Dissertationen zum Thema „Transcriptome bactérien“

L'objectif de ce travail était d'identifier les bases moléculaires associées au caractère "prévalent" ou "sévère" de souches de C. Difficile, par une analyse comparative globale, tana génomique que transcriptomique. Nous avons dû pour cela développer un ensemble d'outils bioinformatique pour analyser les données générées. Nous avons obtenu par séquençage, le contenu et le niveau d'expression des gènes de 9 couples de souches correspondant à 5 souches « prévalentes » associées à des souches phylogénétiquement proche et rarement retrouvées en milieu hospitalier et à 4 souches « sévères » associées à des souches phylogénétiquement identiques mais ayant été responsables de formes modérées de l'infection. Nous avons réalisé les génomes « brouillons » de ces 18 nouvelles souches de C. Difficile sur lesquels ont été alignées les séquences des transcriptomes. L'annotation des nouveaux génomes dépendant fortement de la qualité d'annotation de la souche de référence, nous avons du réaliser une réannotation de l'ensemble des gènes de la souche CD630 de C. Difficile (Monot et al, / Med Micro 2011). Par ailleurs, nous avons développé une interface web spécifiquement créée pour visualiser et analyser l'ensemble des données de séquençage (Monot et al, en révision). Finalement, cette analyse nous a permis 1) d'établir les différences de contenu et d'expression des gènes des couples de souches des deux groupes d'intérêt « prévalent » et « sévère », ii) de réaliser le core et pan génome de C. Difficile ainsi que les reconstructions phylogénétiques à partir de ces nouveaux génomes séquences et iii) de révéler des variabilités génétiques globales et uniques entre les souches étudiées
Since 2000 both the severity and the mortality of the Clostridium difficile infections increased due to the emergence of new hypervirulent strains. To identify the molecular basis of emergence and increase virulence of CJ difficile strains, we conducted comparative pairwise genetic and transcriptomic analyses from a selection of

Le combat contre les infections bactériennes reste un enjeu majeur de santé publique notamment avec la dissémination des Entérobactéries productrices de carbapénèmases, capables d’hydrolyser l’ensemble des β-lactamines. On assiste à l’émergence de certains clones épidémiques, se distinguant par leur distribution mondiale, leur forte transmissibilité et leur capacité à persister chez les patients. L’exemple le plus parlant est le cas du clone de Klebsiella pneumoniae appartenant au « sequence type » (ST) 258 et responsable de la diffusion mondiale de la carbapénèmase KPC (Klebsiella Pneumoniae Carbapenemase) portée majoritairement par des plasmides de la famille InFIIk. Les raisons du succès de ce clone et de l’association KPC/IncFIIk/ST258 ne sont pas encore totalement élucidées. Par ailleurs, il n’existe pas de corrélation entre le niveau d’expression d’une carbapénèmase, la sensibilité in vitro de la souche vis à vis des carbapénèmes et l’efficacité clinique d’un traitement par ces molécules. Les phénomènes d’héterorésistance aux carbapénèmes sont fréquents chez les souches produisant KPC, mais l’impact clinique est inconnu. Les mécanismes de régulation de l’expression des carbapénèmases ne sont pas élucidés.Les objectifs de cette thèse résident dans l’analyse des facteurs génétiques associés à la diffusion et la persistance de clones multi-résistants ainsi que l’analyse de l’expression des β-lactamases associées.La première partie de ce travail porte sur l’analyse de l’évolution in vivo d’une souche de K. pneumoniae ST258 produisant KPC ayant persisté chez un patient pendant près de 5 ans. L’analyse comparative des génomes provenant de 17 isolats a permis de mettre en évidence une diversification génétique importante ainsi que la sélection de mutations modifiant la virulence de la souche et sa sensibilité aux antibiotiques. Afin de caractériser les raisons du succès de certains plasmides portant KPC, une analyse transcriptomique d’une souche de Escherichia coli TOP10 transformée par un plasmide multi-réplicon IncFIIk-IncFIB exprimant KPC-2, a été réalisée en présence ou non d’imipénème. Les gènes les plus exprimés dans ces conditions sont les gènes de résistance aux antibiotiques et certains gènes essentiels à la réplication du plasmide. La présence d’imipénème affecte peu la transcription des gènes plasmidiques mais induit un stress oxydatif important dans l’ensemble de la souche. Par ailleurs, l’analyse de l’expression du gène blaKPC-2 dans différentes espèces par 5’-RACE a permis de révéler que ce gène de résistance est sous la dépendance de plusieurs promoteurs, dont la force diffère selon le fond génétique. Cette caractéristique pourrait expliquer le succès de certains isoformes du transposon Tn4401 permettant une meilleure expression du gène blaKPC-2, dans certaines espèces. Les outils développés dans cette thèse ont également été appliqués à l’analyse d’un clone d’Enterobacter kobei ST125 dont la céphalosporinase naturelle ACT-28 possède une activité d’hydrolyse accrue vis à vis de l’imipénème. Enfin, l’analyse du génome de la première souche Shewanella sp. produisant une BLSE de type CTX-M-15 a permis de révéler la présence d’un nouveau variant oxacillinase chromosomique avec activité carbapénèmase, appelé OXA-535. OXA-535 est proche d’OXA-436, un autre variant carbapénèmase porté par un plasmide ayant déjà disséminé chez les Entérobactéries. L’analyse de l’environnement génétique des gènes blaOXA-535 et blaOXA-436 confirme le rôle du genre Shewanella comme progéniteur des carbapénèmases de classe D. Ce travail contribue à une meilleure compréhension de la diffusion de certains clones multi-résistants et des mécanismes contrôlant l’expression des gènes de résistance aux β-lactamines
Multidrug resistant bacteria and in particular carbapenemase-producing Enterobacteriaceae remain a major health public challenge. Some successful clones are emerging globally, due to their high transmissibility and their ability to colonize and persist in patients over time. Genomic analyses revealed that the dissemination of KPC carbapenemase is closely related to the spread of Klebsiella pneumoniae of the sequence-type (ST) 258 and to few successful plasmids linked to IncFIIk family. However, the reasons of the association between K. pneumoniae ST258, IncFIIk plasmids and KPC that led to the rapid spread of this clone are currently unknown.Furthermore, there is no correlation between expression level of a carbapenemase-encoding gene, in vitro susceptibility to carbapenems and efficiency of a carbapenem-based treatment. Most of the time, KPC-producing K. pneumoniae exhibit a heteroresistant phenotype with carbapenems, but its clinical impact remains unknown. The mechanisms underlying the regulation of carbapenemases expression remain to be explored.The objectives of the thesis are to obtain deeper insights into genomic plasticity of carbapenemase–producing clones, and into the expression of their β-lactamases.The first part of this work was dedicated to the in vivo evolution of a single strain of KPC-producing K. pneumoniae ST258 that colonized a patient for almost 5 years. Genomic comparison of 17 isolates revealed a remarkable diversification with occurrence of several mutations with impact on bacterial virulence and susceptibility to antibiotics.Several studies extensively described the genetic structures of blaKPC-carrying plasmids, but information regarding gene expression at the whole plasmid level are lacking. Accordingly, we performed RNA-seq on Escherichia coli TOP10 transformed with an IncFIIk-IncFI blaKPC-2-carrying plasmid, with or without imipenem exposure. In both conditions, plasmid-encoded genes related to antimicrobial resistance and involved in plasmid replication were the most expressed. Imipenem exposure led to a more general response with overexpression of E. coli numerous chromosome-encoded genes involved in oxidative stress response. In addition, analysis of blaKPC-2 gene expression in several species using 5’RACE revealed the presence of several promoters whose strength depends on the bacterial genetic background. This could promote higher expression of blaKPC-2 gene and explain the association of some isoforms of Tn4401 in different species. The tools developed in the frame of this work were also applied to study a single Enterobacter kobei ST125 clone whose natural cephalosporinase (ACT-28) has increased hydrolytic activity towards imipenem. Finally, genomic analysis of the first ESBL-producing Shewanella sp. was performed. It revealed the presence of blaCTX-M-15 and blaSHV-2 genes carried on an IncA/C plasmid and a new chromosomally-encoded oxacillinase variant of OXA-48 with carbapenemase activity, called OXA-535. OXA-535 was found to be closely related to OXA-436, another carbapenemase which has recently spread in Enterobacteriaceae. Analysis of the genetic environment of both blaOXA-48-like genes confirmed the role of Shewanella spp. as progenitors of class D carbapenemases.Overall, this work contributes to a better comprehension of the diffusion of multi-drug resistant clones and of the mechanisms implicated in β-lactamase expression

Outil d’évaluation des risques microbiologiques d’origine alimentaire, et d’optimisation des procédés de transformation, la microbiologie prévisionnelle ne considère pas l’influence de l’état physiologique des microorganismes sur leur comportement. L’objectif de ce travail est d’identifier des marqueurs permettant de rendre compte de l’impact de l’adaptation cellulaire face à un stress acide. Dans ce cadre, la résistance acide de Bacillus weihenstephanensis a été étudiée et des ARNm ont été identifiés en tant que biomarqueurs de résistance.(i) La résistance acide a été quantifiée via des méthodes culturales pour différents passés cellulaires. L’adaptation à un stress salin est défavorable à la résistance acide en comparaison à des conditions optimales de croissance ou à une adaptation spécifique au stress acide. Néanmoins,la résistance acide de B. weihenstephanensis est modulée de la même façon par l’acidité de l’environnement, indépendamment des conditions de culture préalablement rencontrées.(ii) Un outil basé sur la technologie Pall GeneDisc®a été développé pour permettre la quantification de l’expression génique par RT-qPCR.(iii) La corrélation des données Omic et de résistance acide a permis la sélection de biomarqueurs permettant de différencier les cellules les plus résistantes des cellules les plus sensibles présentent au sein d’une population bactérienne.(iv) Des corrélations linéaires et non linéaires ont également permis de définir des ‘direct biomarker’ qui correspondent aux gènes dont l’expression peut être linéairement corrélée à la résistance; et des ‘long-acting biomarker’ qui correspondent aux gènes dont l’expression transitoire est corrélée à une résistance acide stable.(v) Une analyse multivariée a été utilisée afin de prendre en compte les interactions entre l’expression des différents gènes impliqués dans la résistance acide et a permis la sélection de 9 gènes comme biomarqueurs de résistance acide. Enfin, des premières données prometteuses ont été obtenues. Il serait ainsi possible d’utiliser l’expression génique d’une population bactérienne à un instant donné pour prévoir sa survie dans un environnement létal
Predictive microbiology is a tool to assess food microbiological risks and optimise food processes. However predictive microbiology which predicts the bacterial behaviour does not take bacterial physiological state into consideration. The aim ofthis work is to identify molecular biomarkers to assess the impact of bacterial adaptation on the subsequent acid resistance. In this study, the acid resistance of Bacillus weihenstephanensis wasinvestigated and mRNAs were identified as acid resistance biomarkers.(i) The bacterial acid resistance of different mildstress adapted cells was quantified using cultural methods. Mild salt-adapted cells were less resistant than cells grown in optimal conditions;and the latter less resistant than acid-adaptedcells. However, the bacterial resistance of B.weihenstephanensis followed the same patternwhen facing acidic changes of the environment and that, whatever the environmental condition previously encountered.(ii) For RT-qPCR gene expression quantifications a specific rotative PCR device based on the PallGeneDisc® Technology was developed.(iii) Omic data and bacterial acid resistances correlation allows the selection of biomarkers to track the more resistant and the more sensitive cells present within the bacterial population.(iv) Both linear and non linear correlations allowed to define two types of biomarkers: ‘Directbiomarker’ for which expression patterns uponmild stress treatment were linearly correlated to the subsequent acid resistance and ‘long-actingbiomarkers’ which were transiently up-regulatedduring mild stress exposure and correlated to increased acid resistance over time.(v) A multivariate analysis was performed to correlate the acid bacterial resistance and the gene expression of vegetative cells. This mathematical method provides the advantage to take gene expressions and their interactions into account and allowed the selection of 9 genes as acid resistance biomarkers of B. weihenstephanensis. Finally, some promising results were also obtained. There by, it would be feasible to use gene expression at a given time to predict the bacterialsurvival behaviour in lethal acid conditions

Orientadores: Marcos Antonio Machado, Alessandra Alves de Souza
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia
Made available in DSpace on 2018-08-24T04:53:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Coqueiro_DanilaSouzaOliveira_D.pdf: 3034667 bytes, checksum: 7ce135c75da10c6b26032ec285344dc5 (MD5) Previous issue date: 2013
Resumo: Avaliou-se as alterações transcricionais em laranja 'Pera' (Citrus sinensis L. Osb.) promovidas por quitosana (CHI) e ácido salicílico (SA), utilizando RNA-seq, e o efeito destes compostos no controle do cancro cítrico (Xanthomonas citri subsp. citri) e da clorose variegada dos citros (CVC - Xylella fastidiosa). As plantas foram tratadas com CHI ou SA e após 48h e 24h, respectivamente, foram coletadas amostras foliares para avaliar seus transcriptomas. Para a avaliação dos eliciadores sobre o cancro cítrico e a CVC, as plantas foram tratadas com CHI ou SA e após 48h e 24h, respectivamente, inoculadas com as duas bactérias separadamente. A partir de 24h da inoculação, foram coletadas amostras foliares para avaliar a curva de crescimento de ambas as bactérias, a redução da severidade e/ou incidência das doenças e respostas de defesa da planta por RT-qPCR. Com os resultados do transcriptoma, observou-se que mais genes foram induzidos pelo tratamento com SA do que com CHI. O tratamento com SA aumentou a expressão de genes que participam da via de sinalização do SA na planta (WRKY50, PR2 e PR-9) e genes da biossíntese do etileno e ácido jasmônico (ACS 12, fator de transcrição contendo domínio AP2 e OPR3). Além disso, promoveu a indução de genes relacionados ao metabolismo secundário, processos redox e estresse biótico. No tratamento com CHI, foi observada maior indução de genes relacionados ao metabolismo secundário. Para ambos os tratamentos, a via da auxina foi reprimida. No experimento para controle do cancro cítrico, observou-se que ambos os eliciadores promoveram reduções na severidade e incidência da doença. Entretanto, a CHI pareceu não interferir diretamente na formação do biofilme pela bactéria, mas pode ter dificultado a multiplicação de X. citri na planta. O SA retardou a entrada da bactéria na planta e, aparentemente, inibiu mais a formação do biofilme bacteriano do que a CHI. Comparações da expressão gênica entre os eliciadores reforçam a ideia de que a CHI tem maior potencial de induzir resistência ao cancro cítrico do que SA. No experimento para o controle da CVC, observou-se que a CHI induziu importantes genes da via do SA (NPR1, TGA, EDS1) e etileno (EIN-3, PR-4) 24h após a inoculação. Aplicações exógenas de SA potencializaram o seu efeito endógeno na planta, pois houve indução de NPR1, TGA e PRs. Entretanto, não foi possível estabelecer uma relação clara entre a multiplicação de X. fastidiosa, a incidência da doença e o uso da CHI e SA em laranja 'Pera', já que na maioria das avaliações não houve redução da população bacteriana em amostras foliares e não houve redução da incidência em plantas tratadas. Com base nos resultados, observou-se que CHI e SA induziram diversos genes envolvidos em respostas de defesa em laranja 'Pera'. Entretanto, essas respostas podem ser moduladas diferencialmente a depender do patógeno que afeta a planta, pois os eliciadores foram eficientes no controle da X. citri, um patógeno que coloniza o mesófilo da planta, entretanto não foram efetivos no controle da X. fastidiosa, um patógeno que coloniza o xilema da planta, embora respostas de defesa tenham sido expressas nos momentos iniciais (24h) após a inoculação com X. fastidiosa
Abstract: This study was carried out to evaluate transcriptional modification in sweet orange 'Pera' (Citrus sinensis L. Osb.), promoted by chitosan (CHI) and salicylic acid (SA), using RNA-seq, and the effect of these compounds on citrus canker (Xanthomonas citri subsp. citri) and citrus variegated chlorosis (CVC - Xylella fastidiosa). Plants were treated with CHI or SA and after 48h and 24h, respectively, leaf samples were collected to assess the transcriptome. In the experiments for disease assessment, the plants were treated with CHI or SA and after 48h and 24h, respectively, inoculated. Starting from 24h after inoculation, leaf samples were collected to evaluate the multiplication of the pathogens (X. citri and X. fastidiosa), reduction of the severity and / or incidence and plant defense responses by RT-qPCR. Based upon the transcriptome results, it was observed that more genes were induced by SA than by CHI. SA treatment increased the expression of genes that participate in the SA signaling pathway in the plant (WRKY50, PR2 and-PR9), and genes involved in the biosynthesis of ethylene and jasmonic acid (ACS 12, transcription factor containing AP2 and OPR3 domain). Besides these, SA promoted induction of genes of secondary metabolism, redox processes and biotic stress. The treatment with CHI exhibited higher induction of genes related to secondary metabolism. For both treatments, the auxin pathway was suppressed. In the experiment for the control of citrus canker, it was observed that both elicitors reduced the severity and incidence of the disease. However, CHI seems not to interfere directly in biofilm formation, but may have hindered the multiplication of X. citri in the plant. The SA slowed down the entry of the bacteria into the plant and, apparently, inhibited the formation of biofilm more efficiently than the CHI. Comparisons of gene expression between elicitors reinforce the idea that CHI has higher potential to induce resistance to citrus canker than SA. In the experiment for the control of CVC, it was observed that the CHI induced important genes of the SA (NPR1, TGA, EDS1) and ethylene (EIN-3, PR-4) pathways 24h after inoculation. Exogenous applications of SA potentiated its endogenous effect in the plant, since there was induction of EDS-1, NPR1, TGA and PRs. However, it was not possible to establish a clear relationship between the multiplication of X. fastidiosa, the incidence of the disease and the use of CHI and SA in 'Pera' sweet orange, since most of the assessments did not show reduction of bacterial populations in leaf samples and there was no reduction of the incidence in treated plants. Based upon the results of this study, it was observed that CHI and SA induced several genes involved in defense responses in 'Pera' sweet orange. However, these responses can be modulated differentially depending on the pathogen that affects the plant. This fact was demonstrated in this study, as elicitors were effective in controlling X. citri, a pathogen that colonizes the mesophyll of the plant, but were not effective in controlling X. fastidiosa, a pathogen that colonizes the xylem of the plant, although defense responses were expressed in the early stages (24 h) after inoculation with X. fastidiosa
Doutorado
Bioquimica
Doutora em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Adriana Zerlotti Mercadante, Fabio Marcio Squina
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos
Made available in DSpace on 2018-08-25T13:26:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mandelli_Fernanda_D.pdf: 50728289 bytes, checksum: 659e38d75c97749e6177d608199540ba (MD5) Previous issue date: 2014
Resumo: Espécies reativas de oxigênio (ERO) e nitrogênio (ERN) são geradas dentro das células pela exposição a agentes endógenos e exógenos, estas espécies, quando em níveis normais, encontram-se envolvidas na produção de energia, regulação do crescimento celular, sinalização intercelular e síntese de substâncias biológicas importantes. Por outro lado, se produzidas em excesso, podem provocar oxidação lípidica, de proteínas ou do DNA causando o que conhecemos por estresse oxidativo. Para combater o excesso de espécies reativas, os organimos produzem moléculas antioxidantes tais como os carotenoides e enzimas como superóxido dismutase e catalase. No entanto, é difícil apontar as estratégias de adaptação dos micro-organismos em resposta a diferentes condições de estresse através do estudo individual de moléculas produzidas. Diante do exposto, esta pesquisa teve por objetivo elucidar o genoma, proteoma e transcriptoma bem como a produção de carotenoides da bactéria termófila Thermus filiformis quando submetida à algumas condições de cultivo: presença e ausência de H2O2 e temperatura de crescimento abaixo (63 ?C) e acima (77 ?C) do seu ótimo (70 ?C). Para tanto, o genoma e transcriptoma foram analisados com o emprego de tecnologias de sequenciamento de última geração e ferramentas computacionais, e a proteômica e os carotenoides foram caracterizados por cromatografia líquida e espectrometria de massas. Além disso, devido à conhecida capacidade antioxidante e alto potencial de aplicabilidade na indústria farmacêutica, cosmética e de formulação de alimentos, foi feita a clonagem, expressão e caracterização da enzima superóxido dismutase de Thermus filiformis (TfSOD). A TfSOD apresentou atividade enzimática utilizando como cofator tanto manganês quanto ferro e termoestabilidade a até 80 ?C. O sequenciamento de DNA produziu um total de 9.680.471 reads pareados e uma montagem com n50 = 85,2Kb, n90 = 17,1kb, contig de maior tamanho com 275,5kb e um tamanho total de 2,46MB. A predição genética resultou em 2.403 genes codificadores de proteínas. Na análise de transcriptoma, 97,1% dos genes codificadores de proteínas preditos apresentaram expressão com valores detectáveis de RSEM (RNA-Seq by Expectation-Maximization). Através da análise do transcriptoma foram identificados 37% e 5,86% dos genes diferencialmente expressos (p-valor<0,05) nos ensaios com diferentes temperaturas e com e sem adição de H2O2, respectivamente. Através da análise do proteoma, no ensaio com diferentes temperaturas, foi encontrado um total de 27,7% proteínas diferencialmente expressas com um FDR (False Discovery Rate) < 0,05%, sendo 20% significativamente diferentes (p-valor<0,05, teste T) e, no ensaio com e sem adição de H2O2, um total de 28,3% com um FDR < 0,05%, sendo 6% significativamente diferentes (p-valor<0,05, teste T). Algumas diferenças foram observadas na produção de carotenoides de acordo com cada condição de cultivo. Quanto ao perfil de carotenoides, nas condições a 70 ?C e a 77 ?C os carotenoides majoritários foram termozeaxantina-15 e termozeaxantina-13, enquanto que para condição a 63 ?C foram termozeaxantina-15 e zeaxantina livre. A amostra cultivada a 70 ?C sem adição de H2O2 apresentou a maior quantidade de carotenoides totais (1.516 ?g/g), por outro lado o extrato rico em carotenoides que apresentou maior capacidade de desativação do radical peroxila (50,5) foi o da amostra com adição de H2O2. Os resultados do presente estudo mostram que os principais processos afetados pela mudança de temperatura e adição de peróxido de hidrogênio foram: catabolismo, transcrição e tradução de proteínas. Observou-se também que a alteração na temperatura teve uma maior influencia na expressão diferencial de genes e proteinas do que a adição de peróxido. Através das análises do trancriptoma e do proteoma de T. filiformis foram identificadas enzimas termo-estáveis com potencial de aplicação industrial, como por exemplo alfa-amilases, alfa-galactosidases e esterases. Além disso, o extrato rico em carotenoides dessa bactéria apresentou capacidade de desativar o radical peroxila superior à capacidade de extratos de frutas e até mesmo de padrões de carotenoides
Abstract: Reactive oxygen (ROS) and nitrogen (RNS) species are produced in the cells by exposure to endogenous and exogenous agents, these species, when at normal levels, are involved in energy production, cell growth regulation, intercellular signaling and synthesis of important biological substances. On the other hand, if overproduced, can cause lipid, protein and DNA oxidation, leading to what is known as oxidative stress. To combat excessive reactive species, organisms produce antioxidant molecules such as carotenoids and enzymes such as superoxide dismutase and catalase. However, it is difficult to point out the adaptation strategies of microorganisms in response to different stress conditions through the study of individual molecules. Therefore the aim of this research was to elucidate the genome, proteome and transcriptome, as well as the carotenoid production of Thermus filiformis when submitted to the some cultivation conditions under stress: without and with hydrogen peroxide and temperature below (63 ?C) and above (77 ?C) the optimum (70 ?C). In order to achieve this aim, the genome and transcriptome were analyzed using next generation technology and computational tools, and proteome and carotenoids were characterized by liquid chromatography and mass spectrometry. Moreover, due to its known antioxidant capacity and potential application on pharmaceutical, cosmetics and food formulations, a superoxide dismutase from Thermus filiformis (TfSOD) was cloned, expressed and characterized. The TfSOD showed cambialistic characteristics, once it had enzymatic activity with either manganese or iron as cofactor and thermostability until 80 ?C. The DNA sequencing produced a total of 9,680,471 paired reads and the produced assembly had an n50 = 85.2Kb, n90 = 17.1kb, the largest contig size = 275.5kb and total size of 2.46MB. Gene prediction resulted in 2,403 protein coding genes. In the transcriptome analysis, 97.1% of predicted protein coding genes showed detectable expression with RSEM values (RNA-Seq by Expectation-Maximization). Through the computational analysis of T. filiformis transcriptome 37% and 5.86% of the genes significantly different (p-value < 0.05) in the assays with different temperatures and with and without H2O2 were identified, respectivelly. In the total proteome analysis a total of 27.7% proteins were differentially expressed with a FDR (False Discovery Rate) < 0.05%, being 20% significantly different (p-value < 0.05, T-test) in the temperature assay and 28.3% proteins with a FDR (False Discovery Rate) < 0.05%, being 6% significantly different (p-value < 0.05, T-test) in the H2O2 assay. Some changes were observed in the carotenoid production according to the cultivation condition. Regarding to the carotenoid profile, the major carotenoids under conditions at 70 ?C (without and with H2O2) and at 77 ?C were thermozeaxanthin-15 and thermozeaxanthin-13 while at 63 ?C were thermozeaxanthin-15 and free-zeaxanthin. The sample cultivated at 70 ?C without H2O2 showed the highest amount of total carotenoid (1516 ?g/g of dry mass), on the other hand the sample with the highest antioxidant capacity was the one cultivated at 70 ?C with H2O2. The carotenoid rich extract of all conditions studied showed a peroxyl scavenging capacity higher than those carotenoid rich extracts from some fruits and from some carotenoid standards, demonstrating the potential applicability of T. filiformis extracts in industry. The results of this study show that the main processes affected by temperature change and addition of H2O2 were: catabolism, transcription and protein translation. It was also observed that the change in temperature has greater influence on the differential expression of genes and proteins than the H2O2 addition. Through trancriptome and proteome analysis of T. filiformis thermostable enzymes have been identified with potential industrial applications, such as alpha-amylases, alpha-galactosidases and esterases. Moreover, the extract rich in carotenoids of this bacterium had a greater peroxyl radical scavenging capacity than the capacity of fruit extracts and even carotenoids standards
Doutorado
Ciência de Alimentos
Doutora em Ciência de Alimentos

Les progrès fulgurants de ces dix dernières années réalisés dans les domaines de la microinformatique et de la microfluidique associés au génie génétique (PCR et séquençage) ont permis un changement d'échelle dans la quantité des données acquises au cours d'une même expérience. La transcriptomique est directement issue de ces avancées technologiques. Ce mémoire présenté pour l'obtention d'une Habilitation à Diriger des Recherdes porte sur l'analyse du transcriptome de la bactérie intracellulaire obligatoire des pucerons, Buchnera aphidicola. Dans la première partie, les principales méthodes d'analyses statistiques différentielles et d'intégration des données transcriptomiques sont présentées sous la forme d'une analyse bibliographique. La deuxième partie est consacrée au développement d'outils bioinformatiques : ROSO, un logiciel d'optimisation des sondes oligonucléotidiques, la puce Buchnera et SITRANS, un système d'information pour la gestion et la publication des données d'expression. Enfin, la dernière partie est consacrée à la caractérisation du transcriptome de Buchnera en condition de stress trophique de son hôte, le puceron du pois Acyrthosiphon pisum. La régulation transcriptionnelle chez les bactéries symbiotiques intracellulaires à génome réduit est encore actuellement très mal connue. Cette question sera abordée chez Buchnera tout d'abord au niveau évolutif par l'étude de la relation entre l'expression des gènes et leur organisation dans le génome, puis au niveau fonctionnel, par la caractérisation de la réponse de la bactérie à une diminution de la quantité d'acides aminés essentiels dans le substrat nutritif du puceron, combinée à un stress osmotique.

La colonisation de la plante par les bactéries phytostimulatrices du genre Azospirillum est un aspect important de la symbiose associative avec le végétal, mais les réponses de la bactérie à la présence de la plante et de ses exsudats sont peu connues. L’influence des exsudats du blé sur le transcriptome d’Azospirillum a été étudiée par (i) une approche globale sans a priori, afin d’identifier les gènes induits en présence d’exsudats, et (ii) une approche ciblée, portant sur l’analyse du gène phytobénéfique acdS. La première, fondée sur l’induction différentielle de fluorescence (DFI) et la cytométrie en flux, a identifié de nouveaux gènes induits, dont nirK (nitrite réductase). La seconde a montré que plusieurs constituants présents dans les exsudats régulent la transcription d’acdS. Ce travail indique que les exsudats ont un effet important sur l’expression génique du partenaire bactérien
Plant colonization by phytostimulating bacteria of the genus Azospirillum is an important aspect of the associative symbiosis with the plant, but bacterial responses to the presence of the plant and its exudates are poorly documented. The effect of wheat exudates on Azospirillum transcriptome was studied by following (i) a global approach without a priori, in order to identify exudate-induced genes, and (ii) an approach targeting the phytobeneficial gene acdS. The first one, based on differential fluorescence induction (DFI) promoter trap technique and flow cytometry, identified new exudates-induced genes including nirK (nitrite reductase). The second one showed that several compounds found in exudates regulate the transcription of acdS. This work indicates that exudates have an important effect on gene expression in the bacterial partner

Dans le but de caractériser la pollution métallique dans l’environnement, seules des analyses chimiques exhaustives sont réalisées. Alors que celles-ci sont sensibles et spécifiques, le manque d’informations concernant la biodisponibilité des polluants présents rend l’information incomplète. Pour remédier à ce problème, des bactéries détectrices ont été développées. Permettant la quantification de la fraction biodisponible d’un polluant et l’évaluation de la toxicité associée, ces bioessais ont largement été utilisés au cours des deux dernières décennies. Cependant, malgré les avantages de cette technique, les études reportent leur manque de spécificité, limitant ainsi leurs applications environnementales. Cette thèse cherche à établir une méthodologie d’analyse complète en vue de l’étude de la contamination métallique à destination d’échantillons environnementaux. Tout d’abord, des bioessais ont été développés pour la détection de trois métaux. Pour pallier la faible spécificité de ces souches, une analyse transcriptomique à l’échelle du génome de la bactérie E. coli a aussi été réalisée. Suite à l’établissement et à la validation de la méthodologie d’analyse d’importants jeux de données, des profils de réponse transcriptomiques spécifiques de (i) la présence de métal et de (ii) la concentration en métal ont été établis. Ceux-ci permettent de détecter les métaux et de quantifier la toxicité associée à la présence de mélanges de métaux dans divers environnements. Enfin, par le développement et le couplage des analyses biologiques et chimiques, nous avons mis en évidence le potentiel de cette méthode pour une caractérisation complète des pollutions environnementales
In order to characterize the metallic pollution in the environment, only exhaustive chemical analyzes are performed. While these analyses are sensitive and specific, the lack of information on the bioavailability of pollutants makes this characterization incomplete. To address this problem, biosensing bacteria have been developed. Allowing the quantification of the bioavailable fraction of a pollutant and the evaluation of the associated toxicity, these bioassays have been widely used during the last two decades. However, despite the advantages of this technique, many studies have reported their lack of specificity, limiting their use for environmental applications. This thesis aims to establish a complete methodology of analysis for metallic contamination of environmental samples. In the first part, bioassays were developed for the detection of three metals. To overcome the low specificity of these strains, genome-wide transcriptomic analysis of E. coli bacterium was also performed. Following the establishment and the validation of the methodology for large datasets analyzes, specific transcriptomic response profiles dedicated to (i) the presence of metal and (ii) their concentrations were established. These profiles allow the detection of mixed metals in various environmental matrices. Thus, through the development and coupling of biological and chemical analyzes, we have highlighted the potential of this method for a complete characterization of environmental pollution

Les composés organiques hydrophobes (HOCs), lipides et hydrocarbures, représentent une part significative de la matière organique dans l’environnement marin. Leur faible solubilité dans l’eau exige de la part des bactéries qui les dégradent des adaptations physiologiques permettant de stimuler leur transfert de masse de la phase organique vers la phase aqueuse où ils sont assimilés. La formation de biofilm à l’interface HOC-eau est l’une de ces adaptations. La bactérie marine Marinobacter hydrocarbonoclasticus (Mh), qui est capable d’utiliser un catalogue assez large de HOCs comme les alcanes, les alcools gras et les triglycérides, a été utilisée comme modèle d’étude de la formation de biofilms aux interfaces HOCs-eau. Le but de mes recherches était de : (i) mener la caractérisation fonctionnelle des gènes aupA et aupB, qui sont surexprimés en condition de biofilm sur hexadécane et (ii) dresser, par une étude de transcriptomique, une liste de gènes potentiellement impliqués dans l’adhésion et la formation de biofilm aux interfaces HOCs-eau dans le but d’appréhender les mécanismes moléculaires mis en jeu. L’étude fonctionnelle de aupA et aupB a révélé que ces deux gènes forment un opéron dont l’expression est activée par divers types de HOCs. Il a aussi été démontré qu’ils sont impliqués dans le transport de l’hexadécane et dans la formation de biofilm sur alcanes. La protéine AupA est localisée dans la membrane externe de Mh et AupB, une lipoprotéine présumée, est située dans la membrane interne. AupA appartient à une sous-famille de transporteurs FadL-like, spécifique des bactéries marines hydrocarbonoclastes (HCB). La distribution phylogénétique de l'opéron aupAB limitée aux bactéries marines ayant la capacité de dégrader les alcanes et sa présence en nombreuses copies chez certaines souches d’Alcanivorax sp. suggèrent fortement que les protéines Aup joueraient un rôle primordial dans l’adaptation des HCB à l’utilisation d’alcanes comme sources de carbone et d’énergie. L’analyse transcriptomique des cellules de Mh adhérées (après 15 min ou 3 h de contact) ou formant un biofilm aux interfaces HOCs-eau a révélé une modification importante et précoce de leur transcriptome. De nombreux gènes intervenant dans le métabolisme des HOCs, la production de polysaccharides, la synthèse d’acides aminés et de protéines ribosomales présentent une expression modulée dès 15 min d’adhésion. La surexpression des gènes de flagelle et du chimiotactisme conjointement avec celle de gènes de pili en condition d’adhésion évoquent une possible mobilité des cellules de Mh à l’interface dans les étapes précoces du développement du biofilm. De plus, il semblerait que le facteur de transcription RpoN soit impliqué dans la régulation de la formation de biofilm chez Mh et que les prophages puissent intervenir dans la structure et/ou la dispersion du biofilm. Enfin, le rôle potentiel d’un îlot génomique dans la formation de biofilm sur trioléine a été suggéré
Hydrophobic organic compounds (HOCs), such as lipids and hydrocarbons, represent a significant part of the organic matter in the marine environment. Their low solubility in water requires from bacteria that degrade them physiological adaptations to stimulate their mass transfer from the organic to the aqueous phase where they are assimilated. Biofilm formation at the HOC-water interface is one of those adaptations. The marine bacterium Marinobacter hydrocarbonoclasticus (Mh) which is able to use a broad range of HOCs such as alkanes, fatty alcohols and triglycerides, was used as a model to study the biofilm formation at HOCs-water interfaces. The aim of my research was to (i) conduct the functional characterization of aupA and aupB genes which are overexpressed in biofilm on hexadecane, (ii) draw up a list of genes, through a transcriptomic study, that are potentially involved in adhesion and biofilm formation at HOCs-water interfaces in order to understand the molecular mechanisms involved.Functional study of aupA and aupB revealed that these two genes form an operon whose expression is activated by various types of HOCs. They have also been shown to be involved in the transport of hexadecane and in biofilm formation on alkanes. The AupA protein is localized in the outer membrane and the predicted lipoprotein AupB is located at the inner membrane. AupA belongs to a subfamily of the FadL-like transporters, specific to marine hydrocarbonoclastic bacteria (HCB). The phylogenetic distribution of the aupAB operon restricted to marine bacteria having the ability to degrade alkanes and its presence in multiple copies in somestrains of Alcanivorax sp. strongly suggest that Aup proteins play a key role in the adaptation of HCB to use alkanes as carbon and energy sources. The transcriptomic analysis of Mh cells adhering (after 15 min or 3 h of contact) or forming a biofilm at HOCs-water interfaces revealed significant and early changes in their transcriptome. The expression of many genes involved in the metabolism of HOCs, polysaccharides production, amino acids and ribosomal proteins synthesis is modulated as early as 15 min of adhesion. The overexpression of flagella and chemotaxis genes together with that of pili in adhesion condition suggest a possible motility at the interface during the early stages of biofilm development. In addition, it appears that the transcription factor RpoN is involved in the regulation of biofilm formation in Mh and that prophages could play a role in the structure and/or dispersal of the biofilm. Finally, a potential role of a genomic island in biofilm formation ontriolein was suggested

Mestrado em Biotecnologia
O tributilestanho (TBT) é um composto tóxico com efeitos nefastos para o ambiente. Este composto foi utilizado durante vários anos como componente de tintas anti-vegetativas aplicadas nos cascos dos barcos sendo, por isso, reconhecido mundialmente como uma das fontes de contaminação de ambientes aquáticos. Atualmente, o uso destas tintas está proibido em alguns países, verificando-se uma diminuição na concentração de TBT no ambiente. Apesar disso, devido à estabilidade e persistência deste composto (principalmente nos sedimentos), a poluição por TBT continua a ser preocupante. Aeromonas molluscorum Av27 foi isolada no sedimento da Ria de Aveiro, num local contaminado por TBT. Esta bactéria é tolerante a concentrações elevadas de TBT (até 3 mM) e é capaz de degradar o composto nos seus derivados menos tóxicos, DBT e MBT. Com o intuito de conhecer o(s) mecanismo(s) molecular(es) que estão na base destas propriedades, procedeu-se à análise do transcriptoma desta estirpe por pirosequenciação. Para isso, para além da condição controlo (sem TBT), as células foram expostas a 5 e 50 μM de TBT até atingirem o meio da fase exponencial. A validação dos resultados de pirosequenciação foi feita por PCR em tempo real. De uma forma geral, a análise dos transcriptomas de A. molluscorum Av27 revelou a presença de diversos genes sobre-expressos após exposição ao TBT. Os genes que se relacionam com a atividade enzimática e o transporte/ligação de compostos foram aqueles que sofreram maiores alterações a nível de expressão, propondo-se desta forma o seu envolvimento nos mecanismos de resistência e degradação de TBT. Alguns dos genes sobre-expressos identificados codificam para bombas de efluxo e outras proteínas envolvidas na resistência a antibióticos e metais pesados, corroborando a relação entre a resistência a estes compostos e a resistência ao TBT. Para além disso, foi sugerido que proteínas envolvidas na resposta ao stress térmico podem também desempenhar um papel importante na resistência ao TBT. Tendo em conta a análise feita, não foi possível encontrar uma proteína responsável pela degradação do TBT. No entanto, foram detetadas várias proteínas sobre-expressas de função desconhecida. A anotação destas proteínas é de grande importância, uma vez que poderá contribuir para a elucidação do mecanismo de degradação de TBT nesta bactéria. Em estudos anteriores, demonstrou-se que o gene sugE está envolvido no mecanismo de resistência ao TBT em Av27 e que o seu nível de expressão está dependente da fase de crescimento das células. No presente estudo, foi possível confirmar que o gene sugE é sub-expresso na presença de TBT quando as células atingem a sua fase exponencial. Foi ainda possível notar que genes relacionados com a transcrição estão sub-expressos após exposição ao TBT, indicando que este composto afeta a transcrição genética. O estudo detalhado dos genes identificados neste trabalho, potencialmente envolvidos no mecanismo de resistência e/ou degradação do TBT, poderá contribuir para a compreensão destes mecanismos em A. molluscorum Av27, assim como noutros organismos procariotas.
Tributyltin (TBT) is a toxic compound with a negative impact to the environment. This compound was used for several years as a component of antifouling paints applied to ship hulls, thus contaminating several aquatic environments worldwide. Currently, the use of these paints is prohibited in several countries, and there has been a consequent decrease of TBT concentration in the environment. However, due to the stability and persistence of the compound (mainly in the sediments), TBT pollution remains a serious problem. Aeromonas molluscorum Av27 was isolated in the sediments of Ria de Aveiro, in a TBT contaminated site. This bacterium is tolerant to high TBT concentrations (up to 3 mM) and is able to degrade it into the less toxic compounds DBT and MBT. In order to better understand the molecular mechanism(s) conferring these properties, a transcriptome analysis was carried out. In addition to the control (without TBT), the cells were grown to the mid-log phase in presence of different TBT concentrations (5 and 50 μM). Pyrosequencing analysis was performed in each of the samples. Validation of the transcriptome results was performed by quantitative real-time PCR. The analysis of the transcriptomes of A. molluscorum Av27 revealed that several genes were up-regulated following exposure to TBT. Genes responsible for enzymatic activities and transport/binding were the most affected by TBT exposure and thus, those genes seem to be involved in TBT resistance and degradation. Some efflux pumps and other proteins involved in resistance to antibiotics or heavy metals were found over-expressed when Av27 cells were exposed to TBT, supporting the relationship between the resistance to these compounds and resistance to TBT. Furthermore, a possible role of heat-shock proteins in TBT resistance in A. molluscorum Av27 was also suggested. So far, the analysis of the transcriptome didn’t allow the identification of the protein responsible for TBT degradation in A. molluscorum Av27. However, several proteins of unknown function were over-expressed in the presence of the toxic compound. The annotation of such proteins is important, since it might help to elucidate the TBT degradation mechanisms in this bacterium. Previous studies demonstrated that the sugE gene is involved in TBT resistance in Av27 strain, and that its’ expression levels depend on the growth phase. Likewise, in the present study, the sugE gene was over-expressed when the cells were grown to the mid-log phase. It was also verified that several transcription-related genes were under-expressed in A. molluscorum Av27 following exposure to TBT, suggesting that this compound negatively affects genetic transcription. Further investigation of the genes potentially involved in TBT resistance/degradation may contribute to a better understanding of these mechanisms in A. molluscorum Av27, as well as in other prokaryotes.

L'association entre la bactérie Buchnera aphidicola et les pucerons est l'un des modèles de symbiose les plus étudiés aux plans évolutif, biochimique et plus récemment moléculaire. Il est admis que Buchnera fournit les acides aminés essentiels aux pucerons, qui se nourrissent de la sève phloémienne des plantes, aliment particulièrement pauvre en apports protéiques. La question des mécanismes de régulation du symbiote en réponse aux exigences nutritionnelles de son hôte reste cependant ouverte. Pour répondre à cette question, dans la première partie de cette thèse, nous avons analysé les relations entre l'expressivité des gènes et l'organisation du chromosome de Buchnera et montré qu'il existe une influence réciproque entre ces deux paramètres. Dans la deuxième partie de ce travail nous avons mis en évidence que la bactérie est capable d'ajuster la néosynthèse de leucine en réponse à des concentrations changeantes de cet acide aminé dans l'alimentation de son hôte. Les mécanismes moléculaires sous-jacents sont constitués par une réponse transcriptionnelle rapide complétée, plus tardivement, par une modification du nombre de copies du plasmide pLeu, portant les gènes de biosynthèse de la leucine. L'ensemble de ces résultats suggère que Buchnera a conservé, malgré la réduction de son génome, des capacités régulatrices essentielles pour l'adaptation du puceron aux contraintes de son environnement
The association between the bacterium Buchnera aphidicola and the aphids is one of the best studied examples of symbiosis in terms of evolution, biochemical exchanges and, more recently, molecular interactions. It is admitted that Buchnera provides the insects with essential amino acids, nutrients in short supply in the sole source of food for aphids, the plant phloem sap. However, the question of the molecular mechanisms regulating the response of the symbiont to the changing demands imposed by the host remains open. To answer this question, in the first part of this thesis, we analyzed the relationships between gene expression levels and chromosome organization in Buchnera, and we showed a reciprocal influence of these two parameters. In the second part of this work, we demonstrated that the bacterium is able to adjust its leucine biosynthesis levels in response to variations of the concentration of this amino acid in the aphids diet. The underlying molecular mechanisms consist of a fast transcriptional response, followed by a modification of the copy number of the pLeu plasmid, which carries the leucine biosynthetic genes. All these results suggest that Buchnera has preserved, in spite of the reduction of its genome, regulatory capabilities that are essential for the aphids adaptation to environmental constraints

L'objectif de ce travail est d'identifier des gènes responsables de la variabilité génétique de l'état d'engraissement chez le poulet et les structures génétiques particulières impliqués. Une démarche " gènes candidats " sur deux populations de poulets d'élevage présentant des aptitudes différentes à l'engraissement (grasse ou maigre) a mis en évidence une différence de taux d'ARN messagers (ARNm) pour plusieurs gènes impliqués dans le métabolisme hépatique des lipides (Daval et al. , 2000). Une analyse de liaison génétique au caractère adiposité montre que ceux-ci ne sont pas à l'origine de la différence phénotypique observée. Ces résultats suggèrent cependant une régulation coordonnée des gènes de la lipogénése. Suite à cette approche " gènes candidats ", une démarche anonyme par analyse différentielle des ARNm hépatiques, a été mise en place en 1998. Cette approche en differential display (DD) a permis d'isoler plusieurs centaines de fragments d'ADNc potientiellement différentiels entre animaux gras et maigres (Carre et al. 2001) qui ont fait l'objet des travaux présentés dans ce manuscrit. L'étude de l'expression de quelques produits du DD par Northern-blot a permis de montrer que l'un deux, correspond au gène codant le CYP2C45 est 3 fois plus exprimé chez les animaux maigres (Carre et al. 2002). Ces molécules étant connues dans d'autres espèces pour leur capacité à transformer les acides gras polyinsaturés notamment, nous avons cherché à mieux comprendre le fonctionnement du CYP2C45 ex vivo, dans un système cellulaire d'hépatome de poulet (cellules LMH)

L'objectif de cette thèse est l'étude par la technologie des puces à ADN, du transcriptome de la bactérie Buchnera aphidicola, qui vit en symbiose avec le puceron du pois Acyrthosiphon pisum. Le génome extrêmement réduit de Buchnera a perdu l'essentiel de ses gènes de régulation, mais conserve les voies de biosynthèse permettant la production des acides aminés essentiels pour son hôte. La première partie de cette thèse concerne le développement du logiciel ROSO, qui permet de déterminer les sondes oligonucléotidiques destinées aux puces. Une interface a été conçue pour son utilisation en ligne (http://pbil.univ-lyon1.fr/roso). Dans une seconde partie, la conception et l'utilisation d'une puce dédiée à Buchnera ont permis d'étudier le transcriptome de la bactérie, lorsque son hôte subit un stress nutritionnel et osmotique. Cette analyse montre que Buchnera est capable de réguler son expression génique et de réorienter son métabolisme, pour répondre à la demande changeante de son hôte.

A citricultura destaca-se dentro do agronegócio brasileiro gerando dividendos diretos com exportações e empregos, e indiretos com arrecadação de impostos. No entanto, ainda padece com problemas fitossanitários, com destaque para o HLB (Huanglongbing, HLB, ex-greening), que nos últimos dez anos tem dizimado pomares e provocado o abandono da cultura por muitos produtores. Causada no Brasil pelas bactérias Candidatus Liberibacter asiaticus e Ca. Liberibacter americanus, é uma doença sistêmica, restrita aos vasos do floema, e induz ao aparecimento de sintomas semelhantes àqueles causados por deficiência de nutrientes em folhas e ramos, frutos com tamanhos reduzidos e assimétricos e coloração amarelada das plantas, tornando-as economicamente inviáveis. A transmissão da doença acontece naturalmente pelo inseto Diaphorina citri, e artificialmente por meio de borbulhas contaminadas. Todas as variedades de citros e rutáceas próximas são comprovadamente suscetíveis ao HLB; entretanto, há diferenças marcantes entre níveis de suscetibilidade entre os genótipos, como Poncirus trifoliata, que apresenta certa resistência ou tolerância à doença. Os mecanismos de patogenicidade de Ca. Liberibacter spp. e a resposta molecular da planta à infecção ainda não estão bem definidos e o estudo da ativação dos mecanismos de defesa da planta induzidos por hormônios vegetais é um importante foco na elucidação deste complexo patossistema. Diante deste panorama, este estudo propôs avaliar o perfil de expressão de genes associados às vias do jasmonato e do etileno em plantas de Citrus sinensis L. Osb. (suscetível) e Poncirus trifoliata (L.) Raf. (resistente ou tolerante) em resposta à infecção pelas duas espécies de bactérias causadoras do HLB no Brasil, separadamente. Os perfis transcricionais dos genes avaliados não foram estatisticamente distintos, mas mereceram destaque os genes de biossíntese e metabolismo de jasmonato LOX2, AOC3 e JMT, os genes sinalizadores da via de jasmonato JAZ2 e MYC2, o gene de biossíntese de etileno SAM1, os receptores de etileno ETR1, ERS1 e EIN4, o regulador negativo de etileno CTR1, o regulador positivo da sinalização de etileno EIN2, os fatores de transcrição EIN3, EIL1, ERF1, ERF2, ERF/AP2, uma MAPkinase MAPK6 e uma proteína PR PR-4. Estes resultados mostram que as vias sinalizadas por jasmonato e etileno são modificadas pelas bactérias Ca. Liberibacter spp. No entanto, não foi possível comprovar a importância destas vias na resposta diferencial de genótipos suscetível e resistente/ tolerante de citros ao HLB.
The citrus industry stands out in the Brazilian agribusiness generating direct and indirect jobs and significant revenues. However, the citrus crop faces several diseases, especially the HLB (Huanglongbing, ex-greening), which, in the last ten years, have caused severe losses to growers. In Brazil, HLB is caused by the bacteria Candidatus Liberibacter asiaticus and Ca. Liberibacter americanus, which are restricted to the phloem and induce symptoms similar to those caused by nutrient deficiency in citrus leaves and branches. Fruits are of reduced size and asymmetrical, and the plants tend to show overall yellowing. These symptoms altogether lead to the economical death of the plant. Transmission of the pathogens occurs naturally by the Asian citrus psyllid Diaphorina citri, or by contaminated buds. All citrus varieties and relatives are considered susceptible to HLB; however, there are clear differences in levels of susceptibility among genotypes. Poncirus trifoliata, for instance, exhibits some resistance or tolerance to the disease. The mechanisms involved in the pathogenesis of Ca. Liberibacter spp. and the molecular responses of the hosts to the infection are still unknown, but emphasis has been given to the defense mechanisms induced by plant hormones in order to try to elucidate the interactions of such complex pathosystem. Based on this scenario, this study aimed to evaluate the expression profile of Citrus sinensis (L.) Osb. (susceptible) and Poncirus trifoliata (L.) Raf. (resistant or tolerant) genes associated with the jasmonate and ethylene pathways in response to infection by both species of Ca. Liberibacter spp. causing HLB in Brazil, separately. The transcriptional profiles did not differ statistically, for the evaluated genes, including those in the jasmonate biosynthesis and metabolism (LOX2, AOC3 and JMT), signaling pathway (JAZ2 and MYC2), biosynthesis of ethylene (SAM1), ethylene receptors (ETR1, ERS1 and EIN4), negative regulator of ethylene (CTR1), positive regulator of ethylene signaling (EIN2), transcription factors (EIN3, EIL1, ERF1, ERF2, ERF/AP2), a MAPkinase (MAPK6) and a PR protein (PR-4). These results suggest that the jasmonate and ethylene pathways exhibit some modulation caused by the bacteria Ca Liberibacter spp. However, it does not seem that these pathways are relevant for the differential response of susceptibility or resistance/ tolerance of the citrus genotypes to HLB.

Les mesures des niveaux d'expression de tous les gènes d'un génome requièrent une analyse
statistique afin d'obtenir des conclusions fiables. Les biologistes ont du mal à faire un choix dans la
foule de méthodes existantes. Afin de déterminer quelle méthode est la plus adéquate pour la
problématique abordée, des comparaisons de méthodes d'analyse disponibles sont nécessaires.
Actuellement les critères de comparaison se révèlent soit lacunaires ou soit non pertinents du point de
vue biologique.
Nous avons introduit un nouveau critère biologique de comparaison des méthodes d'analyse du
transcriptome fondé sur une structure des génomes bactériens : les opérons. Les gènes d'un opéron
sont généralement transcrits sur un même ARNm. Si un gène d'un opéron bactérien est identifié, les
autres gènes de l'opéron devraient l'être également. Nous avons ainsi comparé des méthodes
d'analyse appliquées au transcriptome : l'ACP et l'ACI, respectivement analyses en composantes
principales et indépendantes, l'ANOVA, analyse de variance, la régression des moindres carrés
partiels PLS et différents t-tests. Chaque méthode aborde le nuage de données d'un point de vue
différent ce qui donne des résultats complémentaires. Globalement, l'ACI a fourni les meilleurs
résultats tant en sensibilité qu'en terme de précision.
Un autre aspect, en plein développement, de l'analyse du transcriptome est la méta-analyse de
données d'origines diverses malgré les biais inhérents à cette technologie. Généralement ces métaanalyses
visent à préciser les résultats concernant des gènes différentiellement exprimés ou coexprimés.
Elles ouvrent également la possibilité d'étudier de nouveaux champs en biologie. Nous
avons utilisé des données de transcriptome indépendantes afin d'étudier l'organisation de l'expression
des gènes et, ainsi, celle du chromosome bactérien. L'étude du transcriptome de trois bactéries, B.
subtilis, E. coli et S. meliloti a révélé des corrélations d'expression à longue distance valables quel que
soit le gène étudié. Les structures en opéron se manifestent clairement au travers de cette étude, qui
a également permis de préciser que la co-expression de gènes proches s'étend au-delà des opérons
dans une région qui se répand jusqu'à une centaine de gènes.
Pour conclure, l'analyse du transcriptome n'a pas réellement nécessité la mise au point de méthodes
d'analyse statistiques spécifiques. Cependant, elle permet d'aborder de nouveaux horizons dans la
biologie, et notamment l'organisation chromosomique du génome bactérien.

AU COURS DE LA THESE, L'ETUDE DU TRANSCRIPTOME DE SOUCHES GARDEL ET SENEGAL VIRULENTES ET ATTENUEES D'E. RUMINANTIUMA ETE REALISEE. UNE ANALYSE DU TRANSCRIPTOME A DIFFERENTS STADES DE DEVELOPPEMENT, A D'ABORD ETE EFFECTUEE POUR LA SOUCHE GARDEL VIRULENTE. AU STADE CORPS RETICULE (FORME INTRACELLULAIRE NON INFECTIEUSE), UNE SUREXPRESSION DES GENES CODANT POUR DES PROTEINES IMPLIQUEES DANS LE METABOLISME, LE TRANSPORT ET L'ECHANGE DE NUTRIMENTS ET DANS LA RESISTANCE AU STRESS OXYDATIF ETAIT OBSERVEE. IL SEMBLERAIT QUEE. RUMINANTIUMMETTE EN PLACE UN PANEL DE MECANISMES POUR SA SURVIE ET SON DEVELOPPEMENT A L'INTERIEUR DE LA CELLULE HOTE. AU STADE CORPS ELEMENTAIRE (FORME EXTRACELLULAlRE INFECTIEUSE), LE GENE DKSA CODANT POUR UN FACTEUR DE TRANSCRIPTION ETAIT SUREXPRIME. CE GENE A ETE MONTRE COMME ETANT IMPLIQUE DANS LA REGULATION DE FACTEURS DE VIRULENCE. IL SEMBLERAIT . DONC, QU'AU STADE CORPS ELEMENTAIRE, IL Y AIT UNE INDUCTION DE MECANISMES DE VIRULENCE. LA COMPARAISON DE L'EXPRESSION DES GENES AU STADE CORPS ELEMENTAIRE ENTRE SOUCHES VIRULENTES ET ATTENUEES A AUSSI ETE EFFECTUEE. NOS RESULTATS ONT MONTRE UNE MODIFICATION IMPORTANTE DE LA MEMBRANE POUR LES SOUCHES VIRULENTES ET ATTENUEES. POUR LES SOUCHES ATTENUEES, IL A ETE MONTRE UNE SUREXPRESSION DES GENES IMPLIQUES DANS LA BIOGENESE MEMBRANAlRE ET UNE SOUS-EXPRESSION·DES PROTEINES DE LA FAMILLE MULTIGENIQUE MAP. CES RESULTATS SUGGERENT QUE LES PROTEINES MAP JOUENT UN ROLE DE LEURRE VIS-A-VIS DE LA REPONSE IMMUNITAIRE PROTECTRICE. DES PROTEINES MEMBRANAlRES HYPOTHETIQUES SONT SUREXPRIMEES A LA FOIS CHEZ LES SOUCHES VIRULENTES ET ATTENUEES. CERTAINES D'ENTRE ELLES SUREXPRIMEES CHEZ LES SOUCHES ATTENUEES SEMBLENT ETRE DE BONS CANDIDATS VACCINAUX ET DEVRAIENT ETRE ETUDIEES
Transcriptomic study of gardel and senegal both virulent and attenuated e. ruminantium strains was conducted during my phd. an analysis of transcriptome at different stages of development has been first conducted for virulent gardel strain. at reticulate body stage (intracellular form non-infectious), over-expression of genes coding for proteins involved in metabolism, transport and exchange of nutrients and resistance to oxidative stress was observed. at this stage of development, e. ruminantium seems to activate mechanisms for its survival and development within the host cell. at elementary body stage, dksa the gene encoding for a transcription factor was over-expressed. this gene has been shown to be involved in the regulation of virulence factors. it seems, therefore, at the elementary body stage, e. ruminantium induces its virulence factors. secondly, we compare the transcriptome of elementary body between virulent and attenuated strains. our results showed an important membrane modification of attenuated and virulent strains. for attenuated strains, we observed an over-expression of genes involved in membrane biogenesis and a diminution of expression of map multigenic family. it seems that map proteins subvert the protective immune response. hypothetical membrane proteins are over-expressed in both virulent and attenuated strains. some over-expressed proteins in attenuated strains seem to be good vaccine candidates and willstudied

Les métaux sont indispensables à la vie cellulaire car ils sont constitutifs des protéines. Les ions Ni, font partie intégrante des hydrogénases, enzymes primordiales pour le métabolisme énergétique. Paradoxalement, en excès, les métaux deviennent toxiques pour la cellule. Les bactéries luttent contre cette toxicité en produisant des systèmes de résistance ou d’adaptation. Les cellules procaryotes peuvent équilibrer les teneurs en métaux en contrôlant leur entrée ou leur efflux grâce à la biogenèse de transporteurs spécifiques. L’objectif de ces travaux de thèse a consisté à comprendre les mécanismes principaux permettant à la bactérie modèle Escherichia coli de s’adapter à de fortes variations en ions métalliques, en prenant comme modèle un stress provoqué par un excès d’ions Ni. Afin d’appréhender l’ensemble de la réponse cellulaire, l’effet de ce stress a été évalué sur l’expression de l’ensemble des gènes d’E. coli par des approches de transcriptomique couplées à une validation fonctionnelle. L’excès d’ions Ni induit le système d’efflux RcnRAB. En plus de la pompe d’efflux RcnA, ce système comporte une protéine périplasmique, RcnB, qui module le trafic des ions Ni ou Co via RcnA. Ces travaux ont montré que RcnB n’interagit pas avec les ions Ni ou Co mais de façon inattendue avec les ions Cu, définissant une nouvelle classe de cupro-protéines. Nous montrons que si RcnB n’intervient pas dans le contrôle de l’homéostasie du Cu, l’interaction avec ces ions est essentielle à sa fonction dans la modulation de l’efflux des ions Ni et Co. Ces résultats suggèrent des connexions entre les différents systèmes de maintien des homéostasies métalliques. Les résultats d’analyse transcriptomique montrent une forte modulation de l’expression des gènes impliqués dans les homéostasies du Cu et du Fe en présence d’un excès d’ions Ni, corrélée à une augmentation cellulaire de leur teneur mesurée par spectrométrie plasma. Ces métaux sont responsables de la production d’espèces réactives oxygénées entraînant de sérieux dégâts cellulaires, une des cibles privilégiée étant l’ADN. Nous montrons que les ions Ni ne provoquent pas de cassures de l’ADN et n’ont pas d’effet mutagène, par contre ils provoquent une modification importante de l’état de repliement de l’ADN. Nous proposons que ce relâchement de l’ADN soit dû à l’induction indirecte d’un stress oxydant. Ces travaux ont aboutis à l’identification du premier système de transport spécifique des ions Ni à travers la membrane externe chez E. coli. En résumé, un excès d’ions Ni affecte les systèmes spécifiques d’entrée et d’efflux des ions métalliques troublant les teneurs intracellulaires des autres métaux comme le Cu et le Fe. Ces métaux sont en partie responsables de la production de ROS létaux pour les cellules bactériennes. L’excès de Ni va induire une profonde reprogrammation génétique entraînant des changements physiologiques multifactoriels importants pour la survie bactérienne dans ces conditions de stress
Metals are necessary components of all living cells because they are constitutive of many essential proteins. Nickel, for example, is required for hydrogenase activity, which is essential for the energetic metabolism. However, metals become toxic when present in excess. Prokaryotes can overcome this toxicity by using several systems of resistance or adaptation. Import systems must be repressed whereas export pathways activated. This work consists in bringing out the principal strategies established by Escherichia coli for accommodating a stress caused by an excess of Ni ions. In order to understand the cellular response, the effect of nickel stress has been evaluated in E. coli by a transcriptomic approach coupled to functional validation. Excess Ni induces the biosynthesis of the efflux system RcnRAB. In addition to the RcnA efflux pump, this system contains a periplasmic protein called RcnB. This protein modulates Ni and Co traffic. RcnB displayed no Ni or Co binding capacity but was shown to bing Cu ions. RcnB was characterized as a new family of cupro-protein. We showed that RcnB is not involved in the control of Cu homeostasis but that Cu binding is essential for its Ni and Co efflux function. Our results suggest connections between different systems of metals homeostasis. Indeed, RNA-Seq data analysis revealed that exposure to Ni induces strong variations of the expression of genes involved in Cu and Fe homeostasis. Our results correlated with an increase of intracellular Cu and Fe pools as assayed by plasma spectrometry. Both metals are involved in reactive oxygen species (ROS) production and generate serious cell damages, targeting DNA for example. We showed that Ni ions do not trigger DNA breakage and are not mutagenic. On the other hand, Ni stress has a strong effect on DNA folding. We propose that excess Ni causes DNA relaxation by the indirect induction of oxidative stress. Furthermore, we identified the first transport system specific for Ni ions localized in the outer membrane. This system, composed of YddA and YddB, allows the transfer of Ni ions accross the two membranes. The genes encoding these proteins are expressed in conditions evocative of a biofilm lifestyle. Moreover, this work showed that Ni stress promotes biofilm growth instead of a planktonic one. Indeed, in the presence of an excess of Ni ions, genes encoding flagella are down regulated whereas genes encoding adherence structures are up regulated. To conclude, an excess of Ni ions affects specific metals import and efflux systems unbalancing intracellular Fe and Cu contents. These metals in turn generate ROS that are toxic for the bacterial cells. Ni stress induces large transcriptomic modifications causing major physiological changes important for the survival of the bacteria

Pseudomonas brassicacearum nfm421 est une rhizobacterie isolee de racines d'arabidopsis thaliana cultivee sur differents sols. Elle represente l'une des populations dominantes fermement attachees aux racines de cette plante. Cette espece, comme beaucoup d'autres especes bacteriennes associees aux plantes et aux animaux, se caracterise par l'apparition d'une variation de phase. Les variants de p. Brassicacearum nfm421 (cellules en phase ii) apparaissent en bordure des colonies formees par les cellules en phase i, sur milieu de culture. Les colonies formees de cellules en phase ii sont lisses, non muqueuses sans activite proteasique et lipasique, contrairement aux colonies de la phase i, et beaucoup plus grandes que celles en phase i. D'une part, pour essayer d'elucider le mecanisme de variation de phase, nous avons realise une banque genomique des cellules en phase i. Le criblage de la banque par differentes sondes, nous a permis d'isoler un operon contenant les genes codant la protease, la lipase, un homologue aux serines proteases et le systeme de secretion de type i. L'etude par fusion transcriptionnelle entre le promoteur du gene apra et le gene lacz a mis en evidence la non transcription de cet operon chez les cellules en phase ii ; cela suggerant l'intervention d'un element regulateur. D'autre part, nous avons egalement etudie l'effet de pseudomonas brassicacearum nfm421 phase i et ii sur le transcriptome partiel d'arabidopsis thaliana par la technique des filtres a haute densite. Les premiers resultats ont montre que certains genes etaient actives par les cellules en phase i alors que d'autres etaient reprimes par les cellules en phase ii.

Le complexe d'espèces Ralstonia solanacearum (RSSC) est un pathogène de plantes très agressif qui affecte plus de 250 espèces végétales dont la tomate, la pomme de terre, le Pelargonium, le gingembre et le bananier. De plus, ce pathogène multi-hôtes est connu pour sa capacité d'adaptation rapide à de nouvelles plantes hôtes et à de nouveaux environnements. Afin de combattre ce pathogène, il est nécessaire de mieux connaitre les mécanismes moléculaires qui gouvernent ces capacités adaptatives. Les objectifs de cette thèse ont été (1) d'identifier les bases génétiques de l'adaptation d'une souche RSSC à un cultivar résistant, (2) d'analyser le rôle potentiel des modifications épigénétiques dans l'adaptation à l'hôte et (3) d'analyser l'impact de l'espèce végétale sur les modifications génétiques, transcriptomiques et épigénétiques dans les clones bactériens adaptés. Cette étude a été menée sur des clones générés par évolution expérimentale de la souche GMI1000 de RSSC après 300 générations de passages en série sur la tomate résistante 'Hawaii 7996', l'aubergine sensible 'Zebrina' et le haricot tolérant 'Blanc précoce'. Des tests de compétition avec le clone ancestral GMI1000 ont démontré que 95% des clones évolués sur Hawaii 7996 étaient mieux adaptés à la croissance dans cette espèce de tomate que le clone ancestral. L'analyse des séquences génomiques de ces clones adaptés a révélé entre 0 et 2 mutations par clone et nous avons démontré que ces mutations étaient des mutations adaptatives. L'analyse des transcriptomes des clones évolués sur Hawaii 7996, Zebrina et Haricot a révélé un chevauchement parmi les listes des gènes différentiellement exprimés, suggérant une convergence vers un recâblage global du réseau de régulation de la virulence. Deux régulateurs de transcription, HrpG, l'activateur du régulon du système de sécrétion de type III et EfpR, un régulateur global de la virulence et des fonctions métaboliques, sont apparus comme des nœuds clés du réseau de régulation qui sont fréquemment ciblés par des modifications génétiques ou potentiellement épigénétiques affectant leur expression. Des variations transcriptomiques significatives ont également été détectées dans des clones évolués n'ayant aucune mutation, suggérant ainsi un rôle probable des modifications épigénétiques dans l'adaptation. La comparaison des profils de méthylation de l'ADN entre les clones évolués et le clone ancestral a révélé entre 13 et 35 régions différentiellement méthylées (DMRs). Aucun impact de la plante hôte sur la liste des DMRs n'est apparu. Certaines de ces DMRs ciblaient des gènes qui ont été identifiés comme étant différentiellement exprimés entre les clones évolués et le clone ancestral. Ce résultat supporte l'hypothèse que les modifications épigénétiques régulent l'expression des gènes et pourraient jouer un rôle majeur dans l'adaptation de RSSC à de nouvelles plantes hôtes
The Ralstonia solanacearum species complex (RSSC) is a destructive plant pathogen that infects more than 250-plant species including tomato, potato, pelargonium, ginger and banana. In addition, this multihost pathogen is known for rapid adaptation to new plant species and new environments. In order to overcome this pathogen, it is important to understand the molecular mechanisms that govern host adaptation. The objectives of this thesis were (1) to decipher the genetic bases of adaptation of a RSSC strain to a resistant cultivar, (2) to investigate the potential role of epigenetic modifications in host adaptation and (3) to analyze to impact of the plant species on genetic, transcriptomic and epigenetic modifications in RSSC adapted clones. This study was conducted on clones generated by experimental evolution of GMI1000 RSSC strain after 300 generation of serial passages on the resistant tomato ‘Hawaii 7996’ plant, the susceptible eggplant ‘Zebrina’ and the tolerant plant Bean ‘Blanc precoce’. Competitive experiments with the GMI1000 ancestral clone demonstrated that 95% of the clones evolved on Hawaii 7996 were better adapted to the growth into this tomato plant than the ancestral clone. Genomic sequence analysis of these adapted clones found between 0 and 2 mutations per clone and we demonstrated that they were adaptive mutations. Transcriptome analysis of the Hawaii, Zebrina and Bean evolved clones revealed a convergence towards a global rewiring of the virulence regulatory network as evidenced by largely overlapping gene expression profiles. Two transcription regulators, HrpB, the activator of the type 3 secretion system regulon and EfpR, a global regulator of virulence and metabolic functions, emerged as key nodes of this regulatory network that were frequently targeted by either genetic or potential epigenetic modification affecting their expression. Significant transcriptomic variations were also detected in evolved clones showing no mutation, suggesting a potential role of epigenetic modifications in adaptation. Comparison of the DNA methylation profiles between the evolved clones and the ancestral clone revealed between 13 and 35 differentially methylated regions (DMRs). No impact of the host plant on the list of DMRs appeared. Some of these DMRs targeted genes that were identified to be differentially expressed between the evolved clones and the ancestral clone. This result supported the hypothesis that epigenetic modifications regulate gene expression and could play a major role in RSSC adaptation to new host plants

Orientador: Diogo Teruo Hashimoto
Resumo: O pacu Piaractus mesopotamicus é considerado uma das mais importantes espécies de peixe cultivadas no Brasil. Apesar desta representatividade, esta espécie possui poucas informações genéticas disponíveis, principalmente em relação à resistência às enfermidades. A infecção por Aeromonas hydrophila é responsável por grandes prejuízos econômicos na produção de pacu. Experimentos de desafio, baseados em testes de sobrevivência por exposição dos organismos a patógenos específicos, têm sido realizados para buscar estimativas confiáveis para seleção de famílias geneticamente resistentes às enfermidades. Portanto, os principais objetivos deste estudo foram: 1) avaliar a herdabilidade de resistência do pacu à infecção por A. hydrophila; 2) caracterizar a arquitetura genética com a identificação de QTLs (Quantitative Trait Loci) relacionados com resistência à A. hydrophila, por meio de sequenciamento/genotipagem de SNPs (RAD-Seq, restriction site associated DNA sequencing); 3) caracterizar genes do sistema imune, por meio de sequenciamento RNA-Seq, de indivíduos de pacu submetidos ao desafio de resistência à A. hydrophila. Moderados valores de herdabilidade foram encontrados para sobrevivência e tempo de morte, indicando que a resistência contra A. hydrophila em pacu pode ser melhorada por programas de melhoramento genético. 17.453 SNPs foram identificados pela técnica RAD-Seq, para investigar a arquitetura genética da resistência à infecção por A. hydrophila pelo estudo de associação ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)
Abstract: Pacu Piaractus mesopotamicus is considered one of the most important cultivated fish species from Brazil. Despite this representativeness, few genetic information is available for P. mesopotamicus, especially regarding disease resistance. Aeromonas hydrophila infection is responsible for major economic losses in P. mesopotamicus production. Challenge experiments have been performed to evaluate reliable estimates on selection of families genetically resistant to diseases. Therefore, the main objectives of this study were: 1) evaluate the resistance heritability in 36 P. mesopotamicus families subjected to A. hydrophila challenge; 2) characterize the genetic architecture identifying QTLs (Quantitative Trait Loci) related to A. hydrophila resistance by SNP sequencing / genotyping; 3) characterize genes belonging to immune system of individuals submitted to the disease resistance challenge, by transcriptome analysis (RNA-Seq). Moderate heritability values were found for survival rate and time of death, indicating that resistance against A. hydrophila in P. mesopotamicus can be improved by breeding programs. 17,453 SNPs were identified by RAD-Seq technique to investigate the genetic architecture of resistance to A. hydrophila. When a linkage map was constructed, the length of linkage groups (27 linkage groups) varied from 79.95 (LG 14) to 137.01 (LG 1) cM, with a total integrated map length of 2,755.60 cM. 22 QTLs in 17 LGs associated with A. hydrophila resistance suggested a poly... (Complete abstract click electronic access below)
Doutor

Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-06-14T17:48:40Z No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 16108 bytes, checksum: 2cd537f65b91f31ace656e4a54ad1fae (MD5)
Made available in DSpace on 2017-06-14T17:48:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 16108 bytes, checksum: 2cd537f65b91f31ace656e4a54ad1fae (MD5) Previous issue date: 2005-05-16
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
Foram avaliados 14 isolados degradadores de petróleo, quanto à diversidade genética e à atividade catabólica dos mesmos e de cinco destes, em consórcio, no meio de cultivo adicionado de petróleo por meio da técnica de RT-PCR. A diversidade genética dos 14 isolados bacterianos foi avaliada por RAPD utilizando 12 oligonucleotídeos. O padrão de bandas amplificado do DNA total dos isolados evidenciou uma alta diversidade genética entre os isolados LBBMA 1, LBBMA 18a, LBBMA 53, LBBMA 88b, LBBMA 161, LBBMA 191, LBBMA 201 e LBBMA ES11, quando comparado ao padrão de bandas obtidos com os isolados LBBMA 58, LBBMA 75, LBBMA 101b, LBBMA 105a, LBBMA 195 e LBBMA 199. A detecção de seqüências genômicas e dos respectivos transcritos dos genes que codificam alcano hidroxilase, naftaleno dioxigenase e tolueno dioxigenase em meio de cultivo adicionado de petróleo evidenciou que os isolados LBBMA 58, LBBMA 75, LBBMA 101b e LBBMA 199 foram promissores para serem utilizados no processo de biorremediação. O consórcio C7 (LBBMA 105a, LBBMA 191, LBBMA 195, LBBMA 199, LBBMA 201) foi selecionado para ser avaliado quanto à atividade catabólica em meio de cultivo adicionado de petróleo, nos tempos: 0,5 hora, 4 horas, 7 horas e viii24 horas. Detectou-se neste consórcio, os transcritos correspondentes aos genes que codificam alcano hidroxilase e naftaleno dioxigenase em todos os tempos avaliados. Estes resultados mostraram que a avaliação da atividade catabólica por meio da detecção dos transcritos indicou o potencial de aplicação deste consórcio no processo de biorremediação.
The present study objectified to evaluate the genetic diversity among 14 Petroleum-degrading bacterial isolates and to verify the catabolic activity of each one separately and in consortium in culture medium with addition of petroleum by RT-PCR technique. Their genetic diversity was evaluated by RAPD using twelve primers. The isolates presented high polymorphism indicating a great genetic diversity among them. The evaluation of the potential and the catabolic activity of the isolates was accomplished using as markers three catabolic genes that encode alkane hydroxylase, naphthalene dioxygenase and toluene dioxygenase. In these isolates different results were observed for the presence of the genomic sequences and their respective transcripts. These results indicated that the isolates LBBMA 58, LBBMA 75, LBBMA 101b and LBBMA 199 are promising for the bioremediation process. The consortium C7 (LBBMA 105a, LBBMA 191, LBBMA 195, LBBMA 199, LBBMA 201) was chosen to have its catabolic activity appraised due to its greater efficiency. In this consortium transcripts corresponding to the genes that encode alkane hydroxylase and naphthalene dioxygenase were detected with 0,5 hour, 4 xhours, 7 hours and 24 hours. These results indicated the potential of this consortium for bioremediation.

Aujourd'hui, de plus en plus d'études épidémiologiques témoignent que des facteurs environnementaux apparaissant tôt dans la vie peuvent influencer le développement de l'enfant, jusqu'à le prédisposer à développer plus tard dans la vie des maladies chroniques, d'ordre métaboliques ou encore auto-immunes. Pour l'intestin de nombreuses études chez l'animal ont mis en lumière l'importance de la présence maternelle au cours des premiers jours de vie dans l'apparition à l'âge adulte de pathologies spécifiques, tels que des troubles fonctionnels digestifs, comme le syndrome de l'intestin irritable (SII). Un modèle expérimental de stress de séparation maternelle (SM) chronique s'est alors développé, permettant de mimer les symptômes associés au SII tels qu'une altération du transit intestinal, une augmentation de la perméabilité intestinale ainsi qu'une hyperalgésie viscérale. . Les défauts de barrière intestinale sont associés à une altération persistante de l'axe corticotrope et à l'action de médiateurs du stress au niveau du côlon. Toutes ces observations ont conclu qu'une SM chronique durant la période postnatale pouvait avoir des effets délétères favorisant le passage incontrôlé de bactéries vers les organes systémiques et aboutissant à un état de micro inflammation. Alors que toutes ces manifestations ont essentiellement été décrites chez l'adulte, aucune étude n'a en retour considéré l'impact immédiat du stress accompagnant la SM chez le nouveau-né, quand celui-ci présente une barrière intestinale et des fonctions hépatiques en cours de maturation, donc sensibles à de nombreux facteurs environnementaux. C'est d'autant plus le cas chez le nouveau-né prématuré qui présente une vulnérabilité plus élevée, car plus sensible à l'action des glucocorticoïdes (GC) qui participent à la maturation des fonctions intestinales, en particulier dans le côlon. De plus, aucune étude ne s'est intéressée aux effets de la SM sur le développement des fonctions hépatiques, alors qu'elles s'établissent en lien étroit avec celui de l'intestin. Au cours de ce travail de thèse, nous avons développé un modèle expérimental de SM chez le rat en utilisant un épisode unique et de courte durée (4 heures) de privation maternelle telle qu'elle est pratiquée en routine lors de la prise en charge d'un nouveau-né dans les services hospitaliers, en particulier chez l'enfant prématuré. Dans l'optique d'en analyser les conséquences selon l'âge de l'individu, nous avons privilégié deux stades de développement chez le rat : 10 jours et 20 jours post-partum. D'après la littérature le rat âgé de 10 jours, constitue un modèle pertinent à plusieurs égards pour l'enfant prématuré, en particulier concernant l'immaturité de son intestin et de ses fonctions de barrière, en plus des fonctions hépatiques. Au 20ième jour post-partum, le jeune rat est à la veille du sevrage et est à un stade de maturité plus avancé, relativement comparable à celui d'un enfant né à terme. A ces deux âges, nous avons déterminé les conséquences immédiates de la SM unique sur la barrière intestinale, en étudiant les paramètres clés tels que la perméabilité intestinale et la translocation bactérienne, et étendu l'étude à l'impact sur le transcriptome hépatique, une approche sans a priori permettant d'apprécier l'impact global de la SM sur le foie en développement. Les résultats de ses travaux montrent qu'une SM de 4h appliquée une seule fois chez le nouveau-né est bien un facteur de stress, augmentant la corticostéronémie tant pour le jeune rat de 10 jours que pour celui de 20 jours, mais avec des conséquences délétères sur la barrière intestinale essentiellement observées chez le raton de 10 jours. Chez ce dernier, l'impact du stress se traduit par une augmentation de la perméabilité colique aux macromolécules, déjà élevée en conditions basales, et par une translocation bactérienne systémique vers le foie et la rate. Nous avons montré que ces deux effets étaient liés à l'activité de l'enzyme MLCK impliquée dans la contraction du cytosquelette des cellules épithéliales. En amont, l'augmentation de la perméabilité intestinale était liée à l'action des GC via le récepteur aux glucocorticoïdes (GR) exprimé dans l'intestin. Une augmentation de la corticostéronémie liée au stress de SM était également observée chez le rat de 20 jours, mais sans pour autant aboutir à des effets délétères sur la muqueuse intestinale. Nous avons constaté que l'intestin du rat de 20 jours était moins sensible à l'action des GC et présentait une faible expression en GR au niveau du côlon en comparaison du rat de 10 jours. Chez ce dernier, les impacts de la SM unique aboutissent également à une modification du transcriptome hépatique, tout particulièrement à une sous-expression de plusieurs gènes impliqués dans la division cellulaire. Ces effets dans le foie sont apparus transitoires et plus subtils que ceux retrouvés au niveau de l'intestin, et dont les éventuelles conséquences fonctionnelles restent à être évalués. Les travaux de cette thèse reposant sur le modèle rat ont révélé des effets délétères de la séparation maternelle sur la barrière intestinale en cours de développement et des effets indépendants et plus subtils sur le transcriptome hépatique. Ces observations révèlent la nécessité de prise en compte du stress de la séparation maternelle, pratiquée en routine chez l'homme et notamment chez l'enfant prématuré sur la santé de l'enfant et plus tard chez l'adulte
Currently, an increasing number of epidemiological evidences suggest that environmental factors occurring early in life can influence the development of the child and predispose him later in life to develop chronic, metabolic or autoimmune diseases. Concerning the gut, many animals' studies have highlighted the importance of maternal presence during the first days of life on the development of intestinal diseases occurring later in adulthood, such as functional gastrointestinal disorders as irritable bowel syndrome (IBS). An experimental model of chronic maternal separation (MS) stress was developed to mimic symptoms associated with irritable bowel syndrome such as alteration of motility, increased intestinal permeability and visceral hyperalgesia. Alterations of the intestinal barrier were associated with a persistent impairment of the HPA axis and with the action of stress mediators in the colon. All of these observations evidenced that chronic exposure to MS during the early postnatal period could have deleterious effects on the intestinal barrier favoring bacteremia and leading to a micro inflammation state. All these events were mostly described at adulthood but no study had investigated the immediate impact of the maternal separation stress directly in the newborn while his intestinal barrier and liver functions are still maturing and potentially sensitive to environmental stress. This is especially the case of preterm infant who are more vulnerable to stress because they are more sensitive to the action of glucocorticoids involved in intestinal functions maturation, especially in the colon. In addition, no study had investigated the effects of maternal separation on the development of liver function that are still maturing after birth and are in close crosstalk with the intestine. In this thesis, we have developed an experimental model of maternal separation in rats using a single short-term exposure of 4 hours as it could be observed in practice in maternity, especially in prematurity birth cases. In order to analyze the consequences of MS according to the age, we focused on two stages of development in the rat: on the 10th and 20th day post delivery. The 10-day-old rat is often considered as a good model for the premature infant, notably due to an immature gut barrier. At 20 days of age, the rat is at a higher stage of maturity, comparable to the state of a full-term infant. At both ages, we determined the immediate consequences of a single MS on the intestinal barrier by studying key parameters such as intestinal permeability and bacterial translocation. We also extended the study to the impact of a single MS on the liver transcriptome using a genome-wide approach without a priori to assess the overall impact of SM on the developing liver. Our results show that a 4 hours-MS is a stressful event increasing corticosterone level in 10- and 20-day-old rats but associated with deleterious effects on the intestinal barrier in 10-day-old rats only. At this age, the MS stress induced an increase of colonic permeability to macromolecules, already high at baseline, and systemic bacterial translocation to the liver and spleen. Both effects were linked to the activity of the MLCK enzyme involved in the contraction of the cytoskeleton of epithelial cell. The increase of intestinal permeability was related to glucocorticoids (GC) action through intestinal glucocorticoid receptors (GR). The increase of glucocorticoid level was also observed in 20 days rats but without deleterious effects on the intestinal mucosa. We have found that the intestine of 20-day-old rats was less sensitive to GC action and expressed GR at a lower level in the colon compared to 10-day-old rats. At the younger age, the maternal separation also led to a modulation of the liver transcriptome, most notably a down-regulation of genes involved in cell division. These effects were transient and more subtle than those observed on the intestinal barrier. Their potential functional consequences remain to be evaluated. The work of this PhD based on the 10-day-old rat model highlighted the deleterious effects of maternal separation on the intestinal barrier during development as well as independent and more subtle effects on the liver transcriptome. These findings emphasize the need to take into account the stress induced by maternal separation, practiced routinely in humans and especially in premature infants, on the health of the child and later at adulthood

L'objectif de ce travail était d'étudier une bactérie d'affinage de cet écosystème, Brevibacterium aurantiacum (BA). La mise en place d'outils moléculaires pour l'étude de la biodiversité du genre Brevibacterium. L'approche par MLST avec 9 gènes de ménage est un nouvel outil prometteur pour l'identification des Brevibacteriaceae, nous avons identifié une nouvelle espèce appartenant aux souches d'intérêt technologique, B. antiquum. L'approche par puce ADN a permis d'étudier la biodiversité au sein de l'espèce de BA, les résultats montrent que 13% et 15% du génome de la souche séquencée sont absents et/ou divergents dans les souches BL2 et ATCC 9175. Nous avons ensuite réalisé une reconstruction du métabolisme du soufre chez BA ATCC 9175 et étudié sa régulation en fonction de différentes sources de soufre en utilisant des approches omics. Les résultats montrent une répression des voies d'assimilation du sulfate et de la biosynthèse de la cystéine en présence de cystine et une répression des voies de biosynthèse de la méthionine via l'homocystéine et la voie de transulfuration par la méthionine. Enfin, lors d'un ajout de méthionine dans le milieu, nous observons une induction coordonnée des gènes codant pour la méthionine gamma-lyase et un transporteur de la méthionine suggérant la présence d'un régulateur spécifique pour cette voie. Enfin, nous avons étudié le comportement de BA en présence ou en absence d'une levure d'affinage de fromage Kluyveromyces lactis (KL) par des approches biochimiques et transcriptomiques. Chez BA, on observe une modification du métabolisme carboné et de l'azote, de la voie de biosynthèse des pigments.

Le métabolisme du soufre, qui occupe une place centrale au sein de la cellule, est aussi important lors de la fabrication des fromages à pâte molle à croûte lavée. L'écosystème fromager assimile les acides aminés soufrés et peut ainsi produire des composés soufrés volatils (CSVs) indispensables à la flaveur de ces produits. Nous avons étudié le métabolisme du soufre chez deux micro-organismes d'affinage, les levures hémiascomycètes Kluyveromyces lactis et Yarrowia lipolytica. L'analyse in silico du phylum des hémiascomycètes nous a donné pour la première fois une vision évolutive de ce métabolisme. Nous avons relevé des différences fondamentales au niveau de la synthèse de la cystéine mais aussi au niveau des enzymes impliquées dans la production de CSVs. Cette analyse constitue une base solide pour l'étude du métabolisme du soufre. Nous avons combiné plusieurs approches exploratoires (transcriptome, métabolome, dosage des CSVs) afin d'avoir une vision globale de ce métabolisme chez K. lactis et Y.lipolytica. Les différences observées se situent notamment au niveau des voies de synthèse de la cystéine et de la taurine. La production de CSVs semble liée à la surexpression de transaminases spécifiques à chaque espèce combinée à l'accumulation de méthionine intracellulaire. L'affinage du fromage dépendant de tout un écosystème, nous avons également étudié l'interaction entre deux micro-organismes d'affinage, K. lactis et Brevibacterium aurantiacum via une approche transcriptomique, en comparant l'expression d'une co-culture à celle des cultures pures. Nous avons observé de profondes modifications métaboliques touchant notamment le métabolisme du carbone et celui de la biotine.

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CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
A modelagem matemática in silico baseada em restrições é uma abordagem adotada pela Biologia de Sistemas para analisar redes metabólicas. A bactéria Gram-positiva Exiguobacterium antarticum B7 é um extremófilo capaz de sobreviver em ambientes frios como gelo glacial e permafrost. A capacidade de adaptação ao frio desses micro-organismos vem despertando grande interesse biotecnológico. Um fator importante para o entendimento do processo de adaptação ao frio está relacionado à modificação química de ácidos graxos que constituem a membrana celular das bactérias psicotróficas. A finalidade é manter a fluidez da membrana para evitar o congelamento da bactéria. Neste trabalho, a via metabólica de biossíntese de ácidos graxos da bactéria E. antarticum B7 foi reconstruída a partir do genoma anotado disponível. As ferramentas de software KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) e RAST (The Rapid Annotation Server) foram utilizadas para gerar o modelo preliminar da rede. O passo seguinte foi a etapa de cura manual baseada na combinação de informações genômicas, bioquímicas e fisiológicas disponíveis em diversos bancos de dados e literatura especializada. Durante este processo, as enzimas FabZ e DesK, responsáveis por adicionar insaturações na cadeia carbono-carbono ao longo da síntese de ácidos graxos, foram identificadas no genoma, entretanto de forma truncada. O fluxoma da via metabólica foi definido com a descrição das rotas das principais reações, desde o metabólito de entrada, o Acetil-CoA, até o produto final, o ácido Hexadecenóico. A modelagem computacional foi feita com o uso do software MATLAB® juntamente com toolboxes e funções específicos para biologia de sistemas. A quantificação de metabólitos produzidos pela via foi realizada por meio do método baseado em restrições Análise de Balanço de Fluxos (ABF). Para avaliar a influência da expressão gênica na análise do fluxoma, o método ABF foi calculado usando os valores de log2FC obtidos na análise transcriptoma a 0ºC e 37ºC. A via de biossíntese de ácido graxos possui um total de 13 rotas identificadas pelo método Modo Elementar, quatro das quais apresentam caminhos para a produção de ácido hexadecenóico. A via reconstruída demonstrou a capacidade da E. antarcticum B7 em produzir moléculas de ácidos graxos. Sob a influência do transcriptoma, o fluxoma foi alterado, estimulando a produção de cadeia curta em ácidos graxos. Os modelos obtidos contribuem para um melhor entendimento da adaptação bacteriana a ambientes frios.
Mathematical modeling in silico based restrictions is an approach adopted by systems biology to analyze metabolic networks. The Gram-positive bacterium Exiguobacterium antarticum B7 is an extremophile organism able to survive in cold environments as glacial ice and permafrost. The ability of these microorganisms of adaptation to cold attracts great biotechnological interest. An important factor for the understanding of cold adaptation process is related to the chemical modification of fatty acids constituting the cell membrane of psicotrophic bacteria in order to maintain membrane fluidity to avoid freezing ofthe bacteria. In this work, the metabolic pathway of fatty acid biosynthesis of the bacterium E. antarticum B7 was rebuilt from its annotated genome. The software tools KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) and RAST (The Rapid Annotation Server) were used to generate a preliminary network model. The next step was to cure manually the genomic, biochemical and physiological informations available in different databases and specific literature. During this process, the FabZ and DesK enzymes responsible for adding carbon-carbon unsaturations in the fatty acid chain during synthesis have been identified in the genome, though in a truncated form. The fluxome metabolic pathway was defined, describing the routes of the main reactions since the first monomer, Acetyl-CoA, to the final product, the Hexadecenoic acid. A computational modeling was done using the software MATLAB® with toolboxes and specific tools for systems biology. The quantification of metabolites produced via was performed by the method constraint-based Flux Balance Analysis (FBA). To evaluate the influence of the gene expression in the fluxome analysis, the FBA method was also calculated using the log2FC values obtained in the transcriptome analysis at 0ºC and 37ºC. The fatty acid biosynthesis pathway showed a total of 13 elementary flux modes, four of which showed routes for the production of hexadecenoic acid. The reconstructed pathway demonstrated the capacity of E. antarcticum B7 to produce fatty acid molecules. Under the influence of the transcriptome, the fluxome was altered, promoting the production of short-chain fatty acids. The calculated models contributes to better understand the bacterial adaptation at cold environments.

Le développement de biofilms pose de sérieux problèmes dans le domaine marin et médical. Leur grande tolérance vis-à-vis d’agents chimiques utilisés habituellement (désinfectants, antibiotiques, biocides) rend leur éradication difficile. De plus, l’utilisation de molécules biocides est largement controversée, considérant leur impact environnemental catastrophique. Les recherches se sont concentrées sur des systèmes qui, par leur composition, limitent la biocontamination. Parmi eux, on trouve des systèmes amphiphiles pouvant être composés d’une matrice hydrophobe de polydiméthylsiloxane (PDMS) et d’un copolymère amphiphile PDMS-PEG. Malgré leur efficacité, ces systèmes sont remis en cause du fait de l’origine pétrochimique du PDMS. L’objectif de ce projet de thèse est de substituer le PDMS par un biopolymère, le poly(hydroxy alcanoate) (PHA). Un système a été formulé avec du PHA en tant que matrice hydrophobe et un copolymère PHA-PEG en tant qu’additif amphiphile. Deux types de PHA ont été utilisés dans cette étude, le PHBHV (PHA à courtes chaines) et le PHAmcl (PHA à moyennes chaines). Les revêtements formulés ont été caractérisés physiquement, chimiquement et mécaniquement. Puis leur capacité anti-adhésive, anti-biofilm et fouling- release ont été évaluées sur différents microorganismes. Deux bactéries pathogènes opportunistes, Staphylococcus aureus et Pseudomonas aeruginosa, une bactérie marine, Bacillus 4J6 et deux diatomées benthiques, Phaeodactylum tricornutum et Navicula perminuta. Enfin, afin de mieux comprendre le mécanisme moléculaire impliqué dans l’adhésion de S.aureus, des analyses transcriptomiques ont été réalisées
The development of biofilms causes serious problems in the marine and medical fields. Their high tolerance to commonly used chemical agents’ disinfectants, antibiotics, biocides) makes their eradication difficult. Moreover, the use of biocide molecules is widely controversial, considering their catastrophic environmental impact. Research has therefore focused on systems that, by their composition, limit biocontamination. Among them are amphiphilic systems that can be composed of a hydrophobic polydimethylsiloxane (PDMS) matrix and an amphiphilic PDMS-PEG copolymer. Despite their efficiency, these systems are questioned because of the petrochemical origin of PDMS. The objective of this thesis project is to substitute PDMS with a biopolymer, poly(hydroxyalkanoate) (PHA). A system was formulated with PHA as a hydrophobic matrix and a PHA-PEG copolymer as an amphiphilic additive. Two types of PHA were used in this study, PHBHV (short chain length) and PHAmcl (medium chain length). The formulated coatings were characterized physically, chemically and mechanically. Then their anti-adhesive, anti-biofilm and fouling-release capacities were evaluated on different microorganisms. Two opportunistic pathogenic bacteria, Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa, a marine bacterium, Bacillus 4J6 and two benthic diatoms, Phaeodactylum tricornutum and Navicula perminuta. Finally, in order to better understand the molecular mechanisms involved in the adhesion of S. aureus, transcriptomic analyses were performed

Le métabolisme du soufre, qui occupe une place centrale au sein de la cellule, est aussi important lors de la fabrication des fromages à pâte molle à croûte lavée. L'écosystème fromager assimile les acides aminés soufrés et peut ainsi produire des composés soufrés volatils (CSVs) indispensables à la flaveur de ces produits. Nous avons étudié le métabolisme du soufre chez deux micro-organismes d'affinage, les levures hémiascomycètes Kluyveromyces lactis et Yarrowia lipolytica. L'analyse in silico du phylum des hémiascomycètes nous a donné pour la première fois une vision évolutive de ce métabolisme. Nous avons relevé des différences fondamentales au niveau de la synthèse de la cystéine mais aussi au niveau des enzymes impliquées dans la production de CSVs. Cette analyse constitue une base solide pour l'étude du métabolisme du soufre. Nous avons combiné plusieurs approches exploratoires (transcriptome, métabolome, dosage des CSVs) afin d'avoir une vision globale de ce métabolisme chez K. lactis et Y.lipolytica. Les différences observées se situent notamment au niveau des voies de synthèse de la cystéine et de la taurine. La production de CSVs semble liée à la surexpression de transaminases spécifiques à chaque espèce combinée à l'accumulation de méthionine intracellulaire. L'affinage du fromage dépendant de tout un écosystème, nous avons également étudié l'interaction entre deux micro-organismes d'affinage, K. lactis et Brevibacterium aurantiacum via une approche transcriptomique, en comparant l'expression d'une co-culture à celle des cultures pures. Nous avons observé de profondes modifications métaboliques touchant notamment le métabolisme du carbone et celui de la biotine.

L’augmentation de température que subit la planète ces dernières décennies a de nombreuses conséquences dont la recrudescence de maladies infectieuses aussi bien chez l’homme que chez les animaux. Certaines populations de l’ormeau européen Haliotis tuberculata, vivant dans les zones les plus chaudes de Bretagne et de Normandie ont ainsi subi de très importantes mortalités depuis 1997, dues à la bactérie Vibrio harveyi. Cependant, certaines des populations les plus sévèrement touchées se sont aujourd’hui reconstruites et les mortalités semblent s’être arrêtées dans certaines de ces zones. La question se pose donc de l’apparition d’une résistance de l’ormeau face à cette maladie émergente. Pour répondre à cette question, les réponses à l’infection de plusieurs populations naturelles par cette bactérie ont été analysées. Une population présentant une forte résistance à la maladie a été identifiée.La voie d’entrée de la bactérie (ie. les branchies) a été identifiée comme jouant un rôle dans la résistance à l’infection. Par ailleurs, des infections successives ont permis de démontrer un effet d’amorçage immunitaire. Suite à une première exposition, une protection durant jusqu’à deux mois intervient contre l’effet d’inhibition de la phagocytose, provoquée normalement par une infection à V. harveyi. La différence d’expression de gènes des hémocytes d’ormeaux sensibles et résistants a été quantifiée par RNAseq pendant une infection expérimentale. Cette comparaison a montré une reconnaissance plus efficace du pathogène chez les résistants, par des récepteurs tels que les TLR ou les PGRP. La forte surexpression chez la population résistante, d’un gène impliqué dans la synthèse de mucine qui est l’un des composants principaux du mucus renforce l’hypothèse d’une forte implication des branchies dans la résistance. Enfin, une analyse in silico des séquences obtenues en RNAseq a permis d’apporter des preuves de l’existence d’un système de méthylation de l’ADN chez H. tuberculata ainsi qu’une possible implication de ce système dans l’adaptation de l’ormeau à son milieu
Increasing global temperatures have numerous consequences for marine ecosystems, including the rise of infectious diseases. Certain populations of the European abalone Haliotis tucerculata have suffered from severe and recurrent mortality since 1997 due to infection caused by the bacterium Vibrio harveyi, particularly in areas with higher average summer temperatures. Given the spatial heterogeneity in mortalities, and the observation that the historically most severely impacted populations have recovered in recent years, the question of the emergence of resistance to the disease was addressed. The mortality rate in response to infection by V. harveyi was quantified experimentally in abalone originating from three natural populations, and one population exhibiting resistance to the disease was identified. In a subsequent experiment, the immune response of abalone was compared between infected individuals from a resistant and from a susceptible population. The portal of entry of the bacterium (ie. gills) was identified as playing a role in resistance. Furthermore, successive exposures of abalone to the bacterium demonstrated an immune priming effect, such that following a first exposure, phagocytosis was no longer inhibited by infection with V. harveyi, and that this improved protection against the disease lasted for at least two months. Differences in gene expression was quantified by RNAseq in the hemocytes of resistant and susceptible abalone following exposure to the pathogen. This comparison showed that resistant abalone had more effective recognition of the bacterium by receptors as the TLR or PGRP. The substantial over-expression of a gene involved in the synthesis of mucin, the main component of mucus, (UDP-GalNAC) in the resistant population, supports the interpretation of a strong involvement of gills in the resistance. Finally, an in-silico analysis of the sequences obtained from RNAseq indicate the existence of a DNA methylation system in H. tuberculata and suggested an involvement of epigenetic mechanisms in the adaptation of abalone to its environment

Lactobacillus sakei est une bactérie lactique qui fait partie de la flore dominante de la viande. Elle possède un équipement génétique inhabituel chez les bactéries lactiques, dédié à l'utilisation du fer : des transporteurs et 3 régulateurs de transcription fer-dépendants de la famille Fur. Nous avons i) évalué la capacité de L. sakei à utiliser les sources de fer de son environnement en développant une méthode de microanalyse du fer par microscopie (EELS) et spectrométrie de masse (Nano-SIMS), ii) réalisé une étude fonctionnelle des 3 régulateurs Fur-like et iii) réalisé une analyse transcriptomique globale en présence de transferrine ou d'hème. Ce travail a montré que le fer sous forme complexé, transferrine ou hème, était internalisé et améliorait la survie de L. sakei. Nous avons montré que la catalase hème-dépendante n'est pas l'acteur principal de cette survie car un mutant ΔkatA survit comme la souche sauvage en présence d'hème. Nos travaux ont montré aussi que le fer et l'hème induisent des réponses globales différentes. L'hème a un effet protecteur alors que le fer induit plus de stress. Nous avons mis en évidence que les 3 régulateurs Fur-like sont fonctionnellement distincts. Le régulateur Mur est impliqué dans l'homéostasie du manganèse, le PerR régule des gènes impliqués dans la réponse au stress oxydant et le Fur est impliqué dans la séquestration du fer, la morphologie des cellules et la résistance au stress. Cette étude montre que le fer et l'hème conduisent à des réponses cellulaires différentes chez L. sakei et indique que ce métabolisme pourrait être un facteur important pour la compétitivité dans l'écosystème carné.

La spécificité d'hôte est un concept fondamental pour comprendre les mécanismes évolutifs ayant abouti aux interactions étroites entre les bactéries et les plantes. Les études réalisées sur la coopération entre les bactéries rhizosphériques phytostimulatrices (PGPR) et les plantes suggèrent que la spécificité serait régie soit par une adaptation souchespécifique de la bactérie à des caractères aspécifiques de la plante, soit par une adaptation aspécifique de la bactérie à des propriétés spécifiques d'un génotype de plante. Ainsi, nous formulons l'hypothèse que ces adaptations se traduisent par la régulation de nombreux gènes indépendamment de leur implication directe dans l'effet phytobénéfique. Ces régulations pourraient dépendre de la combinaison souche bactérienne/génotype de plante considérée. L'objectif de ce travail est de mettre en évidence les gènes impliqués dans l'adaptation des partenaires l'un à l'autre et ceux impliqués dans la spécificité, au cours de la coopération PGPR-plantes. Pour cela, nous avons choisi comme modèle d'étude l'interaction entre Azospirillum lipoferum 4B et les céréales (blé, maïs, riz cultivars Cigalon et Nipponbare) avec un accent porté sur l'expression des gènes des deux partenaires de la coopération A. lipoferum 4B-riz. Les résultats de transcriptomique sur puce soulignent l'importance des mécanismes de réponse au stress oxydatif au cours de l'adaptation des partenaires l'un à l'autre ainsi que la mise en place de réseaux de régulation complexes. De nombreux gènes présentent un profil d'expression qui dépend de la combinaison souche/cultivar, suggérant que des mécanismes évolutifs ont conduit à une interaction préférentielle entre une souche et son cultivar d'origine
Host specificity is a fundamental concept in understanding evolutionary processes leading to intimate interactions between bacteria and plants. In the case of Plant Growth- Promoting Rhizobacteria (PGPR) specificity appears to be controlled either by a strainspecific bacterial adaptation to non-specific traits of the host plant or by non-specific bacterial adaptation to genotype-specific properties of the host plant. Thus, we hypothesize that these adaptations result in the regulation of a large number of genes, independently of their direct involvement in phytostimulation. These regulations may depend on the bacterial strain / plant genotype combination. This work aims at identifying genes involved in reciprocal adaptation of partners and those involved in host specificity in PGPR-plant cooperation. As a model, we studied the interaction between Azospirillum lipoferum 4B and cereals (wheat, corn, rice cultivars Nipponbare and Cigalon), with an emphasis on gene expression of both partners during A. lipoferum 4B-rice cooperation. Microarray transcriptomic results highlight the importance of mechanisms implicated in response to oxidative stress as well as a tight adjustment of regulatory networks during the adaptation of both partners to each other. Many genes display expression profile that depends on the strain/cultivar combination, suggesting that evolutionary processes have led to a preferential interaction between a strain and its original cultivar

L’objectif principal de cette thèse est d’étudier les mécanismes liés au pouvoir pathogène de V. tapetis.Pour cela, nous avons développé 2 axes de recherche. Le premier axe vise à étudier la virulence de V. tapetis en répondant aux 2 problématiques suivantes : Quels sont les gènes impliqués dans la virulence de V. tapetis ? et Existe-t-il des marqueurs hôtes-spécifiques de la virulence de V. tapetis ? Le second axe de recherche concerne l’interaction hôte pathogène et répond aux 2 problématiques suivantes : Quels sont les gènes exprimés lors de l’infection chez l’hôte ? et Quelles sont les modulations au sein de l’animal associées au pH et à la température lors de l’infection ?Les principales découvertes de cette thèse sont : (i) La bactérie V. tapetis, dans le cadre de la MAB, induit une sous expression des gènes impliqués dans la réponseimmunitaire et une dérégulation des gènes impliqués dans la stabilisation et la synthèse des filaments d’actine (ii) Ce pathogène induit également une diminution de l’activité lysosomale sur les hémocytes exposés (iii) L’effet de V. tapetis sur le cytosquelette d’actine et sur la diminution de l’activité lysosomale est indépendante du système de sécrétion de type IV (T4SS) (iv) Le système de sécrétion de type IV (T4SS) est impliqué dans le développement de la MAB mais n’est pas essentiel pour induire cette affection(v) Dans le cadre de la MAB et de la perte des adhérences des hémocytes in vitro, V. tapetis est capable de moduler le pH des fluides extra-palléaux, respectivement dans les premiers jours et premières heures de l’infection (vi) Enfin, l’approche de « strains typing » basée sur la technique MALDI-TOF permet de discriminer les souches de V. tapetis en fonction de leur pouvoir pathogène vis à vis de la palourde japonaise
The main objective of this thesis is to study the mechanisms related to the pathogenicity of V. tapetis. For this purpose, we developed 2 research axes. The first one aimed at studying the virulence of V. tapetis by answering the following 2 issues: What are the genes involved in the virulence of V. tapetis? and Are there host-specific markers of the virulence of V. tapetis? The second research axis concerned pathogen-host interactions and addressed the following 2 issues: What are the genes expressed during infection in the host? and What are the modulations in the animal associated with pH and temperature during infection? The main findings of this thesis are: (i) V. tapetis, in the context of BRD, induces a down expression of genes involved in the immune response anda deregulation of genes involved in the stabilization and synthesis of actin filaments (ii) This pathogen also induces a decrease in lysosomal activity on exposed hemocytes (iii) The effect of V. tapetis on the actin cytoskeleton and on the decrease in lysosomal activity is independent of the type IV secretion system (T4SS) (iv) The type IV secretion system (T4SS) is involved in the development of BRD but is not essential to induce this disease (v) In the context of BRD and of the loss of hemocyte adhesions properties in vitro, V. tapetis is able to modulate the pH of extrapallial fluids, respectively in the first days and hours of infection (vi) Finally, the "strains typing" approach based on MALDITOF makes it possible to discriminate between V. tapetis strains according to their pathogenicity with regard to Manila clam

Les plantes se développent et évoluent en interaction avec les organismes du sol. L'impact des vers de terre sur la croissance des plantes, généralement positif, a été attribué à des modifications physiques, chimiques ou biochimiques du sol, souvent sans démonstration rigoureuse. Dans ce travail, les techniques développées en sciences du végétal (culture in vitro, utilisation de mutants et transcriptomique) ont été utilisées afin de comprendre les mécanismes à l'origine de l'effet des vers de terre sur les plantes. Nos résultats apportent de nouvelles connaissances fondamentales: (1) la production de molécules-signal à l'intérieur des déjections de vers de terre a un impact significatif sur la croissance d'Oryza sativa et Lolium perenne. (2) Ces molécules agissent sur la voie de signalisation fortement liée à l'auxine, comme suggéré par l'effet significatif du ver de terre sur la croissance du double mutant d'A. thaliana aux1-7;axr4-2. (3) L'abondance de ces molécules-signal en présence de vers de terre pourrait être liée à la stimulation de certaines populations bactériennes capables de synthétiser de l'auxine. (4) Le ver de terre induit une accumulation de transcrits pour des gènes sous contrôle de l'acide jasmonique et de l'éthylène. Ces hormones sont notamment impliquées dans un mécanisme de résistance systémique induite (ISR), connu pour être induit par certaines rhizobactéries promotrices de la croissance des plantes. Enfin, (5) le piétin échaudage, maladie due à un champignon pathogène, déclenche chez le blé (Triticum aestivum) une réaction d'hypersensibilité et une modification de la signalisation hormonale, qui sont considérées comme des mécanismes de contrôle du métabolisme de la plante qui facilitent l'infection du pathogène. La sévérité de cette maladie est réduite en présence de vers de terre. La synthèse de ces résultats indique que les vers de terre, comme d'autres organismes du sol, modifient l'équilibre hormonal de la plante. L'homéostasie hormonale apparaît comme un élément incontournable pour prédire l'issue des interactions multiples que les plantes entretiennent avec les organismes du sol
Plants develop and evolve in interaction with soil organisms. The impact of earthworms, likely positive, has been attributed to modifications of physical, chemical or biochemical soil properties, without rigorous demonstration. In this work, techniques developed in plant science (in vitro culture, use of mutant plants and trancriptomic analysis) were used to understand the mechanism involved in the effect of earthworms on plants. Our results bring new fundamental knowledge: (1) production of signal-molecules within earthworm dejections has a positive impact on the growth of Oryza sativa and Lolium perenne. (2) These molecules act on auxin signaling, as suggested by the positive impact of the earthworm on the growth of A. thaliana double mutant aux1-7;axr4-2. (3) The abundance of these signal-molecules in presence of the earthworms could be related to the stimulation of bacterial communities able to produce auxin. (4) Earthworms induce an accumulation of gene transcripts known to be under control of jasmonic acid and ethylene. These two hormones are most notably involved in the defense mechanism called induced systemic resistance (ISR), known to be induced by plant growth promoting rhizobacteria. Finally, (5) Take-all disease, due to a pathogenic fungus, induced in wheat (Triticum aestivum) a hypersensitive response and a modification on hormone signaling, which are known as manipulations of plant metabolism in a way that facilitates pathogen infection. The severity of take-all disease was alleviated in the presence of earthworms. Synthesis of these results showed that earthworms, like other soil organisms, modify the hormone balance in the plant. Hormone homeostasis appeared to be an important element to predict the issue of the multiple interactions that plants established with soil organisms

Les pucerons sont parmi les principaux ravageurs des cultures dans les régions tempérées. Leur succès comme parasites de plantes repose sur leur fort potentiel reproductif dû à la parthénogénèse durant le printemps et l'été ainsi qu'à la symbiose avec Buchnera aphidicola. Cette bactérie symbiotique obligatoire fournit aux pucerons les acides aminés essentiels qui sont déficients dans leur alimentation déséquilibrée (la sève élaborée des plantes), et contribue ainsi à leur développement et reproduction. Le premier volet de ce travail de thèse a consisté à déterminer les besoins en acides aminés des différents stades embryonnaires, afin d'identifier des facteurs clé de l'association symbiotique au cours du développement du puceron du pois Acyrthosiphon pisum. Cette étude, conduite sur des embryons prélevés in vivo ou mis en culture in vitro, a révélé i) des exigences métaboliques évoluant au cours de développement du puceron, ii) une dépendance au compartiment maternel pour l'approvisionnement des embryons en acides aminés, et iii) de forts besoins en acides aminés aromatiques, notamment en tyrosine, pour les stades embryonnaires tardifs et le premier stade larvaire précoce. Le deuxième volet de cette thèse a alors eu pour objectif l'identification de gènes cibles à l'intérieur des voies révélées par l'approche métabolique. A l'aide d'une puce à ADN dédiée au génome du d'A. pisum, les profils d'expression des gènes du puceron ont été analysés au cours de son développement embryonnaire. L'analyse fonctionnelle des différents groupes de gènes montre que ceux liés au métabolisme des acides aminés présentent de hauts niveaux d'expression et des variations significatives entre les différents stades. La voie métabolique des acides aminés aromatiques et tout particulièrement les gènes menant à la synthèse de la tyrosine, ainsi que les gènes/voies liés à la formation et à la maturation de la cuticule, sont parmi les plus sollicités chez les embryons tardifs. L'ensemble des résultats obtenus par les approches métabolique et transcriptomique suggère une synthèse et une accumulation de tyrosine au cours du développement embryonnaire, en vue de son utilisation comme précurseur pour la sclérotisation et le tannage cuticulaire après la ponte. Le dernier volet de ce travail de thèse a consisté en une analyse fonctionnelle du rôle du gène ACYPI007803, codant l'enzyme catalysant la synthèse de la tyrosine à partir de la phénylalanine, par la technique d'ARN interférence (RNAi). Une augmentation de la mortalité des larves pondues par les femelles traitées est corrélée à la diminution de l'expression du gène cible dans les compartiments symbiotiques (les chaines embryonnaires et les bactériocytes maternels) et confirme le rôle clé du gène ACYPI007803 dans le développement des embryons chez le puceron du pois.

La rhizosphère est la zone étroite de sol soumise à l’influence des racines des plantes qui libèrent un mélange moléculaire complexe : les exsudats racinaires. Ils permettent à la plante de recruter son microbiote rhizosphérique qui joue un rôle clé dans sa croissance et sa résistance aux stress biotiques et abiotiques. Dans le cadre de l’agroécologie, la compréhension du dialogue moléculaire racines-microbiote pourrait permettre de promouvoir l’installation de rhizobactéries bénéfiques pour les plantes (PGPR) dans la rhizosphère. Lors de cette thèse, la capacité des exsudats racinaires de colza (Brassica napus), de pois (Pisum sativum) et de ray-grass (Lolium perenne) à attirer et nourrir trois PGPR (Bacillus subtilis ATCC 6633, Pseudomonas fluorescens ATCC 17400 et Azospirillum brasilense Sp245) a été mesurée et comparée grâce à la définition d’un nouvel indicateur, le score de « love match ». Pour toutes ces bactéries, les exsudats de colza sont les plus attractifs et induisent la croissance la plus rapide, ceux de pois permettent la production de biomasse la plus élevée, tandis que ceux de ray-grass sont les moins efficaces. Si l’on compare les PGPR, P. fluorescens et A. brasilense semblent répondre plus efficacement aux exsudats racinaires que B. subtilis. L’analyse transcriptomique révèle quant à elle que B. subtilis régule l’expression de nombreux gènes en réponse aux exsudats racinaires, tandis que P. fluorescens semble déjà exprimer la plupart des gènes nécessaires à cette réponse. Ces résultats mettent en évidence la sélection spécifique des PGPR par la plante à travers ses exsudats racinaires, et pourraient aider à sélectionner les exsudats les plus efficaces pour promouvoir l'établissement de bioinoculants dans la rhizosphère
The rhizosphere is the narrow zone of soil under the influence of plant roots that release a complex molecular mixture: root exudates. They allow the plant to recruit its rhizosphere microbiota, which plays a key role in its growth and resistance to biotic and abiotic stresses. In the context of sustainable agriculture, understanding the molecular root-microbiota dialogue could help to promote the establishment of Plant Growth-Promoting Rhizobacteria (PGPR) in the rhizosphere. In this thesis, the ability of root exudates from rapeseed (Brassica napus), pea (Pisum sativum) and ryegrass (Lolium perenne) to attract and feed three PGPR (Bacillus subtilis ATCC 6633, Pseudomonas fluorescens ATCC 17400 and Azospirillum brasilense Sp245) was measured and compared by defining a new indicator, the « love match » score. For all bacteria, rapeseed exudates are the most attractive and induce the fastest growth, pea exudates allow the highest biomass production, while ryegrass exudates are the least effective. When comparing PGPR, P. fluorescens and A. brasilense seem to respond more efficiently to root exudates than B. subtilis. Transcriptomic analysis reveals that B. subtilis regulates the expression of many genes in response to root exudates, whereas P. fluorescens appears to already express most of the genes required for this response. These results highlight the specific selection of PGPR by the plant through its root exudates, and could help to select the most efficient exudates in order to promote the establishment of bioinoculants in the rhizosphere

Les impacts environnementaux dues à l'extraction minière sont considérables. C'est l'action des microorganismes, en utilisant leur métabolisme du soufre sur les déchets miniers, qui engendre les plus grands défis. Jusqu'à présent, peu de recherches ont été effectués sur les microorganismes environnementaux pour la compréhension globale de l'action du métabolisme du soufre dans une optique de prévention et de rémédiation des impacts environnementaux de l'extraction minière. Dans cette étude, nous avons étudié une bactérie environnementale, Acidithiobacillus thiooxidans, dans le but de comprendre le métabolisme du soufre selon le milieu de culture et le niveau d'acidité du milieu. Nous avons utilisé la transcriptomique à haut débit, RNA-seq, en association avec des techniques de biogéochimie et de microscopie à électrons pour déterminer l'expression des gènes codants les enzymes du métabolisme du soufre. Nous avons trouvé que l'expression des gènes des enzymes du métabolisme du soufre chez ce microorganisme sont dépendantes du milieu, de la phase de croissance et du niveau d'acidité présent dans le milieu. De plus, les analyses biogéochimiques montrent la présence de composés de soufre réduits et d'acide sulfurique dans le milieu. Finalement, une analyse par microscopie électronique révèle que la bactérie emmagasine des réserves de soufre dans son cytoplasme. Ces résultats permettent une meilleure compréhension de son métabolisme et nous rapprochent de la possibilité de développer une technique de prédiction des réactions ayant le potentiel de causer des impacts environnementaux dus à l'extraction minière.
The environmental impact of mining extraction is important. The action of microorganisms using their sulfur metabolism to metabolise compounds in mining waste contributes to reactions that may impact water quality and the environment. Few studies have been conducted on environmental microorganisms to advance the global comprehension of their sulfur metabolism in an attempt to study their impact on the environment. In this study, we cultivate an environmental bacterium, Acidithiobacillus thiooxidans, in an attempt to understand its sulfur metabolism in different growth media and at different levels of acidity. We used high-throughput RNA sequencing in association with sulfur biogeochemistry and electron microscopy to determine the expression of the genes encoding sulfur metabolism enzymes. The expression of genes encoding sulfur metabolism enzymes was media and pH-dependent. Also, the biogeochemical analysis showed the presence of reduced sulfur intermediates and of sulfuric acid in the medium. Finally, an electron microscopic analysis revealed that the bacteria stock sulfur in the cytoplasm. These results resulted in a better comprehension of its sulfur metabolism and it opens the possibility to predict reactions in mining operations that have impact on the environment.