Dissertationen: „Séquençage de cellules uniques“

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Foulon, Sophie. „Développement du séquençage ARN ciblé sur cellules uniques en microfluidique de gouttes et applications“. Thesis, Paris Sciences et Lettres (ComUE), 2019. http://www.theses.fr/2019PSLET037.

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Les technologies d'analyse à l'échelle de la cellule unique ont vu le jour il y a quelques années et sont depuis en constante évolution. Ces technologies permettent de mieux comprendre le fonctionnement d'ensemble de cellules très hétérogènes. Elles permettent par exemple de découvrir et suivre des sous types cellulaires, avec des applications en cancérologie ou encore en neurobiologie. Nous avons développé une technologie pour étudier le profil d'expression de gènes d'intérêt au niveau d'une cellule unique, en utilisant la microfluidique en gouttes. En limitant le nombre de gènes étudiés comparé aux technologies commerciales de transcriptome entier, l’approche ciblée a plusieurs avantages potentiels : gagner en profondeur de séquençage, augmenter le nombre de cellules étudiées, optimiser la détection pour les bas niveaux d’expression, tout en réduisant la complexité des données et des coûts. Le ciblage est parfois indispensable, notamment lorsque les ARNs ne portent pas de séquence d’amorce générique, comme dans le cas des ARNs viraux. Deux applications sont présentées : l'analyse de l'inflammation des cellules immunitaires du cerveau aux premières étapes du développement, ainsi que l'étude de la recombinaison génétique chez le virus
Single cells technologies were introduced a few years ago and have been dramatically evolving ever since. These technologies have revolutionized biology, making it possible to better understand how heterogeneous cell systems works. For example, they permit to discover and follow cell subtypes, with applications in oncology or neurobiology. We have developed a technology to study the expression profile of genes of interest at the level of a single cell, using droplet-based microfluidics. By limiting the number of genes studied compared to commercial whole-transcriptome technologies, the targeted approach has several potential benefits: gaining deeper sequencing, increasing the number of cells studied, optimizing detection for low levels of expression, while reducing the complexity of data and costs. Targeting is sometimes essential, especially when the RNAs do not carry a generic primer sequence, as in the case of viral RNAs. Two applications are presented: the analysis of inflammation of the immune cells of the brain in the early stages of development, as well as the study of genetic recombination in the virus

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Deprez, Marie. „Étude de l’hétérogénéité cellulaire et des dynamiques de régénération de l’épithélium respiratoire sain par analyses des signatures transcriptionnelles sur cellules uniques“. Electronic Thesis or Diss., Université Côte d'Azur (ComUE), 2019. http://www.theses.fr/2019AZUR6022.

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Les progrès technologiques en séquençage haut débit et en manipulation cellulaire permettent d'analyser simultanément et indépendamment le contenu de nombreuses cellules (ARN, ADN,...). Cette révolution "omique" offre un nouveau cadre pour revisiter la "Théorie Cellulaire", essentiellement basée sur des caractéristiques morphologiques et fonctionnelles. Les nombreuses modalités cellulaires désormais accessibles au niveau de la cellule unique, telles que leur transcriptome, leur localisation spatiale, leurs trajectoires développementales, enrichissent considérablement cette définition, et établissent un contexte totalement renouvelé pour réévaluer la définition de "types" ou d’"états" cellulaires ainsi que leurs interactions. \Mon travail de thèse a été de mettre en place des approches statistiques appropriées pour analyser ces données transcriptomiques sur cellule unique caractérisées par une forte variance, la présence d'un pourcentage élevé de valeurs nulles et un grand volume de données. Mon travail s’est focalisé sur le modèle expérimental central de mon laboratoire d’accueil, l'épithélium des voies respiratoires humaines. Les voies respiratoires humaines sont bordées d'un épithélium pseudo-stratifié composé principalement de cellules basales, sécrétrices, à gobelet et multiciliées. Les voies respiratoires constituent en outre un véritable écosystème cellulaire, dans lequel la couche épithéliale interagit étroitement avec les cellules immunitaires et mésenchymateuses. Cette coordination entre les cellules assure une bonne défense du système respiratoire et sa correcte régénération en cas d'agressions extérieures. Une meilleure compréhension des situations cellulaires normales et pathologiques peut améliorer les approches pour lutter contre des pathologies telles que la maladie pulmonaire obstructive chronique, l'asthme ou la mucoviscidose.J'ai d'abord pu caractériser au niveau de la cellule unique la séquence précise et spécifique des événements conduisant à la régénération fonctionnelle de l'épithélium, en utilisant un modèle 3D de cellules humaines. J'ai identifié des hiérarchies de lignées cellulaires et j'ai pu reconstruire les différentes trajectoires possibles de différentiation cellulaire. J'ai confirmé des trajectoires cellulaires décrites précédemment, mais j'ai aussi découvert une nouvelle trajectoire reliant les cellules à gobelet aux cellules multiciliées, identifiant de nouvelles populations cellulaires et de nouvelles interactions moléculaires impliquées dans le processus de régénération de l'épithélium sain des voies aériennes humaines. J'ai ensuite construit un atlas des différents types cellulaires qui tapissent les voies respiratoires humaines saines, du nez jusqu’à la 12ième génération de bronches. Le profilage de 10 volontaires sains a généré un ensemble de données de 77 969 cellules, provenant de 35 emplacements distincts, qui comprend plus de 26 types cellulaires épithéliaux, immunitaires et mésenchymateuses. Cet atlas illustre l'hétérogénéité cellulaire présente dans les voies respiratoires. Son analyse révèle une différence d'expression des gènes entre le nez et les voies respiratoires pulmonaires que j’ai caractérisé dans les cellules suprabasales, sécrétrices et multiciliées. Mes travaux ont également permis d'améliorer la caractérisation de certaines populations de cellules rares, comme les cellules "hillock", déjà décrites chez la souris. En conclusion, mon travail contribue à une meilleure compréhension des dynamiques de différenciation et d'hétérogénéité cellulaire dans les voies respiratoires humaines saines. La ressource ainsi constituée sera extrêmement utile dans tout projet futur visant à analyser avec précision les conditions spécifiques des maladies respiratoires
Improvements made in nucleic acid sequencing and cell handling technologies now offer the opportunity to analyze simultaneously the content of numerous single cells (RNA, DNA, ...) by global and unbiased approaches. This single-cell ‘omics’ revolution provides a new framework to revisit the “Cell Theory”, elaborated over several centuries, and essentially based on morphological and functional features. The many cell modalities now accessible at single- cell level, such as their transcriptome, spatial localization, developmental trajectories, enrich considerably this definition, and set a renewed context to precisely reassess the definition of ‘cell types’, ‘cell states’ as well as their different interactions and fates.My thesis work initially set up ad hoc approaches and statistical framework to analyze appropriately these single-cell data, which deeply differ from standard bulk RNA-seq. High variance, presence of a huge percentage of null values, large volume of data are among the specific characteristics of these datasets. My work was centered on the main experimental model of my host laboratory, e.g. the human airway epithelium. Human airways are lined by a pseudostratified epithelium mainly composed of basal, secretory, goblet and multiciliated cells. Airways also constitute a true cellular ecosystem, in which the epithelial layer interacts closely with immune and mesenchymal cells. This coordination between cells ensures proper defense of the respiratory system and its correct regeneration in case of external aggression and injuries. A better understanding of the operating sequences in normal and physiopathological situations is relevant in pathologies such as chronic obstructive pulmonary disease, asthma or cystic fibrosis.First, I characterized at a single cell level the precise and cell-specific sequence of events leading to functional regeneration of the epithelium, using a 3D model of human cells. I then built a single-cell atlas of the different cell types that are lining healthy human airways from the nose to the 12th generation of bronchi.By applying computational and statistical approaches, I have identified cell lineage hierarchies and was able to reconstruct a comprehensive cell trajectory roadmap in human airways. I not only confirmed previously described cell lineages, but I have also discovered a novel trajectory that links goblet cells to multiciliated cells, identifying novel cell populations and molecular interactors involved in the process of healthy human airway epithelium regeneration. The profiling of 12 healthy volunteers then generated a dataset of 77,969 cells, derived from 35 distinct locations. The resulting atlas is composed of more than 26 epithelial, immune and stromal cell types demonstrating the cellular heterogeneity present in the airways. Its analysis has revealed a strong proximo-distal gradient of expression in suprabasal, secretory, or multiciliated cells between the nose and lung airways. My work has also improved the characterization of rare cells, including “hillock” cells that have been previously described in mice.In conclusion, this work probably represents one of the first single-cell investigations in human airways. It brings original contributions to our understanding of differentiation’s dynamics and cellular heterogeneity in healthy human airways. The resulting resource will be extremely useful for any future single-cell investigators and also for establishing a very useful joint between clinical and biological works. As such, it will constitute a reference in any future project aiming to precisely analyze specific disease conditions

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Marcy, Guillaume. „Etude des spécificités transcriptionnelles et de la compétence des progéniteurs neuraux postnataux du cerveau antérieur chez la souris“. Thesis, Paris Sciences et Lettres (ComUE), 2018. http://www.theses.fr/2018PSLEP070/document.

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Lors du développement, la coordination d’évènements moléculaires et cellulaires mène à la production du cortex qui orchestre les fonctions sensori-motrices et cognitives. Son développement s’effectue par étapes : les cellules gliales radiaires (RGs) – les cellules souches neurales (NSCs) du cerveau en développement – et les cellules progénitrices de la zone ventriculaire (VZ) et de la zone sous ventriculaire (SVZ) génèrent séquentiellement des vagues distinctes de nouveaux neurones qui formeront les différentes couches corticales. Autour de la naissance, les RGs changent de devenir et produisent des cellules gliales. Cependant, une fraction persiste tout au long de la vie dans la SVZ qui borde le ventricule, perdant au passage leur morphologie radiale. Ces NSCs produisent ensuite les différents sous types d’interneurones du bulbe olfactif ainsi que des cellules gliales en fonction de leur origine spatiale dans la SVZ. Ces observations soulèvent d’importantes questions non résolues sur 1) le codage transcriptionnel régulant la régionalisation de la SVZ, 2) le potentiel des NSCs postnatales dans la réparation cérébrale, et 3) le lignage et les spécificités transcriptionnelles entre les NSCs et leur descendants. Mon travail de doctorat repose sur une étude transcriptionnelle des domaines de la SVZ postnatale. Celle-ci soulignait le fort degré d’hétérogénéité des NSCs et progéniteurs et identifiait des régulateurs transcriptionnels clés soutenant la régionalisation. J’ai développé des approches bio-informatiques pour explorer ces données et connecter l’expression de facteurs de transcription (TFs) avec la genèse régionale de lignages neuraux distincts. J’ai ensuite développé un modèle d’ablation ciblée pour étudier le potentiel régénératif des progéniteurs postnataux dans divers contextes. Finalement, j’ai participé au développement d’une procédure pour explorer et comparer des progéniteurs pré et postnataux à l’échelle de la cellule unique. Objectif 1 : Des expériences de transcriptomique et de cartographie ont été réalisées pour étudier la relation entre l’expression régionale de TFs par les NSCs et l’acquisition de leur devenir. Nos résultats suggèrent un engagement précoce des NSCs à produire des types cellulaires définis selon leur localisation spatiale dans la SVZ et identifient HOPX comme un marqueur d’une sous population biaisé à générer des astrocytes. Objectif 2 : J’ai mis au point un modèle de lésion corticale qui permet l’ablation ciblée de neurones de couches corticales définies pour étudier la capacité régénérative et la spécification appropriée des progéniteurs postnataux. Une analyse quantitative des régions adjacentes, incluant la région dorsale de la SVZ, a révélé une réponse transitoire de progéniteurs définis. Objectif 3 : Nous avons développé la lignée de souris transgénique Neurog2CreERT2Ai14, qui permet le marquage de cohortes de progéniteurs glutamatergiques et de leurs descendants. Nous avons montré qu’une large fraction de ces progéniteurs persiste dans le cerveau postnatal après la fermeture de neurogénèse corticale. Ils ne s’accumulent pas pendant le développement embryonnaire mais sont produits par des RGs qui persistent après la naissance dans la SVZ et qui continuent de générer des neurones corticaux, bien que l’efficacité soit faible. Le séquençage d’ARN sur cellule unique a révélé une dérégulation transcriptionnelle qui corrèle avec le déclin progressif observé in vivo de la neurogénèse corticale. Ensemble, ces résultats soulignent le potentiel des études transcriptomiques à résoudre mais aussi à soulever des questions fondamentales comme les changements trancriptionnels intervenant dans une population de progéniteurs au cours du temps et participant aux changements de leur destinée. Cette connaissance sera la clé du développement d’approches novatrices pour recruter et promouvoir la génération de types cellulaires spécifiques, incluant les sous-types neuronaux dans un contexte pathologique
During development, a remarkable coordination of molecular and cellular events leads to the generation of the cortex, which orchestrates most sensorimotor and cognitive functions. Cortex development occurs in a stepwise manner: radial glia cells (RGs) - the neural stem cells (NSCs) of the developing brain - and progenitor cells from the ventricular zone (VZ) and the subventricular zone (SVZ) sequentially give rise to distinct waves of nascent neurons that form cortical layers in an inside-out manner. Around birth, RGs switch fate to produce glial cells. A fraction of neurogenic RGs that lose their radial morphology however persists throughout postnatal life in the subventricular zone that lines the lateral ventricles. These NSCs give rise to different subtypes of olfactory bulb interneurons and glial cells, according to their spatial origin and location within the postnatal SVZ. These observations raise important unresolved questions on 1) the transcriptional coding of postnatal SVZ regionalization, 2) the potential of postnatal NSCs for cellular regeneration and forebrain repair, and 3) the lineage relationship and transcriptional specificities of postnatal NSCs and of their progenies. My PhD work built upon a previously published comparative transcriptional study of defined microdomains of the postnatal SVZ. This study highlighted a high degree of transcriptional heterogeneity within NSCs and progenitors and revealed transcriptional regulators as major hallmarks sustaining postnatal SVZ regionalization. I developed bioinformatics approaches to explore these datasets further and relate expression of defined transcription factors (TFs) to the regional generation of distinct neural lineages. I then developed a model of targeted ablation that can be used to investigate the regenerative potential of postnatal progenitors in various contexts. Finally, I participated to the development of a pipeline for exploring and comparing select populations of pre- and postnatal progenitors at the single cell level. Objective 1: Transcriptomic as well as fate mapping were used to investigate the relationship between regional expression of TFs by NSCs and their acquisition of distinct neural lineage fates. Our results supported an early priming of NSCs to produce defined cell types depending of their spatial location in the SVZ and identified HOPX as a marker of a subpopulation biased to generate astrocytes. Objective 2: I established a cortical lesion model, which allowed the targeted ablation of neurons of defined cortical layers to investigate the regenerative capacity and appropriate specification of postnatal cortical progenitors. Quantitative assessment of surrounding brain regions, including the dorsal SVZ, revealed a transient response of defined progenitor populations. Objective 3: We developed a transgenic mouse line, i.e. Neurog2CreERT2Ai14, which allowed the conditional labeling of birth-dated cohorts of glutamatergic progenitors and their progeny. We used fate-mapping approaches to show that a large fraction of Glu progenitors persist in the postnatal forebrain after closure of the cortical neurogenesis period. Postnatal Glu progenitors do not accumulate during embryonal development but are produced by embryonal RGs that persist after birth in the dorsal SVZ and continue to give rise to cortical neurons, although with low efficiency. Single-cell RNA sequencing revealed a dysregulation of transcriptional programs, which correlates with the gradual decline in cortical neurogenesis observed in vivo. Altogether, these data highlight the potential of transcriptomic studies to unravel but also to approach fundamental questions such as transcriptional changes occurring in a population of progenitors over time and participating to changes in their fate potential. This knowledge will be key in developing innovative approaches to recruit and promote the generation of selected cell types, including neuronal subtypes in pathologies

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Benavente, Diaz Maria. „Investigation of the molecular diversity defining muscle stem cell heterogeneity“. Electronic Thesis or Diss., Sorbonne université, 2020. https://accesdistant.sorbonne-universite.fr/login?url=https://theses-intra.sorbonne-universite.fr/2020SORUS072.pdf.

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Le muscle squelettique adulte a une capacité de régénération remarquable, pouvant guérir après des traumatismes répétés. Cette propriété dépend de la présence de cellules souches musculaires (SCMu), qui sont pour la plupart quiescentes dans des conditions homéostatiques mais qui s'activent après une blessure, réintègrent le cycle cellulaire et prolifèrent pour donner naissance à des myoblastes qui fusionneront pour restaurer les fibres endommagées. De nombreuses études ont étudié les états transitoires que les SCMu empruntent de l'entrée du cycle cellulaire à la différenciation. Malgré le fait que plusieurs souris rapportrices génétiquement modifiées aient été générées pour examiner ces événements, l'initiation de la différenciation, qui est généralement définie par l'expression du facteur de régulation myogénique Myogenin, est difficilement appréciable à cause du manque de souris rapportrice fiable. Par conséquent, nous avons développé une nouvelle lignée rapportrice où la différenciation des cellules myogéniques exprimant le facteur de transcription Myogenin peut être marquée par l'expression d'une protéine fluorescente tdTomato. Cette nouvelle lignée de souris knock-in nous a permis d'analyser la cinétique de l'expression de Myogenin lors de la différenciation cellulaire in vitro et d'effectuer des expériences préliminaires in vivo par imagerie intravitale. De plus, bien que toutes les SCMu de souris soient caractérisées par l'expression du facteur de transcription Pax7, plusieurs études ont décrit des différences de prolifération, de capacité de transplantation et de sensibilité à la maladie entre les SCMu des muscles crâniens et des membres. Pour étudier les réseaux de régulation des gènes qui régissent cette hétérogénéité fonctionnelle, nous avons combiné des analyses transcriptomiques sur cellules uniques avec des approches de biologie cellulaire utilisant des lignées de souris rapportrices pour identifier les régulateurs clés qui confèrent des propriétés distinctes aux SCMu à haute-performance (extraoculaires) et à faible-performance (tibialis antérieur) en quiescence et lors de l'activation. Nous avons identifié un retard dans la différenciation des SCMu extraoculaires en culture, accompagné par l'expression de facteurs de remodelage de la matrice extracellulaire et de récepteurs membranaires distincts et nous avons validé l'expression de certains de ces candidats au niveau protéique. Des analyses informatiques avancées ont mis en évidence la dynamique sous-jacente au maintien d'une population de progéniteurs dans les SCMu extraoculaires, contrôlée par un réseau singulier de facteurs de transcription formant un module de molécules co-régulées. En conclusion, ces études apportent de nouvelles informations sur les mécanismes qui octroient des propriétés différentes des cellules souches musculaires venant d'emplacements anatomiques distincts
Adult skeletal muscle has a remarkable regenerative capacity, being able to recover after repeated trauma. This property depends on the presence of muscle stem cells (MuSCs), which are mostly quiescent in homeostatic conditions, re-enter the cell cycle after injury and proliferate to give rise to committed myoblasts that will eventually fuse to restore the damaged fibres. Numerous studies have investigated the cell state transitions that MuSCs undergo from cell cycle entry to differentiation. Although several genetically modified reporter mice have been generated to study these events, detailed studies on the initiation of differentiation, which is generally defined by expression of the myogenic regulatory factor Myogenin, have been hampered by the lack of a reliable reporter mouse. Therefore, we developed a fluorescent reporter line where differentiating myogenic cells expressing Myogenin are marked by the expression of a tdTomato fluorescent protein. This novel knock-in mouse line allowed us to monitor the kinetics of Myogenin expression during cell differentiation in vitro, and perform preliminary experiments on the behaviour of myogenic cells in vivo by intravital imaging. Although all mouse MuSCs are characterised by the expression of the transcription factor Pax7 and they share several properties, some studies have reported differences in proliferation, engraftment ability, and sensitivity to disease of MuSCs from cranial and limb muscles. To investigate the gene regulatory networks that govern this functional heterogeneity, we have integrated single-cell transcriptomic analyses with cell biology approaches using mouse reporter lines to identify key regulators that confer distinct properties to high performing (extraocular muscles) and lower performing (limb, Tibialis anterior muscle) MuSCs in quiescence and activated states. We identified a delayed lineage progression of extraocular MuSCs in culture that was accompanied with the expression of distinct extracellular matrix remodelling factors and membrane receptors, and we validated the expression of some of these candidates at the protein level. Advanced computational analyses highlighted the dynamics underlying the maintenance of a stem-like progenitor population in extraocular MuSCs, controlled by a singular network of transcription factors acting as a co-regulating module. Taken together, these studies provide novel insights into the mechanisms underlying the differential properties of muscle stem cells in distinct anatomical locations

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Labrunie, Antoine. „Matériaux « uniques » pour cellules solaires organiques mono-composant“. Thesis, Angers, 2017. http://www.theses.fr/2017ANGE0044/document.

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Au cours des dernières années, le développement des cellules organiques à réseaux interpénétrés a permis d’améliorer les rendements de conversion photovoltaïque (PV). Ces dispositifs incorporent une couche active constituée d’un mélange d’un matériau donneur d’électron (D) et d’un matériau accepteur d’électron (A). La réalisation de ces cellules requiert une optimisation minutieuse de ce mélange et de la morphologie de cette couche photo-active qui en résulte. Cette dernière peut cependant évoluer spontanément vers une ségrégation de phase, généralement délétère pour les performances PV. Une solution possible, et relativement peu étudiée, consiste à lier chimiquement le donneur D et l’accepteur A par un espaceur non-conjugué. Les travaux décrits dans ce manuscrit portent sur la synthèse et la caractérisation d’assemblages moléculaires de type D-σ-A ainsi que leur utilisation comme matériau dit « unique » pour la fabrication de cellules solaires organiques mono composant. Une première famille de dyades et triades à base d’un bloc donneur de type quaterthiophène a été étudiée. Cette partie décrit la méthodologie générale d’assemblage des blocs D et A via une réaction de cycloaddition de type Huisgen. Au cours des chapitres suivant, plusieurs dyades basées sur un bloc donneur « push-pull » ont été synthétisées puis caractérisées. Les performances PV de ces composés ont été évaluées au sein de cellules solaires mono-composant et les meilleurs rendements de conversion, atteignant 1.4 %, rivalisent avec l’état de l’art
Over the last few years, the development of bulk heterojunction organic solar cells (BHJ OSCs) led to significant increase in photovoltaic (PV) efficiency. Such devices are based on interpenetrated networks of an electron-donor material (D) and an electron-acceptor material (A) constituting the active layer. Nevertheless a careful optimization of the morphology is required to reach high power conversion efficiency. Furthermore, this optimized morphology can evolve towards spontaneous phase segregation which can be detrimental for the PV performances. To circumvent these limitations, a relatively unexplored approach relies on the use of a material where the donor and the acceptor moieties are covalently linked to each other through a nonconjugated π-connector. In this context, the work reported herein describes the synthesis and characterization of various molecular D-σ-A assemblies, as well as their preliminary evaluation as “unique” material for the realisation of single component organic solar cells (SC-OSCs). A first family of dyads and triads, based on quaterthiophene moieties as donor block, was studied. A general methodology to assemble the two D and A blocks via a Huisgen-type click-chemistry is described. Then, in the next chapters, several dyads based on a “push-pull” donor block have been synthesized and characterized. The PV performances of these compounds have been evaluated in SC-OSCs leading to power conversion efficiency up to 1.4 %, a value close to the state of the art

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Geisler, Hubert. „Structuration d'hydrogels thermoactivables pour l'analyse de cellules uniques“. Electronic Thesis or Diss., Université Paris sciences et lettres, 2020. http://www.theses.fr/2020UPSLS001.

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Dans cette thèse est présentée une nouvelle technologie microfluidique de capture de cellules uniques basée sur l’utilisation d’hydrogels thermoactivables. Nous utilisons notamment le PolyNIPAM, un polymère dont le volume est augmenté dans l'eau de 400% lorsque la température est inférieure à 32°C et est dégonflé lorsque la température est supérieure à 34°C. Nous exploitons ce gonflement réversible pour ouvrir et fermer des compartiments intégrés dans une chambre microfluidique.Le greffage et la structuration de ces motifs d’hydrogel repose sur la chimie click thiol-ène, initiée par voie thermique ou par irradiation UV. Nous avons développé des méthodes et procédés de microfabrication dans le but de diversifier les substrats d’accroche (du verre vers le PDMS, COC, PMMA, etc), d’élargir la gamme des épaisseurs des structures réalisables (de quelques microns vers la dizaine de microns d’épaisseur) et de renforcer nos connaissances concernant l'incidence de la fabrication sur le comportement de l’hydrogel. Un protocole de photolithographie robuste est finalement obtenu permettant le design de toute sorte de motif 2D sur différents choix de substrat. Une application possible détaillée par la suite est le développement de ces puces microfluidiques capables de capturer des cellules uniques dans des compartiments en hydrogel. (confidentiel)
We present in this work a new microfluidic technology aiming at isolating single cells by the use of thermoactuable polymers. One of the polymers we use is polyNIPAM, a polymer that can expand its volume by 400% in water when the temperature is set under 32°C and can shrink down when it is set over 34°C. We use this reversible swelling capability to open and close compartments embedded in a microfluidic chip.Grafting and structuring these hydrogel features relies on thiol-en click chemistry, initiated thermally or by UV irradiation. We have developed methods and microfabrication protocols in order to diversify the substrate materials (from glass to PDMS, COC, PMMA, etc), to expand the structures thickness range (from few microns to a tenth of microns) and to strengthen our knowledge regarding the fabrication impact on the hydrogel’s behavior. A robust protocol of photolithography has finally been worked on allowing the design of any type of 2D features on a large choice of substrates.One of the realistic applications detailed here is the development of microfluidic chips aiming at isolating single cells in hydrogel compartments. (confidential)

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Vianay, Benoit. „Adhérence de cellules uniques sur supports micro-structurés“. Phd thesis, Grenoble 1, 2009. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00455350.

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L'adhérence cellulaire est un processus vital impliqué dans de nombreux phénomènes biologiques fondamentaux comme la diérenciation, la réparation tissulaire ou encore le développement cellulaire. Cette thèse porte sur une étude alliant expériences et modélisation de cellules uniques en adhérence sur des supports micro-structurés Les résultats montrent que la contrainte géomé- trique imposée par les supports à contraste adhésif limite l'adhérence. Au-delà de cette limitation, une organisation reproductible du cytosquelette d'actine est observée cela suggère l'existence de lois physiques simples régissant ce processus. Nous avons développé une méthode de classication des formes géométriques élémentaires observées expérimentalement nous permettant d'obtenir des statistiques robustes. En nous basant sur le modèle de Potts Cellulaire, nous avons pu reproduire les résultats expérimentaux. Ce modèle énergétique démontre que les formes élémentaires sont des états métastables utilisés par les cellules au cours de l'adhérence. Les paramètres du modèle sont reliés aux paramètres biologiques pertinents. Nous présentons des résultats qui relient la courbure des interfaces aux paramètres biologiques. Nous montrons que la mesure expérimentale de cette courbure est une représentation de la compétition entre la contractilité des bres de stress et l'élasticité du gel d'actine. Une correspondance entre les propriétés physiques issues du modèle et les processus biochimiques régulant et organisant l'adhérence cellulaire est ainsi possible.

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Vianay, Benoit. „Adhérence de cellules uniques sur supports micro-structurés“. Phd thesis, Grenoble 1, 2009. http://www.theses.fr/2009GRE10329.

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L'adhérence cellulaire est un processus vital impliqué dans de nombreux phénomènes biologiques fondamentaux comme la diérenciation, la réparation tissulaire ou encore le développement cellulaire. Cette thèse porte sur une étude alliant expériences et modélisation de cellules uniques en adhérence sur des supports micro-structurés Les résultats montrent que la contrainte géomé- trique imposée par les supports à contraste adhésif limite l'adhérence. Au-delà de cette limitation, une organisation reproductible du cytosquelette d'actine est observée cela suggère l'existence de lois physiques simples régissant ce processus. Nous avons développé une méthode de classication des formes géométriques élémentaires observées expérimentalement nous permettant d'obtenir des statistiques robustes. En nous basant sur le modèle de Potts Cellulaire, nous avons pu reproduire les résultats expérimentaux. Ce modèle énergétique démontre que les formes élémentaires sont des états métastables utilisés par les cellules au cours de l'adhérence. Les paramètres du modèle sont reliés aux paramètres biologiques pertinents. Nous présentons des résultats qui relient la courbure des interfaces aux paramètres biologiques. Nous montrons que la mesure expérimentale de cette courbure est une représentation de la compétition entre la contractilité des bres de stress et l'élasticité du gel d'actine. Une correspondance entre les propriétés physiques issues du modèle et les processus biochimiques régulant et organisant l'adhérence cellulaire est ainsi possible
The cell adhesion is a critical process involved in many fundamental biological phenomena as dierentiation, tissue repair or cell development. This thesis focuses on a study combining experiments and modelization of single cells spreading on micro-fabricated substrates. Experimental results show that the geometrical constraint imposed by the adhesiveness contrast limits the adhesion. Beyond this limitation, a reproducible organization of the actin cytoskeleton of cells spreading on micro-structured materials suggests that simple physical laws govern the process. We have developed a classication method of basic geometrical shapes observed experimentally to obtain robust statistics. Based on the Cellular Potts model, we reproduced experimental results. This energetical model shows that the basic shapes are metastable states used by cells during spreading. The model parameters are linked to relevant biological parameters. We present results that connect the curvature of interfaces to biological parameters. We show that the experimental measurement of this curvature represents the competition between the contractility of stress bers and the elasticity of the actin gel. A correspondence between the physical properties in the model and the biochemical processes that regulate and organize the cellular adhesion is possible

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Lombard, Alain. „QuanTI-FRET, un outil d'imagerie pour l'analyse de la mécanotransduction dans les cellules vivantes uniques“. Thesis, Université Grenoble Alpes, 2020. http://www.theses.fr/2020GRALY055.

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De nombreux processus cellulaires élémentaires (migration, différentiation, mort) sont contrôlés par des ensembles d'acteurs reliés entre eux par des réactions en cascade. Certains de ces réseaux de signalisation convertissent des signaux mécaniques extérieurs à la cellule en signaux biochimiques internes, processus appelé mécanotransduction. Nous cherchons à étudier ces réseaux dans une approche de traitement du signal, pour déterminer expérimentalement un analogue de la fonction de transfert en espace et temps pour la mécanotransduction.Le contrôle de la variable d'entrée mécanique est assuré par différents types de substrats 2D que nous avons mis en place, comme la simple surface de verre, des motifs géométriques d'adhérence, et des substrats magnéto-actifs (composés de micro-piliers insérés dans un élastomère) pouvant stimuler localement et dynamiquement les cellules.La mesure de la variable de sortie biochimique est assurée par des biosenseurs FRET. La fluorescence qu'ils émettent est collectée à travers un microscope de fluorescence en champ large inversé. Nous avons mis en place le calcul de l'efficacité de FRET quantitative à partir de cette fluorescence sans l'utilisation de standards de FRET. Elle donne accès à l'activité en espace et en temps de certaines molécules des réseaux de signalisation.Quelques outils sont enfin présentés comme potentiels candidats pour réaliser la fonction de transfert, parmi lesquels des combinaisons de méthodes de corrélations, et la décomposition en valeurs singulières utilisée en acousto-optique. La combinaison de ces outils et méthodes reste complexe, notamment pour mettre en évidence un comportement biologique à partir d'une grandeur quantitative. Les premiers usages de ces outils ne présentent pas de résultat biologique majeur, mais sont prometteurs pour étudier la mécanotransduction
Many elementary cellular processes (migration, differentiation, death) are controled by a set of agents linked together by cascade reactions. Some of these signaling networks convert mechanical signals external to the cell into internal biochemical signals, a process called mechanotransduction. We seek to study these networks through a signal processing approach, in order to experimentally determine an analogous of the transfer function in time and space for mechanotransduction.Controlling the input variable is done by different type of 2D substrates which have been developped, from the simple glass surface, the adherent geometrical patterns, to the magneto-active substrates (composed of micro-pillars inserted into an elastomer) capable of stimulating locally and dynamically the cells.Measuring the biochemical output variable is done by FRET biosensors. The fluorescence emitted is collected through an inverted widefield fluorescence microscope. We set up the quantitative FRET efficiency calculus from this fluorescence without using FRET standards. It gives access to the activity in space and time of some molecules of network signalisation.Some tools are finally presented as potential candidates to perform the transfer function, among them are combination of correlation methods, and singular value decomposition used in acousto-optics. Combiantion of these tools and methods remains complex, particularly to highlight a biological behaviour from a quantitative quantity. The first use of these tools do not give any biological result, but are promising to study mechanotransduction

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Traboulsi, Abdel-Meneem. „Étude à moyen-débit de la localisation d'ARNm dans les cellules humaines“. Thesis, Montpellier, 2017. http://www.theses.fr/2017MONTT117.

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La localisation d’ARNm a été découverte en 1983 dans les ovocytes et les embryons des ascidies. Depuis, plusieurs exemples d'ARN localisés ont été trouvés dans de nombreux organismes, y compris les plantes, les levures, les champignons, les insectes, les poissons et les mammifères. Les ARNm localisés contribuent à de nombreuses fonctions biologiques, telles que le développement embryonnaire, la division cellulaire asymétrique, la migration cellulaire, la signalisation, la plasticité neuronale et plein d’autres ...Jusqu'à présent, quelques études ont analysé la localisation d’ARNm de manière systématique. Trois d'entre eux ont été effectués chez la drosophile pendant l'embryogenèse, l'oogenèse ou le stade larvaire et ont analysé environ 16000 ARN au total. Les deux autres études ont été réalisées dans des cellules de mammifères et ont analysé près de 1000 ARNm chacune. Ces études ont montré l'importance de la localisation d’ARNm dans les cellules humaines et son implication dans différents processus biologiques. L'objectif de ma thèse était donc d'augmenter le débit des techniques FISH à l’échelle de molécule unique (smFISH) et d'étudier la localisation d’ARNm dans les cellules HeLa de manière systématique.Une limitation de smFISH est le coût de sondes fluorescentes, qui limite le nombre d'ARNm qui peut être analysé. Par conséquent, j'ai développé un protocole alternatif dans lequel des sondes pour de nombreux gènes ont été synthétisées comme un pool d'oligonucléotides (40 par gène en moyenne, plus de 12000 au total). Les sondes spécifiques d’un ARNm donné ont ensuite été amplifiées par PCR et converties en simple brin par transcription in vitro. J'ai généré un protocole complet, à partir de la conception de la sonde et jusqu'à l'acquisition de l'image. Je me suis intéressé à l’étude des ARNm du cycle cellulaire. En effet, les gènes du cycle cellulaire ont été largement étudiés au niveau de la protéine, mais on sait peu de choses sur la localisation de leurs ARNm. Pendant la mitose, les cellules subissent d'importantes modifications morphologiques et la traduction locale pourrait être un moyen d'atteindre la localisation des protéines. Le screening sur ces ARNm est en cours.Parallèlement à ces expériences, j'ai réalisé des expériences de smFISH sur 100 gènes choisis au hasard et 50 régulateurs de la transition G2/M du cycle cellulaire, en utilisant un protocole de smFISH classique. Dans cette configuration, on disposait d'une collection de lignées cellulaires HeLa, dans laquelle chaque cellule contient un chromosome artificiel bactérien avec le gène d'intérêt marqué au GFP. Par conséquent, en utilisant des sondes qui s'hybridaient à la séquence GFP, je pourrais utiliser le même ensemble de sondes marquées pour étudier la localisation de tous les ARNm. Un autre avantage est que la localisation des protéines pourrait être évaluée simultanément. Mes résultats indiquent que 4 ARNm ont montré une localisation spécifique lors du screening de 100 gènes choisis d’une manière aléatoire et 15 ARNm parmi les 54 régulateurs de la transition G2 / M. Ces ARNm appartiennent à cinq classes de localisation: "blobs", qui sont des agrégats d'ARNm cytoplasmiques; «clusters», qui sont des zones de concentration locale élevée d'ARNm, mais où une molécule unique d’ARNm peut encore être résolu; «nuclear membrane », où les ARNm se concentrent autour de l'enveloppe nucléaire; "spindle", qui sont des ARNm accumulés sur l'appareil de division mitotique, “spots" qui sont des agrégats d'ARNm cytoplasmiques où une molécule unique d’ARNm ne peut pas être résolu, et qui sont plus grands que les blobs. La colocalisation entre l'ARNm et la GFP, qui suggère une traduction locale, n'a été trouvée que pour 1 ARNm.Ces screenings aléatoires et ciblés effectués à petite échelle montrent une fréquence et une diversité inattendues dans les modèles de localisation d’ARNm. Cela ouvre la voie pour effectuer des screenings à plus grande échelle
MRNA localization was discovered in 1983 in ascidian oocytes and early embryos. Since then many examples of localized RNAs have been found in many organisms, including plants, yeast, fungi, insects, fish and mammals. Localized mRNAs contribute to many biological functions, such as embryonic patterning, asymmetric cell division, cell migration, signaling, neuronal plasticity and others…Until now, only few studies analyzed RNA localization in a systematic manner. Three of them were done in Drosophila, during embryogenesis, oogenesis or larval stage and analyzed around 16000 mRNAs in total. The two other studies were done in mammalian cells and analyzed nearly 1000 mRNAs each. These studies opened a door and raised questions regarding the importance of mRNA localization in human cells and its implication in different biological processes. The goal of my thesis was thus to increase the throughput of single molecule FISH techniques (smFISH) and to study mRNA localization in HeLa cells in a systematic manner.One limitation in smFISH is the cost of the fluorescent oligonucleotide probes, which limits the number of mRNAs that can be analyzed. Therefore, I developed an alternative protocol in which probes for many genes were synthesized as a pool of oligonucleotides (40 per gene in average, more than 12000 in total). Gene-specific probes were then amplified by PCR and converted into single strand by in vitro transcription. I generated a complete protocol, starting from probe design and up to image acquisition. I was interested in studying cell cycle genes. Indeed, cell cycle genes have been extensively studied at the protein level but little is known concerning the localization of their mRNAs. During mitosis, cells go through important morphological modifications and local translation could be a mean of achieving protein localization. This screen is ongoing.In parallel to these experiments, I performed a smFISH based screen on 100 randomly chosen genes and 50 regulators of the G2/M transition of the cell cycle, using a traditional smFISH protocol. In this set-up, I took advantage of a library of HeLa cell lines, in which each cell line contains a bacterial artificial chromosome with the gene of interest tagged with GFP. Therefore, using oligonucleotides hybridizing to the GFP sequence, I could use the same probe set to study the localization of all the tagged mRNAs. A further advantage is that protein localization could be assessed simultaneously. My results indicate that two mRNAs showed a specific localization when screening 100 random genes, and 16 mRNAs among the 50 regulators of the G2/M transition. These mRNAs belong to five localization classes: "blobs", which are cytoplasmic mRNA aggregates; "clusters", which are areas of high local mRNA concentration but where individual mRNA can still be resolved; "nuclear envelope", where mRNAs concentrate around the nuclear envelope; "spindle", which are mRNAs accumulating on the cell division apparatus during mitosis, “spots" which are cytoplasmic mRNA aggregates where individual mRNA can’t be resolved and are bigger than blobs. Interestingly, colocalization between mRNA and GFP, which suggests local translation, was only found for 1 mRNA.These random and targeted screens performed at small-scale show an unexpected frequency and diversity in mRNA localization patterns, therefore pointing to new functions related to this process. This will stimulate future studies aiming at performing screenings at a higher scale

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Bertrand, Sarah. „Séquençage ciblé en tant qu'outil diagnostique et pronostique dans le lymphome à cellules du manteau“. Thesis, Université Grenoble Alpes (ComUE), 2017. http://www.theses.fr/2017GREAV033.

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Le lymphome est un cancer des ganglions lymphatiques, lieu de prolifération et différenciation des cellules immunitaires en particulier des lymphocytes B qui sont des cellules productrices d'anticorps. Les lymphomes résultent de l’accumulation de mutations génétiques dans le génome d’une cellule B normale contribuant à la transformation en cellule B maligne. Cette cellule B dite transformée prolifère alors pour engendrer un clone de cellules B malignes qui s’accumulent au niveau des ganglions lymphatiques, formant alors une tumeur appelée ‘lymphome B’ (pour cancer lymphoïde issu de la transformation maligne des lymphocytes B). Le ganglion lymphatique normal a une structure histologique qui se décompose ainsi, du centre à la périphérie : le centre germinatif, la zone du manteau et la zone marginale. Les lymphomes B sont classés en différents sous-types histologiques en fonction de leur origine topographique au niveau du ganglion lymphatique et de leurs caractéristiques bio cliniques spécifiques. Parmi ces sous-types, une forme particulièrement agressive peut être distinguée : le lymphome à cellules du manteau. Ce sous-type de lymphome est caractérisé par des rechutes successives et une survie qui est généralement courte (médiane de survie de 4 à 5 ans) même si certains patients, avec des formes plus indolentes de lymphomes à cellules du manteau, présentent des survies prolongées (médiane de survie de 7 à 10 ans). Des biomarqueurs prédictifs de la courte survie manquent aujourd’hui, ce qui rend difficile la prise en charge optimisée des patients. Ce projet s’intéresse à cette question. Plus précisément, nous nous proposons de rechercher des mutations génétiques associées à la résistance thérapeutique. Notre approche sera basée sur le séquençage ciblé à haut débit du génome de cellules B tumorales issus de patients présentant des cas classiques du lymphomes à cellules du manteau mais aussi des cas plus particuliers comme ceux présentant des résistances thérapeutiques précoces, par exemple. Par cette approche dite de ‘cartographie’ à l’échelle du génome, nous espérons identifier des nouveaux prédicteurs moléculaires de la survie chez ces patients atteints de lymphome à cellules du manteau et également apporter de nouvelles connaissances dans l’interconnexion entre la génétique et l’épigénétique dans cette maladie
Lymphoma is a cancer of the lymph nodes which are organs in which immune cells, particularly the antibody producing B cells, proliferate and differentiate before circulating in the blood and tissues to fight infection. B cell lymphoid cancers – ‘B cell lymphoma’ arise as a consequence of the occurrence of gene mutations in B cells. By affecting the functions of key B cell genes, these mutations drive the malignant transformation of the affected B cells which then begin to divide abnormally eventually destroying normal lymph node organization and function. The lymph node is divided into distinct micro-anatomical compartments or zones which are called (from the inner to outer most compartment – germinal centre, mantle zone, and marginal zone). B cell lymphoma classification follows this general organization and classifies tumours depending on the compartment of origin of the particular tumour B cell population. This classification thus defines lymphoma according to a ‘histological subtype’ with defined clinic-biological features. Among these subtypes, mantle cell lymphoma (MCL) is a particularly aggressive form of B lymphoid cancer. This type of lymphoma is characterised by successive relapses and short survival (median is 4 to 5 years), although some patients can show long survival. Predictive biomarkers of this clinical behavior are lacking. This project aims to address this question. More specifically we propose to perform whole ‘exome’ sequencing – i.e. sequencing of all protein coding sections of all known protein coding genes in the genome – of the tumour B cell DNA from patients who show refractory or early relapsing disease compared to patients who show relatively long survival. By doing this genome scale study we hope to identify new gene mutations that can serve as molecular predictors of survival and bring new knowledges in the understanding between genetics and epigenetics in MCL

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Ozier-Lafontaine, Anthony. „Kernel-based testing and their application to single-cell data“. Electronic Thesis or Diss., Ecole centrale de Nantes, 2023. http://www.theses.fr/2023ECDN0025.

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Les technologies de sequençage en cellule unique mesurent des informations à l’échelle de chaque cellule d’une population. Les données issues de ces technologies présentent de nombreux défis : beaucoup d’observations en grande dimension et souvent parcimonieuses. De nombreuses expériences de biologie consistent à comparer des conditions.L’objet de la thèse est de développer un ensemble d’outils qui compare des échantillons de données issues des technologies de séquençage en cellule unique afin de détecter et décrire les différences qui existent. Pour cela, nous proposons d’appliquer les tests de comparaison de deux échantillons basés sur les méthodes à noyaux existants. Nous proposons de généraliser ces tests à noyaux pour les designs expérimentaux quelconques, ce test s’inspire du test de la trace de Hotelling- Lawley. Nous implémentons pour la première fois ces tests à noyaux dans un packageR et Python nommé ktest, et nos applications sur données simulées et issues d’expériences démontrent leurs performances. L’application de ces méthodes à des données expérimentales permet d’identifier les observations qui expliquent les différences détectées. Enfin, nous proposons une implémentation efficace de ces tests basée sur des factorisations matricielles de type Nyström, ainsi qu’un ensemble d’outils de diagnostic et d’interprétation des résultats pour rendre ces méthodes accessibles et compréhensibles par des nonspécialistes
Single-cell technologies generate data at the single-cell level. They are coumposed of hundreds to thousands of observations (i.e. cells) and tens of thousands of variables (i.e. genes). New methodological challenges arose to fully exploit the potentialities of these complex data. A major statistical challenge is to distinguish biological informationfrom technical noise in order to compare conditions or tissues. This thesis explores the application of kernel testing on single-cell datasets in order to detect and describe the potential differences between compared conditions.To overcome the limitations of existing kernel two-sample tests, we propose a kernel test inspired from the Hotelling-Lawley test that can apply to any experimental design. We implemented these tests in a R and Python package called ktest that is their first useroriented implementation. We demonstrate the performances of kernel testing on simulateddatasets and on various experimental singlecell datasets. The geometrical interpretations of these methods allows to identify the observations leading a detected difference. Finally, we propose a Nyström-based efficient implementationof these kernel tests as well as a range of diagnostic and interpretation tools

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Savatier, Pierre. „Structure et évolution du segment intergénique séparant les gènes de globines Delta et Beta chez les mammifères : l'origine du polymorphisme du gène de globine Beta dans les populations humaines“. Lyon 1, 1986. http://www.theses.fr/1986LYO19034.

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Blayo, Philippe. „Une approche comparative combinatoire pour la prédiction de gènes chez les eucaryotes“. Marne-la-Vallée, 2003. http://www.theses.fr/2003MARN0159.

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Ce travail porte sur un problème de traitement informatique des génomes qui consiste à prédire les gènes dans les génomes d'organismes eucaryotes. Plus spécifiquement, on cherche à déterminer avec précision les régions qui codent pour des protéines. Une des manières d'aborder le problème est d'utiliser la comparaison de séquences en se servant du fait que les parties codantes des séquences (exons) sont mieux conservées que les parties non codantes et qu'elles sont délimitées par des signaux. On commence par présenter les différentes méthodes qu'on peut relier à ce problème. On décrit ensuite une nouvelle méthode qui envisage un gène comme un assemblage d'exons qui ne sont pas indépendants. Cette méthode se veut aussi générique que possible, prend en compte de possibles erreurs de séquençage et possède une complexité quadratique en temps et linéaire en espace. Elle a été mise en oeuvre au sein du programme «utopia» qui a été testé sur différents jeux de séquences réelles
This work deals with a computational genome processing problem : eukaryotic gene prediction. More specifically, we try to determine with accuracy the regions coding for proteins. It is possible to use sequence comparison due to the fact that coding regions (exons) are in general more conserved than non coding regions and are delimited by signals. We first present different methods related to this problem. Then we describe a new method which considers a gene as an assembly of exons that are not independent. This method tries to be as generic as possible, takes possible sequencing errors into account and requires quadratic time and linear memory space. It is implemented in the «utopia» software which was tested on different real sequences sets

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Saviano, Antonio. „Physiopathologie du foie à l'échelle de la cellule unique : caractérisation de l'hétérogénéité cellulaire et identification de nouvelles cibles thérapeutiques dans les maladies hépatiques chroniques et le cancer hépatocellulaire“. Thesis, Strasbourg, 2019. http://www.theses.fr/2019STRAJ093.

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Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est parmi les principales causes de mortalité dans le monde et les traitements disponibles sont insuffisants. Ceci est dû à la connaissance limitée de la complexité biologique et du microenvironnement hépatiques en situation normale et pathologique. Pour répondre à ces besoins, nous avons développé un protocole de séquençage d’ARN sur cellule unique (scRNA-seq) à partir de tissus primaires de foie humain. Nous avons assemblé un atlas de cellules du foie humain et comparé le profil scRNA-seq du foie normal au profil du CHC. L’atlas a révélé l’hétérogénéité au sein des principales populations de cellules hépatiques, la zonation transcriptomique des cellules endothéliales et l'existence de progéniteurs épithéliaux dans le foie adulte capable de se différencier à la fois en cholangiocytes et en hépatocytes. L'analyse par scRNA-seq du CHC a dévoilé l'hétérogénéité marquée de cette tumeur, les modifications de son microenvironnement cellule par cellule et les interactions entre les cellules tumorales et le virus de l’hépatite B en découvrant des voies et des facteurs moteurs de la cancérogenèse hépatique jusque-là inconnus
Hepatocellular carcinoma (HCC) is a leading cause of death worldwide and the current treatments are unsatisfactory. One reason is the limited knowledge on the complexity and microenvironment of healthy and diseased liver. To address this gap, we have developed a single cell RNA sequencing (scRNA-seq) pipeline for primary human liver tissues. We have assembled an atlas of human liver cells and compared the scRNA-seq profile of normal liver and HCC. The atlas revealed an unknown heterogeneity within the main populations of liver cells, the transcriptomic zonation of endothelial cells and the existence of an epithelial progenitor in the adult liver capable of differentiating into both cholangiocytes and hepatocytes. ScRNA-seq analysis uncovered the marked cell heterogeneity of HCC, its microenvironment changes at single-cell level and the interactions between tumor cells and hepatitis B virus discovering previously unknown pathways and drivers of hepatocarcinogenesis

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Eisele, Almut. „La cinétique de différentiation des cellules souches hématopoïétiques uniques après transplantation : l´état d´équilibre et l´effet de la cytokine érythropoïétine“. Thesis, Paris Sciences et Lettres (ComUE), 2019. https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-03028817.

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La majorité des cellules de notre corps sont des cellules hématopoïétiques. Un petit nombre de cellules souches hématopoïétiques produit toutes ces cellules par divisions de maintenance and différentiation. Il a longtemps été considéré que ces cellules souches étaient une population homogène et que chaque cellule produit le même nombre et type de cellule hématopoïétique mature. Cette idée a été réfutée quand il est devenu possible de suivre la différentiation de cellules uniques. Ainsi les cellules hématopoïétiques souches individuelles produisent différents types et quantités relatives de cellules hématopoïétiques matures, amenant la reconstitution après transplantation des cellules souches peut être hétérogène. Quelques cellules qui expriment les marqueurs de cellules souche hématopoïétique survivent uniquement pour une courte durée après transplantation, d’autres pour des années.Dans cette thèse, nous avons utilisé la technique de traçage de lignée des codes-barres cellulaires pour comprendre comment les différents types de cellules souches hématopoïétiques se comportent dans les six premières semaines après transplantation et l’influence de la cytokine érythropoïétine sur ce processus. Les codes-barres cellulaires sont des fragments artificiels d’ADN qui sont introduit dans les cellules souches hématopoïétiques murines par transfection virale. Après transplantation de cellules souche hématopoïétique barcodées de cette manière, chaque division cellulaire va transmettre le code-barre aux cellules filles. Par l’analyse des codes-barres dans les cellules hématopoïétiques matures on peut ainsi comprendre quels types et quelles quantités relatives de cellules matures les cellules souches hématopoïétiques ont produites. Nous avons observé que certaines cellules souches contribuaient de manière stable dans les premières semaines après transplantation, ainsi qu’une succession clonale. Des différences au niveau de la production de différents types de cellules hématopoïétiques matures a aussi été observées. Les globules rouges sont produits par des clones de vie courte et les cellules myéloïdes par des clones stables sur 6 semaines. Le traitement des cellules souches hématopoïétiques avec l’érythropoïétine avant leur transplantation, ne change pas ces phénomènes généraux. Cependant en réponse à l’érythropoïétine, deux types de clones deviennent prépondérants : des clones produisant beaucoup plus de globules rouges et myéloïdes que lymphoïdes, et des clones produisant beaucoup de cellules lymphoïdes et myéloïdes et très peu de globules rouges, suggérant une compensation clonale entre les cellules souches hématopoïétiques. Cet effet était transitoire et disparaît 4 mois après transplantation. Cet effet est dose dépendant en fonction de la concentration d’érythropoïétine.Nous espérons que l’étude détaillée de la différentiation de cellules souches hématopoïétiques uniques wt ou traitées avec l’érythropoïétine après transplantation ait un impact pour notre compréhension pour l’hématopoïèse fondamentale, mais aussi pour des applications cliniques. L’érythropoïétine est utilisée couramment comme médicament. La description détaillée de son effet sur les cellules souches hématopoïétiques est importante pour garantir la sécurité de telles utilisations. De plus, elle peut aider à comprendre les principes généraux de l’actions de cytokines sur les cellules souches hématopoïétiques. La transplantation de cellules souches est utilisée comme traitement dans de nombreuses pathologies. Une phase importante pour le succès d’une transplantation sont les premières semaines quand les niveaux de cellules sanguines ne sont pas encore normalisés. Comprendre quelles cellules produisent quels types de cellules dans cette phase peut servir de base pour le développement de nouvelles stratégies pour raccourcir cette phase critique pour le patient
Hematopoietic cells are the most numerous cells in our body, and their overall short half-life requires their steady production. At the apex of the hematopoietic system resides a small number of hematopoietic stem cells (HSC) which give rise to all mature hematopoietic cell types through self-renewal and differentiation divisions. For long it was assumed that these HSC are a homogeneous population of multipotent cells. Technical advancements, which allowed to trace HSC at the single cell level, revealed however that single HSC behave differently with respect to the number of lineages and the relative amounts of different lineages they produce and are heterogeneous with respect to their long-term engraftment capacity. Notably different lineage restricted and biased cells, as well as cells with long-term and short-term engraftment potential have been identified in the HSC gate. One technique allowing the lineage tracing of single HSC is cellular barcoding, which relies on the introduction of an artificially created DNA fragment, the barcode, in the genome of HSCs through viral transfection. As these barcodes are transmitted to all daughter cells, the analysis of the barcode identity of progeny cells reveals which lineages and how much of each is produced by each individual HSCs.In this thesis we used a new cellular barcoding library to analyze how the different HSC subsets previously described interact and behave in the first six weeks after bulk transplantation, as well as the influence of erythropoietin (EPO) on this process. More in detail, we described the reconstitution kinetics of HSC in the myeloid (M; macrophage, monocytes, neutrophils, eosinophils), lymphoid (B-cells), dendritic cells, megakaryocyte and erythroid lineage (E; erythroblasts) at the single cell level. For the analysis of HSC differentiation towards the erythroid lineage we established the detection of cellular barcodes from RNA. We discovered that HSC clonal succession and clonal stability co-occur in the first weeks after transplantation, but are not evenly distributed over the different hematopoietic lineages. Notably the production of erythroid cells 2-weeks after transplantation was maintained by distinct short-lived HSC clones, while high myeloid cell production after transplantation was guaranteed by long-lived multi-outcome HSCs. In vitro EPO exposure of HSC before transplantation, did not change the overall lineage output of transplanted HSC, or HSC differentiation kinetics, lineage restrictions, and biases at the single cell level in the first six weeks after transplantation. However, after transplantation of EPO-exposed HSC long-lived unbiased multi-outcome HSCs lost preponderance with respect to cellular output. Rather, changing clones of two types of highly biased HSCs, myeloid-erythroid (ME)-biased and myeloid B-cell (MB)-biased HSC, produced now the majority (>60%) of erythroid, myeloid and B-cells. This effect was transient but stable over different EPO concentrations and after in vivo EPO treatment during transplantation. It suggests a functional compensation mechanism at work.We hope the detailed description of the engraftment kinetics of single control and EPO-exposed HSC after bulk transplantation will have relevance both for fundamental research and the clinics

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Mareschal, Sylvain. „Caractérisation multi-omique des Lymphomes B Diffus à Grandes Cellules“. Rouen, 2015. http://www.theses.fr/2015ROUES046.

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Les lymphomes B diffus à grandes cellules (LDGCB) sont des proliférations cancéreuses agressives prenant leur origine dans le système lymphatique, et qui représentent 4000 nouveaux cas par an en France. Si des progrès significatifs ont été réalisés ces dernières années concernant leur prise en charge, un peu plus d’un tiers des patients ne répondent pas aux immuno-chimiothérapies actuelles. Les travaux présentés dans ce mémoire visaient à caractériser ces tumeurs par plusieurs techniques à haut débit, afin de mettre en évidence des altérations somatiques susceptibles d’expliquer ou de faire suspecter dès le diagnostic ce phénotype réfractaire. Sur le plan transcriptomique, la sous-classification en lymphomes « Germinal Center B-cell like » et « Activated B-Cell like » grâce à un nouveau test simple et fiable permet désormais d’identifier les patients atteints de ce second sous-type de moins bon pronostic. Sur le plan génomique, le développement d’outils d’analyse bio-informatique pour les puces CGH a conduit à la confirmation de nombreux gains et pertes de copies dans les génomes de ces tumeurs, et à la caractérisation plus fine de la perte du gène CDKN2A. Sur le plan mutationnel enfin, le séquençage exomique de 14 LDGCB réfractaires a permis de mettre en évidence de nouveaux gènes dont la mutation pourrait expliquer la résistance au traitement. Chacun de ces trois volets a fait l’objet d’un état des lieux bibliographique, et de développements d’outils bio-informatiques qui pourront à l’avenir être également appliqués à d’autres types de cancers
Diffuse large B-cell lymphomas (DLBCLs) are tumors originating in the lymphatic system, accounting for 4 000 new cases per year in France. While much progress has been made regarding their treatment, one of three patients still does not respond to current immuno-chemotherapies. The present work consisted in characterizing these cancers using various high-throughput technologies, in order to identify somatic alterations that could explain this refractoriness or allow it to be suspected at diagnosis. Gene expression profiling had previously identified two subtypes with distinct outcomes, termed « Activated B-Cell like » and « Germinal Center B-cell like », which we were able to identify using a new simple diagnostic test. The development of bioinformatics software to handle CGH array data confirmed several copy number gains and losses in DLBCLs, and led to a more precise characterization of CDKN2A loss. Finally the sequencing of 14 exomes of relapsed or refractory DLBCLs produced an interesting picture of somatic mutations associated with this phenotype, and highlighted several new leads. An extensive review of the bibliography is proposed on each of these three aspects of tumoral genome alteration, as well as several new bioinformatics methods that may be applied to distinct cancer types in a near future

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Chen, Wenli. „Spectroscopie diélectrique hyperfréquence de cellules uniques cancéreuses : de l'optimisation du capteur en sensibilité et répétabilité jusqu'au suivi en temps réel de stimuli chimiques“. Thesis, Toulouse 3, 2016. http://www.theses.fr/2016TOU30219/document.

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La mesure de cellules biologiques constitue une étape de routine dans de nombreuses investigations en biologie. Les techniques actuelles utilisées par les biologistes sont principalement basées sur l'utilisation marqueurs optiques de coloration ou fluorescents, qui fournissent des observations moléculaires et cellulaires très précises et efficaces. Dans ce contexte, la spectroscopie diélectrique micro-ondes pour analyse cellulaire constitue une méthode nouvelle et attrayante, en raison du manque de préparation et manipulation des cellules, sans besoin d'ajout de produits chimiques, qui pourraient interférer avec d'autres constituants cellulaires. Sa compatibilité avec l'analyse de cellules uniques, potentiellement en temps réel, constitue également deux atouts importants de la technique d'analyse. Les travaux de cette thèse ont donc porté sur l'optimisation d'un biocapteur hyperfréquence microfluidique, dédié à la spectroscopie diélectrique de cellules biologiques uniques, et au développement de sa métrologie pour accéder au comportement diélectrique de cellule soumise à des stimuli chimique. Après un état de l'art sur les techniques courantes d'analyse de cellule individuelle, nous nous sommes attachés à optimiser le biocapteur hyperfréquence pour en améliorer les performances en sensibilité et en répétabilité. Ces optimisations ont porté sur le procédé de micro-fabrication, l'architecture du composant, que ce soit au niveau mécanique vis à vis de l'efficacité de blocage d'une cellule unique, mais aussi d'un point de vue électromagnétique avec une étude paramétrique. Ces études ont été validées dans un premier temps expérimentalement par la mesure de billes de polystyrène, modèle diélectrique simplifié par rapport à la complexité d'une cellule biologique, puis sur cellules individuelles vivantes dans leur milieu de culture. Le banc de caractérisation a également été optimisé afin de permettre la mesure diélectrique de cellules au cours du temps, et notamment en réaction à un stimulus d'ordre chimique. La cinétique de réaction d'une cellule unique soumise à de la saponine a été enregistrée automatiquement pour différentes cellules. Ces travaux ouvrent ainsi la voie à l'analyse à l'échelle cellulaire par spectroscopie diélectrique micro-onde de processus biologiques complexes en temps réel
The measurement of biological cells is a routine step in many biological investigations. Current techniques used by biologists are mainly based on staining or fluorescent labelings, which provide very precise and effective molecular and cellular observations. Within this context, the microwave dielectric spectroscopy for cell analysis represents a new and attractive method, due to the lack of cells preparation and manipulation, without adding chemicals that could interfere with other cellular constituents. Its compatibility with the analysis of single-cells, potentially in real-time monitoring, constitute also two major assets of the analysis technique. This PhD thesis therefore focused on the optimization of a microfluidic and microwave based biosensor, which is dedicated to the dielectric spectroscopy of individual biological cells, and the development of its metrology to assess the dielectric behavior of cells subjected to chemical stimuli. After a state of the art on the current techniques available to analyze single cells, we focused on the optimization of the microwave biosensor to improve its performances in terms of sensitivity and repeatability. These optimizations dealt with the microfabrication process, the component architecture through the investigation of single cell loading efficacy as well as an electromagnetic parametric study. These developments were validated first experimentally with the measurement of polystyrene beads, which present a simplified dielectric model compared to the complexity of a biological cell, followed then by living individual cells in their culture medium. The test bench was also optimized to allow the dielectric measurement of cells over time, and especially in response to a chemical stimulus. The reaction kinetics of a single-cell subjected to saponin was recorded automatically for different cells. This work opens the door to single-cell analysis with microwave dielectric spectroscopy of complex biological processes in real-time

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Soule, Pierre. „Etude des mécanismes de translocation des peptides pénétrateurs de cellules (cpp) à l'aide de techniques biophysiques“. Thesis, Paris 6, 2015. http://www.theses.fr/2015PA066563/document.

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La nécessité de délivrer des médicaments directement dans les cellules est grandissante avec le développement des thérapies géniques. Les peptides pénétrants (Cell Penetrating Peptides : CPP) représentent une possibilité pour administrer ces médicaments dans les cellules sans effet délétère sur la membrane. Ce sont des peptides d’une dizaine d’acides aminés, généralement cationiques. Ils sont capables de traverser la membrane cellulaire, et conservent cette propriété lorsqu’une cargaison leur est attachée. Cependant, leurs mécanismes d’entrée ne sont toujours pas tous connus. Nous avons caractérisé quelques aspects des mécanismes permettant aux CPP de traverser directement la membrane plasmique à l’aide de trois techniques biophysiques. i) Nous avons ainsi pu mettre en évidence le rôle des sulfates d’héparane comme partenaire d’adhésion forte du CPP pénétratine, à l’aide d’un outil de mesure de force : le Biomembrane Force Probe. ii) Nous avons montré la possibilité pour la pénétratine de franchir la bicouche lipidique (sans mécanisme cellulaire actif) si celle-ci est suffisamment riche en lipides chargés négativement. Ce passage a été étudié sur bicouches modèles, formées à l’interface entre gouttelettes obtenues par émulsion inverse dans de l’huile en présence de lipides. iii) Pour visualiser la translocation de CPP à l’échelle de la molécule unique nous avons développé un montage original de microscopie à onde évanescente sur bicouche suspendue
Gene therapy relies on an efficient and specific delivery of drugs into targeted cells. For this purpose, the use of carriers that will help the drugs to cross the membrane, without introducing deleterious effect due to the membrane disruption, are promising. A family of such carriers is known as Cell Penetrating Peptides (CPPs). These peptides are short, about ten amino acids, and often cationic. They are able to translocate through the membrane with different cargos and deliver them into the cytosol. However the mechanisms are still, to a great extent, unknown. We used three biophysical techniques to gain insights into the mechanisms leading to the translocation of a CPP. i) We found the heparan sulfates to be the strongest partner of the CPP penetratin at the cell surface. This adhesion has been pointed out using the Biomembrane Force Probe, a force measuring tool. ii) We evidenced the translocation of penetratin through the lipid bilayer (without any cell mechanism) as long as it contains enough negatively charged lipids. This has been carried out using model bilayers formed at the interface between droplets generated by an inverted emulsion: water in an oil and lipid mixture. iii) To view the translocation of CPPs at the single molecule level we developed a total internal reflection fluorescence microscope (TIRFM) on a suspended bilayer

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Franco, Claudio Areias. „Rôle du facteur de réponse au sérum dans les cellules endothéliales“. Paris 7, 2008. http://www.theses.fr/2008PA077158.

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Le facteur de réponse au sérum (SRF) est un facteur de transcription que régule l'expression de gènes du cytosquelette mais aussi des gènes de réponse précoce, dans différents types cellulaires. Au cours de ma thèse de doctorat, j'ai étudié le rôle in vivo de SRF dans les cellules endothéliales (CEs). Nous avons utilisé le modèle Cre/loxP pour inactiver spécifiquement SRF, aussi bien dans l'embryon que chez la souris adulte. Lors de l'étude embryonnaire, nous avons utilisé la lignée de souris transgénique Tie1-Cre pour cibler l'inactivation de SRF dans les CEs dès 8,5 jours du développement (E8,5). Les stades précoces de la vasculogenèse et de l'angiogenèse ne sont affectés par la perte de SRF. Par contre, la délétion de SRF dans les CEs induit dès E10,5 des défauts dans la ramification du réseau capillaire et une diminution de la densité vasculaire. Nous avons observé une diminution du nombre de filopodes des Ces bourgeonnantes et aussi un défaut dans le cytosquelette d'actine. Nous avons également observé un défaut majeur dans les jonctions interendothéliales. Ces défauts dans la cytoarchitecture cellulaire ont été corrélés avec une diminution de la capacité migratrice des CEs in vivo et in vitro. Le défaut dans la migration et la désorganisation du réseau vasculaire induit des microanévrismes, qui peuvent être à l'origine de la formation d'anévrismes plus conséquents et des hémorragies à des stades plus avancées du développement et à la mort embryonnaire environ à E14,5. L'expression de plusieurs gènes est diminuée dans les CEs, incluant l'actine-b et la VE-cadhérine. De plus, nous avons démontré que SRF été un effecteur important de la voie du VEGF et FGF dans les CEs et que dans ce contexte SRF joue un rôle important pour la régulation de la transcription de la VE-cadhérine dans les CEs. Lors de l'étude chez les souris adultes, nous avons utilisé la lignée transgénique SCL/Tal1-CreERT2 pour inactiver SRF dans les CEs adultes. Nous avons montré que SRF est important pour l'angiogenèse par bourgeonnement dans la rétine, dans le modèle d'implant de Matrigel ou encore dans le modèle d'angiogenèse de la cornée. De plus, nous avons démontré que l'inactivation de SRF dans les CEs diminue l'angiogenèse tumorale et par conséquent la croissance des tumeurs in vivo. L'ensemble des résultats obtenus au cours de ma thèse m'a permis d'établir que SRF a un rôle crucial dans le processus d'angiogenèse par bourgeonnement et dans le maintien de l'intégrité vasculaire
Serum response factor (SRF) is a transcription factor that regulates the expression of cytoskeleton genes and immediate early genes, in different cell types. During my PhD training, I have studied the in vivo role of SRF in endothelial cells (ECs). We have used the Cre/loxP System to inactivate specifically SRF in ECs, both embryo and adult mouse. In the embryonic study, we used the transgenic Tie1-Cre mouse line to target SRF inactivation in ECs since 8. 5 days of mouse embryo development (E8. 5). The early stages of vasculogenesis and angiogenesis are not affected by the loss of SRF. However, from E10. 5 onwards EC-specific loss of SRF leads to a reduction in capillary density and in number of branching points. Although the number of tip cells was not affected in mutants, there was a reduction in filopodia protrusion number and the actin cytoskeleton was disorganized. We also observed a major defect in the endothelial cell junctions. These defects in cellular cytoarchitecture were correlated with an in vivo and in vitro reduction in migrating capacity of ECs. The defect in migration and disorganization of the vascular network induced the formation of microaneurisms, which could be at the origin to the formation of more severe aneurisms and haemorrhages, at latter development stages and to embryonic death approximately with E14. 5. The expression of several genes is decreased in ECs, including the p-actin and VE-cadherin. Moreover, we showed that SRF is important for the VEGF and FGF signalling pathways in ECs, and in this context SRF plays a major role in the regulation of the transcription of p-actin and VE-cadherin in ECs. In the adult mice, we used the transgenic line SCL/Tal1-CreERT2 to inactivate SRF in the ECs. We showed that SRF is involved in sprouting angiogenesis in the mouse retina, but also in the model of Matrigel plug or in the model of corneal angiogenesis. Moreover, we showed that the inactivation of SRF in ECs decreases tumour-induced angiogenesis and consequently decreases the tumor growth in vivo. Taken together, the results obtained during my thesis allow me to establish that SRF has a crucial role in the process of sprouting angiogenesis and in the maintenance of the vascular integrity

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Laplatine, Loïc. „Résolution spatiale en microscopie par résonance de plasmon de surface à couplage par prisme“. Thesis, Grenoble, 2014. http://www.theses.fr/2014GRENY044/document.

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La microscopie par résonance de plasmon de surface (SPR) à couplage par prisme a vu le jour à la fin des années 60. Le principal avantage de cette technique d'imagerie optique réside dans sa très grande sensibilité à de faibles variations d'indice optique ou d'épaisseurs à la surface d'un métal. De ce fait, le suivi d'interactions biologiques peut se faire en temps réel sans avoir recours à l'utilisation de marqueurs fluorescents ou enzymatiques. Depuis plus de 30 ans, la microscopie SPR s'est imposée comme la technique de référence de biodétection sans marquage. Ses champs d'application vont de la détermination de constantes d'affinité à la détection de bactéries pathogènes, en passant par la biologie cellulaire. Jusqu'à présent, on pensait la résolution spatiale limitée par la longueur de propagation des plasmons de surface. Or, de nombreux exemples ne corroborent pas cette hypothèse. Dans cette thèse, nous montrons qu'à ce phénomène de propagation se rajoute des aberrations optiques induites par l'utilisation d'un prisme pour coupler la lumière et les plasmons de surface. Nous expliquons ainsi pourquoi les résolutions expérimentales étaient souvent bien moins bonnes que celles attendues. Par l'analyse de la formation des images et la quantification des aberrations, nous aboutissons à deux nouvelles configurations optiques optimisées pour la résolution. Nous analysons ensuite quel métal offre le meilleur compromis entre longueur de propagation et sensibilité. Expérimentalement, nous obtenons une résolution comprise entre 1,5 et 4 μm suivant la direction, sur des champs de vision de plusieurs mm2, et ce, avec une sensibilité standard en biodétection. Nous sommes ainsi en mesure d'observer simultanément plusieurs milliers de cellules individuelles, eucaryotes et procaryotes. Finalement, nous développons un prototype dédié au suivi en temps réel de sécrétions de protéines par des cellules immunitaires. Les limites de la microscopie SPR et les solutions qui permettraient de faire aboutir ce type d'étude sont examinées. Des études préliminaires sont aussi menées sur l'amélioration de la détection de bactéries
Prism-based surface plasmon resonance (SPR) microscopy is an optical imaging technique invented in the late 60s'. Its main advantage lies in its high sensitivity to optical index or thickness variations at a metal surface. Therefore, the monitoring of biological reactions can be performed in real-time without labeling agent such as fluorescence or enzymes. Over the last 30 years, SPR microscopy has become the major technique in label-free biodetection. The field of application range from the determination of affinity constant in biochemistry to the detection of pathogenic bacteria via cellular biology. Until now, the propagation length of the surface plasmons has been considered as the spatial resolution limit. However, many examples do not support this statement. In this PhD thesis, we demonstrate that the resolution is also limited by optical aberrations induced by the prism used to couple light and surface plasmons. Thus, we are able to explain why the experimental resolution was usually worse than the predicted one. The analysis of the image formation and the quantification of aberrations lead us to suggest two new optical configurations optimized for resolution. We also analyze which metal exhibits the better trade-off between propagation length and sensitivity. Experimentally, we obtain a resolution between 1.5 and 4 μm depending on the direction, on field-of-view up to several mm2, and with a standard sensitivity for biodetection (monolayer of DNA). We are then able to observe simultaneously several thousands of individual eukaryote and prokaryote cells. Finally, we develop a prototype dedicated to the real-time monitoring of protein secretion by immune cells. The limits of SPR microscopy and the solutions which could allow this kind of study are discussed. Preliminary results on the improvement of bacterial detection are also presented

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Faugeroux, Vincent. „Caractérisation moléculaire et fonctionnelle de cellules tumorales circulantes dans le cancer de la prostate et le cancer bronchique non à petites cellules“. Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2017. http://www.theses.fr/2017SACLS481/document.

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Les cellules tumorales circulantes (CTC) représentent une source de matériel tumoral accessible de manière non invasive, susceptible de fournir des informations cliniques et fondamentales. Ces cellules issues de tumeurs primitives ou métastatiques représentent une population hétérogène d’éléments très rares circulant dans le sang. La personnalisation des traitements en oncologie repose sur la caractérisation moléculaire de biopsies tumorales mais celles-ci peuvent être difficiles à réaliser ou peu informatives. De ce fait, la caractérisation moléculaire et fonctionnelle des CTC présente un double intérêt, clinique pour identifier des biomarqueurs de sensibilité à des traitements, et fondamental pour étudier les mécanismes qui sous-tendent leur potentiel à initier des tumeurs.Les objectifs de ma thèse ont été d’une part de caractériser par séquençage de l’exome (WES) les CTC à l’échelle de cellule unique de patients atteints de cancers de la prostate (PCa) métastatiques et d’autre part d’établir puis caractériser des modèles de xénogreffes dérivés de CTC (CDX) chez des patients atteints de cancers bronchiques non à petites cellules (CBNPC) ou de PCa.Pour répondre au premier objectif, nous avons développé une méthode expérimentale globale incluant trois approches technologiques permettant d’enrichir et d’isoler des CTC individuelles de différents phénotypes (épithélial, épithélio-mésenchymateux et mésenchymateux), d’amplifier la totalité du génome (WGA) et de le séquencer. Le WES a été réalisé pour 34 échantillons de CTC sélectionnés sur des critères de qualité du WGA, ainsi que pour les biopsies de métastases correspondantes chez sept patients. Deux patients présentant une hétérogénéité phénotypique de leurs CTC, ont été analysés en profondeur. Nous avons mis en évidence des mutations partagées entre les CTC et les biopsies tumorales correspondantes ainsi que des mutations uniquement retrouvées dans les CTC. Ces mutations spécifiques aux CTC sont présentes dans tous les phénotypes et affectent particulièrement les gènes impliqués dans le remodelage du cytosquelette, la réparation de l’ADN ou l’invasion. L’existence de mutations communes entre les CTC de différents phénotypes suggère une relation phylogénique entre ces cellules mais une évolution divergente pendant le processus métastatique. Ce travail est soumis pour publication.Dans la seconde partie de ma thèse, nous avons implantés les CTC de 67 patients atteints de CBNPC et 24 patients atteints de PCa chez des souris immunodéprimées. Nous avons établis quatre CDX de CBNPC et un CDX de PCa. La caractérisation de ces modèles, des biopsies tumorales, des CTC collectées au moment de la xénogreffe, des CDX et des lignées cellulaires établies à partir du CDX, ont révélé que les CTC, le CDX et les lignées cellulaires « miment » le phénotype et le profil mutationnel des biopsies tumorales. La caractérisation plus approfondie de l’une des lignées cellulaires montre la présence d’un stress réplicatif et d’une instabilité génomique élevée. Ce résultat nous oriente sur l’hypothèse d’un rôle éventuel de l’instabilité génomique dans la tumorigénicité des CTC.Dans ce travail, nous avons montré que le profil mutationnel des CTC présente de fortes similitudes avec les biopsies tumorales des patients dans les patients atteints de PCa étudiés. De plus, nous avons observé l’existence de mutations spécifiques aux CTC, non détectées dans les biopsies tumorales. Également, nous montrons que des CTC issues de CBNPC et de PCa sont tumorigéniques in vivo et qu’elles reflètent le profil mutationnel des biopsies tumorales des patients. Ces modèles constituent des outils originaux et intéressants pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et stratégies anti-cancéreuses, et comprendre les mécanismes qui supportent le potentiel des CTC à initier des tumeurs
Circulating tumor cells (CTCs) represents an non invasive source of tumor material which may provide clinical and basic information. These cells derived from primary or metastatic tumors represents an heterogeneous population of very rare events which circulates in the blood. Oncology personnalized medicine is based on biopsies molecular characterization but these are sometimes which difficult to realize and poorly informative. Thereby molecular and functional characterization of CTCs presents a double interest, clinical to identify treatments biomarkers sensitivity and basic to study mechanisms underlying their tumor inititiating cell (TIC) potential. The two goals of my thesis were on the one hand to characterize by whole-exome sequencing (WES) at the single level the CTCs from patients with metastatic prostate cancers (mPCa) and on the other hand to establish and characterize CTC-derived xenografts (CDX) from patients with non-small-cell lung cancer (NSCLC) or mPCa. For the first goal we developped a global workflow which include three technological approaches to enrich and isolate individual CTCs from different phenotype (epithelial, epithelial and mesenchymal, mesenchymal), to perform whole genome amplification (WGA) and to sequence them. WES was performed on 34 CTC samples selected according to WGA quality and on corresponding metastasis biopsies from seven patients. Two patients with phenotypic heterogeneity of CTCs were deeply analyzed. We highlighted shared mutations between CTCs and matched biopsies as well as mutations only detected in CTCs. These private CTC mutations are detected in all phenotype and particularly affect genes invlved in cytoskeleton remodeling, DNA repair or invasion. The existence of common mutations between CTCs from various phenotype suggests a phylogenic link between these cells but a divergent evolution during metastatic process. This work is submitted for publication. For the second goal, we implanted CTCs from 67 NSCLC patients and 28 mPCa patients in immunocompromised mice. We established four NSCLC CDX and one mPCa CDX. The characterization of tumor biopsies, CTCs collected at the time of xenograft, CDX and CDX-derived cell lines revealed that CTCs, CDX and cell lines miror the phenotype and mutational landscape of tumor biopsies. The more deeply characterization of one cell line show the presence of a high replicative stress and genomic instability. This result directs us to the hypothesis of a possible role of the genomic instability in CTC tumorigenicity.We demonstrated in this work that CTCs mutational landscape harbors high similairities with patients tumor biopsies in mPCa. Furthermore we observed CTC private mutations not detected in tumor biopsies. Also we showed that some CTCs from NSCLC and mPCa are tumorigenic in vivo and that these CTCs mirror mutational profile of patients tumor biopsies. These models are original and interesting tools to identify new therapeutic targets and anti-tumoral strategies and understand mechanisms underlying the TIC potential of CTCs

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Riquier, Sébastien. „Dans les abysses du transcriptome : découverte de nouveaux biomarqueurs de cellules souches mésenchymateuses par analyse approfondie du RNAseq“. Thesis, Montpellier, 2019. http://www.theses.fr/2019MONTT004.

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Le développement du séquençage ARN, ou RNAseq, a permis l'essor de la recherche intensive de biomarqueurs dans de nombreux domaines de la biologie. L’information complète du transcriptome contenue dans les données de sorties, permet à un bioinformaticien assidu de dépasser les connaissances actuelles et d’accéder, grâce à des pipelines informatiques avancés, à d’innombrables signatures d’intérêts inédites. Dans cette thèse nous mettons en avant que ces marqueurs potentiels, essentiellement explorés pour répondre à des problématiques clinique en conditions pathologiques, peuvent être utilisés pour affiner la caractérisation de types de cellules sans marqueurs strictement spécifiques. Nous nous sommes intéressés aux cellules souches mésenchymateuses (MSCs), un type de cellules souches adultes multipotentes, fortement utilisées en clinique mais ne possédant pas de marqueurs positifs strictement spécifiques.Notre étude se concentre sur la recherche des ARN longs non-codants non annotés. Ces ARNs, aussi nommés "lncRNA", constituent une classe émergente de transcrits encore peu explorée à ce jour. De plus, cette catégorie démontre une spécificité conditionnelle et tissulaire élevée. Nous avons élaboré un pipeline d’analyse RNAseq optimisé pour la reconstruction et la quantification de lncRNAs non annotés.En utilisant les données publiques de RNAseq, venant de différentes sources de MSCs et d'autres types de cellules, nous avons identifié de nouveaux lncRNA non annotés exprimés spécifiquement dans les MSCs.Nous avons développé pour ce projet Kmerator.jl, un outil qui permet de décomposer un transcrit en sous séquences spécifiques (k-mers) afin de chercher et quantifier plus rapidement la signature de nos candidats dans un grand nombre de données RNAseq. Kmerator a également été utilisé dans d'autres applications pour tester la qualité des données RNA-seq disponibles en accés public.Après validation de ces nouveaux biomarqueurs de MSCs par qPCR, nous avons eu recours à plusieurs outils informatiques pour prédire leurs fonctions potentielles. Enfin, nous avons analysé des données RNAseq « single-cell » pour aborder l’hétérogénéité d’expression au sein des populations MSCs
The development of RNA sequencing, or RNAseq, have opened the path of intensive biomarkers research in many areas of biology. The complete information of the transcriptome contained in the output data, allows a bioinformatician to surpass the current knowledge and to access, thanks to advanced computer pipelines, to signatures of new interest. In this thesis, we are showing that these potential markers, classically used in clinical and pathological conditions, can be used to characterize cell types without extensive markers profile. We have studied mesenchymal stem cells, a type of adult multipotent stem cells, strongly used in clinics but without strickly specific positive markers. Our study mainly focuses on the search for non-annotated, long non-coding RNAs. These RNAs, also called "lncRNA", constitute an emerging class of transcripts and are still lightly explored.In addition, this category presents a highly tissue-related specificity. We have developed an optimized RNAseq pipeline for the reconstruction and quantification of non-annotated lncRNAs.Using public data from RNAseq, coming from different sources of MSC and other cell types, we have identified new non-annotated lncRNAs clearly and specifically expressed in MSCs. to complete this project, we developed Kmerator.jl, a bioinformatical tool that allows to decompose a transcript in k-mer, and select specific sub-sequences, in order to search and quantify at a faster rate the signature of our candidates in a large number of RNAseq dataset. After validation of these new biomarkers of MSCs by qPCR, we used several computer tools to predict their potential functions. Finally, we analyzed single-cell RNAseq data to address the heterogeneity of expression within MSC populations

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Sakakini, Nathalie. „Rôle du facteur de transcription EGR1 dans le contrôle de l' autorenouvellement des cellules souches de glioblastomes“. Thesis, Aix-Marseille, 2014. http://www.theses.fr/2014AIXM4071.

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Le glioblastome est la tumeur cérébrale de mauvais pronostic la plus fréquente et la plus agressive. Les traitements actuels combinent la chirurgie à la radio thérapie et la chimiothérapie. Cependant ces traitements sont peu efficaces. Le taux de récidive est élevé et la survie moyenne est de 15 mois.La récidive s'explique en partie par la présence de cellules initiatrices de glioblastomes (CIG). Ces cellules possèdent des propriétés de cellules souches adultes. Elles s'auto-renouvellent en maintenant un pool de cellules tumorales et se différencient en différents types cellulaires. Elles sont aussi résistantes aux thérapies par l'activation de mécanismes d'élimination des molécules destinées à les détruire. L'engagement des CIGs vers un état tumoral différencié diminue fortement leur potentiel tumorigénique les rendant plus vulnérables.Le facteur de transcription EGR1 est impliqué dans des processus biologiques comme la prolifération et la différenciation. Dans les CIG l'expression d'EGR1 est anormalement élevée. Ce niveau diminue lorsque les cellules se différencient. L'expression d'EGR1 est donc corrélée avec un état souche suggérant sa contribution dans la régulation de la prolifération des CIG ou dans le maintien de cet état.Mon objectif est de caractériser le rôle d'EGR1 dans la régulation de l'état proliférant des CIG.Nous avons démontré l'implication d'EGR1 dans une cascade de régulation impliquant le mir18a* et les gènes SHH et GLI1. Il contribue ainsi à l'autorenouvellement, à la prolifération et au maintien de l'état souche des CiGs. De plus en régulant directement le gène PDGFa, EGR1 entretient ce système régulatoire par une deuxième boucle moléculaire
Glioblastoma is the most commun and agressive cerebral tumor. The current treatments combine surgery with chemotherapy and radiotherapy. However these treatments are poor effective. The relapse is frequent and the rate survival is less than 18 months.The relapse is in part due to the presence of glioblastoma initiating cells (GIC). The cells have stem cell properties. They can self-renew to maintain a pool of tumor cells and they can differentiate in different kind of tumor cells. They are also able to resist to the therapies by activating mechanisms of drug efflux. The commitment of GIC toward a differentiated tumor state decreases strongly their tumorigenic potential.EGR1 transcription factor is involved in many biological processes such as proliferation and differentiation. In the GIC EGR1 expression is abnormally elevated. This level decreases when cells are differentiated. EGR1 expression is strongly correlated with stem state suggesting its contribution in the proliferation regulation of GIC or in the maintenance of this state.My aim is to characterize the role of EGR1 in the regulation of proliferating state of the GIC.We have demonstrated the involvement of EGR1 in the pathway involving the mir18a* and the genes SHH and GLI1. It contributes so to the self-renewal, to the proliferation and to the maintenance of the stem state of GIC. In addition by directly regulating the gene PDGFa EGR1 maintains this system by a second molecular loop

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De, Dieuleveult Maud. „Implication des factures de remodelage de chromatine de la famille CHD dans les réseaux de régulation transcriptionnelle des cellules souches embryonnaires“. Phd thesis, Université Paris Sud - Paris XI, 2010. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00555030.

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Les cellules souches embryonnaires (cellules ES) ont la capacité unique de se diviser indéfiniment et de pouvoir se différencier en de multiples types cellulaires. Elles apparaissent donc très prometteuses comme agents thérapeutiques dans les traitements médicaux du futur. Un enjeu majeur de la recherche actuelle consiste à comprendre la contribution des protéines régulatrices de la chromatine à la plasticité et au contrôle de l'expression du génome des cellules. La famille des remodeleurs Chd, qui fait partie de la super famille SNF2, comprend neuf membres, soit le tiers des remodeleurs exprimés dans les cellules ES murines. L'objectif principal de ce projet de thèse a consisté à identifier de manière exhaustive les gènes cibles de chaque facteur pour comprendre comment ils participent à la régulation du génome et se partagent le remodelage de la chromatine. Nous avons entrepris un projet à grande échelle dans lequel chaque gène codant chaque Chd a été fusionné, à son extrémité carboxy-terminale, à une séquence codant une étiquette, par recombinaison homologue en cellules ES. Les cellules ES étiquetées ont ensuite été utilisées pour des expériences d'immunoprécipitation de chromatine (ChIP-seq). La présence de l'étiquette a permis de standardiser et d'optimiser les méthodes d'immunoprécipitation des protéines. Les fragments d'ADN isolés ont ensuite été séquencés dans le laboratoire d'Ivo Gut (CEA/CNG -Evry- et CNAG -Barcelone-). Nous avons également analysé les transcriptomes des cellules ES où la déplétion de chaque protéine Chd a été réalisée, par hybridation sur puce et RNA-seq. Ces données ont permis de montrer le rôle de NuRD (Chd4, Hdac2) au sein des réseaux de la régulation transcriptionnelle des ES. Les données obtenues pour les facteurs Chd1, Chd8 et Chd4 montrent des rôles différents mais interconnectés pour chaque protéine. Enfin, ces données nous ont permis de proposer des hypothèses pour expliquer comment ces protéines contribuent à la régulation du génome.

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Richard, Corentin. „Identification de biomarqueurs prédictifs de l'efficacité du nivolumab dans le traitement de patients atteints de cancer bronchique non à petites cellules de stade avancé“. Thesis, Bourgogne Franche-Comté, 2019. http://www.theses.fr/2019UBFCI008/document.

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L’arrivée récente de l’immunothérapie a bouleversé la prise en charge des cancers broncho-pulmonaires non à petites cellules (CBNPC). Le nivolumab, anticorps inhibiteur du point de contrôle immunitaire PD-1, a montré des résultats remarquables en deuxième ligne métastatique après échec des chimiothérapies standards de première intention. Cependant, seul un quart des patients tire un bénéfice durable de la prise de ce traitement. `A ce jour, aucun biomarqueur prédictif de l'efficacité thérapeutique du nivolumab n'a pu être identifié de manière claire et consensuelle. La recherche de biomarqueurs prédictifs de bénéfice ou de résistance à ce traitement répresente donc un enjeu majeur.L’apparition du séquençage à haut débit au cours de la dernière décennie a eu un impact considérable sur la recherche clinique et fondamentale, permettant d’appréhender la génétique d’une tumeur dans son ensemble. Ces nouvelles techniques s’ajoutent à d’autres déjà éprouvées telles que l’immunophénotypage ou l’immunohistochimie à disposition des chercheurs pour une analyse extensive des caractéristiques de la tumeur et du patient.L’objectif de ce travail a été d’identifier des marqueurs prédictifs d’efficacité du nivolumab dans le traitement des CBNPC avancés au moyen de ces différentes technologies. Pour cela, notre étude s'est alors intéressée à une cohorte multicentrique de 115 patients atteints de CBNPC et traités par nivolumab en deuxième ou troisième ligne métastatique après échec d'un doublet cytotoxique. Dans les limites de disponibilité et de qualité des échantillons, les profils génétique, transcriptomique et immunohistochimique de la tumeur ainsi que les profils clinique et immunologique des patients ont été analysés.Nos résultats mettent en évidence des marqueurs prédictifs majeurs de réponse au nivolumab. Ainsi, une bonne réponse au doublet cytotoxique de première intention favorise une efficacité optimale du nivolumab en ligne ultérieure. Par ailleurs, un contrôle régulier de l'évolution des cellules myéloïdes immunosuppresives et des cellules cytotoxiques exprimant TIM-3 d'un patient permet de détecter une résistance primaire ou secondaire au traitement. D'autre part, l'estimation conjointe des expressions des protéines PD-L1 et CD8 par séquençage d'ARN constitue un marqueur prédictif majeur de réponse. Sa capacité prédictive surpasse celle de l'estimation de PD-L1 seule et celle d'autres signatures transcriptomiques précédemment établies et composées d'un nombre plus important de gènes. Enfin, l'étude des séquençages d'exome des tumeurs montre l'importance d'une analyse étendue de la génétique tumorale et la nécessité de ne pas se limiter à l'estimation de sa charge mutationnelle.Dans ce travail, nous avons pu mettre en évidence des marqueurs prédictifs d'efficacité du nivolumab dans le traitement des CBNPC avancés. Nos résultats soulignent l'importance de l'utilisation de plusieurs technologies pour la caractérisation de la biologie tumorale et de l'immunité du patient dans une démarche de découverte de biomarqueurs et de construction de modèles prédictifs d'efficacité des immunothérapies
The recent introduction of immunotherapy has disrupted the management of non-small cell lung cancer (NSCLC). Nivolumab, an antibody targeting the immune checkpoint inhibitor PD-1, has shown remarkable results in seconde-line setting after failure of standard first-line chemotherapy. However, only a quarter of patients benefits from this therapy. To date, no predictive biomarker of the therapeutic efficacy of nivolumab has been identified in a clear and consensual manner. The research for predictive biomarkers of efficacy or resistance to this treatment is, therefore, a major challenge.The emergence of high-throughput sequencing over the past decade has had a significant impact on clinical and fundamental research, making possible to understand the genetics of a tumor as a whole. These new techniques are in addition to other already proven techniques such as immunophenotyping or immunohistochemistry available to researchers for extensive analysis of tumor and patient characteristics.The objective of this work was to identify predictors of the efficacy of nivolumab in the treatment of advanced NSCLC using these different technologies. To do this, our study focused on a multicentre cohort of 115 NSCLC patients treated with nivolumab in the second- or third-line after failure of a cytotoxic doublet. Within the limits of sample availability and quality, the genetic, transcriptomic and immunohistochemical profiles of the tumor as well as the clinical and immunological profiles of the patients were analysed.Our results highlight major predictive markers of response to nivolumab. Thus, a good response to the first-line cytotoxic doublet promotes optimal efficacy of subsequent online nivolumab. In addition, regular monitoring of the evolution of a patient's immunosuppressive myeloid cells and cytotoxic cells expressing TIM-3 can detect primary or secondary resistance to treatment. On the other hand, the joint estimation of PD-L1 and CD8 protein expressions by RNA sequencing is a major predictive marker of response. Its predictive capacity surpasses that of the PD-L1 estimate alone and that of other previously established transcriptomic signatures composed of a larger number of genes. Finally, the study of tumor exome sequencing shows the importance of extensive analysis of tumor genetics and the need not only to focus on the estimation its mutation burden.In this work, we were able to identify predictive markers of the efficacy of nivolumab in the treatment of advanced NSCLC. Our results highlight the importance of using several technologies for the characterization of tumor biology and patient immunity in a process of biomarker discovery and the construction of predictive models of the efficacy of immunotherapies

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Tondeur, Sylvie. „Cellule souches hématopoïétiques et cellules souches embryonnaires humaines : analyse du transcriptome et mise en ligne des données par la création d'un atlas d'expression“. Montpellier 1, 2009. http://www.theses.fr/2009MON1T012.

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L'étude du transcriptome par les puces à ADN permet de mesurer l'expression globale des gènes et a incontestablement modifié notre manière d'appréhender les questions biologiques. Nous avons appliqué cette technologie à l'étude des cellules souches. Par l'analyse du transcriptome des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh), un modèle essentiel de cellules pluripotentes, nous avons pu mieux définir les mécanismes moléculaires de la pluripotence. En particulier, nous avons comparé des CSEh à des ovocytes humains pour identifier les déterminants intrinsèques de la pluripotence. Les puces Affymetrix Exon ST 1. 0 permettent d'étudier le transcriptome avec une résolution jamais atteinte jusqu'à présent, par la mesure de l'expression de l'ensemble des exons du génome. Nous avons utilisé ces nouvelles puces pour cartographier le profil d'expression exonique (exome) des cellules souches hématopoïétiques et des cellules sanguines normales. Ce travail a mis en évidence des évènement d'épissage alternatif spécifiques du tissu hématopoïétique (NEDD9, CD74) et un switch alternatif de certains transcrits au cours de la maturation (INPP4B, PTPLA, CXCL3 et COMMD6). Les gènes présentant ces évènements d'épissage sont particulièrement impliqués dans la mobilité cellulaire et la réponse immunitaire. Enfin, nous avons créé un atlas internet, Amazonia! (http://amazonia. Transcriptome. Eu/), pour un accès aisé à des données publiques de transcriptome. Des profils d'expression géniques peuvent être visualisées sous forme d'histogrammes ou de matrices colorées dans plus de 5000 échantillons répartis dans les différentes pages thématiques, telles que «stem cell», «hematology» ou «exon»
DNA-microarray based transcriptome study can monitor the expression of a whole genome in one experiment and has completely changed our manner to conceive biological questions. We applied this technology to the study of stem cells. The transcriptome analysis of human embryonic stem cells (hESC), a main model of pluripotent stem cells, led us to better define molecular mechanisms of pluripotency. Of note we compared hESC to human oocytes in order to identify intinsic determinants of pluripotency. Affymetrix Exon ST 1. 0 microarrays are high resolution platforms that can measure the expression of all the exons of a genome. We used this new microarray to map exonic expression profile (exome) of hematopoietic stem cells and mature blood cells. Our work showed hematopoietic specific alternative splicing events (NEDD9, CD74) and an alternative switch for some transcripts during maturation (INPP4B, PTPLA, CXCL3, COMMD6). Alternatively spliced genes are notably involved in cell motility and immune response. Finally, we created a web atlas, Amazonia! (http://amazonia. Transcriptome. Eu/), for an easy access to public transciptome data. Gene expression profiles can be visualised as histograms or colored matrixes in more than 5,000 samples regrouped in thematic pages such as «stem cell», «hematology» or «exon»

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Assou, Saïd. „Étude du transcriptome du développement embryonnaire précoce humain : ovocyte et cellules souches embryonnaires“. Montpellier 1, 2008. http://www.theses.fr/2008MON1T014.

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La première semaine du développement embryonnaire humain (de la fécondation au stade blastocyste) comporte une série d'événements qui transforme des cellules hautement spécialisées, les cellules germinales, en des cellules indifférenciées au potentiel développemental extraordinairement vaste, les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh). La compréhension de ces évènements est essentielle pour les progrès de l'assistance médicale à la procréation (AMP) et de la médecine régénératrice, deux domaines majeurs de la médecine de demain. Utilisant la technologie innovante des puces à ADN, nous nous sommes intéressés à l'expression des gènes dans les extrêmes de cette première semaine de développement : les ovocytes et les CSEh. Grâce à l'optimisation récente des techniques d'analyse du transcriptome, permettant d'étudier de très petites quantités de matériel cellulaire, nous avons obtenu le profil transcriptionnel des ovocytes humains au cours de leur maturation. Ce travail a montré que la sécurine PTTG3 et la kinase AURKC sont préférentiellement exprimés dans les ovocytes durant la méiose. Des facteurs de croissance fortement exprimés dans les ovocytes ont été aussi identifiés, tels que TNFSF13, FGF9, FGF14 et IL4, ainsi que les facteurs de transcription : OTX2, SOX15 et SOX30. L'analyse des cellules du cumulus, qui entourent les ovocytes, a permis la caractérisation des facteurs de communication inter-cellulaire mis en jeu par l'ovocyte au cours de sa maturation. Ces informations sont essentielles pour mieux appréhender la biologie ovocytaire, identifier de nouveaux marqueurs de maturité et de qualité ovocytaire, et elles ouvrent la voie à une stratégie de sélection des meilleurs embryons candidats à l'implantation basée sur l'analyse moléculaire des cellules du cumulus, afin d'améliorer le taux de succès de l'AMP. En parallèle, nous nous sommes intéressés aux CSEh. Ces cellules sont issues de la masse cellulaire interne du blastocyste (MCI), ont des propriétés d'auto-renouvellement et de différenciation qui en font des candidats attractifs pour une utilisation en thérapie cellulaire. Nous avons réussi la dérivation de 3 nouvelles lignées françaises de CSEh et avons étudié leur transcriptome, ainsi que celui de plus de 20 CSEh internationales. Également, nous avons identifié de nouveaux marqueurs membranaires tels que CD24 et la sémaphorine SEMA6A. Ces données transcriptomes ont été intégrées dans un atlas internet d'expression que nous avons créé : Amazonia http://amazonia. Montp. Inserm. Fr. Nous avons enfin, comparé le transcriptome des ovocytes et celui des CSEh, afin de mieux comprendre les évènements moléculaires qui sous-tendent la première semaine du développement humain. Ces résultats révèlent en particulier que le protéasome reste fortement surexprimé dans ces deux types cellulaires, par rapport à plus de 200 échantillons de tissus somatiques, suggérant ainsi un rôle de cette voie de dégradation protéique dans le maintien de la pluripotence. L'ensemble de ce travail a mené directement à des propositions pour l'amélioration des conditions de culture des CSEh, en particulier la mise au point d'un milieu de culture dépourvu de protéines animales, et pour l'amélioration de la reprogrammation cellaire des cellules adultes en cellules souches pluripotentes induites (iPS).

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Jeandard, Damien. „Import d'ARN dans les mitochondries de cellules humaines : identification à grande échelle et applications thérapeutiques“. Thesis, Strasbourg, 2019. http://www.theses.fr/2019STRAJ005.

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Les mutations dans le génome mitochondrial humain sont souvent associées à de graves maladies neuromusculaires. Mon projet de thèse a consisté tout d’abord au développement d’une stratégie thérapeutique basée sur l’import mitochondrial de molécules d’ARN. J’ai pu démontrer que l’expression stable de molécules d’ARN recombinantes dans les cellules humaines permet de diminuer le taux de mutations pathogéniques de l’ADN mitochondrial. Dans une seconde partie, j’ai élaboré une nouvelle méthode, CoLoC-seq, permettant l’identification à grande échelle des ARN localisés dans les mitochondries. En appliquant cette méthode sur des cellules humaines, j’ai pu confirmer l’adressage mitochondrial de certains ARN cytosoliques non-codant et identifier de nouveaux ARN potentiellement importés. Ces données permettront d’élargir les connaissances sur les voies d’adressage mitochondrial des ARN, leurs mécanismes et leur régulation, et d’optimiser les stratégies thérapeutiques basées sur l’import d’ARN
Mutations in the human mitochondrial genome are often associated with severe neuromuscular disorders. The first part of my thesis project consisted in the development of a therapeutic strategy based on the mitochondrial import of RNA molecules. I demonstrated that the stable expression of recombinant RNA molecules in human cells induced the decrease of the pathogenic mutation load in mitochondrial DNA. In the second part, I developed a nex method, CoLoC-seq, for the large-scale identification of RNA species localized in the mitochondria. By applying this method to human cells, I confirmed the mitochondrial targeting of some non-coding cytosolic RNAs and identified new potentially imported RNAs. These data will broaden the knowledge on the pathway of RNA targeting into the mitochondria, its mechanisms and regulation, and will allow optimization of the therapeutic strategies based on RNA import

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Smirnov, Alexandre. „Investigation of the mechanism of 5S rRNA import into human mitochondria“. Strasbourg, 2010. http://www.theses.fr/2010STRA6042.

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Le phénomène de l'import d' ARN cytosoliques dans les mitochondries est très répandu chez les Eucaryotes. Les cellules humaines n'en font pas l'exception car la présence de l'ARNr 5S importé dans les mitochondries des mammifères a été démontrée sans ambiguité. Même si un effort considérable a été fait pour déchiffrer le mécanisme et révéler la signification de ce processus, les connaissances dans ce domaine restent préliminaires. Les objectifs suivants ont été formulés pour mes travaux de thèse : (i) identifier les signaux de localisation mitochondriale de l'ARNr 5S; (ii)mettre en évidence les facteurs protéiques impliqués dans le processus de transport de cet ARN vers la surface mitochondriale (iii) étudier le fonctionnement de ce véhicule moléculaire ; (iv) investiguer le rôle éventuel de l'ARNr importé dans la traduction mitochondriale. Nous avons pu démontrer que l'ARNr 5S humain possède deux déterminants d'import mitochondrial localisés dans les domaines α et β, le domaine β étant sans importance. Ce fait nous a permis d'utiliser la voie d'import de l'ARNr 5S pour délivrer des séquences ARN hétérologues dans les mitochondries des cellules humaines. Nous avons ensuite trouvé que le véhicule minimal pour adresser l'ARNr 5S vers les mitochondries est constitué de deux protéines - la rhodanèse et la pré-MRP-L18, qui agissent en chaîne. Les deux protéines assurent la capture efficace de cet ARN cytosolique et le redirigent vers les mitochondries, en utilisant des effets chaperon réciproques. Finalement, nous avons démontré pour la première fois que l'ARNr 5S est impliqué dans la traduction mitochondriale, probablement étant un composant de mitoribosomes des mammifères.

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Aledani, Tamadir Hamid Wadi. „Expression des ARNm et des microARN dans les cellules de cumulus humains : impact de l'âge maternel“. Thesis, Montpellier, 2015. http://www.theses.fr/2015MONTT011/document.

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L'ovocyte se développe au sein d'un follicule, en contact étroit avec des cellules d'origine somatique, les cellules de cumulus (CC). Ces deux types cellulaires communiquent entre eux via des jonctions intercellulaires, permettant ainsi la régulation et la coordination du métabolisme pendant le développement et la maturation de l'ovocyte. Notre hypothèse est que l'expression et la régulation des gènes dans les CC joue un rôle crucial dans des fonctions essentielles pour la croissance de l'ovocyte et l'acquisition de sa compétence. Mes travaux de thèse comportent deux parties. Dans la première partie nous avons utilisé le séquençage haut débit pour examiner le répertoire des microARN (communément appelés miRNA) dans les cellules de cumulus et dans l'ovocyte. Les miRNA, séquences d'ARN non codantes dont la longueur varie entre 19 et 25 nucléotides, ont émergé récemment comme régulateurs majeurs de nombreux processus biologiques, dont le vieillissement. Nous avons identifié 32 miRNA spécifiquement dans les cellules de cumulus humains et seulement 3 dans l'ovocyte MII. Dans la seconde partie de nos travaux, nous avons analysé l'impact de l'âge maternel sur l'expression des gènes dans les cellules de cumulus. Alors qu'une baisse de la compétence de l'ovocyte avec l'avancement de l'âge maternel est bien établie, les bases moléculaires de ce phénomène demeurent peu connues. Dans une première étape pour aborder cette question, nous avons utilisé des puces à ADN pour analyser les profils d'expression des gènes des CC en fonction de l'âge maternel. De façon remarquable l'âge maternel impacte significativement l'expression de gènes qui sont critiques pour la maturation de l'ovocyte tels que les gènes impliqués dans l'angiogenèse, les voies de signalisation de TGF-ß et de l'insuline. Par l'utilisation d'outils bioinformatiques, nous avons aussi identifié des miRNA potentiels régulateurs de gènes impliqués dans des processus ou des voies impactés par l'âge ; ils pourraient constituer de nouveaux biomarqueurs pour prédire un vieillissement ovarien prématuré ainsi que la qualité et la compétence de l'ovocyte
The oocyte develops into a follicle where it is in close contact with cumulus cells (CCs), of somatic origin. The two cell types undergo a bidirectional communication via gap junctions, which results in the regulation and coordination of the metabolism during oocyte development and maturation. We assume that gene expression and regulation in the CCs play a crucial role in functions that are essential for oocyte growth and competence acquisition. The present study may be subdivided in two parts. In the first part we used deep sequencing to investigate the repertoire of miRNAs in the cumulus cells and the oocyte. MicroRNAs that are noncoding RNA sequences whose length is approximately 19-25 nucleotides have emerged as important regulators in many biological processes including aging. Our data showed that 32 miRNAs were specifically expressed in human cumulus cells while only 3 miRNAs were identified in MII human oocyte. The impact of maternal age on gene expression in cumulus cells was addressed in a second part of my thesis work. While the correlation of oocyte competence decline with advancing maternal age is well established, little is known on its molecular basis. In a first attempt to address this issue, we used microarrays to study gene expression profiles of human cumulus cells according to maternal age. Remarkably, maternal age greatly impacted expression of genes that are critical for oocyte maturation such as genes involved in angiogenesis, TGF-β signaling, and insulin signaling pathways. Also, using bioinformatic tools, we identified miRNAs that potentially target some of the genes involved in the aging-impacted processes and pathways; this could candidate them as new biomarkers to predict premature ovarian aging and oocyte quality and competence

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Magalhaes, Milena. „La méthylation de l'ADN est altérée dans les cellules nasales et sanguines des patients atteints de mucoviscidose“. Thesis, Montpellier, 2016. http://www.theses.fr/2016MONTT024.

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La mucoviscidose (CF) est la maladie génétique récessive létale la plus fréquente dans la population caucasienne. Elle est caractérisée par une obstruction et des infections des voies respiratoires et une inflammation chronique. La morbidité et la mortalité sont principalement dues à l'atteinte pulmonaire, qui est variable chez les patients, même lorsqu’ils sont porteurs du même génotype. Les facteurs responsables sont multiples : les mutations dans CFTR (le gène responsable de la maladie), les gènes modificateurs, mais aussi les facteurs environnementaux et les modifications épigénétiques. L'objectif principal de ce projet était de déterminer s'il y avait une corrélation entre la méthylation de l'ADN et la sévérité de l'atteinte pulmonaire chez les patients CF. Nous avons obtenu la cohorte METHYLCF (49 patients CF p.Phe508del homozygotes et 24 témoins sains) ainsi qu’une biobanque d'ADN à partir de sang total et de cellules épithéliales nasales (NEC). Les patients CF ont été stratifiés en fonction de leur VEMS, ajusté à l’âge. D’une part, nous avons analysé la méthylation de l'ADN dans CFTR plus 13 gènes modificateurs en utilisant la méthode de conversion au bisulfite et séquençage de nouvelle génération (plateforme 454 Roche). D’autre part, nous avons réalisé une analyse pan-génomique de la méthylation de l'ADN avec la plateforme 450k BeadChip (Illumina). Les sites différentiellement méthylés (DMS) sélectionnés ont été validés par pyroséquençage (PyroMark Q24, Qiagen). Deux gènes modificateurs ont été identifiés comme différentiellement méthylés chez les patients CF par rapport aux témoins: EDNRA dans le sang et HMOX1 dans le sang et dans les NEC. De façon intéressante, dans les NEC, la méthylation de EDNRA, HMOX1 et GSTM3 a été corrélée avec la sévérité de l’atteinte pulmonaire. De plus, de faibles niveaux de méthylation d'ADN dans GSTM3 ont été associés à la présence de l'allèle GSTM3*B, un polymorphisme de séquence qui a un effet protecteur chez les patients CF. Grâce à l'analyse tout-génome, nous avons identifié 1267 DMS, associés à 638 gènes, chez les patients CF par rapport aux témoins, et 187 DMS, associés à 116 gènes, chez les patients CF sévères par rapport aux modérés. Parmi ces gènes, il y a de nombreux gènes importants pour l’adhésion cellulaire et les réponses immunitaire et inflammatoire. Les DMS identifiés sont enrichis dans des régions prédites comme enhancers, pouvant représenter des séquences régulatrices, mais également en régions intergéniques. De façon intéressante, 80 gènes différentiellement méthylés sur 638 étaient différentiellement exprimés (méta-analyse de données transcriptomiques disponibles). Six sur neuf DMS sélectionnés ont été validés et cinq DMS sur six ont été répliqués dans une population indépendante. De plus, 23 DMS, dont 10 intergéniques, étaient corrélés avec le VEMS. Notre étude a montré que la méthylation de l'ADN est profondément modifiée dans le sang et dans les NEC des patients CF. Des faibles changements de méthylation de l'ADN ont été observés dans des gènes modificateurs connus ; des changements de méthylation plus importants ont été observés dans d'autres gènes qui pourraient représenter de nouveaux modificateurs de la fonction pulmonaire. Ensemble, ces gènes pourraient moduler la sévérité de l’atteinte pulmonaire chez les patients CF
Cystic fibrosis (CF) is the most common life-threatening recessive genetic disease in the Caucasian population. It is characterized by airway obstruction, respiratory infection and inflammation. Morbidity and mortality are mainly due to lung disease, which is variable among CF patients, even for those having the same genotype. Contributing factors are mutations in CFTR (the disease-causing gene), modifier genes, but also environmental factors and epigenetics. The main goal of this project was to determine whether there was a correlation between DNA methylation and the severity of CF lung disease. We built the METHYLCF cohort (49 p.Phe508del homozygous CF patients and 24 healthy controls) and a DNA biobank from whole blood and nasal epithelial cells (NEC). CF patients were stratified accordion to their FEV1% predicted, adjusted to age. We profiled DNA methylation at 14 modifier genes using bisulfite conversion and next-generation sequencing (454 Roche). Genome-wide DNA methylation was analyzed with the 450K Beadchip (Illumina). Selected differentially methylated sites (DMS) were validated by pyrosequencing. Using the candidate modifier gene approach, we showed that two CF modifier genes were differentially methylated in CF patients compared to controls: EDNRA in blood and HMOX1 in blood and NEC. Methylation of EDNRA, HMOX1 and GSTM3 was associated with lung disease severity in NEC. Interestingly, low DNA methylation levels at GSTM3 were associated with the GSTM3*B allele, a polymorphic 3-bp deletion that has a protective effect on CF patients. In addition, through the genome-wide analysis, we identified 1267 DMS, associated with 638 genes, between CF patients and controls and 187 DMS, associated with 116 genes, between severe CF and mild CF patients. DMS were enriched at predicted enhancers, which may represent regulatory sequences, and also at intergenic regions. Gene ontology analyses highlighted cellular processes relevant to CF, i.e. cell adhesion and inflammatory and immune response. Interestingly, 80 out of 638 differentially methylated genes were differentially expressed in publicly available NEC transcriptomic data. Six out of 9 selected DMS were validated and five out of six DMS were replicated in an independent set of patients. Additionally, 23 DMS, 10 of which were intergenic, correlated with FEV1% predicted. Our study has shown that DNA methylation is altered in blood and NEC of CF patients. Small DNA methylation changes were observed at known CF modifier genes; more dramatic DNA methylation changes were found at other genes that may impact lung function. Collectively, these epigenomic variations may lead to different degrees of lung disease severity in CF patients

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Menudier-Lachaise, Aline. „Rôles biologiques des enzymes de N-déglycosilation : recherche du gène de l'Endo-N-acétyl-[bêta]-D-glucosaminidase de radis (Raphanus sativus)“. Limoges, 1997. http://www.theses.fr/1997LIMO0019.

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Le travail entrepris a pour objectif la comprehension de l'implication des enzymes de n-deglycosylation dans le cycle de vie des vegetaux. La recherche du gene de l'endo-n-acetyl-beta-d-glucosaminidase de raphanus sativus (engase r) a ete menee suivant 4 strategies differentes, conditionnees par le fait qu'aucun renseignement de sequence d'engase eucaryote n'etait disponible. La purification des proteines ayant une activite engase ainsi que le reperage des proteines grace a l'utilisation d'anticorps anti-engase bacterienne ont conduit a suspecter l'existence, chez le radis, de deux engases de masses moleculaires d'environ 20 et 55 kda, dont aucune information de sequence n'a ete obtenue. Des tentatives d'amplification par reaction de polymerisation en chaine a l'aide d'amorces heterologues choisies dans les regions conservees des engases bacteriennes n'ont produit aucun amplifiat interessant. Enfin une derniere approche a ete imaginee suite a la mise en evidence d'une difference d'activite engase entre deux stades de developpement du radis (graines imbibees pendant 15 h et cotyledons de plantules etiolees agees de 3,5 jours). Il s'agit d'un criblage differentiel d'une banque d'adnc de radis destine a selectionner les arnm presents a un taux plus important dans les cotyledons de plantules etiolees que dans les graines imbibees. Les clones selectionnes ont ete tries par sequencage partiel et analyse informatique des sequences. Les 15 adnc resultant de ce tri sont des candidats potentiels pour etre des adnc d'engase r car ils ne possedent aucune homologie avec des proteines de plantes ou meme d'autres organismes. Les etudes d'expression de ces adnc n'ont pas permis de retrouver l'activite recherchee. Les 61 autres clones issus du criblage correspondent a des proteines decrites chez les vegetaux et leur expression differentielle est discutee.

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Bachy, Charles. „Phylogénie, diversité et dynamique temporelle chez les ciliés tintinnidés marins“. Phd thesis, Université Paris Sud - Paris XI, 2012. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00769949.

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La diversité des protistes marins planctoniques, après avoir été historiquement étudiée sur des critères morphologiques, est depuis récemment sujette à une intense recherche à l'aide d'approches moléculaires. Notamment, les études basées sur l'amplification directe de marqueurs moléculaires à partir d'ADN environnemental ont révélées une exceptionnelle diversité. L'objectif central de ce travail est d'améliorer notre compréhension sur le lien existant entre la connaissance classique des eucaryotes unicellulaires et leur diversité estimée à partir des données moléculaires, en particulier pour une meilleure interprétation des processus évolutifs et écologiques. Pour cela, nous avons utilisé comme système modèle l'ordre des ciliés tintinnidés (Tintinnida) qui constituent un groupe riche en espèces, aisément identifiables au microscope grâce à leur coquille externe (lorica) et communément rencontrés dans l'ensemble des eaux marines et lacustres du monde. Un suivi approfondi sur deux ans des tintinnidés de la Baie de Villefranche-sur-Mer (Mer Méditerrannée, France), couplant des analyses moléculaires de la diversité à partir de cellules individuelles et à partir d'ADN environnemental, a permis de caractériser la composition de ces communautés et leur dynamique temporelle aux échelles macro- et micro-évolutives. La première partie de ce travail a été destinée à la réalisation d'une phylogénie moléculaire de référence pour les tintinnidés en incorporant les séquences de 62 individus de morphologies diverses pour lesquelles des données moléculaires n'étaient pas disponibles. Nous avons amplifié et séquencé les gènes codant pour les ARN ribosomiques (ARNr 18S, 5.8S et 28S) et les espaces intergéniques correspondants (ITS1 et ITS2). La classification taxonomique a été réévaluée d'après les données moléculaires. Dans un deuxième temps, nous avons testé l'efficacité des approches moléculaires conventionnelles (amplification, clonage et séquençage Sanger du gène de l'ARNr 18S) et plus récentes (amplification et pyroséquençage de régions de l'ARNr 18S et de l'ITS), pour décrire la composition des communautés des tintinnidés dans des échantillons environnementaux en les comparant avec des estimations de la diversité par observation morphologique sur les mêmes échantillons. Si il existe de légères incongruences entre les approches et/ou les différents marqueurs employés, les approches cultureindépendantes s'avèrent efficaces pour décrire la diversité morphologique. En revanche, afin de ne pas surévaluer artificiellement le nombre d'espèces estimées à partir des données de pyroséquençage, il faut que des méthodes de débruitage et de regroupement en unités taxonomiques opérationnelles (UTOs) contraignantes soient appliquées. La troisième partie de ce travail a été dédiée au suivi temporel des communautés de tintinnidés à différentes profondeurs dans la baie de Villefranche, basé sur le clonage et le séquençage du gène de l'ARNr 18S et des régions ITS. Il apparaît des différences de distribution au cours de l'année à une même profondeur, en particulier en termes d'abondance de séquences pour une UTO donnée. Malgré un cadre phylogénétique solide et assez enrichi, l'approche moléculaire révèle des séquences éloignées des espèces déjà séquencées. La découverte de ces clades environnementaux souligne potentiellement l'importance écologique d'espèces encore mal connues. Enfin, le séquençage direct du gène de l'ARNr 18S et de l'ITS2 à partir des cellules individuelles de l'espèce a offert l'opportunité d'une étude populationnelle sur une période de deux ans. La diversité intra-spécifique mesurée met à jour des phénomènes d'hybridation entre variantes génétiques. Une structuration génétique temporelle a également été observée pour le gène de l'ARNr 18S. Les implications de ces différentes recherches sont discutées dans le cadre de l'étude de la diversité et de l'écologie des tintinnidés, et plus largement, des protistes marins.

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Pagliaro, Sarah Beatriz De Oliveira. „Transcriptional control induced by bcr-abl and its role in leukemic stem cell heterogeneity. Single-Cell Transcriptome in Chronic Myeloid Leukemia: Pseudotime Analysis Reveals Evidence of Embryonic and Transitional Stem Cell States Single Cell Transcriptome in Chronic Myeloid Leukemia (CML): Pseudotime Analysis Reveals a Rare Population with Embryonic Stem Cell Features and Druggable Intricated Transitional Stem Cell States A novel neuronal organoid model mimicking glioblastoma (GBM) features from induced pluripotent stem cells (iPSC) Experimental and integrative analyses identify an ETS1 network downstream of BCR-ABL in chronic myeloid leukemia (CML)“. Thesis, université Paris-Saclay, 2020. http://www.theses.fr/2020UPASQ032.

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La leucémie myéloïde chronique est une hématopoïèse maligne clonale, caractérisée par l'acquisition de la translocation t (9;22) conduisant au chromosome Ph1 et à son homologue l'oncogène BCR-ABL, dans une cellule souche hématopoïétique très primitive. La LMC est un modèle de thérapies ciblées, car il a été démontré que la preuve de la faisabilité du ciblage de l'activité tyrosine kinase (TK) BCR-ABL à l'aide d'inhibiteurs de TK (TKI) entraîne des réponses et des rémissions majeures. Cependant, les problèmes actuels rencontrés dans ces thérapies sont la résistance des cellules souches leucémiques primitives et leur persistance qui serait liée à l'hétérogénéité des cellules souches au moment du diagnostic, ce qui conduit à la sélection clonale de cellules résistant aux thérapies TKI. J'ai appliqué la technologie de l'analyse du transcriptome des cellule uniques aux cellules de la LMC en utilisant un panel de gènes impliqués dans différentes voies, combinée à l'analyse d'inférence de trajectoire au modèle d'expression des gènes. Les résultats ont montré un état transitoire des cellules souches comprenant des gènes embryonnaires identifiés dans les cellules de la LMC au moment du diagnostic, ce qui pourrait contribuer à la résistance et à la persistance de la LSC. En outre, l'oncoprotéine Bcr-Abl est la tyrosine kinase constitutivement active produite par le gène chimérique BCR-ABL dans la leucémie myéloïde chronique (LMC). Les cibles transcriptionnelles de Bcr-Abl dans les cellules leucémiques n'ont pas été étudiées de manière approfondie. Une expérience de transcriptome utilisant la lignée cellulaire UT7 hématopoïétique exprimant BCR-ABL, a identifié la surexpression du facteur d'élongation eucaryote kinase 2 (eEF2K) qui joue un rôle majeur dans la survie des cellules en cas de privation de nutriments. Dans l'ensemble, les données suggèrent que la surexpression de eEF2K dans la LMC est associée à une sensibilité accrue à la privation de nutriments
Chronic myeloid leukemia is a clonal hematopoietic malignancy, characterized by the acquisition of the t (9;22) translocation leading to Ph1 chromosome and its counterpart BCR-ABL oncogene, in a very primitive hematopoietic stem cell. CML is a model of targeted therapies as the proof of concept of the feasibility of targeting the tyrosine kinase (TK) activity BCR-ABL using TK inhibitors (TKI) has been shown to lead to major responses and remissions. However, the current problems encountered in these therapies are primitive leukemic stem cells resistance and their persistence which is thought to be related to the heterogeneity of the stem cells at diagnosis leading to clonal selection of cells resisting to TKI therapies. I have applied the technology of single cell transcriptome analysis to CML cells using a panel of genes involved in different pathways combined with trajectory inference analysis to the gene expression pattern. The results showed a transitional stem cell states including embryonic genes identified in CML cells at diagnosis which could contribute to LSC resistance and persistence. Furthermore, the oncoprotein Bcr-Abl is the constitutively active tyrosine kinase produced by the chimeric BCR-ABL gene in chronic myeloid leukemia (CML). The transcriptional targets of Bcr-Abl in leukemic cells have not been extensively studied. A transcriptome experiment using the hematopoietic UT7 cell line expressing BCR-ABL, has identified the overexpression of eukaryotic elongation factor kinase 2 (eEF2K) which plays a major role in the survival of cells upon nutrient deprivation. Overall, the data suggest that overexpression of eEF2K in CML is associated with an increased sensitivity to nutrient-deprivation

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Lejmi, Esma. „Rôle de la Nétrine-4 dans l'angiogenèse pathologique“. Paris 7, 2008. http://www.theses.fr/2008PA077089.

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Cibler l'angiogenèse constitue une approche thérapeutique prometteuse pour le traitement de plusieurs pathologies. Dans ce travail, nous nous sommes intéressés à l'étude du rôle de la Nétrine-4 sur l'angiogenèse pathologique. La Nétrine-4 a été identifiée dans notre laboratoire comme étant un gène surexprimé par les cellules endothéliales activées. Nous avons montré que cette molécule exerce des activités opposées sur les deux types de cellules qui tapissent la paroi vasculaire. En effet, la Nétrine-4 inhibe la migration, la prolifération et l'organisation en structures tubulaires des cellules endothéliales via les récepteurs Néogénine et UncSB. Inversement, la Nétrine-4 stimule la migration des cellules musculaires lisses via les récepteurs DCC et UncSD et augmentent la couverture des réseaux endothéliaux par les cellules murales. In vivo, la Nétrine-4 présente une activité anti-angiogénique sur trois modèles différents. Elle inhibe l'angiogenèse dans un modèle d'implant de matrigel, réduit la néovascularisation choroïdienne induite par un impact laser et retarde la croissance tumorale dans un modèle de xénogreffe de cellules tumorales. Ce retard de croissance s'accompagne d'une diminution de la densité vasculaire et d'une augmentation de la couverture péricytaire. La Nétrine-4 est un facteur anti-angiogénique qui peut contribuer à la maturation des vaisseaux tumoraux à la fois par l'inhibition des cellules endothéliales angiogéniques et la maturation des péricytes tumoraux. Il s'agit donc d'une cible thérapeutique originale. Qui pourrait favoriser la diffusion des agents de chimiothérapie en augmentant la perfusion des vaisseaux normalisés
Inhibition of angiogenesis is a promising way for treatment of many diseases. To study the adaptation to angiogenesis, we compared gene expression patterns in endothelial cells (EC) after long term exposure to vascular endothelial growth factor (VEGF) or vehicle alone. We focused our search to anti-angiogenic genes up-regulated in angiogenic EC. We found that VEGF induced selectively in EC the overexpression of netrin-4 (N4). The Netrin family members (N1, N3, N4) can bind to two distinct classes of death receptors namely DCC/Neogenin and UncSA, B, C, D. We showed that Netrin-4 has opposite effects on endothelial cells and mural cells. Netrin-4 inhibits endothelial cells proliferation migration and tubologenesis through binding to Neogenin and recruitment of UncSB; and induces mural cells migration and endothelial cells coverage in a coculture model through binding to DCC and UncSD. In vivo, Netrin-4 significantly reduced pathological angiogenesis in matrigel and laser-induced choroïdal neovascularization models. Moreover, Netrin-4 overexpression delayed tumor angiogenesis in a model of subcutaneous xenograft. Immunohistochemistry analysis of tumor sections showed a decrease of vessels density and an increase of pericytes coverage. We propose that Netrin-4 acts as an anti-angiogenic factor which can normalize tumor vasculature to make it more efficient for drug delivery

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Rojo, Mendoza Sandra Elena. „Deciphering the molecular mechanisms of gonadal development“. Thesis, Paris 6, 2015. http://www.theses.fr/2015PA066658/document.

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Chez les mammifères, la détermination du sexe est un processus moléculaire complexe impliquant une balance de gènes finement régulée entre la voie mâle et femelle. La formation de testicules est initiée par SRY en synergie avec SF1 par sur-activation de l'expression de SOX9 au delà d'un seuil critique, ce qui entraîne l'activation du programme de la voie mâle et la répression de la développement ovarien. Des erreurs dans ce processus peuvent entraîner des pathologies de dysgénésie gonadique (DSD). Bien que de nombreux gènes impliqués dans le développement des gonades, sont à présent identifiés, les mutations de ces gènes n'expliquent qu'une minorité de cas de DSD, et les mécanismes conduisant à un développement sexuel inapproprié restent encore largement méconnus.Nous avons identifié, pour la première fois, une mutation ponctuelle dans le gène DMRT1 humain, facteur crucial de la détermination du sexe chez différentes espèces, associée à une absence de développement testiculaire. Une série d'analyses fonctionnelles démontrent le mécanisme par lequel cette mutation pourrait être lie à un DSD et que, différemment de chez la souris, DMRT1 humain, est impliqué dans la détermination testiculaire primaire.Le séquençage d’exomes sur des patients présentant un DSD de type 46,XY ont permis d’identifier des mutations délétères chez SOX7 & SOX8, suggérant une possible redondance fonctionnelle parmi les gènes SOX dans la détermination du sexe; mais également des mutations chez GATA4 établissant un rôle pour ce gène comme cause de DSD. Nos résultats d’analyses fonctionnelles indiquent des changements dans l'activité biologique des protéines mutées, mais dans certains cas, ne révèlent pas les mécanismes impliqués dans l’apparition de DSD. Par conséquent, le développement de nouveaux modèles cellulaires in-vitro pourrait permettre d’élucider ces mécanismes. Notamment, l’utilisation de cellules souches embryonnaires de souris, nous permettra de développer un nouveau modèle cellulaire pour mieux comprendre l'effet biologique de ces mutations
In mammals, sex determination and development is a complex process that involves genetic networks acting synergistically or antagonistically. Testis formation is initiated by SRY+SF1 up-regulation of SOX9 expression beyond a critical level, resulting in the activation of male-specific program and ovaries repression. In females, SRY absence results in the activation of ovarian development and testis repression. Errors in the process result in gonadal dysgenesis (DSD). Although, we begin to know the genes involved in gonad development, mutations in these genes explain only few DSD cases, and the mechanism leading to abnormal sexual development remain misunderstood. DMRT1 regulates sex-determination in different species. Its role in mammalian sex-determination is unclear. We identified the first point mutation in human DMRT1 associated with a lack of testis-determination. Functional analyses revealed the mechanism by which this mutation could lead to DSD. Showing that, differently to mouse, human DMRT1 is involved in primary testis-determination and that at molecular level sex-determination a very conserved process. Further studies using exome sequencing on patients with 46,XY DSD identify pathogenic mutations in 2 SOX genes: SOX7 & SOX8. Suggesting a possible functional redundancy amongst SOX genes in sex-determination. We identified mutations in GATA4 associated with 46,XY DSD, establishing a role for this gene as a DSD cause. The functional consequences of these mutations on their biological activity were assessed using classical approaches. Our results indicate changes in biological activity of the mutated proteins but in some cases don’t reveal the mechanisms involved in DSD. Therefore, the development of novel in-situ cellular models may provide a tool to identify these mechanisms. Using mouse embryonic stem cells we’re developing novel cellular models to understand the biological effect of these mutations in the appropriate environment

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Fievet, Loïc Marc André. „Caractérisation phénotypique et fonctionnelle des cellules stromales mésenchymateuses natives de la moelle osseuse humaine adulte“. Thesis, Toulouse 3, 2020. http://www.theses.fr/2020TOU30137.

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Au sein de la moelle osseuse (MO), les cellules souches hématopoïétiques (CSH) sont logées dans un microenvironnement en 3D spécialisé, appelé "niche". Cette structure contribue à la régulation du comportement (e.g. auto-renouvellement, engagement dans des voies de différentiation, prolifération et survie). Cette niche est composée de plusieurs types de cellules, comme les cellules endothéliales vasculaires, périvasculaires et ostéoblastiques. Les cellules stromales mésenchymateuses (CSM) périvasculaires jouent un rôle clé dans la formation du microenvironnement, tant par leur expression de facteurs pro-hématopoïétiques, que de leur capacité de différenciation vers le lignage ostéoblastique. Ainsi, les sous-populations de CSM composant la niche hématopoïétique sont impliquées dans la régulation de l'hématopoïèse, mais également dans la formation et la régénération du squelette. Récemment décrites chez la souris à l'échelle de la cellule unique, les sous-populations de CSM restent cependant inexplorées dans la MO humaine, il en est ainsi de leur rôle respectif dans la niche. Connaître l'identité des sous-populations cellulaires, déchiffrer leurs propriétés natives et recréer ex vivo ces niches physiologiquement fonctionnelles en 3D restent des enjeux scientifiques importants pour la compréhension de l'hématopoïèse et de l'ostéogenèse humaine. Dans ce travail, nous avons dans un premier temps, utilisé des approches de séquençage d'ARN à l'échelle de la cellule unique (scRNA-seq), afin de caractériser chaque population stromale de la MO humaine et d'identifier des facteurs de niche hématopoïétique clés hautement conservés entre les espèces. Nous avons ainsi identifié plusieurs sous-populations cellulaires, exprimant différents gènes régulateurs de l'hématopoïèse, comprenant des cellules endothéliales, des cellules murales et particulièrement des CSM ayant des trajectoires ostéoblastiques et adipogéniques distinctes. De manière intéressante, nos données suggèrent une hiérarchie de différenciation à branchement simple avec la présence d'un sous-ensemble multipotent, les cellules réticulaires exprimant fortement CXCL12 (CAR) qui seraient à l'origine des autres sous-populations de CSM. Nous avons observé un enrichissement des cellules CAR exprimant le récepteur à la leptine (LEPR) dans la fraction native CD45- / CD271+ / CD200+, ainsi que leur localisation in situ en utilisant des approches histologiques sur des biopsies humaines. Dans un deuxième temps, nous avons élaboré une méthode d'isolation ex vivo pour préserver et amplifier les cellules CAR de la MO, puis étudier leur auto-organisation en culture 3D. Nous avons constaté que les sphéroïdes dérivés des cellules de type CAR ont une angiogenèse abondante, sécrètent des cytokines pro-niche et récapitulent spontanément in vitro la formation osseuse intramembranaire précoce. Grâce à des modèles bio-informatiques et des techniques d'édition du génome, nous avons mis en évidence le rôle de la protéine WDR35 et du cil primaire dans la différenciation ostéoblastique médiée par les voies de signalisation Hedgehog et Wnt. Enfin, nous avons montré que la xénotransplantation ectopique de ces sphéroïdes pouvait donner naissance à des ostéoblastes humains matures, tout en formant une niche aux CSH après humanisation hématopoïétique de souris immunodéprimées NSG. Notre étude donne, pour la première fois, une cartographie du stroma de la MO humaine avec une résolution unicellulaire et montre que les cellules CAR cultivées en 3D représentent un nouvel outil utile en recherche fondamentale avec un fort potentiel en médecine régénérative
Within the bone marrow (BM), hematopoietic stem cells (HSC) are hosted in a specialized 3D microenvironment, called "niche", regulating their behavior (e.g. self-renewal, commitment to lineages, proliferation and survival). This niche is composed of several cells such as vascular endothelial, perivascular, and osteoblastic cells. Perivascular mesenchymal stromal cells (MSCs) play a key role in the formation of the microenvironment, both through expression of pro-hematopoietic factors, and their ability to differentiate towards osteoblastic lineage. Therefore, MSCs sub-populations are of crucial physiological importance in the regulation of hematopoiesis, but also for bone formation and regeneration. Recently described in mice at the single-cell level, BM MSCs subsets remain unexplored in humans, as well as their respective roles in the niche. By characterizing these sub-populations, and deciphering their native properties, it will be possible to shape ex vivo the physiological niches in 3D, addressing the major scientific challenges for understanding human hematopoiesis and osteogenesis. Here, we used single-cell RNA sequencing approaches to characterize the human BM stroma and described key hematopoietic niche factors highly conserved between species. We identified subsets of cells expressing different hematopoietic regulatory genes, spanning endothelial cells, mural cells, and especially MSCs with distinct osteoblastic and adipogenic trajectories. Of interest, our data suggest a simple branching differentiation hierarchy with the presence of a multipotent subset: the CXCL12-abundant reticular (CAR) cells at the origin of the other MSCs subpopulations. We confirmed the enrichment of the CXCL12-abundant reticular (CAR) cell subset expressing the Leptin receptor (LEPR+) in the CD45-/CD271+/CD200+ BM fraction as well as their in-situ localization using histological approaches on human biopsies. Secondly, we developed an ex vivo isolation method to preserve and amplify the BM CAR cells, and then studied their self-organization in 3D culture. We found that CAR derived organoids sustained high angiogenesis, secreted CSH niche cytokines, and spontaneously recapitulates early intramembranous bone formation in vitro. Using bioinformatics models and genome editing techniques, we highlighted the role of the WDR35 protein and the primary cilia in osteoblastic differentiation mediated by the Hedgehog and Wnt signaling pathways. Finally, we have shown that ectopic xenotransplantation of CSM-derived organoids could give rise to mature human osteoblasts while forming a niche for CSHs after hematopoietic humanization of immunocompromised NSG mice. Our study is the first map of the human BM stroma at a single-cell resolution, and CAR cells cultured in 3D represent a new tool useful in basic research as well as in regenerative medicine

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Djiana, Rose. „Régulation de la croissance des plantes par la lumière : caractérisation et étude de l'expression de deux peroxydases cationiques des parois de cellules de lin (linum usitatissimum)“. Rouen, 1998. http://www.theses.fr/1998ROUES045.

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Les peroxydases (E. C. 1. 11. 1. 7), enzymes ubiquistes impliquées dans de nombreux processus physiologiques, ont été étudiées chez le lin (Linum usitatissimum), pour montrer leur contribution à la régulation de la croissance par la lumière. Les analyses biochimiques nous ont permis d'identifier des isoperoxydases dont l'activité varie avec les conditions d'éclairement appliquées lors de la culture des plantules. En effet, il a été observé après focalisation isoélectrique, que les extraits protéiques pariétaux d'hypocotyles de plantules étiolées et ceux des plantules exposées ou transférées à la lumière blanche présentent des profils de distribution enzymatiques différents, entre les segments basaux et apicaux des hypocotyles. Les modifications majeures consistent en l'apparition et/ou l'intensification des bandes correspondant à deux isoformes cationiques (pI 9 et 9,4-9,5) après exposition à la lumière blanche, encore plus nette lorsque l'on analyse des extraits d'épidermes. La comparaison des profils IEF d'hypocotyles, d'épidermes, des cellules et de leur milieu de culture montre que les isoformes cationiques identifiées sont sécrétées dans le milieu de culture des cellules. Ainsi, la purification de deux isoformes cationiques (40 et 34 kDa, pI 9,4 et 9,5) a été faite à partir de cette source. Après microséquencage protéique, des motifs spécifiques choisis dans les séquences et des motifs peptidiques conservés de peroxydases ont servi d'amorces pour l'amplification par PCR d'ADNc partiels, dont deux clones de peroxydases (Linus. Prx_C2 et Linus. Prx_C3) correspondant aux isoformes purifiées. L'hybridation des ARNm transférés sur filtres, avec ces ADNc partiels a permis de révéler que les transcrits de Linus. Prx_C2 sont présents dans tous les organes de la plantule exposée ou non à la lumière, et sont abondants dans les cellules en culture. Leur expression connaît une stimulation transitoire dès le début de l'exposition à la lumière, surtout au niveau de l'hypocotyle et de la racine. Linus. Prx_C3 présent dans les cellules en culture n'est pas exprimé dans les organes des plantules, et pourrait être corrélé au stress.

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Carron, Léopold. „Analyse à haute résolution de la structure spatiale des chromosomes eucaryotes Boost-HiC : Computational enhancement of long-range contacts in chromosomal contact maps Genome supranucleosomal organization and genetic susceptibility to disease“. Thesis, Sorbonne université, 2019. http://www.theses.fr/2019SORUS593.

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L’information génétique est portée par la molécule d’ADN, un polymère de nucléotides de très grande taille. Afin de mieux comprendre les mécanismes impactant le repliement de l’ADN, on peut exploiter une technique de génomique qui permet de quantifier les contacts entre régions distales du génome. Cette technique expérimentale appelée ’capture de conformation de chromosome’ (Hi-C) donne des informations quantitatives sur l’architecture et le repliement tridimensionnel des chromosomes dans le noyau. Largement utilisée chez l’Homme, la souris et la drosophile, cette technique a grandement évolué durant ces dernières années, produisant ainsi des données de qualité variable. Jusque-là étudiées à des résolutions assez grossières, notre objectif est d’étudier les données Hi-C déjà publiées à des résolutions plus fines. Pour cela, j’ai développé un outil bioinformatique, Boost-HiC, pour améliorer l’analyse des contacts chromosomiques. Fort de cette expertise, je proposerai alors une analyse comparative des structures spatiales des génomes eucaryotes, permettant de clarifier comment extraire les compartiments génomiques de manière optimale. Cette expertise sera utilisée également pour décrire le lien entre les bordures des domaines topologiques de la chromatine et la position dans le génome humain des mutations ponctuelles prédisposant au cancer
Genetic information is encoded in DNA, a huge-size nucleotidic polymer. In order to understand DNA folding mechanisms, an experimental technique is today available that quantifies distal genomic contacts. This high-throughput chromosome conformation capture technique, called Hi-C, reveals 3D chromosome folding in the nucleus. In the recent years, the Hi-C experimental protocol received many improvements through numerous studies for Human, mouse and drosophila genomes. Because most of these studies are performed at poor resolution, I propose bioinformatic methods to analyze these datasets at fine resolution. In order to do this, I present Boost-HiC, a tool that enhanced long-range contacts in Hi-C data. I will then used our extended knowledge to compare 3D folding in different species. This result provides the basis to determine the best method for obtaining genomic compartements from a chromosomal contact map. Finally, I present some other applications of our methodology to study the link between the borders of topologically associating domains and the genomic location of single-nucleotide mutations associated to cancer

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Gasc, Cyrielle. „Capture de gènes par hybridation couplée au séquençage de nouvelle génération pour l'exploration d'échantillons métagénomiques. : Génomique et écologie microbienne“. Thesis, Clermont-Ferrand 1, 2016. http://www.theses.fr/2016CLF1MM24.

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Les microorganismes représentent la forme de vie la plus diverse et abondante sur Terre et jouent un rôle fondamental dans tous les processus biologiques. Cependant, du fait de la grande diversité des communautés microbiennes, la caractérisation fine des environnements complexes reste difficile par les approches moléculaires actuelles de PCR et de métagénomique. En effet, ces approches ne conduisent qu’à une caractérisation partielle des communautés et ne permettent pas systématiquement d’associer la structure des communautés aux fonctions métaboliques réalisées. L’approche de capture de gènes par hybridation appliquée à des échantillons métagénomiques complexes a démontré son intérêt pour révéler toute la diversité connue mais aussi inconnue des biomarqueurs fonctionnels ciblés, ainsi que pour enrichir leurs régions flanquantes sur quelques centaines de permettant en évidence des associations de gènes. Ainsi, les travaux de thèse ont visé à développer une nouvelle méthode de capture de gènes par hybridation capable d’enrichir de façon ciblée de larges régions génomiques à partir d’échantillons complexes, permettant ainsi de faire le lien entre structure et fonction des communautés microbiennes. Ces développements ont nécessité la détermination de sondes de capture, l’utilisation d’une méthode d’extraction d’ADN de haut poids moléculaire et la mise au point d’un protocole de capture permettant de piéger des fragments nucléiques de grande taille (jusqu’à 50 kb). La validation de la méthode de capture par hybridation sur un échantillon environnemental de sol a permis de révéler tout son potentiel. Appliquée au gène exprimant l’ARNr 16S, cette stratégie a permis de révéler une diversité microbienne non accessible par les approches moléculaires conventionnelles, avec une résolution d’identification jusqu'au niveau de l’espèce rendue possible grâce à la reconstruction de la séquence complète de ce marqueur phylogénétique. Appliquée à un gène fonctionnel, elle a conduit à la reconstruction de la séquence du biomarqueur et de ses régions flanquantes pouvant atteindre plusieurs dizaines de kb, permettant d’identifier les microorganismes possédant les capacités métaboliques d’intérêt. Ainsi, la capture par hybridation représente une approche alternative prometteuse pour le diagnostic environnemental en conduisant à une meilleure caractérisation des communautés microbiennes
Microorganisms are the most diverse and abundant life forms on Earth and are key players in thefunctioning of all biological processes. Nevertheless, PCR and metagenomics strategies aiming to describemicrobial communities are hampered by their huge diversity. Indeed, these molecular methods only drive to apartial description of communities and do not systematically allow linking functions back to the identities of themicroorganisms. Hybridization capture applied to complex metagenomic samples has demonstrated its efficiency to reveal all known and unknown diversity of targeted biomarkers, and to enrich their flanking regions over a few hundred bp facilitating the discovery of gene associations.Thus, this work aimed at developing a new hybridization capture method capable of specifically enrichinglarge genomic regions from complex samples allowing to associate structure and functions of communities. Thedevelopment of this method required the design of capture probes, the use of a high molecular weight DNAextraction method, and the elaboration of a capture protocol dedicated to the enrichment of large genomicfragments (up to 50 kbp).The validation of the hybridization capture method on an environmental soil sample uncovered all itspotential. Applied to the 16S rRNA gene, this strategy revealed greater microbial diversity than conventionalmolecular methods and improved phylogenetic resolution up to the species level thanks to the reconstruction offull-length genes. Applied to a functional gene, the method enabled the reconstruction of large genomic regionscarrying the targeted biomarker and its flanking regions over several tens of kbp, leading to the identification ofmicroorganisms with specific metabolic functions. Hybridization capture thus appears as a promising alternativemethod for environmental diagnosis, through providing a better knowledge of microbial communities

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Bertrand, Claire. „Long non-coding RNAs in cancer : the role of HOTAIR in Epithelial-to-Mesenchymal Transition“. Thesis, Paris 6, 2014. http://www.theses.fr/2014PA066632/document.

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Le génome humain est largement transcrit en milliers d’ARN non traduits en protéines. Les longs ARN non-codants (ARNlnc) ont un rôle majeur dans la régulation du génome, au cours du développement et lors de la progression de nombreuses maladies, dont les cancers. La transition épithélio-mésenchymateuse (TEM), donnant à une cellule la capacité de former des métastases, semble être un processus crucial transformant une tumeur bénigne en maladie mortelle. Certains ARNlnc ont été associés à ce phénomène, mais leur fonction reste à définir.Un modèle in vitro de TEM et des approches de séquençage d’ARN à très haut débit, nous ont permis de définir un catalogue d’ARNlnc dérégulés entre cellules épithéliales et mésenchymateuses. Parmi eux, nous avons identifié HOTAIR, étudié pour son expression aberrante dans les tumeurs métastasées et son interaction avec les complexes PRC2 et LSD1/CoREST/REST. Par des approches de perte et de gain de fonction, nous avons montré que HOTAIR n’est pas impliqué dans l’initiation de la TEM mais est un régulateur majeur de la prolifération cellulaire ainsi que des capacités de migration et d’invasion des cellules. Nous avons généré des lignées cellulaires sur-exprimant HOTAIR privé de son domaine d’interaction avec PRC2 ou LSD1. L’étude de leur phénotype et l’établissement de leur transcriptome ont permis de montrer que le domaine d’interaction avec le complexe LSD1/CoREST/REST est crucial pour la régulation de nombreux gènes par HOTAIR. Ces résultats permettent une meilleure compréhension du rôle des ARNlnc dans la TEM, et de la fonction cruciale de HOTAIR dans l’acquisition d’un phénotype métastatique par des cellules cancéreuses épithéliales
The human genome is pervasively transcribed into thousands of non-coding transcripts. Numerous studies underline the diversity and importance of long non-coding RNAs (lncRNAs) in genome regulation and their impact on development and diseases. Processes of cancer progression are extensively studied, in particular the Epithelial-to-Mesenchymal Transition (EMT) that enables epithelial cancer cells to invade other tissues to form metastases. If several lncRNAs have been associated with EMT, their molecular function is not clearly defined. Using a well-established in vitro cell model of EMT and high-throughput RNA sequencing approaches, we defined a catalogue of annotated and novel lncRNAs significantly deregulated between epithelial and mesenchymal states of HEK cells. Among them, we identified HOTAIR, linked to cancer metastasis and described as a scaffold RNA guiding chromatin-modifying complexes PRC2 and LSD1/CoREST/REST. Using loss- and gain-of-function approaches, we showed that HOTAIR is not an inducer of the EMT per se but a major regulator of cell proliferation rate, migratory and invasive capacities. We generated stable cell-lines over expressing HOTAIR transcripts lacking PRC2- or LSD1-interacting domains. Transcriptome analysis and phenotypic studies showed that LSD1-binding domain is crucial for HOTAIR-mediated gene regulation. Altogether, our results give new insights into lncRNAs role in EMT, with a better understanding of HOTAIR-mediated gene regulation mechanism and its role in the acquisition of a metastatic phenotype by cancer cells. Further studies will be performed to deeper investigate lncRNAs role in EMT, particularly for previously unannotated lncRNAs

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Bris, Céline. „Influence de la génétique mitochondriale en pathologie : apport des techniques de séquençage haut débit Deep sequencing shows that oocytes are not prone to accumulate mtDNA heteroplasmic mutations during ovarian ageing Novel NDUFS4 gene mutation in an atypical late-onset mitochondrial form of multifocal dystonia“. Thesis, Angers, 2017. http://www.theses.fr/2017ANGE0093.

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Les maladies mitochondriales sont des pathologies fréquentes du métabolisme caractérisées par une forte hétérogénéité clinique et génétique, notamment par la dépendance à 2 génomes, nucléaire (ADNn) et mitochondrial (ADNmt), et le concept d’hétéroplasmie (HT). L’objectif de ce travail de thèse a été de développer une stratégie d’analyse de l’ADNmt par séquençage haut-débit (NGS), puis de l’appliquer à l’étude des maladies mitochondriales et des pathologies liées au vieillissement : glaucome à angle ouvert (GPAO) et vieillissement ovarien précoce. Après validation des performances de notre stratégie NGS pour la détection et la quantification des variations de l’ADNmt, nous avons confirmé l’intérêt de l’analyse systématique de la totalité de l’ADNmt avec l’identification de nouveaux variants et l’utilisation de cellules uroépithéliales pour le diagnostic des maladies mitochondriales. Cependant, ces progrès génèrent de nouveaux défis dont l’interprétation des faibles HT et la priorisation des variants de signification inconnue. Pour les pathologies liées au vieillissement, nous avons mis en évidence le possible rôle protecteur des haplogroupes T et H chez les femmes, respectivement dans la survenue et la sévérité du GPAO, suggérant une modulation de l’influence de l’ADNmt par le genre et donc l’importance de la stratification par sexe dans les études d’association. En revanche, nous n’observons pas d’accumulation d’anomalies de l’ADNmt dans le vieillissement ovarien précoce. En perspective, nous rapportons l’identification d’une mutation de l’ADNn dans un phénotype atypique, rappelant la complexité de l’étude des pathologies mitochondriales, du fait de ce double génome
Mitochondrial diseases are common metabolic disorders characterized by strong clinical and genetic heterogeneity, in particular due to the dependence on 2 genomes, nuclear (nDNA) and mitochondrial DNA (mtDNA), and the concept of mitochondrial heteroplasmy. The purpose of this work was to develop a strategy for the analysis of the mtDNA through next-generation sequencing (NGS), and then to apply it to the study of mitochondrial diseases and those related to aging: primary open-angle glaucoma (POAG) and ovarian aging. After validating the performances of our NGS strategy for the detection and quantification of mtDNA variations, we confirmed the power of systematic analysis of the whole mitochondrial genome with the use of uroepithelial cells for mitochondrial diseases diagnosis and the identification of novel mtDNA variants. However, these advances generate new challenges such as the interpretation of low percentages of mtDNA mutations or the prediction of the pathogenicity of new variants. For aging-related diseases, we have identified the possible protective role of the mitochondrial haplogroups T and H in women, respectively in the occurrence and severity of POAG, suggesting that mtDNA influence is drivenby gender, and thus the importance of gender stratification for association studies. By contrast, we did not observe any accumulation of mtDNA abnormalities in early ovarian aging. In perspective, we report the identification of a nDNA mutation in an atypical phenotype, highlighting the complexity of mitochondrial diseases diagnosis, due to this double genome

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Lei, Lin. „Identification of portal mesenchymal stem cells and derived myofibroblasts in liver fibrosis“. Thesis, Sorbonne université, 2020. https://accesdistant.sorbonne-universite.fr/login?url=http://theses-intra.upmc.fr/modules/resources/download/theses/2020SORUS099.pdf.

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Les travaux antérieurs ont montré que les myofibroblastes portaux (PMFs) contribuaient de manière significative à la fibrogenèse et à l'angiogénèse dans la fibrose hépatique. L'objectif principal de cette thèse était de cartographier les cellules mésenchymateuses portales, et plus particulièrement la niche des cellules souches mésenchymateuses portales. Nous avons caractérisé la variété des cellules mésenchymateuses portales du foie de souris. Résultat important, nous avons identifié une population de cellules mésenchymateuses portales ayant les caractéristiques de cellules souches mésenchymateuses, désignées cellules souches mésenchymateuses portales (PMSCs), qui ont la capacité de se transformer en PMFs in vitro. Nous avons identifié Slit2 comme un marqueur des PMSCs par scRNA-seq et bulk RNA-seq. In vivo, nous avons mis en évidence l'expansion de PMSCs dans le foie de modèles murins de fibrose hépatique et de patients ayant une maladie chronique du foie. Nous avons identifié des signatures transcriptomiques spécifiques des PMSCs d’une part et des cellules étoilées du foie (CEF), de l’autre. Les résultats obtenus par l’utilisation de ces marqueurs, renforcent nos conclusions selon lesquelles les PMSCs s’accumulent de façon corrélée avec la fibrogenèse et l'angiogenèse, tandis que la signature des CEFs ne varie pas. En conclusion, nos travaux apportent des éléments à la connaissance des populations de cellules mésenchymateuses portales du foie. Ils ont permis d’identifier et caractériser les PMSCs ainsi que les myofibroblastes qui en dérivent, ouvrant de nouvelles perspectives dans le domaine des thérapies ciblées et des biomarqueurs pour la pratique clinique
Previous work has demonstrated that portal myofibroblasts (PMFs) significantly contributed to liver fibrogenesis and modulated angiogenesis in liver fibrosis. The main aim of this thesis was to elucidate the landscape of portal mesenchymal cells, with a particular focus on a portal mesenchymal stem cell niche. We characterized the murine normal liver portal mesenchymal cell landscape. Importantly, we revealed a portal mesenchymal cell population with the features of mesenchymal stem cells (MSCs), designated portal mesenchymal stem cells (PMSCs) that possessed the ability to give rise to PMFs in vitro. Furthermore, we identified Slit2 as a new marker of PMSCs based on scRNA-seq and bulk RNA-seq analysis. In vivo, we observed PMSC expansion (measured by the expression of Slit2) in liver from both animal fibrosis models (DDC and CDAA) and patients with chronic liver disease (NASH, PSC and other liver disease). Notably, we defined the specific gene signatures for PMSCs and hepatic stellate cells (HSCs), respectively. By using these markers, we provide further evidence indicating that PMSCs expand in correlation with fibrogenesis and angiogenesis in different murine and human liver diseases, whereas the HSCs gene signatures did not vary. In conclusion, our work collectively offers insights into the components and functions of the mammalian liver portal mesenchymal cell populations, and in particular, identify and characterize PMSCs and their derived myofibroblasts, opening up the possibility for the development of novel targeted drugs or biomarkers of clinical significance with increased precision

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Woringer, Maxime. „Tools to analyze single-particle tracking data in mammalian cells“. Electronic Thesis or Diss., Sorbonne université, 2019. http://www.theses.fr/2019SORUS419.

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Ce travail présente des outils pour analyser la régulation de la transcription dans les cellules eucaryotes, en particulier pour le suivi de facteurs de transcription (TF) individuels dans les cellules de mammifères. Un noyau de cellule eucaryote est complexe et contient de nombreuses molécules (ADN, ARN, protéines, ATP, etc). Ces molécules interagissent avec des TF et influencent la transcription. Certaines de ces interactions peuvent être étudiées par des techniques de biochimie. La plupart, en particulier les interactions faibles, non covalentes, sont invisibles par ces méthodes. La microscopie de cellules vivantes et le suivi de molécules uniques (SPT en anglais) sont de plus en plus utilisées pour étudier ces phénomènes. L'inférence des paramètres biophysiques d'un facteur de transcription, par exemple son coefficient de diffusion, son nombre de sous-populations ou son temps de résidence sur l'ADN sont cruciaux pour comprendre sa dynamique et son influence sur la transcription. Des outils validés et précis sont donc nécessaires pour analyser les données de SPT. Pour être utile, un outil de SPT doit être non seulement validé, mais aussi accessible à des non-programmeurs. Ils doivent aussi tenir compte des biais expérimentaux présents dans les données. Nous proposons un outil d'analyse de SPT, qui se fonde sur l'estimation du propagateur de la diffusion. Ce outil a été validé et est accessible par une interface web. Nous avons montré qu'il donne des résultats proches de l'état de l'art. Il a été testé dans deux cadres : (1) l'étude de la diffusion augmentée par la catalyse enzymatique in vitro et (2) l'analyse de la dynamique du TF c-Myc dans des cellules de mammifères
This work aims at providing tools to dissect the regulation of transcription in eukaryotic cells, with a focus on single-particle tracking of transcription factors in mammalian cells. The nucleus of an eukeryotic cell is an extremely complex medium, that contains a high concentration of macromolecules (DNA, RNA, proteins) and other small molecules (ATP, etc). How these molecules interact with transcription factors, and thus influence transcription rates is an area of intense investigations. Although some of these interactions can be captured by regular biochemistry, many of them, including weak, non-covalent interactions remain undetected by these methods. Live-cell imaging and single-particle tracking (SPT) techniques are increasingly used to characterize such effects. The inference of biophysical parameters of a given transcription factor (TF), such as its diffusion constant, the number of subpopulations or its residence time on DNA, are crucial to understanding how TF dynamics and transcription intertwine. Accurate and validated SPT analysis tools are needed. To be used by the community, SPT tools should not only be carefully validated, but also be easily accessible to non-programmers. They should also be designed to take into account known biases of the imaging techniques. In this work, we first propose a tool, accessible through a web interface, based on the modeling of the diffusion propagator. We validate it extensively and show that it exhibits state-of-the art performance. We apply this tool to two experimental settings: (1) the study of catalysis-enhanced diffusion in-vitro and (2) the analysis of the dynamics of the c-Myc transcription factor in mammalian cells

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Nkiliza, Aurore. „Intérêt du transcriptome de cellules mononucléées périphériques sanguines dans l’étude des mécanismes moléculaires de la maladie de Parkinson“. Thesis, Lille 2, 2015. http://www.theses.fr/2015LIL2S058/document.

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La maladie de Parkinson est une maladie neurodégénérative dont la physiopathologie fait intervenir des causes génétiques qui contribuent non seulement aux formes familiales mais aussi au développement des formes sporadiques, les plus fréquentes, en interagissant sans doute alors avec des facteurs environnementaux. La découverte des déterminants génétiques a permis d’identifier plusieurs mécanismes moléculaires contribuant au développement de la maladie. Ils en ont démontré le caractère complexe. Pour mieux comprendre l’étendue des perturbations moléculaires liées à la maladie, nous avons entrepris des analyses globales du transcriptome par le biais de puces ou de séquençage des ARNs (RNAseq) à partir de cellules mononuclées périphériques sanguines de patients présentant des formes génétiques et sporadiques de la maladie ainsi que de sujets sains.Nous avons identifiés la dérégulation de nombreux gènes dans les cellules mononuclées périphériques sanguines de sujets porteurs de la mutation G2019S de LRRK2 et de sujets sporadiques par rapport à des sujets sains appariés. L’analyse des voies et des processus cellulaires associés à ces gènes met en exergue une altération de la voie de signalisation EIF2 commune aux sujets porteurs de la mutation G2019S de LRRK2 et aux sujets sporadiques. Cette voie fait écho à la régulation de la traduction et de l’épissage, deux processus faisant partie du métabolisme des ARNs. Ces altérations sont retrouvées dans les cellules mononuclées périphériques sanguines de sujets parkinsoniens porteurs de mutations du gène ATXN2, essentiellement connu pour son rôle dans la stabilité, l’épissage et la traduction des ARNm. Cette perturbation des ARNs semble être une altération commune à l’ensemble des formes de maladie de Parkinson étudiées et pourrait donc être un mécanisme sous-tendant la maladie.Les résultats du séquençage des ARNs obtenus chez des parkinsoniens présentant une forme sporadique ou porteurs de mutations délétères ainsi que chez des sujets sains corroborent cette hypothèse en montrant d’une part des différences quantitatives et qualitatives de variants d’épissage au sein d’ARNm eux-mêmes impliqués dans le métabolisme des ARNs et d’autres part des variations de l’épissage de gènes impliqués dans des mécanismes moléculaires connus de la maladie.Ainsi, nos données s’inscrivent dans la dynamique physiopathologique actuelle qui fait état de nombreuses perturbations du métabolisme des ARNs dans les maladies neurodégénératives. Dans la maladie de Parkinson, ces défauts impliqueraient des variations quantitatives et qualitatives de variants d’épissage au sein de gènes liés à l’épissage mais aussi dans des mécanismes connus pour contribuer à la maladie. Une analyse approfondie de ces dérèglements devraient permettre de déterminer leur spécificité et d’évaluer leur potentiel en tant que marqueurs de la maladie et cibles thérapeutiques
Parkinson’s disease is a neurodegenerative disorder with genetic determinants not only contributing to rare familial forms of the disease but also involved in prevalent sporadic forms by interacting with environmental factors. Thanks to the identification of these determinants, several molecular mechanisms contributing to the disease have been found highlighting also its complexity. In order to better understand the molecular perturbations underlying the disease, we performed whole transcriptome analyses using microarrays and RNA sequencing (RNAseq) from peripheral blood mononuclear cells of Parkinson’s disease patients with genetic and sporadic forms of the disease as well as healthy controls.We identified several dysregulated genes in the cells of Parkinson’s disease patients with a G2019S LRRK2 mutation and sporadic patients compared to healthy controls. Pathways and cellular processes related to those genes mainly display disturbances of EIF2 signaling common to G2019S LRRK2 mutation carriers and sporadic patients. These data pinpoint potential perturbations of translation and RNA splicing both related to RNA metabolism. Involvement of RNA metabolism is also observed in peripheral blood mononuclear cells of Parkinson’s disease patients carrying mutations of ATXN2 gene encoding for ataxin-2 protein. It is mainly known as a regulator of the stability, the splicing and the translation of mRNA. Such RNA-mediated perturbations seem to be a common to all forms of Parkinson’s disease and might be a physiological mechanism of the disease. RNAseq data from Parkinson’s disease patients having or not deleterious mutations are in agreement with this hypothesis showing quantitative and qualitative discrepancies of splicing variants inside genes involved in RNA metabolism but also in known molecular pathways of the disease.As a conclusion, our results support the current view of RNA metabolism association with neurodegenerative disorders. In Parkinson’s disease, those alterations could involve quantitative and qualitative variations of splicing variants inside genes involved in RNA metabolism but also in known perturbed molecular pathways of the disease. Further analyses of these dysregulations should be helpful to determine their specificity and evaluate their potential as biomarkers and therapeutic targets

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Chami, Bayan. „Développement de technologie µLAS pour la séparation des acides nucléiques“. Thesis, Toulouse 3, 2019. http://www.theses.fr/2019TOU30206.

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La séparation par taille des acides nucléiques est un processus important, couramment utilisé pour le diagnostic, l'analyse médico-légale et le séquençage. Ce processus est le plus souvent effectué à l'aide de gels en plaques dans les laboratoires de recherche ou par électrophorèse capillaire pour des analyses à haut débit dans les laboratoires de médecine légale. Dans un souci de simplification, de réduction des coûts et d'accélération de l'analyse, des technologies de micropuces remplissant la même fonction ont été développées. Elles offrent une réduction du temps d'analyse, de la consommation d'échantillon, ainsi que la portabilité, l'automatisation et le multiplexage. Aujourd'hui, avec l'avancée des technologies de micro et nanofabrication, des dizaines d'études émergent chaque année sur de nouveaux dispositifs de séparation par micropuces pour les acides nucléiques, les protéines, les particules, les cellules, les biovésicules, etc... Nos travaux portent sur le développement d'une technologie de micropuce pour la séparation des acides nucléiques; molécules d'ADN double brin de différentes tailles et ADN et ARN simple brin. La technologie appelée "µLAS" a été créée en 2016. Elle fonctionne sur le principe du fractionnement et de la concentration simultanés d'acides nucléiques dans un dispositif microfluidique utilisant un actionnement électro-hydrodynamique dans une solution viscoélastique. Le groupe avait démontré l'utilisation de la technologie pour le fractionnement de l'ADN sur une plage de 300-50000 bp et son application pour le diagnostic de la maladie de Huntington et l'analyse de l'ADN en circulation. Dans le cadre de ma thèse, j'ai travaillé sur l'optimisation de la technologie µLAS au format puce afin d'étendre la plage de tailles de séparation aux molécules d'ADN de 25 bp à 150 Kbp et de réaliser la séparation des molécules d'ARN. Cette optimisation a nécessité la modélisation du fractionnement en fonction de l'actionnement électro-hydrodynamique bidirectionnel dans les écoulements viscoélastiques, qui reproduit avec précision les données expérimentales. L'étude de la géométrie de la micropuce, de différentes formulations de matrice polymère et de paramètres d'actionnement nous permet de montrer que µLAS est à la pointe de l'état de l'art grâce à un positionnement sur l'ensemble des techniques de séparation sur micropuces
Nucleic acids size-separation is an important, routinely used process for diagnosis, forensic analysis, and sequencing. This process is regularly performed using slab gels in research laboratories and using capillary electrophoresis for high throughput analysis in forensic laboratories. In attempts to simplify, reduce the cost and speed up the analysis, microchip technologies, that perform the same function, have been developed, which offered reduced analysis time, sample consumption, cost, and labor in addition to portability, automation and multiplexing. Today, with the advancement of micro and nanofabrication technologies, tens of studies emerge every year on new microchip separation devices for nucleic acids, proteins, particles, cells, bio-vesicles etc. Using different physical principles, each of these devices could separate specific types of molecules or specific size ranges. Our work discusses the development of a microchip technology for the se! paration of nucleic acids; double stranded DNA molecules of different size ranges, single stranded DNA and RNA. The technology called "µLAS" has been created in 2016. It works on the principle of simultaneous fractionation and concentration of nucleic acids in a microfluidic device using opposing electro-hydrodynamic actuation in a viscoelastic polymer sieving matrix. The group had demonstrated the use of the technology for the fractionation of dsDNA over the range of 300-50000 bp, the application of the technology for the diagnosis of Huntington's disease, and the analysis of circulating DNA. Further developments have extended the separation range to 100's of Kbps using microchip and capillary formats. In the capillary format, the technology performs fast analysis of circulating DNA. In the framework of my PhD, I worked on the optimization of chip-based µLAS technology in order to extend the range of separation sizes to DNA molecules from 25 bp to 150 Kbp and to achieve the separation of RNA molecules. This optimization required modeling of size fractionation based on bidirectional electro-hydrodynamic actuation in viscoelastic flows, which accurately reproduces the experimental data. The study of the microchip geometry, different polymer matrix formulations and actuation parameters allows us to show that µLAS is at the forefront of the state of the art thanks to a positioning with respect to all microchip separation techniques

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Cazin, Coralie. „Dissecting the impact of cellular senescence on muscle regeneration“. Electronic Thesis or Diss., Sorbonne université, 2020. https://accesdistant.sorbonne-universite.fr/login?url=https://theses-intra.sorbonne-universite.fr/2020SORUS070.pdf.

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La régénération tissulaire est un processus de remplacement des cellules perdues ou endommagées lors d'une blessure. La sénescence cellulaire est une réponse physiologique au stress caractérisée par un arrêt du cycle cellulaire stable. Mon doctorat vise à étudier la sénescence in vivo lors de la régénération musculaire, y compris son identité, ses fonctions et sa dynamique. Nous avons précédemment démontré que la sénescence induite par blessure favorise la reprogrammation dans le muscle squelettique. Mon projet vise à étudier la biologie de la sénescence lors de la régénération musculaire de manière systémique. Premièrement, j'ai montré que la sénescence atteignait son maximum au 3ème jour après la blessure et se terminait au 15ème jour après la blessure. Ensuite, j'ai trouvé que les FAPs (Fibro-Adipogenic Progenitors) sont les principales cellules qui deviennent sénescentes. Par ailleurs, les FAPs sénescents améliorent peut-être la myogenèse in vitro de manière paracrine. P57 est le principal inhibiteur de CDK qui permet l’induction de la sénescence associée aux FAPs. En effet, il y a une réduction significative de la sénescence induite par blessure chez les souris P57KO. Enfin, nous avons trouvé que Mcl-1 est surexprimé dans les FAPs sénescents, ce qui suggère l'utilisation potentielle d’inhibiteurs de MCL-1 comme drogues sénolytiques. Dans l’ensemble, mon doctorat montre que les FAPs sont sénescents lors d'une lésion musculaire, via P57 et pourraient être important pour la régénération musculaire en favorisant la myogenèse. Ces découvertes soutiennent fortement le rôle bénéfique de la sénescence lors de la régénération musculaire
Tissue regeneration is a process of replacing lost or damaged cells upon injury. Cellular senescence is a physiological response to stress characterized by a stable cell cycle arrest and is associated with various biological and pathological processes. My Ph.D. project aims to investigate in vivo senescence during muscle regeneration, including its identities, functions, and dynamics. It has been demonstrated that cellular senescence could facilitate optimal wound healing. We previously demonstrated that injury-induced senescence promotes reprogramming in the skeletal muscle, notably through IL-6 (Chiche et al., 2017). Firstly, I showed that senescence was peaking at day 3 post-injury and terminated by day 15 post injury. Then, I found that FAPs is the primary cell type that becomes senescent by RNA sequencing (both bulk population and single-cell). Besides, senescent FAPs enhance myogenesis in vitro in a paracrine manner. Of note, P57 is the major CKI which mediates the FAPs-associated senescence. Importantly, there is a significant reduction of the injury-induced senescence in the P57 null mice. Lastly, we found Mcl-1 is overexpressed in the senescent FAPs, suggesting the potential usage of MCL-1 inhibitors as senolytic drugs.Taken together, my ph.D show that FAPs are senescent upon muscle injury, which is P57-dependent and might be important to muscle regeneration by enhancing myogenesis. These findings strongly support a beneficial role of senescence during muscle regeneration, which has direct implications in muscular degenerative diseases and muscle aging

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Joubel, Anita. „Analyse protéomique du suppresseur de tumeur p53 : modifications post-traductionelles et protéines partenaires“. Thesis, Lille 1, 2008. http://www.theses.fr/2008LIL10035.

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La protéine suppresseur de tumeurs p53, est impliquée dans de nombreuses voies de signalisation cellulaire et est également la protéine la plus mutée dans les cancers. Les mécanismes de régulation de l'activité de p53 impliquent des modifications post-traductionnelles et des protéines partenaires pour lesquelles les données de la littérature sont pléthoriques et fragmentaires. Dans la présente étude, nous avons développé une approche de protéomique basée sur l'immunoprécipitation et la spectrométrie de masse pour étudier les modifications post-traductionnelles de p53 et identifier ses protéines d'interaction. Dans un premier temps nous avons séquencé la totalité de la protéine p53 immunoprécipitée des cellules du modèle Cos-1. Cette expérience nous a permis d'identifier plusieurs sites de phosphorylations déja connus sur les serines: S15, S33, S315 et S392. Nous avons également identifié des acétylations sur les lysines suivantes: K305, K370, K372, K373, K381 et K382. C'est la première fois que des acétylations sont reportées pour la proteine p53 isolée des cellules Cos-1. De plus, il est reporté pour la toute première fois l'existence d'acétylation sur les résidus 319, 357 et 386. Dans un second temps, nous avons recherché les protéines qui se fixent sur p53 dans les cellules épithéliale mammaire non cancéreuse (MCF10A) versus les cellules cancéreuse (MCF7). Nos résultats identifient un certain nombre de partenaires potentiels de p53 et montrent pour la première fois que l'inhibiteur de serine protéase Maspine est capable de former un complexe avec p53. Ce complexe nucléaire est retrouvé exclusivement dans les cellules non cancéreuses MCFlOA et pourrait constituer un nouveau mécanisme de régulation de l'activité de p53
The tumor suppressor protein p53 is involved in many signaling pathways and is the most frequently mutated protein in cancers. The mechanisms for the regulation of p53 activity involve post-translational modifications and partner proteins for which literature is phletoric and fragmentary. ln the present study, we have developed a proteomics approach, coupling immunoprecipitation and mass spectrometry, to investigate p53 post-translational modifications and protein partners. First, we sequenced the full p53 protein immunoprecipitated from the Cos-l cells. This lead to the identification and localization of several known phosphorylations on serine residues S 15, S33, S315 and S392 as weIl as several known acetylations on lysine residues: K305, K370, K372, K373, K381 and K382. Acetylation sites are being reported for the tirst time on monkey p53 from Cos-l cells on lysine 319,357 and 386. Second, we looked for partner proteins that can bind to p53 in non cancerous (MCFlOA cells) versus cancerous (MCF7) human breast epithelial cells. Our results report a series of putative interacting partners among which the serine protease inhibitor maspin. The complex between p53 and maspin was validated by westem-blotting, localized in the nucleus and found in the noncancerous MCFlOA cells only. The p53/maspin interaction could represent a new regulatory mechanism for the activity of p53

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Galtier, Eloïse. „Etude du dégradosome à ARN de la bactérie pathogène Helicobacter pylori“. Thesis, Sorbonne Paris Cité, 2017. http://www.theses.fr/2017USPCC002.

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Dissertationen zum Thema „Séquençage de cellules uniques“

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