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Auswahl der wissenschaftlichen Literatur zum Thema „Système CRISPR-Cas9“
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Zeitschriftenartikel zum Thema "Système CRISPR-Cas9"
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Ballouhey, Océane, Marc Bartoli, and Nicolas Levy. "CRISP(R)ation musculaire." médecine/sciences 36, no. 4 (2020): 358–66. http://dx.doi.org/10.1051/medsci/2020081.
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Les dystrophies musculaires sont un ensemble de pathologies musculaires rares, caractérisées par une faiblesse et une dégénérescence progressive du muscle. Ce sont des maladies d’origine génétique causées par la mutation d’un ou de plusieurs gènes impliqués dans les fonctions musculaires. Malgré des progrès significatifs réalisés dans le champ des biothérapies au cours des dernières années, il n’existe pas, à ce jour, de traitement curatif disponible pour ces pathologies. Les études menées depuis la découverte de l’outil d’édition génomique CRISPR-Cas9 ont néanmoins permis des avancées significatives et prometteuses dans le traitement des dystrophies musculaires. Le système CRISPR-Cas9 permet une édition stable et permanente du génome et doit permettre d’éviter les traitements longs et répétitifs. Dans cette revue, nous aborderons les dernières avancées thérapeutiques utilisant le système CRISPR-Cas9 dans le cadre des dystrophies musculaires d’origine génétique.
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Croteau, Félix R., Geneviève M. Rousseau, and Sylvain Moineau. "Le système CRISPR-Cas." médecine/sciences 34, no. 10 (2018): 813–19. http://dx.doi.org/10.1051/medsci/2018215.
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CRISPR-Cas est un système immunitaire adaptatif utilisé par de nombreux microbes pour se défendre contre l’invasion d’acides nucléiques tels que les génomes viraux et autres éléments génétiques mobiles. Le système microbien utilise son locus CRISPR pour stocker de l’information génétique afin de produire des ARN guides. Ces derniers, de concert avec des endonucléases (Cas), empêchent des invasions futures. Des parties de ce système microbien ont été exploitées pour développer un puissant outil d’édition des génomes dans une panoplie d’organismes. La capacité de CRISPR-Cas9 à couper efficacement et à des endroits très précis de l’ADN pourrait peut-être permettre un jour de guérir certaines maladies génétiques humaines. La malléabilité de cet outil d’édition rend possible une variété d’applications allant de la modulation de l’expression de gènes à des modifications épigénétiques. Les locus CRISPR représentent également une mine d’informations pouvant servir de méthode de typage de souches microbiennes ou encore une façon d’étudier les interactions entre les bactéries et leurs habitats.
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Cohen, O., P. Maru, Q. Liang, and J. Saeij. "Toxoplasma : Identification d'une protéine impliquée dans l'échappement immunitaire grâce au système CRISPR/Cas9." Médecine et Maladies Infectieuses Formation 3, no. 2 (2024): S107. http://dx.doi.org/10.1016/j.mmifmc.2024.04.316.
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Brusson, Megane, та Annarita Miccio. "Une approche CRISPR/Cas pour traiter les β-hémoglobinopathies". médecine/sciences 41, № 1 (2025): 33–39. https://doi.org/10.1051/medsci/2024191.
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Les β-hémoglobinopathies sont des anémies génétiques graves dues à des mutations affectant l’hémoglobine adulte. Pour y remédier, le système CRISPR/Cas9 a été utilisé pour modifier génétiquement les cellules souches/progénitrices hématopoïétiques des patients ex vivo, et réactiver l’expression de l’hémoglobine fœtale dans la lignée érythroïde. Plus de 70 patients atteints de β-thalassémie ou de drépanocytose ont reçu la thérapie Casgevy®. La plupart de ces patients ont présenté une amélioration notable de leur phénotype clinique, avec une grande efficacité d’édition et des taux d’hémoglobine normaux ou presque. Bien que la sécurité et l’efficacité à long terme doivent encore être évaluées, des stratégies sont en développement pour améliorer les résultats, réduire la génotoxicité potentielle et diminuer les coûts.
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Dekeyzer, Blanche, Marie Hoareau, and Gabriel Laghlali. "Utiliser le système CRISPR/Cas9 SAM (synergic activation mediator) pour identifier des facteurs de restriction antiviraux par criblage génomique." médecine/sciences 34, no. 5 (2018): 401–3. http://dx.doi.org/10.1051/medsci/20183405010.
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Chaudhry, Ahsen Tahir, and Daud Akhtar. "Gene Therapy and Modification as a Therapeutic Strategy for Cancer." University of Ottawa Journal of Medicine 6, no. 1 (2016): 44–48. http://dx.doi.org/10.18192/uojm.v6i1.1564.
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Gene therapy is an exciting new field of personalized medicine, allowing for medical procedures that can target diseases such as cancer in novel ways. Technologies that involve gene transfer treatments allow for the insertion of foreign DNA into tumour cells, resulting in restored protein expression or altered function. Gene therapy can also be used as a form of immunotherapy, either by modifying cancer cells to make them better targeted by the immune system, or by modifying the body’s immune cells to make them more aggressive towards tumours. Additionally, oncolytic virotherapy uses classes of genetically modified viruses that can specifically target and interfere with tumour cells. The ongoing development of the CRISPR/Cas9 gene editing tool may also have promise in future therapeutic applications, with the tool being capable of removing cancer-causing, latent viral infections, such as HPV, from afflicted cells. Nonetheless, there are still many questions of safety, efficacy, and commercial viability which remain to be resolved with many gene therapy procedures. There is also emerging controversy over the ethical, legal, and moral implications that modifying the genetic content of human beings will have on society. These concerns must be confronted and addressed if the benefits promised by gene therapy are to be properly realized. La thérapie génétique est un nouveau domaine d’étude médicale personnalisée qui permet de cibler des maladies spécifiques comme le cancer de façon innovatrice. Cette thérapie utilise le transfert de gènes avec une insertion d’ADN étrangère dans les cellules cancéreuses dans le but de restaurer l’expression des protéines et de retrouver la fonction cellulaire. La thérapie génétique peut aussi être utilisée comme une forme d’immunothérapie, soit en modifiant les cellules cancéreuses pour qu’elles soient mieux ciblées par le système immunitaire ou en modifiant les cellules immunitaires du corps pour les rendre plus agressives envers les tumeurs. De plus, une virothérapie oncolytique utilise des virus génétiquement modifiés qui peuvent cibler spécifiquement et interférer avec des cellules cancéreuses. Le développement du système d’édition génétique CRISPR/Cas9 s’avère prometteur pour les applications thérapeutiques futures. Cet outil est capable d’enlever les infections virales latentes dans les cellules affectées qui peuvent causer le cancer, tel que l’HPV. Malgré ces découvertes, plusieurs questions importantes demeurent quant à la sécurité et à l’efficacité de leur application. Il s’agit d’un domaine controversé avec des implications éthiques, légales, et morales, car le tout implique une modification du contenu génétique humain. Ces inquiétudes doivent être adressées afin de pouvoir continuer à explorer les bienfaits de cette thérapie génétique. En poursuivant la recherche dans ce domaine, il serait possible de valider cette thérapie et optimiser ses bienfaits.
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Reboud-Ravaux, Michèle. "Dégradation induite des protéines par des molécules PROTAC et stratégies apparentées : développements à visée thérapeutique." Biologie Aujourd’hui 215, no. 1-2 (2021): 25–43. http://dx.doi.org/10.1051/jbio/2021007.
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Alors que, pour la plupart, les médicaments actuels sont de petites molécules inhibant l’action d’une protéine en bloquant un site d’interaction, la dégradation ciblée des protéines, découverte il y a une vingtaine d’années via les petites molécules PROTAC, connaît aujourd’hui un très grand développement, aussi bien au niveau universitaire qu’industriel. Cette dégradation ciblée permet de contrôler la concentration intracellulaire d’une protéine spécifique comme peuvent le faire les techniques basées sur les acides nucléiques (oligonucléotides antisens, ARNsi, CRISPR-Cas9). Les molécules PROTAC sont des chimères hétéro-bifonctionnelles capables de lier simultanément une protéine spécifique devant être dégradée et une E3 ubiquitine ligase. Les PROTAC sont donc capables de provoquer l’ubiquitinylation de la protéine ciblée et sa dégradation par le protéasome 26S. De nature peptidique, puis non peptidique, les PROTAC sont maintenant administrables par voie orale. Ce détournement du système ubiquitine protéasome permet aux molécules PROTAC d’élargir considérablement le champ des applications thérapeutiques puisque l’élimination de protéines dépourvues de poches ou de crevasses bien définies, dites difficiles à cibler, devient possible. Cette technologie versatile a conduit à la dégradation d’une grande variété de protéines comme des facteurs de transcription, des sérine/thréonine/tyrosine kinases, des protéines de structure, des protéines cytosoliques, des lecteurs épigénétiques. Certaines ligases telles que VHL, MDM2, cereblon et IAP sont couramment utilisées pour être recrutées par les PROTAC. Actuellement, le nombre de ligases pouvant être utilisées ainsi que la nature des protéines dégradées sont en constante augmentation. Deux PROTAC sont en étude clinique pour les cancers du sein (ARV471) et de la prostate (ARV110). La dégradation spécifique d’une protéine par le protéasome peut aussi être induite par d’autres types de molécules synthétiques : colles moléculaires, marqueurs hydrophobes, HaloPROTAC, homo-PROTAC. D’autres constituants cellulaires sont aussi éligibles à une dégradation induite : ARN-PROTAC pour les protéines se liant à l’ARN et RIBOTAC pour la dégradation de l’ARN lui-même comme celui du SARS-CoV-2. Des dégradations induites en dehors du protéasome sont aussi connues : LYTAC, pour des chimères détournant la dégradation de protéines extracellulaires vers les lysosomes, et MADTAC, pour des chimères détournant la dégradation par macroautophagie. Plusieurs techniques, en particulier des plates-formes de criblage, la modélisation mathématique et la conception computationnelle sont utilisées pour le développement de nouveaux PROTAC efficaces.
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Kang Yue, 康玥, 廖雪瑶 Liao Xueyao, 谭向宇 Tan Xiangyu, 郭萍 Guo Ping та 田训 Tian Xun. "CRISPR/Cas9系统活细胞成像技术进展（特邀）". Infrared and Laser Engineering 51, № 11 (2022): 20220597. http://dx.doi.org/10.3788/irla20220597.
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Kwon, Deok-Ho, Joong-Hee Park, Deok Yeol Jeong, et al. "Application of Genome Editing Method on Kluyveromyces marxianus 17694-DH2 using CRISPR-Cas9 System for Enhanced Xylose Utilization." KSBB Journal 34, no. 4 (2019): 243–47. http://dx.doi.org/10.7841/ksbbj.2019.34.4.243.
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Klein, Nathalie, Selina Rust, and Lennart Randau. "CRISPR-Cas-Systeme der Klasse 1: Genome Engineering und Silencing." BIOspektrum 28, no. 4 (2022): 370–73. http://dx.doi.org/10.1007/s12268-022-1775-9.
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AbstractClass 1 CRISPR-Cas systems are prevalent among prokaryotes and are characterized by effector complexes that consist of multiple Cas protein subunits. Type I systems recruit the DNA nuclease Cas3 for target DNA degradation. Type IV systems exhibit CRISPR interference in the absence of DNA cleavage. These mechanisms allow for versatile genome engineering and silencing approaches. Here, we indicate advantages and drawbacks in comparison to more commonly employed Cas9-based tools.
Dissertationen zum Thema "Système CRISPR-Cas9"
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Parrot, Camila. "Création d'un système rapporteur pour l'étude de mutations de p53." Thesis, Bordeaux, 2016. http://www.theses.fr/2016BORD0198.
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Le cancer est responsable de plus de 15% des décès. L’activation d’oncogènes et l’inactivation de gènes suppresseurs de tumeur contribuent à la transformation des cellules. Dans 50% des cas de cancers le gène TP53 est muté. C’est pourquoi comprendre les conséquences de ces mutations est indispensable pour développer des tests permettant de cibler p53 dans le cadre de thérapies. Dans cette étude nous avons utilisé la nouvelle technique de modification de génomes, CRISPR-Cas9. Cette technique a été utilisée dans le but d’introduire des mutations spécifiques de TP53 dans le génome de fibroblastes non tumoraux. Nous avons alors analysé les effets de ces mutations au niveau transcriptionnel et protéomique. Ces analyses aideront à identifier les effets spécifiques de chaque mutation de p53. Ces résultats seront utilisés pour établir des lignées cellulaires permettant de cribler et d’identifier des composés capables de restaurer la fonction sauvage de p53<br>Cancer is responsible for more than 15% of human deaths. Activation of oncogenes and inactivation of tumor suppressor genes contribute to malignant transformation of cells. Mutations of the tumor suppressor gene TP53 are observed in about 50% of human cancers. Therefore, it is of high interest to understand functional consequences of TP53 mutations in order to develop biological tests that allow targeting mutant p53 for oncotherapy. In this study we use CRISPR-Cas9, the latest genome editing technique, for introducing specific TP53 mutations into the genome of a non-tumoral fibroblast cell line. We analyze the effects of p53 mutations at the transcriptomic and proteomic level. These analyses will help identifying gene- and pathway-specific effects of distinct p53 mutations. These results will be used for establishing cell lines that allow high throughput screening, in order to discover new chemical compounds that are able to restore crucial functions of mutant p53 proteins
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Prat, Florence. "Les solutions pour prévenir de la génotoxicité du système CRISPR-Cas9." Thesis, Bordeaux, 2020. http://www.theses.fr/2020BORD0322.
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Le système CRISPR-Cas9 a révolutionné le monde de la génétique. Il est aujourd’hui utilisé dans de nombreux domaines de recherches comme la médecine, l’agronomie, l’environnement etc. Il commence également à être utilisé en clinique. Cependant, depuis quelques années, de plus en plus d’études soulignent les risques génotoxiques de la nucléase Cas9. Alors que les premières études s’intéressaient au manque de spécificité et aux risques hors cibles du système et que des solutions ont été apportées, les nouvelles constatations pointent du doigt les risques de génotoxicité au locus ciblé. En effet, des risques d’apparition d’insertions/délétions non voulue au locus lors d’expériences d’HDR, d’inversion de séquences, de larges délétions chromosomiques terminales ont été décrits. Le travail de thèse présenté ici a pour but de trouver des solutions contre ces évènements génotoxiques au locus ciblé. Dans un premier temps, nous avons développé des solutions dans les lignées cellulaires, et les cellules souches hématopoïétiques en développant le système nickase, puis nous nous sommes intéressés aux cellules humaines pluripotentes induites avec l’utilisation d’un guide allèle-spécifique. Enfin, nous avons mis au point un système sensible de détection des risques génotoxiques dans des cellules diploïdes immortalisées afin de mieux les caractériser. Bien que très efficace, CRISPR-Cas9 nucléase reste un outil à optimiser. Des contrôles qualités doivent être mis en place pour une utilisation correcte de ce nouvel outil révolutionnaire pour la biologie et ses limites doivent être connues pour mieux les maitriser<br>CRISPR-Cas9 system has revolutionized genetic world. Nowadays, it is used in various research domains as medicine, agronomy, environment… It is also involved in clinic. However, for a few years, more and more studies have underlined the Cas9 genotoxicity risks. As the first studies focused on the system lack of specificity and on its off-target risks, solutions were brought. Now, new ascertainments emphasize the on-target genotoxic risks. Indeed, non-desired insertions / deletions at the locus in HDR experiments, sequence inversions, large chromosomic truncations were described. The thesis work presented here, aims at finding solutions against these on-target genotoxic risks. In a first time, we have developed solutions in cell lines and hematopoietic stem cells with the nickase system development, and then we have focused on human induced pluripotent stem cells with the use of an allele-specific guide. Finally, we have worked out in sensitive detection genotoxic risks system in immortalized diploid cells to characterized them better. Quality controls must be set up to a correct use of this new biologic revolutionary tool and its limits must be known to controlled them better
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Sollelis, Lauriane. "Dynamique de la réplication de l’ADN et complexe pré-réplicatif chez Leishmania sp.. : apport du système CRISPR/Cas9." Thesis, Montpellier, 2016. http://www.theses.fr/2016MONTT062/document.
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Leishmania est un parasite eucaryote divergent responsable d’un large spectre de maladies à travers le monde. Ce parasite est caractérisé par une aneuploïdie mosaïque, constitutive, c’est-à-dire qu’au sein d’une population chaque cellule comporte une combinaison unique de mono-, di- et trisomies de chacun de ses 36 chromosomes. L’aneuploïdie mosaïque est générée et maintenue chez les générations suivantes grâce à un taux élevé de répartition asymétrique des chromosomes lors de la mitose, entrainant le gain ou la perte de chromosomes entiers. Ceci implique une régulation non-conventionnelle de la réplication, suivie d’une ségrégation permissive des chromosomes.L’objectif général de cette étude était de comprendre la dynamique de la réplication de l’ADN ainsi que de cartographier les sites d’initiation de la réplication chez Leishmania, en utilisant la technique du peignage moléculaire d’une part et celle du ChIP-seq d’une autre part. Nous avons ainsi pu caractériser les différents paramètres de progression de la fourche de réplication. Un des résultats majeurs qui ressort de cette étude est que Leishmania possède les plus grandes distances inter-origines et la plus grande vitesse de réplication parmi les autres eucaryotes déjà étudiés. Nous avons également pu estimer que le génome de Leishmania possède environ 168 origines de réplication. Afin d’étudier les acteurs impliqués dans la réplication de l’ADN chez Leishmania, nous avons développé l’outil génétique CRISPR/Cas9. Pour développer cet outil, nous avons basé notre approche sur une stratégie à deux vecteurs : l’un permet l’expression du single guide (sg)RNA et l’autre celle de l’endonucléase Cas9. La validation de cet outil génétique a été réalisée par le knock-out du locus PFR2 codant une protéine flagellaire. Dans un second temps, nous avons fait évoluer le CRISPR/Cas9 vers un système inductible pour réaliser les knock-out et des étiquetages au locus endogène de protéines d’intérêt. Nous avons utilisé ce nouveau système pour étudier la fonction de deux protéines potentiellement impliquées dans le complexe de reconnaissance des origines de réplication. Malgré une fuite du système, nous avons pu réaliser le KO des gènes Orc1b et Orc1/Cdc6 et suivre la progression du cycle cellulaire. Nous avons pu constater que la perte de ces gènes conduisait à un défaut de croissance ainsi qu’à l’apparition de cellules sans noyau. L’insertion d’une étiquette au locus endogène d’Orc1b nous a parmi de confirmer la localisation que nous avions obtenue avec une construction épisomale et va permettre d’étudier plus précisément le rôle de cette protéine.En conclusion, nous avons mis en évidence des paramètres de réplication originaux et démontré, en utilisant le CRISPR/Cas9, que les protéines Orc1b et Ocr1/Cdc6 étaient impliquées dans la duplication du noyau de Leishmania, ce qui est en accord avec leur rôle putatif dans la réplication de l’ADN<br>Leishmania, a protozoan parasite which causes a large range of diseases worldwide, is characterized by a constitutive 'mosaic aneuploidy', i.e. each cell in a population possesses a unique combination of mono-, di- and trisomies for each of its 36 heterologous chromosomes. Mosaic aneuploidy is generated and maintained via high rates of asymmetric chromosomal allotments during mitosis, leading to the gain or loss of whole chromosomes. This implies an unconventional regulation of the replication, followed by a permissive segregation.The main objective of this study was to unravel DNA replication dynamics and to map the replication initiation sites in Leishmania using DNA combing and ChIP-seq analyses. First, we have characterized DNA replication fork parameters. One of the major findings of this study was that Leishmania exhibits the fastest replication speed and the largest interorigin distances among the eukaryotes tested so far. We have also estimated that the Leishmania major genome possesses 168 origins of replication.To study the actors involved in DNA replication, we first had to develop novel genetic tools. The CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats and CRISPR associated endonuclease 9) system is a recently discovered powerful technique for genome editing. In order to adapt this system to Leishmania, we have chosen a two-plasmid strategy: one for the expression of the single guide (sg) RNA and a second for the expression of the endonuclease CAS9. The proof of concept has been based on the disruption of the paraflagellar rod-2 (PFR2) loci by the CRISPR-Cas9 system. In a second attempt, we have developed an inducible CRISPR-Cas9 system, both to obtain knock outs and to perform marker-free endogenous gene tagging. We used the system to investigate the function of Origin Recognition Complex proteins. Although the system was leaky, the genome was edited as expected. We thus deleted Orc1b and Orc1/Cdc6 and monitored the cell cycle progression of the parasite. We found that the depletion of these nuclear proteins lead to a growth defect and to the appearance of zoids (anucleated cells). The endogenous tagging of Orc1b confirmed the localization previously obtained using an episomal expression vector, and will allow further investigation on the role of this protein.In total, we have shown the presence of original replication dynamics parameters in Leishmania, and using CRISPR Cas9, we have demonstrated that Orc1b and Orc1/Cdc6 are involved in the nuclear duplication of Leishmania, in agreement with their putative in DNA replication
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Renaud, Ariane. "L'utilisation du système CRISPR-Cas9 pour l'étude des protéines non structurales du bactériophage 2972 infectant Streptococcus thermophilus." Master's thesis, Université Laval, 2019. http://hdl.handle.net/20.500.11794/67934.
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Les bactériophages sont des maîtres manipulateurs, prenant le contrôle complet d'une cellule bactérienne, contournant les systèmes de défense et détournant la machinerie de transcription et de traduction du génome bactérien pour la réplication virale. Les grandes étapes de la multiplication des phages sont connues, pourtant les mécanismes intrinsèques de cette prise de contrôle restent un mystère bien préservé. Malgré la petite taille et la simplicité relative des génomes de phages, seuls les gènes associés à la structure des virions sont amplement caractérisés. Toutefois, les protéines non structurales qui sont susceptibles d'être responsables de la prise de contrôle sont rarement étudiées. C'est effectivement le cas pour le phage modèle 2972, infectant la souche Streptococcus thermophilus DGCC7710 largement utilisée en industrie laitière. Son génome code pour 44 protéines putatives, dont 14 protéines sont classées comme étant non structurales et dont aucune fonction n'est encore associée. Lors de ce projet de maîtrise, le système CRISPR-Cas de type II-A, naturellement présent chez S. thermophilus, a été utilisé à des fins d'édition du génome de ce phage pour étudier le rôle des protéines non structurales. Ce système est idéal pour les manipulations génétiques des phages virulents généralement complexes à modifier. Ainsi, une connaissance approfondie des interactions entre le phage et son hôte sera un outil indispensable pour développer de meilleures méthodes de contrôle des phages en industrie laitière.<br>Bacterial viruses are master manipulators of bacterial cells. They are able to take complete control of a bacterium, bypassing bacterial immune systems, hijacking core transcription and translation machinery, and typically resulting in lysis of the host. Although the major steps of phage replication are well understood, very little is known about the mechanisms of the host-cell takeover. Despite phages having relatively small and 'simple' genomes, generally only the structural proteins have been well characterized. In contrast, non-structural proteins, which include those involved in host cell takeover, tend to be completely uncharacterized. This is certainly the case for the model of Streptococcus thermophilus phages, 2972, which infects the strain DGCC7710 widely used by the dairy industry. Its genome encodes for 44 putative proteins, 14 of which are non-structural and have no known function. In this master thesis, the type II-A CRISPR-Cas system naturally present in S. thermophilus was used for genome engineering purposes to investigate the role of non-structural proteins of phage 2972. This natural bacterial immune system provides an ideal means for genetic manipulation of virulent phages, which are otherwise intractable. This could lead to potentially valuable discoveries allowing us to further fine-tune the bacteria used in various biological processes.
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Di, Donato Vincenzo. "Axonal target specificity in the CRISPR/Cas9 era : a new role for Reelin in vertebrate visual sytem development." Thesis, Paris 6, 2016. http://www.theses.fr/2016PA066409/document.
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Les connexions neuronales du système visuel forment des synapses spatialement distribuées en couches discrètes. Comprendre la base du ciblage spécifique axonale est critique pour déchiffrer la formation des réseaux neuronaux complexes. Dans une première étude, nous avons investigué le rôle de la protéine de la matrice extracellulaire Reelin dans la formation in vivo du circuit rétinotectal chez le poisson zèbre. Ce circuit se compose de cellules ganglionnaires de la rétine (CGRs) transmettant l’information visuelle au cerveau via la projection de leur axone dans les différentes couches du tectum optique. Nous avons démontré que la Reelin secrétée par de neurones inhibiteurs localisés dans les couches supérieures du tectum optique forme un gradient. L’induction de mutations délétères dans la voie de signalisation canonicale de la Reelin à l’aide d’outils génétiques a conduit à des défauts de ciblage des axones de CGRs. Nos résultats démontrent un nouveau rôle de la Reelin lors du développement du système visuel et la décrivent comme signature moléculaire nécessaire au ciblage et au positionnement précis des axones de CGRs.Dans une seconde étude, nous avons utilisé la technique CRISPR/Cas9 pour développer une nouvelle approche de mutagénèse conditionnelle chez le poisson zèbre. Nos résultats démontrent que la perturbation de gènes dans des tissues spécifiques peut être effectué par l’induction de l’expression de la protéine Cas9 via le système Gal4/UAS. Nous avons établis un outil pour induire l’apparition de mutations délétères dans des clones de cellules mais aussi dans des cellules individuelles, tous pouvant être suivit distinctement grâce à un marquage génétique<br>Neuronal connections in the visual system are arranged in synaptic laminae. Understanding the basis of lamina-specific axonal targeting is critical to gain deeper insights on how complex neural networks form. In a first study we investigated the role of the ECM protein Reelin during zebrafish retinotectal circuit formation in vivo. Here retinal ganglion cells (RGCs) convey the visual information to the brain by projecting their axons to different layers of the optic tectum. We demonstrated that Reelin secreted by a specific class of tectal superficial inhibitory neurons is spatially distributed in a superficial-to-deep gradient within the tectal neuropil. Induced gene disruption for all the components of the canonical Reelin pathway expressed in the retinotectal system resulted in aberrant layering of RGC axons suggesting a role for Reelin pathway in axonal sublaminar segregation. Altogether our findings elucidate a new role for Reelin in vertebrate visual system development, during which it acts as molecular cue by imparting positional information for ingrowing RGCs.In a second study we took advantage of the CRISPR/Cas9 technology to develop a novel approach for conditional mutagenesis in zebrafish. Our results provide evidence that tissue-specific gene disruption can be achieved by driving Cas9 expression with the Gal4/UAS system. We established a tool to induce loss-of-function mutations in cell clones or single cells that can be followed by genetic labeling, enabling their phenotypic analysis. Our technique has the potential to be applied to a wide-range of model organisms, allowing systematic mutagenesis and labeling on a genome-wide scale
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Hekking, Rebecca. "Identification du rôle des vésicules extracellulaires d’origine astrocytaire au cours de la transmission synaptique et de la plasticité synaptique à long terme." Electronic Thesis or Diss., Bordeaux, 2024. http://www.theses.fr/2024BORD0454.
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Le fonctionnement du cerveau repose sur le transfert d’informations de neurone en neurone au niveau de la synapse. Ce transfert d’informations n’est pas immuable et une synapse peut être potentialisée ou inhibée. Des travaux réalisés ces 20 dernières années ont notamment identifié les astrocytes, un autre type de cellules présentes dans le cerveau, comme des partenaires clefs des neurones capables de réguler la transmission synaptique. Plusieurs voies de signalisation, comme la recapture des ions, des neurotransmetteurs et la sécrétion de facteurs solubles, permettent aux astrocytes d’influencer le fonctionnement des synapses. Cependant, il existe une autre voie, encore peu explorée, qui pourrait participer à la régulation de la transmission synaptique par les astrocytes : la libération de vésicules extracellulaires.Les vésicules extracellulaires (VE) sont de petites particules délimitées par une membrane et qui contiennent des molécules bioactives telles que des protéines, des acides nucléiques et des lipides. La plupart des types cellulaires produisent ces vésicules, qui leur permettent d’échanger des composants avec d’autres cellules plus ou moins distantes. Les VE sont impliquées dans de nombreux processus, comme le fonctionnement du système immunitaire ou la progression de maladies neurodégénératives. Bien que certains travaux rapportent que les astrocytes sont capables de libérer des VE, nous ne savons toujours pas si ces vésicules d’origine astrocytaire sont importantes pour les fonctions synaptiques.L’objectif de cette thèse est d’identifier si les vésicules extracellulaires libérées par les astrocytes jouent un rôle clef dans la régulation de la transmission et de la plasticité synaptique. Pour répondre à cette problématique, nous avons imaginé deux approches complémentaires.Dans un premier temps, nous avons isolé les VE sécrétées par des astrocytes in vitro afin d’en étudier les conditions de libération et le contenu. Nous avons montré d’une part qu’une stimulation avec de l’ATP induit une augmentation de la quantité de petites VE libérées par les astrocytes sur une période de 30 minutes. De plus le contenu en microARN des VE libérées est modifié par cette même stimulation à l’ATP. Une analyse bioinformatique des cibles de ces microARNs nous a permis de prédire que ce changement de contenu pourrait affecter, entre autres, les voies de signalisation régulant la transmission synaptique dans les cellules réceptrices. Ces modifications semblent être spécifiquement induites par l’ATP, car une exposition au glutamate, un neurotransmetteur excitateur, ou au GABA, un neurotransmetteur inhibiteur, ne modifient pas la quantité de petites VE libérées par les astrocytes en l’espace de 30 minutes.Dans un deuxième temps, nous avons étudié l’implication des VE d’origine astrocytaire dans la transmission synaptique in vivo. Pour cela, nous avons créé un outil permettant d’inhiber la sécrétion de petites VE par les astrocytes, chez la souris adulte. En effet, l’enzyme Cas9 est connue pour sa capacité à agir comme des ciseaux moléculaires, coupant l’ADN à des endroits soigneusement choisis afin de modifier le génome. Nous avons tiré profit de cette capacité et dirigé la Cas9 contre un gène impliqué dans la biogénèse des petites VE, afin d’invalider ce gène et donc d’inhiber la libération de ces vésicules. Ce système est mis en œuvre spécifiquement dans les astrocytes adultes grâce à une approche virale conçue sur mesure. Grâce à cet outil, nos résultats préliminaires montrent que l’inhibition de la libération de petites VE d’origine astrocytaire altère la plasticité synaptique dans l’hippocampe de souris mâles.En conclusion, nos résultats suggèrent que les petites vésicules extracellulaires libérées par les astrocytes pourraient effectivement être impliquées dans la régulation de certaines formes de plasticité synaptique, et qu’il serait intéressant d’explorer d’avantage cette voie de recherche<br>Brain function relies on the transfer of information between neurons, which occurs at a subcellular structure called the synapse. Interestingly, the efficiency of a synapse can be modified under certain conditions, potentiating or inhibiting information transfer. Over the past 20 years, astrocytes, a type of glial cells, have been identified as key neuronal partners that are able to regulate synaptic transmission. Several pathways allowing astrocytes to regulate synaptic function have already been elucidated, such as for instance ion clearance, neurotransmitter recycling or release of soluble factors. Another interesting but under-investigated pathway would be through the release of extracellular vesicles.Extracellular vesicles (EVs) are small membrane-bound particles that contain bioactive molecules such as proteins, nucleic acids, and lipids. Most cells release these vesicles which allow them to exchange cellular components with neighbouring -but also sometimes distant- cells. EVs have been linked to many biological processes, such as immune function or spreading of neurodegenerative diseases. Some studies suggest that astrocytes also release EVs, yet it is still unclear whether these astrocyte-derived vesicles are involved in synaptic functions.This thesis aims at elucidating whether astrocyte-derived extracellular vesicles play a key role in the regulation of synaptic transmission and plasticity. To address this question, we have designed two complementary studies.We first isolated astrocyte-derived EVs in vitro in order to investigate their release rate and their content. We have shown on one hand that exposing astrocyte cultures to ATP in vitro leads to an increase in the amount of small EVs released within 30 min of the stimulus. Furthermore, the microRNA content of these vesicles is altered in response to the stimulus. A bioinformatics analysis predicted that the altered EV content could eventually affect signalling pathways involved in synaptic transmission in recipient cells. These changes seem to be induced specifically by ATP, since exposure to the excitatory neurotransmitter glutamate or to the inhibitory neurotransmitter GABA did not modify the amount of small EVs released within 30 min of the stimulation.We also studied the involvement of astrocyte-derived EVs in vivo. To this end, we developed a tool that allows us to inhibit EV release from astrocytes in the adult mouse brain. Our tool uses the Cas9 enzyme, i.e. the well-known molecular scissors that can specifically cut DNA at a chosen locus in order to modify an organism’s genome. We used Cas9 to invalidate a gene involved in EV biogenesis, thereby inhibiting small EV release. We specifically implemented the Cas9 system in astrocytes using a custom-designed viral approach. Using this tool, our preliminary data suggest that inhibiting the release of small EVs from astrocytes alters a form synaptic plasticity in the hippocampus of adult male mice.To conclude, our findings suggest that small astrocyte-derived extracellular vesicles could indeed be involved in the regulation of some forms of synaptic plasticity and will hopefully encourage further studies to understand the underlying mechanisms
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Djermoun, Sarah. "Le plasmide RP4 : de son utilisation comme outil antibactérien à l’étude de sa dynamique de transfert au sein de biofilm bactérien." Electronic Thesis or Diss., Lyon 1, 2023. http://www.theses.fr/2023LYO10080.
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L’étude de la dynamique de conjugaison des plasmides conjugatifs chez les bactéries Gram-négatif est la thématique centrale de recherche de notre laboratoire et autour de laquelle s’est articulé mon projet de thèse. Mes travaux de recherche ont eu pour but d’apporter de véritables connaissances sur l’étendue et l’impact de la conjugaison dans les communautés bactériennes. Le biofilm est largement considéré par la communauté scientifique comme un hotspot favorisant le transfert de gènes principalement en raison des contacts cellulaires propices qui existent dans sa structure. Or, les seules études qui ont essayé de démontrer expérimentalement que le biofilm permet d’augmenter les transferts par conjugaison n’apportent aucunes données claires sur la dynamique de ces transferts qui ont lieu dans le biofilm et comment celui-ci impacte ces transferts. L’approche que nous avons utilisée pour étudier la dynamique de conjugaison dans le biofilm repose sur un projet collaboratif entre notre laboratoire et celui du Dr Knut Drescher, basé au Biozentrum de Bâle en Suisse. Cette collaboration a permis de déployer des techniques de microscopie à fluorescence innovantes développées par nos deux laboratoires et jusqu’ici jamais utilisées dans le contexte de l’étude de la conjugaison dans le biofilm.Nous nous sommes centrés sur le plasmide RP4 qui est un plasmide conjugatif de type IncP. Retrouvé au sein de nombreux environnements naturels, il a été le modèle plasmidique principal des études qui se sont intéressées à la conjugaison dans le biofilm, et il a été largement exploité comme outil génétique par la communauté scientifique. Malgré le fait qu’il ait été très utilisé, les mécanismes de transferts du plasmide RP4 sont très peu décrits. Le plasmide RP4 s’est donc révélé comme un modèle d’étude de la conjugaison très pertinent que nous avons utilisé à la fois dans un aspect biotechnologique pour élargir le spectre d’hôte des systèmes antibactériens TAPs et à la fois dans un aspect fondamental pour étudier sa dynamique de conjugaison, que ce soit au sein d’une population E. coli cultivées en 2D et au sein d’une population E. coli structurées en biofilm 3D.Durant mes travaux de thèse, j’ai donc exploité le plasmide RP4 pour véhiculer des systèmes CRISPR antibactériens chez diverses espèces bactériennes phylogénétiquement éloignées. J’ai apporté les premières images en temps réel du transfert du plasmide RP4 en 2D et de nouvelles données très intéressantes sur la chronologie de conversion de l’ADN en double brin dans la receveuse. Enfin, une approche totalement innovante a permis d’étudier la dynamique de conjugaison du plasmide RP4 dans le biofilm. Ces résultats constituent finalement la première étude qui décrit réellement comment la conjugaison a lieu dans le biofilm et qui va au-delà en termes de compréhension sur cette dynamique grâce à l’approche 2D que nous avions mis en place. Nous démontrons que biofilm n’est pas un hotspot pour le transfert du plasmide RP4 et que les facteurs de la matrice EPS qui compose sa structure n’empêchent pas la dissémination du plasmide. Mais qu’il s’agit plutôt du stade de développement du biofilm qui va rendre possible l’accessibilité des donneurs à l’attachement aux zones de contact avec la surface, à proximité des cellules receveuses<br>The study of conjugation dynamics of conjugative plasmids in Gram-negative bacteria is the central research theme of our laboratory and around which my thesis project was built. The aim of my research was to provide real knowledge on the extent and impact of conjugation in bacterial communities. The biofilm is widely considered by the scientific community as a hotspot for gene transfer mainly because of the favorable cell contacts that exist in its structure. However, the only studies that have attempted to demonstrate experimentally that biofilms increase gene transfer by conjugation do not provide clear data on the dynamics of these transfers that take place in the biofilm and how the biofilm impacts these transfers. The approach we used to study the dynamics of conjugation in biofilm is based on a collaborative project between our laboratory and that of Dr. Knut Drescher, based at the Biozentrum in Basel, Switzerland. This collaboration allowed us to deploy innovative fluorescence microscopy techniques developed by our two laboratories and never used before in the context of the study of conjugation in biofilm.We focused on the RP4 plasmid which is an IncP conjugative plasmid. Found within many natural environments, it has been the primary plasmid model for studies that have focused on conjugation in the biofilm, and has been widely exploited as a genetic tool by the scientific community. Despite the fact that it has been widely used, the transfer mechanisms of the RP4 plasmid are very poorly described. The RP4 plasmid has thus proven to be a very relevant model for studying conjugation that we have used both in a biotechnological aspect to broaden the host spectrum of antibacterial TAPs systems and in a fundamental aspect to study its conjugation dynamics, both within a 2D cultured E. coli population and within a 3D biofilm structured E. coli population.During my thesis work, I therefore exploited the RP4 plasmid to carry antibacterial CRISPR systems in various phylogenetically distant bacterial species. I provided the first real-time images of the RP4 plasmid transfer in 2D and very interesting new data on the timing of DNA double-strand conversion in the recipient. Finally, a totally innovative approach allowed to study the conjugation dynamics of the RP4 plasmid in the biofilm. These results finally constitute the first study that really describes how conjugation takes place in the biofilm and that goes beyond in terms of understanding this dynamic thanks to the 2D approach that we had set up. We demonstrate that biofilm is not a hotspot for the transfer of the RP4 plasmid and that the factors of the EPS matrix that compose its structure do not prevent the dissemination of the plasmid. Rather, it is the stage of biofilm development that makes it possible for the donors to attach to the surface contact areas near the recipient cells
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Guyon, Antoine. "Insertion d’une mutation protectrice pour la maladie d’Alzheimer dans le gène de la protéine précurseur de l’amyloïde via le système CRISPR/Cas9." Doctoral thesis, Université Laval, 2021. http://hdl.handle.net/20.500.11794/68776.
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La maladie d’Alzheimer est la plus commune des formes de démence qui touche presque cinquante millions de personnes dans le monde. Les symptômes les plus fréquents sont la perte de mémoire, la difficulté à planifier des tâches et des confusions temporelles et spatiales. Il n’existe à ce jour aucun traitement pour cette maladie. La protéine précurseur de l’amyloïde (APP) est habituellement coupée par l’enzyme alpha-sécrétase, cependant une coupure anormale par la bêta-sécrétase conduit à la formation de peptides bêta-amyloïdes, qui forment des agrégats s’accumulant sous forme de plaques dans le cerveau des patients Alzheimer. De nombreuses mutations du gène APP sont à l’origine de changements dans la séquence d’acides aminés de la protéine, responsable d’une accumulation accrue de plaques. Ces mutations sont appelées formes familiales de la maladie d’Alzheimer ou FAD (Familial Alzheimer’s disease). Cependant il a été découvert qu’une forme de FAD d’APP (mutation islandaise A673T) présente dans une population d’Europe nordique, différant d’une seule paire de bases du gène normal dans l’exon 16, modifiant une alanine de la protéine en thréonine qui réduit de 40% sa coupure par la bêta-sécrétase. La découverte de la technologie CRISPR/Cas9 ouvre de nouvelles perspectives pour le développement de traitements préventifs ou curatifs des maladies génétiques et dans notre cas Alzheimer. L’endonucléase Cas9 peut couper l’ADN double brin du génome en étant guidée par un ARNg et en reconnaissant une séquence cible « protospacer » suivie d’un PAM (protospacer adjacent motif). Depuis 2016, une optimisation du système CRISPR appelée édition de base permet maintenant de modifier de façon très précise la base cytidine enthymine et les guanines en adénines sur le brin opposé de l’ADN. Le premier article de cette thèse vise à démontrer que l’ajout de la forme FAD A673Ten codominance avec une autre forme pathologique provoque ou non des répercussions bénéfiques sur la sécrétion de peptides amyloïde-beta. Les expériences ont été réalisées avec des plasmides, permettant de visualiser un effet maximum de la mutation A673T. Il était important de déterminer si cette mutation était protectrice en codominance pour assurer une approche thérapeutique la plus polyvalente possible. Nous avons confirmé cet effet bénéfique sur une majorité de formes FAD et en particulier sur la mutation London V717I.Le deuxième article de cette thèse traite de l’introduction de la mutation A673T par un système dérivé de CRISPR/Cas9, l’édition de base. Plusieurs modèles d’éditeurs de base ont été comparés et optimisés dans le but d’obtenir une modification du génome aussi efficace et précise que possible. Un candidat a été sélectionné après des tests sur cellules modèles HEK 293T et neuroblastomes SH-SY5Y.La troisième partie de ce manuscrit présente les résultats obtenus lors de l’insertion de cet éditeur de base dans des vecteurs viraux dans le but d’infecter des modèles de neurones humains et murins présentant des formes FAD. L’ensemble de cette démarche a permis d’ouvrir une nouvelle avenue à une potentielle thérapie pour la maladie d’Alzheimer.<br>Alzheimer’s disease (AD) is the most common form of dementia in the world, withnearly fifty million people affected currently. The most common symptoms of this diseaseare memory loss, difficulties in task management, and temporal and spatial confusions. There is currently no treatment for this disease. The amyloid precursor protein (APP) is usually cut by the alpha-secretase enzyme; however, abnormal cleavage by the beta-site APP cleaving enzyme 1 (BACE1) leads to the formation of beta-amyloid peptides. These peptides in turn forms aggregates, which accumulate as plaques in the brains of Alzheimer patients. Many non-silent APP mutationscause changes to the amino acid composition of the protein and result in increased plaque accumulation. These mutations are called familial forms of Alzheimer’s disease (FAD).However, one of these mutations (Icelandic A673T mutation) has been shown to confer aprotection against the on set and development of AD. This mutation of a single mutation inexon 16 changes an alanine into a threonine and has been shown to reduce the cleavage ofthe APP protein by BACE1 by 40%.This kind of single point mutation is the perfect target for the newly discoveredCRISPR/Cas9 technology, which opens new perspectives for the development of preventiveor curative treatments for genetic diseases and in our case Alzheimer’s. The Cas9endonuclease is a powerful tool for the modification of genetic data. The protein has been shown to cut double-stranded DNA with the help of a guide RNA (gRNA) to target a specified sequence adjacent to a PAM (protospacer adjacent motif). The base CRISPRsystem has been coopted by many different research teams; one of which used the technology to develop a technique they called base editing. This technique allows researchers toexchange cytidine bases for thymine and guanine bases for adenine with a strong accuracy. The first article of this thesis aims to demonstrate that the addition of the A673Tmutation in codominance with another pathological form of AD may have beneficial effectson the reduction of beta-amyloid peptides in patients’ brains. To determine if the mutationwas protective, plasmids carrying the A673T mutation along with another random FADmutation were used. Ultimately, we confirmed the beneficial effect for many forms of FAD,in particular the London V717I mutation demonstrated the greatest reduction in beta amyloidproteins. The second article of this thesis deals with the insertion of the A673T mutation by theCRISPR/Cas9 derived system, base editing. Several base editor complexes were compared and optimized to achieve the most effective and accurate genome modification possible. A candidate was selected after testing on HEK293T cells and SH-SY5Y neuroblastoma. The third part of this manuscript presents the results obtained when using lentiviraland AAV vectors to infect induced human and mouse neurons with a base editor complex and harvested mouse neurons with FAD forms. This whole approach has opened up an avenue for a potential therapy for Alzheimer’sdisease.
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Poggi, Lucie. "Gene editing approaches of microsatellite disorders : shortening expanded repeats." Electronic Thesis or Diss., Sorbonne université, 2020. http://www.theses.fr/2020SORUS412.
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Les maladies à triplet sont dues à des expansions de trinucléotides dans l’ADN. Aucun traitement n’existe pour les soigner. Le but de cette thèse est de mettre au point de nouvelles approches de thérapie génique pour supprimer les expansions pathologiques dans le génome humain. Dans une première partie, un système expérimental dans la levure a été construit afin d’évaluer l’efficacité de différentes nucléases associées au système CRISPR sur des microsatellites. La seconde partie est concentrée sur une maladie à triplet en particulier ; la dystrophie myotonique de type 1 (DM1), qui est due à une expansion d’une répétition de triplets CTG dans la région 3’UTR du gène DMPK. Une nucléase, TALENCTG , construite pour induire une cassure double-brin dans les répétitions CTG en 3’UTR du gène DMPK, induit de manière très efficace des contractions de triplets CTG dans la levure. Des événements de contraction ont été observés lorsque cette nucléase est exprimée. Des expériences in vivo dans un modèle de souris contenant un fragment d’ADN génomique humain de patient contenant 1000 CTG ont été menées. Des particules virales AAV recombinantes portant le gène de la TALEN ont été produites. Après injection intramusculaire, les cellules musculaires expriment la nucléase, mais dû à une toxicité ou immunogénicité de la protéine, l’expression est perdue. Enfin, le système mis au point dans la levure a été transposé dans une lignée cellulaire humaine établie, les HEK293FS. Ce système pourra servir à sélectionner des nucléases actives dans les cellules humaines<br>Microsatellite disorders are a specific class of human diseases that are due to the expansion of repeated sequences above pathological thresholds. These disorders have varying symptoms and pathogenic mechanisms, caused by the expanded repeat. No cure exists for any of these dramatic conditions. This thesis is investigating new gene editing approaches to remove pathological expansions in the human genome. In a first part, a yeast-based screen was constructed to identify potent CRISPR-associated nucleases that can cut these microsatellites. The second part focuses on myotonic dystrophy type 1 (DM1), which is due to and expanded CTG repeat tract located at the 3’UTR of the DMKP gene. A nuclease, TALENCTG was designed to induce a double strand break into the CTG repeats. It was previously shown to be active in yeast cells, inducing contractions of CTG repeats from a DM1 patient integrated into the yeast genome. The TALEN was tested in DM1 patient cells. The nuclease was found to trigger some contraction events in patient cells. In vivo experiments were carried out in a mouse model of myotonic dystrophy type 1 containing a human genomic fragment from a patient and 1000 CTG. Intramuscular injections of recombinant AAV encoding the TALENCTG revealed that the nuclease is toxic and/or immunogenic in muscle cells in the tested experimental conditions. Finally, the reporter assay integrated in yeast to screen nucleases was transposed in HEK293FS cell line. The integrated cassette contains a CTG expansion from a myotonic dystrophy type 1 patient flanked by two halves of GFP genes. This system would enable to find nucleases active in human cells
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Cullot, Grégoire. "Génotoxicité des systèmes CRISPR-Cas9." Thesis, Bordeaux, 2019. http://www.theses.fr/2019BORD0344.
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La thérapie génique est une stratégie thérapeutique prometteuse pour le traitement des maladies monogéniques. Si les premières approches, dites additives, ont reposées sur l’utilisation de vecteurs viraux, une part grandissante se tourne désormais vers l’édition génique. Celle-ci est permise par la mise au point de nouvelles générations d’endonucléases, et en particulier le système CRISPR-Cas9. Moins d’une décennie après sa caractérisation, le système CRISPR-Cas9 a permis de faire passer l’édition génique à un stade clinique. Toutefois, dans le même laps de temps, plusieurs interrogations ont été soulevées vis-à-vis de la génotoxicité pouvant être induite par la Cas9. Une littérature émergente pointe le risque de génotoxicité au site ciblé. Le travail de thèse présentée ici s’inscrit dans cette thématique. La première partie de l’étude a eu pour objectif de décrire la génotoxicité induite par une unique cassure double-brin faite par la Cas9. La caractérisation des effets a été faite à la fois à l’échelle nucléotidique, par le suivi de la balance HDR / InDels, mais également à l’échelle du chromosome. Le suivi de l’intégrité chromosomique a permis de mettre en lumière un nouveau risque de génotoxicité encore non-caractérisé. Un système de détection sensible et spécifique de ce risque a été mis au point pour continuer de le caractériser. Le second objectif a été de répondre aux limites soulevées par la génotoxicité non-voulus, en mettant au point une méthode d’édition génique plus sûre et aussi efficace, via l’utilisation d’une unique cassure simple-brin par la Cas9D10A -nickase<br>Gene therapy is a promising therapeutic strategy for the monogenic diseases treatment. If the first approaches, called additive, have relied on the use of viral vectors, a growing share is now turning to gene editing. Less than a decade after its characterization, the CRISPR-Cas9 system has moved gene editing to a clinical stage. However, in the same period of time, several questions have been raised regarding the genotoxicity that can be induced by Cas9. An emerging literature points to the risk of genotoxicity at the targeted site. The thesis work presented here is part of this theme. The first part of the study aimed to describe the genotoxicity induced by a single double-stranded break made by Cas9. Characterization of the effects was done both at the nucleotide level, by monitoring the HDR / InDels balance, but also at the chromosome scale. The monitoring of chromosomal integrity has brought to light a new risk of genotoxicity that was not characterized. A sensitive and specific detection system for this risk has been developed to further characterize it. The second objective was to address the limitations of unwanted genotoxicity by developing a safer and more efficient gene editing method through the use of a single single-stranded breakage by Cas9D10A-nickase
Bücher zum Thema "Système CRISPR-Cas9"
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Kozubek, Jim. Modern Prometheus: Editing the Human Genome with Crispr-Cas9. Cambridge University Press, 2018.
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Yamamoto, Takashi. Targeted Genome Editing Using Site-Specific Nucleases: ZFNs, TALENs, and the CRISPR/Cas9 System. Springer, 2016.
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3
Yamamoto, Takashi. Targeted Genome Editing Using Site-Specific Nucleases: ZFNs, TALENs, and the CRISPR/Cas9 System. Springer, 2015.
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4
Yamamoto, Takashi. Targeted Genome Editing Using Site-Specific Nucleases: ZFNs, TALENs, and the CRISPR/Cas9 System. Springer, 2015.
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5
Yamamoto, Takashi. Targeted Genome Editing Using Site-Specific Nucleases: ZFNs, TALENs, and the CRISPR/Cas9 System. Springer Japan, 2015.
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Modern Prometheus: Editing the Human Genome. University of Cambridge ESOL Examinations, 2016.
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Uddandrao, V. V. Sathibabu, and Parim Brahma Naidu, eds. Advancements in Cardiovascular Research and Therapeutics: Molecular and Nutraceutical Perspectives. BENTHAM SCIENCE PUBLISHERS, 2022. http://dx.doi.org/10.2174/97898150508371220101.
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This reference summarizes recent advancements in knowledge about cardiovascular disease and pharmacology. The goal of the book is to inform readers about recent findings on cardiovascular therapeutics and how to conduct experiments to evaluate natural products. It presents 10 chapters that cover basic clinical research on cardiovascular diseases and therapeutic agents derived from natural sources. The book concludes with a series of experiments that demonstrate the methods to test the ameliorative effects of 3 phytochemicals: Biochanin A (red clover), Zingiberene (ginger oil) and Betaine (sugar beet). Key Features - 10 chapters that highlight recent research cardiovascular medicine and pharmacology - Covers knowledge about basic cardiovascular physiology, congestive heart failure treatment and the treatment of heart inflammation. - Covers uses, benefits, and drawbacks of numerous rodent and non-rodent animal models for studying CVD - Updates readers about 21st-century CRISPR-cas9 technology and its uses in CVD. - Covers the significance of Indian Ayurvedic techniques on the cardiovascular system, - Covers information about nutraceuticals for CVD therapy - Includes experiments to evaluate 3 phytochemicals for the treatment of different heart diseases such as hypertension, obesity-cardiomyopathy and the mitigation of inflammatory cytokines in myocardial infarction. This book is an informative resource for cardiologists, and researchers working in the field of cardiovascular pharmacology. It also helps readers to understand the benefits of herbal medications that are commonly available for consumption in homes.
Buchteile zum Thema "Système CRISPR-Cas9"
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Sharma, Sahil, and Cynthia M. Sharma. "Identification of RNA Binding Partners of CRISPR-Cas Proteins in Prokaryotes Using RIP-Seq." In Methods in Molecular Biology. Springer US, 2021. http://dx.doi.org/10.1007/978-1-0716-1851-6_6.
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AbstractCRISPR-Cas systems consist of a complex ribonucleoprotein (RNP) machinery encoded in prokaryotic genomes to confer adaptive immunity against foreign mobile genetic elements. Of these, especially the class 2, Type II CRISPR-Cas9 RNA-guided systems with single protein effector modules have recently received much attention for their application as programmable DNA scissors that can be used for genome editing in eukaryotes. While many studies have concentrated their efforts on improving RNA-mediated DNA targeting with these Type II systems, little is known about the factors that modulate processing or binding of the CRISPR RNA (crRNA) guides and the trans-activating tracrRNA to the nuclease protein Cas9, and whether Cas9 can also potentially interact with other endogenous RNAs encoded within the host genome. Here, we describe RIP-seq as a method to globally identify the direct RNA binding partners of CRISPR-Cas RNPs using the Cas9 nuclease as an example. RIP-seq combines co-immunoprecipitation (coIP) of an epitope-tagged Cas9 followed by isolation and deep sequencing analysis of its co-purified bound RNAs. This method can not only be used to study interactions of Cas9 with its known interaction partners, crRNAs and tracrRNA in native systems, but also to reveal potential additional RNA substrates of Cas9. For example, in RIP-seq analysis of Cas9 from the foodborne pathogen Campylobacter jejuni (CjeCas9), we recently identified several endogenous RNAs bound to CjeCas9 RNP in a crRNA-dependent manner, leading to the discovery of PAM-independent RNA cleavage activity of CjeCas9 as well as non-canonical crRNAs. RIP-seq can be easily adapted to any other effector RNP of choice from other CRISPR-Cas systems, allowing for the identification of target RNAs. Deciphering novel RNA-protein interactions for CRISPR-Cas proteins within host bacterial genomes will lead to a better understanding of the molecular mechanisms and functions of these systems and enable us to use the in vivo identified interaction rules as design principles for nucleic acid-targeting applications, fitted to each nuclease of interest.
2
Challa, Anil Kumar. "CRISPR in Zebrafish." In Learning Materials in Biosciences. Springer Nature Switzerland, 2025. https://doi.org/10.1007/978-3-031-73734-3_7.
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What You Will Learn in This Chapter Zebrafish is a good model organism to use with CRISPR technology, in the undergraduate laboratory environment Important steps involved in undertaking CRISPR work in zebrafish Possible pitfalls while using CRIPSR-Cas9 methods in the zebrafish system How CRISPR can be used in zebrafish with UG students
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Ulbricht, Randi. "CRISPR in Yeast." In Learning Materials in Biosciences. Springer Nature Switzerland, 2025. https://doi.org/10.1007/978-3-031-73734-3_9.
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What You Will Learn in This Chapter This chapter will provide an overview of CRISPR in yeast for instructors considering using CRISPR in this simple model system. Considerations, suggestions, and resources for student-led experimental design are provided, including target selection, Cas9 expression, genotyping and phenotyping.
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Ledford, Heidi. "Die Rätsel des CRISPR/Cas-Systems." In CRISPR/Cas9 – Einschneidende Revolution in der Gentechnik. Springer Berlin Heidelberg, 2018. http://dx.doi.org/10.1007/978-3-662-57441-6_2.
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5
Cong, Le, and Feng Zhang. "Genome Engineering Using CRISPR-Cas9 System." In Chromosomal Mutagenesis. Springer New York, 2014. http://dx.doi.org/10.1007/978-1-4939-1862-1_10.
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6
Gopika, Boro Arthi, Arumugam Vijaya Anand, Natchiappan Senthilkumar, Senthil Kalaiselvi, and Santhanu Krishnapriya. "Gene Editing Using CRISPR/Cas9 System." In CRISPR and Plant Functional Genomics. CRC Press, 2024. http://dx.doi.org/10.1201/9781003387060-15.
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7
Hill, Eric M., Cheng-Yi Chen, Florencia del Viso, et al. "Manipulation of Gene Activity in the Regenerative Model Sea Anemone, Nematostella vectensis." In Methods in Molecular Biology. Springer US, 2022. http://dx.doi.org/10.1007/978-1-0716-2172-1_23.
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AbstractWith a surprisingly complex genome and an ever-expanding genetic toolkit, the sea anemone Nematostella vectensis has become a powerful model system for the study of both development and whole-body regeneration. Here we provide the most current protocols for short-hairpin RNA (shRNA)-mediated gene knockdown and CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis in this system. We further show that a simple Klenow reaction followed by in vitro transcription allows for the production of gene-specific shRNAs and single guide RNAs (sgRNAs) in a fast, affordable, and readily scalable manner. Together, shRNAknockdown and CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis allow for rapid screens of gene function as well as the production of stable mutant lines that enable functional genetic analysis throughout the Nematostella life cycle.
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Wollert, David. "CRISPR for the High School Classroom." In Learning Materials in Biosciences. Springer Nature Switzerland, 2025. https://doi.org/10.1007/978-3-031-73734-3_3.
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What You Will Learn in This Chapter With the unraveling of the mechanism for CRISPR-Cas systems in Streptococcus pyogenes in 2012, the application of the basic knowledge to gene editing revolutionized life science research. The newest gene technology method brings with it the promise of new cures for genetic diseases, bringing us ever closer to truly personalized medicine. It’s a fascinating and potentially controversial topic that will capture the interest of your high school students. Fortunately, there are now plenty of CRISPR-related resources available, including wet-labs that allow students to actually perform CRISPR gene editing in the classroom. Many (perhaps most) high school budgets, however, may not be in a position to purchase and implement expensive lab kits. To meet this need, there are also a variety of free and inexpensive resources to introduce CRISPR in the classroom. The goal of this chapter is to introduce you to CRISPR (also called CRISPR-Cas9) and direct you to some resources for teaching CRISPR to your high school students.
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Challa, Anil Kumar. "Expansions on CRISPR-Cas9 Technology: Innovations for the Future." In Learning Materials in Biosciences. Springer Nature Switzerland, 2025. https://doi.org/10.1007/978-3-031-73734-3_2.
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What You Will Learn in This Chapter Bacterial immune systems—RM system, CRISPR system. Site specific nucleases—need for gene manipulation. Nanobiobots as tools in molecular genetics. Wildtype and engineered nucleases (PAM engineering, specificity).
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Li, Chao, and Baohong Zhang. "Genome Editing in Cotton Using CRISPR/Cas9 System." In Methods in Molecular Biology. Springer New York, 2018. http://dx.doi.org/10.1007/978-1-4939-8952-2_8.
Der volle Inhalt der QuelleKonferenzberichte zum Thema "Système CRISPR-Cas9"
1
S, Narendra Kumar, Arya Hariharan, Abhisha B. H, Bhumika K, and Pragathi Basavaraj. "CRISPR-Cas9 Guide RNA Designer using Python." In 2024 8th International Conference on Computational System and Information Technology for Sustainable Solutions (CSITSS). IEEE, 2024. https://doi.org/10.1109/csitss64042.2024.10816736.
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2
Ezerskii, V. A., E. M. Koloskova, and T. P. Trubitsina. "Green fluorescent protein gene for site-specific integration into the locus of the rabbit whey acidic protein gene." In CURRENT STATE, PROBLEMS AND PROSPECTS OF THE DEVELOPMENT OF AGRARIAN SCIENCE. Federal State Budget Scientific Institution “Research Institute of Agriculture of Crimea”, 2020. http://dx.doi.org/10.33952/2542-0720-2020-5-9-10-129.
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The high content of whey acidic protein in rabbit milk makes the gene of this protein a promising candidate for its replacement by the gene of pharmacologically active protein using the CRISPR/Cas9 system. The plasmid that contains 5’ and 3’ arms of homology to the rabbit WAP gene was created. A fragment containing a green fluorescent protein gene under the CMV promoter has been integrated into this site. A strategy of making double-stranded cuts in the gene WAP and receiving four pX330 plasmids encoding the endonuclease Cas9 and guide RNAs was developed. The plasmid containing a fragment cmvEGFP was designed for site-specific integration by homologous recombination into the gene WAP to assess the effectiveness of site-specificity of components of the CRISPR/Саѕ9 in vitro.
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Ермолаев, А. С., М. Мардини, А. М. Пивоваров, and Л. И. Хрусталева. "APPROACHES TO "DNA-FREE" GENOME EDITING OF POLLEN GRAINS OF ONION (ALLIUM CEPA L.)." In Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и сельскохозяйственной микробиологии. Crossref, 2022. http://dx.doi.org/10.48397/arriab.2022.22.xxii.009.
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Открытие системы геномного редактирования CRISPR/Cas9 создает новые возможности в получении сортов растений с заданными свойствами. Генетическое редактирование имеет огромный потенциал для эффективного создания новых сортов растений с заданными свойствами с минимальными затратами времени. Прямое редактирование пыльцевых зерен без использования ДНК-плазмиды, а лишь только с использованием белка Cas9 представляет из себя привлекательную возможность для создания генетически редактированных организмов (ГРО), которые, возможно, будут восприниматься потребителями охотнее, чем ГМО, поскольку при их создании не используется чужеродная ДНК. Кроме этого, такой подход также является менее ресурсозатратным поскольку позволяет избежать этапа регенерации новых растений из редактированных тканей и сразу получить жизнеспособные отредактированные семена со зрелым зародышем. The discovery of the CRISPR/Cas9 genomic editing system creates new opportunities for obtaining plant varieties with desired properties. Genetic editing has a huge potential for the efficient creation of new plant varieties with desired properties with minimal time. Direct editing of pollen grains without the use of a DNA plasmid, but only using the Cas9 protein, is an attractive opportunity to create genetically edited organisms (GROs), which may be more readily accepted by consumers than GMOs, since they do not use foreign DNA. In addition, this approach is also less resource-intensive, since it allows one to avoid the stage of regeneration of new plants from edited tissues and immediately obtain viable edited seeds with a mature embryo.
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Yamskikh, A. A., E. S. Ilina, N. S. Dyrkheeva, et al. "CREATION OF HUMAN CELL LINES WITH A REDUCED CONTENT OF KU ANTIGEN SUBUNITS USING THE CRISPR/CAS9 SYSTEM." In X Международная конференция молодых ученых: биоинформатиков, биотехнологов, биофизиков, вирусологов и молекулярных биологов — 2023. Novosibirsk State University, 2023. http://dx.doi.org/10.25205/978-5-4437-1526-1-399.
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In this work, using the CRISPR/Cas9 system, we obtained clones of HEK293A and HEK293FT cell lines with a reduced content of Ku70 or Ku80 proteins. The decrease in the target proteins amount was confirmed by Western blot analysis and affinity modification with chemically active DNA.
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Jiang, Qiancheng. "CRISPR-Cas9 system applications in cancer models." In International Conference on Biological Engineering and Medical Science (ICBIOMed2022), edited by Gary Royle and Steven M. Lipkin. SPIE, 2023. http://dx.doi.org/10.1117/12.2669382.
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Dolzhikova, O. A., O. A. Semikolenova, M. I. Meschaninova, and D. S. Novopashina. "ALLOSTERIC REGULATION OF CRISPR/CAS9 SYSTEM ON THE RNA LEVEL." In X Международная конференция молодых ученых: биоинформатиков, биотехнологов, биофизиков, вирусологов и молекулярных биологов — 2023. Novosibirsk State University, 2023. http://dx.doi.org/10.25205/978-5-4437-1526-1-71.
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CRISPR/Cas9 systems are commonly used for the introduction of double-strand break at the targeted point of DNA. A possible way to improve its specificity is allosteric regulation. Here, we designed guide RNA containing theophylline-binding or Mango aptamer and investigated their functional activity by the example of the model DNA cleavage either in absence or in presence of theophylline or thiazole orange respectively.
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Benz, T., P. Larghero, and R. Marschalek. "Optimizing CRISPR/Cas9 technologies to develop disease model systems." In 34. Jahrestagung der Kind-Philipp-Stiftung für pädiatrisch onkologische Forschung. Georg Thieme Verlag, 2023. http://dx.doi.org/10.1055/s-0043-1768500.
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8
Brisson, Jennifer A. "Developing the CRISPR/Cas9 system in the pea aphid." In 2016 International Congress of Entomology. Entomological Society of America, 2016. http://dx.doi.org/10.1603/ice.2016.105396.
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Xiao, Zening. "Principle, application and prospect of CRISPR-Cas9 regulatory system." In International Conference on Modern Medicine and Global Health (ICMMGH 2023), edited by Sheiladevi Sukumaran. SPIE, 2023. http://dx.doi.org/10.1117/12.2692261.
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Баранов, Д. Ю., С. В. Долгов, and В. Р. Тимербаев. "GENE EDITING OF THE TRANSLATION ELIGATION FACTOR IN TOMATO." In Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и сельскохозяйственной микробиологии. Crossref, 2021. http://dx.doi.org/10.48397/arriab.2021.21.xxi.046.
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По мере роста мирового населения растет спрос на продовольствие. Один из возможных способов решения этой проблемы – создание новых сортов сельскохозяйственных культур с ценными признаками, такими как повышенная урожайность, устойчивость к болезням, холодостойкость, улучшенная соле- и засухоустойчивость. Для производства новых сортов в течение десятилетий использовали методы традиционной селекции, но новые технологии, такие как редактирование генома, позволяют добиться желаемого результата быстрее и дешевле, путем точной модификации аллелей в разных видах и сортах растений. Менее чем за 5 лет метод, базирующийся на использовании CRISPR/Cas9, стал одним из самых широко применяемых методов в генной инженерии, в том числе растений. Некоторые системы геномного редактирования позволяют избежать встраивания чужеродной ДНК в геном экспериментального объекта или избавиться от нее в следующих поколениях. As the world population grows, so does the demand for food. One possible way to solve this problem is to develop new crop varieties with valuable traits such as increased yield, disease resistance, cold tolerance, improved salt and drought tolerance. Traditional breeding methods have been used to produce new varieties for decades, but new technologies, such as genome editing, can achieve the desired result faster and cheaper by precisely modifying alleles in different plant species and varieties. In less than 5 years, the CRISPR/Cas9 based method has become one of the most widely used methods in genetic engineering, including plants. Some genomic editing systems make it possible to avoid the insertion of foreign DNA into the genome of an experimental object or to get rid of it in future generations.
Berichte der Organisationen zum Thema "Système CRISPR-Cas9"
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Chakraborty, Srijani. The Dawn of RNA Therapeutics. Spring Library, 2020. http://dx.doi.org/10.47496/sl.blog.19.
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Morin, S., L. L. Walling, Peter W. Atkinson, J. Li, and B. E. Tabashnik. ets for CRISPR/Cas9-mediated gene drive in Bemisia tabaci. United States-Israel Binational Agricultural Research and Development Fund, 2021. http://dx.doi.org/10.32747/2021.8134170.bard.
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The goal of our BARD proposal was to build both the necessary infrastructure and knowledge for using the CRISPR/Cas9-based gene drive system to control the whitefly Bemisia tabaci. Our research focused on achieving three main goals: (1) establishing a CRISPR/Cas9 gene-editing system for producing genetically-edited B. tabaci; (2) generating and testing CRISPR/Cas9-mediated mutations targeting genes that represent two gene drive strategies: population replacement and population suppression; (3) using computer modeling to optimize strategies for applying CRISPR/Cas9 to control B. tabaci populations in the field. CRISPR gene drive is one of the most promising strategies for diminishing the negative impacts of harmful insects. This technique can introduce mutations into wild populations of pests that reduce their ability to cause damage, reduce their population size, or both. In principle, this can be selfsustaining because mutations carried by relatively few insects can increase in frequency and spread quickly throughout wild populations. Because of this sustainability and the potential benefits to society, agricultural gene-drive systems are most likely to be funded by government agencies, foundations, and grower associations; as with sterile insect releases and most biocontrol programs. Although gene drives have received intensive study in Drosophila and mosquito vectors of human disease, we were one of the first teams pursuing this approach for crop pests. Our project was also one of the first to address CRISPR gene drive in the Hemiptera, an insect order that includes hundreds of pest species. We focused on developing and implementing CRISPR gene drive to reduce the massive damage caused by B. tabaci. This haplodiploid insect is one of the world's most devastating crop pests. Whereas extensive work by others explored CRISPR in diploid species, our project pioneered application of this revolutionary technology to haplodiploids, which have a distinct system of inheritance that presents special challenges and opportunities. Our project has achieved several breakthroughs, including publication of the first paper analyzing CRISPR gene drive in haplodiploids (Li et al. 2020, see next section). Our modeling results from this landmark study demonstrate that CRISPR gene drive can work in haplodiploids, especially if fitness costs associated with the driver allele are low or nil. Our paper was the first to provide a conceptual framework for evaluating and optimizing CRISPR gene drive strategies for managing B. tabaci and other haplodiploid pests. Our breakthroughs in the laboratory have created the infrastructure needed to develop CRISPR for controlling B. tabaci. We established a microinjection system enabling us to introduce CRISPR-derived mutations into B. tabaci embryos. We have used this system to generate and track inherited eye-color mutants of B. tabaci. We have identified and cloned germline promoters, and demonstrated their function in transgenic B. tabaci embryos and other hemipteran insects. We have also developed a tool to easily identify B. tabaci harboring CRISPR-mediated mutations by tagging target genes using a transgenic fluorescent marker. The successful completion of our project provides all the knowledge and infrastructure essential for developing a novel genetic approach for B. tabaci control, which can serve as a non-chemical "green" alternative for managing this global pest. We predict that our discoveries will accelerate the development of the CRISPR gene drive technique for reducing the numbers of this pest and the damage it causes. Still, realization of the benefits of gene-drive technology for pest control will require sustained attention to potential environmental and societal impacts, as well as regulatory and implementation challenges. Given the great promise of this technology and the urgent need for better control methods, we expect that guidance documents and regulations will be in place to allow the scientific community to safely move gene drives for pest control from the laboratory to field trials.
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Vardhaan Ambati, Vardhaan Ambati. Personalized Cancer and Viral Therapy: Clostridium-based Cell Delivery System coupled to CRISPR/Cas9 Nanotherapeutic. Experiment, 2016. http://dx.doi.org/10.18258/7926.
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Sessa, Guido, and Gregory Martin. role of FLS3 and BSK830 in pattern-triggered immunity in tomato. United States Department of Agriculture, 2016. http://dx.doi.org/10.32747/2016.7604270.bard.
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Pattern-recognition receptors (PRRs) located on the plant cell surface initiate immune responses by perceiving conserved pathogen molecules known as pathogen-associated molecular patterns (PAMPs). PRRs typically function in multiprotein complexes that include transmembrane and cytoplasmickinases and contribute to the initiation and signaling of pattern-triggered immunity (PTI). An important challenge is to identify molecular components of PRR complexes and downstream signaling pathways, and to understand the molecular mechanisms that mediate their function. In research activities supported by BARD-4931, we studied the role of the FLAGELLIN SENSING 3 (FLS3) PRR in the response of tomato leaves to flagellin-derivedPAMPs and PTI. In addition, we investigated molecular properties of the tomato brassinosteroid signaling kinase 830 (BSK830) that physically interacts with FLS3 and is a candidate for acting in the FLS3 signaling pathway. Our investigation refers to the proposal original objectives that were to: 1) Investigate the role of FLS3 and its interacting proteins in PTI; 2) Investigate the role of BSK830 in PTI; 3) Examine molecular and phosphorylation dynamics of the FLS3-BSK830 interaction; 4) Examine the possible interaction of FLS3 and BSK830 with Pstand Xcveffectors. We used CRISPR/Cas9 techniques to develop plants carrying single or combined mutations in the FLS3 gene and in the paralogsFLS2.1 and FLS2.2 genes, which encode the receptor FLAGELLIN SENSING2 (FLS2), and analyzed their function in PTI. Domain swapping analysis of the FLS2 and FLS3 receptors revealed domains of the proteins responsible for PAMP detection and for the different ROS response initiated by flgII-28/FLS3 as compared to flg22/FLS2. In addition, in vitro kinase assays and point mutations analysis identified FLS2 and FLS3 domains required for kinase activity and ATP binding. In research activities on tomato BSK830, we found that it interacts with PRRs and with the co-receptor SERK3A and PAMP treatment affects part of these interactions. CRISPR/Cas9 bsk830 mutant plants displayed enhanced pathogen susceptibility and reduced ROS production upon PAMP treatment. In addition, BSK830 interacted with 8 Xanthomonastype III secreted effectors. Follow up analysis revealed that among these effectors XopAE is part of an operon, is translocated into plant cells, and displays E3 ubiquitinligase activity. Our investigation was also extended to other Arabidopsis and tomato BSK family members. Arabidopsis BSK5 localized to the plant cell periphery, interacted with receptor-like kinases, and it was phosphorylatedin vitro by the PEPR1 and EFRPRRs. bsk5 mutant plants displayed enhanced susceptibility to pathogens and were impaired in several, but not all, PAMP-induced responses. Conversely, BSK5 overexpression conferred enhanced disease resistance and caused stronger PTI responses. Genetic complementation suggested that proper localization, kinase activity, and phosphorylation by PRRs are critical for BSK5 function. BSK7 and BSK8 specifically interacted with the FLS2 PRR, their respective mutant plants were more susceptible to B. cinereaand displayed reduced flg22-induced responses. The tomato BSK Mai1 was found to interact with the M3KMAPKKK, which is involved in activation of cell death associated with effector-triggered immunity. Silencing of Mai1 in N. benthamianaplants compromised cell death induced by a specific class of immune receptors. In addition, co-expression of Mai1 and M3Kin leaves enhanced MAPKphosphorylation and cell death, suggesting that Mai1 acts as a molecular link between pathogen recognition and MAPK signaling. Finally, We identified the PP2C phosphatase Pic1 that acts as a negative regulator of PTI by interacting with and dephosphorylating the receptor-like cytoplasmickinase Pti1, which is a positive regulator of plant immunity. The results of this investigation shed new light on the molecular characteristics and interactions of components of the immune system of crop plants providing new knowledge and tools for development of novel strategies for disease control.
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Avni, Adi, and Gitta L. Coaker. Proteomic investigation of a tomato receptor like protein recognizing fungal pathogens. United States Department of Agriculture, 2015. http://dx.doi.org/10.32747/2015.7600030.bard.
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Maximizing food production with minimal negative effects on the environment remains a long-term challenge for sustainable food production. Microbial pathogens cause devastating diseases, minimizing crop losses by controlling plant diseases can contribute significantly to this goal. All plants possess an innate immune system that is activated after recognition of microbial-derived molecules. The fungal protein Eix induces defense responses in tomato and tobacco. Plants recognize Eix through a leucine-rich-repeat receptor- like-protein (LRR-RLP) termed LeEix. Despite the knowledge obtained from studies on tomato, relatively little is known about signaling initiated by RLP-type immune receptors. The focus of this grant proposal is to generate a foundational understanding of how the tomato xylanase receptor LeEix2 signals to confer defense responses. LeEix2 recognition results in pattern triggered immunity (PTI). The grant has two main aims: (1) Isolate the LeEix2 protein complex in an active and resting state; (2) Examine the biological function of the identified proteins in relation to LeEix2 signaling upon perception of the xylanase elicitor Eix. We used two separate approaches to isolate receptor interacting proteins. Transgenic tomato plants expressing LeEix2 fused to the GFP tag were used to identify complex components at a resting and activated state. LeEix2 complexes were purified by mass spectrometry and associated proteins identified by mass spectrometry. We identified novel proteins that interact with LeEix receptor by proteomics analysis. We identified two dynamin related proteins (DRPs), a coiled coil – nucleotide binding site leucine rich repeat (SlNRC4a) protein. In the second approach we used the split ubiquitin yeast two hybrid (Y2H) screen system to identified receptor-like protein kinase At5g24010-like (SlRLK-like) (Solyc01g094920.2.1) as an interactor of LeEIX2. We examined the role of SlNRC4a in plant immunity. Co-immunoprecipitation demonstrates that SlNRC4a is able to associate with different PRRs. Physiological assays with specific elicitors revealed that SlNRC4a generally alters PRR-mediated responses. SlNRC4a overexpression enhances defense responses while silencing SlNRC4 reduces plant immunity. We propose that SlNRC4a acts as a non-canonical positive regulator of immunity mediated by diverse PRRs. Thus, SlNRC4a could link both intracellular and extracellular immune perception. SlDRP2A localizes at the plasma membrane. Overexpression of SlDRP2A increases the sub-population of LeEIX2 inVHAa1 endosomes, and enhances LeEIX2- and FLS2-mediated defense. The effect of SlDRP2A on induction of plant immunity highlights the importance of endomembrane components and endocytosis in signal propagation during plant immune . The interaction of LeEIX2 with SlRLK-like was verified using co- immunoprecipitation and a bimolecular fluorescence complementation assay. The defence responses induced by EIX were markedly reduced when SlRLK-like was over-expressed, and mutation of slrlk-likeusing CRISPR/Cas9 increased EIX- induced ethylene production and SlACSgene expression in tomato. Co-expression of SlRLK-like with different RLPs and RLKs led to their degradation, apparently through an endoplasmic reticulum-associated degradation process. We provided new knowledge and expertise relevant to expression of specific be exploited to enhance immunity in crops enabling the development of novel environmentally friendly disease control strategies.