for its traffic, we have no other indication on the signals in the cytoplasmic tail used by BP80 traffic. In an attempt to identify trafficking signals, we fused the GFP to the transmembrane and the cytosolic domains of BP80 and called the resulting fusion protein GFP-PS1. Like the native vacuolar receptor, GFP-PS1 accumulates and cycles in the same cell compartment. We then introduced single or two mutation(s) in the cytosolic portion of GFP-PS1. Using this approach, we identify two important sorting signals, which participates to recycling and endocytic events of BP80
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Blot, Guillaume. „Caractérisation de deux nouveaux partenaires du domaine cytoplasmique de la glycoprotéine d'enveloppe du VIH-1 : tIP47 et Luman“. Paris 7, 2003. http://www.theses.fr/2003PA077202.
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Renault, Noémie. „Trafic intracellulaire de la protéine Gag du virus Foamy“. Paris 7, 2009. http://www.theses.fr/2009PA077154.
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Les virus foamy sont des rétrovirus complexes qui appartiennent à la famille des spumaviridae. Ces rétrovirus présentent de nombreuses particularités qui les différencient des orthorétrovirus comme l'existence d'ADN viral infectieux dans la particule virale ou celle d'un ARNm codant pour la polyprotéine Pol, ou encore l'absence d'un facteur de régulation post-transcriptionnelle de type Rev ou Rex. De la même manière, les protéines Gag ne présentent pas les caractéristiques fondamentales retrouvées chez les autres rétrovirus comme le clivage en matrice, capside et nucléocapside. Nous avons focalisé notre travail sur ces protéines structurales et sur leurs rôles tant lors des étapes précoces que tardives. Lors des étapes précoces, la polyprotéine Gag protège le génome viral et le guide sur le réseau microtubulaire jusqu'à la membrane nucléaire. Dans les cellules qui cyclent, les particules,virales enfantes du virus foamy sont retrouvées intactes au centrosome à partir de 4 h post-infection. La capside subit alors un désassemblage en partie dépendant de la protéase virale. A l'inverse, dans les cellules quiescentes, nous montrons que les capsides restent structurées autour centrosome. A la reprise du cycle cellulaire, le cycle réplicatif viral reprend avec le déshabillage de la capside et l'intégration du provirus. Les protéases cellulaires et virales, qui interviennent lors de la décapsidation, semblent ainsi inactives lorsque les cellules sont en phase GO. De manière non exclusive, les sites de clivage de ces protéases sur les protéines structurales du virus pourraient être inaccessibles dans ces conditions. Les protéines Gag jouent également un rôle clé lors des étapes tardives de l'infection, en étant responsables de l'assemblage des capsides qui a lieu dans le cytoplasme, autour du centrosome. De manière intéressante, avant l'assemblage, ces protéines transitent dans le noyau. Nous nous sommes intéressés à cette étape nucléaire et montrons que la protéine Gag est exportée du noyau grâce à un signal d'export nucléaire riche en leucine et sensible à la leptomycine B, présent dans la partie N-terminale de la protéine. Une protéine Gag mutée dans ce domaine est non seulement incapable de quitter le noyau mais interfère négativement avec la réplication d'un virus sauvage. Nous suggérons que les protéines Gag des virus foamy pourraient intervenir dans l’export nucléaire de l’ARN viral lors des étapes tardives de l'infectionFoamy viruses (FVs) are complex exogenous animal retroviruses that differ in many aspects of their life cycle from the orthoretroviruses such as human immunodefîciency virus (HIV). In particular, in FVvs, Gag and Pol proteins are expressed independently of one another, and both proteins undergo single clivage events. None of the conventional Gag landmarks of exogenous retroviruses, such as the major homology region or Cys-His motifs, are found in this protein. Instead, FV Gag harbors conserved C-terminal basic motifs, referred to as Gly-Arg (GR) boxes. Although the first GR (GRI) box binds viral nucleic acids and is required for viral genome packaging, the second (GRII) harbors a nuclear localization sequence (NLS) at its C-terminus, targeting Gag to the nucleus early after infection. GRII also contains a chromatin binding sequence (CBS) in its N-terminus, tethering the FV incoming pre-integration complex onto host chromosomes. The present work focuses on the structural Gag proteins, in early and late stages of infection. Troviral Gag proteins are involved in early stages of infection such as trafficking of incoming viruses nd nuclear import. FV Gag protein uses the microtubule network to reach the nucleus. In cycling cells,FV articles are structured at the centrosome 4 h post-infection. Then, the viral protease helps capsid for ncoating. In quiescent cells, we have shown that viral particles remain structured at the centrosome during everal weeks and that uncoating does not occur : this step is a limiting factor for infection although viral articles are still infectious. Upon cells reactivation, viral capsids undergo proteolysis and disassembly, llowing infection to proceed. During the late stages of infection, Gag undergoes transient nuclear trafficking after it synthesis, before returning back to the cytoplasm for capsid assembly and virus egress. The functional role of this nuclear stage, as well as the molecular mechanisms responsible for Gag nuclear export, are not understood. Here, we identify a leptomycin-sensitive nuclear export sequence (NES) within the N-terminus of the primate foamy virus Gag protein that is absolutely required for the completion of late stages of virus replication. Point mutation of conserved residues within this motif leads to nuclear retention of Gag and dramatically affects viral replication. Moreover, complementation experiments demonstrate that nuclear export-defective Gag mutants negatively interfere with virus release by sequestering wild-type Gag in the nucleus
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Viranaicken, Wildriss. „Etude structurale et fonctionnelle des facteurs Ilf3 et NF90, deux protéines impliquées dans le routage intracellulaire des ARN messagers“. Paris 6, 2005. http://www.theses.fr/2005PA066365.
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Siffroi-Fernandez, Sandrine. „Rôle des motifs N-glycanniques et des protéines chaperons sur la maturation et le transport intracellulaire du récepteur de la thyrotropine“. Aix-Marseille 2, 2001. http://theses.univ-amu.fr.lama.univ-amu.fr/2001AIX20666.pdf.
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Le récepteur de la thyrotropine (R-TSH) est la protéine clé dans le contrôle de la fonction thyroïdienne et un des autoantigènes majeurs de la thyroïde. Il est localisé sur la membrane basolatérale des thyréocytes, lieu, où il va lier la thyrotropine et transduire le signal. Le RTSH est une glycoprotéine de famille des récepteurs couplés aux protéines G. La partie extracellulaire contient 6 sites potentiels de N-glycosylation. Ce récepteur après avoir été synthétisé et transporté jusqu'à la membrane plasmique sous la forme d'une seule sous-unité va être clivé dans sa partie extracellulaire et donner ainsi deux sous-unités: A et B reliées entre elles par des ponts disulfures. Le clivage peut avoir lieu à deux endroits différents ce qui conduit à la libération d'un petit peptide, le peptide C. Nous avons montré dans cette thèse que la glycosylation du R-TSH est essentielle pour le transport intracellulaire du R-TSH vers la surface cellulaire et que le maintien de sa capacité à lier la thyrotropine nécessite l'acquisition de motifs de type complexe. Nous avons également observé une augmentation de la sensibilité à des protéases avec une possible libération du peptide C lorsque le R-TSH n'est pas porteur des motifs de type complexe. Ce qui laisse à penser que ces motifs protègent le R-TSH du clivage protéolytique. Nous avons également observé qu'il n'y a que 50% du R-TSH synthétisé par les cellules qui est capable d'acquérir des motifs de type complexe. Les autres 50% sont probablement polyubiquitinilés avant d'être dégradés par le protéasome. Nous avons alors étudié le rôle de trois protéines chaperons de la lumière du RE, la calnexine, la calréticuline et BiP sur la maturation du R-TSH. Nous avons observé que la calnexine et la calréticuline permettent de protéger le R-TSH d'une dégradation immédiate après sa synthèse mais que cette interaction n'est pas absolument requise pour obtenir le repliement correct d'une partie du récepteur. Par contre, BiP a un effet négatif sur le repliement du R-TSH en augmentant sa dégradation et en diminuant la quantité de R-TSH capable d'atteindre l'appareil de Golgi et d'acquérir ses motifs de type complexe.
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Akarsu, Hatice. „Etudes structurales et fonctionnelles des protéines virales impliquées dans le trafic intracellulaire du génome du virus de la grippe“. Phd thesis, Université Joseph Fourier (Grenoble), 2005. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00011131.
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Le virus de la grippe appartient à la famille des Orthomyxoviridae. Son génome est segmenté en huit ribonucléoprotéines virales (vRNPS) composées chacune d'une molécule d'ARN négatif simple brin recouverte de nucléoprotéines (NP) et associée au complexe de la polymérase. Le virus entre dansla cellule hôte par endocytose, libère dans le cytoplasme ses vRNPs qui gagnent ensuite le noyau cellulaire pour être transcrites et répliquées. Les vRNPs sont importées via l'hétérocomplexe des importines alpha/beta. La NP, composant majoritaire des vRNPs, pourrait être impliquée dans cette étape et serait aussi un candidat idéal dans la mise au point de drogues antivirales. Nous avons voulu déterminer les caractéristiques structurales de
NP en complexe avec l'importine alpha 5 humaine. Grâce à la technique de microscopie électronique à transmission, nous avons obtenu un premier
modèle à basse résolution du complexe NP/importine alpha.
Dans le noyau, les vRNPs sont étroitement liées à la chromatine. En phase tardive du cycle viral, la protéine matricielle M1 se lierait aussi à la chromatine, peut-être pour décrocher les vRNPs. Nous avons pu montrer, par la technique de sédimentation, que les vRNPs se lient aux queues des histones, alors que M1 se fixe sur le domaine globulaire des octamères d'histones.
En fin de cycle viral, les vRNPs amplifiées sortent du noyau. Nos tests enzymatiques, d'interaction sur billes et en sédimentation montrent que les protéines virales M1 et NEP servent d'adaptateurs entre les vRNPs et le système d'export nucléaire CRM1/RanGTP. Nous avons aussi obtenu la
structure cristallographique du domaine C-terminal de NEP se liant à M1.
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Deroubaix, Aurélie. „Etude de la localisation intracellulaire de la protéine core du virus de l’hépatite B humaine et de ses multimères“. Thesis, Bordeaux 2, 2011. http://www.theses.fr/2011BOR21907/document.
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L’hépatite B, causée par le virus de l’hépatite B (VHB), est responsable d’un à deux millions de morts chaque année dans le monde. Le VHB occasionne des lésions importantes au niveau du foie, pouvant amener à la cirrhose et au carcinome hépatocellulaire. Ce virus, de la famille des hepadnavirus, contient une capside formée de 240 copies d’une même protéine : la protéine core. Des biopsies de patients infectés par le VHB montrent que la protéine de capside se localise soit dans le noyau soit dans le cytoplasme des cellules infectées. On s’accorde à dire qu’une localisation majoritairement cytoplasmique est liée à une aggravation de la maladie. Nous avons observé que, dans des cellules HuH-7, la protéine core seule est nucléaire alors qu’en contexte viral, elle se localise dans le cytoplasme. Après avoir vérifié que nos observations ne sont pas dues aux conditions de culture des cellules, nous avons démontré que la relocalisation de core est due à des facteurs viraux : la polymérase virale grâce à son domaine TP ainsi que la Tige/Boucle présente sur l’ARN prégénomique. La localisation de core est aussi influencée par l’état de phosphorylation de ses sérines 157, 170 et 172.Ainsi, nous avons pu montrer à quel point le trafic de core était complexe et qu’il était régulé par divers facteurs viraux et cellulaires. Ces travaux permettront une étude plus approfondie des régulations du trafic intracellulaire de la protéine core et ainsi de faire évoluer plus favorablement l’hépatite B chez les patients infectésHepatitis B is a liver inflammation caused by the Hepatitis B virus (HBV). It is responsible of one to two millions deaths per year in the world. HBV is the cause of important liver damages and may lead to cirrhosis and hepatocellular carcinoma.HBV is a member of hepadnaviral family. It has a capsid composed of 240 copies of the same protein: the core protein. In literature, patients’ biopsies showed that capsid is found either in the nucleus or in the cytoplasm or both compartments of hepatocytes. In general, a cytoplasmic localization is related to an advanced state of the disease.In our study, we observed that in HuH-7 cells, core protein alone has a nuclear localization, whereas in viral context it is essentially found in the cytoplasm. We verified that these observations were not due to culture conditions. Then, we demonstrated that the cytoplasmic localization of core was due to viral factors. The viral polymerase is implied by its TP domain. The second component is the viral pregenomic RNA, by its Epsilon stem loop structure. At last, core localization is also influenced by the phosphorylation state of its serines 157, 170 and 172.Thus, we demonstrated that the core protein traffic is very complex and regulated by different viral and cellular factors. This work will further study the regulation of intracellular trafficking of the core protein and allow a better outcome for the infected patients
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Driouich, Azeddine. „Etude du rôle de la glycosylation dans l'exportation des protéines par des suspensions cellulaires de sycomore (acer pseudoplatanus l. )“. Rouen, 1990. http://www.theses.fr/1990ROUE5018.
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Des suspensions cellulaires de sycomore (acer pseudoplatanus l. ) sécrètent de nombreuses protéines, en particulier des hydrolases acides, dans le compartiment apoplastique. Ces protéines extracellulaires sont glycosylées et présentent des glycanes n-liés de type polymannosidique et/ou complexe. L'inhibition de la n-glycosylation par la tunicamycine réduit de 84% a 98% l'accumulation des protéines néosynthétisées dans le compartiment extracellulaire alors que la biosynthèse protéique n'est pas affectée. Par contre, l'inhibition de la biosynthèse des glycanes complexes par la castanospermine et la déoxymannojirimycine ne perturbe pas la sécrétion des glycoprotéines par les cellules de sycomore. Ces résultats suggèrent que la maturation des glycanes complexes n'est pas nécessaire pour l'adressage des protéines végétales vers le compartiment extracellulaire. En revanche, la glycosylation joue probablement un rôle important dans la stabilité des glycoprotéines sécrétées. Pour étudier de façon détaillée le rôle de la glycosylation dans le transport et la stabilité des protéines végétales, nous avons purifié une glycoprotéine excrétée par les cellules de sycomore, la laccase. La préparation d'un immunosérum monospécifique anti-laccase a permis la caractérisation de cette glycoprotéine. Nous disposons maintenant d'outils, de caractérisation, spécifiques des glycanes complexes de la laccase (lectines et anticorps). Ces outils nous permettront d'utiliser la structure des oligosaccharides n-liés a la laccase comme marqueur du transport intracellulaire de cette enzyme
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Denmat-Ouisse, Lise-Anne. „Rôle de la N-glycosylation et du repliement lors du transport des protéines solubles dans la cellule végétale“. Rouen, 1998. http://www.theses.fr/1998ROUES044.
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Dans la cellule végétale, les protéines solubles vacuolaires et extracellulaires entrent dans le système endomembranaire de sécrétion au niveau du réticulum endoplasmique. Ces protéines sont ensuite transportées via des vésicules de transport jusqu'à leur compartiment de stockage, la vacuole et le compartiment extracellulaire, en passant par l'appareil de Golgi. Dès leur insertion dans la lumière du RE, ces protéines vont subir des modifications co-traductionnelles, en particulier la N-glycosylation et le repliement qui leur conféreront stabilité et activité biologique. Des suspensions cellulaires de tabac BY-2 exprimant simultanément plusieurs protéines-marqueur vacuolaires et extracellulaires nous ont permis d'étudier les implications des modifications co-traductionnelles dans le transport de protéines et de glycoprotéines à travers le système endomenbranaire de sécrétion. Nous avons montré qu'un defaut de repliement d'une glycoprotéine vacuolaire peut d'une part entraîner une modification de sa N-glycosylation et d'autre part sa réorientation vers la surface cellulaire. Les mécanismes de tri et la maturation des glycoprotéines vacuolaires ont été également étudiés en présence de drogues perturbant le fonctionnement de l'appareil de Golgi. Enfin, le transport protéique dans le système endomembranaire de sécrétion a été étudié dans des conditions où la N-glycosylation est inhibée par la tunicamycine. Ainsi, nous avons montré qu'en absence de N-glycosylation, le transport à la vacuole des protéines et des glycoprotéines a lieu mais se trouve fortement ralenti. En revanche, la sécrétion des glycoprotéines extracellulaires est totalement inhibée alors que, dans les mêmes conditions, les protéines sont transportées vers le compartiment extracellulaire. Nous avons pu préciser que les glycoprotéines extracellulaires non-glycosylées en presence de tunicamycine sont dégradées dans le système endomembranaire de sécrétion par un mécanisme pré-golgien et indépendant des protéasomes.
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Samih, Nezha. „Expression et adressage du transporteur de glucose Glut-1 dans les cellules épithéliales thyroïdiennes“. Aix-Marseille 2, 2001. http://theses.univ-amu.fr.lama.univ-amu.fr/2001AIX20656.pdf.
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Le transporteur de glucose de type 1 (Glut-1) est l'isoforme majoritairement exprimée dans la cellule thyroïdienne. Sa fonction principale est le transport du glucose à travers la membrane plasmique par diffusion facilitée. Nous nous sommes intéressés au mécanisme d'action de l'insuline, de la TSH et du dibutyryl AMP cyclique sur le transport du glucose et l'exocytose de Glut-1 vers la surface de la cellule thyroïdienne FRTL-5. Nous avons montré tout d'abord que ces différents facteurs augmentaient la consommation et le transport du glucose vers l'intérieur de la cellule ainsi que l'exocytose de Glut-1 vers la surface cellulaire. Nous avons d'autre part montré que l'exocytose de Glut-1, stimulée par ces différents facteurs, est dépendante de l'activité de la PB-kinase. En effet, l'inhibition de la PB-kinase affecte aussi bien la translocation que l'activité du transport du glucose, stimulée par l'insuline, la TSH ou le dibutyryl AMP cyclique. Par ailleurs, nous avons montré que la PKA qui relaie les effets de l' AMP cyclique n'exerce aucun effet sur le transport du glucose ni sur l'exocytose de Glut-1, dans notre modèle expérimental. Ainsi, la PB-kinase via le cAMP semble jouer un rôle clé dans le transport du glucose et l'exocytose de Glut-1, dans la cellule FRTL-5. Au cours de ce travail, nous avons observé une différence d'expression-de Glut-1 en fonction des situations·pathologiques. Dans des cellules thyroïdiennes humaines provenant d'un cancer anaplasique, une altération du transport du glucose ainsi qu'une altération structurale dans la partie glycannique de Glut-1 ont été observées par rapport aux cellules thyroïdiennes humaines normales·. Ce constat nous a conduit dans un premier temps à nous intéresser au rôle biologique de la partie glycannique de Glut-1 dans. La cellule thyroïdienne de rat FRTL-5 et dans les cellules thyroïdiennes humaines provenant d'un cancer anaplasique. Dans ce but, nous avons essayé de comprendre la relation entre le transport du glucose, l'expression de Glut-1 à la surface cellulaire et les étapes de maturation de sa partie glycannique. Les résultats que nous avons obtenus montrent que la partie glycannique semble nécessaire au bon fonctionnement du transporteur mais pas à son exocytose vers la surface cellulaire. En effet, la déglycosylation complète de Glut-1 est associée à la perte de son activité biologique et bien que les deux formes glycosylée et non glycosylée de Glut-1 arrivent à la surface cellulaire, seule la forme glycosylée semble fonctionnelle. D'autre part, nous avons montré que le transporteur portant des chaînes oligosaccharidiques N-liées de type oligomannosidique, au lieu des chaînes complexes, reste fonctionnel. La maturation des motifs glycanniques ne semble pas nécessaire au transport de Glut-1, ni à son activité biologique.
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Raio, vilela Fernando Augusto. „Structural characterization of JIP3 recruitment by Kinesin-1“. Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2019. http://www.theses.fr/2019SACLS123.
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Le transport intracellulaire de cargos est un processus critique au sein des cellules eucaryotes, et notamment au niveau des neurones, pour contrôler différentes fonctions dont la maturation et la transmission synaptique. La kinésine-1 est un moteur moléculaire capable de transporter différents types de cargos, comme des organelles, des vésicules ou des assemblages macromoléculaires le long des microtubules. La kinésine-1 est un hétérotétramère constitué d’un homodimère de chaînes lourdes (KHC) associé à deux chaînes légères (KLC) ; les deux chaînes, KHC et KLC étant capables de recruter des cargos. L’un des premiers cargos de la kinésine-1 à avoir été identifiés sont les protéines JIP3/4 (JNK-Interacting Protein 3/4) ; elles jouent aussi un rôle de protéines adaptatrices pour le transport d’autres cargos de la kinésine-1. La kinésine-1 recrute les protéines JIP3/4 de deux façons distinctes et indépendantes (i) via KHC et (ii) via KLC. Le recrutement de JIP3/4 par KHC et KLC est capable, via des mécanismes moléculaires distincts, d’activer la motilité de la kinésine-1 et donc de contrôler le transport intracellulaire dans lequel elle est impliquée et les fonctions associées au sein des neurones.Au cours de mon travail de thèse, j’ai contribué à caractérisé par des approches bio-informatiques, biochimiques/biophysiques et structurales, les deux modes de recrutement des protéines JIP3/4 par la kinésine-1 : (i) via KHC et (ii) via KLC. Ce travail a permis d’apporter des nouveaux éléments pour comprendre le mode de recrutement de ces protéines cargos/adaptatrices par la kinésine-1, mais aussi de mieux comprendre les mécanismes moléculaires de son activation par les protéines JIP3/4The intracellular transport of cargos is a crucial process on eukaryotic cells, and notably in neurons, in order to regulate different functions as cell’s maturation and synaptic transmission. The Kinesin-1 is a molecular motor capable of transporting different types of cargos as organelles, vesicles and macromolecular assemblies along the microtubules. It is a heterotetramer composed by a homodimer of heavy chains (KHC) bound to two light chains (KLC), where both KHC and KLC are capable of cargos recruitment. One of the first identified cargos of Kinesin-1 is JIP3/4 (JNK-Interacting Protein 3/4), which are also adaptor proteins, intermediating the transport of other cargos. Kinesin-1 recruits JIP3/4 by two different and independent modes, (i) via KHC and (ii) via KLC. Therefore, JIP3/4 recruitment by KHC and KLC activates the motility of Kinesin-1, by distinct mechanisms, allowing the intracellular transport of cargos and the associated functions in neurons. During my PhD, I contributed to the characterization of the dual binding mode of Kinesin-1 and JIP3/4 by bioinformatical, biochemical/biophysical and structural approaches. This work allowed a better understanding of the cargos’ recruitment by Kinesin-1, as well as the molecular mechanisms of Kinesin-1 activation by JIP3/4
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Ben, Ahmed Awatef. „Implication de la O-GlcNAcylation dans le trafic intracellulaire : impact de la O-GlcNAc Transférase (OGT) sur le positionnement du système endolysosomal et cartographie de son interactome proximal par BioID“. Electronic Thesis or Diss., Université de Lille (2022-....), 2024. https://pepite-depot.univ-lille.fr/ToutIDP/EDBSL/2024/2024ULILS101.pdf.
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La O-GlcNAcylation est une modification post-traductionnelle réversible orchestrée par la O-GlcNAc transférase (OGT) qui transfère un seul résidu de GlcNAc sur les Ser/Thr des protéines à partir de l'UDP-GlcNAc. Inversement la O-GlcNAcase (OGA) hydrolyse la liaison O-glycosidique. La dynamique de O-GlcNAcylation régule les propriétés biologiques de nombreuses protéines cibles, dont leur stabilité ou leur activité enzymatique. L'intégration de la dynamique O-GlcNAc en réponse à un stress cellulaire permet aux cellules de mieux s'adapter à leur microenvironnement. Il a notamment été démontré que lors d'un stress nutritionnel, des changements de O-GlcNAcylation de protéines spécifiques régulent le flux autophagique, favorisant ainsi la survie cellulaire. Ce processus catabolique repose sur la formation et la maturation de vacuoles autophagiques qui fusionnent avec les lysosomes. Cette fusion assure la dégradation de composants cytoplasmiques et leur recyclage en précurseurs métaboliques. On dispose en revanche de peu de données sur le rôle de l'OGT dans l'autophagie basale qui, dans des conditions physiologiques, assure la dégradation des protéines et des organites endommagés pour maintenir l'homéostasie cellulaire, notamment au niveau de l'épithélium du colon.Dans ce contexte, le premier objectif de ma thèse était de comprendre comment l'activité de l'OGT régule l'autophagie basale dans des cellules coliques humaines cancéreuses ou non, cultivées dans des conditions riches en nutriments. Grâce à des d'approches cellulaires et à l'imagerie confocale, mes résultats montrent que l'inhibition ou l'extinction de l'OGT induit un blocage du flux autophagique basal dans les deux lignées cellulaires en altérant la maturation des autophagosomes. L'inhibition de l'OGT s'accompagne d'une accumulation périnucléaire anormale des lysosomes et des endosomes, associée à un défaut de colocalisation d'une protéine régulatrice du système endolysosomal, la GTPase Rab7. Dans un second temps, nous avons utilisé la stratégie de BioID pour identifier l'interactome proximal cytoplasmique de l'OGT sensible à son activité catalytique et à l'apport nutritionnel en glucose. L'analyse BioID montre que l'inhibition de l'OGT perturbe son interaction proximale avec deux protéines impliquées dans le cycle d'activation des Rab GTPases, RabGGTA et GDI1. Nous avons également identifié la kinésine KIFC1 et deux sous-unités de la dynéine, qui sont des moteurs moléculaires impliqués dans le transport intracellulaire des organelles le long du réseau de microtubules. Mes résultats d'imagerie confocale suggèrent que l'inhibition de l'OGT altère de manière antagoniste la localisation subcellulaire de ces protéines motrices.Mes travaux de thèse révèlent un rôle critique de l'OGT dans l'autophagie basale et dans l'homéostasie du système endolysosomal. Ils ouvrent de nouvelles perspectives sur la compréhension des mécanismes moléculaires régulant ces processus cellulaires fondamentauxO-GlcNAcylation is a reversible post-translational modification orchestrated by O-GlcNAc transferase (OGT), which transfers a single GlcNAc residue from UDP-GlcNAc to Ser/Thr residues of proteins, and O-GlcNAcase (OGA), which hydrolyses the O-glycosidic bond. O-GlcNAcylation regulates the biological properties of many target proteins, including their stability and enzymatic activity. O-GlcNAcylation is part of the cellular response to various stresses, allowing cells to adapt to their microenvironment. In particular, it has been shown that during nutritional stress, changes in the O-GlcNAc status of specific proteins regulate the autophagic flux, thereby ensuring cell survival. This catabolic process relies on the formation and maturation of autophagic vacuoles, which fuse with lysosomes to degrade cytoplasmic components and recycle them into metabolic precursors. However, there is limited data on the role of OGT in basal autophagy, which occurs under physiological conditions to degrade damaged proteins and organelles to maintain cellular homeostasis, particularly in the colon epithelium.In this context, the first aim of my thesis was to understand how OGT activity regulates basal autophagy in human colon cells, both cancerous and non-cancerous, cultured under nutrient-rich conditions. Using cellular approaches and confocal imaging, my results show that inhibition or depletion of OGT induces a blockade of the basal autophagic flux in both cell lines by altering autophagosome maturation. OGT inhibition is accompanied by an abnormal perinuclear accumulation of lysosomes and endosomes, which is associated with a defect in the colocalisation of a key regulatory protein of the endolysosomal system, the Rab7 GTPase. We then used the BioID strategy to identify the cytoplasmic proximal interactome of OGT, which is sensitive to its catalytic activity and glucose supply. BioID analysis shows that inhibition of OGT disrupts its proximal interaction with two proteins involved in the Rab GTPase activation cycle, RabGGTA and GDI1. We also identified the kinesin KIFC1 and two subunits of dynein, which are molecular motors involved in the intracellular transport of organelles along the microtubule network. Confocal imaging results suggest that OGT inhibition antagonistically alters the subcellular localisation of these motor proteins.My dissertation work reveals a critical role for OGT in basal autophagy and the positioning and homeostasis of the endolysosomal system in human cells. These findings open new perspectives for understanding the molecular mechanisms regulating these fundamental cellular processes
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Gata, Gabriel. „Regulated export of G-protein coupled receptors“. Thesis, Paris 5, 2014. http://www.theses.fr/2014PA05T066.
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La plus grande famille de récepteurs membranaires est constituée par des récepteurs à sept domaines transmembranaires couplés aux protéines G (RCPG). Ces récepteurs sont impliqués dans un grand nombre de réponses cellulaires physiologiques et pathologiques et représentent la ciblé de une grande majorité des produits thérapeutiques. La fonction d’un récepteur est déterminée par la quantité de récepteur fonctionnel à la surface cellulaire, qui dépend de différents paramètres comme le niveau de biosynthèse, l’export vers la surface cellulaire à partir de stocks intracellulaires, l’endocytose et les modifications post-transcriptionelles (ex. phosphorylation). Le nouveau concept d’export régulé pour les RCPG présent l’importance physiologique de la rétention de récepteurs, leur relargage, leur interaction avec les partenaires chaperonnes et les escortes. Les études présentées ici concernent les mécanismes d’export régulé de deux RCPG, le récepteur métabotropique de l’acide γ-amino butyrique (GABAB) et le récepteur de chimiokines CC 5 (CCR5). GABAB est un récepteur constitué de deux sous-unités GB1 et GB2 et CCR5 est probablement un homo-dimer. GB1 ainsi que CCR sont retenus dans des compartiments intracellulaire (RE et appareil Golgi) d’où ils sont relâchés en réponse à un signal extern (CCR5) ou/et en interagissant avec protéines d’escorte (comme CD4 pour CCR5 et GB2 pour GB1). L’objectif de ces études était de comprendre le mécanisme de rétention de ces récepteurs et leur régulation. Dans ce contexte, nous avons déterminé en utilisant des approches biophysiques et biochimiques que ces récepteurs interagissent de façon spécifique avec les membres de Prenylated Rab Acceptors Family (PRAF). Ces protéines sont résidentes dans le RE (PRAF2 et PRAF3) et dans le appareil Golgi (PRAF1) où elles fonctionnent comme de gatekeepers pour les récepteurs. Nous avons pu démontrer que PRAF2 interagie de manière spécifique avec des motifs de rétention connus pour leur implication dans la rétention de récepteurs. Cette interaction détermine une rétention au niveau de RE donc régule de façon négatif l’export vers la membrane cellulaire. Dans le cas de récepteur GABAB, l’interaction de GB2 avec GB1 permet la libération de GB1 de sa rétention par PRAF2 par simple compétition. La modification de l’équilibre stoichiométrique entre les gatekeepers PRAF et les protéines d’escorte pour les récepteurs induit des modifications de la fonction du récepteur in vitro et in vivo. Les PRAFs sont ubiquitaires et peuvent interagir avec plusieurs RCPG représentant dans ce cas des régulateurs majors de la fonction de RCPG dans des conditions physiologiques et pathologiquesThe largest family of membrane receptors is constituted by conserved seven-membrane domain spanning receptors, the G-protein coupled receptors (GPCRs). They are involved in numerous cell responses and diseases thus being a major drug target. Receptor function is determined by the amount of active receptors at the cell surface, which depends on various parameters, such as the biosynthetic rate, the export to the cell surface from internal stores, the endocytosis and post-transcriptional modifications (i.e. phosphorylation). Only recently, the importance of the regulated export has emerged, shedding new light on the physiological role of receptor retention, release, chaperoning and escorting. This work concerns the regulated export mechanisms of two members of the GPCRs family, the chemokine receptor 5 (CCR5) and the metabotropic receptor of the g amino butyric acid (GABAB). Whereas CCR5 is likely a homo-dimer of 2 identical protomers, GABAB is an obligatory hetero-dimer of 2 distinct subunit known as GB1 and GB2. Both CCR5 and GB1 are retained in intracellular compartments (the ER and the Golgi) from which they are released in response to external signals (CCR5) and/or interaction with “private escort proteins” (CD4 for CCR5 and GB2 for GB1). The main goal of our work was to understand the mechanism of retention of these receptors and its regulation. In this context, we determined using biochemical and biophysical approaches that these GPCRs specifically interact with the members of the Prenylated Rab Acceptor Family (PRAF). These proteins are resident either in the ER (PRAF2 and PRAF3) or in the Golgi apparatus (PRAF1) where they function as receptor gatekeepers. Indeed, we could document for PRAF2 that this protein likely interacts directly with previously identified receptor retention motifs and inhibits receptor egress from the ER and subsequent trafficking to the plasma membrane. In the context of the GABAB receptor, PRAF2-dependent retention of GB1 can be overridden by GB2 via simple competition. Perturbing the stoichiometry of PRAF gatekeepers respective to that of receptors significantly perturbs receptor function both in vitro and in vivo. Because PRAFs are ubiquitous and seem to interact with many other GPCRs, they might represent major regulators of receptor function both in physiological and pathological conditions
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Sidelarbi, Khadidja. „Implication du chaperome de la protéine F508del-CFTR dans son transport intracellulaire et/ou sa dégradation : rôle des lectines EDEMs et la mannosidase du RE“. Thesis, Poitiers, 2017. http://www.theses.fr/2017POIT2286/document.
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De nombreuses maladies génétiques sont directement liées à la reconnaissance de protéines mal repliées par le contrôle qualité du réticulum endoplasmique (RE), conduisant à leur rétrotranslocation vers le cytosol puis leur dégradation. Dans le cas des glycoprotéines mutées, comme la protéine F508del-CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator), la démannosylation extensive de leur résidus mannoses constitue une étape clé dans ce processus. L’objectif de ce travail a été d’identifier et de caractériser des molécules capables de rétablir l’expression membranaire de F508del-CFTR en ciblant cette activité enzymatique. Dans un premier temps, nous avons testé des dérivés multivalents basés sur le Deoxymannojirimycin (DMJ), un inhibiteur spécifique de la classe I des α-mannosidases et révélé leur effet correcteur puissant sur F508del-CFTR. Nous avons par la suite mis en évidence leur mécanisme d’action et tenté d’expliquer l’augmentation d’efficacité observée entre les monovalents et les multivalents. Nous nous sommes enfin focalisés sur le rôle des principales mannosidases dans le RE, l’α1,2-mannosidase I du RE (ERManI) et la famille des lectines EDEM (ER degradation-enhancing α-mannosidase-like protein). Nous avons montré par une stratégie de siRNA qu’ERManI, EDEM1 et EDEM2 sont impliquées dans la rétention réticulaire du F508del-CFTR.Notre étude ouvre ainsi de nouvelles perspectives quant à l’identification de nouveaux agents pharmacologiques ciblant ces protéinesNumerous genetic diseases are directly associated to the recognition of misfolded proteins by the endoplasmic reticulum (ER) quality control, leading to their retention and subsequently their retrotranslocation to the cytosol for degradation. In the case of mutated glycoproteins such as F508del-CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator), causing CF pathology, mannose trimming is a key step of this process. Our objective was to identify and characterize molecules targeting ER-mannosidases activity, with the goal to restore F508del-CFTR to the plasma membrane.First, we tested multivalent derivatives, based mainly on Deoxymannojirimycin (DMJ), a specific inhibitor of α-mannosidasesI and revealed their better corrective effect on F508del-CFTR and their mechanism of action. Then we explored the mechanism explaining the higher efficiency of the multivalents compared to the monovalent. Finally, we focused on the role of key players of mannose trimming, ER-α1,2-mannosidase I (ERManI) and EDEMs (ER degradation-enhancing α-mannosidase-like protein) proteins on F508del-CFTR trafficking defect. We showed the implication of ERManI, EDEM1 and EDEM2 in F508del-CFTR retention, using a siRNA strategy. In conclusion, our study highlights these proteins as potential pharmacological targets to develop correctors for the F508del-CFTR trafficking defect
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Catez, Frédéric. „Identification et caractérisation des signaux de transport intracellulaire de la protéine US11 de HSV-1 : définition des modalités de la localisation nucléaire et nucléolaire“. Lyon 1, 2000. http://www.theses.fr/2000LYO10172.
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Marchal, Michelle. „La valence du ligand du récepteur à la transferrine 1 (TfR1) détermine son routage intracellulaire“. Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2019. http://www.theses.fr/2019SACLS418.
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Le récepteur à la transferrine (TfR1) est un récepteur très bien conservé au cours de l’évolution qui permet l’entrée du fer (Fe) lié à la transferrine (Fe-Tf) dans les cellules. Une fois internalisé, le fer se détache de la Tf et est exporté dans le cytoplasme tandis que le complexe Tf/TfR1 est recyclé à la membrane plasmique. Le TfR1 est internalisé par un mécanisme clathrine dépendant et peut être soit recyclé à la membrane plasmique par la voie rapide, soit être dirigé vers le compartiment endosomal de recyclage (ERC). Une fois dans l’ERC, le TfR1 peut être soit recyclé à la membrane plasmique par la voie lente, soit être dirigé vers les lysosomes. De nombreuses protéines régulent le routage des protéines internalisées comme les protéines Rab. Il s’agit de petites GTPases impliquées dans les échanges moléculaires entre les différents compartiments cellulaires.Etant la principale voie d’entrée du fer dans la cellule,le TfR1 est exprimé par la plupart des cellules et est surexprimé par les cellules hautement prolifératives dont certaines cellules cancéreuses. Le TfR1 est très étudié comme cible thérapeutique dans le développement de nouvelles stratégies anti-cancéreuses. A24 est un anticorps murin anti-TfR1 dont l’action anti-proliférative et pro-apoptotique ont été démontrées dans plusieurs hémopathies malignes.Nous nous sommes demandés comment la fixation de A24 sur le TfR1 peut produire des effets différents de la fixation de la Fe-Tf. En générant un fragment Fab, nous avons d’abord démontré que le routage du TfR1 dépend de la valence de son ligand. Nous avons ensuite démontré que la fixation monovalente du TfR1 par la Fe-Tf et le Fab induisent son recyclage sans passer par l’ERC. Nous avons également démontré que la fixation divalente du TfR1 par A24 induit son routage depuis l’ERC vers les lysosomes par une voie dépendante de Rab12The transferrin receptor (TfR1) is a highly conserved receptor that allows the entry of iron (Fe) linked to transferrin (Fe-Tf) into cells. Once internalized, Fe separates from the Tf and is exported in the cytoplasm whereas the complex Tf/TfR1 is recycled to the cell membrane. TfR1 is internalized by a clathrin mediated endocytosis and can be either recycled to the cell membrane through the rapid pathway or be routed towards the endosomal recycling compartment (ERC). Once in the ERC, the TfR1 can be either recycled to the cell membrane through the slow pathway or be routed towards lysosomes. Many proteins regulates the routing of internalized proteins such as Rab proteins. They are small GTPases involved in molecular exchanges between the different cellular compartments.Being the main mode of entry of iron into cells, TfR1is expressed by almost every cells and is overexpressed by highly proliferative cells including some cancer cells. TfR1 is extensively studied as a therapeutic target for the development of new anti-cancer strategies. A24 is a murine anti-TfR1 whose anti-proliferative and pro-apoptotic roles were demonstrated in several hematological malignancies.We wondered how A24 binding on TfR1 can produce different effects from Fe-Tf binding. By the manufacturing of a Fab fragment, we first demonstrated that TfR1 fate depends on its ligand’s valency. We then demonstrated that the monovalent binding of TfR1 with Fe-Tf or the Fab leads to its recycling without going through the ERC. We also showed that the divalent binding of the TfR1 by A24 leads to its routing from the ERC to lysosomes through a Rab12 dependent pathway
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Bouvet, Samuel. „Lipides et trafic : rôles de GBF1, facteur d’échange de la petite protéine G Arf1“. Thesis, Paris 11, 2013. http://www.theses.fr/2013PA112172/document.
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La cellule eucaryote compartimentalise ses tâches au sein d’organelles communiquant les unes avec les autres au moyen de vésicules de transport. Le trafic vésiculaire est contrôlé par des petites protéines G de la superfamille Ras, activées par un changement de nucléotide guanidique catalysé par un facteur d’échange (GEF). En particulier, au niveau du cis-Golgi la petite protéine G Arf1 est activée par GBF1, permettant le transport rétrograde des vésicules COPI vers le réticulum endoplasmique. Récemment, GBF1 a été impliqué dans d’autres fonctions, notamment dans le cycle réplicatif de certains virus ou dans le métabolisme des gouttelettes lipidiques.Les gouttelettes lipidiques sont les organelles ubiquitaires du stockage des lipides et ont un rôle majeur dans l’homéostasie des lipides à l’échelle de la cellule. Le trafic intracellulaire des ces organelles dynamiques serait contrôlé par des petites protéines G. Notre équipe à montré dans une précédente étude que GBF1 est localisé sur les gouttelettes lipidiques et est impliqué dans le recrutement de PLIN2 et de la lipase ATGL sur les gouttelettes lipidiques. Cette thèse montre, par des études de biologie cellulaire et de microscopie, que GBF1 possède un domaine de fixation aux phospholipides via une hélice amphipatique. Cette hélice est nécessaire et suffisante pour l’association aux gouttelettes lipidiques in cellulo. La régulation de la localisation de GBF1 repose sur l’interaction avec Rab1B (cascade entre Rab1 et Arf1 dans la voie sécrétoire précoce) ainsi que sur les interactions intramoléculaires entre les différents domaines de GBF1The eukaryotic cell physically separates its functions within several membrane-bound organelles, which communicate using vesicles. Vesicular trafficking is under the control of small GTPases that exist as an inactive GDP-bound form and an active GTP-bound form. The switch between GDP and GTP is catalyzed by a guanine nucleotide exchange factor (GEF). On cis-Golgi membranes, Arf1, activated by the large GEF GBF1, recruits the COPI coat. COPI coated vesicles ensure the retrograde transport from the Golgi to the ER. Recently, GBF1 has been implicated in other pathways, such as the life cycle of various viruses and lipid droplet metabolism.Lipid droplets (LD), the major lipid storage organelle, play a major role in lipid homeostasis within the cell. LDs are connected to membrane trafficking and are therefore under the control of GTPases. In previous studies, our team showed that GBF1 localizes around LDs and that it is required for protein loading onto the LD surface. Here, data support the idea that GBF1 localizes to the LD surface. Using cell biology tools and microscopy, we identified, within GBF1, a lipid binding domain. In this domain, a single amphipathic helix is necessary and sufficient for LD targeting in cells. The regulation of GBF1 localization relies on interaction with Rab1 (data support a Rab1-Arf1 cascade between the ER and the Golgi) and on intramolecular interactions between GBF1 domains
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Vincent, Patrick. „Trafic intracellulaire des phospholipides du système endomembranaire chez un végétal supérieur Allium porrum L. : étude de la relation synthèse-transport de la phosphatidylsérine à la surface cellulaire. Caractérisation chez ce végétal d'ADNc codant pour des protéines membres potentiels de la famille des SNAREs Ykt6p, impliquée dans le transport RE-Golgi“. Bordeaux 2, 2000. http://www.theses.fr/2000BOR28816.
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Les travaux présentés dans ce mémoire concernent l'étude de la biogenèse de la membrane plasmique des végétaux supérieurs, sur le modèle des plantules étiolées d'Allium porrum. La membrane plasmique des eucaryotes est nrichie en phosphatidylsérine, où elle joue un rôle fondamental dans diverses activités biologiques, notamment dans le trafic membranaire mettant en relation la cellule avec le milieu extracellulaire. Les études menées sur la relation entre la synthèse et le transport de la phosphatidylsérine à la surface cellulaire ont permis d'envisager le fait que ce phospholipide peut y avoir une double origine : vésiculaire, en provenance de la voie réticulum endoplasmique-Golgi-membrane plasmique, par une activité de synthèse à la surface cellulaire. Les espèces à acides gras à très longues chaînes sont triées et acheminées prioritairement vers la voie de sécrétion. Elles sont synthétisées en amont dans le réticulum endoplasmique par une activité d'échange de base, mais également dans la membrane plasmique avec la même activité enzymatique. Afin de caractériser des vésicules riches en phosphatidylsérine, formées et isolées dans un système acellulaire à partir du réticulum endoplasmique, des travaux ont été initiés sur la recherche d'ADNc codant pour des protéines membres potentiels de la famille des SNAREs Ykt6p. Chez l'animal et la levure, cette famille est impliquée dans le ciblage spécifique des vésicules issues du RE et destinées à l'appareil de GolgiThe work presented in this thesis concerns the study of the biogenesis of the plasma membrane in higher plants, on the model of Allium porrum. The plasma membrane of the eukaryotes is enriched in phosphatidylserine, where it plays a fundamental role in various biological activities, notably in the membrane traffic, allowing for exchanges in the extracellular environment. The studies carried out on the relationship between the synthesis and the transport of this phospholipid to the cellular surface, have demonstrated that there may be two different origins : vesicular, through the endoplasmic reticulum-Golgi apparatus pathway, and locally, by synthesis activity on the plasma membrane. Very long chain fatty acid species are sorted and directed in priority towards the secretion pathway. They are synthetized in the endoplasmic reticulum by a Base exchange activity, but also at the cellular surface with the same enzyme activity. In order to characterise vesicles which are rich in phosphatidylserine, formed and isolated from the endoplasmic reticulum in an cell-free system, studies have been carried out on the research of cDNA coding for proteins which are potentially members of Ykt6p SNAREs. In animals and yeast cells, this family is involved in the specific targeting of vesicles which come from the endoplasmic reticulum and which are to be used in the Golgi apparatus
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Richer-Potier, Carole. „Identification de signaux impliqués dans la rétention d'une protéine membranaire de type I : la calnexine, dans le réticulum endoplasmique (RE) de la cellule végétale“. Rouen, 2000. http://www.theses.fr/2000ROUES054.
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Dans les systèmes d'expression eucaryotes, les protéines destinées à être sécrétées sont introduites dans le système endomembranaire de sécrétion via le réticulum endoplasmique (RE). Ces protéines sont ensuite transportées par des vésicules jusqu'à leur compartiment de stockage : vacuole et compartiment extracellulaire en passant par l'appareil de Golgi. Dès leur insertion dans la lumière du RE, ces protéines vont subir des maturations post-traductionnelles qui leur confèreront stabilité et activité biologique. Les protéines responsables de ces maturations doivent posséder des signaux peptidiques spécifiques de rétention pour échapper au flux de sécrétion. Les mécanismes de localisation des protéines solubles et membranaires dans le RE ont été très étudiés dans les cellules animales et de levure mais peu d'informations sont disponibles chez les plantes. Au cours de cette étude, la calnexine d'A. Thaliana a été choisie comme protéine modèle pour identifier les signaux impliqués dans la rétention d'une protéine membranaire de type I dans le RE de cellules végétales. Des protéines chimères contenant les domaines transmembranaire et/ou cytosolique de la calnexine d'A. Thaliana fusionnés à une protéine marqueur extracellulaire, la prosporamine, ont été réalisées. Ces protéines chimères ont été exprimées dans des cellules de tabac BY2 via Agrobacterium tumefaciens et leur localisation a été étudiée. Nous avons mis en évidence que le segment transmembranaire de la calnexine d'A. Thaliana permet la rétention d'une protéine marqueur dans le RE de cellules de tabac. Toutefois, nous avons observé que, quand ce segment transmembranaire est remplacé par celui d'une protéine vacuolaire, l'extrémité cytosolique de la calnexine est également impliquée dans la rétention de la protéine marqueur dans le RE.
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Castro, Cruz Monica del Carmen. „The impact of the syndecan-PDZ interactome on endosomal trafficking and extracellular vesicle composition“. Thesis, Aix-Marseille, 2018. http://www.theses.fr/2018AIXM0302.
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Les syndécans forment une famille de quatre protéines transmembranaires qui sont substituées par l'héparane sulfate. Grâce à ces chaînes glucidiques extracellulaires, les syndécans contrôlent la signalisation d'une pléthore de facteurs de croissance et de molécules d'adhésion. Une autre caractéristique remarquable des syndécans est la conservation de leur domaine intracellulaire au cours de l'évolution. Ce domaine contient un motif C-terminal qui peut induire une interaction avec les protéines dites «PDZ». Les interactions PDZ sont promiscues et les protéines PDZ contrôlent divers aspects de la signalisation cellulaire et de la communication cellule-cellule. Quatre interactions syndecan-PDZ ont été décrites à ce jour et toutes ces interactions ont des effets drastiques sur le comportement des cellules. En particulier, il a été documenté que l'interaction syndécan-synténine a un impact sur le trafic intracellulaire de molécules de signalisation liant l’héparan sulfate. De plus, les syndécans et la synténine coopèrent dans le contrôle la biogenèse des exosomes, organites extracellulaires fonctionnant comme des médiateurs importants de la communication cellule-cellule (y compris dans différentes maladies systémiques comme le cancer). Le protéome humain compte 150 protéines PDZ qui contiennent 266 domaines PDZ. Dans ce travail, nous avons mis à jour la complexité de l'interactome syndecan-PDZ et testé son impact sur le trafic membranaire et sur la composition des vésicules extracellulaires. Notre travail ouvre la voie à une meilleure compréhension des réseaux moléculaires contrôlant la communication cellule-cellule en physio-pathologieSyndecans form a family of four transmembrane proteins that are substituted with heparan sulfate. By virtue of these extracellular carbohydrate chains, syndecans control the signaling of a plethora of growth factors and adhesion molecules. Another remarkable feature of syndecans is the conservation of their intracellular domain through evolution. This domain contains a C-terminal motif that can mediate interaction with PDZ proteins. PDZ interactions are promiscuous and PDZ proteins control various aspects of cell signaling and cell-cell communication. Four syndecan-PDZ interactions have been described so far and all these interactions have broad effects on cell behavior. In particular, it was documented that syndecan-syntenin interaction has impact on the intracellular trafficking of heparan sulfate cargo. Moreover syndecan-syntenin controls the biogenesis of exosomes, extracellular organelles emerging as important mediators of cell-cell communication in health and diseases. The human proteome contains 150 PDZ proteins and 266 PDZ domains. Here we started addressing the complexity of the syndecan-PDZ interactome and tested for its impact on membrane trafficking and on the composition of extracellular vesicles. Our work paves the way for a better understanding of the molecular mechanisms and networks controlling cell-cell communication in health and disease
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Dalkara, Deniz. „Transfert intracellulaire de protéines“. Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008), 2006. http://www.theses.fr/2006STR13021.
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Les travaux réalisés au cours de cette thèse ont consisté à mettre au point des méthodes efficaces de transfert de protéines dans le cytoplasme des cellules mammifères. Pour cela, nous avons utilisé des formulations lipides cationiques – protéines, puis étudié l’inter-nalisation de ces complexes dans des cellules. La plupart des approches permettant l'expression spécifique d’une protéine sont fondées sur la vectorisation du gène codant pour cette protéine dans le noyau des cellules. En considérant que le but du transfert de gène est la production de protéines et que les vecteurs synthétiques sont capables d’effectuer efficacement un transfert de macromolécules dans le cytoplasme, nous avons étudié le transfert de protéines par ces mêmes vecteurs. Nous avons donc dans un premier temps étudié le transfert intracellulaire de protéines avec un lipide cationique, le dioctadécylamidoglycyl-spermine ou DOGS. Nous avons étudié l’interaction du DOGS avec l’albumine sérique, et ensuite déterminé les différents paramètres impliqués dans l’obtention de complexes internalisables dans les cellules. Nous avons appliqué cette stratégie pour transférer d’autres protéines avec des propriétés physico-chimiques différentes, et ainsi mieux analyser la contribution de chaque paramètre au processus de complexation et de vectorisation par le DOGS. Nous avons réussi à transférer avec grande efficacité une large variété de protéines anioniques comme des anticorps monoclonaux, une enzyme et une phycobiliprotéine. Au cours de cette thèse, nous avons donc développé une stratégie originale de transfert intracellulaire de protéines, qui devrait nous permettre de transférer in vitro, dans des cellules animales, une large variété de protéines à but thérapeutique ou fonctionnelDuring this thesis we have developped an efficient method for intracytoplasmic protein delivery into mammalian cells. This method employs cationic lipids, previously used in gene delivery, to complex proteins and to transport them into the cytoplasm of cells in culture. In the last decade, the most commonly used approach for protein expression has been the transfection of its gene. Considering that the aim of transfection is to produce proteins and that synthetic vectors are capable of efficient gene delivery to mammalian cells ; we studied direct intracellular protein delivery using these carriers. The direct delivery of functionally active proteins can be helpful in overcoming some bottlenecks of transfection mediated protein production. We thus initiated studying intracellular protein delivery using the cationic lipid DOGS. We studied the interaction of the cationic lipid with bovine serum albumin and determined the different parameters involved in creating complexes that are well internalised by cells. We applied the notions acquired during the intracellular delivery of this model protein to a variety of other proteins with different physico-chemical properties in order to apprehend the contribution of these properties to the processus of complexation and vectorisation by DOGS. We successfully delivered a variety of proteins such as monoclonal antibodies, an enzyme, and a phycobilliprotein into different mammalian cell lines. Furthermore, we demonstrated that the antibodies delivered using this method retain their ability to bind their antigens once they reach the cytoplasm. From this point of view, intracellular protein delivery with cationic lipids can be considered another way to interfere with cellular activities. During this thesis, we have thus developped an original strategy for the intracellular delivery of proteins which will allow us to deliver, in vivo, a large variety of proteins for therapeutic purposes or functional studies
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Sloves, Pierre-Julien. „La sortiline et les voies endosomales apparentées sont les éléments clefs pour la biogenèse des organites apicaux et la virulence chez Toxoplasma gondii“. Thesis, Lille 2, 2012. http://www.theses.fr/2012LIL2S020/document.
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Toxoplasma gondii, l'agent de la toxoplasmose, représente un modèle appartenant aux parasites Apicomplexa, phylum dans lequel on retrouve Plasmodium falciparum, l'agent causal du paludisme, et de nombreux agents opportunistes dangereux. Les parasites de ce phylum possèdent la même organisation avec des organites situés à l'apex, spécialisés dans l'interaction hôte-pathogène et qui sont cruciaux pour permettre l'infection de l'hôte: les rhoptries et micronèmes. Les protéines contenues dans ces organites sécrétoires sont acheminées via le système de type endolysosomal. Toutefois, les récepteurs qui jouent un rôle clé dans le tri des protéines et la biogenèse des organites apicaux restaient à identifier. La sortiline est un récepteur transmembranaire de type I, plus connu chez l'Homme dans le tri, le transport des protéines et ses rôles dans la maladie de Parkinson, d'Alzheimer ou du diabète ont largement été décrits. Nous avons déterminé que l'homologue de la sortiline chez Toxoplasma TgSORTLR pour «Toxoplasma gondii Sortiline Like Receptor» est localisé au niveau de l'appareil de Golgi et du réseau post-Golgien. TgSORTLR se lie spécifiquement aux protéines de rhoptries et de micronèmes à l’aide du domaine N-terminus, probablement au niveau de l'appareil de Golgi. Nous avons montré que le domaine C-terminus est déterminant pour la localisation de TgSORTLR et que l'expression d'une version tronquée de la protéine dépourvue du domaine C-terminus induit la complète délocalisation des protéines de rhoptries et de micronèmes. Nous avons également identifié les protéines cytosoliques qui interagissent avec le domaine C-terminus de TgSORTLR et démontré que ces protéines cytoplasmiques sont pour la plupart connues pour leurs rôles importants dans le transport antérograde ou rétrograde des vésicules du trafic intracellulaire. L’absence de TgSORTLR obtenue grâce à une stratégie de «knock-out » conditionnel entraîne non seulement une totale délocalisation des protéines de rhoptries et de micronèmes mais aussi à une disparition des organites apicaux, ce qui conduit à la forte atténuation de la virulence du parasite chez la souris et surtout à l'absence complète de symptômes toxoplasmiques. Des expériences de complémentations réalisées dans la souche dépourvue de TgSORTLR ont montré que l’extrémité N-terminus (acides aminés 39 à 202) de TgSORTLR est également nécessaire pour sa localisation correcte et pour ses fonctions de récepteur intracellulaire chez T. gondii. Enfin, nous avons caractérisé, par des techniques de « knock in » ou remplacement du gène endogène par une copie étiqueté avec l’épitope HA, puis montré que des protéines homologues de μ1-adaptine, Sec23, Vps9, Vps26 et Vps35 de T. gondii co-localisent et se fixent spécifiquement à TgSORTLR. Ces résultats récents confirment que l'extrémité C- terminus et cytoplasmique du récepteur TgSORTLR se comporte d'une manière similaire aux sortilines des cellules de mammifère. L’étude de ces partenaires de TgSORTLR nous permet de mieux comprendre le trafic de TgSORTLR, de reconstituer en partie le système endolysosomal et son rôle dans le transport et la biogenèse des organites vitaux de T. gondiiToxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis belongs to the phylum named Apicomplexa that also contains Plasmodium falciparum, the causative agent of malaria and others parasites such as Cryptosporidium or Eimeria. Apicomplexan parasites are uniquely characterized by specific organelles, rhoptries and micronemes, which are located at the apical end of the parasite. These organelles are involved in the control of host-pathogen interactions. The proteins in these secretory organelles are trafficked through the endolysosomal system. However, the receptors that play key roles in protein sorting and biogenesis of these apical organelles remain to be identified. Sortilin is a type I transmembrane receptor known in humans for protein sorting and trafficking. Here, we report that the homologue of sortilin in T. gondii designated TgSORTLR for “Toxoplasma gondii SORTilin Like Receptor” is localized to Golgi and post-Golgi compartments and transports proteins into rhoptries and micronemes via their specific interactions with its luminal domain. We demonstrate that the C-terminus of TgSORTLR is also important for its subcellular localization through binding to cytosolic components of vesicular trafficking proteins known to be involved in anterograde and retrograde transports. The depletion of TgSORTLR using conditional knock-out strategy causes a complete rmis-localization of proteins of both rhoptries and micronemes, leading to the loss of these apical organelles. These mutants display a strong attenuation of the parasite virulence in mice with the absence of acute toxoplasmosis symptoms. Complementation of the strain lacking TgSORTLR showed that N-terminal region between 39-202 amino acids indicated that the N-terminus, similarly to the C-terminus is essential for its correct localization. We conclude that the full-length TgSORTLR protein is required for its biological functions as intracellular sorting receptor in T. gondii
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Elias, Emmanuel. „Dynamique intracellulaire des protéines nucléolaires“. Reims, 2005. http://www.theses.fr/2005REIMM203.
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Le nucléole est le site de synthèse et de maturation des ARNs ribosomiques. Chez l'homme, les gènes d'ADNr sont répétés et leur transcription est assurée par l'ARN polymérase I, associée à plusieurs facteurs de transcription. Le facteur UBF est présent sous la forme de deux variants, UBF1 et UBF2, produits par épissage alternatif d'un même ARNm. Il est connu que l'inhibition de la synthèse des ARNr par les médicaments anticancéreux comme l'actinomycine D (AMD) se traduit par une importante réorganisation structurale du nucléole. L'objectif du présent travail a été dans un premier temps d'étudier l'organisation des protéines nucléolaires UBF1, UBF2, PAF53, Topo I, fibrillarine, nucléoline et B23 en utilisant des protéines de fusion associées à la GFP. Les résultats obtenus pour les cellules contrôles ont été comparés à ceux obtenus pour des cellules traitées pendant 2 h par 50 ng/ml d'AMD, une concentration inhibant sélectivement l'ARN polymérase I. Le devenir spatio-temporel des chimères GFP-UBF1, UBF2 et fibrillarine a ensuite été étudié grâce à l'utilisation de logiciels (3D + temps), dans des cellules vivantes soumises à l'action de l'AMD. Cette étude révèle un comportement similaire des deux variants d'UBF. Sous l'effet du traitement, les entités marquées se regroupent en un nombre restreint de masses qui se délocalisent à la périphérie nucléolaire. La réorganisation de fibrillarine aboutit également à la formation de coiffes périnucléolaires mais la phase de regroupement des amas, observée également pour UBF, est précédée d'une phase de concentration du marquage. Par ailleurs, les sites contenant les chimères GFP ont été identifiés en microscopie électroniqueThe nucleolus is the site where synthesis and maturation of ribosomal RNAs occur. The tandemly repeated rDNA genes are transcribed by RNA polymerase I associated to several transcription factors. Among them, the Upstream Binding Factor (UBF) is expressed from a unique gene by alternative splicing as two isoforms, UBF1 and UBF2. In order to visualize both variants, which are not discriminated by specific anti-UBF antibodies, we previously developed chimeric proteins between UBF1/UBF2 and GFP. Moreover, it is well-known that inhibition of RNA polymerase I by actinomycin D (AMD) (50 ng/ ml) induces a complex segregation of the nucleolar components as observed on cells fixed. In the present work, we addressed the 3D localisation of nucleolar proteins UBF1, UBF2, PAF53, Topoisomerase I, Fibrillarin, Nucleolin and B23 by confocal microscopy within fixed control KB cells and during the action of AMD. Furthermore, we followed the localisation of UBF1, UBF2 and Fibrillarin within living KB cells during the action of AMD. In order to study the complex 3D trajectories of the components containing GFP-UBF and GFP-fibrillarin during the nucleolar segregation, we used both classical visualization tools using (2D + time) modes and developed tools based on (3D + time) visualization procedure. Under action of AMD, the spots labelled by UBF aggregate and form caps localised at the nucleolar periphery. For fibrillarin, the rings observed in control cells evolved into spots under the treatment. Finally, these spots merged to form caps also localized at the nucleolar periphery. This study revealed a different kind of reorganization for both variants of UBF and Fibrillarin upon treatment
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Cavelier, Adeline. „Complementarité des protéines de detoxication et trafic intracellulaire“. Phd thesis, Université René Descartes - Paris V, 2007. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00553511.
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La coopération fonctionnelle entre le cytochrome P450 3A (CYP3A) et la P-glycoprotéine (P-gp) décrite dans la littérature est un facteur déterminant contribuant à la variabilité de la biodisponibilité de la plupart des médicaments administrés per os. Le CYP3A et la P-gp sont des protéines membranaires dont les localisations respectives communément attribuées sont la membrane du réticulum endoplasmique pour le CYP3A et la membrane plasmique pour la P-gp. Le but de notre étude était une description intégrée au niveau cellulaire du fonctionnement de ces protéines membranaires de détoxication des médicaments et de leurs métabolites, grâce à la détermination de la localisation cellulaire de ces protéines par immunomarquage et par suivi fonctionnel de composés fluorescents, à l'aide de techniques de microscopie à épifluorescence. Le matériel utilisé comprenait des coupes de foie de rat et humain, des hépatocytes en culture primaire ou des lignées cellulaires de fibroblastes de Hamster chinois D/ADX surexprimant la P-gp. Nous avons ainsi démontré que le CYP3A se localise exclusivement au niveau du réticulum endoplasmique, alors que la P-gp est retrouvée au pôle apical des hépatocytes, au niveau des canalicules biliaires et sur la membrane plasmique des fibroblastes. Une colocalisation membranaire des composés et enzymes, synonyme d'une grande efficacité de détoxication, n'a pas été mise en évidence dans les hépatocytes, à cause de difficultés techniques et d'une trop faible fluorescence des substrats utilisés.
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Charlier, Caroline. „Analyse du transport intracellulaire du bornavirus“. Toulouse 3, 2013. http://thesesups.ups-tlse.fr/2208/.
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Le Bornavirus (BDV) est un virus neurotrope qui persiste dans le système nerveux central. Son cycle viral est mal caractérisé, en particulier en ce qui concerne les modalités du transport intracellulaire des complexes de réplication viraux (RNP). Afin de visualiser le transport des RNP, nous avons construit un virus recombinant pouvant être marqué de façon fluorescente. L'observation de ce virus par différentes techniques d'imagerie en temps réel nous a permis d'étudier la dynamique des RNP durant les phases précoces de l'infection, ainsi que dans des cellules infectées de façon persistante. Nous avons ensuite étudié les modalités du transport du BDV dans les neurones et nous avons montré que les RNP étaient transportées par les endosomes axonaux. Ces résultats ouvrent de nouvelles perspectives pour une meilleure caractérisation de la biologie du BDVBorna disease virus (BDV) is a neurotropic virus that establishes long-term persistence in the central nervous system. The cellular cycle of BDV remains poorly understood, in particular concerning the modalities of intracellular transport of viral ribonucleoparticles (RNP). During my Ph. D. , I developed several approaches aiming at a better understanding of the modalities of BDV transport. To track RNP transport in live, infected cells, we constructed a recombinant virus that can be fluorescently labeled. We analyzed viral dynamics in persistently and newly infected cells using live imaging. We also studied the molecular mechanisms of BDV transport in primary cultures of neurons and we demonstrated that RNP are transported by axonal endosomes
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Nizak, Clément. „Développement d'outils pour l'étude de la dynamique de l'appareil de Golgi en interphase et en mitose“. Phd thesis, Université Paris-Diderot - Paris VII, 2003. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00190898.
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L'appareil de Golgi est un organite central du réseau des voies de transport intracellulaire des cellules eucaryotes. L'étude de son fonctionnement dynamique complexe nécessite le développement de nouveaux outils. J'ai donc suivi plusieurs stratégies en parallèle pour proposer de nouvelles approches d'étude de l'appareil de Golgi. Tout d'abord, j'ai utilisé la technique d'Interférence ARN, qui permet d'inhiber l'expression d'une protéine d'intérêt, et ainsi révélé la complexité de la régulation du transport golgien par la GTPase Rab6.
Ensuite, j'ai suivi une stratégie reposant sur l'imagerie in vivo du désassemblage et du réassemblage de l'appareil de Golgi au cours de la mitose, et ainsi mis en évidence une étape particulière du désassemblage golgien.
Enfin, le cœur de ma thèse a consisté en la production d'anticorps recombinants dirigés contre des protéines golgiennes par Phage Display, et le développement de leur utilisation pour tracer le comportement des protéines-cibles in vivo.
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Molla, Herman Anahi. „Trafic intracellulaire et ciliogénèse“. Paris 5, 2009. http://www.theses.fr/2009PA05T020.
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Le cil primaire (CP) est présent dans presque la totalité de cellules des vertébrés, et des défauts de son assemblage/fonctionnement sont associés à des nombreuses ciliopathies. Le CP semble fonctionner comme une antenne mécanosensorielle dû à la présence de récepteurs dans la membrane ciliaire, comme les récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs). Les beta-arrestines (βarrs) 1 et 2 sont connues pour réguler les RCPGs membranaires, ce qui suggère qu'elles pourraient également réguler les RCPGs ciliaires. Nous avons observé que la parr2 est localisée au cil primaire de façon spécifique et qu'elle interagit avec Kif3A et 14-3-3, deux protéines importantes pour la ciliogenèse, suggérant un possible rôle directe sur la formation du cil. En effet, la parr2 joue un rôle sur la ciliogenèse, cependant, ceci semble être indirecte car son absence entraîne une surproliferation cellulaire, empêchant la formation du cil. Nous avons constaté que le cil est invaginé dans une poche ciliaire qui peut être transitoire ou permanente selon le type cellulaire d'où bourgeonnent de puits couverts de clathrine, ce qui nous a invité à étudier le rôle de complexes adaptateurs (AP) dans la ciliogenèse, observant que AP1 serait important pour la morphologie/orientation du cil. Ainsi, il est possible d'imaginer que cette poche ciliaire serve de plateforme d'arrimage de vésicules provenant du Golgi ainsi que pour de processus d'endocytose qui pourraient réguler des composant ciliairesThe primary cilium (PC) is present in almost all vertebrate cells and defects in its assembly/function are associated with a huge number of ciliopathies. PC seems to function as a mecanosensory antenna since is enriched in receptors, like the G-protein coupled receptors (RCPGs). Beta-arrestines (βarrs) 1 and 2 regulate GPCR at the cell membrane, suggesting that they could also play a role in cilia-associated GPCRs. We found that βarr2 is specifically localised to PC and that it interacts with Kif3A and 14-3-3, two proteins involved in ciliogenesis, suggesting a possible function of βarr2 in ciliogenesis. Indeed, βarr2 absence impedes PC formation. Nevertheless, this seems to be an indirect effect due to the fact that the absence of βarr2 leads to a cell over proliferation, preventing cilia formation. We also observed that PC is invaginated in what we call the ciliary pocket, which can be transitory or permanent, depending on the cell type, from which clathrin coated pits bud forming clathrine coated vesicles. This led us to study the role of clathrin adaptor complexes (AP) in ciliogenesis, and we could observe that API would be important for the morphology/orientation of PC. Thus, it is possible to imagine that the ciliary pocket serves as a membrane platteform for the docking of Golgi-coming vesicles or for endocytic process which could control ciliary components
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Dürrbach, Antoine. „Role des myosines 1 dans le transport intracellulaire“. Paris 6, 1997. http://www.theses.fr/1997PA066070.
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L'endocytose est une etape essentielle de la vie cellulaire impliquee dans l'homeostasie de l'individu, la maturation des antigenes au cours de la reponse immunitaire, la degradation et la regulation de signaux transmis au niveau de la membrane plasmique par des ligands extracellulairs. Au cours de l'endocytose dependant de recepteurs, les molecules extra-cellulaires sont internalisees dans les endosomes puis sont ensuite dirigees vers le compartiment de degradation, ou recyclees a la membrane plasmique. Ces differentes etapes necessitent des modifications dynamiques des membranes cellulaires aboutissant a la formation de compartiments d'endocytose de morphologie variee. Les filaments d'actine forment un reseau tres dynamique qui sous-tend la membrane plasmique. Le lien etroit entre les filaments d'actine et la membrane plasmique suggere qu'ils puissent participer aux modifications dynamiques des membranes cellulaires telles qu'on les observe au cours de l'endocytose et dans l'organisation du domaine apical des cellules epitheliales polarisees. Le but de ce travail a ete de preciser le role du cytosquelette d'actine au cours de l'endocytose dependant de recepteurs et d'etudier le role de mecano-enzyme associe a l'actine, les myosines i dans ce transport intracellulaire. Pour determiner les differentes etapes de l'endocytose impliquant l'organisation dynamique des microfilaments, les cellules ont ete incubees en presence d'un agent desorganisant les microfilaments (la cytochalasine d). Les cinetiques d'entree, de recyclage et de degradation des ligands ont ete determinees dans les cellules traitees ou non en presence de cytochalasine d. Nous avons observe que les microfilaments d'actine sont impliques dans deux etapes de l'endocytose dependant de recepteurs : l'internalisation de ligands au niveau de la membrane plasmique et egalement le transfert de ligands du compartiment d'endocytose tardif vers les lysosomes (j. Cell sciences, 1996, 457-465). Nous avons determine si des mecano-enzymes, les myosines i, interagissant avec les microfilaments et les membranes cellulaires pouvaient egalement etre impliquees dans certaines de ces etapes en produisant dans des lignees stables d'hepatomes en culture et dans les cellules epitheliales polarizees caco-2, la myosine i de la bordure en brosse, et differentes formes tronquees de cette proteine. Les resultats obtenus dans les cellules non polarisees (hepatomes) suggerent que la myosine i de la bordure en brosse est impliquee dans la regulation du transport membranaire des endosomes vers les lysosomes (proc. Natl. Acad. Usa. 1996, 93, 7053-7058). Dans les cellules epitheliales polarisees de l'intestin, il a ete propose que la myosine i de la bordure en brosse participe a l'organisation structurale de la bordure en brosse et au transport de proteines de l'appareil de golgi vers le domaine apical de ces cellules. En produisant la myosine i de la bordure en brosse et differentes formes tronquees de cette proteines dans les cellules epitheliales caco-2, nous avons observe qu'elle n'etait pas impliquee dans ces fonctions mais qu'elle participait a l'organisation des compartiments d'endocytose et de degradation. Les resultats de ce travail suggerent que les filaments d'actine et des mecano-enzymes associes a l'actine, les myosines i regulent differentes etapes du transport le long de la voie d'endocytose dans differents types cellulaires.
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Cosson, Pierre. „Mécanismes de formation de vésicules de transport intracellulaire“. Aix-Marseille 2, 1989. http://www.theses.fr/1989AIX22070.
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L'acheminement de constituants membranaires entre divers compartiments membranaires necessite la formation incessante de vesicules de transport intracellulaire ayant une composition specifique. Nous avons montre qu'un ph intracellulaire acide inhibe de facon reversible plusieurs etapes de transport le long des voies d'endocytose et d'exocytose. Pour etudier plus precisement la polymerisation du manteau cytoplasmique de clathrine, qui accompagne la formation de vesicules mantelees, nous avons utilise comme traceur des molecules de clathrine fluorescentes, microinjectees dans des cellules vivantes. Par microphotolyse laser, nous montrons que diverses conditions de blocage du trafic membranaire stabilisent les assemblages de clathrine mais modifient de facon variable la quantite de clathrine libre. En fabriquant des mutants des domaines cytoplasmiques des molecules de classe ii ,du complexe majeur d'histocompatibilite, nous esperons supprimer les sites d'interaction de ces molecules avec les constituants du manteau et modifier leur transport intracellulaire. L'analyse de ces mutants doit nous permettre de determiner le role de diverses etapes de transport intracellulaire dans le phenomene de presentation antigenique
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Mamane, Alexandre. „Transport intracellulaire par des moteurs moléculaires : étude théorique“. Thesis, Paris 6, 2015. http://www.theses.fr/2015PA066728/document.
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Nous étudions deux phénomènes de transport actif dans la cellule. Cette activité est induite par des moteurs moléculaires. Leur fonctionnement général est compris, mais leurs interactions et fonctions spécifiques font émerger de nouveaux comportements.En première partie nous étudions l'extraction de tubes membranaires par la myosine 1b sur un faisceau d'actine. Ce moteur est non processif, renforcé par la force. Il est impliqué dans une voie de transport membranaire au niveau de l'appareil de Golgi. Nous modélisons ce phénomène. Nous montrons que le renforcement par la force induit l'apparition d'un régime d'extraction par fluctuation géante, et abaisse le nombre de moteurs requis pour l'extraction. Les tubes extraits par des moteurs non processifs ne présentent pas de régime oscillatoire. La croissance du tube peut s'accompagner d'une déplétion avec des moteurs non processifs. Nos prédictions sont en bon accord avec les observations expérimentales.En deuxième partie, nous étudions l'écoulement cytoplasmique dans l'embryon de C.elegans. Sa fonction supposée est le mélange du cytoplasme. Son orientation se renverse aléatoirement. Son mouvement est supporté par des microtubules et des kinésines entrainant le reticulum endoplasmique au niveau cortical. Nous modélisons ce phénomène et montrons que la transition vers l'écoulement est une brisure spontanée de symétrie. Nos prédictions sont en bon accord avec les observations expérimentales. Le point de fonctionnement du système optimise les fluctuations, ce pourrait être le mécanisme du mélange. Nos prédictions sont en bon accord avec les observations expérimentalesWe study two intracellular transport phenomena. They are powered by molecular motors. Motors general mechanisms are understood, but their interactions leads to emerging properties, and some of them have specialised functions.In the first part, we study the extraction of membrane tubes by myosin 1b supported by actin bundles. Myosin 1b is a non processive motor with catch bond property. It is implied in membrane trafficking at the Golgi apparatus level. We model this phenomenon in the frame of a collaboration with experimentalists. We show that catch bond effect induces a regime where tube extraction requires a giant length fluctuation, and the minimal number of motors allowing extraction is decreased. Tubes extracted by non processive motors do not show oscillatory regime. During tube growth motors can deplete with non processive motors. Our predictions are in good agreement with experimental observations.In the second part we study in collaboration with experimentalists the cytoplasmic streaming in C.elegans. Its function is supposed to be the mixing the cytoplasm. Its orientation reverses stochastically. Its movement is supported by microtubules and kinesins, that drive the endoplasmic reticulum at the cortical level. We model this phenomenon and show that the transition toward streaming is a spontaneous spatial symetry breaking. Our predictions are in good agreement with the experimental observations. The parameters values of the system optimize flow fluctuations, this could be the mechanism driving the mixing. Our predictions are in good agreement with experimental observations
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Baratti-Elbaz, Catherine. „Internalisation et recyclage du récepteur de la TSH“. Paris 11, 2000. http://www.theses.fr/2000PA11T058.
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Le récepteur TSH est un récepteur couplé aux protéines G présentant des spécificités par rapport aux récepteurs homologues de la lutropine (LH) et folliculostimuline (FSH): (i) son volumineux domaine extracellulaire clivé en deux sous-unités (ii) son activité constitutive (iii) l'existence d'auto-anticorps stimulants dirigés contre le récepteur et impliqués dans l'hyperthyroïdisme. Le trafic intracellulaire du TSHR n'était pas documenté. Des lignées permanentes de cellules L exprimant ce récepteur ainsi que des anticorps monoclonaux dirigés contre le récepteur permettent d'étudier sa distribution et son endocytose en microscopie confocale et électronique. Le TSHR est initialement présent sur la membrane plasmique au sens strict et les puits recouverts de clathrine, au niveau desquels il est internalisé. L'internalisation constitutive représente 10% des récepteurs présents à la surface. L'hormone n'augmente que d'un facteur 3 cette endocytose. La majorité du récepteur internalisé est recyclé via des vésicules lisses alors que l'hormone est dégradée dans les lysosomes. Le recyclage est inhibé par la monensine et emprunte une voie indépendante de la cavéoline-1. Les études de microscopie conduites sur les thyrocytes humains en culture primaire montrent une polarisation baso-latérale du récepteur et une voie d'endocytose similaire. Le récepteur LH est lui internalisé massivement puis dégradé dans les lysosomes. Les essais de colocalisation avec le récepteur transferrine démontrent que les récepteurs homologues LH et TSH suivent un trafic intracellulaire différent dans le même système d'expression cellulaire. L'utilisation de récepteurs chimères des TSHR et LHR prouvent que les domaines transmembranaires et intracellulaires contiennent les informations responsables de l'orientation vers la voie de recyclage versus celle de dégradation. Le domaine extracellulaire semble conditionner le taux d'internalisation. La détermination des séquences impliquées est en coursThe TSH receptor is a G protein coupled receptor, with specific characteristics from the two high homologous lutropin (LH) and folliculostimulin (FSH) receptors (i) its large extracellular domain which is cleaved in two subunits (ii) its constitutive activity towards the cAMP transduction pathway and (iii) the existence of stimulating anti-receptor autoantibody implicated in hyperthyroïdism. Seant information is available on the intracellular trafficking of this receptor. Stahly transfected L cells expressing TSH receptor and anti-receptor antibodies were used to study by confocal and electron microscopies its cellular distribution and endocytosis. The TSH receptor was initially localized on the plasmalemma proper and in clathrin-coated pits. Lt was internalized through clathrin-coated vesicles. Constitutive endocytosis represented 10% of cell surface receptor molecules. Endocytosis was increased only 3 fold by the hormone. The majority of internalized receptor recycled to cell surface via smooth vesicles whereas hormone was degraded in lysosomes. This recycling was inhibited by administration of monensin and occurred via a caveolin-1 independent pathway. Microscopic studies repeated in primary cultures of human thyroid cells showed a baso-lateral distribution and a very similar endocytosis pathway. The LH receptor is endocytosed in high proportion and degraded in lysosomes. Colocalization studies with transferrin receptor confirmed that highly homologous LH and TSH receptors exhibit, when expressed in the same cells, very different cellular trafficking properties. The use of LHITSH receptor chimeras showed that transmembrane and intracellular domains contain information orienting the protein toward recycling or degradative pathways. The extracellular domain seems to play a role in the extent of internalization. These observations should now allow the determination of the molecular signals involved in these processes
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Kuster, Aurélia. „SNARE et trafic membranaire intracellulaire : rôle de SNAP-47 nouveau partenaire des SNARE vésiculaires“. Paris 7, 2013. http://www.theses.fr/2013PA077165.
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Le trafic vésiculaire permet le transport des protéines et des lipides entre les compartiments intracellulaires. Les v-SNARE, à la membrane des vésicules et les t-SNARE, à la membrane des compartiments cibles, interagissent via leurs domaines SNARE, et forment un complexe permettant la fusion membranaire. TI-VAMPNAMP7 est un v-SNARE présent au niveau de l'appareil de Golgi, des endosomes tardifs et des lysosomes, qui intervient dans le transport apical, la croissance neuritique et la migration cellulaire. Nous avons montré d'une part que TI-VAMP est phosphorylée par c¬Src et qu'un mutant phospho-mimétique active son exocytose. D'autre part, par une approche protéomique, nous avons mis en évidence une interaction entre TI-VAMP et le t-SNARE SNAP-47. Nous avons montré que SNAP-47 interagit aussi avec VAMP4 et VAMP8, et présente une localisation périnucléaire, proche du réticulum endoplasmique et de l'ERGIC. Un mutant délété de son domaine carboxy-terminal, que nous avons généré, interagit toujours avec les v¬SNARE VAMP4,7, et 8 et affecte la distribution des VAMP4 et 7, suggérant un rôle de SNAP-47 dans leur localisation subcellulaire. Par ailleurs, ce mutant est partiellement délocalisé au noyau. SNAP-47 possède des signaux de localisation et d'export nucléaire et un traitement des cellules à la leptomycine B induit la relocalisation de la protéine sauvage au noyau, suggérant un transit entre noyau et cytoplasme. SNAP-47 apparaît donc différente des t-SNARE classiques et pourrait intervenir dans d'autres mécanismes, que la fusion membranaire. Nous suggérons que SNAP-47 pourrait notamment jouer un rôle de chaperonne en régulant la localisation des v-SNARE partenairesVesicular trafficking allows for protein and lipid transport between intracellular compartments. V-SNAREs, present at the vesicular membrane, and t-SNAREs, present at the target membrane, interact via their SNARE domains, and form a complex that allows membrane fusion. TI-VAMPNAMP7 is a v-SNARE localized in the Golgi apparatus, late endosomes and lysosomes, which plays a role in apical transport, neurite growth and cell migration. First, we showed that TI-VAMP is phosphorylated by c-src and that a phosphomimetic mutant activates its exocytosis. Secondly, by a proteomics approach, we found that TI-VAMP interacts with the t-SNARE SNAP-47. We highlighted that SNAP-47 interacts also with VAMP4 and VAMP8, and has a perinuclear localization, closed to the endoplasmic reticulum and the ERGIC. A carboxy-terminal domain deleted mutant still interacts with VAMPs 4, 7 and 8 and affects VAMPs 4 and 7 distribution, suggesting a role of SNAP-47 in the v-SNAREs' subcellular localization. Moreover, SNAP-47 mutant is partially delocalized to the nucleus. SNAP-47 possesses nuclear localization and export signais, and cell treatment with leptomycine B induces relocalization of the WT protein in the nucleus, suggesting a transit between nucleus and cytoplasm. Thus, SNAP-47 appears different from classical t-SNAREs and could potentially have a fonction in other mechanisms than membrane fusion. We suggest that SNAP-47 could play a role of chaperone by regulating its v-SNARE partners'localization
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Bastin, Guillaume. „Les résidus cystéines en positions 2 et 12 de RGS4 influencent son trafic intracellulaire et ses fonctions“. Thesis, Lille 1, 2013. http://www.theses.fr/2013LIL10003/document.
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Les protéines RGS (Regulator of G-protein Signaling) sont des inhibiteurs des voies de signalisation des protéines G. RGS4 atténue l’activité de protéines G dans plusieurs tissus tel que la diminution de son activité peut accroître la sévérité de la bradycardie, cardiomyopathies liées au diabète, l’invasion de cellule cancéreuse du sein, résistance à l’insuline et intolérance au glucose. RGS4 a été localisé à la membrane plasmique ainsi que dans des compartiments intracellulaires, cependant, son mode de trafique intracellulaire reste méconnu. En utilisant des outils de microscopie confocale sur cellules vivantes et méthode de détection d’activité des voies de signalisation conditionnée par les protéines G, nous avons caractérisé l’importance de deux sites de palmitoylation, ces deux sites : Cys2 et Cys12 montrent des intérêts complémentaires dans le trafic de RGS4 vers la membrane cellulaire. Dans un axe linéaire, nous avons identifié DHHC3 et 7, deux enzymes de palmitoylation participant au trafique intracellulaire de RGS4 et donc à la maximalisation de son activité inhibitrice des voies de signalisation contrôlées par Galphaq. Enfin des marqueurs de membranes endosomales, les protéines rab ont permis de caractériser les voies de trafic intracellulaire empruntée par RGS4, par exemple RGS4 est internalisé de la membrane plasmique par Rab5 et recyclé à la membrane cellulaire par Rab11. L’activation ou inhibition de Rab5 et 11 ont permis d’observer des changements d’activité de RGS4. Ces travaux confèrent une base de données pour des études ultérieures visant à développer des stratégies thérapeutiques à accroître les fonctionnalités de RGS4RGS proteins (Regulator of G-protein Signaling) are potent inhibitors of heterotrimeric G-protein signaling. RGS4 attenuates G-protein activity in several tissues such that loss of its function may lead to bradycardia, diabetic cardiomyopathy, breast cancer cell invasion, insulin resistance and glucose intolerance. RGS4 has been localized to both plasma membrane and intracellular pools, however, the nature of its intracellular trafficking remains to be elucidated. G-protein inhibition requires the presence of RGS4 at the plasma membrane. In this work, we characterized the complementary roles of two putative palmitoylation sites on RGS4 to target intracellular compartments and plasma membrane. We identified palmitoylation on Cys2 and 12 respectively important for RGS4 endosomal targeting and plasma membrane localization, when mutations were introduced to the palmitoylation sites, RGS4 capability of inhibiting Gq-mediated signaling was impaired. As a continuum we identified two palmitoylating enzymes, DHHC3 and 7 as modulator of RGS4 localization and function. Knock downs of DHHC3 and 7 impaired RGS4 endosomal and plasma membrane targeting and capability of inhibiting M1-muscarinic receptor signaling. Finally we used live cell confocal microscopy to define RGS4 intracellular trafficking routes. Specifically Rab5 mediated RGS4 trafficking from the plasma membrane to intracellular compartments while Rab11 mediated RGS4 trafficking to the plasma membrane. Activation and inhibition of Rab5 and 11 routes impaired RGS4 capability of inhibiting M1-muscarinic receptor signaling pathway. These novel findings provide a strong rationale for future studies aimed at developing new strategies to increase the function of RGS4
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Bensmail, Laila. „Contribution à l'étude de la régulation et de la sécrétion chez Myxococcus xanthus : utilisation comme sonde d'un gène codant une endoglucanase“. Rouen, 1996. http://www.theses.fr/1996ROUES065.
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Myxococcus xanthus est une bactérie du sol non pathogène à gram-négatif, qui vit au détriment d'autres microorganismes en sécrétant dans le milieu extérieur des enzymes hydrolytiques pour dégrader sa proie. Elle a un cycle de développement multicellulaire unique chez les procaryotes. Ces caractéristiques font de M. Xanthus un modèle d'étude des mécanismes de sécrétion des protéines. L'étude de la localisation des protéines (exocellulaires chez la bactérie hôte) exprimées chez Escherichia coli a permis d'obtenir dans de nombreux cas un certain nombre de renseignements concernant le mode de sécrétion de ces protéines chez leur hôte d'origine. Ainsi pour étudier le mécanisme de sécrétion d'une protéine exocellulaire de M. Xanthus, une endoglucanase, le gène correspondant celA a été cloné dans un plasmide chez E. Coli et séquencé. Chez E. Coli, la localisation cellulaire de l'activité endoglucanase dépend d'une part de de sa structure, peptide signal potentiel et hydrophobicité, et d'autre part de la présence d'une séquence d'ADN adjacente transcrite dans le sens opposé. Ce nouveau gène codant probablement un transporteur de la famille des MFS joue manifestement un rôle important chez M. Xanthus, puisqu'il n'a pas été possible d'obtenir une inactivation de cette séquence chez cette bactérie. Le gène celA a été aussi utilisé pour étudier les 3 mutants Exc+/- de M. Xanthus qui sont des mutants affectés dans la production globale des protéines exocellulaires et notamment de l'endoglucanase. Ces mutants sont aussi incapables d'initier le cycle de développement multicellulaire. En ce qui nous concerne, nous avons montré que le gène celA est régulé au niveau transcriptionnel chez deux de ces mutants (asgA-, asgC-) et post-transcriptionnel chez le troisième (excA-) en phase végétative.
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Girardin, Stephen. „Régulation de la voie de signalisation intracellulaire JNK/SAPK“. Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008), 2001. http://www.theses.fr/2001STR13179.
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Klein, Sarah. „Application des outils de la physique statistique au transport intracellulaire“. Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2016. http://www.theses.fr/2016SACLS090/document.
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La plupart des processus dans notre vie quotidienne sont des processus hors équilibre. Un exemple de système hors équilibre est la cellule biologique et le transport qui a lieu dedans. Dans cette thèse ce transport intracellulaire est modélisé par des processus stochastiques. Pour cela deux approches différentes ont été utilisées : d’une part une modélisation explicite de particules actives avec des degrés de liberté internes obtenus expérimentalement, d’autre part une description phénoménologique des effets collectifs, qui est réalisée au moyen de processus d’exclusion.Un des résultats principaux pour le modèle explicite est qu’il est crucial de prendre en compte les fluctuations des forces pour reproduire les caractéristiques principales du mou- vement. Un autre élément important est la prise en considération de l’environnement cellu- laire, qui peut produire des effets non-triviaux, comme par exemple une inversion du sens de déplacement moyen. Pour étudier les effets collectifs il est possible de représenter le mou- vement des particules d’une manière simplifiée, en utilisant un processus d’exclusion avec des particules ayant des états internes. Le désordre sur les taux de saut qui en résulte peut provoquer une condensation dépendant de la densité.Un autre modèle étudié est un processus d’exclusion sur un réseau à deux voies. On suppose que deux types de particules se déplacent dans une géométrie tubulaire, inspirée par les champignons filamenteux. Ces hypothèses définissent un modèle minimal qui présente une transition de phase d’une phase de basse densité vers une phase pulsante caractérisée par des oscillations de densitéMost processes in our daily life are far from equilibrium. The prime example is a cell and the transport occurring within. In this thesis intracellular transport is modeled by means of stochastic processes. For this, two different approaches are applied: the explicit mod- eling of active particles with internal degrees of freedom with characteristics as they were determined experimentally. And secondly, the collective effects occurring in many particle systems are studied in a phenomenological way by means of exclusion processes.In the explicit model one important result is given by the fact that force fluctuations are essential to capture the relevant motion characteristics. Further, the influence of the cellular environment creates counter-intuitive effects, like a possible inversion of the bias. The motion characteristics can be represented in a coarse-grained manner as an exclusion process for particles with internal states. Due to the resulting disorder in the hopping rates a density-dependent condensation occurs.In a second part, a two-lane exclusion model is studied. Two species in a tubular geometry inspired by filamentous fungi are considered.This can be seen as a minimal model exhibiting a phase transition from a low density phase to an intriguing phase with periodically changing particle densities
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Boeuf, Julien. „Caractérisation des GASP, une nouvelle famille de protéines impliquées dans le trafic intracellulaire des récepteurs couplés aux protéines G“. Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008), 2008. https://publication-theses.unistra.fr/public/theses_doctorat/2008/BOEUF_Julien_2008.pdf.
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Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) constituent une vaste famille de protéines située à la surface de la cellule et assurent la communication entre les cellules de notre organisme. Ce sont des cibles thérapeutiques privilégiées, mais leur stimulation prolongée conduit à des adaptations, en particulier le développement de la tolérance. La tolérance, qui peut se définir comme une baisse de l’efficacité d’un composé au cours du temps, est bien connue des cliniciens dans le cas de traitements prolongés de nombreuses pathologies avec des médicaments ayant pour cibles les RCPG. La compréhension des mécanismes impliqués dans ces phénomènes adaptatifs constitue ainsi un défi majeur qui pourrait conduire au développement de nouveau traitement visant à limiter la tolérance. C’est dans ce contexte que nous avons récemment identifié une nouvelle famille de protéines interagissant avec les RCPG. Cette famille, appelée GASP, aurait une fonction importante dans la dégradation des RCPG, phénomène considéré comme un élément clé du développement de la tolérance in vivo. Durant ma thèse, je me suis intéressé aux régions des GASP et des RCPG cruciales pour l’interaction de ces deux types de protéines, identifiant ainsi un nouveau motif d’interaction protéine-protéine et développant un petit peptide capable d’inhiber cette interaction. Je me suis également intéressé à l’interaction de GASP-1 et -2 avec le récepteur muscarinique M1 à l’acétylcholine, et ses conséquences sur la dégradation de ce récepteur, montrant ainsi pour la première fois l’implication des GASP dans la régulation du trafic intracellulaire des RCPG à recyclage rapide. Finalement, j’ai exploré le rôle physiologique de GASP-1 à l’aide d’un modèle animal déficient en cette protéine. Dans un premier temps, les mécanismes adaptatifs, comportementaux et biochimiques, liés à la consommation de cocaïne ont été étudiés, montrant une diminution de l’effet hyperlocomoteur de la cocaïne chez les animaux mutants. Ces animaux présentent également une difficulté à acquérir un comportement d’autoadministration de la cocaïne qui s’accompagne d’une baisse de la densité en récepteurs dopaminergiques et muscariniques dans le striatum. Dans un deuxième temps, la régulation des rythmes circadiens a été étudiée et bien qu’aucune différence en terme de régulation du rythme de veille-éveil n’ait été décelée entre les animaux sauvages et mutants, une interaction entre les GASP et les protéines horloges Period conduisant à la modification de leur profil de localisation subcellulaire a pu être mise en évidenceG protein-coupled receptors (GPCRs), one of the most important family of proteins, are distributed at the plasma membrane and are implicated in cell communication. They represent major targets for pharmaceutical drugs and their function is tightly regulated. Recently, we identified a novel family of proteins interacting with GPCRs. This family, called GASP, could have an important function in the proteolysis of the GPCRs, which is considered as a key feature of the regulation of GPCR activity. My PhD work focused on the domains of GASPs and GPCRs that are critical for the interaction between these two kinds of proteins, identifying a novel protein-protein interaction motif and designing and developing a small peptide capable of preventing this interaction. I also focused on the interaction between GASP-1 and -2 and the acetylcholine muscarinic M1 receptor, and the consequences of this interaction on the proteolysis of this receptor, showing for the first time the implication of GASPs in the intracellular trafficking of fast recycling GPCR. Finally, I studied the physiological role of GASP-1 using transgenic animals deficient in this protein. These mice showed notably alteration in behavioral and biochemical adaptive mechanisms related to acute and prolonged administration of cocaine. The regulation of the circadian rhythms was also assessed. Despite the lack of difference in terms of sleep-activity rhythm between wild-type and mutant mice, an interaction between the GASPs and the PER clock proteins, that leads to the modification of their subcellular distribution, was observed
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Cailler, Françoise. „Étude du trafic intracellulaire de protéines membranaires de la famille de la néprilysine“. Thesis, National Library of Canada = Bibliothèque nationale du Canada, 1999. http://www.collectionscanada.ca/obj/s4/f2/dsk2/ftp02/NQ47601.pdf.
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Vannier, Christian. „Induction et activation intracellulaire de la lipoprotéine lipase de cellules adipeuses en culture“. Nice, 1985. http://www.theses.fr/1985NICE4049.
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Ravel, Sophie. „Mécanisme d'action des immunotoxines : étude de l'intériorisation et du transport intracellulaire“. Montpellier 2, 1990. http://www.theses.fr/1990MON20186.
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Les immunotoxines a chaine a de ricine allient une haute specificite de reconnaissance a une puissante toxicite. Neanmoins, ces molecules ont une efficacite inferieure a ce qui est necessaire pour une therapeutique du cancer. En vue d'ameliorer cette efficacite, nous avons examine le mecanisme d'action de ces conjuges. L'entree de l'immunotoxine, indispensable a l'activite cytotoxique, ne semble pas constituer l'etape limitante dans le processus d'intoxication des cellules leucemiques. Apres interiorisation, la majeure partie des molecules d'immunotoxine reste intacte, sans rupture du pont disulfure reliant la chaine a a l'anticorps. Une etude de fractionnement cellulaire a montre que le conjugue n'atteint pas les lysosomes mais se localise plutot dans un compartiment endosomo-golgi a partir duquel la chaine a pourrait etre transferee aux ribosomes. Le chlorure d'ammonium et la monensine qui ameliorent considerablement l'efficacite du conjugue, n'accelerent pas sa cinetique d'interiorisation et ne modifient pas sa degradation, ni sa localisation intracellulaire. Ceci suggere que l'etape limitante se situe tardivement dans le transport du conjugue, probablement au niveau du passage de la chaine a au cytosol. Nous avons constate que l'internalisation et le transport intracellulaire de l'immunotoxine sont gouvernes par l'anticorps porteur et que l'interiorisation de l'anticorps anti-t65 dans les lymphocytes t du sang peripherique est un processus rapide et conduit a une degradation massive dont les monocytes sont en grande partie responsables
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LEPAGE-LEZIN, AGNES. „Maturation post-traductionnelle de la prosomatostatine, relation avec son transport intracellulaire“. Paris 6, 1991. http://www.theses.fr/1991PA066204.
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La maturation par proteolyse limitee de la prosomatostatine aboutit a la liberation de plusieurs entites peptidiques, dont la somatostatine-14. Le travail relate dans cette these a consiste en l'identification des sites intracellulaires ou se produisent ces evenements proteolytiques. Ceci a ete realise par evaluation quantitative des produits de la prosomatostatine, au sein de fractions enrichies en reticulum endoplasmique, en complexe de golgi et en synaptosomes, obtenues par subfractionnement du tissu cortical de rat par ultracentrifugation sur gradient de sucrose et identifiees en microscopie electronique et mesure d'enzymes marqueurs. Les produits de maturation ont ete quantifies par dosage radioimmunologique. Les resultats ont montre que la fraction reticulaire renfermait le plus fort taux de prosomatostatine, tandis que la fraction golgi contenait des produits de maturation de la prosomatostatine, constituant par la-meme le site intracellulaire ou debute la maturation de la prosomatostatine. Cette maturation a ete demontree par blocage du transport intracellulaire entre le complexe de golgi et les granules de neurosecretion; ainsi que par immunocytochimie directe. Il est postule l'hypothese d'une maturation post-traductionnelle organite-dependante lors de la maturation d'un precurseur polypeptidique
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Pollard, Hélène. „Metabolisme intracellulaire des plasmides therapeutiques (doctorat : biologie)“. Nantes, 1999. http://www.theses.fr/1999NANT07VS.
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