Auswahl der wissenschaftlichen Literatur zum Thema „Transcriptomique en cellule unique“

Astroblastoma is an uncommon, controversial neoplasm of the Central Nervous System (CNS) emerging from the glia. “Astroblastoma” as a terminology was initially coined in 1924 for a tumefaction characteristically emerging as a unique astrocytic glioma comprised of tumour cells configuring perivascular pseudo-rosettes and appearing immune reactive to Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP). Bucy and Bailey in 1930 delineated diverse macroscopic and microscopic features of the neoplasm with description of individual astroblasts as unipolar cells with broad “feet” amalgamating adjacent to vascular articulations. Subsequently in 1933, Cox categorized astroblastoma as a neoplasm transitioning between astrocytoma and glioblastoma multiforme.

Le développement de techniques originales de manipulation de la lumière ont permis de grandes avancées dans le domaine de l’optogénétique. Elles permettent d’étudier et de stimuler la communication au sein des circuits neuronaux et du cerveau avec une précision spatiale et temporelle correspondant à l’activation d’une cellule unique au sein d’un circuit.

Les progéniteurs fibro-adipogéniques (FAPs), cellules stromales mésenchymateuses (CSMs) résidentes du muscle squelettique, jouent un rôle crucial dans l’homéostasie et la régénération musculaire via leur activité paracrine. Les avancées technologiques récentes dans le domaine du séquençage de l’ARN en cellule unique ont permis la description de l’hétérogénéité de cette population cellulaire. Dans cet article, nous présenterons les différentes sous-populations de FAPs en condition basale, lésionnelle ou de dégénérescence, ainsi que leurs fonctions associées chez la souris et l’homme. Nous discuterons ensuite de l’origine extra-musculaire possible d’une population de FAPs post-lésionnelle. En effet, nos travaux récents démontrent que des CSMs provenant du tissu adipeux et infiltrées dans le muscle pourraient participer à l’hétérogénéité des FAPs.

Projetée trois semaines après le lancement de l’opération, la cellule de coordination et d’évacuation de blessés est un maillon incontournable du soutien santé du théâtre. L’immensité du territoire malien, l’entrée en premier, mais également la dureté des combats associée à une rusticité des conditions de vie, ont constitué autant de défis pour le personnel du Service de santé des armées projeté sur place. Le flux des blessés dans les premières semaines, le faible nombre de vecteurs aériens et le point unique d’évacuation vers la métropole ont bien démontré l’impérieuse nécessité d’une régulation des demandes d’évacuation médicale associée à un suivi des patients en temps réel. Nous proposons de décrire cet outil projeté pour la deuxième fois sur un théâtre et qui fait partie intégrante de la chaîne du soutien médical en opération extérieure mais aussi de la chaîne de conduite des opérations.

Le myélome multiple (MM) est une tumeur hématologique causée par la prolifération incontrôlée de plasmocytes à longue durée de vie. L’hétérogénéité génomique du MM est caractérisée par une diversité importante des altérations génétiques somatiques, des modifications épigénétiques, et des programmes transcriptionnels dont l’articulation reste mal comprise et que nous explorons en trois axes. Nous montrons que (1) l’ADN du MM est globalement appauvri en 5-hydroxyméthylcytosine (5hmC) par rapport à l’ADN de plasmocytes non-tumoraux. Le faible niveau global de 5hmC dans l’ADN corrèle avec l’agressivité de la maladie. La marque est présente localement aux régions actives et transcrites de la chromatine, et reflète les sousgroupes moléculaires du MM (CCND1, MMSET, etc.) ainsi que leurs programmes d’expression génique associés. Puis, (2) nous décrivons les anomalies génomiques associées à la progression clinique et à l’acquisition de la résistance au venetoclax, une thérapie ciblée anti-BCL2. Les altérations génomiques sélectionnées sont concentrées sur la famille du BCL2 de façon clonale ou sousclonale. Ces résultats sont étayés par des tests fonctionnels et des analyses d’expression génique. Enfin, (3) nous proposons d’associer la transcriptomique des cellules de myélome aux paramètres de rendu d’imagerie médicale pour définir de nouveaux indicateurs pronostiques qui reflètent l’expansion et l’agressivité de la maladie. Ce travail contribue à notre compréhension de l’oncogenèse et de la progression du MM tout en fournissant des biomarqueurs susceptibles de trouver leur place en clinique
Multiple Myeloma (MM) is a hematological malignancy caused by the uncontrolled proliferation of long-lived plasma cells. Genomic heterogeneity of MM is characterized by a significant diversity of somatic genetic alterations, epigenetic modifications, and of transcriptional programs whose integration remains poorly understood, and that we discuss in three parts. First, compared to normal plasma cells, we found global DNA 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) levels to be lower in MM. Higher 5hmC levels correlated with a less severe disease. Local 5hmC remained at active and transcribed regions of the chromatin where it mirrored the MM molecular subgroups (CCND1, MMSET, etc.) as well as their gene expression programs. Second, we described unique genomic abnormalities that were associated with clinical progression and acquired resistance to venetoclax, an anti-BCL2 targeted therapy. The BCL2 family of genes displayed numerous alterations that were clonally or sub-clonally selected. Functional tests and gene expression profiling underpinned these results. Third, transcriptional programs of MM cells were associated with biomedical imaging parameters to define new prognostic markers that mirrored the expansion and severity of the disease. Together, this work contributes to our understanding of MM oncogenesis and progression while it also unravels novel clinical biomarkers

L'inférence des réseaux de régulation de gènes (RRG) à partir de données d'expression est un défi majeur en biologie. L’arrivée des technologies de mesure de transcriptomique à l’échelle de la cellule a suscité de nombreux espoirs, mais paradoxalement elles montrent une nouvelle complexité du problème d’inférence des RRG qui limite encore les approches existantes. Nous avons commencé par montrer, à partir de données d'expression en cellules uniques acquises sur un modèle aviaire de différenciation érythrocytaire, que les RRG sont des systèmes stochastiques à l'échelle de la cellule et qu'il y a une évolution dynamique de cette stochasticité au cours du processus de différenciation (Richard et al, PLOS Comp.Biol., 2016). C'est pourquoi nous avons développé par la suite un modèle de RRG mécaniste qui inclus cette stochasticité afin d'exploiter au maximum l'information des données expérimentales à l'échelle de la cellule (Herbach et al, BMC Sys.Biol., 2017). Ce modèle décrit les interactions entre gènes comme un couplage de processus de Markov déterministes par morceaux. En régime stationnaire une formule explicite de la distribution jointe est dérivée du modèle et peut servir à inférer des réseaux simples. Afin d'exploiter l'information dynamique et d'intégrer d'autres données expérimentales (protéomique, demi-vie des ARN), j’ai développé à partir du modèle précédent une approche itérative, intégrative et parallèle, baptisée WASABI qui est basé sur le concept de vague d'expression (Bonnaffoux et al, en révision, 2018). Cette approche originale a été validée sur des modèles in-silico de RRG, puis sur nos données in-vitro. Les RRG inférés affichent une structure de réseau originale au regard de la littérature, avec un rôle central du stimulus et une topologie très distribuée et limitée. Les résultats montrent que WASABI surmonte certaines limitations des approches existantes et sera certainement utile pour aider les biologistes dans l’analyse et l’intégration de leurs données
Inference of gene regulatory networks from gene expression data has been a long-standing and notoriously difficult task in systems biology. Recently, single-cell transcriptomic data have been massively used for gene regulatory network inference, with both successes and limitations.In the present work we propose an iterative algorithm called WASABI, dedicated to inferring a causal dynamical network from timestamped single-cell data, which tackles some of the limitations associated with current approaches. We first introduce the concept of waves, which posits that the information provided by an external stimulus will affect genes one-byone through a cascade, like waves spreading through a network. This concept allows us to infer the network one gene at a time, after genes have been ordered regarding their time of regulation. We then demonstrate the ability of WASABI to correctly infer small networks, which have been simulated in-silico using a mechanistic model consisting of coupled piecewise-deterministic Markov processes for the proper description of gene expression at the single-cell level. We finally apply WASABI on in-vitro generated data on an avian model of erythroid differentiation. The structure of the resulting gene regulatory network sheds a fascinating new light on the molecular mechanisms controlling this process. In particular, we find no evidence for hub genes and a much more distributed network structure than expected. Interestingly, we find that a majority of genes are under the direct control of the differentiation-inducing stimulus. Together, these results demonstrate WASABI versatility and ability to tackle some general gene regulatory networks inference issues. It is our hope that WASABI will prove useful in helping biologists to fully exploit the power of time-stamped single-cell data

Les voies aériennes humaines sont bordées d'un épithélium pseudostratifié composé principalement de cellules basales et de cellules pyramidales parmi lesquelles figurent les cellules sécrétrices de mucus et les cellules multiciliées. Toutes ces cellules contribuent à la clairance mucociliaire des voies respiratoires. Cet épithélium se régénère lentement dans des conditions homéostatiques, mais il est capable de se régénérer rapidement après agression grâce à des processus de prolifération, de migration, de polarisation et de différenciation. Chez les patients atteints de maladies respiratoires chroniques telles que la broncho-pneumopathie chronique obstructive, l'asthme ou la mucoviscidose, la réparation tissulaire est souvent défectueuse, caractérisée par une perte de cellules multiciliées et une hyperplasie des cellules sécrétrices, ayant pour conséquence une clairance mucociliaire affectée. La séquence des événements cellulaires conduisant à un tissu fonctionnel ou remodelé est encore mal décrite. Notre principal objectif a été d’identifier les types cellulaires successifs mis en jeu lors de la régénération tissulaire et les événements moléculaires responsables d'une régénération saine ou pathologique. Nous avons analysé la composition cellulaire de l’épithélium des voies respiratoires à plusieurs stades de différenciation en utilisant un modèle de culture 3D in vitro qui reproduit la composition cellulaire in vivo. En appliquant une méthode de transcriptomique sur cellule unique couplée à des méthodes bioinformatiques, nous avons établi les hiérarchies cellulaires permettant de reconstruire les différentes trajectoires cellulaires mises en jeu lors de la régénération de l’épithélium des voies respiratoires humaines. Après avoir confirmé les lignages cellulaires qui ont été précédemment décrits, nous avons découvert une nouvelle trajectoire reliant les cellules sécrétrices de mucus aux cellules multiciliées. Nous avons également caractérisé de nouvelles populations cellulaires et de nouveaux acteurs moléculaires impliqués dans le processus de régénération de l'épithélium des voies respiratoires humaines. Enfin, grâce à ces approches, nous avons mis en évidence des réponses spécifiques de chaque type cellulaire survenant dans des situations pathologiques d’hyperplasie sécrétoire. Ainsi, nos données, en apportant d'importantes contributions à la compréhension de la dynamique de différenciation de l’épithélium des voies respiratoires humaines, ouvrent de nouvelles voies vers l’identification de cibles thérapeutiques
Human airways are lined by a pseudostratified epithelium mainly composed of basal and columnar cells, among these cells we can find multiciliated, secretory cells and goblet cells. All these cells work together in the mucociliary clearance of the airways. This epithelium regenerates slowly under homeostatic conditions but is able to recover quickly after aggressions through proliferation, migration, polarization and differentiation processes. However, in patients with chronic pulmonary diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, asthma or cystic fibrosis, epithelial repair is defective, tissue remodeling occurs, leading to loss of multiciliated cells and goblet cell hyperplasia, impairing correct mucociliary clearance. The sequence of cellular events leading to a functional or remodelled tissue are still poorly described. Hence, we aim at identifying the successive cell types appearing during tissue regeneration and the molecular events that are responsible for healthy or pathological regeneration. We have analysed airway epithelial cell composition at several stages of differentiation using an in vitro 3D culture model which reproduces in vivo epithelial cell composition. Applying single cell transcriptomics and computational methods, we have identified cell lineage hierarchies and thus constructed a comprehensive cell trajectory roadmap in human airways. We have confirmed the cell lineages that have been previously described and have discovered a novel trajectory linking goblet cells to multiciliated cells. We have also discovered novel cell populations and molecular interactors involved in the process of healthy human airway epithelium regeneration. Using these approaches, we have finally shed light on cell-type specific responses involved in pathological goblet cell hyperplasia. Our data, by bringing significant contributions to the understanding of differentiation’s dynamics in the context of healthy and pathological human airway epithelium, may lead to the identification of novel therapeutic targets

Lors du développement, la coordination d’évènements moléculaires et cellulaires mène à la production du cortex qui orchestre les fonctions sensori-motrices et cognitives. Son développement s’effectue par étapes : les cellules gliales radiaires (RGs) – les cellules souches neurales (NSCs) du cerveau en développement – et les cellules progénitrices de la zone ventriculaire (VZ) et de la zone sous ventriculaire (SVZ) génèrent séquentiellement des vagues distinctes de nouveaux neurones qui formeront les différentes couches corticales. Autour de la naissance, les RGs changent de devenir et produisent des cellules gliales. Cependant, une fraction persiste tout au long de la vie dans la SVZ qui borde le ventricule, perdant au passage leur morphologie radiale. Ces NSCs produisent ensuite les différents sous types d’interneurones du bulbe olfactif ainsi que des cellules gliales en fonction de leur origine spatiale dans la SVZ. Ces observations soulèvent d’importantes questions non résolues sur 1) le codage transcriptionnel régulant la régionalisation de la SVZ, 2) le potentiel des NSCs postnatales dans la réparation cérébrale, et 3) le lignage et les spécificités transcriptionnelles entre les NSCs et leur descendants. Mon travail de doctorat repose sur une étude transcriptionnelle des domaines de la SVZ postnatale. Celle-ci soulignait le fort degré d’hétérogénéité des NSCs et progéniteurs et identifiait des régulateurs transcriptionnels clés soutenant la régionalisation. J’ai développé des approches bio-informatiques pour explorer ces données et connecter l’expression de facteurs de transcription (TFs) avec la genèse régionale de lignages neuraux distincts. J’ai ensuite développé un modèle d’ablation ciblée pour étudier le potentiel régénératif des progéniteurs postnataux dans divers contextes. Finalement, j’ai participé au développement d’une procédure pour explorer et comparer des progéniteurs pré et postnataux à l’échelle de la cellule unique. Objectif 1 : Des expériences de transcriptomique et de cartographie ont été réalisées pour étudier la relation entre l’expression régionale de TFs par les NSCs et l’acquisition de leur devenir. Nos résultats suggèrent un engagement précoce des NSCs à produire des types cellulaires définis selon leur localisation spatiale dans la SVZ et identifient HOPX comme un marqueur d’une sous population biaisé à générer des astrocytes. Objectif 2 : J’ai mis au point un modèle de lésion corticale qui permet l’ablation ciblée de neurones de couches corticales définies pour étudier la capacité régénérative et la spécification appropriée des progéniteurs postnataux. Une analyse quantitative des régions adjacentes, incluant la région dorsale de la SVZ, a révélé une réponse transitoire de progéniteurs définis. Objectif 3 : Nous avons développé la lignée de souris transgénique Neurog2CreERT2Ai14, qui permet le marquage de cohortes de progéniteurs glutamatergiques et de leurs descendants. Nous avons montré qu’une large fraction de ces progéniteurs persiste dans le cerveau postnatal après la fermeture de neurogénèse corticale. Ils ne s’accumulent pas pendant le développement embryonnaire mais sont produits par des RGs qui persistent après la naissance dans la SVZ et qui continuent de générer des neurones corticaux, bien que l’efficacité soit faible. Le séquençage d’ARN sur cellule unique a révélé une dérégulation transcriptionnelle qui corrèle avec le déclin progressif observé in vivo de la neurogénèse corticale. Ensemble, ces résultats soulignent le potentiel des études transcriptomiques à résoudre mais aussi à soulever des questions fondamentales comme les changements trancriptionnels intervenant dans une population de progéniteurs au cours du temps et participant aux changements de leur destinée. Cette connaissance sera la clé du développement d’approches novatrices pour recruter et promouvoir la génération de types cellulaires spécifiques, incluant les sous-types neuronaux dans un contexte pathologique
During development, a remarkable coordination of molecular and cellular events leads to the generation of the cortex, which orchestrates most sensorimotor and cognitive functions. Cortex development occurs in a stepwise manner: radial glia cells (RGs) - the neural stem cells (NSCs) of the developing brain - and progenitor cells from the ventricular zone (VZ) and the subventricular zone (SVZ) sequentially give rise to distinct waves of nascent neurons that form cortical layers in an inside-out manner. Around birth, RGs switch fate to produce glial cells. A fraction of neurogenic RGs that lose their radial morphology however persists throughout postnatal life in the subventricular zone that lines the lateral ventricles. These NSCs give rise to different subtypes of olfactory bulb interneurons and glial cells, according to their spatial origin and location within the postnatal SVZ. These observations raise important unresolved questions on 1) the transcriptional coding of postnatal SVZ regionalization, 2) the potential of postnatal NSCs for cellular regeneration and forebrain repair, and 3) the lineage relationship and transcriptional specificities of postnatal NSCs and of their progenies. My PhD work built upon a previously published comparative transcriptional study of defined microdomains of the postnatal SVZ. This study highlighted a high degree of transcriptional heterogeneity within NSCs and progenitors and revealed transcriptional regulators as major hallmarks sustaining postnatal SVZ regionalization. I developed bioinformatics approaches to explore these datasets further and relate expression of defined transcription factors (TFs) to the regional generation of distinct neural lineages. I then developed a model of targeted ablation that can be used to investigate the regenerative potential of postnatal progenitors in various contexts. Finally, I participated to the development of a pipeline for exploring and comparing select populations of pre- and postnatal progenitors at the single cell level. Objective 1: Transcriptomic as well as fate mapping were used to investigate the relationship between regional expression of TFs by NSCs and their acquisition of distinct neural lineage fates. Our results supported an early priming of NSCs to produce defined cell types depending of their spatial location in the SVZ and identified HOPX as a marker of a subpopulation biased to generate astrocytes. Objective 2: I established a cortical lesion model, which allowed the targeted ablation of neurons of defined cortical layers to investigate the regenerative capacity and appropriate specification of postnatal cortical progenitors. Quantitative assessment of surrounding brain regions, including the dorsal SVZ, revealed a transient response of defined progenitor populations. Objective 3: We developed a transgenic mouse line, i.e. Neurog2CreERT2Ai14, which allowed the conditional labeling of birth-dated cohorts of glutamatergic progenitors and their progeny. We used fate-mapping approaches to show that a large fraction of Glu progenitors persist in the postnatal forebrain after closure of the cortical neurogenesis period. Postnatal Glu progenitors do not accumulate during embryonal development but are produced by embryonal RGs that persist after birth in the dorsal SVZ and continue to give rise to cortical neurons, although with low efficiency. Single-cell RNA sequencing revealed a dysregulation of transcriptional programs, which correlates with the gradual decline in cortical neurogenesis observed in vivo. Altogether, these data highlight the potential of transcriptomic studies to unravel but also to approach fundamental questions such as transcriptional changes occurring in a population of progenitors over time and participating to changes in their fate potential. This knowledge will be key in developing innovative approaches to recruit and promote the generation of selected cell types, including neuronal subtypes in pathologies

Ces dernières années, l’émergence des approches en cellules uniques (scRNA-seq) a favorisé la caractérisation de l’hétérogénéité cellulaire avec une précision inégalée. Malgré leur démocratisation, l’analyse de ces données reste complexe, en particulier pour les organismes dont les annotations sont incomplètes. Au cours ma thèse, j’ai observé que les annotations génomiques du poulet sont lacunaires, ce qui engendre la perte d’un grand nombre de lectures de séquençage. J’ai évalué à quel point une annotation améliorée affecte les résultats biologiques et les conclusions issues de ces analyses. Nous proposons une nouvelle approche basée sur la ré-annotation du génome à partir de données scRNA-seq et de RNA-seq bulk en lectures longues. Ce projet de biologie computationnelle s’appuie sur une étroite collaboration avec l’équipe expérimentale de Xavier Morin (IBENS). Le principal objectif biologique est la recherche de signatures de mode de division symétrique et asymétrique au sein de progéniteurs neuronaux. Afin d’identifier les principaux changements transcriptionnels, j’ai mis en place des approches dédiées à la recherche de signatures géniques à partir de données scRNA-seq
In recent years, single-cell RNA-seq (scRNA-seq) has fostered the characterization of cell heterogeneity at a remarkable high resolution. Despite their democratization, the analysis of scRNA-seq remains a challenge, particularly for organisms whose genomic annotations are partial. During my PhD, I observed that the chick genomic annotations are often incomplete, thus resulting in a loss of a large number of sequencing reads. I investigated how an enriched annotation affects the biological results and conclusions from these analyses. We developed a novel approach based on the re-annotation of the genome with scRNA-seq data and long reads bulk RNA-seq. This computational biology project capitalises on a tight collaboration with the experimental team of Xavier Morin (IBENS). The main biological focus is the search for signatures of symmetric versus asymmetric division mode in neural progenitors. In order to identify the key transcriptional switches that occur during the neurogenic transition, I have implemented bioanalysis approaches dedicated to the search for gene signatures from scRNA-seq data

Le développement de créatures artificielles est un domaine de recherche en plein essor. Depuis plus de vingt ans maintenant, de nombreuses techniques sont apparues afin de simuler à plusieurs niveaux des êtres artificiels : en commençant par la simulation de leur comportement au début des années 90, on a ensuite continué en modifiant leur morphologie pour qu'elle soit adaptée à leur environnement. Plus récemment, l'embryogenèse artificielle s'inspire des mécanismes de développement du vivant afin de générer de petites créatures de quelques dizaines à plusieurs centaines de cellules. Le but de ces systèmes est d'une part de mieux comprendre le vivant mais aussi de produire des modèles comportementaux pour les futurs robots modulaires. Après avoir étudié ces différents niveaux de simulation, nous nous sommes aperçus qu'il n'existait pas de modèle transversal permettant une simulation à plusieurs échelles des créatures. Le but de ces travaux est de développer une créature complète en partant d'une cellule unique, possédant différents organes et des fonctionnalités haut niveau. Le but de cette thèse est de construire le modèle chimique de cet ensemble de simulateurs. Nous avons ainsi proposé un modèle basé sur une forte simplification du modèle de développement naturel. Les créatures devront de plus intégrer un métabolisme afin de pouvoir extraire de l'énergie des différents constituants de son environnement. Ce métabolisme est trop souvent oublié dans les modèles de développement de la littérature bien qu'il soit à la base de la vie de tous les êtres vivants. A travers différentes expérimentations que nous avons effectuées, nous avons prouvé que ce modèle est capable de produire différents organes et de les assembler afin de créer un organisme plus complexe. Nous avons aussi montré la possibilité à produire une forme particulière. Enfin, nous avons observé d'importantes capacités d'auto-réparation inhérentes au modèle. Ce modèle de développement est un premier simulateur qui sera inclu dans un ensemble de simulateurs agissants à différentes échelles de la créature. Comme nous le verrons dans les perspectives de ces travaux, nous avons commencé à imaginer un simulateur physique et un simulateur hydrodynamique permettant de plonger une créature en train de se développer dans un monde physique aux lois newtoniennes et un monde hydrodynamique répondant aux équations de Navier et Stokes.

La structure de la chromatine joue un rôle crucial dans la régulation de plusieurs fonctions cellulaires chez les cellules de mammifères. Perturber l’organisation spatiale de la chromatine peut avoir des conséquences dramatiques sur la vie d’une cellule et peut amener`des pathologies graves chez les organismes. Deux facteurs nucléaires, CTCF et Cohesine, sont parmi les principaux acteurs dans la régulation et le maintien de l’architecture de l’ADN. Des avancements importants ont révélé ́la complexité ́des mécanismes qui régulent l’organisation de la chromatine, mais le domaine manque encore d’une description dynamique à l’échelle de la cellule et de la molécule unique. Cette étude est centrée sur la description de la dynamique de CTCF et Cohesin réalisé ́avec de méthodes de suivi de la molécule unique dans des cellules souche embryonnaires vivantes de souris. L’interaction entre ces deux facteurs a été étudiée à travers la caractérisation de la dynamique de Cohesin en absence de CTCF et dans le contexte d’autres altérations biologiques
Chromatin structure and cellular function are tightly linked in the nucleus of mammalian cells. Disruption of chromatin spatial organisation dramatically affects the life of a cell and eventually leads to severe pathologies in entire organisms. Two nuclear factors, CTCF and Cohesin, have been found to play a crucial role in the regulation and maintenance of DNA architecture. Huge advancements have been made in the understanding of the mechanisms behind chromatin arrangement but the field is still lacking a dynamic picture at the single cell and single molecule level. This study provide this study provides insight into the dynamics of CTCF and Cohesin through single particle tracking of CTCF and Cohesin dynamics achieved with single molecule tracking in living mouse embryonic stem cells. The interplay between these two factors was studied by looking at Cohesin’s behaviour in the absence of CTCF and in the context of other biological alterations

Nous avons étudié le trafic intracellulaire de l’ADN nu dans la cellule eucaryote. Dans ces dernières années, des molécules d’ADN exogène ont été utilisées en thérapie génique et chimiothérapie. À présent nous ne savons pas par quelle voie ces molécules d’ADN atteignent le noyau des cellules. Pour étudier ce phénomène, nous avons utilisé le suivi de molécule unique nous permettant d’observer la dynamique d'une molécule d’ADN nu dans le cytoplasme d’une cellule eucaryote. La molécule choisie comme modèle est le Dbait, un fragment d’ADN double-brin développée à l’Institut Curie comme adjuvant des thérapies anti-tumorales classiques. Les molécules de Dbait ont été modifiées pour ne pas être dégradées dans le cytoplasme et marquées avec des nanoparticules fluorescentes. Nous les avons suivies avec une haute précision spatiale et temporelle dans le cytoplasme des cellules HeLa. Ces expériences nous ont suggéré un mécanisme de transport actif du Dbait le long des filaments du cytosquelette. Nous avons ensuite développé un système in vitro pour mimer le transport du Dbait soit sur des microtubules soit sur des filaments d’actine. Ces expériences ont montré que seul le réseau des microtubules est impliqué dans le transport actif du Dbait. De plus, elles suggèrent la présence d’un ou plusieurs moteurs moléculaires de la famille des kinésines ou des dynéines acteurs du transport du Dbait. Nous avons complété notre travail par une co-purification Dbait-protéines cytoplasmiques pour identifier ces moteurs moléculaires. Nous avons isolé quatre moteurs moléculaires qui ont une affinité pour les molécules de Dbait : la dynéine cytoplasmique et trois moteurs de la famille des kinésines

Le niveau d’expression des 21 000 gènes que comporte une cellule humaine doit être très précisément régulé en fonction de nombreux signaux extra- et intracellulaires. A ce titre, des défauts dans le contrôle de l’expression génique sont souvent impliqués dans des maladies comme les cancers. Le choix des gènes, ainsi que leurs niveaux d’expression, sont le résultat de la régulation de l’ARN polymérase II par une combinaison de facteurs de transcription. Généralement, ces évènements sont étudiés sur de larges populations cellulaires, masquant d’éventuelles variations entre cellules d’une même population. Au cours de ma thèse, je me suis particulièrement intéressé à comprendre la régulation transcriptionnelle du proto-oncogène c-Fos à l’échelle de la cellule unique. Pour cela, nous avons développé un outil permettant de compter les ARNm unique et les ARN naissant sur les sites de transcription à l’aide d’expériences d’Hybridation in situ en Fluorescence. A l’aide de ce programme, nous avons découvert un mode de régulation de c-Fos particulièrement simple et efficace. Le gène est transcrit durant une brève période appelé burst transcriptionnel. Nous avons montré que l’amplitude des bursts n’est pas régulée alors que leur fréquence est modulée par le niveau d’activation des voies de signalisation intracellulaire. Nous avons également observé des agrégations dynamiques d’ARN polymérase II sur les gènes. Ces agrégations pourraient fournir une explication à l’origine moléculaire de ces bursts transcriptionnels tout en apportant un cadre pour déchiffrer leurs régulations
The expression level of the 21,000 genes present in a human cell must be precisely controlled according to several extra- and intracellular signals. Failures in the control of gene expression are often involved in diseases such as cancer. The choice of genes, as well as their expression level, are the result of the regulation of RNA polymerase II by a combination of transcription factors. Usually, these events are studied over large cell populations, thus masking variations between cells of the same population. In my work, I particularly focused on the transcriptional regulation of the c-Fos proto-oncogene at the single cell level. To this end, we developed a tool for quantifying single mRNA and nascent RNA on transcription site from Fluorescence in situ Hybridization data. With this program, we discovered a remarkably simple regulation of c-Fos transcription. Multiple transcripts are produced during short and infrequent transcriptional bursts. We have shown that while the burst size is not regulated, their frequency is modulated by the level of activation of intracellular signaling pathways. We also observed a dynamics clustering of RNA polymerase II on genes. This clustering may provide an explanation for the molecular origin of these transcriptional bursts as well as providing a framework to decipher their regulation