Auswahl der wissenschaftlichen Literatur zum Thema „Terpene-isolation“

Matrix isolation Fourier transform infrared spectra (MI/FT-IR), mass spectra (MS), carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance (13C-NMR) spectra, condensed-phase infrared spectra, and vapor-phase infrared (IR) spectra are presented for a series of terpene compounds. Subtle differences in positional and configurational isomers commonly found with terpenes could be easily detected by the MI/FT-IR spectra. The results are comparable in some aspects to those obtainable from 13C-NMR and thin-film IR; however, most importantly, they are acquired at the low nanogram level for MI/FT-IR, as compared to the milligram level for the other techniques. These results represent an advance in the technology available for the analysis of complex mixtures such as essential oils containing terpene-like molecules.

Abstract Terpenoids are the largest, most diverse class of plant natural products and they play numerous functional roles in primary metabolism and in ecological interactions. The first committed step in the formation of the various terpenoid classes is the transformation of the prenyl diphosphate precursors, geranyl diphosphate, farnesyl diphosphate, and geranylgeranyl diphosphate, to the parent structures of each type catalyzed by the respective monoterpene (C10), sesquiterpene (C15), and diterpene synthases (C20). Over 30 cDNAs encoding plant terpenoid synthases involved in primary and secondary metabolism have been cloned and characterized. Here we describe the isolation and analysis of six genomic clones encoding terpene synthases of conifers, [(-)-pinene (C10), (-)-limonene (C10), (E)-α-bisabolene (C15), δ-selinene (C15), and abietadiene synthase (C20) from Abies grandis and taxadiene synthase (C20) from Taxus brevifolia], all of which are involved in natural products biosynthesis. Genome organization (intron number, size, placement and phase, and exon size) of these gymnosperm terpene synthases was compared to eight previously characterized angiosperm terpene synthase genes and to six putative terpene synthase genomic sequences from Arabidopsis thaliana. Three distinct classes of terpene synthase genes were discerned, from which assumed patterns of sequential intron loss and the loss of an unusual internal sequence element suggest that the ancestral terpenoid synthase gene resembled a contemporary conifer diterpene synthase gene in containing at least 12 introns and 13 exons of conserved size. A model presented for the evolutionary history of plant terpene synthases suggests that this superfamily of genes responsible for natural products biosynthesis derived from terpene synthase genes involved in primary metabolism by duplication and divergence in structural and functional specialization. This novel molecular evolutionary approach focused on genes of secondary metabolism may have broad implications for the origins of natural products and for plant phylogenetics in general.

AbstractThe teleocidin B family members are terpene indole compounds isolated from Streptomyces bacteria, and they strongly activate protein kinase C (PKC). Their unique structures have attracted many researchers in the natural product chemistry and pharmacology fields, and numerous isolation and bioactivity studies have been conducted. The accumulated information has facilitated the identification of the enzymatic reactions in teleocidin biosynthesis, and new developments in structural biology have strongly aided efforts to clarify the finer points of these reactions. This review describes the recent biochemical and structural biological studies to reveal their reaction mechanisms, with a primary focus on the terpene cyclization triggered by the C-N bond formation by P450 oxygenase (TleB), the prenyltransferase (TleC), and the methyltransferase (TleD). This new knowledge will benefit future engineering studies to create unnatural PKC activators.

Two cDNA libraries, from Salvia fruticosa and Salvia pomifera were used as starting material for this research. An analysis of the expressed sequence tags (ESTs) was made in both cases and compared with ESTs from another member of the same Labiatae family (Origanum vugare), with a monocotyledon species (Oryza sativa), and with a dicotyledon with secondary growth (Populus sp). As expected, the gene distribution in the different categories suggested by the Munich Information Center for Protein Sequences (MIPS) was very similar for all the member of the Labiatae family. The analysis showed that sequences generally group together based on species relationships rather than function. This makes it difficult to use sequence information for the prediction of function. However, it could be noted that within closely related species, enzymes of similar function group together and in these cases, sequence information may be informative for predicting functionally important amino acids.

A família Lamiaceae engloba um conjunto de espécies onde se inclui o género Thymus. Plantas do género Thymus são conhecidas pelas suas propriedades aromáticas de elevado potencial comercial e económico, com várias aplicações na medicina tradicional ou como plantas aromáticas de interiores e no uso de fragrâncias em sabonetes, perfumes e detergentes. Estas características são conferidas pelos óleos essenciais produzidos por estruturas especializadas denominadas de tricomas glandulares que se encontram nos seus órgãos aéreos. Esta família apresenta dois tipos de tricomas glandulares, os tricomas peltados e os capitados, sendo os primeiros os maiores contribuintes para a síntese do óleo essencial. O óleo essencial produzido é composto por uma mistura heterogénea de metabolitos maioritariamente secundários, como alcalóides, fenóis, aldeídos e terpenos, sendo esta última a classe de compostos mais abundante. Os terpenos são a maior família de produtos naturais, com aproximadamente 20 000 compostos que se dividem em várias classes de acordo com o número de átomos de carbono que os constituem, sendo denominados de monoterpenos (C10), sesquiterpenos (C15), diterpenos (C20) e triterpenos (C30) e são sintetizados respectivamente pelas monoterpeno, sesquiterpeno, diterpeno e triterpeno sintases. Os monoterpenos são sintetizados a partir do geranil difosfato (GDP) e requerem a presença de dois metais divalentes (Mn2+ ou Mg2+) para a sua ionização em 3R- ou 3Slinalil difosfato (LDP, dependendo da posição inicial do geranil difosfato). A partir deste intermediário universal a reacção pode adoptar vários fins, podendo desta forma resultar na síntese de diferentes terpenóides. As monoterpeno sintases são caracterizadas pela presença de várias regiões conservadas, entre as quais os motivos DDXXD e (M/L)L(S/Q/N)L(F/Y)EAS que estão envolvidos na interacção com os metais divalentes e na sua actividade enzimática. O objectivo deste trabalho consistiu em isolar e caracterizar as sequências codificantes de duas monoterpeno sintases presentes em plantas do género Thymus, respectivamente Thymus albicans Hoffmans & Link quimiótipo cineol e Thymus mastichina (L.) L. spp. mastichina quimiótipo linalol. Neste estudo a região codificante das enzimas 1,8-cineol e linalol sintases, que estão envolvidas na síntese dos monoterpenos 1,8-cineol e linalol, monoterpenos predominantes nos óleos essenciais das plantas em estudo, foram isoladas, totalmente ou parcialmente e os tricomas glandulares caracterizados a nível estrutural em T. albicans. Inicialmente avaliou-se a distribuição de tricomas peltados nos órgãos aéreos de T. albicans e constatou-se que os tricomas peltados se encontram em maior abundância nas folhas, brácteas e sépalas, em comparação com o ovário e as pétalas. Observações ao microscópio óptico das secções das folhas revelaram que a estrutura dos tricomas peltados de T. albicans é similar à maioria das espécies da família Lamiaceae, apresentando uma célula basal ligada à epiderme da folha seguindose uma célula pedícular e uma cabeça composta por células secretoras distribuídas por dois círculos concêntricos, com 8 células secretoras em torno de 4 células centrais. Em contrapartida, os tricomas capitados são compostos por duas células pediculares e uma cabeça alongada, maior que as células pediculares. A estrutura apresentada pelos tricomas capitados contrasta com a maioria dos tricomas observados na família Lamiaceae, que são caracterizados por apresentarem uma célula pedicular maior que metade do comprimento da cabeça. Com base nestas observações as folhas foram o órgão da planta seleccionado para isolar a sequência codificante destas enzimas a partir do seu RNA total. Este estudo não incluiu a caracterização dos tricomas dos órgãos aéreos de T. mastichina devido à difícil disponibilidade do material vegetal desta espécie e também porque os seus tricomas glandulares já foram analisados em outros estudos. A estratégia utilizada para isolar a região codificante das enzimas baseou-se na amplificação do DNA (PCR e PCR-RACE) utilizando primers degenerados em zonas conservadas da sequência nucleotídica, tais como as regiões DDXXD e (M/L)L(S/Q/N)L(F/Y)EAS ou em regiões especificas do transcripto amplificado em cDNA de folha de T. albicans e T. mastichina. Como resultado obteve-se a sequência completa correspondente à região codificante de uma possível 1,8-cineol sintase de T. albicans (TalbCyn), com 1857 pb e 70% de similaridade com a 1,8-cineol de Rosmarinus officinalis. Obtiveram-se também dois fragmentos de possíveis monoterpeno sintases em T. albicans com 972 pb (TalbLin) e T. mastichina com 795 pb (TmlCyn), que partilham 71% de similaridade com uma linalol sintase de Perilla setoyensis e com 57% de similaridade para com a 1,8-cineol sintase de Rosmarinus officinalis, respectivamente. Alinhamentos entre as sequências de aminoácidos de TalbCyn, TmlCyn, TalbLin e outras 1,8-cineol sintases e linalool sintases revelou motivos característicos dos membros desta família (RRX8W, DDXXD, (M/L)L(S/Q/N)L(F/Y)EAS e (N/D)DX2(S/T)X3E) e também três regiões (região 1, região 2 e região 3) menos conservados entre as 1,8-cineol e linalol sintases, que podem ser determinantes para a estrutura terciária das proteínas, conferindo-lhes especificidade na síntese do produto. viii TalbLin apresenta uma substituição no motivo DDXXD no último ácido aspártico (D) por uma serina (S), o que poderá justificar o baixo rendimento de extracção de linalol (0.4%) comparando com 1,8-cineol (67.9%) em T. albicans verificado em estudos anteriores. A Região1 menos conservada, presente em ambas as sequências isoladas, contém um resíduo de asparagina que não está presente em TalbLin e está envolvido na deprotonação da água necessária para a síntese do 1,8-cineol. A Região 3, sendo uma região característica das terpeno ciclases, está presente nas ciclases 1,8-cineol sintases mas não se encontra nas acíclicas linalol sintases. Estas diferenças encontradas entre as 1,8-cineol e linalol sintases reflectem diferenças por parte das enzimas na especificidade do produto, resultando na síntese de diferentes monoterpenos. Para caracterizar funcionalmente as enzimas isoladas, a região correspondente à proteína madura da 1,8-cineol sintase de T. albicans, respectivamente a partir da região RRX8W, foi clonada no vector de expressão pCR®T7/NT-TOPO® utilizando o hospedeiro E. coli BL21 (DE3) e incluindo uma cauda de histidinas na sua extremidade amino-terminal para possibilitar o isolamento e purificação da proteina recombinante produzida. Ensaios preliminares de indução da expressão na presença de 0.7 mM de IPTG a 20 ºC foram realizados para avaliar o padrão de expressão da proteina recombinada e o extracto proteico da fracção insolúvel de amostras da cultura retiradas no final de 4, 10, 24, 48 e 72 horas foram analisadas por SDS-PAGE. Após 10 horas de indução, obteve-se na fracção insolúvel uma proteína com 70 KDa, peso molecular aproximado ao estimado para a proteína recombinante, 72.92 KDa respectivamente. No entanto, a identidade desta proteina carece ainda de ser confirmada através de Western blot, com anticorpos específicos para a cauda de histidinas e por sequenciação. De uma forma geral, os resultados obtidos neste trabalho constituem os passos iniciais que permitirão o isolamento e caracterização das enzimas 1,8-cineol e linalol sintases de T. albicans e T. mastichina, com o objectivo de elucidar o mecanismo reaccional complexo das monoterpeno sintases.