Auswahl der wissenschaftlichen Literatur zum Thema „Tming de la Réplication“

L’infection par le virus de l’hépatite B (HBV) constitue un problème majeur de santé publique avec plus de 250 millions de personnes chroniquement infectées au niveau mondial, qui présentent un risque important d’évolution vers la cirrhose et le cancer du foie. Les traitements disponibles permettent de réduire la réplication virale mais pas d’éliminer le virus. Il est donc primordial de développer de nouvelles thérapies antivirales. Des modulateurs allostériques (ou CAM), qui interfèrent avec les fonctions structurales de Core, la protéine de capside du virus, sont actuellement en évaluation clinique. L’étude des fonctions régulatrices de la protéine Core pourrait également permettre d’identifier des agents ciblant l’hôte et de développer des thérapies combinées pour un meilleur contrôle de la réplication virale.

La réplication de l'ADN est régulée par l'emplacement et le moment de l'initiation de la réplication. Par conséquent, beaucoup d'efforts ont été investis dans l'identification et l'analyse des sites d'initiation de la réplication dans les cellules humaines. Cependant, la nature hétérogène de la cinétique de réplication eucaryote et la faible efficacité de l'utilisation du site d'initiation individuelle chez les métazoaires a rendu difficile la cartographie de l'emplacement et du moment de l'initiation de la réplication dans les cellules humaines. Une solution potentielle au problème de la cartographie de la réplication humaine est l'analyse dans les molécules uniques. Cependant, les approches actuelles ne fournissent pas le débit requis pour les expériences à l'échelle du génome humaine. Pour relever ce défi, nous avons développé la cartographie de réplication optique (Optical Replicaiton Mapping - ORM), une approche de molécule unique à haut débit pour cartographier l'ADN nouvellement répliqué, et l'avons utilisée pour cartographier les événements d'initiation précoce dans les cellules humaines. La nature de molécule unique de nos données, et une couverture totale de plus de 2000 fois du génome humain sur 27 millions de fibres d'une longueur moyenne d'environ 300 kb, nous permettent d'identifier les sites d'initiation et leur probabilité d’initiation avec une grande confiance. En particulier, pour la première fois, nous sommes en mesure de mesurer à l'échelle du génome humain l'efficacité absolue de l'initiation de la réplication. Nous constatons que la distribution de l'initiation de la réplication humaine est cohérente avec l'initiation inefficace et stochastique de complexes d'initiation potentiels distribués de manière hétérogène enrichis en chromatine accessible. En particulier, nous constatons que les sites d'initiation de la réplication humaine ne sont pas limités à des origines de réplication bien définies, mais sont plutôt répartis sur de larges zones d'initiation constituées de nombreux sites d'initiation. De plus, nous ne trouvons aucune corrélation des événements d'initiation entre les zones d'initiation voisines. Bien que la plupart des événements d'initiation précoce se produisent dans les régions à réplication précoce du génome, un nombre significatif se produit dans les régions tardives. Le fait que les sites d'initiation dans les régions tardive aient une certaine probabilité d’initiation au début de la phase S suggère que la principale différence entre les événements d'initiation dans les régions à réplication précoce et tardive est leur probabilité intrinsèque d’initiation, et n’est pas due à une différence qualitative dans leur distribution de temps d’initiation. De plus, la modélisation de la cinétique de réplication démontre que la mesure de l'efficacité d’initiation de la zone d'initiation au début de la phase S suffit pour prédire le temps d’initiation moyen de ces zones tout au long de la phase S, ce qui suggère en outre que les différences entre les temps d’initiation des zones d'initiation précoce et tardive sont quantitatives plutôt que qualitatives. Ces observations sont cohérentes avec les modèles stochastiques de la régulation de l'initiation et suggèrent que la régulation stochastique de la cinétique de réplication est une caractéristique fondamentale de la réplication chez eucaryotes, conservée de la levure à l'homme
DNA replication is regulated by the location and timing of replication initiation. Therefore, much effort has been invested in identifying and analyzing the sites of human replication initiation. However, the heterogeneous nature of eukaryotic replication kinetics and the low efficiency of individual initiation site utilization in metazoans has made mapping the location and timing of replication initiation in human cells difficult. A potential solution to the problem of human replication mapping is single-molecule analysis. However, current approaches do not provide the throughput required for genome-wide experiments. To address this challenge, we have developed Optical Replication Mapping (ORM), a high-throughput single-molecule approach to map newly replicated DNA and used it to map early initiation events in human cells. The single-molecule nature of our data, and a total of more than 2000-fold coverage of the human genome on 27 million fibers averaging ~300 kb in length, allow us to identify initiation sites and their firing probability with high confidence. In particular, for the first time, we are able to measure genome-wide the absolute efficiency of human replication initiation. We find that the distribution of human replication initiation is consistent with inefficient, stochastic initiation of heterogeneously distributed potential initiation complexes enriched in accessible chromatin. In particular, we find sites of human replication initiation are not confined to well-defined replication origins but are instead distributed across broad initiation zones consisting of many initiation sites. Furthermore, we find no correlation of initiation events between neighboring initiation zones. Although most early initiation events occur in early-replicating regions of the genome, a significant number occur in late replicating regions. The fact that initiation sites in typically late-replicating regions. The fact that initiation sites in typically late-replicating regions have some probability of firing in early S phase suggests that the major difference between initiation events in early and late replicating regions is their intrinsic probability of firing, as opposed to a qualitative difference in their firing-time distributions. Moreover, modeling of replication kinetics demonstrates that measuring the efficiency of initiation-zone firing in early S phase suffices to predict the average firing time of such initiation zones throughout S phase, further suggesting that the differences between the firing times of early and late initiation zones are quantitative, rather than qualitative. These observations are consistent with stochastic models of initiation-timing regulation and suggest that stochastic regulation of replication kinetics is a fundamental feature of eukaryotic replication, conserved from yeast to humans

Les télomères sont constitués de répétitions de courtes séquences dont un des brins est riche en guanine (G) et l'autre riche en cytosine (C).Les télomères de Saccharomyces cerevisiae sont répliqués par la télomérase qui ajoute des répétitions nouvelles au brin G-riche. Lors de la réplication des télomères de levure, les extrémités des chromosomes acquièrent de longues extensions simple-brin 3' riche en G. Ces extensions 3' sont générées à la fin de la phase S. Le candidat idéal pour la génération de ces queues G-riche était la télomérase. Toutefois, dans une souche de levure dépourvue de la télomérase, nous avons aussi retrouvé des extensions 3' télomériques durant la phase S. Ces résultats démontrent l'existence d'une activité indépendante de la télomérase pour la génération de ces queues riche en G. Cette activité pourrait être une exonucléase 5'-3' nécessaire pour générer une structure uniforme à tous les télomères puisque suite à la réplication semi-conservative, une extrémité du chromosome va comporter une courte extension 3' et l'autre extrémité, un bout franc. Pour déterminer si cette activité de dégradation du brin C-riche était dépendante du passage de la machinerie de réplication, nous avons utilisé un plasmide linéaire comportant des télomères à chacune de ses extrémités et qui ne peut se répliquer. Dans un tel cas, les télomères n'acquièrent pas d'extensions simple-brin riche en G contrairement à un plasmide correspondant comportant une origine de réplication. Ceci nous permettait de proposer un lien entre la machinerie de réplication conventionnelle et le maintien des télomères. Pour confirmer le lien pouvant exister entre la réplication des télomères et la machinerie de réplication conventionnelle, nous avons examiné les télomères d'une souche de levure possédant une mutation dans la sous-unité catalytique de l'ADN polymérase [alpha]. En plus de posséder des télomères allongés par rapport à une souche de type sauvage, un tel mutant démontre une augmentation de la quantité de simple-brin télomérique G-riche. Cette augmentation du simple-brin terminal est probablement causée par une synthèse inefficace du brin C-riche par la machinerie du brin retardé puisque ce simple-brin télomérique est généré durant la phase S. L'augmentation de la taille des télomères étant dépendante de la télomérase, nous proposons donc un couplage de la synthèse du brin G-riche par la télomérase avec la synthèse du brin C-roche par la machinerie de réplication conventionnelle pour permettre une régulation de la taille des télomères.

Dans cette thèse, nous présentons un système de réplication optimiste pour les applications collaboratives asynchrones. Dans notre modèle, les réplicas travaillent de façon autonome et se synchronisent deux à deux afin d'assurer la propagation épidémique des écritures et la cohérence globale à terme des données. Nous avons conçu pour cela un protocole qui garantit des échanges incrémentaux. Il optimise la consommation de bande passante et simplifie la détection des mises-à-jour à intégrer. Il repose sur un mécanisme de journalisation des écritures. Ce mode de persistance offre de bonnes performances, une grande robustesse et un support simple pour l'évolution de schéma. Lorsque deux réplicas se synchronisent, des conflits peuvent apparaître. Pour y faire face, nous proposons un mécanisme d'horloge logique qui définit un ordre total sur les écritures, cohérent avec l'ordre temporel. Il permet de résoudre les mises-à-jour conflictuelles par un ordonnancement conforme à l'intuition pour les utilisateurs. D'autres types de conflits propres à l'application et à l'intégrité des données peuvent survenir. Le développeur d'applications dispose d'une interface de programmation pour définir des procédures de résolution spécifiques. Par ailleurs, nous présentons deux extensions au protocole de propagation épidémique pour le rendre exploitable à large échelle : le contrôle de la vitesse de convergence et la réplication partielle. En complément de la réplication des données, nous proposons un "framework" pour le déploiement dynamique des mises-à-jour du code et des ressources de l'application. Enfin, l'ensemble du système de réplication est illustré sur une application collaborative asynchrone, Pharos, qui permet le partage de recommandations dans des communautés d'intérêt.

Ma thèse a porté sur la régulation de l'initiation de la réplication chez les vertébrés. J'ai participé à l'identification et la caractérisation d'origines de réplication (ori) sur 1% du génome humain. Ces ori ont été identifiées dans des cellules HeLa grâce à la quantification de petits brins naissants, spécifiques de l'initiation de la réplication. Nous avons pu montrer qu'un lien fort existe entre les ori et les îlots CpG et que l'association des ori avec des marques de chromatine ouverte comme l'acétylation des histones n'est pas indispensable pour l'initiation. De plus, il n'y a pas de lien clair entre densité en ori et moment de réplication d'une région génomique donnée. Je me suis aussi intéressée à l'étape de licensing c. -à-d. La fixation au niveau des sites d'initiation potentiels du complexe de Pré-réplication (Pré-RC) avec en premier lieu ORC (Origin récognition complex). Le licensing s'effectue en phase Gl du cycle cellulaire et seuls les sites de fixation du Pré-RC peuvent être utilisés comme site d'initiation. Nous avons choisi de travailler avec la lignée aviaire DT40 qui effectue la recombinaison homologue à forte fréquence. J'ai donc construit des lignées qui expriment une protéine Orcl ou Orc2 étiquetée à partir du locus endogène. J'ai réalisé des immunoprécipitations de chromatine pour identifier leurs sites de fixation. Nous arrivons à avoir des enrichissements faibles mais cohérents de Orcl au niveau des ori connues du poulet. Comme les faibles enrichissements obtenus compliquent des approches plus globales, nous envisageons de répéter ces expériences sur des cellules en phase Gl, obtenues par élutriation, afin d'augmenter les enrichissements obtenus
My PhD focused on the molecular mechanisms governing initiation of DNA replication in vertebrates. I participated in the identification and characterization of origins of replication (ori) on 1% of the human genome. These ori have been identified in HeLa cells by quantification of short nascent strands, which are specific of replication initiation. We showed that a strong link exists between ori and CpG islands and that the association of ori with open chromatin marks like histone acetylation is dispensable for origin specification. Furthermore, no clear link emerges between ori density and the moment at which a genomic region replicates. I have also been interested in the licensing step which consists in the binding on the initiation sites of the Pre-replication complex (Pre-RC), in first place ORC (Origin recognition complex). Licensing takes place in the Gl phase of the cell cycle and only Pre-RC binding sites can be used as initiation sites. We chose to work with the avian DT40 cell line, able to perform homologous recombination at high frequency. I thus constructed cell lines which express tagged versions of the Orcl and Orc2 proteins and from the endogenous locus. I realized chromatin immunoprecipitations (ChIP) to identify their binding sites. We obtain small but coherent enrichments of Orcl at well known chicken ori. As these small enrichments complicate genome-wide approaches, we plan to repeat these experiments with elutriated cells in Gl phase in order to increase the ChIP enrichments

Les recherches décrites dans cette thèse ont pour but le développement de systèmes modèles pour 'réparer' des sites abasiques dans des doubles hélices d'ADN. Nous ne pensons pas rétablir la base naturelle manquante, mais introduirons une modification chimique du site abasique pour restaurer la stabilité du duplex. La base opposée au site abasique sera utilisée pour sélectionner un "réactif de réparation" complémentaire au sens de l'appariement de type Watson-Crick, parmi plusieurs réactifs possibles. Cette étape de sélection devrait donc constituer une sorte de "transfert d'information" ou de "réplication" de la base opposée vers le site abasique, et elle devrait être intéressante a ce titre. Nous voudrions que notre système de réparation de sites abasiques utilise des réactions qui soient réversibles à l'échelle de l'expérience. Cela devrait permettre une correction in situ des erreurs commises par le système. Nous voudrions également que les unités de réparation réagissent avec le squelette de l'ADN, mais sans le couper. Nous pensons qu'éviter la coupure du brin rendra notre système beaucoup plus fiable. Nous avons choisi la réaction entre des aldéhydes et des dérivés d'amines pour former des dérivés d'imines. Ces réactifs peuvent réagir de manière réversible dans l'eau à pH 7. Cette thèse est divisée en trois chapitres principaux; dans le chapitre deux une étude bibliographique de la littérature sur laquelle nos travaux sont basés est présentée. Le chapitre trois contient les travaux sur la réparation des sites abasiques naturels. Le chapitre quatre concerne les travaux sur la réparation des sites abasiques artificiels.

L’étude présentée dans ce manuscrit porte sur la réplication de structures naturelles multi-échelles et multifonctionnelles, que sont les ailes des papillons Morpho rhetenor, Morpho menelaus et Papilio ulysse, ou celles de la cigale Cicada orni. De telles structures sont en effet constituées de sous-structures à différentes échelles, du centimètre au nanomètre, et à chacune de ces échelles est associée une propriété ou fonction. On parle alors de multifonctionnalité. Cet atout, très recherché actuellement pour nos futurs objets et matériaux, est accessible par deux voies de complexification : celle de la composition chimique du ou des matériaux constituant l’objet (matériaux composites, hybrides organique-inorganique) et/ou celle de leur géométrie (structuration). Or, si nos connaissances en chimie nous permettent de mettre en œuvre la première voie, l’élaboration de structures multi-échelles est encore difficile par nos techniques actuelles de structuration (lithographie par exemple). Ainsi, pour augmenter les propriétés d’un système possédant une géométrie multi-échelles existante dans la nature, nous avons réalisé des répliques des structures naturelles précédemment évoquées dans des matériaux inorganiques (TiO2 et SiO2), soit des matériaux très différents du complexe chitino-protéique qui constituent les ailes organiques. A cette fin, trois méthodes ont été utilisées : un dépôt de matière dans les structures naturelles par voie sol-gel, un dépôt par pulvérisation cathodique et une minéralisation directe de la structure des ailes, s’inspirant de processus de biominéralisation
The present study deals with the replication of multiscale and multifunctional natural structures. These natural structures are wings of Morpho rhetenor, Morpho menelaus and Papilio ulysse butterflies, and those of Cicada orni cicada. Such structures are composed of smaller structures at different scales, from centimetre to nanometre, and to each of these scales is associated a property or a function. This we call multifunctionality. This multifunctionality is expected to become a property of our future objects or materials, and can be achieved by two different ways: to make the material(s) chemical composition of the object more complex (composite, hybrid organic-inorganic materials) and/or to make its architecture more complex (structuration). Although it is possible to achieve the first (chemical composition), we have so far been unable to successfully make multiscale structures with our current structuration techniques (lithography for example). Therefore, to increase the properties of a system characterised by a multiscale structure seen in nature, we have made replicas of the natural structures previously presented in inorganic materials (TiO2 and SiO2). That is to say, very different materials in comparison with the natural chitin-protein complex. To do this, three methods were used: a sol-gel solution deposition in the natural structures, a physical vapor deposition and a direct mineralization of the wings structure, which is inspired by natural biomineralization processes

Haloferax volcanii est une archée appartenant au phylum euryarchaeota et à la classe des Halobacteriales. Les mécanismes liés à la réplication et à la réparation chez les archées sont très similaires à ceux rencontrés chez les eucaryotes, faisant d’H. volcanii un des organismes modèle pour l’étude de la réplication et de la biologie des archées, notamment car de nombreux outils génétiques sont disponibles chez cet organisme. De plus, H. volcanii possède la particularité de pouvoir avoir toutes ses origines de réplication supprimées, soulevant beaucoup de questions sur les mécanismes impliqués. Plusieurs hypothèses ont été émises sur la façon dont cette souche initie sa réplication, basées soit sur la dérivation des mécanismes liés à la réparation de l’ADN, soit sur un mécanisme d’initiation de la réplication indépendant des origines. Afin d’étudier ces mécanismes liés à la réplication, j’ai construit une souche d’H. volcanii capable d’incorporer des analogues de la thymidine dans l’ADN lors de sa synthèse grâce à la délétion de gènes impliqués dans la voie de biosynthèse de la thymidine. Des temps de cultures courts de la souche en présence d’un analogue permet son incorporation au niveau des zones actives de réplication pour marquer spécifiquement l’ADN néosynthétisé. L’immunodétection de l’analogue incorporé à l’ADN, en travaillant en cellule entière avec un microscope à fluorescence, permet la localisation de l’ADN néosynthétisé, reflétant ainsi les régions où la réplication est active. Ces analyses révèlent majoritairement 2 à 3 régions de réplication actives dans des cellules en prolifération, sans localisation particulière. Ces régions ont déjà été observées en étudiant la localisation d’une protéine clé de la réplication (RPA2) fusionnée à la protéine verte fluorescente GFP, confirmant sa localisation aux zones actives de réplication. Une étonnante variabilité observée d’une cellule à l’autre et suggère une initiation probabiliste de la réplication. Il est également étonnant de n’observer qu’aussi peu de zones actives de réplication, comparé au fort taux de polyploïdie de cette souche. Se pose alors la question de ce à quoi correspondent ces zones de réplication. Pour cela, j’ai développé chez H. volcanii la technique de peignage moléculaire permettant d’isoler des molécules individuelles d’ADN et révéler spécifiquement les analogues incorporés pour pouvoir déterminer le nombre de copies du chromosome qui sont actives lors de la réplication, ainsi que le nombre d’origines actives sur chacune des copies. J’ai également développé une technique de Time-lapse dans le but de suivre ces régions au cours du temps en observant les divisions cellulaires directement sous le microscope
Haloferax volcanii is an archaea belonging to the phylum euryarchaeota and the class Halobacteriales. The mechanisms related to replication and repair in archaea are very similar to those found in eukaryotes, making H. volcanii a relevant model organisms for the study of replication and archaeal biology, especially since many genetic tools are available. Interestingly, all replication origins can be removed from the chromosome of H. volcanii, raising many questions about the mechanisms involved. Several hypotheses have been proposed on how this strain initiates its replication, either relying on recombination-dependent replication initiation or an origin-independent mechanism. In order to study these replication-related mechanisms, I have constructed a strain of H. volcanii able to incorporate thymidine analogues into DNA during its synthesis by deleting genes involved in the thymidine biosynthesis pathway. A short-time cultures of the strain in the presence of an analogue allows its incorporation in nascent DNA. By immunodetection of the analog coupled to fluorescence microscopy observation of whole cells, it is possible to investigate the localization of neosynthesized DNA,which reflect the regions where replication is active. These analyses revealed mainly 2 to 3 active replication regions per cell, without any particular location. These regions had already been observed by studying the localization of a key replication protein (RPA2) fused to the fluorescent green protein GFP, confirming its location in active replication areas. A surprising variability in the number of replication foci from one cell to another was observed, suggesting a probabilistic initiation of replication. It is also surprising to observe so few active replication areas compared to the high polyploidy of this strain. This raises the question of what these replication areas correspond to. For further understanding, I developed for H. volcanii molecular combing, to isolate individual DNA molecules and specifically reveal incorporated analogues to determine the number of copies of the chromosome that are being replicated, as well as the number of active origins on each of the copies. I have also developed time-lapse approach to track these regions over time by monitoring cell proliferation directly under the microscope

L'étude a porté sur la protéine pUL17 du virus MDV (Marek's Disease Virus), homologue à la protéine de capside et de tégument d'HSV-1. La stratégie adoptée repose sur la délétion et l'étiquetage du gène UL17 par recombinaison homologue en utilisant un chromosome bactérien artificiel (BAC) contenant le génome de la souche pathogène RB-1b du virus MDV (BAC-RB-1b). La délétion du gène UL17 ou la mutagenèse de l'ATG sont létales. La restauration du gène permet au virus de retrouver sa capacité de réplication. Lors de l'infection virale, la phosphoprotéine pUL17 (82 kDa) est localisée au noyau, pour partie associée à la membrane nucléaire. Cette localisation nucléaire n'est pas une propriété intrinsèque de la protéine et implique un facteur viral. La co-localisation partielle de pUL17 avec la protéine majeure de capside VP5 et l'influence qu'elle exerce sur la relocalisation de la protéine de tégument pUL14 semblent confirmer l'intervention de pUL17 dans la constitution du tégument viral
This work aimed at studying the Marek's Disease virus (MDV) UL17 protein which is homologous to the capsid and tegument protein of HSV-1 virus. For this purpose, we used a bacterial artificial chromosome (BAC) of the highly pathogenic MDV strain RB-1b to generate mutant viruses in which the UL17 gene was either deleted or tagged with the HA peptide. The results showed that MDV pUL17 is a phosphoprotein (82 kDa) essential for viral replication. During the infection, pUL17 localizes in the nuclear compartment. This nuclear localization is not an intrinsic property of pUL17 and implies a viral factor. The co-localization of pUL17 with the major capsid protein VP5 and its influence on the cellular distribution of the tegument protein pUL14 favour the hypothesis that pUL17 participates in early tegumentation

Les particules virales défectueuses sont une sous-population de particules virales incapables d’accomplir un cycle de réplication complet en l’absence d’un virus standard co-infectant. Elles sont générées lors de la réplication de virus de plantes, d’arthropodes et de mammifères et contiennent des génomes viraux défectueux (DVG) qui résultent d’altérations génomiques introduites lors de la réplication virale.

La transmission des virus de plantes par vecteurs arthropodes s’opère via des interactions spécifiques entre plante, virus et vecteur. Les stratégies de transmission par vecteur sont déterminées par : la localisation du virus transmissible dans l’arthropode (transmission par virus circulant ou non circulant dans le vecteur), la durée de la relation virusvecteur (non persistante, semi-persistante ou persistante) et s’il y a réplication ou pas du virus dans l’insecte (tranmission propagative ou non propagative). La plupart des virus de plantes sont transmis horizontalement par les arthropodes, même si des réovirus, rhabodovirus et tenuivirus peuvent aussi être transmis verticalement chez le vecteur. Ce chapitre analyse des progrès récents et des questions de longue date de la biologie des vecteurs.