Auswahl der wissenschaftlichen Literatur zum Thema „Résistance aux ITKs“

ABSTRACTSince 2000, incidence and mortality rates attributable to malaria have declined significantly. However, this decline may be short-lived due to the emergence of insecticide-resistant malaria vectors caused by the overuse of indoor residual spraying (IRS) and insecticide treated nets (ITNs). This policy paper will discuss the emergence, causes, and implications of vector resistance and will propose solu­tions to prevent a future public health crisis.RÉSUMÉDepuis 2000, l’incidence et les taux de mortalité attribuables au paludisme ont diminué significativement. Toutefois, ce déclin risque d’être de courte durée en raison de l’émergence de vecteurs du paludisme résistants aux insecticides, causée par la surutilisation de la pulvérisation intradomiciliaire (PID) et de moustiquaires imprégnées d’insecticides (MII). Cet article de politique discutera de l’émergence, des causes et des implications de la résistance des vecteurs, et proposera des solutions dans le but de prévenir une éventuelle crise sanitaire.

Les fonctions du système nerveux autonome sont décrites depuis plusieurs décennies. Cependant, son rôle dans la biologie cellulaire des tissus innervés n’a fait que plus récemment l’objet d’un intérêt soutenu, en particulier en cancérologie. Les fibres afférentes et efférentes de ce système innervent les organes périphériques et contribuent au maintien de l’homéostasie de l’organisme. Elles sont impliquées dans les processus de développement, de réparation et de régénération. Tous ces phénomènes sont, de leur côté, documentés depuis longtemps comme étant associés au cancer. De nouvelles preuves suggèrent que les cellules cancéreuses profitent de l'innervation pathologique associée au cancer pour favoriser l'initiation et la progression de la maladie. En effet, le système nerveux autonome joue un rôle important dans le développement de diverses tumeurs localisées dans des organes innervés physiologiquement comme le pancréas, les ovaires et l’utérus, en régulant notamment la prolifération, la différenciation, la migration, et la dissémination des cellules cancéreuses. Le foie, en tant qu'organe innervé, voit sa physiopathologie également conditionnée par le système nerveux autonome. Toutefois, peu d’études détaillées ont documenté le rôle des fibres nerveuses autonomes dans le carcinome hépatocellulaire (CHC) et sa progression. Cette thèse a exploré la régulation du système nerveux autonome dans l’apparition et la progression du cancer du foie, ainsi que les conséquences de sa modulation dans le but d’identifier de potentielles nouvelles stratégies thérapeutiques fondées sur le niveau de connaissance et de sûreté des médicaments ciblant cette grande fonction physiologique depuis des décennies. Pour cela, nous avons eu recours à des échantillons cliniques, de rats, de souris, ainsi qu’à des cellules primaires, des sphéroïdes, des hépatocytes primaires, et différentes lignées cellulaires. Par immunofluorescence, nous avons mis en évidence la présence de marqueurs neuronaux et plus spécifiquement la colocalisation d’un marqueur immature et d’un marqueur cholinergique dans la capsule et la masse tumorale d’échantillons cliniques. A l’échelle protéique, nous avons montré que ces mêmes marqueurs corrélaient avec l’apparition et la progression de la maladie dans des échantillons cliniques et de rats. En utilisant des données de bio-informatique, nous avons stratifié les CHC en deux groupes : adrénergique et cholinergique en utilisant un score neuronal défini par une approche mathématique simple. A partir de cette stratification, nous avons identifié les tumeurs cholinergiques, comme étant corrélées aux mutations TP53 (p ≤ 0,05), à un intervalle sans progression et à une survie globale plus courts que les tumeurs adrénergiques. De plus, elles étaient corrélées à des traits moléculaires plus pathogènes (tels que, des signatures transcriptomiques prolifératives, moins différenciées, riches en AFP, associées à des fonctions mitotiques plus élevées), ainsi qu’à des caractéristiques définissant la classe proliférative du CHC (CHC agressif) contrairement aux tumeurs adrénergiques. Enfin, en inhibant pharmacologiquement la voie cholinergique par des antagonistes muscariniques et leurs contrôles nicotiniques in vitro, nous avons observé une diminution de la croissance cellulaire indépendante de l’ancrage ainsi qu’une synergie avec les inhibiteurs de tyrosine kinase (ITKs) sorafenib et lenvatinib, tout en préservant les fonctions hépatocytaires des cellules primaires testées. Dans l’ensemble, nos travaux suggèrent que la polarité cholinergique est défavorablement impliquée dans la pathogénicité du carcinome hépatocellulaire et constitue donc une cible d’intérêt futur, légitime en thérapeutique
The functions of the autonomic nervous system have been described for several decades. However, its role in the cellular biology of innervated tissues has only recently been the subject of sustained interest, particularly in cancerology. The afferent and efferent fibers of this system innervate peripheral organs and help maintain the homeostasis of the organism. They are involved in the processes of development, repair and regeneration. All these phenomena, in turn, have been documented as being associated with cancer. New evidence suggests that cancer cells take advantage of the pathological innervation associated with cancer to promote disease initiation and progression. Indeed, the autonomic nervous system plays an important role in the development of various tumors located in physiologically innervated organs such as the pancreas, ovaries and uterus, notably by regulating the proliferation, differentiation, migration and dissemination of cancer cells. As an innervated organ, the liver's pathophysiology is also conditioned by the autonomic nervous system. However, few detailed studies have documented the role of autonomic nerve fibers in hepatocellular carcinoma (HCC) and its progression. This thesis explored the regulation of the autonomic nervous system in the onset and progression of liver cancer, and the consequences of its modulation, with the aim of identifying potential new therapeutic strategies based on the level of knowledge and safety of drugs targeting this major physiological function for decades. To achieve this, we used clinical, rat and mouse samples, as well as primary cells, spheroids, primary hepatocytes and different cell lines. Using immunofluorescence, we highlighted the presence of neuronal markers and, more specifically, the colocalization of an immature marker and a cholinergic marker in the capsule and tumor mass of clinical samples. At the protein level, we showed that these same markers correlated with disease onset and progression in clinical and rat samples. Using bioinformatics data, we stratified HCCs into adrenergic and cholinergic groups using a neuronal score defined by a mathematical approach. From this stratification, we identified cholinergic tumors as correlated with TP53 mutations (p ≤ 0.05), shorter progression-free interval and overall survival than adrenergic tumors. Furthermore, they were correlated with more pathogenic molecular features (such as, proliferative transcriptomic signatures, less differentiated, AFP-rich, associated with higher mitotic functions), as well as with features defining the proliferative class of HCC (aggressive HCC) unlike adrenergic tumors. Finally, by pharmacologically inhibiting the cholinergic pathway with muscarinic antagonists and their nicotinic controls in vitro, we observed a decrease in anchorage-independent cell growth as well as synergy with the tyrosine kinase inhibitors (TKIs) sorafenib and lenvatinib, while preserving hepatocyte functions in the primary cells tested. Overall, our work suggests that cholinergic polarity is unfavorably implicated in the pathogenicity of hepatocellular carcinoma, and therefore constitutes a legitimate target of future therapeutic interest

Les recherches présentées dans ma thèse portent sur l’étude du rôle de la chromogranine A (CGA) et de ses peptides dérivés dans l’immunité innée. Dans la partie de recherche clinique, nous avons montré que la concentration sérique de CGA à l’admission en réanimation augmente chez les patients atteints de sepsis et de SIRS. De plus, elle est un marqueur pronostique indépendant pour les patients admis en réanimation médicale. Dans la partie de recherche fondamentale, nous démontrons par des techniques de cytométrie en flux et d’imagerie calcique que la chromofungine et la catestatine, deux peptides antimicrobiens dérivés de la CGA, provoquent une entrée spécifique de Ca2+ dans les neutrophiles par des mécanismes d’activation d’iPLA2. Nous proposons que ces deux peptides jouent un rôle dans l’activation des neutrophiles. L’ensemble de ces résultats sont importants pour comprendre le rôle biologique de la CGA et de ses peptides dérivés dans l’immunité innée
Research results presented in my thesis concern the role of chromogranine A (CGA) and its derived peptides in the innate immunity. In the clinical research part, we have demonstrated that serum CGA on admission increases significantly in the group of sepsis and SIRS patients. Moreover, it is an independent prognostic marker for medical ICU patients. In the basic research part, we found that chromofungin and catestatin, two CGA derived antimicrobial peptides, can provoke a specific Ca2+ entry on neutrophils via a mechanism involving iPLA2 activation. We proposed that these 2 peptides can play a role in neutrophils activation. All together, our results are important to understand the biological role of CGA derived peptides in the innate immunity

Les mastocytoses systémiques (SM) constituent un groupe hétérogène de maladies rares, caractérisées par l’accumulation anormale de mastocytes malins dans la moelle osseuse et dans d’autres organes extra-cutanés. La majorité des patients avec SM ont une mutation activatrice du gène KIT, le plus souvent la mutation KIT D816V, retrouvée chez plus de 90% de tous les patients. Cette mutation induit l’activation constitutive du récepteur KIT en déclenchant de façon aberrante une cascade de voies de signalisation, dont la voie PI3K/AKT et JAK/STAT5, aboutissant à l’inhibition de l’apoptose et à l’augmentation de la prolifération et de la survie des mastocytes malins. Cependant, l’efficacité des inhibiteurs de tyrosines kinases (ITKs) sur cette mutation est limitée à cause de la résistance et/ou de toxicité liée à un manque de spécificité. Il est donc nécessaire de trouver de nouvelles approches thérapeutiques afin de contourner cette résistance au cours des SM KIT D816V+ avancées. Nous avons utilisé une approche consistant à cibler de façon combinée des molécules activées en aval de KIT D816V, comme AKT et STAT5, par des inhibiteurs pharmacologiques. Ceci nous a permis d’identifier une combinaison synergique entre un inhibiteur d’AKT (GSK690693) et un inhibiteur de STAT5 (BP-1-102). Ces composés sont capables d’inhiber la prolifération des cellules KIT D816V+ seuls ou en combinaison, mais à de très fortes concentrations, malheureusement non utilisables en thérapeutique. Néanmoins, ces premiers résultats ont permis de valider AKT et STAT5 comme cibles potentielles dans le traitement des SM avancées. La seconde approche employée a été de cibler directement le récepteur KIT D816V par des inhibiteurs pharmacologiques. A l’issu d’un criblage, nous avons identifié trois composés - BLU2317, BLU2718 et DCC-2618 - capables d’inhiber sélectivement la phosphorylation de KIT D816V. Ces composés inhibent la prolifération des cellules ROSAKIT D816V et HMC-1.2, et induisent l’apoptose des cellules de façon dose-dépendante. Bien que les effets de ces trois composés soient similaires, DCC-2618 agit à des concentrations plus faibles par rapport aux composés BLU2317 et BLU2718. Afin d’apprécier l’efficacité in vivo de DCC-2618, nous avons d’abord établi un nouveau modèle de SM basé sur l’injection intraveineuse des cellules ROSAKIT D816V-Gluc exprimant la Gaussia luciferase (Gluc) dans des souris NSG. La présence de la Gluc sécrétée par les cellules ROSAKIT D816V-Gluc facilite la mise en évidence de prise de greffe et permet un contrôle précis de la progression de la maladie. Ce modèle reproduit, au bout de 4 semaines, chez toutes les souris greffées, une SM avancée similaire à celle retrouvée chez l’homme, avec atteinte de la moelle osseuse, du sang, de la rate et du foie, tandis que la dégradation de l’état général des souris n’est observée qu’à partir de 12 semaines. Ce nouveau modèle offre suffisamment de temps pour explorer la cinétique de la progression de la maladie et surtout pour effectuer des études pharmacologiques précliniques. L’évaluation de l’effet de DCC-2618 in vivo a été réalisée sur ce modèle. Etonnamment, DCC-2618 n’a pas été capable d’inhiber la progression de la maladie chez les souris traitées, bien qu’atteignant des concentrations élevées dans la moelle osseuse et le plasma des souris traitées. Néanmoins, DCC-2618 s’est montré capable d’inhiber la phosphorylation de KIT dans les cellules issues de la moelle osseuse des souris traitées. En revanche, contrairement aux effets observés in vitro, DCC-2618 a induit une surexpression de phospho-ERK1/2 dans les cellules malignes des souris greffées. Ceci suggère qu’ERK1/2 joue un rôle important dans la résistance au composé DCC-2618 et éventuellement à d’autres ITKs, indépendamment du récepteur KIT. ERK1/2 pourrait donc être une nouvelle cible thérapeutique d’intérêt dans le traitement des SM résistantes aux ITKs
Systemic mastocytosis (SM) is a heterogeneous group of rare diseases characterized by abnormal accumulation of malignant mast cells (MCs) in the bone marrow (BM) and other extra-cutaneous organs. The majority of SM patients have an activating mutation in the KIT gene, usually the D816V point mutation, which is found in more than 90% of all patients. This mutation induces constitutive activation of the KIT receptor by triggering a cascade of signaling pathways, including the PI3K/AKT and the JAK/STAT5 pathways, resulting in the inhibition of apoptosis and increased survival and proliferation of malignant mast cells. However, the efficacy of the tyrosine kinase inhibitors (TKIs) on this mutation is limited due to resistance and/or toxicity associated with a lack of specificity. It is therefore critical to find new therapeutic approaches to overcome this resistance to TKIs, particularly for advanced KIT D816V+ SM. In the present thesis, we have used an approach consisting in targeting molecules activated downstream of KIT D816V, such as AKT and STAT5, using pharmacological inhibitors in combination. This allowed us to identify a synergistic combination of an AKT inhibitor (GSK690693) and an inhibitor of STAT5 (BP-1-102). These compounds are able to inhibit proliferation of KIT D816V+ cells, alone or in combination, but at very high concentrations, unfortunately not useful therapeutically. Nevertheless, these initial results have validated STAT5 and AKT as potential targets for the treatment of advanced SM. The second approach used was to target directly the KIT D816V receptor by pharmacological inhibitors. After a large screening, we identified three compounds - BLU2317, BLU2718 and DCC-2618 - which selectively inhibit the phosphorylation of KIT D816V. These compounds inhibit the proliferation of ROSAKIT D816V and HMC-1.2 cells, and induce apoptosis of these cells in a dose-dependent manner. Although the effects of these three compounds are similar, the DCC-2618 compound acts at lower concentrations relative to BLU2317 and BLU2718 compounds. In order to assess the in vivo efficacy of DCC-2618, we first established a new model of SM based on intravenous injection of cells expressing Gaussia luciferase (Gluc), ROSAKIT D816V-Gluc cells, in NSG mice. The presence of the secreted Gluc in ROSAKIT D816V-Gluc cells facilitates the detection of engraftment and allows precise monitoring of disease progression. This model reproduced within four weeks, in all grafted mice, an advanced SM similar to the one found in humans, with neoplastic MCs infiltration in BM, blood, spleen and liver, while the terminal deterioration of the clinical condition of the mice was observed after 12 weeks. Thus, this new in vivo model allows modulating the aggressiveness of the disease by varying the number of injected cells. It provides sufficient time to explore the kinetics of disease progression and especially to conduct preclinical pharmacological studies. We then evaluated the effect of DCC-2618 compound in vivo on this model. Surprisingly, DCC-2618 was not able to inhibit disease progression in treated mice, although it reached high concentrations in the BM and the plasma of treated mice. Nevertheless, we showed that the compound was able to inhibit the phosphorylation of the KIT receptor in cells derived from the BM of treated mice. In addition, contrasting to the effects observed in vitro, DCC-2618 induced an over-expression of phospho-ERK1/2 in the malignant cells of transplanted mice. This suggests that ERK1/2 may play a critical role in the resistance to DCC-2618, and possibly to other TKIs, independently of the KIT receptor. ERK1/2 could thus be a new interesting therapeutic target in the treatment of advanced SM resistant to TKIs

Chez les bactéries à Gram-négatif, l’imperméabilité de la membrane externe est un facteur majeur contribuant au développement de la résistance. Chez Escherichia coli, les porines OmpF et OmpC sont des protéines de la membrane externe qui forment des canaux pour la diffusion de petites molécules hydrophiles tels que les antibiotiques. L’expression des porines est soumise à une régulation fine, et des petits ARN non-codants (sRNAs, small RNAs) jouent un rôle important au niveau post-transcriptionnel. Dans ce cadre, et en utilisant E. coli comme bactérie modèle, les objectifs de mon travail de thèse étaient : (1) de caractériser la régulation du sRNA MicC et la co-régulation putative de la porine quiescente OmpN; (2) d’examiner l'effet global de MicC sur le transcriptome; (3) d’analyser l'impact de l'expression de MicC sur la sensibilité aux antibiotiques. Les résultats obtenus montrent l’induction de MicC en présence d'antibiotiques de la famille des β-lactamines, ou en l’absence du facteur sigma de réponse au stress de l’enveloppe sigmaE. Ces mêmes conditions activent aussi l'activité d'une fusion ompN-lacZ, indiquant une régulation transcriptionnelle commune de micC et ompN. Etant donnée la conservation de MicC chez les entérobactéries, nous avons effectué une étude par RNASeq pour déterminer l'impact de la surexpression de MicC sur le transcriptome d’E. coli et identifié 60 ARNm régulés par MicC en plus de sa cible initiale ompC. L'identification des spectres cibles globaux des sRNAs est importante pour comprendre leur importance dans la physiologie bactérienne, ici celui de MicC dans la résistance aux antibiotiques
A major factor contributing to antimicrobial resistance is the inability of antibiotics to penetrate the bacterial outer membrane to reach their target. In Escherichia coli, the two abundantly expressed porins OmpF and OmpC form channels for diffusion of small hydrophilic molecules including antibiotics. The expression of porins is under complex regulation and the small regulatory RNAs (sRNAs) fine tune the porin expression level at post-transcriptional level. MicF and MicC are the two major sRNAs that negatively regulate expression of OmpF and OmpC, respectively. Interestingly, these two sRNAs are encoded next to porin gene, i.e. micF-ompC and micC-ompN, suggesting a dual regulation. Our goals in this work were: (1) to characterize the regulation of the sRNA MicC and the putative co-regulation of the quiescent porin OmpN in E. coli; (2) to examine the global effect of MicC on the E. coli transcriptome; (3) to analyze the impact of MicC expression on antibiotic susceptibility. Our work shows that the expression of micC was increased in the presence of carbapenems and cephalosporins and in an rpoE depleted mutant. The same conditions enhanced the expression of OmpN, suggesting a dual regulation of micC and ompN. We also performed RNA sequencing to determine the impact of MicC overexpression on E. coli transcriptome. This identified 60 mRNA targets negatively regulated by MicC apart from its original target. Identification of the global target spectra of MicC is of importance to understand its importance on the overall bacterial physiology, and more specifically on AMR

Pseudomonas aeruginosa est un pathogène opportuniste à Gram-négatif, responsable d’infections nosocomiales chez des patients immunodéprimés et principale cause de morbidité et de mortalité chez les patients atteints de mucoviscidose. Les traitements utilisés contre P. aeruginosa peuvent être mis en échec en raison des nombreux mécanismes de résistance développés par la bactérie tels que les systèmes d’efflux RND, capables d’exporter les antibiotiques à l’extérieur de la cellule. Parmi ces systèmes, MexEF-OprN est très peu produit dans les souches sauvages mais il est surproduit chez les mutants appelés nfxC et conduit à une résistance aux fluoroquinolones, au chloramphénicol et au triméthoprime. Ces mutants ont également la particularité de résister de façon concomitante aux carbapénèmes et d’être peu virulents. Notons enfin que la pompe MexEF-OprN est codée par un opéron à trois gènes, mexEF-oprN, dont la transcription est activée par MexT, un régulateur appartenant à la famille LysR.Les mutants nfxC étant peu décrits dans le contexte clinique, nous avons évalué leur prévalence et caractérisé les événements génétiques conduisant à la surexpression de mexEF-oprN. A partir d’une collection de 221 souches cliniques isolées au CHRU de Besançon, et sélectionnées en raison de leur sensibilité diminuée à la ciprofloxacine et à l’imipénème, 19.5% surexprimaient mexEF-oprN. Nous avons par la suite caractérisé 22 souches non-redondantes et montré que seulement 13.6% d’entre elles possédaient des mutations inactivatrices dans le gène mexS alors que 40.9% avaient des mutations conduisant à la substitution d’un seul acide-aminé. Il est apparu que ces dernières mutations avaient des effets modérés sur les profils de résistance et de virulence alors que les mutations inactivatrices donnaient des hauts niveaux de résistance mais aucune virulence. Enfin, nous n’avons pas pu identifier de mutations génétiques pouvant expliquer la surexpression de mexEF-oprN des 45.5% de souches restantes, suggérant l’existence des mécanismes de régulation encore inconnus de cet opéron.Nous avons donc étudié des mutants résistants au chloramphénicol, sélectionnés in vitro à partir de la souche de référence PA14. Leur caractérisation nous a permis de découvrir un nouveau type de mutants surproducteurs de MexEF-OprN que nous avons appelé nfxC2. Tous possédaient des mutations gain-de-fonction sur le gène PA14_38040 (nommé cmrA) codant pour un régulateur de la famille AraC, jamais étudié auparavant. Chez les mutants nfxC2, l’expression de cmrA est augmentée, ainsi que celle de l’opéron mexEF-oprN et ceci, d’une façon MexS- et MexT-dépendante. De façon intéressante, ces mutations dans cmrA font apparaître un phénotype résistant sans toutefois altérer la virulence de la souche. Une analyse transcriptomique a montré que CmrA pouvait activer l’expression de 11 gènes parmi lesquels PA14_38020 apparaît comme étant nécessaire pour l’activation indirecte de mexEF-oprN. Ce gène code pour une quinol monooxygenase partageant des domaines conservés avec YgiN, une enzyme d’Escherichia coli qui participe à la réponse contre les électrophiles. D’ailleurs, l’exposition de la souche PA14 à des concentrations sub-inhibitrices d’électrophiles toxiques (glyoxal, méthylglyoxal et cinnamaldéhyde) active suffisamment la pompe MexEF-OprN pour générer un phénotype de résistance et ce, de façon CmrA-dépendante. Enfin, cette même exposition aux électrophiles active également deux autres pompes RND, à savoir MexAB-OprM et MexXY/OprM. Les voies de régulation conduisant à l’activation de ces deux opérons d’efflux seront étudiées prochainement au laboratoire
Pseudomonas aeruginosa is a Gram negative opportunistic pathogen, responsible for several nosocomial infections in immunocompromised patients, and the main cause of mortality and morbidity of patients suffering from cystic fibrosis. Treatment of P. aeruginosa infections turns to be difficult due to its natural resistance to antibiotics, increased in part by the overproduction of RND efflux pumps capable to export antibiotics out of the cell. Amongst these systems, MexEF-OprN exports several antibiotics such as fluoroquinolones, chloramphenicol and trimethoprim. This efflux pump is quiescent in wild-type strains but it is highly produced in nfxC mutants, making them resistant to MexEF-OprN substrates. In addition, these mutants are characterized by their concomitant resistance to carbapenems and their low-virulence profile. MexEF-OprN is encoded by a three-gene operon, mexEF-oprN, whose transcription is activated by MexT, a member of the LysR family of transcriptional regulators. In the clinical context, nfxC mutants being poorly described, we evaluated their prevalence and characterized the genetic events responsible for mexEF-oprN overexpression. A collection of 221 clinical isolates from the University Hospital of Besançon exhibiting a reduced susceptibility to ciprofloxacin and imipenem was screened. We found that 19.5% of these strains overexpressed mexEF-oprN and further characterization of the 22 non-redundant mutants showed that only 13.6% of these mutants harbored a disrupted mexS gene. Moreover, 40.9% of nfxC clinical strains harbored missense mutations in mexS conducing to the substitution of a single amino-acid residue in the encoding protein. Interestingly, these mutations were associated to moderate effects on resistance and virulence factor production while disruptive mutations produced highly resistant but completely non-virulent strains. For the 45.5% of remaining strains, we failed to identify genetic mutations, which could explain mexEF-oprN overexpression; this indirectly suggested that there might be additional regulatory loci controlling the expression of this operon.We thus studied chloramphenicol resistant mutants selected in vitro derived from reference strain PA14 and found a new class of MexEF-OprN overproducers, which we called nfxC2, harboring gain-of-function mutations in a so-far uncharacterized gene, PA14_38040 (hereafter called cmrA) coding for an AraC transcriptional regulator. In nfxC2 mutants, the mutated CmrA increases its proper gene expression and upregulates the expression of mexEF-oprN through MexS and MexT, resulting in a multi-drug resistant phenotype without altering virulence factor production. Transcriptomic experiments showed that CmrA positively regulates the expression of 11 genes, including PA14_38020, which is required for the MexS/MexT-dependent activation of mexEF-oprN. Gene PA14_38020 is predicted to code a quinol monooxygenase sharing conserved domains with YgiN of Escherichia coli, which was reported to be involved in the response of the bacterium to electrophiles. Interestingly, exposure of strain PA14 to sub-inhibitory concentrations of toxic electrophiles (glyoxal, methylglyoxal or cinnamaldehyde) strongly activates the CmrA-pathway and upregulates mexEF-oprN sufficiently to provoke the resistance to the pump substrates. Finally, we found that the same exposure to electrophiles is capable to activate two other RND pumps, MexAB-OprM and MexXY/OprM. The regulatory pathways conducing to activation of these two efflux operons will be elucidated at the laboratory

La méthylation et déméthylation de l'ADN jouent un rôle majeur dans la stabilité des génomes, l'empreinte génomique, la paramutation et le développement. En revanche, le rôle de cette régulation épigénétique a été peu étudiée dans les interactions hôtes-pathogènes. Dans ce projet de thèse, nous avons tout d'abord montré que la méthylation de l'ADN régule négativement la résistance d'Arabidopsis thaliana à une souche de Pseudomonas syringae pathogène. Nous avons également identifié un grand nombre de gènes de l'immunité ciblés directement par la méthylation de l'ADN dirigée par petits ARN dans leurs régions promotrices. Nous proposons que cette régulation génique permettrait de maintenir une faible expression basale de ces gènes et d'éviter ainsi des effets délétères qui seraient causés par une expression constitutive de la réponse immunitaire. De plus, nous montrons que la déméthylase active REPRESSOR OF SILENCING 1 (ROS1) facilite l'activation transcriptionnelle de gènes de l'immunité en laissant potentiellement des éléments de régulation en cis accessibles à des facteurs de transcription. Nous avons également démontré que ce facteur contribue à la résistance à P. syringae chez Arabidopsis, caractérisant ainsi la première déméthylase eucaryote dans la résistance antibactérienne. Sur la base de ces résultats, nous proposons que la méthylation de l'ADN maintient une faible expression basale de gènes de l'immunité en absence de pathogène, tandis que la déméthylation active assure une induction rapide de ces gènes au cours de la réponse immunitaire en favorisant potentiellement le recrutement de facteurs de transcription sur la chromatine
DNA methylation and demethylation are regulatory processes involved in genome stability, genomic imprinting, paramutation and development. Until recently, very little was known about the role of these epigenetic processes in plant disease resistance and in the transcriptional control of immune-responsive genes. Here we provide evidence that DNA methylation negatively regulates antibacterial resistance against a virulent Pseudomonas syringae strain in Arabidopsis. Accordingly, we have identified a subset of defense genes that are targeted and repressed by RNA-directed DNA methylation (RdDM), presumably to prevent trade-off effects that would be caused by their constitutive expression and/or sustained induction. In addition, we found that the active DNA demethylase facilitates the transcriptional activation of some of these defense genes by pruning DNA methylation at their promoter regions and leaving cis-elements accessible for transcription factor binding. In addition, we show that the active demethylase REPRESSOR OF SILENCING 1 (ROS1) positively regulates late immune responses including Pathogen Associated Molecular Pattern (PAMP)-triggered callose deposition and salicylic acid (SA)-dependent defense response. We also demonstrate that ROS1 restricts Pto DC3000 propagation in Arabidopsis leaf secondary veins, providing the first example for a role of an active DNA demethylase in antibacterial resistance. Based on these findings we propose that DNA methylation maintains a low basal expression of some immune-responsive genes in normal growth condition, while active DNA demethylation ensures a rapid and pervasive induction of these genes upon bacterial pathogen detection

Introduction : Le traitement des cancers bronchiques non à petites cellules (CBNPC) EGFR mutés repose sur les inhibiteurs de tyrosine kinase (ITK) du récepteur de l’Epidermal Growth Factor (EGFR). Cependant tous les patients traités par ITK EGFR finissent par présenter une progression tumorale, du fait de mécanismes de résistance comme l’amplification du gène codant pour le récepteur tyrosine kinase MET. Il n’existe actuellement aucune donnée sur les modifications phénotypiques induites par l’activation de MET dans ce contexte. L’objectif de cette thèse est de déterminer si l’amplification de MET, lors de la résistance aux ITK EGFR dans les CBNPC EGFR mutés, confère aux cellules tumorales un phénotype plus agressif et modifie l’histoire naturelle de la maladie.Méthodes : Les capacités de prolifération, de croissance sans ancrage, de formation de sphéroïdes, de résistance à l’anoïkis et de migration ont été étudiées in vitro dans la lignée HCC827, dérivée d’un CBNPC EGFR muté, et dans sa lignée fille HCC827-GR6 (GR6) devenue résistante aux ITK EGFR via une amplification du gène MET. L’expression de la vimentine, de ZEB1, et de la E-cadherine a également été étudiée dans les deux lignées cellulaires afin d’évaluer l’impact de l’amplification de MET sur la transition épithélio-mésenchymateuse (TEM). In vivo la croissance tumorale et le potentiel métastatique ont respectivement été analysés dans des modèles murins de xénogreffe ectopique et d’injection intracardiaque. Enfin les données cliniques de patients issus de 15 centres avec un CBNPC EGFR muté métastatique, présentant une forte surexpression de MET en immunohistochimie (score 3+) ou une amplification de MET en FISH sur une re-biopsie réalisée après la progression sous ITK EGFR ont été analysées rétrospectivement. Résultats : In vitro, l’amplification de MET induisait une augmentation significative de la prolifération, de la croissance sans ancrage, de la formation de sphéroïdes, de la résistance à l’anoïkis et de la migration. En présence d’un inhibiteur de MET, le PHA-665752, ces différentes propriétés biologiques étaient réduites de façon significative dans les cellules GR6 porteuses de l’amplification de MET. Il était également mis en évidence dans les cellules GR6 une augmentation de l’expression de la vimentine et de ZEB1. In vivo, l’amplification de MET augmentait significativement la croissance tumorale et le potentiel métastatique. Un traitement par crizotinib, ITK ciblant MET, diminuait de façon significative le potentiel métastatique des cellules porteuses de l’amplification de MET. Enfin les patients atteints d’un CBNPC EGFR muté, porteur d’une amplification de MET à la résistance à l’ITK EGFR, présentaient une durée jusqu’à apparition de nouvelles métastases plus courte après progression sous ITK EGFR que les patients avec une forte surexpression de MET sans amplification génique. Conclusion L’amplification de MET dans un contexte de résistance aux ITK EGFR est associée à un phénotype tumoral plus agressif. Ces résultats plaident en faveur d’une utilisation précoce d’inhibiteurs de MET en association avec les ITK EGFR afin d’éviter l’émergence d’un clone tumoral résistant plus agressif
Introduction: Treatment of Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) mutated non-small cell lung cancers (NSCLC) relies on EGFR tyrosine kinase inhibitors (TKI). However, all patients treated with EGFR TKI eventually present tumor progression, due to mechanisms of resistance such as the MET amplification. There is currently no data on phenotypic changes induced by MET activation in this context. The objective of this thesis is to determine whether the MET amplification during EGFR TKI resistance in the EGFR mutated NSCLC induces a more aggressive phenotype in tumor cells and alters the natural history of the disease.Methods: Proliferation, anchorage independent growth, spheroid formation, anoïkis resistance and migration were studied in vitro in the HCC827 cell line, derived from an EGFR mutated NSCLC, and in its daughter cell line HCC827-GR6 (GR6) which became resistant to EGFR TKI through MET amplification. The expression of vimentin, ZEB1, and E-cadherin was evaluated in these cellular models in order to investigate an epithelial to mesenchymal transition (EMT) process induced by the MET amplification. In vivo, the tumor growth and the metastatic potential were analyzed by subcutaneous xenograft and intracardiac injection in mouse models. Finally, the clinical data of patients from 15 centers with a metastatic EGFR mutated NSCLC, exhibiting high MET overexpression in immunohistochemistry (score 3+) or MET amplification assessed by FISH on a re-biopsy performed after TKI EGFR progression were analyzed retrospectively.Results: In vitro, the MET amplification induced a significant increase in proliferation, anchorage independent growth, spheroid formation, anoïkis resistance and migration. Treatment with PHA-665752, a MET TKI, significantly reduced these biological properties in the GR6 cells harboring the MET amplification. An increase in the expression of vimentin and ZEB1 was also observed in the GR6 cells. In vivo, the MET amplification significantly increased the tumor growth and the metastatic potential. Treatment with crizotinib, another MET TKI, significantly decreased the metastatic potential of cells carrying MET amplification. Finally, patients with an EGFR mutated NSCLC, displayed a time to new metastases after TKI EGFR progression shorter than patients with high MET overexpression without MET amplification.Conclusion: The MET amplification during EGFR TKI resistance is associated in EGFR muted NSCLC with a more aggressive tumor phenotype. These results argue for the early use of MET inhibitors in combination with EGFR TKIs to avoid the emergence of a more aggressive resistant tumor clone

La méthylation et déméthylation de l'ADN jouent un rôle majeur dans la stabilité des génomes, l'empreinte génomique, la paramutation et le développement. En revanche, le rôle de cette régulation épigénétique a été peu étudiée dans les interactions hôtes-pathogènes. Dans ce projet de thèse, nous avons tout d'abord montré que la méthylation de l'ADN régule négativement la résistance d'Arabidopsis thaliana à une souche de Pseudomonas syringae pathogène. Nous avons également identifié un grand nombre de gènes de l'immunité ciblés directement par la méthylation de l'ADN dirigée par petits ARN dans leurs régions promotrices. Nous proposons que cette régulation génique permettrait de maintenir une faible expression basale de ces gènes et d'éviter ainsi des effets délétères qui seraient causés par une expression constitutive de la réponse immunitaire. De plus, nous montrons que la déméthylase active REPRESSOR OF SILENCING 1 (ROS1) facilite l'activation transcriptionnelle de gènes de l'immunité en laissant potentiellement des éléments de régulation en cis accessibles à des facteurs de transcription. Nous avons également démontré que ce facteur contribue à la résistance à P. syringae chez Arabidopsis, caractérisant ainsi la première déméthylase eucaryote dans la résistance antibactérienne. Sur la base de ces résultats, nous proposons que la méthylation de l'ADN maintient une faible expression basale de gènes de l'immunité en absence de pathogène, tandis que la déméthylation active assure une induction rapide de ces gènes au cours de la réponse immunitaire en favorisant potentiellement le recrutement de facteurs de transcription sur la chromatine
DNA methylation and demethylation are regulatory processes involved in genome stability, genomic imprinting, paramutation and development. Until recently, very little was known about the role of these epigenetic processes in plant disease resistance and in the transcriptional control of immune-responsive genes. Here we provide evidence that DNA methylation negatively regulates antibacterial resistance against a virulent Pseudomonas syringae strain in Arabidopsis. Accordingly, we have identified a subset of defense genes that are targeted and repressed by RNA-directed DNA methylation (RdDM), presumably to prevent trade-off effects that would be caused by their constitutive expression and/or sustained induction. In addition, we found that the active DNA demethylase facilitates the transcriptional activation of some of these defense genes by pruning DNA methylation at their promoter regions and leaving cis-elements accessible for transcription factor binding. In addition, we show that the active demethylase REPRESSOR OF SILENCING 1 (ROS1) positively regulates late immune responses including Pathogen Associated Molecular Pattern (PAMP)-triggered callose deposition and salicylic acid (SA)-dependent defense response. We also demonstrate that ROS1 restricts Pto DC3000 propagation in Arabidopsis leaf secondary veins, providing the first example for a role of an active DNA demethylase in antibacterial resistance. Based on these findings we propose that DNA methylation maintains a low basal expression of some immune-responsive genes in normal growth condition, while active DNA demethylation ensures a rapid and pervasive induction of these genes upon bacterial pathogen detection

Le phénomène de multirésistance aux médicaments laisse les patients atteints de cancer avec un pronostic défavorable et leurs options de traitement sont limitées. Par conséquent, des intérêts croissants dans la recherche de nouveaux composés antitumoraux ou d'autres stratégies pour combattre la multirésistance se sont manifestés. La microscopie électrochimique à balayage (SECM) est dans ce domaine une candidate prometteuse pour l'étude de cellules vivantes. Cette méthode emploie des électrodes nanométriques qui peuvent être utilisées pour détecter des métabolites dans les études portant sur une cellule unique. Le présent travail montre l'influence du ferrocèneméthanol (FcCH2OH) sur deux lignées différentes de cellules humaines cancéreuses du col utérin. Le potentiel de la microscopie électrochimique à balayage biologique (Bio-SECM) est démontré par le fait que la réponse différentielle au FcCH2OH des cellules résistantes aux médicaments provient en partie de l'efflux non spécifique d'une protéine associée cette résistance, la MRP1. Le lien nouvellement établi entre FcCH2OH / [FcCH2OH]+, GSH / GSSG et la multirésistance dans les cellules cancéreuses humaines pourrait avoir un impact sur de futures applications qui nécessitent une évaluation adéquate de la réponse métabolique à des médicaments anticancéreux chez les cellules résistantes à la chimiothérapie. Pour améliorer les futures études de Bio-SECM sur les cellules, une nouvelle procédure d'adhésion cellulaire est établie. Grâce à des membranes élastomériques comprenant des pores à des endroits précis, il est possible de créer des motifs contenant un seul type de cellules, ainsi que de co-cultures. En outre, la technique de Bio-SECM est améliorée par l'introduction d'un mode particulier de balayage de la sonde. Ce mode, appelé distance constante, permet de découpler les informations sur la topographie et sur la réactivité. Le travail présenté est une première étape importante vers l'établissement d'un indicateur quantifiant les activités reliées à la résistance aux médicaments des cellules. Cela pourrait être utilisé tout au long de la vie des cellules et sur différentes lignées, ce qui permettrait de faire un dépistage de médicaments ciblés. Cela améliorerait l'analyse actuelle du cancer, ce qui conduirait finalement à avoir un meilleur traitement chimiothérapeutique. La présente thèse est structurée en trois chapitres, dont deux ont le format d'un manuscrit d'un article scientifique. Le premier chapitre se concentre sur l'utilisation de la microscopie électrochimique à balayage (SECM) pour étudier les cellules vivantes. Grâce à cette technique, les auteurs abordent le phénomène de multirésistance chez les cellules cancéreuses humaines et son impact sur la recherche médicale future. Une nouvelle procédure de structuration de l'adhésion cellulaire sur des motifs définis est présentée dans le chapitre deux de cette thèse. Elle vise à améliorer les conditions de travail pendant les études de Bio-SECM. Le dernier chapitre décrit les perspectives et les objectifs à long terme à atteindre au cours qu’offre ce travail. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Microscopie, Électrochimique à balayage, Multirésistance aux médicaments, Formation de motif cellulaire, Imagerie électrochimique, Cancer