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Dissertationen zum Thema „Transcriptomique en cellule unique“
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Alberge, Jean-Baptiste. „Étude des mécanismes de l'initiation et de la progression du myélome multiple par transcriptomique en cellule-unique et cartographie de l'hydroxyméthylome“. Thesis, Nantes, 2021. http://www.theses.fr/2021NANT1006.
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Le myélome multiple (MM) est une tumeur hématologique causée par la prolifération incontrôlée de plasmocytes à longue durée de vie. L’hétérogénéité génomique du MM est caractérisée par une diversité importante des altérations génétiques somatiques, des modifications épigénétiques, et des programmes transcriptionnels dont l’articulation reste mal comprise et que nous explorons en trois axes. Nous montrons que (1) l’ADN du MM est globalement appauvri en 5-hydroxyméthylcytosine (5hmC) par rapport à l’ADN de plasmocytes non-tumoraux. Le faible niveau global de 5hmC dans l’ADN corrèle avec l’agressivité de la maladie. La marque est présente localement aux régions actives et transcrites de la chromatine, et reflète les sousgroupes moléculaires du MM (CCND1, MMSET, etc.) ainsi que leurs programmes d’expression génique associés. Puis, (2) nous décrivons les anomalies génomiques associées à la progression clinique et à l’acquisition de la résistance au venetoclax, une thérapie ciblée anti-BCL2. Les altérations génomiques sélectionnées sont concentrées sur la famille du BCL2 de façon clonale ou sousclonale. Ces résultats sont étayés par des tests fonctionnels et des analyses d’expression génique. Enfin, (3) nous proposons d’associer la transcriptomique des cellules de myélome aux paramètres de rendu d’imagerie médicale pour définir de nouveaux indicateurs pronostiques qui reflètent l’expansion et l’agressivité de la maladie. Ce travail contribue à notre compréhension de l’oncogenèse et de la progression du MM tout en fournissant des biomarqueurs susceptibles de trouver leur place en cliniqueMultiple Myeloma (MM) is a hematological malignancy caused by the uncontrolled proliferation of long-lived plasma cells. Genomic heterogeneity of MM is characterized by a significant diversity of somatic genetic alterations, epigenetic modifications, and of transcriptional programs whose integration remains poorly understood, and that we discuss in three parts. First, compared to normal plasma cells, we found global DNA 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) levels to be lower in MM. Higher 5hmC levels correlated with a less severe disease. Local 5hmC remained at active and transcribed regions of the chromatin where it mirrored the MM molecular subgroups (CCND1, MMSET, etc.) as well as their gene expression programs. Second, we described unique genomic abnormalities that were associated with clinical progression and acquired resistance to venetoclax, an anti-BCL2 targeted therapy. The BCL2 family of genes displayed numerous alterations that were clonally or sub-clonally selected. Functional tests and gene expression profiling underpinned these results. Third, transcriptional programs of MM cells were associated with biomedical imaging parameters to define new prognostic markers that mirrored the expansion and severity of the disease. Together, this work contributes to our understanding of MM oncogenesis and progression while it also unravels novel clinical biomarkers
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Bonnaffoux, Arnaud. „Inférence de réseaux de régulation de gènes à partir de données dynamiques multi-échelles“. Thesis, Lyon, 2018. http://www.theses.fr/2018LYSEN054/document.
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L'inférence des réseaux de régulation de gènes (RRG) à partir de données d'expression est un défi majeur en biologie. L’arrivée des technologies de mesure de transcriptomique à l’échelle de la cellule a suscité de nombreux espoirs, mais paradoxalement elles montrent une nouvelle complexité du problème d’inférence des RRG qui limite encore les approches existantes. Nous avons commencé par montrer, à partir de données d'expression en cellules uniques acquises sur un modèle aviaire de différenciation érythrocytaire, que les RRG sont des systèmes stochastiques à l'échelle de la cellule et qu'il y a une évolution dynamique de cette stochasticité au cours du processus de différenciation (Richard et al, PLOS Comp.Biol., 2016). C'est pourquoi nous avons développé par la suite un modèle de RRG mécaniste qui inclus cette stochasticité afin d'exploiter au maximum l'information des données expérimentales à l'échelle de la cellule (Herbach et al, BMC Sys.Biol., 2017). Ce modèle décrit les interactions entre gènes comme un couplage de processus de Markov déterministes par morceaux. En régime stationnaire une formule explicite de la distribution jointe est dérivée du modèle et peut servir à inférer des réseaux simples. Afin d'exploiter l'information dynamique et d'intégrer d'autres données expérimentales (protéomique, demi-vie des ARN), j’ai développé à partir du modèle précédent une approche itérative, intégrative et parallèle, baptisée WASABI qui est basé sur le concept de vague d'expression (Bonnaffoux et al, en révision, 2018). Cette approche originale a été validée sur des modèles in-silico de RRG, puis sur nos données in-vitro. Les RRG inférés affichent une structure de réseau originale au regard de la littérature, avec un rôle central du stimulus et une topologie très distribuée et limitée. Les résultats montrent que WASABI surmonte certaines limitations des approches existantes et sera certainement utile pour aider les biologistes dans l’analyse et l’intégration de leurs donnéesInference of gene regulatory networks from gene expression data has been a long-standing and notoriously difficult task in systems biology. Recently, single-cell transcriptomic data have been massively used for gene regulatory network inference, with both successes and limitations.In the present work we propose an iterative algorithm called WASABI, dedicated to inferring a causal dynamical network from timestamped single-cell data, which tackles some of the limitations associated with current approaches. We first introduce the concept of waves, which posits that the information provided by an external stimulus will affect genes one-byone through a cascade, like waves spreading through a network. This concept allows us to infer the network one gene at a time, after genes have been ordered regarding their time of regulation. We then demonstrate the ability of WASABI to correctly infer small networks, which have been simulated in-silico using a mechanistic model consisting of coupled piecewise-deterministic Markov processes for the proper description of gene expression at the single-cell level. We finally apply WASABI on in-vitro generated data on an avian model of erythroid differentiation. The structure of the resulting gene regulatory network sheds a fascinating new light on the molecular mechanisms controlling this process. In particular, we find no evidence for hub genes and a much more distributed network structure than expected. Interestingly, we find that a majority of genes are under the direct control of the differentiation-inducing stimulus. Together, these results demonstrate WASABI versatility and ability to tackle some general gene regulatory networks inference issues. It is our hope that WASABI will prove useful in helping biologists to fully exploit the power of time-stamped single-cell data
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Ruiz, Garcia Sandra. „Appréhender l'hétérogénéité cellulaire et la dynamique de différenciation des épithéliums des voies aériennes au moyen de signatures transcriptionnelles sur cellule unique“. Thesis, Université Côte d'Azur (ComUE), 2018. http://www.theses.fr/2018AZUR4204/document.
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Les voies aériennes humaines sont bordées d'un épithélium pseudostratifié composé principalement de cellules basales et de cellules pyramidales parmi lesquelles figurent les cellules sécrétrices de mucus et les cellules multiciliées. Toutes ces cellules contribuent à la clairance mucociliaire des voies respiratoires. Cet épithélium se régénère lentement dans des conditions homéostatiques, mais il est capable de se régénérer rapidement après agression grâce à des processus de prolifération, de migration, de polarisation et de différenciation. Chez les patients atteints de maladies respiratoires chroniques telles que la broncho-pneumopathie chronique obstructive, l'asthme ou la mucoviscidose, la réparation tissulaire est souvent défectueuse, caractérisée par une perte de cellules multiciliées et une hyperplasie des cellules sécrétrices, ayant pour conséquence une clairance mucociliaire affectée. La séquence des événements cellulaires conduisant à un tissu fonctionnel ou remodelé est encore mal décrite. Notre principal objectif a été d’identifier les types cellulaires successifs mis en jeu lors de la régénération tissulaire et les événements moléculaires responsables d'une régénération saine ou pathologique. Nous avons analysé la composition cellulaire de l’épithélium des voies respiratoires à plusieurs stades de différenciation en utilisant un modèle de culture 3D in vitro qui reproduit la composition cellulaire in vivo. En appliquant une méthode de transcriptomique sur cellule unique couplée à des méthodes bioinformatiques, nous avons établi les hiérarchies cellulaires permettant de reconstruire les différentes trajectoires cellulaires mises en jeu lors de la régénération de l’épithélium des voies respiratoires humaines. Après avoir confirmé les lignages cellulaires qui ont été précédemment décrits, nous avons découvert une nouvelle trajectoire reliant les cellules sécrétrices de mucus aux cellules multiciliées. Nous avons également caractérisé de nouvelles populations cellulaires et de nouveaux acteurs moléculaires impliqués dans le processus de régénération de l'épithélium des voies respiratoires humaines. Enfin, grâce à ces approches, nous avons mis en évidence des réponses spécifiques de chaque type cellulaire survenant dans des situations pathologiques d’hyperplasie sécrétoire. Ainsi, nos données, en apportant d'importantes contributions à la compréhension de la dynamique de différenciation de l’épithélium des voies respiratoires humaines, ouvrent de nouvelles voies vers l’identification de cibles thérapeutiquesHuman airways are lined by a pseudostratified epithelium mainly composed of basal and columnar cells, among these cells we can find multiciliated, secretory cells and goblet cells. All these cells work together in the mucociliary clearance of the airways. This epithelium regenerates slowly under homeostatic conditions but is able to recover quickly after aggressions through proliferation, migration, polarization and differentiation processes. However, in patients with chronic pulmonary diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, asthma or cystic fibrosis, epithelial repair is defective, tissue remodeling occurs, leading to loss of multiciliated cells and goblet cell hyperplasia, impairing correct mucociliary clearance. The sequence of cellular events leading to a functional or remodelled tissue are still poorly described. Hence, we aim at identifying the successive cell types appearing during tissue regeneration and the molecular events that are responsible for healthy or pathological regeneration. We have analysed airway epithelial cell composition at several stages of differentiation using an in vitro 3D culture model which reproduces in vivo epithelial cell composition. Applying single cell transcriptomics and computational methods, we have identified cell lineage hierarchies and thus constructed a comprehensive cell trajectory roadmap in human airways. We have confirmed the cell lineages that have been previously described and have discovered a novel trajectory linking goblet cells to multiciliated cells. We have also discovered novel cell populations and molecular interactors involved in the process of healthy human airway epithelium regeneration. Using these approaches, we have finally shed light on cell-type specific responses involved in pathological goblet cell hyperplasia. Our data, by bringing significant contributions to the understanding of differentiation’s dynamics in the context of healthy and pathological human airway epithelium, may lead to the identification of novel therapeutic targets
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Marcy, Guillaume. „Etude des spécificités transcriptionnelles et de la compétence des progéniteurs neuraux postnataux du cerveau antérieur chez la souris“. Thesis, Paris Sciences et Lettres (ComUE), 2018. http://www.theses.fr/2018PSLEP070/document.
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Lors du développement, la coordination d’évènements moléculaires et cellulaires mène à la production du cortex qui orchestre les fonctions sensori-motrices et cognitives. Son développement s’effectue par étapes : les cellules gliales radiaires (RGs) – les cellules souches neurales (NSCs) du cerveau en développement – et les cellules progénitrices de la zone ventriculaire (VZ) et de la zone sous ventriculaire (SVZ) génèrent séquentiellement des vagues distinctes de nouveaux neurones qui formeront les différentes couches corticales. Autour de la naissance, les RGs changent de devenir et produisent des cellules gliales. Cependant, une fraction persiste tout au long de la vie dans la SVZ qui borde le ventricule, perdant au passage leur morphologie radiale. Ces NSCs produisent ensuite les différents sous types d’interneurones du bulbe olfactif ainsi que des cellules gliales en fonction de leur origine spatiale dans la SVZ. Ces observations soulèvent d’importantes questions non résolues sur 1) le codage transcriptionnel régulant la régionalisation de la SVZ, 2) le potentiel des NSCs postnatales dans la réparation cérébrale, et 3) le lignage et les spécificités transcriptionnelles entre les NSCs et leur descendants. Mon travail de doctorat repose sur une étude transcriptionnelle des domaines de la SVZ postnatale. Celle-ci soulignait le fort degré d’hétérogénéité des NSCs et progéniteurs et identifiait des régulateurs transcriptionnels clés soutenant la régionalisation. J’ai développé des approches bio-informatiques pour explorer ces données et connecter l’expression de facteurs de transcription (TFs) avec la genèse régionale de lignages neuraux distincts. J’ai ensuite développé un modèle d’ablation ciblée pour étudier le potentiel régénératif des progéniteurs postnataux dans divers contextes. Finalement, j’ai participé au développement d’une procédure pour explorer et comparer des progéniteurs pré et postnataux à l’échelle de la cellule unique. Objectif 1 : Des expériences de transcriptomique et de cartographie ont été réalisées pour étudier la relation entre l’expression régionale de TFs par les NSCs et l’acquisition de leur devenir. Nos résultats suggèrent un engagement précoce des NSCs à produire des types cellulaires définis selon leur localisation spatiale dans la SVZ et identifient HOPX comme un marqueur d’une sous population biaisé à générer des astrocytes. Objectif 2 : J’ai mis au point un modèle de lésion corticale qui permet l’ablation ciblée de neurones de couches corticales définies pour étudier la capacité régénérative et la spécification appropriée des progéniteurs postnataux. Une analyse quantitative des régions adjacentes, incluant la région dorsale de la SVZ, a révélé une réponse transitoire de progéniteurs définis. Objectif 3 : Nous avons développé la lignée de souris transgénique Neurog2CreERT2Ai14, qui permet le marquage de cohortes de progéniteurs glutamatergiques et de leurs descendants. Nous avons montré qu’une large fraction de ces progéniteurs persiste dans le cerveau postnatal après la fermeture de neurogénèse corticale. Ils ne s’accumulent pas pendant le développement embryonnaire mais sont produits par des RGs qui persistent après la naissance dans la SVZ et qui continuent de générer des neurones corticaux, bien que l’efficacité soit faible. Le séquençage d’ARN sur cellule unique a révélé une dérégulation transcriptionnelle qui corrèle avec le déclin progressif observé in vivo de la neurogénèse corticale. Ensemble, ces résultats soulignent le potentiel des études transcriptomiques à résoudre mais aussi à soulever des questions fondamentales comme les changements trancriptionnels intervenant dans une population de progéniteurs au cours du temps et participant aux changements de leur destinée. Cette connaissance sera la clé du développement d’approches novatrices pour recruter et promouvoir la génération de types cellulaires spécifiques, incluant les sous-types neuronaux dans un contexte pathologiqueDuring development, a remarkable coordination of molecular and cellular events leads to the generation of the cortex, which orchestrates most sensorimotor and cognitive functions. Cortex development occurs in a stepwise manner: radial glia cells (RGs) - the neural stem cells (NSCs) of the developing brain - and progenitor cells from the ventricular zone (VZ) and the subventricular zone (SVZ) sequentially give rise to distinct waves of nascent neurons that form cortical layers in an inside-out manner. Around birth, RGs switch fate to produce glial cells. A fraction of neurogenic RGs that lose their radial morphology however persists throughout postnatal life in the subventricular zone that lines the lateral ventricles. These NSCs give rise to different subtypes of olfactory bulb interneurons and glial cells, according to their spatial origin and location within the postnatal SVZ. These observations raise important unresolved questions on 1) the transcriptional coding of postnatal SVZ regionalization, 2) the potential of postnatal NSCs for cellular regeneration and forebrain repair, and 3) the lineage relationship and transcriptional specificities of postnatal NSCs and of their progenies. My PhD work built upon a previously published comparative transcriptional study of defined microdomains of the postnatal SVZ. This study highlighted a high degree of transcriptional heterogeneity within NSCs and progenitors and revealed transcriptional regulators as major hallmarks sustaining postnatal SVZ regionalization. I developed bioinformatics approaches to explore these datasets further and relate expression of defined transcription factors (TFs) to the regional generation of distinct neural lineages. I then developed a model of targeted ablation that can be used to investigate the regenerative potential of postnatal progenitors in various contexts. Finally, I participated to the development of a pipeline for exploring and comparing select populations of pre- and postnatal progenitors at the single cell level. Objective 1: Transcriptomic as well as fate mapping were used to investigate the relationship between regional expression of TFs by NSCs and their acquisition of distinct neural lineage fates. Our results supported an early priming of NSCs to produce defined cell types depending of their spatial location in the SVZ and identified HOPX as a marker of a subpopulation biased to generate astrocytes. Objective 2: I established a cortical lesion model, which allowed the targeted ablation of neurons of defined cortical layers to investigate the regenerative capacity and appropriate specification of postnatal cortical progenitors. Quantitative assessment of surrounding brain regions, including the dorsal SVZ, revealed a transient response of defined progenitor populations. Objective 3: We developed a transgenic mouse line, i.e. Neurog2CreERT2Ai14, which allowed the conditional labeling of birth-dated cohorts of glutamatergic progenitors and their progeny. We used fate-mapping approaches to show that a large fraction of Glu progenitors persist in the postnatal forebrain after closure of the cortical neurogenesis period. Postnatal Glu progenitors do not accumulate during embryonal development but are produced by embryonal RGs that persist after birth in the dorsal SVZ and continue to give rise to cortical neurons, although with low efficiency. Single-cell RNA sequencing revealed a dysregulation of transcriptional programs, which correlates with the gradual decline in cortical neurogenesis observed in vivo. Altogether, these data highlight the potential of transcriptomic studies to unravel but also to approach fundamental questions such as transcriptional changes occurring in a population of progenitors over time and participating to changes in their fate potential. This knowledge will be key in developing innovative approaches to recruit and promote the generation of selected cell types, including neuronal subtypes in pathologies
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Lehmann, Nathalie. „Development of bioinformatics tools for single-cell transcriptomics applied to the search for signatures of symmetric versus asymmetric division mode in neural progenitors“. Electronic Thesis or Diss., Université Paris sciences et lettres, 2021. http://www.theses.fr/2021UPSLE070.
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Ces dernières années, l’émergence des approches en cellules uniques (scRNA-seq) a favorisé la caractérisation de l’hétérogénéité cellulaire avec une précision inégalée. Malgré leur démocratisation, l’analyse de ces données reste complexe, en particulier pour les organismes dont les annotations sont incomplètes. Au cours ma thèse, j’ai observé que les annotations génomiques du poulet sont lacunaires, ce qui engendre la perte d’un grand nombre de lectures de séquençage. J’ai évalué à quel point une annotation améliorée affecte les résultats biologiques et les conclusions issues de ces analyses. Nous proposons une nouvelle approche basée sur la ré-annotation du génome à partir de données scRNA-seq et de RNA-seq bulk en lectures longues. Ce projet de biologie computationnelle s’appuie sur une étroite collaboration avec l’équipe expérimentale de Xavier Morin (IBENS). Le principal objectif biologique est la recherche de signatures de mode de division symétrique et asymétrique au sein de progéniteurs neuronaux. Afin d’identifier les principaux changements transcriptionnels, j’ai mis en place des approches dédiées à la recherche de signatures géniques à partir de données scRNA-seqIn recent years, single-cell RNA-seq (scRNA-seq) has fostered the characterization of cell heterogeneity at a remarkable high resolution. Despite their democratization, the analysis of scRNA-seq remains a challenge, particularly for organisms whose genomic annotations are partial. During my PhD, I observed that the chick genomic annotations are often incomplete, thus resulting in a loss of a large number of sequencing reads. I investigated how an enriched annotation affects the biological results and conclusions from these analyses. We developed a novel approach based on the re-annotation of the genome with scRNA-seq data and long reads bulk RNA-seq. This computational biology project capitalises on a tight collaboration with the experimental team of Xavier Morin (IBENS). The main biological focus is the search for signatures of symmetric versus asymmetric division mode in neural progenitors. In order to identify the key transcriptional switches that occur during the neurogenic transition, I have implemented bioanalysis approaches dedicated to the search for gene signatures from scRNA-seq data
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Cussat-Blanc, Sylvain. „Créatures Artificielles : Développement d'Organismes à partir d'une Cellule Unique“. Phd thesis, Université des Sciences Sociales - Toulouse I, 2009. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00449673.
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Le développement de créatures artificielles est un domaine de recherche en plein essor. Depuis plus de vingt ans maintenant, de nombreuses techniques sont apparues afin de simuler à plusieurs niveaux des êtres artificiels : en commençant par la simulation de leur comportement au début des années 90, on a ensuite continué en modifiant leur morphologie pour qu'elle soit adaptée à leur environnement. Plus récemment, l'embryogenèse artificielle s'inspire des mécanismes de développement du vivant afin de générer de petites créatures de quelques dizaines à plusieurs centaines de cellules. Le but de ces systèmes est d'une part de mieux comprendre le vivant mais aussi de produire des modèles comportementaux pour les futurs robots modulaires. Après avoir étudié ces différents niveaux de simulation, nous nous sommes aperçus qu'il n'existait pas de modèle transversal permettant une simulation à plusieurs échelles des créatures. Le but de ces travaux est de développer une créature complète en partant d'une cellule unique, possédant différents organes et des fonctionnalités haut niveau. Le but de cette thèse est de construire le modèle chimique de cet ensemble de simulateurs. Nous avons ainsi proposé un modèle basé sur une forte simplification du modèle de développement naturel. Les créatures devront de plus intégrer un métabolisme afin de pouvoir extraire de l'énergie des différents constituants de son environnement. Ce métabolisme est trop souvent oublié dans les modèles de développement de la littérature bien qu'il soit à la base de la vie de tous les êtres vivants. A travers différentes expérimentations que nous avons effectuées, nous avons prouvé que ce modèle est capable de produire différents organes et de les assembler afin de créer un organisme plus complexe. Nous avons aussi montré la possibilité à produire une forme particulière. Enfin, nous avons observé d'importantes capacités d'auto-réparation inhérentes au modèle. Ce modèle de développement est un premier simulateur qui sera inclu dans un ensemble de simulateurs agissants à différentes échelles de la créature. Comme nous le verrons dans les perspectives de ces travaux, nous avons commencé à imaginer un simulateur physique et un simulateur hydrodynamique permettant de plonger une créature en train de se développer dans un monde physique aux lois newtoniennes et un monde hydrodynamique répondant aux équations de Navier et Stokes.
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Caccianini, Laura. „Imagerie de l'architecture dynamique de la chromatine dans la cellule unique“. Thesis, Paris Sciences et Lettres (ComUE), 2019. https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-02896692.
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La structure de la chromatine joue un rôle crucial dans la régulation de plusieurs fonctions cellulaires chez les cellules de mammifères. Perturber l’organisation spatiale de la chromatine peut avoir des conséquences dramatiques sur la vie d’une cellule et peut amener`des pathologies graves chez les organismes. Deux facteurs nucléaires, CTCF et Cohesine, sont parmi les principaux acteurs dans la régulation et le maintien de l’architecture de l’ADN. Des avancements importants ont révélé ́la complexité ́des mécanismes qui régulent l’organisation de la chromatine, mais le domaine manque encore d’une description dynamique à l’échelle de la cellule et de la molécule unique. Cette étude est centrée sur la description de la dynamique de CTCF et Cohesin réalisé ́avec de méthodes de suivi de la molécule unique dans des cellules souche embryonnaires vivantes de souris. L’interaction entre ces deux facteurs a été étudiée à travers la caractérisation de la dynamique de Cohesin en absence de CTCF et dans le contexte d’autres altérations biologiquesChromatin structure and cellular function are tightly linked in the nucleus of mammalian cells. Disruption of chromatin spatial organisation dramatically affects the life of a cell and eventually leads to severe pathologies in entire organisms. Two nuclear factors, CTCF and Cohesin, have been found to play a crucial role in the regulation and maintenance of DNA architecture. Huge advancements have been made in the understanding of the mechanisms behind chromatin arrangement but the field is still lacking a dynamic picture at the single cell and single molecule level. This study provide this study provides insight into the dynamics of CTCF and Cohesin through single particle tracking of CTCF and Cohesin dynamics achieved with single molecule tracking in living mouse embryonic stem cells. The interplay between these two factors was studied by looking at Cohesin’s behaviour in the absence of CTCF and in the context of other biological alterations
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Bontoux, Nathalie. „Analyse du transcriptome d'une cellule unique à l'aide d'une puce microfluidique“. Paris 6, 2006. http://www.theses.fr/2006PA066600.
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Farina, Francesca. „Transport de l'ADN dans le cytoplasme d'une cellule eucaryote“. Paris 6, 2011. http://www.theses.fr/2011PA066283.
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Nous avons étudié le trafic intracellulaire de l’ADN nu dans la cellule eucaryote. Dans ces dernières années, des molécules d’ADN exogène ont été utilisées en thérapie génique et chimiothérapie. À présent nous ne savons pas par quelle voie ces molécules d’ADN atteignent le noyau des cellules. Pour étudier ce phénomène, nous avons utilisé le suivi de molécule unique nous permettant d’observer la dynamique d'une molécule d’ADN nu dans le cytoplasme d’une cellule eucaryote. La molécule choisie comme modèle est le Dbait, un fragment d’ADN double-brin développée à l’Institut Curie comme adjuvant des thérapies anti-tumorales classiques. Les molécules de Dbait ont été modifiées pour ne pas être dégradées dans le cytoplasme et marquées avec des nanoparticules fluorescentes. Nous les avons suivies avec une haute précision spatiale et temporelle dans le cytoplasme des cellules HeLa. Ces expériences nous ont suggéré un mécanisme de transport actif du Dbait le long des filaments du cytosquelette. Nous avons ensuite développé un système in vitro pour mimer le transport du Dbait soit sur des microtubules soit sur des filaments d’actine. Ces expériences ont montré que seul le réseau des microtubules est impliqué dans le transport actif du Dbait. De plus, elles suggèrent la présence d’un ou plusieurs moteurs moléculaires de la famille des kinésines ou des dynéines acteurs du transport du Dbait. Nous avons complété notre travail par une co-purification Dbait-protéines cytoplasmiques pour identifier ces moteurs moléculaires. Nous avons isolé quatre moteurs moléculaires qui ont une affinité pour les molécules de Dbait : la dynéine cytoplasmique et trois moteurs de la famille des kinésines
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Senecal, Adrien. „Régulation transcriptionnelle du proto-oncogène c-Fos à l’échelle de la cellule unique“. Paris 6, 2013. http://www.theses.fr/2013PA066786.
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Le niveau d’expression des 21 000 gènes que comporte une cellule humaine doit être très précisément régulé en fonction de nombreux signaux extra- et intracellulaires. A ce titre, des défauts dans le contrôle de l’expression génique sont souvent impliqués dans des maladies comme les cancers. Le choix des gènes, ainsi que leurs niveaux d’expression, sont le résultat de la régulation de l’ARN polymérase II par une combinaison de facteurs de transcription. Généralement, ces évènements sont étudiés sur de larges populations cellulaires, masquant d’éventuelles variations entre cellules d’une même population. Au cours de ma thèse, je me suis particulièrement intéressé à comprendre la régulation transcriptionnelle du proto-oncogène c-Fos à l’échelle de la cellule unique. Pour cela, nous avons développé un outil permettant de compter les ARNm unique et les ARN naissant sur les sites de transcription à l’aide d’expériences d’Hybridation in situ en Fluorescence. A l’aide de ce programme, nous avons découvert un mode de régulation de c-Fos particulièrement simple et efficace. Le gène est transcrit durant une brève période appelé burst transcriptionnel. Nous avons montré que l’amplitude des bursts n’est pas régulée alors que leur fréquence est modulée par le niveau d’activation des voies de signalisation intracellulaire. Nous avons également observé des agrégations dynamiques d’ARN polymérase II sur les gènes. Ces agrégations pourraient fournir une explication à l’origine moléculaire de ces bursts transcriptionnels tout en apportant un cadre pour déchiffrer leurs régulationsThe expression level of the 21,000 genes present in a human cell must be precisely controlled according to several extra- and intracellular signals. Failures in the control of gene expression are often involved in diseases such as cancer. The choice of genes, as well as their expression level, are the result of the regulation of RNA polymerase II by a combination of transcription factors. Usually, these events are studied over large cell populations, thus masking variations between cells of the same population. In my work, I particularly focused on the transcriptional regulation of the c-Fos proto-oncogene at the single cell level. To this end, we developed a tool for quantifying single mRNA and nascent RNA on transcription site from Fluorescence in situ Hybridization data. With this program, we discovered a remarkably simple regulation of c-Fos transcription. Multiple transcripts are produced during short and infrequent transcriptional bursts. We have shown that while the burst size is not regulated, their frequency is modulated by the level of activation of intracellular signaling pathways. We also observed a dynamics clustering of RNA polymerase II on genes. This clustering may provide an explanation for the molecular origin of these transcriptional bursts as well as providing a framework to decipher their regulation
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Cruard, Jonathan. „Le Myélome Multiple et son environnement immunitaire à l’échelle de la cellule unique“. Electronic Thesis or Diss., Nantes Université, 2023. http://www.theses.fr/2023NANU1033.
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Le Myélome Multiple (MM) est un cancer hématologique dont la cellule tumorale dérive du plasmocyte à longue durée de vie. Cette pathologie est caractérisée par une forte hétérogénéité à divers niveaux. Cette hétérogénéité comprend des altérations intrinsèques et extrinsèques aux tumeurs, lesquelles ont un impact sur le pronostic des patients et leurs réponses aux traitements. L’apparition des technologies de séquençage en cellule unique nous permet aujourd’hui d’explorer de nouveaux aspects de cette diversité. Les travaux présentés ici explorent dans un premier temps la diversité de réponse à la dexaméthasone au sein de la lignée MM.1S de MM. Ces travaux montrent qu’au sein de cette population tumorale homogène il existe une diversité de réponse au traitement. Dans un second temps nous avons travaillé sur le MM et son environnement immunitaire à l’échelle de la cellule unique. Afin de mieux comprendre comment l’environnement immunitaire évolue au cours de la maladie mais aussi sous la pression des traitements. Cet aspect est d’autant plus essentiel que les traitements les plus récents impliquent directement l’environnement immunitaire en le redirigeant contre la tumeur. Mieux caractériser l’environnement immunitaire pourrait donc permettre de mieux prédire la réponse aux traitements mais aussi leurs conséquences pour l’environnement immunitaireMultiple myeloma (MM) is a hematological cancer in which the tumor cell is derived from the long-lived plasma cell. This pathology is characterized by strong heterogeneity at various levels. This heterogeneity includes alterations intrinsic and extrinsic to tumors, which have an impact on patient prognosis and response to treatment. The development of single-cell sequencing technologies has enabled us to explore new aspects of this diversity. The work presented here first explores the diversity of response to dexamethasone within the MM.1S cell line of MM. This work shows that within this homo- geneous tumoral population there is a diversity of response to treatment. Secondly, we worked on MM together with its immune environment at the single-cell level. In order to better understand how the immune environment evolves during the course of the disease, but also under the pressure of treatment. This as- pect is even more essential as the most recent treatments directly involve the immune environment by redirecting it against the tumor. A better characterization of the immune environment could therefore enable us to better predict the response to treatments, as well as their consequences for the immune environment
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Meistermann, Dimitri. „Modélisation du développement préimplantatoire humain à partir de données de transcriptome de cellule unique“. Thesis, Nantes, 2020. http://www.theses.fr/2020NANT1019.
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Le développement préimplantatoire humain s'étend de la fécondation à la nidation de l'embryon dans la paroi utérine. C'est au cours de cette période que les cellules embryonnaires font leur premier choix de destin cellulaire, passant d'une cellule à un embryon stratifié par trois types cellulaires. Cependant, la séquence d'événements au cours de ces toutes premières spécifications reste inconnu. Pour la comprendre, nous avons tout d'abord établi des lignées induites de cellules souches pluripotente naïves humaines. Grâce à des analyses transcriptomiques, nous avons montré que ces lignées in vitro étaient un modèle représentatif de l'épiblaste humain préimplantatoire. Nous avons ensuite construit des modèles in silica du développement préimplantatoire humain et murin à partir de données transcriptomiques en cellules uniques. Le coeur de l'analyse consiste en une inférence des trajectoires cellulaires par un algorithme de pseudo-temps. Nous montrons que la première spécification chez l'homme n'est achevée qu'à partir du stade blastocyste, et non au stade morula comme chez la souris. Enfin le partitionnement du transcriptome en modules de gènes couplé au pseudo-temps permet de décrire les vagues d'expression qui rythment le développement préimplantatoire. Ceci nous a permis de démontrer que le trophectoderme polaire évolue plus rapidement que le trophectoderme mural. Ces approches ont contribué de manière significative à notre compréhension du développement préimplantatoire, ouvrant de nouvelles voies de recherche dans les domaines de l'assistance à la procréation et de la médecine régénérativeCe travail de thèse est consacré à l’étude de nouveaux mélanges gazeux pour la gravure plasma du CdHgTe, à savoir : CH₃NO₂/H₂/Ar, CH₃OH/H₂/Ar et CH₄/NO₂/H₂/Ar. L’objectif est de graver sans polarisation du substrat pour limiter l’énergie déposée sur les surfaces gravées. Une première partie portant sur l’analyse de ces plasmas par sondes électrostatiques et spectroscopie d’émission optique a permis de montrer que la substitution de nitrométhane ou méthanol au méthane a un effet sur la composante chimique de la gravure. Pour ces nouveaux mélanges hydrocarbonés, l’apparition de molécules telles que CO et CN est corrélée à l’annihilation du dépôt spontané de polymère. La seconde partie, consacrée à la gravure du CdHgTe avec ces nouveaux précurseurs a prouvé la faculté de graver sans polarisation du substrat avec les mélanges CH₃NO₂/H₂/Ar et CH₄/N₂O/H₂/Ar et ainsi réduire les dommages engendrés au matériau, notamment la rugosité en surface. Une étude plus poussée de la gravure en mélange CH₄/N₂O/H₂/Ar montre notamment une augmentation de la vitesse de gravure pour les faibles polarisations jusqu’à un certain seuil, avant qu’elle ne stagne, correspondant au passage d’une gravure à dominance chimique à une gravure à dominance physique. De plus, la rugosité est indépendante de la puissance d’excitation du plasma, de la température du substrat ainsi que de la durée de gravure. Enfin, la gravure de tranchées a permis de mettre en évidence la gravure chimique et isotrope à faible polarisation avec les mélanges CH₄/N₂O/H₂/Ar et CH₃NO₂/H₂/Ar mais qui, à plus forte polarisation présente une meilleure passivation latérale que les gravures en plasma CH₄/H₂/Ar
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Pierrat, Sébastien. „Etude de l'adhésion cellulaire à différentes échelles de la molécule unique à la cellule“. Paris 6, 2004. http://www.theses.fr/2004PA066485.
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Moussy, Alice. „Caractérisation des premières étapes de différenciation des cellules hématopoïétiques à l'échelle de la cellule unique“. Thesis, Paris Sciences et Lettres (ComUE), 2017. http://www.theses.fr/2017PSLEP029/document.
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Bien que largement étudiés, les mécanismes fondamentaux de prise de décision dans les processus de différenciation cellulaire restent mal compris. Les théories déterministes, souvent basées sur des études populationnelles, atteignent rapidement leur limite lorsqu’il s’agit d’expliquer les différences de choix individuels de cellules, pourtant exposées au même environnement. L’objectif de ma thèse est donc d’étudier les premières étapes de la différenciation des cellules hématopoïétiques à l’échelle de la cellule unique, par des analyses transcriptomiques, protéomiques et morphologiques. Ce travail a été effectué sur deux modèles de différenciation : les lymphocytes T régulateurs et les cellules CD34+ humaines issues de sang de cordon. Nous avons observé le comportement de ces cellules uniques après stimulation. Grâce à la combinaison de la microscopie en time lapse et des analyses moléculaires réalisées à l’échelle de la cellule individuelle, nous avons pu démontrer que le choix du devenir cellulaire n’était pas unique, programmé. La cellule passe d’abord par un état dit « multi-primed », métastable où elle exprime des gènes de plusieurs lignées différentes, puis elle passe par une phase dite « incertaine », instable où elle hésite entre deux phénotypes avant de se stabiliser dans un état fixe. Nos observations sont cohérentes avec une explication stochastique de la prise de décision. La différenciation serait donc un processus spontané, dynamique, fluctuant et non un processus prédéterminé. Les décisions du destin cellulaire sont prises séparément par les cellules individuellesDespite intensively studies, the fundamental mechanisms of cell fate decision during cellular differentiation still remain unclear. The deterministic mechanisms, often based on studies of large cell populations, cannot explain the difference between individual cell fates choices placed in the same environment. The aim of my thesis work is to study the first steps of hematopoietic cell differentiation at the single cell level thanks to transcriptomic, proteomic and morphological analyses. Two differentiation models have been used: T regulatory lymphocytes and human cord blood-derived CD34+ cells. The behavior of individual cells following stimulation has been analyzed. Using time-lapse microscopy coupled to single cell molecular analyses, we could demonstrate that the cell fate choice is not a unique, programmed event. First, the cell reaches a metastable “multi-primed” state, which is characterized by a mixed lineage gene expression pattern. After transition through an “uncertain”, unstable state, characterized by fluctuations between two phenotypes, the cell reaches a stable state. Our observations are coherent with a stochastic model of cell fate decision. The differentiation is likely to be a spontaneous, dynamic, fluctuating and not a deterministic process. The cell fate decisions are taken by individual cells
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Meunier, Anne. „Méthodes analytiques pour la détection de phénomènes biologiques de sécrétion à l'échelle de la cellule unique“. Phd thesis, Université Pierre et Marie Curie - Paris VI, 2011. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00858915.
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De par leur excellente résolution spatiale et leurs propriétés particulières, les ultramicroélectrodes (UME) constituent des outils de choix pour l'étude de mécanismes biologiques de sécrétion à l'échelle de la cellule unique. En configuration " synapse semi-artificielle ", du fait de la faible distance qui sépare la cellule émettrice de l'UME, les molécules sont libérées dans un faible volume, induisant alors des concentrations suffisamment élevées pour être détectables par électrochimie. Ainsi, les UME offrent la possibiIité de mesurer des flux, même infimes, de molécules électroactives en temps réel. Cette technique analytique a été utilisée, complétée ou adaptée afin d'étudier deux phénomènes biologiques : l'exocytose vésiculaire et le stress oxydant cellulaire. L'analyse ampérométrique de l'exocytose, mécanisme impliqué dans la communication cellulaire, permet l'étude quantitative de la cinétique de libération des molécules intravésiculaires libérées dans le milieu extracellulaire. L'UME, placée dans le milieu extérieur, n'apporte pas d'information quant au statut des vésicules avant la fusion. Pour compléter ces informations, nous avons développé, par des techniques de microfabrication, un microsystème constitué d'électrodes conductrices et transparentes d'ITO permettant un couplage des détections ampérométrique et optique (microscopie TIRF) pour l'étude de la sécrétion des cellules BON BC21. L'ampérométrie à quatre potentiels constants, utilisée au laboratoire pour la détection des ROS/RNS libérées par les macrophages, cellules du système immunitaire, nécessite un grand nombre d'expériences pour s'affranchir de la variabilité cellulaire et des différences de sensibilité des UME. Afin de réduire considérablement le temps d'expérience, nous avons développé un microsystème constitué de quatre chambres de mesure, chacune contenant un jeu de trois électrodes. Ces quatre chambres permettront, à terme, le suivi et la détection simultanée en temps réel des variations de production de H2O2, ONOO-, NO* et NO2- libérées par une cellule.
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Bois, Nadège. „Développement d'un système de gouttes en microfluidique pour la récupération et l'étude de la cellule unique“. Paris 6, 2013. http://www.theses.fr/2013PA066776.
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Les études de populations de cellules permettent de comprendre les mécanismes biologiques, normaux ou pathologiques. Cependant, il faut tenir compte de la particularité des cellules au sein d’une même population. Leur hétérogénéité peut noyer des informations significatives. Il est donc essentiel de pouvoir étudier cellule par cellule les niveaux d’expression des gènes. Cet enjeu majeur en biologie reste un défi compte tenu de la faible quantité de matériel contenu dans une seule cellule. Le but de notre projet a donc été de développer des outils innovants et intégrés basés sur la microfluidique pour réaliser des analyses d’expression génique au niveau de nombreuses cellules individuelles. Nous nous sommes tournés vers la microfluidique digitale qui permet à haut débit d’encapsuler des cellules dans de très petites gouttes de quelques nanolitres telle une émulsion d’eau dans l’huile. Nous avons réalisé une plateforme permettant la création des gouttes et leurs récupérations individuellement. Ce système a ensuite été utilisé en vue de deux applications différentes. Tout d’abord, nous avons utilisé cette plateforme afin de réaliser des cultures monoclonales. Cela pourrait permettre la création de lignées stables ou la production d’anticorps monoclonaux. D’autre part, une fois encapsulées dans ces nanoréacteurs, il est possible de lyser les cellules, le contenu en ARN pouvant alors être transformé en ADN complémentaires puis amplifié, récupéré et analysé sur des puces à ADN. Cela permettra d’obtenir un profil d’expression génique au niveau de cellules individuellesStudies of cell populations are necessary to better understand normal and pathological biological mechanisms. However, one must take into account the specificity of each cell within a population. The study of their heterogeneity can provide meaningful information and it is therefore essential to investigate the gene expression levels of individual cell. This is a major challenge given the small amount of material in a single cell. The aim of our project was to develop innovative and integrated tools based on microfluidics to perform gene expression analyzes at the single cell level. For that purpose we used droplet microfluidics that enables the generation of small droplets of water in oil at high throughput. We developed a platform enabling single cell encapsulation and providing an easy handling of individual droplets. This system was then used for two different applications: first, we investigated the capabilities of this platform to make monoclonal cultures for the creation of stable cell lines or the production of monoclonal antibodies. Second, we targeted an application devoted to transcriptom analysis: once encapsulated in droplets, cells can be lysed and their RNA content can then be converted to complementary DNA, amplified by RT PCR, recovered and analyzed on microarrays. This strategy provides a gene expression profile in individual cells
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Jacquey, Frédéric. „Développement d'une technique de microspectrophotométrie rapide destinée à l'étude des signaux ioniques cytoplasmiques sur cellule unique“. Lyon 1, 1994. http://www.theses.fr/1994LYO10092.
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Un dispositif original de micro-spectrophotometrie rapide a ete developpe, permettant la mesure simultanee de la concentration en ions libres intracytoplasmiques (h#+, ca#2#+ et mg#2#+), du potentiel d'action, et de l'amplitude de la contraction, sur des cellules en culture ou isolees: un colorant sensible aux ions libres est injecte par une micro-electrode, utilisee egalement pour la mesure des potentiels membranaires et la stimulation electrique de la cellule. L'acquisition rapide des spectres d'absorption cellulaires entre 400 et 700 nm, a la cadence de 50 spectres par seconde, permet de suivre sur cellule unique les variations de concentration ionique transitoires. En utilisant l'antipyrylazo iii, sensible a la fois au calcium et au magnesium, on observe un signal bref (50 ms) debutant immediatement apres la stimulation, puis un autre 100 ms apres l'impulsion, d'une duree totale d'environ 200 ms. L'etude detaillee des spectres d'absorption montre que le premier signal est lie au calcium et le second correspond a une variation de magnesium (comprise entre 50 et 200 m). Il apparait que le signal magnesium debute toujours apres la contraction et que l'amplitude de la variation de magnesium est liee au niveau du magnesium de repos, la concentration maximale atteinte dependant peu des cellules etudiees. Des hypotheses physiologiques sont formulees pour expliquer ces phenomenes
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Seeleuthner, Yoann. „Rôle des protistes hétérotrophes marins dans le cycle du carbone océanique par génomique en cellule unique“. Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2018. http://www.theses.fr/2018SACLE002/document.
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Les eucaryotes unicellulaires (protistes), ont des rôles extrêmement importants dans les cycles biogéochimiques des océans. Tout d’abord, bien qu’en moyenne moins abondants que les cyanobactéries, les protistes photosynthétiques représentent une grande part de la production primaire nette. Étant relativement plus faciles à mettre en culture, les organismes photosynthétiques sont relativement plus étudiés et leurs génomes représentent une grande fraction des génomes de protistes marins disponibles dans les bases de données. En revanche, les organismes hétérotrophes demandent un travail beaucoup plus important pour la mise en culture et sont par conséquent beaucoup moins bien connus. De plus, la majorité des génomes de protistes hétérotrophes séquencés à ce jour concernent des organismes d’intérêt pour l’homme (parasites de plantes, organismes pathogènes), mais le choix de ces organismes comme modèles d’étude ne reflète pas leur intérêt écologique.L’objectif de cette thèse est d’étudier par une approche de génomique en cellule unique certains picoeucaryotes hétérotrophes, fortement abondants dans les océans ouverts et encore non cultivés à ce jour. Pour cela, un protocole de séquençage, d’assemblage et d’annotation de génome à partir de cellules uniques a été mis en place.Le génome de sept lignées de straménopiles a été partiellement reconstruit et annoté, permettant de confirmer de façon robuste la phylogénie des straménopiles obtenue par les marqueurs ribosomiques, mais surtout de formuler des hypothèses quant à leur spécialisation en termes de mobilité ou de mode trophique.En particulier, la comparaison des répertoires de gènes permettant la dégradation des carbohydrates indique des régimes alimentaires probablement différents chez les organismes étudiés.Par ailleurs, l’utilisation combinée de ces génomes et des séquences métagénomiques de l’expédition Tara Oceans a permis de décrire la distribution géographique de ces organismes ainsi que la distance génétique des populations à nos génomes de références. La corrélation de ces distributions avec les paramètres environnementaux mesurés aux points d’échantillonnages montrent que la température est un facteur clé de la distribution de ces micro-organismes. De plus, l’utilisation des données métatranscriptomiques de l’expédition nous a permis de distinguer différents profils d’expression – correspondant potentiellement à différents états physiologiques – chez la lignée la plus cosmopolite étudiée.En conclusion, cette thèse montre qu’il existe une forte diversité génomique à explorer chez les protistes marins hétérotrophes, permettant notamment d’émettre des hypothèses sur leurs modes trophiques. Elle démontre également l’intérêt de la génomique en cellule unique, en particulier sa complémentarité avec les approches métagénomiques et métatranscriptomiques pour la compréhension exhaustive des écosystèmes marinsUnicellular eukaryotes (protists) have important roles in the biogeochemical cycles of the ocean. First, although on average less abundant than cyanobacteria, photosynthetic protists account for a large proportion of net primary production. Since they are relatively easier to culture, photosynthetic organisms are relatively more studied and their genomes represent a large fraction of the genomes of marine protists available in databases. On the other hand, heterotrophic organisms require much more work for cultivation and are therefore much less well known. Moreover, the majority of genomes of heterotrophic protists sequenced to date concern organisms of interest to humans (plant pests, pathogenic organisms), but the choice of these organisms as study models does not reflect their ecological interest.The objective of this thesis is to study, using a single-cell genomic approach, several heterotrophic picoeucaryotes, that are highly abundant in the open oceans and have not yet been cultivated. For this purpose, a protocol for sequencing, assembling and annotation of genomes from single cells has been developed.The genomes of seven stramenopile lineages have been partially reconstructed and annotated, making it possible to confirm in a robust way the phylogeny of stramenopiles obtained by ribosomal markers, and, more important, to formulate hypotheses regarding their specialization in terms of mobility or trophic mode.Particularly, the comparison of gene repertoires of carbohydrate degradation indicates likely different food spectra in the organisms studied.In addition, the combined use of these genomes and metagenomic sequences from the Tara Oceans expedition made it possible to describe the geographical distribution of these organisms as well as the genetic distance between environmental populations and our reference genomes. The correlation of these distributions with the environmental parameters measured at the sampling points shows that temperature is a key factor in the distribution of these microorganisms. In addition, the use of metatranscriptomic data from the expedition allowed us to distinguish different expression profiles - potentially corresponding to different physiological states - in the most cosmopolitan lineage studied.In conclusion, this thesis shows that there is a strong genomic diversity to be explored in heterotrophic marine protists, allowing us to make hypotheses about their trophic modes. It also demonstrates the value of single-cell genomics, in particular its complementarity with metagenomic and metatranscriptomic approaches for the comprehensive understanding of marine ecosystems
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Mary, Pascaline. „Génération de gouttes en microfluidique pour l'étude de la cellule unique, l'extraction liquide-liquide et la vectorisation“. Phd thesis, Université Pierre et Marie Curie - Paris VI, 2009. http://pastel.archives-ouvertes.fr/pastel-00005739.
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La génération contrôlée et à haut débit de gouttes de volume caractéristique un nanolitre dans des canaux microfluidiques permet le suivi simultané de réactions dans des centaines de microréacteurs. En particulier, l'encapsulation d'une cellule par goutte ouvre la voie de l'étude de populations hétérogènes d'organismes biologiques au niveau de la cellule unique. Cette thèse décrit, dans une première partie, le développement d'un microsystème dédié à la mesure haut débit de l'expression de gênes d'intérêt de cellules individuelles isolées dans des gouttes, par la méthode de transcription inverse suivie d'une réaction de polymérisation en chaîne en temps réel. Dans une deuxième partie, la technologie de gouttes est mise à profit pour une étude fondamentale originale des transferts de masse entre une phase dispersée et une phase porteuse. Nous illustrons ce chapitre par deux applications de l'extraction liquide-liquide dans des microgouttes : la première concerne l'extraction du zinc sous forme ionique, la deuxième présente les premières étapes de la purification de l'ARN. Enfin, la dernière partie constitue une ouverture sur les applications potentielles de la génération d'émulsions micrométriques complexes pour la vectorisation de médicaments ou de vaccins par phagocytose.
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Lu, Cong. „Analyse microélectrochimique du stress oxydant à l'échelle de la cellule unique : application aux cellules cancéreuses du sein“. Phd thesis, Université Pierre et Marie Curie - Paris VI, 2012. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00828217.
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Les quantités et flux infinitésimaux de biomolécules électroactives émises par une cellule unique isolée en boite de Pétri peuvent être mesurés en temps réel par une ultramicroélectrode placée au contact de la cellule sécrétrice. Le travail présenté dans ce manuscrit a pour but d'étendre cette méthodologie analytique d'utilisation des microélectrodes de carbone platiné à l'étude du lien entre stress oxydant et l'effet de substances anti-cancéreuses (FcdiOH, DP1 et Fc-OH-TAM) sur des cellules tumorales du sein. Le signal ampérométrique est collecté par une microélectrode de carbone platiné positionnée à une centaine de nanomètres au-dessus d'une cellule tumorale du sein et incubée en présence d'espèces anticancéreuses de type ferrocifènes. La libération in situ des espèces réactives de l'oxygène (ROS) et de l'azote (RNS), i.e., H2O2, ONOO-, NO et NO2-, par ces cellules (MCF7 et MDA-MB-231) est analysée. Les études morphologiques montrent que les produits FcdiOH, DP1 et Fc-OH-TAM présentent un effet anti-prolifératif significatif. Le traitement avec Fc-diOH et surtout DP1 augmente significativement la production de ROS. Par contre, Fc (témoin) et Fc-OH-TAM n'ont pas ou très peu d'effet. Cela est assez surprenant pour Fc-OH-TAM, qui a l'effet anti-prolifératif le plus fort parmi les ferrocifènes testés. Fc-diOH et DP1, quant à eux, semblent induire une surproduction de NO° et/ou de NO2-, ainsi que du peroxyde d'hydrogène. Cette comparaison inédite entre études morphologiques et électrochimiques tend à montrer que les ferrocifènes agissent par deux voies qui sont complémentaires, soit via la formation de quinone méthide (Fc-OH-TAM), soit par réaction directe (DP1, Fc-diOH).
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Crozatier, Cécile. „Contrôle et analyse électrochimique de la réactivité biologique à l'échelle de la cellule unique dans un dispositif microfluidique“. Phd thesis, Université Paris-Diderot - Paris VII, 2007. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00178656.
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Les systèmes d'analyse miniaturisés sont particulièrement adaptés pour les analyses de cellules en faible nombre ou de cellules isolées. Une telle diminution du volume d'analyse permet une augmentation de la concentration locale et par conséquent une augmentation de la sensibilité des mesures effectuées. Les travaux présentés dans cette thèse se positionnent dans ce cadre en proposant un outil analytique novateur, couplant le contrôle dynamique des micro-environnements de la cellule par la microfluidique et l'analyse instantanée et locale des espèces en solution par l'électrochimie.Grâce au développement d'outils modulables de culture cellulaire et de manipulation de cellules vivantes dans des dispositifs microfluidiques, nous avons mis en place le contrôle dynamique stable de stimulations chimiques sur une population de cellules souches mésenchymateuses (CSM) en culture et poursuivons cette étude dans le but d'induire la réactivité cellulaire des CSM vers la voie de différenciation neuronale.
Le développement d'un microsystème intégré de détection électrochimique du stress oxydant sur cellules uniques est mis en oeuvre à travers la réalisation d'un dispositif microfluidique intégré consistant en un réseau de chambres de mesures, contenant des microélectrodes fonctionnelles, et permettant d'isoler des macrophages uniques et de les maintenir en survie pendant plusieurs dizaines de minutes, durée suffisante pour réaliser nos mesures électrochimiques. En faisant varier les conditions de mesure, comme le nombre de cellules sondées dans le même micro-environnement, la nature du stimulus ou la présence ou non de communication cellulaire avec une population voisine, nous posons les bases d'une analyse originale jamais réalisée jusqu'à présent.
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Trouchet, Amandine. „PCR digitale pour la détection et la caractérisation de micro-organismes pathogènes au niveau de la cellule unique“. Thesis, Sorbonne Paris Cité, 2016. http://www.theses.fr/2016USPCC170/document.
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Nous avons pour but de développer un système microfluidique en gouttes, capable, à l’échelle de la cellule/bactérie unique, de détecter et de co-localiser plusieurs marqueurs génétiques, en utilisant une version digitale et multiplexée de la réaction de polymérisation en chaîne (PCR). Les systèmes de PCR digitale actuellement commercialisés ne le permettent toujours pas. Un tel prototype garantira la présence de multiples marqueurs à l’intérieur d’un même génome, ce qui permettra l’identification du pathogène avec précision et un taux de faux-positifs proche de zéro. Comme première application, nous démontrerons la possibilité de co-localiser quatre gènes de virulence de la souche O157:H7 d’Escherichia coli, un pathogène majeur, qui est détecté dans des échantillons alimentaires ou provenant de fèces cliniques pouvant aussi contenir des E. coli non pathogènes porteuses d’une partie des gènes de virulence. Avant de procéder à des tests TaqMan multicolores en point final, E. coli sera d’abord encapsulée dans des gouttes micrométriques et lysée par la chaleur in situ. Notre objectif est de démontrer que ce test peut être appliqué avec succès à un petit ensemble d’échantillons cliniques ou alimentairesWe aim to develop a prototype of droplet-based microfluidic system capable of detecting and colocalizing multiple genetic markers at the single cell/bacteria level, using the Polymerase Chain Reaction (PCR) in a digital multiplexed version. This cannot be achieved using current commercial digital PCR systems, and should increase the sensitivity and reliability of the detection of pathogens. Importantly, the system will guarantee the presence of multiple markers within the same genome and enable accurate identification, and bring the false positive rate close to zero. As a first application, we will demonstrate the possibility to co-localize 3 virulence genes in the E.coli strain O157:H7, a major foodborne pathogen, which has to be detected in clinical feces samples or food samples, which may also contain non pathogenic E. coli carrying only a subset of these virulence genes. E. Coli will be encapsulated in micrometric droplets, lysed by heating in situ prior performing a multicolour end-point Taqman assay. Our objective is to demonstrate that this test can be successfully applied to real clinical or food samples
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Chen, Tong. „Développement de biocapteurs hyperfréquences microfluidiques pour la spectroscopie diélectrique non-invasive de la cellule unique : applications en cancérologie“. Toulouse 3, 2012. http://thesesups.ups-tlse.fr/2172/.
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L'analyse biologique à l'échelle de la cellule unique, permettant la compréhension des mécanismes cellulaires, est de toute importance pour les domaines de la biologie, de la médecine et en particulier pour la cancérologie. Les microtechnologies ont ouvert la perspective de tels dispositifs et de nombreuses recherches sont en cours sur le développement de systèmes d'analyse non-invasive, rapide, sans marquage ni altération des cellules. La convergence de biocapteurs hyperfréquenes avec la microfluidique permet de répondre à ces challenges. Nous avons développé conjointement (1) des micro-dispositifs hyperfréquences permettant la spectroscopie diélectrique de fluides biologiques et (2) des systèmes microfluidiques permettant la manipulation de population de populations de cellules ainsi que de cellule unique en milieu de culture. L'ingénierie des champs électromagnétiques a été menée afin d'optimiser le volume fluidique d'analyse ainsi que la sensibilité de détection. La microfabrication réalisée au LAAS-CNRS a permis le positionnement contrôlé de la cellule unique dans la zone d'analyse. Nous avons enfin démontré expérimentalement des contrastes diélectriques significatifs entre cellules cancéreuses de lymphome RL vivantes et en apoptose avec de plus une capacité de suivi longitudinal du phénomène d'apoptose. Ces travaux de recherches sur l'analyse non-invasive de la cellule unique, la capacité discriminatoire d'états biologiques différents, la possibilité de suivi temporel de mécanisme biologiques ouvrent de nouvelles perspectives d'analyse cellulaire pour la cancérologieDevelopment of microwave microfluidic bio-sensors for non-invasive dielectric spectroscopy of single cell: Applications in Cancerology. Biological analysis at the level of the single cell, allowing the understanding of cellular mechanisms, is of great importance in the fields of biology, medicine and especially in oncology. Microtechnology has opened up the prospect of such devices and many researches are underway on the development of analysis systems which are non-invasive, rapid, label-free or has no cell damage. The convergence of bio-microwave sensors with microfluidics can meet these challenges. We developed jointly (1) micro-devices for microwave dielectric spectroscopy of biological fluids and (2) microfluidic systems for manipulation of cell populations and single cell in the culture medium. The electromagnetic fields engineering was conducted to optimize the fluid volume analysis and the detection sensitivity. Microfabrication performed at LAAS-CNRS allowed controlled positioning of single cell in the analysis area. We finally demonstrated experimentally significant dielectric contrast between cancer cells alive and RL lymphoma apoptosis with more tracking capability longitudinal of apoptosis. These researches work on non-invasive analysis of single cell, the discriminatory capacity of different biological states, the possibility of temporal tracking of biological mechanisms open new perspectives for the cell analysis in cancerology
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Guille, Manon. „Détection par microélectrodes de flux atto-à femtomolaires de neuromédiateurs sur cellule unique et dans un tissu vivant“. Paris 6, 2005. http://www.theses.fr/2005PA066207.
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Eid, Joelle. „Etude du relargage du VIH-1 en temps réel à l'échelle de la cellule unique par la Viro-fluidique“. Thesis, Université de Montpellier (2022-….), 2022. http://www.theses.fr/2022UMONT007.
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Le cycle de réplication du VIH-1 débute par l’entrée du virus dans la cellule hôte et s’achève par la libération des particules virales dans le milieu extracellulaire. L’étape cruciale de libération virale reste peu étudiée car elle nécessite une étude à l’échelle de la cellule unique. En effet, la quantification de la production virale réalisée à partir de populations de cellules dont les cinétiques de réplication du VIH-1 sont très hétérogènes, donnerait des résultats approximatifs. C’est pourquoi nous avons développé une approche microfluidique qui permet d’étudier la dynamique du relargage du VIH-1 en temps réel à l’échelle de la cellule unique.Les travaux réalisés durant ma thèse portent sur la combinaison de la virologie et la microfluidique continue afin de développer une technologie sensible et fiable pour visualiser et quantifier la production virale d’une cellule unique en temps réel. Trois types de puces ont été construites. La puce de capture nous a permis de déterminer les paramètres physiques et biologiques pour immobiliser une cellule (~10 µm) unique qui produit des VLP-GFP. La puce de détection, dont la performance a été comparée avec la technique du Nanoparticle Tracking Analysis, s’est avérée un outil précieux pour une quantification précise et reproductible de VLPs fluorescents (~140 nm) à l’échelle de la particule unique dans des surnageants de culture cellulaire. Et enfin, la puce multiplexe, qui couple les deux fonctions (capture de cellules uniques et détection de virus) m’a permis d’étudier la cinétique de relargage virale en temps réel, à l’échelle de la cellule unique. Des lignées HeLa et HEK 293 productrices de VLPs-GFP m’ont servi de modèles d’études. Pour la première fois la cinétique de production virale a pu être mesurée avec en moyenne 50 VLPs / cellule / h. Ce résultat a été validé par la mesure des virus produits par les mêmes cellules cultivées en boite de culture, confirmant la fiabilité et la sensibilité de notre approche. De façon intéressante, le profil de la cinétique du relargage montre un processus périodique (période ~4min) qui pourrait être expliqué par la présence d’une ou de plusieurs étapes limitantes dans le mécanisme de biogenèse des virions. Les nouveaux outils développés ici apportent des informations inédites sur la cinétique du relargage du VIH-1. Ils pourront être utilisés ou facilement adaptés pour l’étude d’autres pathogènes ou des vésicules extracellulairesUpon its entry, HIV-1 replicates and produces new viral particles that are released into the extracellular environment. The crucial step of virus release remains poorly understood because it requires the study at the single cell level. Indeed, quantification of viral production from cell populations with very heterogeneous HIV-1 replication kinetics would give approximate results. This is why we have developed a microfluidic approach that allows the study of HIV-1 release dynamics in real-time at the single cell level. In this study, continuous microfluidics was combined to the virology in order to develop a sensitive and reliable technology to visualize and quantify virus production by a single cell. Three types of chips were fabricated: the trapping chip allowed us to determine the physical and biological parameters that ensure single cell trapping (~10 µm) producing VLPs-GFP. The detection chip, whose performance was compared with the Nanoparticle Tracking Analysis technique, proved to be a valuable tool for accurate and reproducible quantification of fluorescent VLPs (~140 nm) at the single particle scale in cell culture supernatants. The multiplex chip, which combines the two previous chips, allowed us to study in real-time the virus release kinetics at the single cell scale. VLPs-GFP producing HeLa and HEK 293 cell lines were used as study models. For the first time, viral production kinetics could be measured with an average of 50 VLPs / cell / h that was validated by the measurement of viruses produced by the same cells grown in culture dish, confirming the reliability and sensitivity of our approach. Interestingly, the release kinetics profile shows a periodic process (period ~4min) that could be explained by the presence of one or more limiting steps in the virion biogenesis mechanism. The new tools developed here provide novel information on the kinetics of HIV-1 salting-out. They can be used or easily adapted for the study of other pathogens or extracellular vesicles
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Martineau, Eugénie. „Linking single cell directionality to dynamic multicellular transitions in Myxococcus xanthus : a multiscale analysis“. Thesis, Aix-Marseille, 2018. http://www.theses.fr/2018AIXM0089.
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La δ-proteobactérie Myxococcus xanthus est étudiée depuis des décennies pour sa capacité à s’auto-organiser en réponse à des stimuli environnementaux. Cette bactérie colonise des niches écologiques favorables grâce à sa capacité à se mouvoir sur des surfaces. Cette motilité lui permet d’avoir un comportement prédateur envers des organismes proies, alors qu’en absence de nutriments, elle met en place un processus développemental permettant la formation de corps fructifères contenant des myxospores résistant aux stress environnementaux. Tous ces comportements multicellulaires requièrent un contrôle dynamique de la polarité de la cellule, établi par trois protéines polaires : MglA, MglB et RomR. Ensemble, elles définissent la direction de la cellule, qui peut être rapidement inversée sous l’action du système chimiotactique Frz (réversion). Dans ce travail de thèse, à travers une approche expérimentale et computationnelle, nous avons mis en évidence que le système de régulation forme un nouveau type d’oscillateur protéique, contrôlé par deux protéines RomR et FrzX, qui agissent ensemble et de manière complémentaire pour déclencher la réversion à l’arrière des cellules. L’architecture unique de ce système permet une réponse très large à différents stimuli, essentielle pour de nombreux comportements multicellulaires. Afin de comprendre l’importance de ces transitions, nous avons mis au point un outil à haute résolution spatiale et temporelle afin de connecter les cellules individuelles aux comportements multicellulaires, et ainsi comprendre le rôle du système Frz dans un modèle multicellulaire de prédationThe δ-proteobacteria Myxococcus xanthus has been a model of study for decades for its self-organized behavior as a response of environmental stimuli. It colonizes favorable ecological niches by using surface motility. In particular, this motility allows M.xanthus to predate collectively over prey microorganisms, while under starvation they start a developmental process to form macroscopic fruiting bodies, filled with environmental resistant myxospores. All these multicellular behaviors require a dynamic control of the cell polarity established by the polarity proteins MglA, MglB and RomR. Together, they define the direction of movement of the cell, which can be rapidly inverted by the Frz chemosensory system (reversion). In this thesis work, through combined computational/experimental approaches, we highlight that the regulation system forms a new type of biochemical oscillator, controlled by two proteins RomR and FrzX, which act together through complementary action to trigger the reversion at the lagging pole. The unique architecture of this system allows a wide response to various stimuli, which could be very beneficial for collective cell behaviors. To understand the importance of these transitions, we have developed a new high-resolution single cell assay linking single cMARTINEAU EUGENIE 2018AIXM0089/016ED62 2018/03/21 62 SCES SCHell behaviors to multicellular structures at unprecedented spatial and temporal resolutions. This way, we have investigated the role of the newly identified biochemical oscillator in the multicellular model of predation
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Fiszman, Nicolas. „Etude de cinétique de la traduction eucaryote à l'échelle de la molécule unique“. Phd thesis, Palaiseau, Institut d'optique théorique et appliquée, 2013. http://pastel.archives-ouvertes.fr/pastel-00939858.
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La synthèse des protéines est un mécanisme central de la vie cellulaire dont la compréhension est un enjeu du domaine biomédical. Les études en molécule unique permettent d'observer chaque système réactionnel individuellement et donnent accès à des évènements asynchrones difficilement observables en mesure d'ensemble, tels la traduction de protéines.Cette thèse présente les premiers résultats en molécule unique sur la traduction par un ribosome eucaryote (mammifère). Nous observons les systèmes traductionnels grâce à des marqueurs fluorescents liés à des oligonucléotides pouvant s'hybrider sur les séquences d'ARN traduites. L'observation de ces marqueurs est faite par microscopie de fluorescence en onde évanescente (TIRF), les ARN étant fixés sur une lamelle de microscope. En lisant l'ARN, le ribosome détache les marqueurs, et leurs instants de départs donnent des informations sur le passage du ribosome à différentes positions sur l'ARN. Cette méthode permet d'obtenir des données cinétiques sur un grand nombre de systèmes traductionnels en parallèle pouvant alors être interpolées par des lois de probabilité. Nous obtenons par cette méthode des mesures de la cinétique in vitro de l'élongation eucaryote et nous observons un délai dû à une initiation non-canonique. En effet, nous complexons le ribosome sur l'ARN grâce à une structure de type IRES. Dans nos conditions d'expérience, l'incorporation d'un acide aminé prend environ une seconde tandis que cette structure induit un retard à la traduction de plusieurs dizaines de secondes. Ces résultats ouvrent des perspectives d'étude cinétique dans des cas plus complexes tels le franchissement de structures secondaires de l'ARN.
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Rodrigues, Peixoto Antonio José. „Stratégies de différenciation des lymphocytes T CD8 intervenant au cours d'une réponse immunitaire in vivo : étude au niveau d'une cellule unique“. Paris 5, 2005. http://www.theses.fr/2005PA05N20S.
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Ce travail a consisté en la caractérisation de la différenciation des cellules T CD8 après immunisation in vivo. Dans un premier temps nous avons développé des outils nécessaires pour cette étude : La single-cell multiplex quantitative RT-PCR. Cette méthode nous a permis d'avoir un nouveau regard sur la différenciation des cellules T CD8 in vivo. L'acquisition de l'activité cytolytique par les cellules T naïves après immunisation est acquise uniquement lorsque les cellules uniques co-expriment des molécules cruciales pour la fonction effectrice. De plus, ceci n'est pas un phénomène synchrone. La génération des cellules memoires n'est pas suivie d'une différentiation terminale. En effet, plusieurs re-immunisation induisent l'accumulation et diversification des fonctions effectrices exprimées par les cellules mémoires. En conclusion, nos résultats imposent la redéfinition des étapes et phénomènes intervenant au cours de la différenciation des cellules T CD8 après immunisation in vivoThis work consisted in the study of the CD8 T cell differentiation after immunization in vivo. Due to the absence of appropriate methods to pursue this study, we have developed the necessary tools : the single cell quantitative RT-PCR. The use of this methodology has allowed us to gain a completely new insight into the differentiation of CD8 T cells during immune responses in vivo. First, cytotoxicity is only acquired once the necessary functions are co-expresseded by individual T cells after immunization. Moreover, this process is not synchronous and individual T cells engage differently in the acquisition of effector functions. Second, the generation of memory T cells is not followed by a terminal differntiation. Re-immunisation induced the accumulation and diversification of effector functions expressed by individual memory T cells. In summary, our results impose a redefinition of the stages of immune responses and challenge the current definition of memory T cells
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Geisler, Hubert. „Structuration d'hydrogels thermoactivables pour l'analyse de cellules uniques“. Electronic Thesis or Diss., Université Paris sciences et lettres, 2020. http://www.theses.fr/2020UPSLS001.
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Dans cette thèse est présentée une nouvelle technologie microfluidique de capture de cellules uniques basée sur l’utilisation d’hydrogels thermoactivables. Nous utilisons notamment le PolyNIPAM, un polymère dont le volume est augmenté dans l'eau de 400% lorsque la température est inférieure à 32°C et est dégonflé lorsque la température est supérieure à 34°C. Nous exploitons ce gonflement réversible pour ouvrir et fermer des compartiments intégrés dans une chambre microfluidique.Le greffage et la structuration de ces motifs d’hydrogel repose sur la chimie click thiol-ène, initiée par voie thermique ou par irradiation UV. Nous avons développé des méthodes et procédés de microfabrication dans le but de diversifier les substrats d’accroche (du verre vers le PDMS, COC, PMMA, etc), d’élargir la gamme des épaisseurs des structures réalisables (de quelques microns vers la dizaine de microns d’épaisseur) et de renforcer nos connaissances concernant l'incidence de la fabrication sur le comportement de l’hydrogel. Un protocole de photolithographie robuste est finalement obtenu permettant le design de toute sorte de motif 2D sur différents choix de substrat. Une application possible détaillée par la suite est le développement de ces puces microfluidiques capables de capturer des cellules uniques dans des compartiments en hydrogel. (confidentiel)We present in this work a new microfluidic technology aiming at isolating single cells by the use of thermoactuable polymers. One of the polymers we use is polyNIPAM, a polymer that can expand its volume by 400% in water when the temperature is set under 32°C and can shrink down when it is set over 34°C. We use this reversible swelling capability to open and close compartments embedded in a microfluidic chip.Grafting and structuring these hydrogel features relies on thiol-en click chemistry, initiated thermally or by UV irradiation. We have developed methods and microfabrication protocols in order to diversify the substrate materials (from glass to PDMS, COC, PMMA, etc), to expand the structures thickness range (from few microns to a tenth of microns) and to strengthen our knowledge regarding the fabrication impact on the hydrogel’s behavior. A robust protocol of photolithography has finally been worked on allowing the design of any type of 2D features on a large choice of substrates.One of the realistic applications detailed here is the development of microfluidic chips aiming at isolating single cells in hydrogel compartments. (confidential)
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Ben, Meriem Zacchari. „Memory of stress response in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae“. Thesis, Sorbonne Paris Cité, 2018. http://www.theses.fr/2018USPCC311.
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La mémoire cellulaire est une capacité critique dont font preuve les micro-organismes pour s'adapter aux fluctuations environnementales potentiellement néfastes. Chez l'eucaryote unicellulaire S. cerevisiae, il a été montré à l’échelle d’une population que la mémoire cellulaire peut prendre la forme d'une réponse plus rapide ou moins prononcée suite à des stress répétés. Nous présentons ici une étude sur la façon dont les levures réagissent à des stress hyperosmotiques de courte durée à l’échelle de la cellule unique. Nous avons analysé le comportement dynamique du promoteur STL1, exprimé en condition de stress osmotique, et fusionné à un rapporteur fluorescent en faisant usage de microfluidique et de microscopie à fluorescence. Nous avons établi que pSTL1 présente une variabilité dynamique dans ses activations successives après deux stress courts. Malgré cette variabilité, la plupart des cellules présentent une mémoire des stress passés caractérisée par une diminution de l'activité de pSTL1. Nous avons montré que cette mémoire ne nécessite pas de nouvelle synthèse de protéines. L'emplacement génomique est important pour cette mémoire puisque le déplacement du promoteur vers un domaine chromatinien péricentromérique entraîne une diminution de sa force transcriptionnelle ainsi que la perte de la mémoire. Nos résultats indiquent aussi une implication non rapportée du complexe SIR sur l'activité de pSTL1 lorsqu'il est déplacé dans le domaine péricentromérique, dans nos conditions expérimentales. Cette étude fournit une description quantitative d'une mémoire cellulaire qui inclut la variabilité cellulaire et prend en compte la contribution de la structure de la chromatine sur la mémoire du stress. Nos travaux pourraient servir de base à des études plus larges sur le positionnement des gènes de réponse au stress en positions subtélomériques dans la levure, tant d'un point de vue génétique qu'évolutifCellular memory is a critical ability displayed by micro-organisms in order to adapt to potentially detrimental environmental fluctuations. In the unicellular eukaryote S. cerevisiae, it has been shown at the population level that cellular memory can take the form of a faster or a decreased response following repeated stresses. We here present a study on how yeasts respond to short, pulsed hyperosmotic stresses at the single-cell level. We analyzed the dynamical behavior of the stress responsive STL1 promoter fused to a fluorescent reporter using microfluidics and fluorescence time-lapse microscopy. We established that pSTL1 displays a dynamical variability in its successive activations following two short and repeated stresses. Despite this variability, most cells displayed a memory of past stresses through a decreased activity of pSTL1 upon repeated stresses. We showed that this memory does not require do novo protein synthesis. Rather, the genomic location is important for the memory since promoter displacement to a pericentromeric chromatin domain leads to its decreased transcriptional strength and to the loss of the memory. Interestingly, our results points towards an unreported involvement of the SIR complex on the activity of pSTL1 only when displaced to the pericentromeric domain in our experimental conditions. This study provides a quantitative description of a cellular memory that includes single-cell variability and points towards the contribution of the chromatin structure in stress memory. Our work could serve as a basis to broader studies on the positioning of stress response genes at subtelomeric positions in the budding yeast, from a genetic point of view as well as an evolutionary one
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Ducousso, Mathieu. „Acoustique picoseconde dans une cellule biologique individuelle“. Phd thesis, Université Sciences et Technologies - Bordeaux I, 2010. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00537030.
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L'acoustique picoseconde est une technique qui permet de générer et de détecter des ondes acoustiques de longueur d'onde submicrométrique par l'utilisation d'impulsions lumineuses ultrarapides (100 fs). Si la technique commence à être appliquée industriellement pour le contrôle non-destructif de films solides micrométriques, comme les microprocesseurs, très peu d'études concernent son application aux milieux liquides ou mous, malgré son potentiel unique pour les mesures acoustiques très hautes fréquences (supérieur à la dizaine de GHz). Ce travail de thèse dresse un premier panorama d'applications possibles de la technique d'acoustique picoseconde pour l'étude d'une cellule biologique unique, dont l'épaisseur peut être d'une centaine de nanomètres à quelques micromètres. Les résolutions atteintes permettent des applications pour l'imagerie et la tomographie acoustique d'une cellule unique par la détermination locale de ses propriétés physiques. Un modèle de simulation analytique est développé pour aider à la compréhension des signaux détectés et pour la résolution du problème inverse. La génération acoustique est simulée en résolvant les équations couplées de diffusion de la chaleur et de la propagation acoustique. La détection optique est ensuite étudiée en résolvant l'équation de Maxwell où les phénomènes thermiques et acoustiques perturbent l'indice optique du matériau. Pour les besoins expérimentaux, une enceinte biologique, étanche et thermostatée, est conçue. De même, le montage laser est adapté pour permettre une détection bicolore de l'onde acoustique se propageant dans la cellule. Enfin, un microscope combinant la visualisation des cellules par épifluorescence au dispositif laser expérimental est développé. Ce dernier permet de localiser précisément les éléments subcellulaires de la cellule, pour ensuite les étudier par acoustique picoseconde. La démonstration du potentiel de la méthode pour l'imagerie cellulaire et l'évaluation de sa sensibilité est faite sur cellule végétale. Ensuite, une mesure quantitative des propriétés viscoélastiques de cellules ostéoblastes (MC3T3-E1), adhérentes sur un matériau mimant une prothèse de titane, est réalisée. Puis, l'effet du peptide RGD et de la protéine BMP-2 sur les propriétés viscoélastiques de la cellule ostéoblaste est quantifié. Ce travail est réalisé en partenariat avec une équipe de recherche en bio-ingénierie et reconstruction tissulaire, l'U577.
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Brisset, Sophie. „Apport de l'hybridation génomique comparative (CGH) sur puce en cytogénétique constitutionnelle : applications à l'étude de remaniements télomériques et à l'analyse chromosomique d'une cellule unique“. Paris 5, 2006. http://www.theses.fr/2006PA05N03S.
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L'hybridation génomique comparative (CGH) sur chromosomes et sur puce à ADN (CGH microrray) permettent une analyse globale des déséquilibres chromosomiques du génome. La première partie de ce travail a concerné l'étude de remaniements télomériques par CGH sur puce. Nous avons analysé par les deux techniques de CGH des fœtus à nuque épaissie. La CGH sur puce nous a permis de caractériser précisément un remaniement chromosomique déséquilibré diagnostiqué chez un fœtus à nuque épaissie. La deuxième partie a concerné l'analyse CGH sur une cellule unique. Une première étape a été la mise au point d'une méthode d'amplification de l'ADN de lymphocytes isolés, normaux et trisomiques 21, par DOP-PCR. La CGH sur puce a donné un profil corrélant avec l'anomalie chromosomique attendue. Ainsi, l'analyse chromosomique d'une cellule unique ou d'un petit groupe cellulaire apparaît prometteuse, pouvant être appliquée dans différents domaines tels que le diagnostic prénatal ou la cancérologieComparative genomic hybridisation (CGH) on metaphase spreads and microarray CGH are genome-wide analyses of DNA copy number imbalances. First of all, we studied telomeric rearrangements by microarray CGH. Fetuses with increased nuchal translucency have been analysed with conventional and microarray CGH. Precise characterisation of a de novo unbalanced chromosomal abnormality has been achieved using microarray CGH. Secondly, we performed CGH analysis of a single cell. A reliable DOP-PCR protocol have been developed to amplify single lymphocytes DNA. Trisomy 21 has been detected on a single lymphocyte by microarray CGH. Chromosomal analysis of a single cell or few cells is promising and should be applied in prenatal diagnosis or cancer
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Foulon, Sophie. „Développement du séquençage ARN ciblé sur cellules uniques en microfluidique de gouttes et applications“. Thesis, Paris Sciences et Lettres (ComUE), 2019. http://www.theses.fr/2019PSLET037.
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Les technologies d'analyse à l'échelle de la cellule unique ont vu le jour il y a quelques années et sont depuis en constante évolution. Ces technologies permettent de mieux comprendre le fonctionnement d'ensemble de cellules très hétérogènes. Elles permettent par exemple de découvrir et suivre des sous types cellulaires, avec des applications en cancérologie ou encore en neurobiologie. Nous avons développé une technologie pour étudier le profil d'expression de gènes d'intérêt au niveau d'une cellule unique, en utilisant la microfluidique en gouttes. En limitant le nombre de gènes étudiés comparé aux technologies commerciales de transcriptome entier, l’approche ciblée a plusieurs avantages potentiels : gagner en profondeur de séquençage, augmenter le nombre de cellules étudiées, optimiser la détection pour les bas niveaux d’expression, tout en réduisant la complexité des données et des coûts. Le ciblage est parfois indispensable, notamment lorsque les ARNs ne portent pas de séquence d’amorce générique, comme dans le cas des ARNs viraux. Deux applications sont présentées : l'analyse de l'inflammation des cellules immunitaires du cerveau aux premières étapes du développement, ainsi que l'étude de la recombinaison génétique chez le virusSingle cells technologies were introduced a few years ago and have been dramatically evolving ever since. These technologies have revolutionized biology, making it possible to better understand how heterogeneous cell systems works. For example, they permit to discover and follow cell subtypes, with applications in oncology or neurobiology. We have developed a technology to study the expression profile of genes of interest at the level of a single cell, using droplet-based microfluidics. By limiting the number of genes studied compared to commercial whole-transcriptome technologies, the targeted approach has several potential benefits: gaining deeper sequencing, increasing the number of cells studied, optimizing detection for low levels of expression, while reducing the complexity of data and costs. Targeting is sometimes essential, especially when the RNAs do not carry a generic primer sequence, as in the case of viral RNAs. Two applications are presented: the analysis of inflammation of the immune cells of the brain in the early stages of development, as well as the study of genetic recombination in the virus
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Aquino, Yann. „Bases génétiques et évolutives de la variabilité interpopulationnelle de la réponse immunitaire au SARS-CoV-2“. Electronic Thesis or Diss., Sorbonne université, 2023. http://www.theses.fr/2023SORUS488.
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Tous les humains ne sont pas égaux face au SARS-CoV-2. Les bases génétiques et immunologiques de ces différences inter-individuelles commencent à être déchiffrées, mais les prédicteurs de différences immunitaires face au SARS-CoV-2 entre populations restent méconnus. Dans ce contexte, nous rapportons des données de séquençage d'ARN en résolution cellule unique sur des cellules mononucléaires du sang périphérique provenant de 222 donneurs sains de diverses origines, qui ont été stimulées par le SARS-CoV-2 ou le virus de la grippe. Nous montrons que le SARS-CoV-2 induit une activité moins forte, mais plus hétérogène, des gènes stimulés par l'interféron par rapport au virus de la grippe, ainsi qu'une signature pro-inflammatoire unique dans les cellules myéloïdes. Les réponses transcriptionnelles aux virus présentent des différences marquées entre populations, principalement dues à des changements dans la composition cellulaire, y compris une différenciation lymphoïde accrue associée à une infection latente par le cytomégalovirus. Les loci associés à des traits quantitatifs d’expression (eQTLs), ainsi que les analyses de médiation, révèlent un large effet de la composition cellulaire sur les disparités de réponses immunitaires entre populations, avec des variants génétiques exerçant un fort effet sur des loci spécifiques. De plus, nous montrons que la sélection naturelle a accru les différences de réponse immunitaire entre populations, en particulier pour les variants associés à la réponse au SARSCoV-2 chez les populations d’Asie de l’Est, et nous montrons les mécanismes cellulaires et moléculaires par lesquels l'introgression néandertalienne a modifié les fonctions immunitaires, telles que la réponse des cellules myéloïdes aux virus. Enfin, les analyses de colocalisation et d'association transcriptomique à l'échelle du génome révèlent un chevauchement entre la base génétique des réponses immunitaires au SARS-CoV-2 et la gravité de la COVID-19, fournissant des informations sur les facteurs contribuant aux disparités actuelles dans le risque de COVID-19Humans display substantial interindividual clinical variability after SARS-CoV-2 infection, the genetic and immunological basis of which has begun to be deciphered. However, the extent and drivers of population differences in immune responses to SARS-CoV-2 remain unclear. Here we report single-cell RNA-sequencing data for peripheral blood mononuclear cells—from 222 healthy donors of diverse ancestries—that were stimulated with SARS-CoV-2 or influenza A virus. We show that SARS-CoV-2 induces weaker, but more heterogeneous, interferon-stimulated gene activity compared with influenza A virus, and a unique pro-inflammatory signature in myeloid cells. Transcriptional responses to viruses display marked population differences, primarily driven by changes in cell abundance including increased lymphoid differentiation associated with latent cytomegalovirus infection. Expression quantitative trait loci and mediation analyses reveal a broad effect of cell composition on population disparities in immune responses, with genetic variants exerting a strong effect on specific loci. Furthermore, we show that natural selection has increased population differences in immune responses, particularly for variants associated with SARS-CoV-2 response in East Asians, and document the cellular and molecular mechanisms by which Neanderthal introgression has altered immune functions, such as the response of myeloid cells to viruses. Finally, colocalization and transcriptome-wide association analyses reveal an overlap between the genetic basis of immune responses to SARS-CoV-2 and COVID-19 severity, providing insights into the factors contributing to current disparities in COVID-19 risk
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Ozier-Lafontaine, Anthony. „Kernel-based testing and their application to single-cell data“. Electronic Thesis or Diss., Ecole centrale de Nantes, 2023. http://www.theses.fr/2023ECDN0025.
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Les technologies de sequençage en cellule unique mesurent des informations à l’échelle de chaque cellule d’une population. Les données issues de ces technologies présentent de nombreux défis : beaucoup d’observations en grande dimension et souvent parcimonieuses. De nombreuses expériences de biologie consistent à comparer des conditions.L’objet de la thèse est de développer un ensemble d’outils qui compare des échantillons de données issues des technologies de séquençage en cellule unique afin de détecter et décrire les différences qui existent. Pour cela, nous proposons d’appliquer les tests de comparaison de deux échantillons basés sur les méthodes à noyaux existants. Nous proposons de généraliser ces tests à noyaux pour les designs expérimentaux quelconques, ce test s’inspire du test de la trace de Hotelling- Lawley. Nous implémentons pour la première fois ces tests à noyaux dans un packageR et Python nommé ktest, et nos applications sur données simulées et issues d’expériences démontrent leurs performances. L’application de ces méthodes à des données expérimentales permet d’identifier les observations qui expliquent les différences détectées. Enfin, nous proposons une implémentation efficace de ces tests basée sur des factorisations matricielles de type Nyström, ainsi qu’un ensemble d’outils de diagnostic et d’interprétation des résultats pour rendre ces méthodes accessibles et compréhensibles par des nonspécialistesSingle-cell technologies generate data at the single-cell level. They are coumposed of hundreds to thousands of observations (i.e. cells) and tens of thousands of variables (i.e. genes). New methodological challenges arose to fully exploit the potentialities of these complex data. A major statistical challenge is to distinguish biological informationfrom technical noise in order to compare conditions or tissues. This thesis explores the application of kernel testing on single-cell datasets in order to detect and describe the potential differences between compared conditions.To overcome the limitations of existing kernel two-sample tests, we propose a kernel test inspired from the Hotelling-Lawley test that can apply to any experimental design. We implemented these tests in a R and Python package called ktest that is their first useroriented implementation. We demonstrate the performances of kernel testing on simulateddatasets and on various experimental singlecell datasets. The geometrical interpretations of these methods allows to identify the observations leading a detected difference. Finally, we propose a Nyström-based efficient implementationof these kernel tests as well as a range of diagnostic and interpretation tools
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Nissant, Antoine. „Caractérisation des canaux chlorures de la membrane basolatérale du néphron distal de souris“. Paris 6, 2005. http://www.theses.fr/2005PA066450.
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Santamaria, Kathleen. „Etude de l’hétérogénéité des centrocytes humains à travers l’expression du CD23 : différenciation en plasmablastes et expression d’une signature minimale transcriptionnelle au niveau cellule-unique comportant DEC2“. Thesis, Rennes 1, 2020. http://www.theses.fr/2020REN1B038.
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La différenciation terminale des lymphocytes B à travers le centre germinatif conduit à la production de cellules sécrétrices d’anticorps : les plasmocytes (PC) à longue durée de vie et de haute affinité pour l’antigène. Cette réaction implique la formation d’une microstructure anatomique qui comprend une zone sombre : lieu d’intenses proliférations des centroblastes et de maturation d’affinité de leur BCR, et une zone claire dans laquelle ont lieu les commutations de classes isotypiques du BCR et la sélection des centrocytes (CC). Ce processus est finement contrôlé par les lymphocytes T folliculaires auxiliaires (Tfh) notamment à travers la production de molécules comme l’IL-4, le CD40L et l’IL-21. Ce travail de thèse s'intéresse à l'expression du CD23 à la surface des CC lors de leur métamorphose en PC. J'ai d’abord montré que l'expression de ce récepteur de faible affinité aux IgE est régulée par les signaux Tfh : CD40L et IL-4. De plus j'ai mis en évidence que les CC humains exposés aux signaux Tfh mais négatifs pour le CD23 sont capables de se différencier en PC. Dans ce cadre, la signature transcriptionnelle de ces progéniteurs de PC a été étudiée à l'échelle de la cellule unique et a permis d’identifier un gène jusqu’alors jamais décrit dans les PC qui code pour le facteur de transcription DEC2 et dont la fonction reste à déterminer. J'ai par ailleurs étudié l'expression du CD23 dans le lymphome folliculaire et mis en évidence qu’il existe des différences entre les populations tumorales positives et négatives pour le CD23, suggérant que les cellules CD23neg ont un avantage de survie et une capacité de différenciation supérieure en culture que les cellules CD23posTerminal B cell differentiation through the germinal center leads to the production of antibody-secreting cells: plasma cells (PC) with a long lifespan and high affinity for the antigen. This reaction involves the formation of an anatomical microstructure that includes a dark zone: site of intense proliferation and affinity maturation of the BCR of the centroblasts, and a light zone in which the class switch recombination of the BCR and centrocyte (CC) selection take place. This differentiation is finely controlled by follicular helper T cells (Tfh) that produce molecules such as IL-4, CD40L and IL-21. This phD work focus on the CD23 expression on the surface of CC during their metamorphosis into PC. Firstly, I showed that the expression of the low affinity IgE receptor is regulated by Tfh derived IL-4 and CD40L. Moreover, I showed that CC exposed to Tfh signals and which do not express the CD23 were the ones that have the ability to differentiate into PC. In this context, I identified at the single cell level a transcriptional signature expressed specifically by these cells which contains a gene never described in PC, encoding the transcription factor DEC2 whose function remains to be determined. In addition, I studied CD23 expression in follicular lymphoma and showed the existence of differences between these two populations, suggesting a preferential survival and differentiation of CD23neg cells compared to CD23pos cells
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Koh, Alaric C. W. „Analyses électrochimiques d’espèces réactives de l’oxygène et de l’azote produites par un macrophage immunostimulé“. Paris 6, 2009. http://www.theses.fr/2009PA066465.
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La libération des espèces réactives de l’oxygène de l’azote (ROS/RNS) par des macrophages immunostimulés a été suivie en temps réel avec des microélectrodes de carbone platiné. Les mesures à potentiels constants ont montré que des macrophages activés par IFN-γ/LPS et/ou PMA produisent principalement le ONOO−, NO•, NO2− et/ou H2O2. Sous activation par IFN-γ/LPS, la majorité de ces espèces semblait être dérivée d’une co-production de NO• et d’O2•− par la NOS inductible. Ce travail a fourni la première preuve directe de la libération d’ONOO− par les macrophages immunostimulés. De plus, des mesures chronoampérométriques à triple saut de potentiel ont montré des variations temporelles de la libération de chaque espèce. Une augmentation d’H2O2 en présence de [MnII(pyane)Cl2] a été observée, démontrant son rôle comme mimique de SOD. Cependant, des atténuations d’ONOO− et de NO• ont aussi été observées, accompagné par une augmentation de NO2−. Ceci démontre une activité NO• dismutase de ce complexe, aussi que sa réactivité envers l’ONOO−, ce que nous avons ensuite confirmé par des études électrochimiques in vitro.
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Rey, Camille. „Cytosolic bacterial subversions of mucosal immunity : a study of microfold (M) cell and enterocyte infections by S. flexneri and L. monocytogenes“. Thesis, Sorbonne Paris Cité, 2018. https://theses.md.univ-paris-diderot.fr/Rey_camille_1_va_20180321.pdf.
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Les pathogènes bactériens cytosoliques S. flexneri et L. monocytogenes échappent à l'immunité extracellulaire de la muqueuse en induisant leur entrée et leur mode de vie intracellulaire dans l'épithélium intestinal. Dans leur cellule hôte, ils peuvent rapidement s’échapper de leur vacuole d'internalisation, envahir le cytosol et éviter l’élimination par la dégradation cellulaire en se propageant directement de cellule à cellule.Afin d’initier l’invasion intestinale, ces deux pathogènes ciblent les cellules M préleveusesd'antigènes qui recouvrent les sites d'induction immunitaire. Toutefois le mode de vie de ces pathogènes dans les cellules M, le mécanisme de propagation de l'infection à partir de ce pointd’entrée vers les entérocytes voisins ainsi que le mécanisme d'évasion de l'induction de l'immunité adaptative sont très peu caractérisés. Dans cette étude, nous présentons un nouveau modèle physiologique d'infection apicale par S. flexneri de cellules M humaines in vitro, qui récapitule les étapes précoces de l'invasion de l’épithelium intestinal par le pathogène. Nous montrons qu'une population de S. flexneri est rapidement transcytosée, en 15 minutes, à travers les cellules M. Nous amenons une nouvelle approche microscopie en temps réel de l'infection des cellules M, qui révèle qu'une deuxième sous-population de bactéries induit son entrée plus tardivement dans les cellules M, accompagnée de projections membranaires apicales, suivie par une rupture vacuolaire et l’initiation de la réplication cytosoliique des bactéries dans les cellules M. Nous découvrons que S.flexneri a également la capacité de se propager des cellules M aux cellules voisines par la motilité liéeà l'actine, qui constitue la voie principale de propagation basolatérale de l'infection. En étendant notre étude à L. monocytogenes, nous observons qu’à la différence de S. flexneri, cette bactérie détourne le processus de transcytose à travers les cellules M en utilisant le facteur de virulence ActA. Cependant, nous notons que L. monocytogenes se propage dans l'épithélium exclusivement par la motilité liée à l'actine, de façon similaire à S. flexneri. Nous proposons que la subversion de la voie de transcytose au travers des cellules M et l'évitement des tissus immunitaires sous-jacents sont des caractéristiques partagées par les pathogènes cytosoliques, leur permettant d'échapper à l'induction de l'immunité adaptative.Par ailleurs, nous présentons une approche de tri basée sur la fluorescence d’entérocytes individuels aux stades successifs de l'infection par S. flexneri, combinée avec une analyse transcriptomique parPCR quantitative en multiplex. Cette méthode révèle la production de réponses distinctes chez les entérocytes hôtes en fonction de la localisation subcellulaire du pathogène. Nous observons la production d'une réponse bystander forte, impliquant de multiples voies de signalisation corrélées chez les enterocytes non infectés. De plus nous détectons la production de profils de réponses distincts chez l’hôte en fonction de la localisation vacuolaire ou cytosolique de la bactérie chez les entérocytes infectés. Nous montrons que le facteur de virulence OspF contribue à atténuer les réponses des entérocytes infectés et à perturber des voies de signalisation autrement corrélées chez l’hôte.En conclusion, nos études exposent de nouvelles stratégies de subversion immunitaire liées aux modes de vie intracellulaires de bactéries entériques cytosoliques, soulignant l'importance des cellules M dans la propagation bactérienne initiale et le détournement de l'immunité adaptative, ainsi que l'organisation et la perturbation des réponses immunitaires innées chez les entérocytes au cours de l’infectionCytosolic bacterial pathogens S. flexneri and L. monocytogenes subvert extracellular mucosal immunity by inducing their uptake and intracellular lifestyle in the intestinal epithelium. Within the host, they are able to rapidly escape their internalization vacuole, invade the cytosol and escape cellular degradation by spreading from cell-to-cell. Antigen sampling M cells overlying immune induction sites are targeted by these pathogens to initiate intestinal invasion. However, the intracellular lifestyle of these pathogens within M cells, the mechanism of spread of the infection toneigh boring enterocytes from this entry point and the mechanism of S. flexneri evasion of adaptive immunity is poorly characterized. We present a novel physiologic model of apical S. flexneri infection of human in vitro M cells which recapitulates the early steps of epithelial invasion. We show that a subset of S. flexneri is rapidly transcytosed, within 15 minutes, through M cells. We establish a newtime-lapse imaging approach of M cell infections, which reveals that another subset of bacteriainduces apical ruffling upon entry, vacuolar rupture and replicates within the M cells at later timepoints. Remarkably, these bacteria are able to spread from M cells to neighboring cells by actinbased-motility, which we show constitutes the main route of basolateral spreading of the infection.As we extend our study to L. monocytogenes, we observe that unlike S. flexneri, the bacterium diverts M cell transcytosis via the virulence factor ActA. However, we discover that L. monocytogenes spreads within the epithelium exclusively by actin-based motility, similar to S. flexneri. We propose that subversion of M cell transcytosis and avoidance of underlying immune tissues are features shared by cytosolic pathogens, allowing their escape from induction of adaptive immunity.In addition, we submit a pipeline of fluorescence-based single cell sorting of enterocytes atsuccessive stages of infection combined with transcriptional analysis by multiplex qPCR. This methodreveals the production of distinct responses in host enterocytes according to subcellular pathogen localizations. We observe the production of a strong bystander response involving multiplecorrelated host pathways in non-infected enterocytes. Moreover, we detect the output of distinct host response patterns according to vacuolar or cytosolic bacterial localizations in infectedenterocytes. We further show that the virulence effector OspF contributes to dampen infected host responses and disrupt otherwise correlated host signaling pathways. To conclude, our studies expose new immune subversion strategies linked to the intracellular life styles of cytosolic enteric bacteria, highlighting the importance of M cells in initial bacterial dissemination and diversion of adaptive immunity, and the organization and disruption of innate immune responses provoked in enterocytes during infection
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Saviano, Antonio. „Physiopathologie du foie à l'échelle de la cellule unique : caractérisation de l'hétérogénéité cellulaire et identification de nouvelles cibles thérapeutiques dans les maladies hépatiques chroniques et le cancer hépatocellulaire“. Thesis, Strasbourg, 2019. http://www.theses.fr/2019STRAJ093.
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Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est parmi les principales causes de mortalité dans le monde et les traitements disponibles sont insuffisants. Ceci est dû à la connaissance limitée de la complexité biologique et du microenvironnement hépatiques en situation normale et pathologique. Pour répondre à ces besoins, nous avons développé un protocole de séquençage d’ARN sur cellule unique (scRNA-seq) à partir de tissus primaires de foie humain. Nous avons assemblé un atlas de cellules du foie humain et comparé le profil scRNA-seq du foie normal au profil du CHC. L’atlas a révélé l’hétérogénéité au sein des principales populations de cellules hépatiques, la zonation transcriptomique des cellules endothéliales et l'existence de progéniteurs épithéliaux dans le foie adulte capable de se différencier à la fois en cholangiocytes et en hépatocytes. L'analyse par scRNA-seq du CHC a dévoilé l'hétérogénéité marquée de cette tumeur, les modifications de son microenvironnement cellule par cellule et les interactions entre les cellules tumorales et le virus de l’hépatite B en découvrant des voies et des facteurs moteurs de la cancérogenèse hépatique jusque-là inconnusHepatocellular carcinoma (HCC) is a leading cause of death worldwide and the current treatments are unsatisfactory. One reason is the limited knowledge on the complexity and microenvironment of healthy and diseased liver. To address this gap, we have developed a single cell RNA sequencing (scRNA-seq) pipeline for primary human liver tissues. We have assembled an atlas of human liver cells and compared the scRNA-seq profile of normal liver and HCC. The atlas revealed an unknown heterogeneity within the main populations of liver cells, the transcriptomic zonation of endothelial cells and the existence of an epithelial progenitor in the adult liver capable of differentiating into both cholangiocytes and hepatocytes. ScRNA-seq analysis uncovered the marked cell heterogeneity of HCC, its microenvironment changes at single-cell level and the interactions between tumor cells and hepatitis B virus discovering previously unknown pathways and drivers of hepatocarcinogenesis
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Grosselin, Kevin. „Cartographie épigénétique de cellules cancéreuses résistantes rares par microfluidique en gouttelettes“. Thesis, Paris Sciences et Lettres (ComUE), 2018. http://www.theses.fr/2018PSLET015.
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La nature dynamique de la chromatine est un acteur majeur de la régulation de la transcription et est suspectée de contribuer à l'évolution tumorale. L'étude des modifications de la chromatine à l'échelle de la cellule unique est indispensable pour comprendre l'impact de la plasticité épigénétique au cours de la tumorigénèse.Dans ce manuscrit, je décris le développement d'un système basé sur la microfluidique en gouttelettes permettant d'obtenir la cartographie des modifications de la chromatine à l'échelle de la cellule unique.Le système a été évalué pour cartographier des modifications d'histones associées à un état transcriptionnel actif (H3K4me3) ou réprimé (H3K27me3) de cellules B et T humaines. Les données ont permis de classer >99% des cellules sur la base de leur profil épigénétique, définissant ainsi avec une grande précision des états de la chromatine propres à chaque type cellulaire.A partir de xénogreffes dérivées de patient atteint du cancer du sein et ayant acquis une résistance thérapeutique, le système a permis la détection de sous-populations rares de cellules parmi les tumeurs non-traitées, présentant un profil chromatinien similaire aux cellules cancéreuses résistantes.Cette étude démontre l'importance de l'hétérogénéité cellulaire sur la progression tumorale et met en évidence une signature épigénétique associée à la résistance et susceptible d'être la cible d'un traitement thérapeutiqueThe dynamic nature of chromatin and transcriptional features play a critical role in normal differentiation and are expected to contribute to tumor evolution. Studying the heterogeneity of chromatin alterations with single-cell resolution is mandatory to understand the contribution of epigenetic plasticity in cancer.In this thesis, I describe a droplet microfluidics approach to profile chromatin landscapes of thousands of cells at single-cell resolution, with an unprecedented coverage of 10,000 loci per cell.The system was evaluated to profile histone modifications associated with active (H3K4me3) and inactive transcription (H3K27me3) of human B cells and T cells, and revealed that >99% of the cells were correctly assigned to one cell type, defining distinct chromatin states of immune cells with high accuracy.In patient-derived xenograft (PDX) models of breast cancer with acquired drug resistance, the system enabled the detection of a rare subpopulation of cells in the untreated, drug-sensitive tumors with chromatin features characteristic of resistant cancer cells. These cells had lost chromatin marks (H3K27me3) associated with stable transcriptional repression for a number of genes known to promote resistance, potentially priming them for transcriptional activation.These results highlight the potential selection of cells with specific chromatin marks in response and in resistance to cancer therapy
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Vandecasteele, Marie. „Interactions locales (synapses chimiques et électriques) entre les neurones dopaminergiques de la substance noire compacte“. Paris 6, 2006. http://www.theses.fr/2006PA066323.
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Galindo, González Luis Javier. „Deep eukaryotic phylogenomics : the holomycota branch Combined cultivation and single-cell approaches to the phylogenomics of nucleariid amoebae, close relatives of fungi Evolutionary Genomics of Metchnikovella incurvata (Metchnikovellidae): an early Branching Microsporidium A new fungal clade helps reconstructing the tree of Fungi and the evolution of the flagellum in Holomycota Ancient Adaptive Lateral Gene Transfers in the Symbiotic Opalina–Blastocystis Stramenopile Lineage“. Thesis, université Paris-Saclay, 2020. http://www.theses.fr/2020UPASS050.
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La plupart de la diversité biologique est en réalité microbienne. L'arbre phylogénétique des eucaryotes comprend plusieurs grands supergroupes monophylétiques, dont les Opisthokonta. Ce groupe comprend deux branches, les Holozoa, qui inclut les animaux, et les Holomycota, qui regroupe les champignons et leurs parents unicellulaires. Bien que les champignons multicellulaires soient bien connus, nos connaissances sur la diversité des champignons unicellulaires et de leurs parents phylogénétiques restent limitées. Cette fraction unicellulaire comprend plusieurs lignées zoosporiques (par exemple chytrids) au sein des champignons, mais aussi une variété de lignées liées aux champignons classiques : les nucleariids, les rozellids, les aphelids et les microsporidies. Cependant, les relations phylogénétiques de ces lignées entre elles et avec les champignons restent à établir solidement. Les arbres phylogénétiques des gènes d'ARNr 18S environnementaux montrent une grande diversité d'Holomycota unicellulaires dans la plupart des écosystèmes terrestres. Cependant, le signal phylogénétique de ce gène est limité et ne permet pas de résoudre la plupart des relations phylogénétiques profondes. Au cours des dernières années, les techniques à haut débit ont permis de séquencer des centaines de nouveaux génomes et transcriptomes. Cela a permis de réaliser des études phylogénomiques multi-gènes, qui augmentent le signal disponible pour résoudre les relations évolutives. Néanmoins, la plupart de ces génomes correspondent à des espèces fongiques faciles à cultiver, souvent avec un intérêt particulier pour l'homme. Actuellement, les approches de type « omique » à partir des cellules uniques se révèlent comme potentiellement utiles pour étudier les eucaryotes unicellulaires non cultivés, en permettant de reconstruire des analyses phylogénétiques robustes d'une grande diversité environnementale à l'aide de données génomiques et transcriptomiques. Au cours de mon travail de doctorat, j'ai appliqué des approches de « cellule unique » pour obtenir des informations phylogénétiques à partir de lignées Holomycota divergentes, clarifier les relations phylogénétiques entre les champignons et ses proches parents et inférer l'évolution de leurs traits. Plus précisément, j'ai utilisé cette approche pour :1) Générer des données génomiques et transcriptomiques pour les nucleariids et mieux reconstruire les relations internes dans le clade et les caractères présents dans leur ancêtre. Nos résultats confirment que les genres de protistes à thèque Pompholyxophrys et Lithocolla sont en effet des nucleariids et branchent avec Nuclearia, Parvularia et Fonticula. La reconstruction d'une phylogénie robuste de ce groupe nous a permis d’inférer les traits (par exemple pas de flagelle) ancestraux du groupe. 2) Séquencer et analyser de manière comparative le génome de Metchnikovella incurvata, pour confirmer sa position relativement basale dans Microsporidia et déterminer les synapomorphies du clade. L'analyse phylogénomique du metchnikovellid Metchnikovella incurvata a confirmé que des Metchnikovellidae branchent à la base des Core-Microsporidia. Nous avons également confirmé que leur profil métabolique était plus similaire à celui des Core-microsporidia, tous deux ayant réduit de manière similaire leurs gènes / fonctions. 3) Générer des données génomiques pour Amoeboradix gromovi et Sanchytrium tribonematis, qui forment le clade des sanchytrides, une nouvelle lignée de champignons zoosporiques identifiée récemment, et résoudre leur position phylogénétique. L'étude des deux génomes de sanchytrids a clarifié leur placement au sein des Fungi en tant que nouvelle groupe frère des Blastocladiomycota. Des analyses génomiques comparatives montrent que leur métabolisme est réduit par rapport aux lignées apparentées. En particulier, le système flagellaire est fortement réduit par rapport à d'autres Holomycota, avec 4 événements indépendants de perte de flagelle dans le cladeDespite the astonishing diversity of plants, animals and macroscopic fungi, most eukaryotic diversity is actually microbial. The eukaryotic tree comprises several large monophyletic supergroups. One of these groups is the Opisthokonta, which encompasses two branches, Holozoa, including animals, and Holomycota, grouping Fungi and their unicellular relatives. While multicellular fungi are well known, knowledge on the diversity of unicellular Fungi and their phylogenetic relatives is still poor. This unicellular fraction includes several zoosporic lineages (e.g. Chytridiomycota and Blastocladiomycota) within Fungi, but also a variety of lineages related to the classical core Fungi: nucleariids, rozellids, aphelids and Microsporidia. However, the phylogenetic relationships of these lineages among them and with classical Fungi remain to be solidly established. Molecular phylogenetic trees of 18S rRNA genes retrieved from environmental studies have showed a wide diversity of unicellular holomycotans in almost all environments on Earth. However, the phylogenetic signal of this gene is limited and does not allow robustly resolving most deep phylogenetic relationships. During past years, high-throughput techniques have allowed sequencing hundreds of new genomes and transcriptomes. This has made possible to carry out multi-gene phylogenomic studies, which increase the available signal to resolve evolutionary relationships. Nevertheless, most sequenced genomes correspond to easy-to-culture fungal species, often with particular interest for humans (e.g. parasites, plant symbionts, yeast). Recently, single-cell omics has become a potential useful approach to study uncultured unicellular eukaryotes, making it possible to reconstruct robust phylogenetic analyses of a wide environmental diversity using genomic and transcriptomic data. During my PhD work, I have applied single-cell techniques to get phylogenetic information from divergent holomycotan lineages, clarify phylogenetic relationships among fungi and their close relatives and infer trait evolution. More specifically, I have used this approach to: 1) Generate genomic and transcriptomic data for nucleariids and better reconstruct inner relationships in the clade and the characters present in the nucleariid ancestor. Our results confirm that the cover-bearing unicellular genera Pompholyxophrys and Lithocolla are indeed nucleariids and branch together with Nuclearia, Parvularia and Fonticula. The reconstruction of a robust phylogeny for the group allowed us to infer the traits (e.g. no flagellum, glycocalyx, no cover) already present in their ancestor. 2) Sequence and comparatively analyze the genome of Metchnikovella incurvata, to confirm its relatively basal position within Microsporidia, and determine synapomorphies for the clade. Phylogenomic analysis of the metchnikovellid Metchnikovella incurvata confirmed that Metchnikovellidae branch at the base of Core-Microsporidia. We also confirmed their metabolic profile to be more similar to Core-microsporidia, being both similarly reduced in genes/functions. 3) Generate genomic data for Amoeboradix gromovi and Sanchytrium tribonematis, which form the newly described zoosporic fungal clade of sanchytrids, and resolve their phylogenetic position. The study of the two sanchytrid genomes clarified their placement within Fungi as a new clade sister to Blastocladiomycota. Comparative genomics showed that their metabolic composition was reduced in comparison with related lineages. This reduction was especially important in their flagellar toolkit when compared with other Holomycota, confirming 4 independent flagellum loss events in the clade
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Bost, Pierre. „Decoding cellular communications and interactions between immune cells by using single-cell approaches“. Electronic Thesis or Diss., Sorbonne université, 2020. https://accesdistant.sorbonne-universite.fr/login?url=https://theses-intra.sorbonne-universite.fr/2020SORUS020.pdf.
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Les communications cellulaires sont indispensables au bon fonctionnement des organismes multicellulaires, notamment pour s’adapter à un environnement changeant en permanence. Les cellules du système immunitaire n’échappent pas à cette règle mais les interactions entre cellules immunitaires restent peu connues et compliquée à étudier. La récente apparition des technologies de séquençage dites ‘cellules uniques’ représente une opportunité unique pour étudier ces communications. Dans cette thèse, différentes approches expérimentales et analytiques ont été développées pour étudier ces communications à une échelle de cellules uniques. Ces stratégies ont ensuite été appliquées à différents contextes pathologiques, incluant le COVID-19, la maladie d’Alzheimer ou une immunisation par des pathogènes inactivés, et ont permis d’identifier des voies de communications cellulaires jusqu’ici inconnues ou mal comprises. Néanmoins, l’efficacité de ces approches est limitée par l’absence d’informations sur la localisation des cellules et des travaux supplémentaires intégrant ce genre de données est essentiel pour aller plus loin dans la dissection des communications entre cellules immunitairesCellular communications are essential to the proper functioning of multi-cellular organisms, particularly in order to adapt to a constantly changing environment. The cells of the immune system are no exception to this rule, but the interactions between immune cells remain little known and complicated to study. The recent emergence of 'single cell' sequencing technologies represents a unique opportunity to study these communications. In this thesis, different experimental and analytical approaches have been developed to study these communications on a single cell scale. These strategies were then applied to different disease contexts, including COVID-19, Alzheimer's disease or immunisation with inactivated pathogens, and identified previously unknown or poorly understood cellular communication pathways. However, the effectiveness of these approaches is limited by the lack of information on cell location and further work integrating such data will be essential to go further in the dissection of immune cell communications
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Josephides, Joseph Mark. „Genome-wide link between DNA replication and genome instability at the single cell level“. Electronic Thesis or Diss., Université Paris sciences et lettres, 2023. http://www.theses.fr/2023UPSLS059.
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La réplication de l'ADN est essentielle pour les cellules, car elle permet de créer les quelque 30 000 milliards de cellules qui composent le corps humain à partir d'un seul zygote lors de l'embryogenèse. De plus, tout au long de la vie humaine, la réplication continue de l'ADN et la division cellulaire sont nécessaires pour remplacer les cellules âgées, mortes ou endommagées. Par conséquent, il est crucial que le programme de réplication de l'ADN fonctionne correctement à chaque division cellulaire. Cependant, de nombreux facteurs de stress, à la fois exogènes et endogènes, remettent régulièrement en question l'intégrité de l'ADN, ce qui entraîne une instabilité du génome. Cette instabilité est une cause majeure de cancers et d'autres maladies humaines.Malgré l'importance du stress de réplication et de l'instabilité génomique dans les cancers, nous ne comprenons pas complètement les mécanismes sous-jacents ni leurs impacts sur le génome. Au cours de la dernière décennie, d'énormes progrès ont été réalisés dans l'analyse des cellules individuelles. L'étude des variants structuraux (VS) au niveau cellulaire est devenue cruciale pour comprendre l'instabilité génomique, en particulier dans des populations cellulaires hétérogènes telles que les échantillons de tumeurs, qui ne peuvent pas être facilement obtenus par des analyses de masse. Des études récentes ont révélé une corrélation importante entre le timing de réplication et l'apparition de VS dans les cancers, montrant que de nombreux VS résultent de mécanismes liés à la réplication. Cependant, il existe un manque d'études détaillées sur les mécanismes précis, en particulier sur les liens entre réplication, transcription et VS au niveau de la cellule unique. Comprendre ces mécanismes est crucial pour lutter contre les principales maladies humaines.Pour répondre à cette question, ce projet développe et utilise de nouvelles méthodes informatiques basées sur l'intelligence artificielle. Il vise à (i) étudier directement le timing de réplication dans les cancers en analysant le nombre de copies au niveau de la cellule unique et (ii) examiner les interactions entre la réplication et les VS au niveau de la cellule unique. Les signatures des VS découvertes dans ce projet pourraient contribuer à améliorer le diagnostic et à définir de meilleures stratégies thérapeutiques. Dans l'ensemble, ce projet permet de mieux comprendre les mécanismes de la cancérogenèse et contribue à améliorer le diagnostic, le pronostic, le traitement et le suivi personnalisé des patientsDNA replication is a vital process of cells. Besides creating the ~30 trillion cells that comprise the human body from a single zygote during embryogenesis, continuous DNA replication and cell division is necessary during the entire human lifespan to replace the old, dead or damaged cells. It is therefore essential that the DNA replication program is correctly executed at each cell division. However, large numbers of exogenous and endogenous replication stresses routinely challenge DNA integrity and lead to genome instability, which is an important cause of cancers and many other human diseases.Although replication stress and genomic instability are two important hallmarks of cancer, we lack full comprehension of the mechanisms that lead to these deregulations and the impacts they have on the genome. During the last decade, great progress has been made in analyses of individual cells. Determination of structure variations (SVs) in single cells has become an important approach to study genomic instability in heterogeneous cell populations, such as tumour samples, that cannot easily be obtained from bulk analyses. Recent studies have revealed that replication timing shows a strong association with the occurrence of SVs in cancers, and large amounts of SVs generated during tumorigenesis result from replication-associated mechanisms. However, studies addressing the direct mechanisms and, in particular, the links between replication, transcription and SVs at the single-cell level are missing. Investigating such mechanisms is critically important to address major human diseases.To address this question, this project develops and uses novel computational methods, based on artificial intelligence, to: (i) directly investigate single cell replication timing (scRT) in cancers by single-cell copy number analysis, and (ii) examine the interactions of replication and SVs at the single cell level. The SV signatures in cancers revealed in this project might help to improve the diagnosis and better define therapeutic strategies. Altogether, this project provides further understanding of the mechanisms of carcinogenesis and contributes to improving the diagnosis, prognosis, treatment and/or personalised monitoring of patients
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Deprez, Marie. „Étude de l’hétérogénéité cellulaire et des dynamiques de régénération de l’épithélium respiratoire sain par analyses des signatures transcriptionnelles sur cellules uniques“. Electronic Thesis or Diss., Université Côte d'Azur (ComUE), 2019. http://www.theses.fr/2019AZUR6022.
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Les progrès technologiques en séquençage haut débit et en manipulation cellulaire permettent d'analyser simultanément et indépendamment le contenu de nombreuses cellules (ARN, ADN,...). Cette révolution "omique" offre un nouveau cadre pour revisiter la "Théorie Cellulaire", essentiellement basée sur des caractéristiques morphologiques et fonctionnelles. Les nombreuses modalités cellulaires désormais accessibles au niveau de la cellule unique, telles que leur transcriptome, leur localisation spatiale, leurs trajectoires développementales, enrichissent considérablement cette définition, et établissent un contexte totalement renouvelé pour réévaluer la définition de "types" ou d’"états" cellulaires ainsi que leurs interactions. \Mon travail de thèse a été de mettre en place des approches statistiques appropriées pour analyser ces données transcriptomiques sur cellule unique caractérisées par une forte variance, la présence d'un pourcentage élevé de valeurs nulles et un grand volume de données. Mon travail s’est focalisé sur le modèle expérimental central de mon laboratoire d’accueil, l'épithélium des voies respiratoires humaines. Les voies respiratoires humaines sont bordées d'un épithélium pseudo-stratifié composé principalement de cellules basales, sécrétrices, à gobelet et multiciliées. Les voies respiratoires constituent en outre un véritable écosystème cellulaire, dans lequel la couche épithéliale interagit étroitement avec les cellules immunitaires et mésenchymateuses. Cette coordination entre les cellules assure une bonne défense du système respiratoire et sa correcte régénération en cas d'agressions extérieures. Une meilleure compréhension des situations cellulaires normales et pathologiques peut améliorer les approches pour lutter contre des pathologies telles que la maladie pulmonaire obstructive chronique, l'asthme ou la mucoviscidose.J'ai d'abord pu caractériser au niveau de la cellule unique la séquence précise et spécifique des événements conduisant à la régénération fonctionnelle de l'épithélium, en utilisant un modèle 3D de cellules humaines. J'ai identifié des hiérarchies de lignées cellulaires et j'ai pu reconstruire les différentes trajectoires possibles de différentiation cellulaire. J'ai confirmé des trajectoires cellulaires décrites précédemment, mais j'ai aussi découvert une nouvelle trajectoire reliant les cellules à gobelet aux cellules multiciliées, identifiant de nouvelles populations cellulaires et de nouvelles interactions moléculaires impliquées dans le processus de régénération de l'épithélium sain des voies aériennes humaines. J'ai ensuite construit un atlas des différents types cellulaires qui tapissent les voies respiratoires humaines saines, du nez jusqu’à la 12ième génération de bronches. Le profilage de 10 volontaires sains a généré un ensemble de données de 77 969 cellules, provenant de 35 emplacements distincts, qui comprend plus de 26 types cellulaires épithéliaux, immunitaires et mésenchymateuses. Cet atlas illustre l'hétérogénéité cellulaire présente dans les voies respiratoires. Son analyse révèle une différence d'expression des gènes entre le nez et les voies respiratoires pulmonaires que j’ai caractérisé dans les cellules suprabasales, sécrétrices et multiciliées. Mes travaux ont également permis d'améliorer la caractérisation de certaines populations de cellules rares, comme les cellules "hillock", déjà décrites chez la souris. En conclusion, mon travail contribue à une meilleure compréhension des dynamiques de différenciation et d'hétérogénéité cellulaire dans les voies respiratoires humaines saines. La ressource ainsi constituée sera extrêmement utile dans tout projet futur visant à analyser avec précision les conditions spécifiques des maladies respiratoiresImprovements made in nucleic acid sequencing and cell handling technologies now offer the opportunity to analyze simultaneously the content of numerous single cells (RNA, DNA, ...) by global and unbiased approaches. This single-cell ‘omics’ revolution provides a new framework to revisit the “Cell Theory”, elaborated over several centuries, and essentially based on morphological and functional features. The many cell modalities now accessible at single- cell level, such as their transcriptome, spatial localization, developmental trajectories, enrich considerably this definition, and set a renewed context to precisely reassess the definition of ‘cell types’, ‘cell states’ as well as their different interactions and fates.My thesis work initially set up ad hoc approaches and statistical framework to analyze appropriately these single-cell data, which deeply differ from standard bulk RNA-seq. High variance, presence of a huge percentage of null values, large volume of data are among the specific characteristics of these datasets. My work was centered on the main experimental model of my host laboratory, e.g. the human airway epithelium. Human airways are lined by a pseudostratified epithelium mainly composed of basal, secretory, goblet and multiciliated cells. Airways also constitute a true cellular ecosystem, in which the epithelial layer interacts closely with immune and mesenchymal cells. This coordination between cells ensures proper defense of the respiratory system and its correct regeneration in case of external aggression and injuries. A better understanding of the operating sequences in normal and physiopathological situations is relevant in pathologies such as chronic obstructive pulmonary disease, asthma or cystic fibrosis.First, I characterized at a single cell level the precise and cell-specific sequence of events leading to functional regeneration of the epithelium, using a 3D model of human cells. I then built a single-cell atlas of the different cell types that are lining healthy human airways from the nose to the 12th generation of bronchi.By applying computational and statistical approaches, I have identified cell lineage hierarchies and was able to reconstruct a comprehensive cell trajectory roadmap in human airways. I not only confirmed previously described cell lineages, but I have also discovered a novel trajectory that links goblet cells to multiciliated cells, identifying novel cell populations and molecular interactors involved in the process of healthy human airway epithelium regeneration. The profiling of 12 healthy volunteers then generated a dataset of 77,969 cells, derived from 35 distinct locations. The resulting atlas is composed of more than 26 epithelial, immune and stromal cell types demonstrating the cellular heterogeneity present in the airways. Its analysis has revealed a strong proximo-distal gradient of expression in suprabasal, secretory, or multiciliated cells between the nose and lung airways. My work has also improved the characterization of rare cells, including “hillock” cells that have been previously described in mice.In conclusion, this work probably represents one of the first single-cell investigations in human airways. It brings original contributions to our understanding of differentiation’s dynamics and cellular heterogeneity in healthy human airways. The resulting resource will be extremely useful for any future single-cell investigators and also for establishing a very useful joint between clinical and biological works. As such, it will constitute a reference in any future project aiming to precisely analyze specific disease conditions
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Chen, Wenli. „Spectroscopie diélectrique hyperfréquence de cellules uniques cancéreuses : de l'optimisation du capteur en sensibilité et répétabilité jusqu'au suivi en temps réel de stimuli chimiques“. Thesis, Toulouse 3, 2016. http://www.theses.fr/2016TOU30219/document.
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La mesure de cellules biologiques constitue une étape de routine dans de nombreuses investigations en biologie. Les techniques actuelles utilisées par les biologistes sont principalement basées sur l'utilisation marqueurs optiques de coloration ou fluorescents, qui fournissent des observations moléculaires et cellulaires très précises et efficaces. Dans ce contexte, la spectroscopie diélectrique micro-ondes pour analyse cellulaire constitue une méthode nouvelle et attrayante, en raison du manque de préparation et manipulation des cellules, sans besoin d'ajout de produits chimiques, qui pourraient interférer avec d'autres constituants cellulaires. Sa compatibilité avec l'analyse de cellules uniques, potentiellement en temps réel, constitue également deux atouts importants de la technique d'analyse. Les travaux de cette thèse ont donc porté sur l'optimisation d'un biocapteur hyperfréquence microfluidique, dédié à la spectroscopie diélectrique de cellules biologiques uniques, et au développement de sa métrologie pour accéder au comportement diélectrique de cellule soumise à des stimuli chimique. Après un état de l'art sur les techniques courantes d'analyse de cellule individuelle, nous nous sommes attachés à optimiser le biocapteur hyperfréquence pour en améliorer les performances en sensibilité et en répétabilité. Ces optimisations ont porté sur le procédé de micro-fabrication, l'architecture du composant, que ce soit au niveau mécanique vis à vis de l'efficacité de blocage d'une cellule unique, mais aussi d'un point de vue électromagnétique avec une étude paramétrique. Ces études ont été validées dans un premier temps expérimentalement par la mesure de billes de polystyrène, modèle diélectrique simplifié par rapport à la complexité d'une cellule biologique, puis sur cellules individuelles vivantes dans leur milieu de culture. Le banc de caractérisation a également été optimisé afin de permettre la mesure diélectrique de cellules au cours du temps, et notamment en réaction à un stimulus d'ordre chimique. La cinétique de réaction d'une cellule unique soumise à de la saponine a été enregistrée automatiquement pour différentes cellules. Ces travaux ouvrent ainsi la voie à l'analyse à l'échelle cellulaire par spectroscopie diélectrique micro-onde de processus biologiques complexes en temps réelThe measurement of biological cells is a routine step in many biological investigations. Current techniques used by biologists are mainly based on staining or fluorescent labelings, which provide very precise and effective molecular and cellular observations. Within this context, the microwave dielectric spectroscopy for cell analysis represents a new and attractive method, due to the lack of cells preparation and manipulation, without adding chemicals that could interfere with other cellular constituents. Its compatibility with the analysis of single-cells, potentially in real-time monitoring, constitute also two major assets of the analysis technique. This PhD thesis therefore focused on the optimization of a microfluidic and microwave based biosensor, which is dedicated to the dielectric spectroscopy of individual biological cells, and the development of its metrology to assess the dielectric behavior of cells subjected to chemical stimuli. After a state of the art on the current techniques available to analyze single cells, we focused on the optimization of the microwave biosensor to improve its performances in terms of sensitivity and repeatability. These optimizations dealt with the microfabrication process, the component architecture through the investigation of single cell loading efficacy as well as an electromagnetic parametric study. These developments were validated first experimentally with the measurement of polystyrene beads, which present a simplified dielectric model compared to the complexity of a biological cell, followed then by living individual cells in their culture medium. The test bench was also optimized to allow the dielectric measurement of cells over time, and especially in response to a chemical stimulus. The reaction kinetics of a single-cell subjected to saponin was recorded automatically for different cells. This work opens the door to single-cell analysis with microwave dielectric spectroscopy of complex biological processes in real-time
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Boone, Nathalie. „Les cellules souches olfactives humaines : un nouveau modèle d'étude des mécanismes à l'origine d'une maladie neurodégénérative, la dysautonomie familiale“. Thesis, Aix-Marseille 2, 2011. http://www.theses.fr/2011AIX20694.
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La dysautonomie familiale (FD) est une neuropathie héréditaire provoquée par des mutations au sein du gène IKBKAP, la plus commune d'entre elles induisant un épissage alternatif de l'exon 20 au sein de du pré-ARNm de façon tissu-spécifique. L'épissage aberrant est particulièrement prononcé dans les tissus nerveux, conduisant à la dégénerescence progressive des neurones sensoriels et autonomes. La spécificité de la perte des cellules nerveuses dans la FD est mal comprise, par manque d'un modèle approprié. Afin de mieux comprendre les mécanismes moléculaires de l'épissage des ARNm d'IKBKAP, nous avons utilisé un modèle original : les cellules souches olfactives ecto-mesenchymateuses (hOE-MSC) de patients FD. Les hOE-MSC sont pluripotentes et ont la capacité de se différencier en diverses lignées cellulaires, y compris les neurones et les cellules gliales.Nous avons confirmé la présence du transcrit exempt de l'exon 20 d'IKBKAP dans les hOE-MSC de FD et nous avons observé une expression significativement inférieure de la somme des transcrits IKBKAP chez ces patients, du fait de la dégradation d'une partie des isoforme aberrants. Cette réduction est correlée avec une réduction d'expression de la protéine traduite à partir du transcrit d’IKBKAP possèdant l’exon 20, IKAP/hELP1. Nous avons localisé IKAP/hELP1 dans différents compartiments cellulaires, y compris le noyau, ce qui soutient des rôles multiples de cette protéine. Nous avons confirmé que la kinétine, une cytokinine, améliorait le taux de transcrit incluant l'exon 20 et rétablissait des niveaux normaux d'IKAP/hELP1 dans les hOE-MSC de FD. Par ailleurs, nous avons pu modifier le rapport d'épissage d'IKBKAP en augmentant ou en réduisant le ratio WT (inclusion de l'exon 20) : MU (saut de l'exon 20) respectivement, en produisant des sphères flottantes, ou en engageant les cellules vers une différentiation neurale. Les sphères et les cellules différenciées ont été étudiées au niveau pan-génomique, ce qui a permis d'identifier le développement du système nerveux comme étant le processus le plus affecté chez les FD. De plus, nous soulignons le rôle de la kinétine comme un probable régulateur de facteurs d'épissage contribuant à la restauration d'un épissage correct d'IKBKAP.Les hOE-MSC isolées de patients FD représentent une nouvelle approche pour modéliser la pathologie et mieux comprendre l'expression génétique et les approches thérapeutiques possibles de la FD. En outre, elles offrent une application originale à la compréhension d'autres maladies génétiques neurologiquesFamilial dysautonomia (FD) is a hereditary neuropathy caused by mutations in the IKBKAP gene, the most common of which results in variable tissue-specific mRNA splicing with skipping of exon 20. Defective splicing is especially severe in nervous tissue, leading to incomplete development and progressive degeneration of sensory and autonomic neurons. The specificity of neuron loss in FD is poorly understood due to the lack of an appropriate model system. To better understand and modelize the molecular mechanisms of IKBKAP mRNA splicing, we collected human olfactory ecto-mesenchymal stem cells (hOE-MSCs) from FD patients. hOE-MSCs have a pluripotent ability to differentiate into various cell lineages, including neurons and glial cells.We confirmed IKBKAP mRNA alternative splicing in FD hOE-MSCs and observed a significant lower expression of both IKBKAP transcripts and IKAP/hELP1 protein in FD cells resulting from the degradation of the transcript isoform skipping exon 20. We localized IKAP/hELP1 in different cell compartments, including the nucleus, which supports multiple roles for that protein. Moreover, we showed that kinetin improved exon 20 inclusion and restores a normal level of IKAP/hELP1 in FD hOE-MSCs. Furthermore, we were able to modify the IKBKAP splicing ratio in FD hOE-MSCs, increasing or reducing the WT (exon 20 inclusion):MU (exon 20 skipping) ratio respectively, either by producing free-floating spheres, or by inducing cells into neural differentiation. Spheres forming cells and lineage neuroglial progenitors were investigated at the genome-wide level, and we confirmed that nervous system development was the most altered process in FD. More, we highlight kinetin role as a putative regulator of splicing factors which contribute to restore a correct splicing of IKBKAP.hOE-MSCs isolated from FD patients represent a new approach for modeling FD to better understand genetic expression and possible therapeutic approaches. This model could also be applied to other neurological genetic diseases
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Sun, Hui. „Développement d'une méthode microspectrophotométrique destinée à la mesure des concentrations ioniques cytoplasmiques sur cellule unique et étude physico-chimique des colorants microinjectés dans les myoballs de rat pour la détermination précise du pH et du magnésium libre cytoplasmiques“. Lyon 1, 1994. http://www.theses.fr/1994LYO1T189.
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Tamra, Amar. „Spectroscopie diélectrique hyperfréquence de cellules individualisées sous électroporation“. Thesis, Toulouse 3, 2017. http://www.theses.fr/2017TOU30011/document.
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L'électroporation est un procédé physique qui consiste à appliquer des impulsions de champ électrique pour perméabiliser de manière transitoire ou permanente la membrane plasmique. Ce phénomène est d'un grand intérêt dans le domaine clinique ainsi que dans l'industrie en raison de ses diverses applications, notamment l'électrochimiothérapie qui combine les impulsions électriques à l'administration d'une molécule cytotoxique, dans le cadre du traitement des tumeurs. L'analyse de ce phénomène est traditionnellement réalisée à l'aide des méthodes optique et biochimique (microscopie, cytométrie en flux, test biochimique). Elles sont très efficaces mais nécessitent l'utilisation d'une large gamme de fluorochromes et de marqueurs dont la mise en œuvre peut être laborieuse et coûteuse tout en ayant un caractère invasif aux cellules. Durant ces dernières années, le développement de nouveaux outils biophysiques pour l'étude de l'électroporation a pris place, tels que la diélectrophorèse et la spectroscopie d'impédance (basse fréquence). Outre une facilité de mise en œuvre, ces méthodes représentent un intérêt dans l'étude des modifications membranaires de la cellule. De là vient l'intérêt d'opérer au-delà du GHz, dans la gamme des micro-ondes, pour laquelle la membrane cytoplasmique devient transparente et le contenu intracellulaire est exposé. L'extraction de la permittivité relative suite à l'interaction champ électromagnétique/cellules biologiques reflète alors l'état cellulaire. Cette technique, la spectroscopie diélectrique hyperfréquence, se présente comme une méthode pertinente pour analyser les effets de l'électroporation sur la viabilité cellulaire. De plus, elle ne nécessite aucune utilisation des molécules exogènes (non-invasivité) et les mesures sont directement réalisées dans le milieu de culture des cellules. Deux objectifs ont été définis lors de cette thèse dont les travaux se situent à l'interface entre trois domaines scientifiques : la biologie cellulaire, l'électronique hyperfréquence et les micro-technologies. Le premier objectif concerne la transposition de l'électroporation conventionnelle à l'échelle micrométrique, qui a montré une efficacité aussi performante que la première. La deuxième partie du travail concerne l'étude par spectroscopie diélectrique HyperFréquence de cellules soumises à différents traitements électriques (combinés ou non à une molécule cytotoxique). Ces travaux présentent une puissance statistique et montrent une très bonne corrélation (R2 >0 .94) avec des techniques standards utilisées en biologie, ce qui valide 'biologiquement' la méthode d'analyse HF dans le contexte d'électroporation. Ces travaux montrent en outre que la spectroscopie diélectrique hyperfréquence s'avère être une technique puissante, capable de révéler la viabilité cellulaire suite à un traitement chimique et/ou électrique. Ils ouvrent la voie à l'analyse 'non-invasive' par spectroscopie diélectrique HyperFréquence de cellules électroporées in-situElectroporation is a physical process that consists in applying electric field pulses to transiently or permanently permeabilize the plasma membrane. This phenomenon is of great interest in the clinical field as well as in the industry because of its various applications, in particular electrochemotherapy which combines electrical pulses with the administration of a cytotoxic molecule in the treatment of tumors. The evaluation of this phenomenon is raditionally carried out using optical and biochemical methods (microscopy, flow cytometry, biochemical test). They are very effective but require the use of a wide range of fluorochromes and markers, which can be laborious and costly to implement, while being invasive to the cells. In recent years, the development of new biophysical tools for the study of electroporation has taken place, such as dielectrophoresis and impedance spectroscopy (low frequency). In addition to the ease of implementation, these methods are of interest in the study of membrane modifications of the cell. Hence the advantage of operating beyond the GHz, in the range of microwaves, for which the cytoplasmic membrane becomes transparent and the intracellular content is exposed. The extraction of the relative permittivity as a result of the electromagnetic field / biological cell interaction then reflects the cell state. This technique, microwave dielectric spectroscopy, is a relevant method for analyzing the effects of electroporation on cell viability. Moreover, it does not require any use of the exogenous molecules (non-invasive) and the measurements are directly carried out in the culture medium of the cells. Two objectives were defined during this thesis whose work is located at the interface between three scientific fields: cellular biology, microwave electronics and micro-technologies. The first objective concerns the transposition of conventional electroporation to the micrometric scale, which has shown an efficiency as efficient as the first. The second part of the work concerns the study by HighFrequency dielectric spectroscopy of cells subjected to different electrical treatments (combined or not with a cytotoxic molecule). This work presents a statistical power and shows a very good correlation (R2> 0.94) with standard techniques used in biology, which biologically validates the HF analysis method in the context of electroporation. This work also shows that microwave dielectric spectroscopy proves to be a powerful technique capable of revealing cell viability following chemical and / or electrical treatment. They open the way to 'non-invasive' analysis by hyper-frequency dielectric spectroscopy of electroporated cells in situ