Dissertationen zum Thema „Septicémies“

Etude clinique sur des infevtions graves à Pseudomonas cepacia. A partir d' une série continue de 62 patients ayant présenté une hémoculture positive à P. Cepacia de mars 1983 à août 1986 dans les services cliniques de Clermont-Ferrand, l' auteur a réalisé une enquête clinique et une étude thérapeutique et pronostique de ces infections. L' étude des observations cliniques a permis d' identifier les principaux paramètres des infections graves à P. Cepacia. La résistance de ce germe à de nombreux antibiotiques pose un difficile problème thérapeutique. Le travail a essayé de préciser les différents traitements antibiotiques qui restent actifs sur ce germe. Enfin l' auteur a essayé de définir à partir d' une enquête épidémiologiques une attitude préventive qui devrait permettre une réduction de la fréquence de ces infections.

L'objet de ce travail a été d'étudier la présentation sémiologique des infections systémiques chez le sujet âgé selon. E nombre d'hémoculture(s) positives(s). 5 critères cliniques et biologiques ont été étudiés. Distinguait 2 groupes de malades : - Le groupe "bactériémie" (1 seule hémoculture positive) et - Le groupe "septicémie" (2 hémocultures positives ou plus). L'étude des caractères sémiologiques permettait de noter - L'inconstance des signes cliniques et biologiques dans les 2 groupes. - Que le nombre moyen de signe est comparable dans les 2 groupes. - Que seuls 3 signes sur les 16 étudiés diffèrent quant à leur fréquence entre les 2 groupes. En conclusion la présentation sémiologique de la septicémie et de la bactériémie est comparable chez le sujet âgé.

La septicémie chez le sujet âgé n' est pas plus fréquente que chez l' adulte jeune mais beaucoup plus grave. Tous les germes peuvent se rencontrer mais en milieu institutionnalisé les germes hospitaliers sont redoutables. Le système immunitaire du vieillard est défaillant et la mortalité dépend étroitement du terrain sur lequel survient la maladie, en particulier chez les cancéreux.

Nos travaux ont permis de mettre en évidence un plasmide de virulence pS88 portant une région plasmidique conservée (CVP) impliquée non seulement dans la virulence de la souche de méningite néonatale S88 appartenant au sous-groupe hautement virulent B21 mais aussi dans la virulence d'une souche de méningite multirésistante (S286) appartenant au groupe phylogénétique A/B1 associé aux souches commensales. L'analyse épidémiologique d'une collection de souches A/B1 a montré que CVP pourrait être un déterminant génétique majeur des souches ExPEC A/B1. D'autre part, nos travaux sur les souches de septicémies néonatales E. Coli ont mis en évidence l'implication potentielle de CVP dans les infections materno-foetales. L'analyse fonctionnelle de CVP devrait permettre d'identifier de nouveaux facteurs de virulence concourant à une meilleure compréhension de la physiopathologie des infections néonatales à E. Coli et au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques ou prophylactiques
Our work has highlighted a virulence plasmid pS88 carrying a conserved region (CVP) not only involved in the virulence of strain S88 neonatal meningitis belonging to subgroup highly virulent B21 but also in the virulence of a resistant strain of meningitis (S286) belonging to phylogenetic group A/B1 associated with commensal strains. Epidemiological analysis of a collection of strains A/B1 showed that CVP could be a major genetic determinant of ExPEC strains A/B1. On the other hand, our work on strains of neonatal spesis E. Coli showed the potential involvement of CVP in early-onset infections. Functional analysis of CVP should identify new virulence factors contributing to a better understanding of the pathophysiology of E. Coli neonatal infections and the development of new therapeutic or prophylactic strategy

Les bactéries impliquées dans les septicémies mettent en place des mécanismes de résistance aux antibiotiques très variés. Chaque heure perdue à identifier ces mécanismes diminue fortement les chances de survie du malade. L’élaboration de méthodes analytiques rapides, efficaces et robustes est primordiale pour le diagnostic des infections bactériennes afin de pouvoir offrir dès que possible le traitement approprié à chaque patient. Les enjeux de cette thèse concernent l’application de la protéomique bottom-up pour l’analyse des biomolécules associées à l’antibiorésistance. Le premier grand axe de recherche de cette thèse a été le développement de méthodes analytiques ciblées en spectrométrie de masse à basse résolution avec le mode d’acquisition Multiple Reaction Monitoring pour l’identification de marqueurs spécifiques aux bêta-lactamases à spectre élargi (BLSE). Ces enzymes sont de plus en plus retrouvées dans le cadre du sepsis et induisent un degré élevé de résistance aux antibiotiques. L’étude a été centrée sur « TEM » et « SHV », deux bêta-lactamases qui peuvent présenter une résistance à plus ou moins large spectre selon les mutations mises en jeu dans leur chaine protéique. La capacité de la méthode à discriminer les variants de TEM et SHV à activité de BLSE a été validée lors de l’analyse de 530 hémocultures d’entérobactéries. Le deuxième axe de recherche a été d’évaluer l’intérêt de la spectrométrie de masse à haute résolution pour le diagnostic des infections bactériennes du sang. L’accessibilité du mode d’acquisition Sequential Window Acquisition of all THeoretical fragment ion spectra à une application en routine a été étudiée via le développement d’un logiciel automatisé retraitant les données complexes issues de ce mode d’acquisition non ciblé. Cette méthode a ensuite été utilisée pour identifier les mécanismes responsables de la résistance aux antibiotiques observés chez 40 souches d’entérobactéries et a été comparée à des approches en protéomique ciblées
The bacteria involved in sepsis develop a wide range of antibiotic resistance mechanisms. Every hour lost in identifying these mechanisms severely reduces the patient's survival rate. The development of rapid, effective and robust analytical methods is essential for diagnosis, so that the appropriate treatment can be offered to each patient as soon as possible. This thesis focuses on the application of bottom-up proteomics to the analysis of biomolecules associated with antibiotic resistance. The first main research axis was the development of targeted analytical methods using low-resolution mass spectrometry in Multiple Reaction Monitoring acquisition mode for the identification of markers specific to extended-spectrum beta-lactamases. These enzymes are increasingly found in sepsis and induce a high degree of antibiotic resistance. The study focused on “TEM” and “SHV”, two beta-lactamases that can display a varying degree of resistance depending on the mutations involved in their protein chain. The method's ability to discriminate the ESBL variants of TEM and SHV was validated by analysing 530 blood cultures from Enterobacterales strains. The second area of research was to investigate the relevance of high-resolution mass spectrometry for the diagnosis of bloodstream infections. The suitability of the Sequential Window Acquisition of all THeoretical fragment ion spectra mode for routine use was investigated by the development of an automated software tool for processing the complex data generated by this non-targeted acquisition method. This method was then used to identify the mechanisms involved in the antibiotic resistance observed in 40 Enterobacterales strains and was compared with targeted approaches

La septicémie associée à un cathéter de voie centrale (central line-associated bloodstream infection, CLABSI) est la cause la plus fréquente d’infection nosocomiale aux soins intensifs et entraine une morbidité significative, un allongement des durées d’hospitalisation et un accroissement des coûts. La maîtrise des CLABSI est une préoccupation permanente dans les institutions hospitalières.

Les staphylocoques à coagulase négative (SCN), et en particulier Staphylococcus epidermidis, colonisants de la peau, sont parmi les agents pathogènes opportunistes les plus fréquemment impliqués dans les infections de matériel étranger comme les cathéters, grâce à leur capacité à produire un biofilm.

Dans un travail préliminaire sur la prise en charge des septicémies sur cathéters à chambres implantables, nous avons observé qu’un tiers des septicémies dues à des SCN se solde par le retrait du cathéter et que la sévérité des présentations cliniques est très variable. Nous avons suspecté que des facteurs liés à S. epidermidis lui même pouvaient jouer un rôle dans la sévérité de la présentation clinique et le succès ou l’échec thérapeutique.

Objectifs :

Ce travail de thèse a pour but d’approfondir les connaissances nécessaires à la maîtrise de la septicémie sur cathéter à S. epidermidis. Il a été développé sur deux axes principaux :(1) une recherche sur les facteurs liés au pathogène, basée sur l’étude phénotypique et génotypique des différences entre les S. epidermidis provenant de trois sous-populations (volontaires sains - personnel soignant - patients avec CLABSI) et sur la compréhension de la source à l’origine de la contamination (peau du patient versus personnel soignant); (2) une approche clinique opérationnelle sur les aspects de prévention et de surveillance des CLABSI.

Méthodes :

Nos travaux de recherche ont porté sur l’épidémiologie moléculaire des S. epidermidis (pulsotypie, PFGE et multi-locus sequence typing, MLST), sur leur antibio-résistance (phénotypique et génotypique), sur la détermination du type de cassette mec (SCCmec typing), sur l’identification de facteurs de virulence [ACME (arginine catabolic mobile element) et ica (intercellular adhesin)] et sur la recherche de la production de biofilm in vitro dans les sous-populations étudiées.

Nous avons également discuté les limites des définitions des CLABSI dans une étude comparative et avons investigué, dans une étude multicentrique, la prévention des CLABSI par un programme de monitoring externe des processus de soins de cathéters et de feedback régulier au personnel soignant concernant leurs indicateurs de performance.

Résultats :

Facteurs liés au pathogène :

Les souches de S. epidermidis colonisant le personnel soignant sont résistantes à plus

d’antibiotiques que celles colonisant les volontaires sains (multisensibles), mais à un moins grand nombre que celles causant des CLABSI (souvent multirésistantes), à l’exception de la résistance à la méticilline.

La production de biofilm est sous la dépendance de l’opéron ica mais l’expression de ces gènes est variable, soumise à une régulation complexe. La majorité des S. epidermidis ayant une production importante de biofilm in vitro sont porteurs de l’opéron ica tandis que la majorité des S. epidermidis n’en produisant pas sont ica négatif. Par contre, nous avons observé que les souches de S. epidermidis formant un biofilm in vitro avec une biomasse importante étaient présentes dans les trois sous-populations étudiées.

Tant les S. epidermidis commensaux que ceux responsables d’infection présentent une grande diversité génétique par PFGE mais ils se révèlent, après analyse MLST, comme appartenant pour la plupart au même complexe clonal (CC).

Nous avons également montré que dans un tiers des cas, les souches de S. epidermidis récoltées sur les mains des soignants dans le même hôpital et au cours de la même période de temps, sont identiques à celles responsables de CLABSI, ce qui soutient l’hypothèse que les soignants peuvent servir de réservoir.

Cependant, les présentations cliniques les plus sévères de CLABSI sont dues à des souches de S. epidermidis appartenant à certains MLST séquences types (STs) particuliers :ST2 et SLV (single locus variant) ST54, toutes ica positives, mecA positives et multi-résistantes. Aucune souche présentant ces MLST types n’a été retrouvée sur les mains des soignants, ni chez les volontaires sains.

Surveillance et prévention :

Nous avons démontré que l’intensité de la documentation microbiologique et l’usage de définitions incluant des critères cliniques font varier les densités d’incidence de CLABSI mesurés et donc limitent l’intérêt des comparaisons inter-hospitalières.

Nous avons également démontré l’efficacité d’un programme original de prévention de type audit externe des compliances aux processus de soins des cathéters associé à un feedback régulier. En effet, nous avons observé une diminution statistiquement significative de l’incidence des CLABSI dans les unités de soins intensifs mais nous avons également identifié les limites de cette approche.

Conclusion :

La septicémie sur cathéter due à S. epidermidis peut être contrôlée par un programme de prévention en diminuant les risques de contamination tant endo- qu’extra-luminale. Cependant, certains clones de S. epidermidis (ST2 et ST54) particulièrement adaptés à l’environnement hospitalier, combinant virulence et multi-résistance, sont responsables de présentations cliniques sévères de CLABSI. De nouvelles approches basées sur les caractéristiques des souches pathogènes de S. epidermidis et sur la sévérité de la présentation clinique de la CLABSI pourraient permettre le développement de stratégies de prévention et de traitement plus ciblées.

Doctorat en Sciences médicales
info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les infections causées par Staphylococcus aureus sont associées à un fort taux de mortalité au sein de la société. En plus d'être responsable de diverses infections, cette bactérie possède une panoplie de résistances aux antibiotiques ce qui rend son traitement beaucoup plus difficile. La vaccination semble être la voie la plus prometteuse compte tenu de l'inefficacité des antibiotiques. Bien que cette bactérie cause beaucoup de dommages, il est difficile d'enrayer toute source de S. aureus puisque celle-ci est un commensal de l'humain et se retrouve au niveau du nez et sur la peau de porteurs sains. L'étude de l'efficacité d'un vaccin suite à une infection septicémique avec différentes souches de S. aureus chez la souris était le principal objectif du présent projet. Il s'agissait donc de comparer la protection immunitaire engendrée par le vaccin face à ces souches. Les souches SHY97-3906 (isolat de mammite), MRSA256c (isolat nasal chez l'humain) et Newman (souche contrôle séquencée, isolée au départ d'une ostéomyélite) ont été utilisées. Le vaccin que nous avons employé est composé de quatre protéines différentes hautement conservées chez les différentes souches de S. aureus soit; IsdB (iron-regulated surface determinant ), HarA/IsdH (haptoglobin receptor A ), CIfA (clumping factor A ) et GapC/B (glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase). De plus, deux adjuvants ont été utilisés, le PCEP (polyphosphazene ) et le pGM-CSF (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor plasmidique). Ces différents éléments de notre vaccin ont été choisis suite à des résultats préliminaires obtenus au laboratoire par Marie Rivest. Ce vaccin a donc été testé chez la souris (CD-1) face à une infection septicémique. Suite à des résultats non concluants, l'objectif de l'étude s'est plutôt redirigé vers l'investigation de l'échec du vaccin face à la septicémie. Puisque le vaccin ne semblait pas pouvoir contenir l'infection, il était important de vérifier l'efficacité des anticorps à lier la bactérie. Une grande variabilité a été obtenue ce qui a poussé l'analyse plus loin, au niveau de l'expression des gènes cibles. Des PCR réguliers et quantitatifs ont été réalisés sur les différentes souches afin de déterminer les différences d'expression. De plus, lors de mise au point du modèle de septicémie des différences notables de virulence in vivo avaient été observées entre les souches de S. aureus . Un lien a donc pu être fait entre l'habileté des anticorps à lier les souches, l'expression des protéines cibles et la virulence des souches afin d'expliquer en partie, l'échec de notre vaccin face à S. aureus . Comme il a été démontré dans la littérature que les individus portant S. aureus au niveau du nez étaient plus enclins à développer des infections, une mise au point du modèle nasal a été effectuée. Cependant, aucun résultat significatif au niveau de la protection n'a été obtenu.

Trabajo donde se describe la ocurrencia de una enfermedad emergente en poblaciones de trucha arcoíris de México. Se detallan los signos clínicos y lesiones macroscópicas observadas en peces afectados. Se describe la importancia epidemiológica de esta enfermedad, hasta ahora solo reportada en China, Brasil y en los Estados Unidos de Norteamérica.
Dentro del grupo de las denominadas bacterias acido lácticas (BAL) se encuentra la bacteria Weissella ceti, una bacteria emergente identificada como patógena que afecta a la trucha arcoíris Oncorhynchus mykiss presentándose en forma septicémica. En México, se han presentado mortalidades en granjas productoras de trucha arcoíris con signos sugerentes a la enfermedad denominada Weissellosis. En el presente estudio se aislaron bacterias cocobacilares de organismos con signología aparente de enfermedad que incluyen: exoftalmia, opacidad corneal, lesiones hemorrágicas en ojos, boca, aletas pectorales, hemorragias multifocales en hígado y cerebro. Los aislados se caracterizaron bioquímicamente como bacterias Gram positivas, oxidasa y catalasa negativas, hemolíticas, no móviles, con actividad fermentadora a partir de los carbohidratos dextrosa, glucosa, maltosa y trehalosa. La bacteria Weissella ceti aislada de los organismos afectados fue genéticamente caracterizada por medio del uso de PCR convencional utilizando primers específicos de un sitio de adhesión al colágeno identificado únicamente en esta especie. Las lesiones histológicas que se evidenciaron en las truchas arcoíris afectadas por esta bacteria fueron en ojo separación de fibras del estroma y hemorragia en la coroides, hepatitis necrótica multifocal con hepatocitos en degeneración y meningitis y congestión en cerebro. Este es el primer reporte de la bacteria en cuadros septicémicos en truchas arcoíris en México.
4489/2018/CI. Caracterización bioquímica y molecular de Streptococcus spp obtenidas de trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss)

Sepsis et défaillances viscérales; aspects diagnostiques et thérapeutiques

Le sepsis est un problème fréquemment rencontré en unité de soins intensifs (USIs) avec une morbidité et une mortalité élevées. Comprendre les mécanismes physiopathologiques du sepsis est essentiel à la fois pour mieux déterminer les bénéfices et/ou les effets indésirables des thérapies déjà en cours et développer de nouvelles statégies thérapeutiques. Des études épidémiologiques offrent une vue d´ensemble sur l´importance de la mobidité et la mortalité liées au sepsis et permettent d’apporter un élément de réponse aux questions essentielles concernant le sepsis et son traitement à l’USI, ce qui permet de réaliser les fondements de nouvelles études contrôlées randomisées à venir.

Ces dernières années, un certain nombre d´études ont été publiées concernant les données épidémiologiques sur la fréquence de survenue, les facteurs associés et le coût engendré par la prise en charge des patients atteints de sepsis. Cependant, vu la dynamique du sepsis qui est un syndrome multifactoriel et complexe, une mise à jour régulière de nos connaissances sur le diagnostic, la prise en charge et le pronostic du sepsis est d’importance capitale.

L´étude SOAP, une étude de cohorte, multicentrique d´observation a été réalisée pour mieux définir l´incidence du sepsis et les caractéristiques des patients hospitalisés en USI en Europe. Chez tous les patients admis entre le 1er et le 15 mai 2002 dans 198 USI dans 24 pays d´Europe, les données épidémiologiques, cliniques et biologiques et les maladies chroniques sous-jacentes ont été relevées de façon prospective. Les patients ont été suivis jusqu´à leur décès ou leur sortie de l´USI pendant une durée de 60 jours.

Sur 3147 adultes, avec un age moyen de 64 an, 1177 (soit 37.4%) avaient un sepsis; parmi eux 777 (soit24.7%) avaient un sepsis à l´admission. L´origine du sepsis était le plus souvent pulmonaire (68%) et abdominale dans 22%. Une preuve bactériologique a été mise en évidence dans 60% des cas. Les germes rencontrés étaient un staphyloccoque doré (30%, dont 14% méthicilline-résistant), Pseudomonas sp.(14%), Escherischia coli (13%). Par analyse multivariée, Pseudomonas sp. était le seul germe associé à une mortalité plus élevé. Les patients septiques avaient des défaillances viscérales plus graves, un séjour hospitalier et en USI plus long et une mortalité plus élevé que les patients sans sepsis. Chez les patients septiques l´âge, un état de choc, un cancer, un bilan hydrique positif et une admission médicale (plutôt que chirurgicale) étaient les facteurs pronostiques corrélés à une mortalité plus élevée. Il y avait des variations considérables selon les pays, avec une corrélation importante entre la fréquence du sepsis et les taux de mortalité en USI dans chaque pays.

Des publications récentes ont suggéré que les conditions de ventilation mécanique pouvaient influencer le devenir des patients présentant un ALI et un ARDS. Nous avons étudié si l´utilisation de volumes courants plus élevés en cas d´infection/sepsis que ceux utilisés dans l´étude ARDSnet (> 7,4ml/kg) avait des conséquences péjoratives (en terme de mortalité) chez les patients présentant un ALI/ARDS.

Sur les 3147 patients inclus dans l´étude SOAP, 393 (soit 12,5%) avaient les critères d’ALI/ARDS. Le taux de mortalité en USI et la mortalité hospitalière étaient plus élevés chez ces patients (respectivement 39 contre 16% et 46 contre 21 %, p < 0,001). Un analyse multivariée en régression logistique prenant le devenir en USI comme facteur déterminant a montré que les facteurs pronostiques indépendants étaient: l´existence d´un cancer, l´utilisation de volumes courant plus élevés que ceux utilisés dans l´étude ARDSnet, le degré de défaillance multiviscérale et un bilan hydrique positif. Le sepsis, le choc septique et la saturation d´O2 au début de l´ALI/ARDS n´avaient pas de valeur pronostique.

Chez les patients en USI, l´utilité d´un monitorage par cathéter artériel pulmonaire (PAC) est discutable. Nous avons étudié les aspects épidémiologiques de l´utilisation du monitorage artériel pulmonaire dans les USI en Europe et leur impact en terme de mortalité. Les patients sous PAC (n: 481, 15,3%) étaient plus âgés, plus souvent atteints d´une cardiopathie, moins souvent d´un cancer et en majorité des patients “chirurgicaux”. La mortalité en USI et hospitalière étaient plus importante chez les patients monitorés (respectivement 28,1 contre 16,8 et 32,5 contre 22,5%, p<0,001). Cependant le monitorage artériel pulmonaire n´était pas un facteur de risque indépendant pour la durée de séjour de 60 jours en analyse multivariée. De plus, et chez 453 malades pairés (“propensity matched-pairs”), les taux de mortalité en USI et hospitalière étaient similaires (27 contre 26 and 31 contre 33 %, p:NS). La survie à 60 jours était également similaire dans les 2 groupes appairés (Log Rank: 0,02, p = 0,89). Cette étude suggère que le monitorage artériel pulmonaire n´est pas corrélé à une mortalité supplémentaire dans cette population hétérogène.

La drogue vasoactive “idéale” à administrer en cas de choc est également controversée. Nous avons étudié l´influence de l´administration de dopamine sur l’état de choc. Sur 3147 patients, 1058 (soit 34%) avaient un état de choc tout le long de la période d´étude; 462 (soit 15%) avaient un choc septique. Le taux de mortalité en USI par état de choc était de 38 % et de 47 % en cas de choc septique. Parmi les patients en état de choc, 375 (soit 35 %) recevaient de la dopamine (groupe dopamine) et 683 (soit 65 %) n´en recevaient pas. L´âge, le sexe, les scores de sévérité (SAPS II et SOFA) était comparables dans les 2 groupes. Le groupe dopamine avait un une mortalité en USI et hospitalière plus élevée (respectivement 43 contre 36%, p:0,02 et 50 contre 42%, p = 0,01). L´étude des courbes de survie Kaplan-Meier a montré une survie à 30 jours diminuée dans le groupe dopamine (log Rank: 4,6; p: 0,032). Dans une étude multivariée prenant le taux de mortalité en USI comme facteur indépendant, l´âge, un cancer, les patients admis pour raison médicale (non-chirurgicale), le score SOFA moyen plus élevé, un bilan hydrique positif et l´administration de dopamine étaient des facteurs pronostiques indépendants. Cette étude suggère que l´administration de dopamine est associée à une augmentation de la mortalité en cas de choc. Afin de confirmer cette hypothèse, une étude prospective comparant la dopamine à la noradrénaline dans la prise en charge de l´état de choc a été lancée.

Nous avons également étudié l´administration des solutions d´albumine dans les USI en Europe et son influence en terme de mortalité :350 patients (soit 11,2%) ont reçu de l´albumine et 2793 patients (soit 89 %) n´en ont pas reçu. Les patients du groupe albumine étaient plus souvent cirrhotiques, atteints de cancer, “chirurgicaux” ou de sepsis. Ces patients avaient un séjour en USI et un taux de mortalité plus élevé, mais étaient également plus sévèrement malades comme en témoignent des scores SAPS II et SOFA plus élevés. Un modele de Cox (risque proportional) a montré que l´administration d´albumine était significativement corrélée avec une moindre survie à 30 jours. La mortalité en USI et hospitalière était plus élevée chez les patients du groupe albumine que chez ceux n´en ayant pas reçu (respectivement 35 contre 21% et 41 contre 28%, p<0,001). Nous en avons conclu que l´administration d´albumine était associée avec une moindre survie chez ces patients gravement malades. Des études prospectives randomisées et contrôlées sont nécessaires pour étudier les effets de l´administration d´albumine sur la survie de ces patients pris en charge en USI.

Finalement, nous avons étudié les effets de l´administration de solutions d’hydroxyethylamidon (HES) sur la fonction rénale chez les patients inclus dans l´étude SOAP. Les patients ayant reçu une solution de HES (n: 1075, soit 34%) étaient plus âgés (moyenne+/- DS: 62+/- 18 ans, p: 0,022), avaient en majorité des affections chirurgicales ou hématologiques, une défaillance cardiaque, un score SAPS II ou SOFA plus élevé et étaient moins susceptible de recevoir un support rénal extracorporel (2 contre 4%, p<0,001) que ceux n´ayant pas reçu de solution de HES. Le score SOFA rénal était significativement plus élevé au cours du séjour en USI indépendamment du liquide de remplissage utilisé. Cependant, dans le groupe HES plus de patients avaient besoin de support rénal extracorporel que dans le groupe “non-HES” (11 contre 9%, p: 0,006). Toutefois, en analyse multivariée, l´administration de HES n´était pas associée à un besoin plus élevé de support rénal extracorporel. Le sepsis, la défaillance cardio-vasculaire, une hémopathie maligne et un score SOFA rénal de base > 1 étaient tous associés à un besoin plus élevé de RRT.

Les altérations microcirculatoires sont fréquentes chez les patients septiques. Les sont directement liées à la sévérité du sepsis et plus marquées chez les patients qui sont décédés que chez ceux qui ont survécu, sans toutefois être corrélées à l´état hémodynamique ou aux besoins en agents vasoactifs. Ces obnservations ont été faites au début de la maladie si bien que leur évolution dans le temps n´a pas bien pu être caractérisée. L´OPS est une nouvelle technqiue, qui permet d´étudier la microcirculation des tissus recouverts d´un fin épithélium, comme les muqueuses. Cette technique a été validée pour l´étude de la microcirculation chez l´homme et l´animal.

Pour préciser l´évolution de l´altération de la microcirculation et son pronostic en terme de morbidité et de mortalité chez les patients présentant un choc septique, nous avons étudié chez 49 patients en choc septique, l’évolution des altérations microcirculatoires (par OPS) du jour du début de l´état de choc et de façon quotidienne les jours suivants jusqu´à résolution complète du choc ou le décès. Au début de l´état de choc, les survivants et les non survivants avaient la même densité de capillaire et le même pourcentage de capillaire perméable au niveau du tissu étudié. La microcirculation était préservée chez les survivants, mais pas chez les patients décédés. Malgré un statut hémodynamique et des besoins en drogues vasoactives similaires ainsi qu´à des taux de saturation en oxygène comparable, les patients décédés des suites du choc septique dans un tableau de défaillance multiviscérale avaient un pourcentage de capillaires perfusés significativement inférieur aux patients ayant survécu. Nous en avons conclu que les altérations de la microcirculation s´améliorent rapidement en cas d’évolution favorable, mais au contraire progressent en cas de défaillance multiviscérale.

Pour étudier les effets de la transfusion de concentrés érythrocytaires sur la microcirculation au cours du sepsis, nous avons évalué la microcirculation de la muqueuse sublinguale à l´aide de l´OPS chez 35 patients avant et après la transfusion de 1 à 2 unités de concentrés érythrocytaires. Cinq séquences de 20 secondes chacune ont été enregistrées et analysées par une méthode semi- quantitative. La transfusion de concentrés érythrocytaires a augmenté le taux d´hémoglobine, la pression artérielle et le transport en oxygène. La microcirculation ne s´est pas significativement altérée mais des variations individuelles considérables ont été relevées. Les modifications de la perfusion capillaire après transfusion ont été significativement corrélées avec le degré inital de perfusion capillaire. La perfusion capillaire de base était significativement inférieure chez les patients qui ont augmenté leur perfusion capillaire de plus de 5% par rapport à ceux ne l´ayant pas augmenté, et cela à conditions hémodynamiques et de transport d´oxygène similaire dans les 2 groupes. Ces résultats montrent que la microcirculation muqueuse sublinguale n´est pas altérée par l´apport de concentrés érythrocytaires en cas de sepsis. Cependant, la perfusion capillaire de base peu augmenter en cas d´altération préexistante.

Et finalement, pour évaluer les effets de la dobutamine sur la microcirculation chez les patients septiques, nous avons étudié 10 malades sous dobutamine (administrée à la dose de 5 mcg/kg.min) pendant 2 heures suivies par l´application de 10 - 2 M d´acéthylcholine sur la muqueuse sublinguale. Un monitorage hémodynamique complet avant et après l´administration de dobutamine a été réalisé. Les enregistrements ont été obtenus grâce à l´OPS avant et après l´administration de dobutamine et d´acétylcholine. La dobutamine augmente significativement la perfusion capillaire et ce avec de larges variations individuelles, alors que la densité capillaire est restée constante. L´adjonction topique d´acéthylcholine restitue entièrement la perfusion et la densité capillaire. Les modifications de la perfusion capillaire n´ont pas été en rapport avec les fluctuations de la pression artérielle et de l´index cardiaque. La baisse de la lactacidémie était proportionnelle à l´augmentation de la perfusion capillaire, et sans corrélation avec les modifications de l´index cardiaque. Nous en avons conclu que l´administration de 5 mcg/kg.min de dobutamine en cas de choc septique peut augmenter la perfusion capillaire sans toutefois la restaurer. Ces modifications sont indépendantes des fluctuations de l´hémodynamique systémique.

Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques
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Introdução: A sépsis representa um grave problema de saúde pública, comparável ao acidente vascular cerebral e ao enfarte agudo do miocárdio, e a sua incidência aumenta 1,5% ao ano. A Direção Geral da Saúde (DGS) considerou ser imperativa a implementação de mecanismos organizacionais que permitam a sua rápida identificação e instituição atempada de terapêutica otimizada, traduzida na circular normativa “Criação e Implementação da Via Verde de Sépsis (VVS)”, de 2010. Objetivos: Analisar a metodologia de implementação da VVS em hospitais portugueses e avaliar o grau de execução do protocolo de VVS nos Serviços de Urgência (SU). Métodos: Estudo descritivo, analítico e de corte transversal. Foram aplicados inquéritos a médicos e enfermeiros que trabalham nos SU do Centro Hospitalar Cova da Beira (CHCB) e do Hospital Sousa Martins (HSM), avaliando o grau de conhecimento e identificação com as práticas preconizadas na VVS. Foram recolhidos e analisados dados de processos clínicos de doentes admitidos no SU do CHCB, por Sépsis Adquirida na Comunidade (SAC), no período compreendido entre janeiro de 2010 e dezembro de 2011, representando um ano antes e um ano após a implementação da VVS, recolhendo: i) suspeita de sépsis na triagem; ii) pesquisa de hipoperfusão; iii) realização de Exames Complementares de Diagnóstico (ECD), incluindo hemoculturas; iv) administração de fluidos; v) administração de antibioterapia; vi) destino do doente admitido no SU com sépsis; vii) resultado hospitalar antes e depois da VVS implementada. Resultados: Dos hospitais estudados, o CHCB e o HSM, a VVS foi implementada apenas no CHCB em dezembro de 2010. Foram aplicados 153 inquéritos, 75 (49%) no CHCB (43 médicos e 32 enfermeiros) e 78 (50,1%) no HSM (50 médicos e 28 enfermeiros). A maioria dos inquiridos, 114 (74,5%), afirmou conhecer a VVS. No CHCB, 19 em 32 enfermeiros (59,4%) responderam ter recebido formação sobre a VVS. De forma homogénea, os profissionais do CHCB consideraram que a suspeita de sépsis pode ser realizada na triagem de Manchester; no HSM, 76,0% (38 em 50) dos médicos consideraram que sim e 50,0% (14 em 28) dos enfermeiros responderam não. No CHCB e no HSM, médicos e enfermeiros consideraram que é realizada confirmação médica após caso-suspeito de sépsis (100%, 71 em 71, e 98%, 49 em 50, respetivamente). Os indicadores mais utilizados pelos médicos do CHCB para diagnosticar sépsis grave são hipotensão arterial e hiperlactacidémia. A maioria das respostas de ambos os hospitais afirmou que realizam habitualmente hemoculturas entre outros ECD, antibioterapia adequada e fluidoterapia. A maioria dos médicos do CHCB e do HSM afirmou que os doentes com sépsis grave eram transferidos para a UCI (46,5%, 20 em 43, e 38,0%, 19 em 50, respetivamente), já os enfermeiros do CHCB e do HSM responderam que eram transferidos para o Serviço de Observação (SO) ou continuavam no SU à espera dos resultados das análises e com plano terapêutico. No CHCB, mais enfermeiros admitiram já ter ativado a VVS (68,8%, 22 em 32), frequência mensal média de 1 caso por mês. A maioria dos inquiridos admitiu existência suficiente de antibióticos no SU de ambos os hospitais. Relativamente aos dados obtidos através dos processos clínicos, foram admitidos, no serviço de urgência do CHCB, 116 doentes com SAC, 18 (15,8%) no período de janeiro a novembro de 2010 (antes da implementação da VVS), e 98 (84,5%) após a VVS ser implementada, sendo destes ativada a VVS em 76 (77,6%). Observou-se, após implementação da VVS: maior número de avaliações da lactacidémia, e em menos de 1hora; mais doentes foram excluídos corretamente da VVS por não apresentarem hipotensão; aumento do nº de hemoculturas colhidas em <1 hora; redução do tempo médio de realização destas (3h17min para 1h53 min); melhores resultados hospitalares, com redução do número de mortes – de 55,6% (10 em 18) para 13,5% (13 em 96). Em todas as outras variáveis em estudo, não se verificou melhoria dos resultados após implementação da VVS. Conclusões: Verificou-se que apesar da não implementação da VVS no HSM, a maioria dos profissionais de saúde de ambos os hospitais demonstraram apresentar conhecimentos similares acerca do algoritmo da VVS. Verificaram-se falhas organizacionais na transmissão de conhecimentos acerca da identificação precoce de sépsis e instituição de tratamento adequado e atempado, em casos de sépsis grave/choque séptico. Após comparação dos dados dos processos clínicos de 2010 e 2011, verificou-se que a maioria dos parâmetros analisados ficaram aquém das expectativas, podendo assim concluir que se deverão instituir outras medidas organizacionais de forma a melhorar a formação dos profissionais de saúde, aperfeiçoar as suas condutas e os tempos de atuação. Instrumentos para melhoria poderão ser: formações 6 em 6 meses sobre o algoritmo da VVS, simulações periódicas e existência de material de registo específico para a VVS.

Sepsis remains a severe issue in critically ill patients. Adjunctive therapies might play important role to decrease morbidity and mortality. The aim of this thesis is to investigate new adjunctive therapies role in the treatment of sepsis and septic shock.
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Summary

Brain dysfunction is a frequent complication of sepsis and is usually defined as “sepsis-associated encephalopathy” (SAE). Its pathophysiology is complex and related to a number of processes and pathways, while the exact mechanisms producing neurological impairment in septic patients have not been completely elucidated. Alterations in cerebral blood flow (CBF) have been suggested as a key component for the development of SAE. Reduction of CBF may be caused by cerebral vasoconstriction, induced either by inflammation or hypocapnia. More importantly, the natural mechanisms that protect the brain from reduced/inadequate CBF can be impaired in septic patients, especially in those with shock, and this further contributes to cerebral ischemia if blood pressure drops below a critical threshold. Hypercapnia is associated with a narrower autoregulatory plateau, which may potentially results in large CBF variations when mean arterial pressure (MAP) varies within usual targets. However, few data are available on the role of PaCO2 on cerebral autoregulation (CA). Finally, as SAE occurs also in patients without hemodynamic instability, alterations in brain tissue perfusion could occur independently from hypotension; thus, alterations in cerebral microcirculation, which largely regulates regional flow and blood-cellular nutrients exchanges, could contribute to SAE. In septic animals, these microcirculatory abnormalities could be implicated in the development of electrophysiological abnormalities observed during sepsis and contribute to neurological alterations. However, these findings were limited by several factors, including the technique used to assess the microcirculation, the short time of observation and the limited amount of fluid resuscitation used in those models.

In the first part of this work, I evaluated CA and the potential influence of PaCO2 on CA in patients with septic shock. In 21 mechanically ventilated patients, I observed that 14 of them had impaired CA. All the 7 patients with a PaCO2 ≥ 40 mmHg but only 7 of the 14 patients with a PaCO2 <40 mmHg had an impaired CA (p=0.046). Specifically, 4/9 (44%) patients with PaCO2 < 35 mmHg, 7/9 (77%) with PaCO2 between 35 and 42 mmHg, and 3/3 (100%) with PaCO2 > 42 mmHg had impaired CA. The Receiver Operating Characteristic (ROC) analysis showed that a PaCO2 threshold of 38 mmHg had a sensitivity of 50% and a specificity of 100% for the prediction of impaired CA, with an area under the ROC curve of 0.76 (95% confidence interval: 0.52–0.91).

In the second part of this work, I hypothesized that altered cerebral microcirculation may occur in the early phase of sepsis and contribute to brain hypoxia. In a clinically relevant model of ovine fecal peritonitis, I showed that there was a progressive deterioration of cerebral microvascular flow in septic animals (n=10) when compared to sham animals (n=5), starting already after 6 hours from sepsis induction and becoming significant at 12 hours thereafter. Moreover, changes in the cerebral microcirculation were not related to changes in MAP, cardiac output or blood lactate levels, suggesting that these alterations in the brain may occur even when global perfusion pressure is maintained, i.e. in non-hypotensive conditions. In a second study, including 10 septic and 5 sham animals, I found that cortical microvascular alterations were associated with decreased cerebral oxygenation. Furthermore, cerebral metabolic disturbances compatible with tissue hypoxia (i.e. increased brain lactate/pyruvate ratio, LPR) occurred mostly during shock, suggesting that hypotension is a critical factor in the development of anaerobic metabolism in the septic brain. Nevertheless, I showed in a third study (n=8) that the reversal of hypotension using vasopressor agents, although increased cerebral oxygenation and slightly reduced LPR, did not significantly influence the alterations of cerebral microcirculation and was associated with an increase in glutamate and glycerol, suggesting ongoing excitotoxicity and cellular damage. These alterations in cerebral microcirculation, oxygenation and metabolism may then contribute to the pathogenesis of SAE.

Résumé

La dysfonction cérébrale est une complication fréquente du sepsis et elle est généralement identifiée comme « encéphalopathie associée au sepsis » (sepsis-associated encephalopathy, SAE). La physiopathologie de la SAE est complexe et liée à des nombreux processus et voies de signalisation, même si les mécanismes qui induisent cette dysfonction cérébrale chez les patients en sepsis n’ont pas été clairement élucidés. Des anomalies du débit sanguin cérébral (cerebral blood flow, CBF) ont été proposées comme une des déterminants pour le développement de l’SAE. La réduction du CBF pourrait être induite par une vasoconstriction cérébrale, élicitée pas l’inflammation ou par l’hypocapnie. De plus, les mécanismes qui naturellement règlent le CBF pour qu’il soit ni diminué ni inadéquat aux besoins cellulaires peuvent être altérés pendant le sepsis, particulièrement en cas de choc septique, et ceci pourrait davantage contribuer au développement de zones d’hypoperfusion cérébrale si la pression artérielle diminue au-dessous d’un seuil critique. Un autre point important est que l’hypercapnie est associée à une diminution du plateau d’autorégulation du CBF, ce qui pourrait potentiellement causer des larges variations du CBF endéans des valeurs de pression artérielle considérés comme normaux en pratique clinique; malheureusement, très peu de données sont disponibles sur le rôle de la PaCO2 sur l’autorégulation cérébrale (cerebral autoregulation, CA). Enfin, vu que l’SAE survient aussi chez des patients qui n’ont pas d’instabilité hémodynamique, des anomalies de la perfusion cérébrale régionale pourraient se produire en absence de toute hypotension artérielle ;en effet, des altérations de la microcirculation cérébrale, qui règle le débit sanguin au niveau des tissues et l’échange d’oxygène et nutriments entre la circulation sanguine et le cellules, peuvent aussi contribuer au développement de la SAE. Dans des modelés expérimentaux de sepsis, les altérations microcirculatoires ont été associées à des troubles électrophysiologies et à la présence d’anomalies « cliniques ». Cependant, ces données ont été biaisées par le type de technique utilisée pour évaluer la microcirculation, le temps d’observation très court et la quantité limitée de fluides administrés au cours de la réanimation liquidienne dans ces modelés.

Dans la première partie de ce travail, j’ai décrit les anomalies de la CA et l’impact de la PaCO2 sur la CA chez des patients en choc septique. En étudiant 21 patients en ventilation mécanique, j’ai pu observer que 14 d’entre eux avaient une CA altérée, y compris 7/14 avec une PaCO2 < 40 mmHg et 7/7 avec une PaCO2 ≥ 40 mmHg (p = 0.046). De plus, 4/9 (44%) avec PaCO2 < 35 mmHg, 7/9 (77%) avec PaCO2 between 35 and 42 mmHg, and 3/3 (100%) avec PaCO2 > 42 mmHg avaient une CA altérée. L’analyse selon la « Receiver Operating Characteristic » (ROC) montrait une sensibilité de 50% et une spécificité de 100% pour prédire une CA altérée, avec un seuil de PaCO2 de 38 mmHg (l’aire sous la courbe de l’analyse ROC était à 0.76 [95% ICs: 0.52–0.91]).

Dans la deuxième partie de ce travail, j’ai émis l’hypothèse que des anomalies de la microcirculation cérébrale peuvent survenir dans la phase précoce du sepsis et contribuer au développement d’une hypoxie tissulaire. Dans un modelé de péritonite fécale induite chez le mouton, très proche de la situation clinique, j’ai pu montrer que il existe une détérioration progressive de la microcirculation cérébrale chez les animaux septiques (n-=10) quand comparés aux animaux témoins (n=5) qui commence déjà a la sixième heure de l’induction du sepsis and devient significative après 12 heures. De plus, les changement de la microcirculation cérébrale n’étaient pas corrélés à ceux de la pression artérielle, du débit cardiaque ou des taux de lactate, ce qui suggère que ces anomalies peuvent se produire aussi en conditions de stabilité hémodynamique. Dans une deuxième étude comprenant 10 animaux septique et 5 témoins, j’ai observé que les anomalies microcirculatoires étaient associées à une diminution de l’oxygénation cérébrale tissulaire. Toutefois, les anomalies du métabolisme cérébral compatible avec une hypoxie tissulaire (des valeurs élevées du rapport lactate/pyruvate, LPR) se développaient que dans la phase du choc septique, indiquant que l’hypotension artérielle est le facteur déterminant pour ces anomalies métaboliques au cours du sepsis. Cependant, dans une troisième étude sur 8 animaux en sepsis, j’ai démontré que la correction de l’hypotension par administration de vasopresseurs, même si elle était associée à une augmentation de l’oxygénation cérébral et une diminution du LPR, n’améliorait pas de façon significative la microcirculation cérébrale et s’accompagnait par une augmentation des taux de glutamate et glycérol, ce qui plaidait plutôt pour un excitoxicité persistante et une progression des lésions cellulaires. Toutes ces anomalies de microcirculation, oxygénation et métabolisme cérébral pourraient contribuer à la pathogenèse de l’SAE.

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Le sepsis, un syndrome d'infection générale grave, est une importante cause de décès dans le monde et a un impact considérable sur le taux de mortalité dans le département des soins intensifs des hôpitaux. Plusieurs médecins soutiennent que le diagnostic de sepsis est fréquemment omis, menant ainsi à de graves conséquences pour l'état de santé du patient. Considérant cette problématique, la présente étude a pour buts de déterminer les caractéristiques du processus décisionnel des médecins en situation de triage et de prise en charge du sepsis pédiatrique, d'évaluer la performance des médecins en contexte de détection du sepsis pédiatrique et enfin, de valider une méthode permettant de développer un modèle cognitif de prise de décision relié à cette condition médicale. Une tâche décisionnelle à l'aide d'un tableau d'information est administrée aux participants. Les résultats sont analysés selon une combinaison de méthodes : la théorie de détection de signal, l'identification de la règle décisionnelle et l'extraction du processus décisionnel. Le personnel médical a une capacité de discrimination moyenne. Leurs réponses tendent vers un biais libéral. La comparaison entre un arbre décisionnel normatif et les arbres décisionnels individuels a démontré une mésestimation de l'importance des critères diagnostics pertinents. Il y a présence d'hétérogénéité quant aux critères utilisés par les médecins pour poser le diagnostic. Ces résultats permettent de cibler davantage la problématique de détection du sepsis pédiatrique et démontre la pertinence de développer un outil d'aide à la détection afin de soutenir les médecins dans leurs décisions. Les résultats de la présente étude fournissent des lignes directrices quant au développement d'un tel outil. Les résultats montrent également que la combinaison de la théorie de détection de signal, de l'identification de la règle décisionnelle et de l'extraction du processus décisionnel fournie une méthode adaptée afin de développer des modèles de prise de décision.

La microcirculation est rapidement altérée dans le sepsis et la persistance de ces altérations est associée à un mauvais pronostic. La microcirculation est composée de vaisseaux invisibles à l’œil (< 100 µm), de l’endothélium, du glycocalyx, des cellules musculaires lisses et des éléments sanguins dont les GR.

De nombreuses études animales et humaines ont rapporté des altérations rhéologiques des GR dans le sepsis. Ces modifications comprennent une diminution de la déformabilité, une augmentation de l’agrégation et de l’adhérence globulaire.

De plus, l’altération de la déformabilité peut induire des altérations du flux microcirculatoire dans des modèles expérimentaux animaux. Ces mêmes altérations rhéologiques sont rapportées dans le diabète. Dans cette pathologie, les GR présentent une diminution du contenu membranaire en AS, comme dans les processus de sénescence.

La déformabilité des GR dépend des caractéristiques cellulaires incluant surtout les propriétés de la membrane, la géométrie cellulaire et dans une moindre mesure la viscosité cellulaire. Malgré la connaissance des altérations de la rhéologie dans le sepsis, peu de travaux, au contraire du diabète, s’interessent aux modifications de la membrane.

Nous avons étudié, par analogie aux altérations globulaires rapportées dans le diabète, la membrane des GR de patients admis en soins intensifs pour un sepsis, et comparé à des GR de patients non septiques et de volontaires sains. Le contenu membranaire en AS était significativement diminué chez les patients septiques par rapport aux patients non-septiques et aux volontaires sains. De plus, les GR des patients septiques, analysés par une technique de cytométrie en flux indépendante de la température de l’échantillon, étaient rapidement plus sphériques (dans les 24 heures du sepsis) et incapables de modifier leurs formes en hypoosmolalité. Cette technique de cytométrie a par ailleurs aussi été utilisée pour l’analyse de GR de patients diabétiques et en insuffisance rénale terminale.

La diminution du contenu en AS est aussi rapidement observée sur la transferrine, suggérant une augmentation de la concentration et/ou de l’activité de la neuraminidase, enzyme clivant l’AS. Dans un modèle de choc septique induit chez l’ovin, nous avons confirmé la rapidité de ce phénomène. En effet, la concentration en AS libre augmente dès la 15ième heure après induction du sepsis.

In-vitro, nous avons pu reproduire les modifications de forme des GR observés chez les patients septiques par incubation de GR de volontaire avec de la neuraminidase, et ce en 10 heures, quelles que soient les concentrations utilisées. Ces modifications de forme et de membrane s’accompagnent d’une augmentation significative du contenu en lactate, suggérant une stimulation de la glycolyse érythrocytaire et en 2,3-DPG, facilitant la libération de l’O2 de l’Hb vers les tissus.

Toutes ces modifications touchant la membrane des GR des patients de soins intensifs, surtout septiques, peuvent être responsables des altérations de rhéologie que nous avons observé grâce au LORCA sur une large population admis aux soins intensifs.

Une meilleure compréhension des mécanismes conduisant aux altérations rhéologiques des GR dans le sepsis, et ses effets potentiellement déletères sur la microcirculation, sont nécessaires avant d’envisager les GR comme cible thérapeutique.

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Neisseria meningitidis, ou méningocoque, est une bactérie responsable de méningites et de septicémies, dont la forme la plus grave, purpura fulminans, est souvent fatale. Cette bactérie, qui réside naturellement dans le rhinopharynx de l’Homme, est pathogène lorsqu’elle atteint la circulation sanguine et entre en contact avec les cellules endothéliales. L’établissement d’une interaction étroite entre le méningocoque et les cellules endothéliales est essentiel à la résistance des bactéries au flux sanguin et à la colonisation vasculaire. Cette interaction peut conduire à une désorganisation massive des endothéliums périphériques et cérébraux permettant la dissémination de la bactérie. Ces processus dépendent de la primo-interaction des pili de type IV du méningocoque avec le récepteur endothélial CD147 et de l’activation du récepteur β2-adrénergique (β2AR). L’activation de voies de signalisation en aval du β2AR dans les cellules hôtes permet l’adhérence efficace et intime des bactéries à la surface des cellules endothéliales. Toutefois, comment les récepteurs CD147 et β2AR coopèrent pour promouvoir une interaction initiale efficace et rapide n’était pas connu. Au cours de ma thèse, j’ai donc analysé les éventuelles interactions et liens fonctionnels existants entre les récepteurs CD147 et β2AR et suivi, à l’aide de nouvelles approches d’imagerie à haute résolution, leur organisation moléculaire aux sites de contact bactéries/cellule. Mes travaux ont permis de révéler l’existence d’une interaction fonctionnelle entre les récepteurs CD147 et β2AR, et d’identifier un nouveau partenaire cytosolique interagissant directement avec ces récepteurs, l’α-actinine4 (Actn4). L’expression de l’Actn4 est requise pour l’assemblage organisé de ces récepteurs en complexes multimoléculaires aux sites de contact bactéries/cellule endothéliale. Cette organisation est déterminante pour générer une force suffisante à l’interaction initiale du méningocoque aux cellules endothéliales, et promouvoir l’activation rapide des voies de signalisation nécessaires à la consolidation de cette interaction. L’infection des cellules endothéliales par le méningocoque s’accompagne de la désorganisation des jonctions intercellulaires et l’ouverture d’une voie paracellulaire favorisant la dissémination tissulaire des bactéries. Ces évènements dépendent de l’activation de la petite GTPase Cdc42 et, en aval, de la relocalisation du complexe de polarité Par3/Par6/aPKC au site d’adhérence bactérien. Ce complexe moléculaire très conservé est impliqué dans la mise en place de la polarité baso-apicale des cellules endothéliales. La perte de la polarité cellulaire constituant un élément déterminant de la perte de l’intégrité vasculaire, dans une seconde partie de ma thèse, j’ai donc entrepris une analyse des événements de signalisation précoces conduisant au remodelage de l’organisation apico-basale des cellules endothéliales par N. meningitidis. Mes travaux montrent que rapidement après adhésion aux cellules endothéliales, le méningocoque induit la ré-orientation de l’axe de polarité noyau-centrosome des cellules en direction des bactéries et mettant en jeu un mécanisme original indépendant de l’activation de Cdc42 par le β2AR. Le recrutement des ERM (Ezrine et Moesin) et la polymérisation d’actine corticale au site d’infection semblent constituer des facteurs clé de cette étape précoce de modification de la polarité endothéliale induite par le méningocoque. Ainsi, ces études ont permis une avancée majeure dans notre compréhension du mécanisme d’adhésion du méningocoque aux cellules endothéliales et des événements moléculaires précoces conduisant à l’altération de l’intégrité vasculaire, deux étapes clés au cœur de la pathogénèse des infections invasives à méningocoque
Neisseria meningitidis or meningococcus is a commensal bacterium of the human nasopharynx responsible for septicemia and meningitis. Establishment of a close interaction between meningococcus and endothelial cells is an important step in meningococcal pathogenesis as it promotes bacterial resistance to blood flow and vascular colonization, leading to major endothelial dysfunctions and bacterial dissemination into perivascular tissues. This process depends on the interaction of meningococcal type IV pili with the endothelial receptor CD147 and the activation of the β2 adrenergic receptor (β2AR). Activation of a cellular response downstream of β2AR activation is important to allow the efficient adhesion of meningococci at the endothelial cell surface. However, how CD147 and the β2AR cooperate to promote a rapid and efficient initial adhesion remained to be explored. During my thesis, I have analyzed the interaction and the functional link between these two receptors and, using super resolution microscopy, I have investigated their molecular organization at sites of bacterial adhesion. My work revealed a functional interaction in cis between CD147 and the β2AR and binding of these receptors complexes to the molecular scaffold protein α-actinin 4 (Actn4). Actn4 expression is required for the organized assembly of these receptors in highly-ordered complexes at bacterial adhesion sites. This specific organization is decisive to provide a sufficient binding strength of meningococcal type IV pili with endothelial receptors and to promote a rapid activation of downstream signaling events in a short time frame. Endothelial cell infection by N. meningitidis is associated with the disruption of intercellular junctions and the opening of a paracellular route favoring bacterial dissemination into tissues. These events are dependent on Cdc42 activation and on the relocalization of the Par3/Par6/aPKC polarity complex at bacterial adhesion sites. This molecular complex is conserved and involved in baso-apical polarity establishment in endothelial cells. Since endothelial polarity is essential in maintaining junction integrity, in a second part of my thesis work I have analyzed the early signaling events triggered by meningococcal infection with a particular emphasis on endothelial cell polarity modifications. I observed that bacterial adhesion rapidly induced a re-orientation of the nucleus-centrosome axis toward bacterial adhesion sites. Unexpectedly, this re-orientation was independent of Cdc42 activation downstream of the β2AR. In place, the ERM proteins (Ezrin and Moesin), along with cortical actin polymerization seem to be key factors in this process. This work contributes to the understanding of the meningococcal adhesion mechanism to endothelial cells and the early molecular events leading to the loss of vascular integrity. These two key steps are very important in the meningococcal pathogenesis

Les états septiques demeurent un réel problème de santé publique. Depuis 20 ans, leur mortalité est restée globalement constante en dépit d'une meilleure prise en charge initiale des patients et de nombreux essais cliniques. Parmi les défaillances d'organes provoquées par les états septiques, une profonde immunodépression se met en place après la phase initiale de la maladie. Son amplitude et sa persistance dans le temps, variables d'un patient à l'autre, semblent associées à un risque accru d'infections nosocomiales et de décès secondaire. Aussi, un des challenges actuels est d'explorer de nouvelles pistes thérapeutiques immunostimulantes pour les patients septiques les plus immunodéprimés. En l'absence de signe clinique de cet état, l'identification et la validation de nouveaux biomarqueurs contribuera sans doute à la mise en place de thérapies ciblées et individualisées. Notre travail s'inscrit dans ce contexte. L'objectif était d'utiliser le niveau d'expression génique comme outil de monitorage clinique et de recherche en physiopathologie. Nous avons donc conduit un travail de recherche translationnelle alliant études cliniques (lymphopénie, apoptose) et expérimentales basées sur un modèle de tolérance à l'endotoxine dans lequel nous avons testé différentes options thérapeutiques. Nous avons validé l'hypothèse de travail en montrant qu'un panel d'ARNm, mesurable dans le sang total des patients, devrait permettre à la fois d'identifier les patients qui pourraient bénéficier de thérapeutiques immunostimulantes et d'en contrôler l'efficacité dans la restauration des fonctions immunitaires
Septic syndromes remain a real public health issue. For 20 years, despite improvements in early management of patients and despite a number of clinical trials, the rate of mortality due to septic syndrome has remained broadly constant. After the initial phase of sepsis, patients rapidly exhibit profound immunodepression. Amplitude and duration of this state vary between patients and appear to be associated with increased risk of nosocomial infections and secondary deaths. One of the current challenges is to develop novel immunostimulant therapeutics for the most immunocompromised septic patients. Development of biomarkers will allow patient stratification and will undoubtedly contribute to the development of appropriately targeted and individualized therapies. The goal of our study was to evaluate the potential of gene expression level for clinical monitoring and for research in pathophysiology. We conducted translational research by combining experimental data with clinical studies (lymphopenia, apoptosis). We used endotoxin tolerance as a model to test different therapeutic options. Our data confirmed that expression levels of a panel of mRNAs, measured in the whole blood of patients, is a powerful tool for patient stratification and the monitoring of the effect of immunostimulant therapy on the immune system

Depuis quelques années, il y a émergence de souches de Salmonella enterica sérovar Typhimurium multirésistantes causant une septicémie et la mort chez le porc. Ceci constitue un problème majeur pour l’industrie porcine et possiblement pour la santé publique. L’objectif de ce projet était de comparer et de caractériser une souche capable de causer une septicémie chez le porc et une souche commensale, en observant l’interaction avec des cellules épithéliales, des macrophages humains et d’identifier des gènes exprimés par les souches septicémiques et les souches commensales. Tout d’abord, l’infection de cellules épithéliales permet d’observer l’adhérence et l’invasion des bactéries, pour ainsi mettre en évidence la capacité des souches à coloniser le tractus gastro-intestinal. La souche commensale possède un pouvoir d’adhésion supérieur à la souche septicémique. Par la suite, l’infection de macrophages permet de caractériser le niveau de phagocytose et de survie. L’importance de la survie dans les macrophages pourrait permettre de faire un lien avec la septicémie. Toutefois, aucune différence n’est observable dans les conditions qui ont été testé. Ensuite, la technique SCOTS (Selective Capture of Transcribed Sequences) est utilisée pour capturer des gènes uniques à la souche septicémique et un autre SCOTS est fait pour capturer les gènes spécifiques à la souche commensale. Finalement, les gènes sont clonés, leur spécificité face aux souches est analysé par dot blot et ils sont identifiés par séquençage suivient d’une analyses bioinformatiques. Les gènes identifiés par SCOTS, lors des captures pour la souche septicémique et la souche commensale, se trouvent à être des gènes communs aux Salmonella. Toutefois, la différence de pathologie causée par les deux souches, n’est peut-être pas l’acquisition de nouveaux gènes, mais plutôt une différence d’expression entre les deux souches.
For many years, there has been an emergence of new multi-drug resistant Salmonella enterica serovar Typhimurium strains responsible for high mortality rates in regards to swine infections. This represents a major problem for the swine industry and also for public health. The objective of this project was to characterize an isolate capable of creating swine septicemic illness and another which is naturally present in this host’s intestinal tract. The study conducted here includes observations of bacteria-epithelial cell interactions, bacteria-macrophage interactions and identification of genes expressed during different epithelial cell infections. Bacterial adherence and invasion of cells were observed after epithelial cell infection. This type of assay underlines the ability of the isolates to colonize the intestinal tract. The commensal strain has a better adherence then the other. Macrophage infections allowed characterization of bacterial phagocytosis and intracellular survival. Survival within macrophages reflects the capacity of the bacterial isolates to infect and survive in the host. There’s no difference between the two strains with the condition we test. A technique termed SCOTS (Selective Capture of Transcribed Sequences) was used to capture unique transcripts from the isolate which caused illness during swine infection. SCOTS was also used to find unique genes expressed by the commensal isolate. The captured fragments were cloned, their strain specificity was analyzed by dot blot and the genes transcribed were identified by direct sequencing followed by bioinformatic analysis. SCOTS carried out with the septicemic and the commensal isolates was done. During the SCOTS conducted with the strain isolated from a sick swine or with the isolate from healthy swine, common Salmonella genes were found. Thus, even though these two isolates cause different pathologies, virulence of the strains does not rely on the acquisition of new genes, but perhaps on differential gene expression among both.

Les infections à Salmonella Typhimurium constituent un problème de taille pour l’industrie porcine et la santé publique car cet animal est un réservoir pour les infections chez l’homme. De plus, on observe, chez des souches appartenant au lysotype (LT) 104, des résistances multiples aux antimicrobiens associées à des septicémies chez les porcs en engraissement, ce qui peut contribuer à la contamination des carcasses. Il faut donc contrôler l’infection au niveau du troupeau. Pour ce faire, il importe donc de mieux caractériser ces souches, comprendre la pathogénie de l’infection et identifier des facteurs de virulence. L’objectif principal de cette étude était de caractériser des isolats de S. Typhimurium provenant de porcs septicémiques et de les comparer avec ceux de porcs sains. Une banque d’isolats provenant de porcs septicémiques (ASC) et de porcs sains à l’abattoir (SSC) était constituée. Le lysotype des isolats a été identifié et ceux-ci ont été caractérisés selon le profil de résistance aux antimicrobiens, le SDS-PAGE et l’immunobuvardage et le PFGE. Chez les isolats ASC, LT 104 représentait 36.4% des isolats et chez les isolats SSC la proportion était de 51.5%. Les isolats pouvaient être résistants jusqu’à douze antimicrobiens, peu importe leur origine. Il n’a toutefois pas été possible d’associer une protéine spécifique au groupe d’isolats ASC. Parmi les souches LT 104, plusieurs groupes génétiques ont été identifiés. Les différentes étapes de la pathogénie de Salmonella ont ensuite été évaluées, dont l’adhésion et l’invasion des isolats des deux banques sur des cellules intestinales humaines. Nos résultats ont démontré que les isolats ASC avaient un pouvoir accru d’invasion comparés aux isolats SSC (P=0.003). Pour un sous-groupe d’isolats sélectionnés selon leur taux d’invasion, des tests de phagocytose, d’apoptose et d’adhésion au mucus intestinal ont été effectués en utilisant la cytométrie en flux. La survie des bactéries après la phagocytose a aussi été évaluée et la méthode MATS a été utilisée pour évaluer l'adhésion aux solvants. Les pourcentages de phagocytose chez les isolats SSC par les monocytes porcins étaient plus élevés que chez les isolats ASC à 15 minutes (P=0.02). Nous n’avons trouvé aucune différence significative pour les autres méthodes utilisées. Nous avons ensuite comparé le génome d’un isolat ASC (#36) à celui d’un isolat SSC (#1) par le SSH pour identifier des facteurs de virulence potentiels. Des clones correspondant à des gènes retrouvés sur le chromosome ainsi que sur des plasmides ont été identifiés. Ces résultats nous ont dirigés vers l’analyse des profils plasmidiques de tous les isolats. Les différents profils étaient retrouvés autant chez les isolats ASC que chez les isolats SSC. Deux profils (PL14 et PL20) étaient observés plus fréquemment chez les isolats LT 104 que chez les isolats d’autres lysotypes (P=0.01 et P=0.01, respectivement). Le séquençage d’un des plasmides de l’isolat ASC, démontrait la présence d’informations génétiques codant pour la réplication et une bêta-galactosidase-α. Il serait intéressant de préciser le rôle exact de ces gènes dans l’infection. Nos travaux suggèrent que les isolats de S. Typhimurium provenant de porcs septicémiques se distinguent par un pouvoir d’invasion accru ainsi que par des taux de phagocytose plus faibles dans les phases initiales de l’infection. Cette étude aura donc permis d’accroître les connaissances sur la pathogénie des infections à S. Typhimurium chez le porc.
Salmonella Typhimurium infections represent an important threat both to the swine industry and public health since pig is also a reservoir for human infections. Multiresistance to antimicrobial agents is often associated with S. Typhimurium belonging to phage type (PT) 104, and these isolates can cause septicemia in fattening pigs. It is thus necessary to control the infection at the herd level to avoid meat contamination by these isolates. However, in order to develop more efficacious control measures, it is important to characterize isolates, better understand the pathogenesis of infection and identify virulence factors. The main objective of this study was to characterize isolates of S. Typhimurium associated with septicemia in swine and to compare them to isolates recovered from healthy pigs. Isolates of S. Typhimurium associated with septicemia in swine (CS) were compared to isolates recovered from healthy animals at slaughterhouses (WCS). The phage type of each isolate was identified and these isolates were characterized by antimicrobial resistance, SDS-PAGE and immunoblotting, and PFGE. Among the CS isolates, PT 104 represented 36.4% of isolates while it represented 51.5% of WCS isolates. Resistance to as many as twelve antimicrobial agents was found in isolates from CS and WCS. However, it was not possible to associate any particular protein to septicemic isolates. Multiple genetic profiles were identified among the isolates of PT 104. Different steps of the pathogenesis of Salmonella infection were evaluated, in particularly the ability to adhere to and invade intestinal epithelial cell lines by CS and WCS isolates. The isolates recovered from diseased animals invaded intestinal epithelial cell lines at a higher rate than isolates from healthy pigs (P=0.003). Some isolates were selected according to their invasion rate and some analysis, using flow cytometry were done to evaluate phagocytosis, induction of apoptosis, and adhesion to intestinal mucus. The survival in monocytes was evaluated and the MATS method was used to evaluate the bacterial surface properties, measuring interactions with solvents. Isolates from WCS were more phagocytized than isolates fom CS at 15 minutes (P=0.02). We found no significant difference for the other methods used. Using SSH, we also compared the genome of a CS isolate (#36) to that of a WCS isolate (#1), for the identification of putative virulence factors. Clones with chromosome and plasmids homology were obtained. It was therefore decided to analyze the plasmid profiles of all isolates. Two profiles (PL14 and PL20) were more frequently observed in the PT 104 isolates than in the isolates belonging to other phage types (P=0.01 and P=0.01, respectively). Various profiles were found in both isolates from septicemic pigs and those from healthy pigs. An interesting plasmid of the CS isolate was sequenced. This plasmid possesses genetic information for replication as well as a beta-galactosidase-α. It would be needed to characterize the role of these putative virulence factors in the future. Our work suggests that isolates from septicemic pigs may be distinguished from isolates from healthy pigs by their better ability to invade intestinal cells as well as by a lower rate of phagocytosis in the early steps of infection. This study increased our knowledge on the pathogeny of S. Typhimurium infection in pigs.