Auswahl der wissenschaftlichen Literatur zum Thema „Technologies omiques“

Malgré les efforts de la recherche biomédicale, les mécanismes pathologiques et les cibles thérapeutiques des maladies restent difficiles à identifier. L’essor des technologies à haut débit a conduit au développement de technologies innovantes dites « omiques » (omics en langue anglaise). Elles visent à caractériser de manière exhaustive un ensemble de molécules : gènes, ARN, protéines, métabolites, etc. Ces méthodes sans a priori permettent une caractérisation moléculaire fine des maladies et une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques complexes. Dans cet article, nous ferons un tour d’horizon des approches omiques, de leur intégration et de leurs applications dans le contexte de la myologie.

Grâce à l’accroissement des connaissances associées aux génomes permis par le séquençage à haut débit, à la multiplication des outils d’ingénierie génétique ainsi qu’aux autres technologies « omiques », les biotechnologies pharmaceutiques ont favorisé l’identification et la validation de nombreuses cibles diagnostiques et thérapeutiques et ont ainsi conduit au développement de nombreuses thérapies ciblées. Bien que leur histoire soit récente, les biotechnologies pharmaceutiques évoluent rapidement et offrent des perspectives réjouissantes à l’aube de la médecine de précision.

La recherche biomédicale connaît depuis le début du siècle un bouleversement de grande ampleur avec l’avènement de technologies à grand débit (les -omiques) appliquées à la biologie et associées à des approches biologiques, moléculaires ou aux techniques d’imagerie. Cette révolution méthodologique s’appuie sur l’analyse d’échantillons biologiques prélevés sur les patients puis conservés dans des biobanques. L’intégration des données massives obtenues par ces différentes technologies et leur analyse devrait permettre d’accroître nos connaissances des mécanismes complexes des pathologies humaines et une meilleure stratification des patients selon une nomenclature génétique ou moléculaire. L’accroissement exponentiel des données générées et leur complexité nécessitent cependant la mise en place d’infrastructures adaptées, de nouvelles modalités d’accès et d’échanges de ces données ainsi qu’une organisation optimisée des biobanques afin d’intégrer de nouvelles disciplines adaptées à l’analyse de ces données.

Les anticorps monoclonaux font désormais partie intégrante de l’arsenal thérapeutique pour une multitude de maladies. Étant donné le nombre croissant de produits commerciaux et de candidats en développement, l’état actuel des systèmes de bioproduction est une préoccupation majeure de l’industrie. La productivité des plateformes d’expression, ainsi que la performance des technologies utilisées dans les procédés en amont et en aval, sont des facteurs critiques qui ont un impact sur le coût et la durée du développement des anticorps thérapeutiques. De multiples stratégies de génie cellulaire peuvent être utilisées pour l’amélioration de la production des anticorps et pour un contrôle accru des modifications post-traductionnelles, comme la glycosylation, particulièrement importante, car elle peut avoir un effet prononcé sur l’activité thérapeutique des anticorps. Les avancées des techniques « omiques » rendent maintenant possibles de nouvelles approches pour l’amélioration de ces plateformes. Nous passons ici en revue les progrès en bioproduction essentiels à la croissance continue du marché des anticorps thérapeutiques.

Les mécanismes moléculaires à l’origine des processus biologiques sont gouvernés par les produits de l’expression d’une multitude de gènes dont les stratégies d’étude ont bénéficié d’avances technologiques considérables ces dernières années. En effet, alors que la biologie moléculaire était ciblée sur quelques gènes choisis selon leur fonction biologique dans les processus étudiés, les approches en «omique» permettent aujourd’hui d’étudier simultanément un grand nombre de gènes, protéines ou métabolites sans a priori sur leur fonction biologique. Ces nouvelles technologies peuvent contribuer à une meilleure connaissance de la biologie des herbivores dans une perspective d’élevage durable. Dans les exemples présentés dans cette courte synthèse, il apparaît en effet que ces approches à haut débit peuvent contribuer à améliorer l’efficacité économique des productions notamment par la détection de marqueurs de l’exposition aux mycotoxines et par une meilleure efficacité métabolique et physiologique des herbivores (partage des nutriments entre tissus et organes, différenciation du muscle pour la production de viande, régulation de l’expression des gènes par les nutriments). Les approches en «omique» peuvent aussi contribuer aux autres piliers du développement durable : bien-être animal (par la mise en évidence de marqueurs de stress), protection de l’environnement (par la maîtrise des rejets azotés par les animaux), qualité des produits (par une maîtrise de la composition en acides gras et de la qualité sensorielle des produits laitiers et carnés, et par la recherche biologique de prédicteurs de la tendreté de la viande).

Les cellules T régulatrices CD8+ (Tregs) ont été les premières cellules suppressives signalées en 1970, mais elles ont été mises de côté pendant des années en raison du manque de marqueurs permettant de les définir correctement. Notre équipe a démontré que les Tregs CD8+ identifiés par une expression faible et/ou négative de CD45RC, une des isoformes de la molécule CD45, montrent une puissante activité suppressive in vitro et in vivo, alors que les cellules exprimant des niveaux élevés de CD45RC ne le font pas. Dans cet article, nous nous sommes penchés sur l'hétérogénéité au sein des lymphocytes T CD8+, en particulier dans les Tregs CD8+CD45RClow/- et avons identifié de nouveaux marqueurs. Ces analyses ont permis de caractériser l'hétérogénéité transcriptomique au niveau d'une seule cellule à partir de cellules T CD8+ totales non stimulées et de définir des sous ensembles de Tregs CD8+CD45RClow/- régulateurs. Une analyse fonctionnelle utilisant le tri cellulaire et des tests de suppression a mis en évidence le potentiel suppressif du sous-ensemble de Tregs CD8+CD45RClow/- TNFR2+CD29low. À ce jour, à notre connaissance, il s'agit de la plus grande étude de caractérisation des Tregs CD8+ humains, cette énorme ressource de données aidera à la relance actuelle des Tregs CD8+ dans la recherche, améliorera notre compréhension de l'hétérogénéité des cellules T et aidera à conduire les Tregs CD8+ en clinique
CD8+ regulatory T cells (Tregs) were the first suppressive cells reported in 1970, but they were put aside for years due to a lack of markers to properly define them. Our team demonstrated that CD8+ Tregs identified by low and/or negative expression of CD45RC, one the isoforms of the CO45 molecule, show potent suppressive activity in vitro and in vivo, while cells expressing high levels of CO45RC do not. Herein, we addressed the heterogeneity within CD8+ T lymphocytes, particularly in CD8+CD45RClow/- Tregs and identified new markers. These analyses enabled the characterization of the transcriptomic heterogeneity at a single cell level from non-stimulated total CD8+ T cells and allowed definition of regulatory CD8+CD45RClow/- Treg subsets. Functional analysis using cell sorting and suppressive assays highlighted the suppressive potential of the CD8+CD45RClow/- TNFR2+CD29low Tregs subset. To date, to our knowledge, this is the largest characterization study of human CD8+ Tregs, this huge data resource will help in the current revival of CD8+ Tregs in research, will improve our understanding of T cell heterogeneity and will help translate CD8+ Tregs to the clinic

La maladie de l’œil sec (MOS) ou la kératoconjonctivite sèche (KCS) est une pathologie multifactorielle du segment antérieur de l’œil altérant la surface oculaire (SO). Ce travail de thèse a eu pour but de décrypter et d’explorer les mécanismes cellulaires et moléculaires qui sous-tendent l'initiation et la progression de la maladie, pouvant conduire à l’identification des biomarqueurs candidats. Cela a été entrepris à travers des approches moléculaires omiques ciblées ou non ciblées, à partir de prélèvements humains de la SO de patients et de modèles expérimentaux de la MOS. Ce programme de recherche s’est articulé selon 3 parties principales. En premier lieu, les approches omiques et les considérations pré-analytiques de la SO à partir des prélèvements humains. Ensuite, un phénotypage clinique avec imagerie spécifique pour une classification précise des patients. Enfin, l’identification des biomarqueurs candidats pour l’œil sec. Cette approche multimodale a permis d’assurer l’application d'une méthodologie rationnelle pour la dissection des réseaux moléculaires à partir des prélèvements rares comme les empreintes conjonctivales ou les bandelettes de Schrimer. Les effecteurs moléculaires identifiés mettent en lumière le rôle des cellules épithéliales dans l’homéostasie de la SO par les relations croisées entre le stress oxydant et l’inflammation, médiés par les voies des IFNs et du TNF-alpha, entres autres. De plus, le phénotypage clinique à travers des caractéristiques anatomiques par l’imagerie de précision ou cellulaire de la SO, a permis d’apporter une réflexion nouvelle pour reconsidérer la classification affinée des patients en sous-groupes
Dry eye disease (DED) or keratoconjunctivitis sicca (KCS) is a multifactorial pathology of the anterior segment of the eye affecting the ocular surface (OS). This thesis work aimed to decipher and explore the cellular and molecular mechanisms underlying the initiation and progression of the disease, which could lead to the identification of candidate biomarkers. This was undertaken through targeted or untargeted molecular omics approaches, using human samples of patient OS and experimental models of MOS. This research program was structured into 3 main parts. Firstly, omics approaches and pre-analytical considerations of OS from human samples. Then, clinical phenotyping with specific imaging for precise classification of patients. Finally, the identification of candidate biomarkers for dry eye. This multimodal approach ensured the application of a rational methodology for the dissection of molecular networks from rare samples such as conjunctival imprints or Schrimer strips. The identified molecular effectors highlight the role of epithelial cells in OS homeostasis through the cross-talk between oxidative stress and inflammation, mediated by the IFNs and TNF-alpha pathways, among others. In addition, clinical phenotyping through anatomical characteristics through precision or cellular imaging of the OS has made it possible to provide new thinking to reconsider the refined classification of patients into subgroups

Plusieurs évolutions sont constatées dans la recherche en biologie. Tout d’abord, les études menées reposent souvent sur des approches expérimentales quantitatives. L’analyse et l’interprétation des résultats requièrent l’utilisation de l’informatique et des statistiques. Également, en complément des études centrées sur des objets biologiques isolés, les technologies expérimentales haut débit permettent l’étude des systèmes (caractérisation des composants du système ainsi que des interactions entre ces composants). De très grandes quantités de données sont disponibles dans les bases de données publiques, librement réutilisables pour de nouvelles problématiques. Enfin, les données utiles pour les recherches en biologie sont très hétérogènes (données numériques, de textes, images, séquences biologiques, etc.) et conservées sur des supports d’information également très hétérogènes (papiers ou numériques). Ainsi « l’analyse de données » s’est petit à petit imposée comme une problématique de recherche à part entière et en seulement une dizaine d’années, le domaine de la « Bioinformatique » s’est en conséquence totalement réinventé. Disposer d’une grande quantité de données pour répondre à un questionnement biologique n’est souvent pas le défi principal. La vraie difficulté est la capacité des chercheurs à convertir les données en information, puis en connaissance. Dans ce contexte, plusieurs problématiques de recherche en biologie ont été abordées lors de cette thèse. La première concerne l’étude de l’homéostasie du fer chez la levure pathogène Candida glabrata. La seconde concerne l’étude systématique des modifications post-traductionnelles des protéines chez la levure pathogène Candida albicans. Pour ces deux projets, des données « omiques » ont été exploitées : transcriptomiques et protéomiques. Des outils bioinformatiques et des outils d’analyses ont été implémentés en parallèle conduisant à l’émergence de nouvelles hypothèses de recherche en biologie. Une attention particulière et constante a aussi été portée sur les problématiques de reproductibilité et de partage des résultats avec la communauté scientifique
Biological research is changing. First, studies are often based on quantitative experimental approaches. The analysis and the interpretation of the obtained results thus need computer science and statistics. Also, together with studies focused on isolated biological objects, high throughput experimental technologies allow to capture the functioning of biological systems (identification of components as well as the interactions between them). Very large amounts of data are also available in public databases, freely reusable to solve new open questions. Finally, the data in biological research are heterogeneous (digital data, texts, images, biological sequences, etc.) and stored on multiple supports (paper or digital). Thus, "data analysis" has gradually emerged as a key research issue, and in only ten years, the field of "Bioinformatics" has been significantly changed. Having a large amount of data to answer a biological question is often not the main challenge. The real challenge is the ability of researchers to convert the data into information and then into knowledge. In this context, several biological research projects were addressed in this thesis. The first concerns the study of iron homeostasis in the pathogenic yeast Candida glabrata. The second concerns the systematic investigation of post-translational modifications of proteins in the pathogenic yeast Candida albicans. In these two projects, omics data were used: transcriptomics and proteomics. Appropriate bioinformatics and analysis tools were developed, leading to the emergence of new research hypotheses. Particular and constant attention has also been paid to the question of data reproducibility and sharing of results with the scientific community

La qualité germinative (vigueur) des semences est un caractère agronomique majeur. Elle correspond à la capacité d'un lot de semences à germer de façon rapide et homogène dans une large gamme de conditions environnementales. Cette qualité germinative est notamment contrôlée par une interaction antagoniste entre deux phytohormones, l'acide abscissique (ABA) qui induit et maintient la dormance et les gibbérellines (GAs) qui stimulent la germination et la croissance de la plantule. La dormance, qui correspond à un blocage physiologique de la germination, est un paramètre non souhaitable d'un point de vue agronomique. Par conséquent la compréhension de la régulation hormonale sur la qualité des semences représente un intérêt fort pour la communauté scientifique mais aussi pour les acteurs de la filière "semences". De nombreuses études ont démontré l'existence d’une importante régulation de la synthèse des protéines au cours de l’imbibition des graines. Cette régulation traductionnelle contribuerait à la mise en place des programmes métaboliques différents en fonction de l’état physiologique des semences pour maintenir un état de dormance ou initier le processus de germination.Le travail réalisé dans le cadre de cette thèse s’est concentré à apporter des éléments nouveaux sur le rôle de l’ABA dans la détermination de la qualité physiologique des semences au cours du développement de la graine et au cours de la germination. L’impact de l’ABA a été particulièrement décortiqué à l’aide de mutant d’Arabidopsis thaliana présentant des teneurs en ABA endogènes contrastées. Par une approche multi-omique combinant des analyses transcriptomiques, protéomiques et métabolomiques, nous avons étudié les mécanismes moléculaires et biochimiques associées avec la mise en place de la qualité physiologique des semences en relation avec l’ABA. Nos résultats ont montré qu’au-delà du contenu en ABA, l’origine tissulaire de cette hormone dans les graines gouverne de nombreux réarrangements métaboliques qui participent au déterminisme de la profondeur de dormance et de la vigueur germinative. Il apparaît un lien entre l’ABA et l’activité traductionnelle, étroitement associé au métabolisme énergétique et à l’homéostasie RedOx.L’effet de l’ABA sur l’activité traductionnelle a été suivi par une adaptation des méthodes SILAC (stable-isotope labelled amino acids in cell culture) aux grains d’Arabidopsis. Cette technique a été utilisée pour décrire la dynamique du protéome dépendante du contenu en ABA des graines au cours de leur imbibition. Nos résultats montrent que cette approche originale permet d’enrichir les connaissances sur la biologie fondamentale des semences. En effet, nous avons montré que l’ABA est un régulateur clé de la synthèse protéique dans les graines et est un contributeur majeur dans la mise en place des différents programmes traductionnels. Cette approche a montré que l’ABA exerce un contrôle sur la traduction de plus de 400 ARNm au cours de l’imbibition des graines et ouvre de nouvelles pistes pour la compréhension de la régulation de la synthèse protéique chez les semences et chez les plantes. Ces données générées offrent un nouveau regard sur le processus germinatif et de sa régulation par l’ABA.Sur la base des données existantes au laboratoire et celles générées au cours de cette thèse, nous avons également développé une utilisation de bio-marqueurs pour l’évaluation de la qualité des semences et nous avons mis au point des traitements de semences innovants. Ces technologies ont été développé en accord avec les attentes des industriels de la filière « semences ». La récente obtention d’un financement pour ce projet de recherche appliquée démontre la complémentarité des recherches effectuées au sein du laboratoire avec les besoin des industriels de la filière « semences »
Germination vigor is a main concern in agriculture. High seed vigor is defined as the capacity of a seed lot to germinate rapidly, uniformly and in a wide range of environmental conditions. Seed quality is controlled by a dynamic balance between two antagonistic hormones, abscisic acid (ABA), which induces and maintains dormancy and gibberellins (GAs), which stimulate seed germination and seedling establishment. Seed dormancy corresponds to a block to the completion of germination and is an undesirable characteristic from an agronomic point of view. Thus, investigation of seed quality toward a better understanding of hormonal regulation is of fundamental concern for scientific community and seed industry.Recent studies have highlighted the intensive regulation of protein synthesis during seed germination. Translational regulation would govern the implementation of different metabolic programs during seed imbibition in order to maintain seed dormancy or to initiate the germination process. In this thesis, we explore the role of ABA in the control of germination quality during seed development and seed germination, using Arabidopsis thaliana mutant displaying contrasted ABA content.By combined “omic” approaches, we have highlighted the impact of ABA level on metabolic rearrangements during seed maturation. Our results showed that ABA origin in the seeds governs many metabolic rearrangements controlling dormancy depth and germination vigor. In addition, the present work suggests an intimate linkage between translational activity and ABA content, in association with energetic pathways and redox homeostasis.The impact of ABA on proteome turnover during seed germination was studied by adapting a metabolic labeling of neosynthesized proteins based on SILAC methods (stable isotope labelled amino acids in cell culture) to Arabidopsis seeds. Our results suggest that ABA is a key regulator of protein synthesis and modulates metabolic changes during seed imbibition. Indeed, this novel approach has highlighted that ABA controls the translation of more than 400 mRNAs during seed imbibition. This work provides an original perspective on the contribution of ABA and mRNA translation in seed germination and provides a valuable basis for further investigation of translational regulation in seeds and in plants.Based on existing data and those generated during this thesis, we also developed innovative seed treatments and new biomarkers for seed quality assessment. Recent funding for a maturation program dedicated to improve these biotechnologies demonstrates that our research meets the needs of seed industry

Clostridium beijerinckii DSM 6423 est une souche bactérienne atypique capable de fermenter une variété de substrats et de produire naturellement un mélange de solvants composé d’isopropanol, de butanol et d’éthanol (IBE). Malgré ce potentiel, des limitations subsistent pour son utilisation dans un procédé de synthèse d’isopropanol biosourcé. En particulier, sa faible sélectivité envers cet alcool et sa faible tolérance au mélange de solvants réduisent la quantité de produits récupérables. Ces défauts pourraient être corrigés par des modifications ciblées du génome de cette souche, mais ceci passe par le développement d’outils génétiques, jusqu’à présent inexistants pour cette bactérie, et une meilleure compréhension de son métabolisme. Dans ce contexte, une première thèse réalisée à IFPEN a permis d’établir sa carte génétique et d’isoler de premiers mutants présentant une tolérance accrue à l’isopropanol.Dans la continuité de ces premiers résultats, les travaux de thèse présentés dans ce manuscrit se sont d’abord attachés à développer des outils de génétique ciblée performants. L’utilisation de plasmides Dam- Dcm- a permis pour la première fois de transformer ce microorganisme avec succès, ouvrant la voie au développement d’un outil basé sur la technologie CRISPR-Cas9, qui révolutionne l’ingénierie génétique en modifiant les génomes de manière itérative et sans laisser de trace. Comme preuve de concept, les 2 gènes CIBE_0562 (upp) et CIBE_3859 (catB) ont été inactivés. Cette deuxième modification a rendu ce micro-organisme sensible au thiamphénicol et compatible avec un système CRISPR à deux plasmides développé précédemment à IFPEN pour modifier le génome d’une souche solvantogène de référence, Clostridium acetobutylicum. Après suppression du plasmide endogène pNF2, les efficacités de transformation de la souche ont été drastiquement accrues, nous permettant ainsi d’obtenir une souche plateforme ∆catB ∆pNF2 qui pourra constituer le point de départ de la construction d’une souche performante pour la production d’isopropanol.Parallèlement au développement de ces outils génétiques, ma thèse s’est également consacrée à la caractérisation du microorganisme par plusieurs approches. La première a consisté à déterminer l’impact de différents substrats, modèles ou industriels, sur les performances et le métabolisme de la souche. Après sélection de trois substrats (glucose, saccharose, mélasse de betterave), un procédé de fermentation continue a été mis au point pour isoler les deux états physiologiques caractéristiques d’une fermentation IBE, puis couplé à une analyse multi-omiques. Les résultats préliminaires, s’appuyant sur les données obtenues par protéomique, soulignent l’impact très important de l’utilisation de substrats industriels sur la croissance.Deuxièmement, une approche transcriptomique, le Capp-Switch sequencing, a été employée pour cartographier, à l’échelle du génome, l’ensemble des sites d’initiation de la transcription (TSS) pour la souche DSM 6423 et deux autres souches solvantogènes de référence. Une analyse comparative des TSS a notamment révélé une régulation différentielle de l’opéron de synthèse du butyryl-CoA entre les espèces C. beijerinckii et C. acetobutylicum.Bien que non prévu au début de ce travail, le séquençage d’un mutant obtenu lors de travaux précédents et incapable de produire de l’isopropanol (souche AA), puis la reconstruction de son phénotype dans une souche modèle de C. beijerinckii, a par ailleurs révélé le rôle fondamental du facteur σ54 pour le contrôle des voies de synthèse des solvants et d’assimilation de sucres alternatifs.En conclusion, en approfondissant nos connaissances sur C. beijerinckii DSM 6423 et en permettant des modifications ciblées de son génome, ma thèse s’inscrit dans un ensemble de travaux menés à IFPEN visant à faire de cette souche un organisme modèle pour la fermentation IBE, permettant à terme la bioproduction d’isopropanol à échelle industrielle
Clostridium beijerinckii DSM 6423 is an atypical bacterial strain which can ferment a wide array of substrates and naturally produce a solvent mixture composed of isopropanol, butanol and ethanol (IBE). Despite its potential, the prospect of using this microorganism for a biobased isopropanol synthesis process remains limited. In particular, its poor selectivity to this alcohol and its weak tolerance to the solvent mixture reduce isopropanol recoverability, although these drawbacks might be alleviated by targeted genome editing approaches. For this matter, developing genetic tools, that were until this work inexistent for this bacterium, and increasing our knowledge of its metabolism are important steps. In this context, a first IFPEN thesis did the ground work by drawing its genetic map and isolating isopropanol-tolerant mutants.Based on this context, my thesis first aimed at developing efficient targeted genetic tools for this relevant strain. Use of Dam- Dcm- plasmids permitted for the first time the successful transformation of this microorganism, enabling the development of a reusable, scarless, genome editing tool based on the CRISPR-Cas9 technology. As a proof of concept, the 2 genes CIBE_0562 (upp) and CIBE_3859 (catB) were inactivated. This second modification made the strain sensitive to thiamphenicol and allowed the use of a dual-plasmid CRISPR system that had previously been engineered in IFPEN to modify the genome of a reference solventogenic species: Clostridium acetobutylicum. After the deletion of the pNF2 endogenous plasmid, transformation efficiencies were drastically increased, resulting in a ∆catB ∆pNF2 platform strain that may be used in the future to construct an efficient strain for isopropanol production.In addition to the development of these genetic tools, my thesis also aimed at characterizing the microorganism by different approaches. Firstly, we studied the impact of several model or industrial carbon sources on the strain performances and on its metabolism. Focusing on three substrates (glucose, sucrose, beetroot molasse), a continuous fermentation process was next designed to isolate the two IBE-characteristic physiological states and coupled to a multi-omic analysis. Proteomics preliminary results highlight the severe impacts of industrial substrates on growth.Secondly, the Capp-Switch sequencing transcriptomic approach was used to map transcription start sites (TSS) at the genome scale for the DSM 6423 strain and two other reference solventogenic strains. A comparative TSS analysis notably revealed a differential regulation of the butyryl-CoA synthesis operon between the C. beijerinckii and C. acetobutylicum species.Although initially not planned at the beginning of this work, the sequencing of the AA strain, one of the mutants that were obtained in the first thesis and that is unable to produce isopropanol, as well as a targeted genome approach reproducing its phenotype in a C. beijerinckii model strain, also revealed the crucial role of σ54 in controlling solvent synthesis and alternative sugar uptake pathways.To conclude, by deepening our knowledge on C. beijerinckii DSM 6423 and by allowing targeted genome editing approaches, my thesis is involved in a series of work conducted at IFPEN that aim at making this strain an IBE fermentation model organism, in order to use it for the bioproduction of isopropanol at the industrial scale