Auswahl der wissenschaftlichen Literatur zum Thema „Réseaux de gènes synthétiques“

Parmi les outils utilisés dans la recherche de marqueurs biologiques en dépression, l’étude de l’expression génétique dans des tissus périphériques a permis d’obtenir des résultats prometteurs. Plusieurs travaux ont démontré, à partir de l’étude du tissu sanguin, que l’expression de certains gènes pouvait distinguer les patients des sujets sains et/ou être prédictive de la réponse au traitement à venir [1,2]. Mais les différences d’expression peuvent concerner également l’ensemble du génome à l’échelle des réseaux de gènes. Nous présenterons ici les résultats d’une étude des réseaux de gènes chez des sujets souffrant de dépression à l’aide d’analyses bio-informatiques appelés « Weighted Gene Co-expression Networks Analyses » [3].L’objectif principal est de démontrer s’il existe des différences dans l’architecture et le niveau d’expression des ces réseaux entre les patients et les témoins sains, mais aussi entre les patients qui seront répondeurs et les non-répondeurs. Nous nous baserons sur les résultats obtenus à partir de trois cohortes différentes (n = 67, n = 63, n = 18).Les résultats de cette étude démontrent qu’il existe à la fois des différences qualitative et quantitative de l’expression des réseaux de gène entre les patients futur répondeurs et non-répondeurs. Ces réseaux de gènes sont associés à de nombreuses fonctions biologiques qui impliquent l’inflammation et la régulation immunitaire. La reproductibilité de ces résultats sera discutée et ces résultats seront mis en perspective avec d’autres études en cours d’analyse.Enfin, leur portée sur la compréhension de la notion de réponse thérapeutique sera abordée.

La recherche en biotechnologie et en génétique est marquée par la constitution de grandes équipes de recherche et une préoccupation pour la commercialisation des résultats de recherche. Cette étude constitue une étude de cas sur la découverte de deux gènes responsables du cancer du sein et des ovaires (BRCA1 et BRCA2) dans les années 1990. Il s’agit des premiers gènes découverts pour une maladie fréquente et sévère. L’objectif est de comprendre la construction des grands réseaux de collaboration scientifique, notamment dans le contexte de la présence de l’industrie. Trois dimensions sont importantes pour expliquer ces réseaux. Premièrement, les particularités du secteur de recherche sont importantes, notamment les spécialisations des chercheurs. Deuxièmement, les stratégies et les objectifs de chercheurs sont déterminants. Au moment des grandes découvertes, les réseaux sont instables et les conflits émergent plus facilement. Troisièmement, les organisations incluant les politiques de financement expliquent aussi les stratégies des chercheurs.

L’épigénétique étudie les modifications chimiques qui régulent l’expression des gènes sans changement de séquence de l’ADN. L’existence d’un lien entre méthylation des paires CpG de l’ADN, une caractéristique de l’épigénome, et vieillissement a été montrée : un nombre limité de ces paires voit en effet sa méthylation augmenter ou diminuer, avec l’âge. La variation de méthylation sur l’ensemble de l’ADN permet ainsi de définir un « âge épigénétique », qui est corrélé avec l’âge chronologique. Chez des individus jeunes, la courbe moyenne de méthylation selon l’âge permet de repérer la qualité de leur vieillissement. Ces résultats sont surprenants car ils sont obtenus sur des tissus dont la durée de vie est pourtant variable. Certaines paires CpG sont organisées en réseaux dans lesquels on observe des co-méthylations, réseaux qui impliquent des gènes participant à la régulation de la morphogenèse ou de la différenciation cellulaire. Ces réseaux seraient les effecteurs de cette horloge épigénétique.

Les progrès du séquençage à haut débit permettent de rechercher simultanément des mutations sur plusieurs gènes pour explorer la prédisposition héréditaire au cancer du sein. Selon le gène, le niveau de risque et le spectre des cancers peuvent varier. Les dispositions spécifiques de prise en charge préconisées sont modulées en fonction des gènes, classés en : (1) très haut risque, tels les gènes BRCA1/2 suivant les recommandations de l’INCa 2017 ; (2) risque élevé ; (3) augmentation modérée : dans ce dernier cas, les mesures de surveillance sont similaires à la population générale. En l’absence de mutation, d’autres facteurs de risque peuvent intervenir et des scores professionnels être calculés. Cependant, selon les recommandations de la HAS 2014, l’histoire familiale prévaut : sur cette base, le dispositif national d’oncogénétique de l’INCa a mis en place un maillage national de réseaux de suivi des personnes à haut risque, présentant ou non des mutations. Enfin, de nouvelles voies thérapeutiques spécifiques s’ouvrent pour les personnes porteuses de mutations.

L'adaptation d'une bactérie aux changements de son environnement est contrôlée par un réseau de régulation large et complexe, faisant intervenir de nombreux acteurs et modules différents. Dans ce travail, nous avons étudiés un module de régulation spécifique, contrôlant l'adaptation de la bactérie Escherichia coli à un changement de sources de carbone. Dans un milieu contenant du glucose et de l'acétate, la croissance est divisée en deux phases : les bactéries utilisent préférentiellement le glucose et commencent à métaboliser l'acétate qu'après l'épuisement du glucose. En effet, la présence du glucose réprime la transcription d'un gène nécessaire à la croissance sur acétate, le gène acs (codant pour l'acétyl-CoA synthétase). Le mécanisme régulateur fait intervenir le facteur de transcription Crp-AMPc et le système de transfert de phosphate (PTS), qui permet l'import du glucose. Plusieurs modèles décrivent en détail la cascade de réactions moléculaires à l'origine de cette " répression catabolique ". Cependant, certaines de nos observations expérimentales ne sont pas correctement prédites par les modèles actuels. Ces modèles doivent être révisés ou complétés. L'outil majeur que nous employons pour les expériences est la fusion transcriptionnelle : une région promotrice fusionnée en amont d'un gène rapporteur (GFP, luciferase). Avec ces constructions, nous mesurons la dynamique de l'expression génique dans différentes souches (mutants) et différentes conditions environnementales. Les observations à l'échelle de la population sont corroborées par des mesures similaires à l'échelle de la cellule unique. Nous utilisons cette même technologie pour construire de petits systèmes synthétiques qui sondent davantage le phénomène de répression catabolique. Nous avons ainsi créé un interrupteur génétique dont le fonctionnement est contrôlé par le flux glycolytique et nous avons construit un petit système de communication intercellulaire basé sur la molécule AMPc. Enfin, nous proposons une manière originale de mesurer l'état métabolique des cellules en utilisant la dépendance énergétique de la luciferase.

La biologie synthétique promet de révolutionner la façon dont les scientifiques manipulent et analysent les systèmes vivants. Dans ce projet, nous proposons de développer une nouvelle classe de réseaux de gènes synthétiques, basée sur la compétition entre la forme active et inactive d'un facteur de transcription synthétique. Afin de déterminer les paramètres moléculaires et les topologies requises pour une fonction voulue, nous utilisons une approche in silico évolutionnaire couplée à de la modélisation. Avec cette méthodologie, nous voulons construire des circuits à multiples entrées, ainsi que de nouveaux réseaux bistables et oscillatoires. Cette nouvelle classe de réseaux pourra par la suite être étendue à des réseaux multi-cellulaires montrant des motifs dissymétriques ou oscillatoires. Ce projet fondamental à l'interface entre la modélisation et la validation expérimentale permettra de promouvoir le développement de circuits avancés avec des applications prometteuses en diagnostique, en thérapie génique et en ingénierie tissulaire avancée
Synthetic biology, by its engineering approach, promise to revolutionize the way scientists manipulate and analyze living systems. In this project, we propose to develop a new class of synthetic gene circuits whose fine tuning rely on the affinity competition between active and inactive forms of a transcription factor. Modelling, together with an in silico evolutionary approach, will be used to determine molecular parameters and network topologies required for a given functionality. Circuits will be assembled accordingly and their expression in mammalian cells measured to confirm the expected response or correct our model. Using this methodology, we plan to build multi-inputs circuits with tunable response function, as well as new bistable and oscillatory circuits. The new investigated class of circuits will also be extended to multi-cellular networks exhibiting symmetry breaking or oscillating patterns. This fundamental project bridging modelling and experimental validation will promote the development of advanced targeting circuits with promising applications in diagnosis, gene therapy and complex tissue engineering

Le sujet de cette thèse concerne l'élaboration de systèmes vecteurs de transfert de gènes destinés à la thérapie génique. Une série de télomères et de cotélomères polycationiques a été synthétisé. Leur obtention se fait via des réactions de télomérisation et de cotélomérisation de télogènes (thiols) et de taxogènes polymérisables contenant la (les) fonction(s) ammonium(s). Ces composés possèdent un nombre variable de fonctions amines (primaires et /ou tertiaires) associés éventuellement à des fonctions polyols. Le design de ces molécules inclut également i) des chaînes lipidiques, ii) divers résidus contenant une fonction de faible pKa pouvant jouer le rôle de tampon, ou iii) un ligand galactose. Une série de lipopolyamines et lipopolyamidoamines a également été élaborée. Ces composés sont obtenus par couplage direct de polyamines et de polyamidoamines (de géométrie branchée et linéaire) sur un synthon lipidique dérivé de l'acide 2,3-diaminopropanoi͏̈que sur lequel sont greffées deux chaînes hydrocarbonées en C14. Le potentiel de tous ces composés (seuls ou coformulés avec le colipide DOPE) en tant qu'agents de condensation et de transfert de gènes a été évalué in vitro. Pour les séries de télomères et de cotélomères, les résultats sont très encourageants car certains téloplexes atteignent des niveaux de transfection comparables à ceux de la référence pcTG90/DOPE (1/1). Certains éléments structuraux favorisent la transfection sans induire de toxicité et le vecteur de transfert de gènes qui se dégage de cette étude est un télomère non lipidique. La présence de DOPE dans les formulations de lipopolyamines et de lipopolyamidoamines permet d'améliorer nettement leur efficacité de transfection, car les complexes formulés avec ces composés seuls sont inefficaces.

Le sujet de cette thèse concerne l'élaboration de vecteurs fonctionnels de transfert de gènes destinés à la thérapie génique de tumeurs.
Deux familles de vecteurs synthétiques fonctionnels ont été synthétisées afin d'améliorer d'une part la biodisponibilité des vecteurs dans les applications in vivo et d'autre part leur spécificité de ciblage des tissus tumoraux.
La première famille de composés est constituée de télomères et de cotélomères « furtifs » issus des réactions de (co)télomérisation. Le design des télomères est basé sur un squelette « diblock » composé d'une partie polyaminée de degré de télomérisation aléatoire et d'une partie hydrophile (polyéthylène glycol). Le design des cotélomères est basé sur un squelette aléatoire de motifs aminés et de structures hydrophiles (tétraéthylène glycol et trishydroxyméthyl). La deuxième famille de vecteurs synthétiques est issue de la synthèse de lipides et polymères cationiques conjugués à un ligand dérivé de l'antagoniste des récepteurs à chimiokines CXCR-4, l'AMD3100 ou bicyclame.
Le potentiel des (co)télomères « furtifs » en tant qu'agents de condensation et de transfert de gènes a été évalué in vitro sur des cellules de carcinome pulmonaire humain A549.
Le potentiel des conjugués ciblés lipidiques et polymériques à compacter l'ADN et à transfecter de manière spécifique des cellules par la voie récepteur médiée a été évalué à la fois sur des cellules n'exprimant pas le récepteur CXCR-4 (A549, T98G) et sur des cellules l'exprimant (Jurkat).
Certains des (co)télomères « furtifs » testés (PEG2000-[NH2]n) ont démontré des efficacités de transfection comparables à des formulations lipidiques de référence (pcTG90/DOPE) tout en étant moins toxiques. Parmi les conjugués ciblés, le cotélomère iBu-[NH]80-[AMD]4 s'est révélé être un agent de transfert de gènes spécifique sur les cellules Jurkat sous certaines conditions de formulations, par rapport aux lipides et polymères conventionnels.
Mots clés : thérapie génique, transfert de gènes, lipoplexes, polyplexes, polyéthylène glycol, biodisponibilité, AMD-3100, ciblage, transfection.
Discipline : Chimie.

Le sujet de cette thèse concerne l'élaboration de vecteurs fonctionnels de transfert de gènes destinés à la thérapie génique de tumeurs. Deux familles de vecteurs synthétiques fonctionnels ont été synthétisées afin d'améliorer d'une part la biodisponibilité des vecteurs dans les applications in vivo et d'autre part leur spécificité de ciblage des tissus tumoraux. La première famille de composés est constituée de télomères et de cotélomères " furtifs " issus des réactions de (co)télomérisation. Le design des télomères est basé sur un squelette " diblock " composé d'une partie polyaminée de degré de télomérisation aléatoire et d'une partie hydrophile (polyéthylène glycol). Le design des cotélomères est basé sur un squelette aléatoire de motifs aminés et de structures hydrophiles (tétraéthylène glycol et trishydroxyméthyl). La deuxième famille de vecteurs synthétiques est issue de la synthèse de lipides et polymères cationiques conjugués à un ligand dérivé de l'antagoniste des récepteurs à chimiokines CXCR-4, l'AMD3100 ou bicyclame. Le potentiel des (co)télomères " furtifs " en tant qu'agents de condensation et de transfert de gènes a été évalué in vitro sur des cellules de carcinome pulmonaire humain A549. Le potentiel des conjugués ciblés lipidiques et polymériques à compacter l'ADN et à transfecter de manière spécifique des cellules par la voie récepteur médiée a été évalué à la fois sur des cellules n'exprimant pas le récepteur CXCR-4 (A549, T98G) et sur des cellules l'exprimant (Jurkat). Certains des (co)télomères " furtifs " testés (PEG2000-[NH2]n) ont démontré des efficacités de transfection comparables à des formulations lipidiques de référence (pcTG90/DOPE) tout en étant moins toxiques. Parmi les conjugués ciblés, le cotélomère iBu-[NH]80-[AMD]4 s'est révélé être un agent de transfert de gènes spécifique sur les cellules Jurkat sous certaines conditions de formulations, par rapport aux lipides et polymères conventionnels
The aim of this thesis was the synthesis and the assessment of new functionals non viral gene delivery systems. Two groups of synthetic vectors were synthesised in order to improve the biodisponibility of non viral vectors and increase specific gene delivery into targeted cells. One group of vectors was based on diblock and random cotelomers combining hydrophilic neutral groups (polyethylene glycol, polyhydroxylated groups) with cationic ones. The other group consisted into polycationic lipids or polymers conjugated to AMD3100 which is a specific ligand of the CXCR4 receptor. These vectors were evaluated as non-specific and specific gene transfer agents on human CXCR4(-) cell lines and CXCR4(+) Jurkat cells. Among these new gene delivery systems, compounds PEG2000-[NH2]n which contains a mean number n of amine functions of 190 exhibited a significant transfection efficiency on A549 cell lines as compared with reference systems. With regard to targeted complexes, compound iBu-[NH2]80-[AMD]4 proved to be, under certain conditions, a specific gene delivery system on Jurkat cells

Pour que le transfert de gènes devienne une alternative thérapeutique, il faut développer des systèmes vecteurs fonctionnalisés. Cette thèse concerne l'élaboration de nanoparticules monomoléculaires en ADN et fonctionnalisées par un conjugué amphiphile-PEG-ligand, et l’évaluation, en tant qu’agents de transfert de gènes, d’une famille de cyclodextrines amphiphiles polyaminées choisies pour leur potentiel à former des édifices avec l’ADN et pour les possibilités de post-fonctionnalisation par ancrage d’éléments hydrophobes dans leur cavité. Les divers détergents cationiques dimérisables développés condensent l’ADN en nanoparticules de 50-80nm, monomoléculaires en ADN qui ont été fonctionnalisées par un conjugué PEG-folate. Les nanoparticules cationiques présentent une efficacité de transfection non spécifique supérieure à des polyplexes références. Par cytométrie de flux, nous avons montré que les nanoparticules [détergent]2/ADN/conjugué sont internalisées préférentiellement par des cellules KB(+) surexprimant les récepteurs folates. Toutefois la quantité de luciférase exprimée dans les cellules KB(-) et KB(+) est comparable dans les 2 types cellulaires. Ce système reste néanmoins très prometteur pour des applications in vivo. Notre étude sur les cyclodextrines a mis en évidence la nécessité pour ces dérivés de posséder un caractère amphiphile pour condenser l’ADN en nanoparticules stables (taille 50-75 nm). Elles présentent une efficacité de transfection et une viabilité cellulaire supérieures à celles de polyplexes références. Il est maintenant indispensable d’étudier les possibilités de multi-fonctionnalisation de ces nanoparticules offertes par les cyclodextrines
The elaboration of synthetic virus is a key step for gene transfer to become a clinical alternative. This thesis relates on the design of DNA monomolecular particles coated by an amphiphilic-PEG-ligand conjugate and the evaluation as gene transfer agents of amphiphilic polycationic cyclodextrins chosen for their potential to form nanostructures with DNA and for their easy post-decoration by inclusion of hydrophobic conjugate into their cavity. Our dimerisable cationic detergents condense plasmid DNA into a homogenous population of 50-80 nm particles, which are then successively coated by the amphiphilic-PEG-folate conjugate. The cationic nanoparticles transfect cells, in a non-specific manner, more efficiently than reference PEI polyplexes. The [detergent]2/DNA/conjugate system was shown to display by flux cytometry a specific folate-mediated internalization. Although the luciferase expression is similar in both cell types (KB(-) and KB(+)) this novel system presents promising properties for in vivo applications. Our study on the new cyclodextrins showed the necessity for these compounds to posses an amphiphilic character in order to condense DNA into stable particles (50 -75 nm size). They display a better transfection efficiency and cell viability than reference PEI polyplexes. It is now necessary to investigate the DNA nanoparticle’s multi-functionalization allowed by these cyclodextrins

L'utilisation de l'ADN comme moyen thérapeutique nécessite le développement de vecteurs capables de protéger, transporter et faciliter la pénétration des gènes dans les cellules cibles. Notre travail a consisté à développer de nouveaux vecteurs synthétiques capables de complexer l'ADN. Dans une première partie, nous avons synthétisé des lipides de type tétraéther du glycérol neutres et dicationiques analogues de lipides membranaires d'archaebactéries et nous avons déterminé leurs propriétés physico-chimiques ainsi que leur auto-organisation au sein des membranes liposomiales. Ces différents vecteurs ont ensuite fait l'objet de tests de transfection afin d'étudier leur potentiel de transfection in vitro (sur deux lignées cellulaires) et in vivo. Dans la dernière partie de ce travail, nous avons synthétisé de nouveaux analogues de ces lipides incorporant une structure triantennée, constituée de trois unités lactose ou mannose, comme agent de ciblage.

Le développement de techniques à haut débit fournit de nombreuses données sur le fonctionnement de réseaux de régulation. Il devient donc de plus en plus important de développer des techniques qui permettent de déduire la topologie et le fonctionnement des réseaux de régulation à partir des données expérimentales. La plupart des études dans ce domaine se focalisent sur la reconstruction de l'architecture locale du réseau de régulation et la détermination des paramètres qui relient les composants du réseau. Cependant, les réseaux biologiques ne sont jamais entièrement connus. L'absence d'un noeud important dans le réseau de régulation peut facilement conduire à de mauvaises prédictions de la structure du réseau ou des paramètres d'interactions. Dans cette thèse, nous proposons une méthode qui permet d'inférer l'existence, le profile d'expression et la connexion au reste du réseau d'un gène (ou de gènes) manquant. Pour résoudre ce problème difficile, nous devons simplifier la description du réseau de régulation. Nous faisons l'hypothèse communément acceptée que les interactions dans le réseau sont décrites par des fonctions de Hill. Nous approximons ces fonctions trop compliquées par des fonctions de puissance et nous montrons que cette simplification préserve la dynamique du réseau. En prenant le logarithme du système d'équations nous convertissons le système non-linéaire en un système linéaire. De nombreux outils sont disponibles pour analyser des systèmes linéaires. Nous utilisons l'analyse factorielle (FA) et l'analyse de composants indépendants (ICA) pour extraire le profil d'expression du gène inconnu à partir des profils d'expression des parties connues du réseau de régulation. Après avoir estimé le pattern d'expression du gène inconnu, nous explorons les différentes possibilités de connecter ce gène au reste du réseau. Une recherche exhaustive est trop coûteuse pour des grands réseaux de régulation. Nos proposons donc un algorithme de réduction de l'espace de recherche pour diminuer le nombre de calculs nécessaires. L'algorithme proposé est robuste au bruit expérimental et le profil d'expression du gène inconnu est retrouvé avec une probabilité de 80% dans des réseaux de petite taille et avec une probabilité de 60% pour des grands réseaux. FA est plus efficace que ICA pour extraire le profile du gène inconnu. L'algorithme est finalement appliqué à un réseau biologique réel: le réseau de régulation de la transcription du gène acs d'Escherichia coli. Nous prédisons qu'il y a un gène manquant dans ce réseau et les deux méthodes d'extraction du signal trouvent un profil d'expression très similaire pour le gène inconnu. De plus, ce profil d'expression est identique dans trois contextes expérimentaux différents : la souche sauvage, la souche dont l'adénylate cyclase a été délété et cette même souche complémentée par des l'AMPc ajouté au milieu de croissance. Puisque le profil d'expression du gène inconnu reste le mŘme dans les trois souches nous pouvons conclure que ce gène est indépendant de l'AMPc. Les deux méthodes d'extraction du profil d'expression prédisent deux structures différentes du réseau complet. FA prédit que le gène manquant contrôle l'expression de fis, tandis que ICA prédit que le gène inconnu contrôle d'expression de crp.

Le développement de techniques à haut débit fournit de nombreuses données sur le fonctionnement de réseaux de régulation. Il devient donc de plus en plus important de développer des techniques qui permettent de déduire la topologie et le fonctionnement des réseaux de régulation à partir des données expérimentales. La plupart des études dans ce domaine se focalisent sur la reconstruction de l'architecture locale du réseau de régulation et la détermination des paramètres qui relient les composants du réseau. Cependant, les réseaux biologiques ne sont jamais entièrement connus. L'absence d'un noeud important dans le réseau de régulation peut facilement conduire à de mauvaises prédictions de la structure du réseau ou des paramètres d'interactions. Dans cette thèse, nous proposons une méthode qui permet d'inférer l'existence, le profile d'expression et la connexion au reste du réseau d'un gène (ou de gènes) manquant. Pour résoudre ce problème difficile, nous devons simplifier la description du réseau de régulation. Nous faisons l'hypothèse communément acceptée que les interactions dans le réseau sont décrites par des fonctions de Hill. Nous approximons ces fonctions trop compliquées par des fonctions de puissance et nous montrons que cette simplification préserve la dynamique du réseau. En prenant le logarithme du système d'équations nous convertissons le système non-linéaire en un système linéaire. De nombreux outils sont disponibles pour analyser des systèmes linéaires. Nous utilisons l'analyse factorielle (FA) et l'analyse de composants indépendants (ICA) pour extraire le profil d'expression du gène inconnu à partir des profils d'expression des parties connues du réseau de régulation. Après avoir estimé le pattern d'expression du gène inconnu, nous explorons les différentes possibilités de connecter ce gène au reste du réseau. Une recherche exhaustive est trop coûteuse pour des grands réseaux de régulation. Nos proposons donc un algorithme de réduction de l'espace de recherche pour diminuer le nombre de calculs nécessaires. L'algorithme proposé est robuste au bruit expérimental et le profil d'expression du gène inconnu est retrouvé avec une probabilité de 80% dans des réseaux de petite taille et avec une probabilité de 60% pour des grands réseaux. FA est plus efficace que ICA pour extraire le profile du gène inconnu. L'algorithme est finalement appliqué à un réseau biologique réel: le réseau de régulation de la transcription du gène acs d'Escherichia coli. Nous prédisons qu'il y a un gène manquant dans ce réseau et les deux méthodes d'extraction du signal trouvent un profil d'expression très similaire pour le gène inconnu. De plus, ce profil d'expression est identique dans trois contextes expérimentaux différents : la souche sauvage, la souche dont l'adénylate cyclase a été délété et cette même souche complémentée par des l'AMPc ajouté au milieu de croissance. Puisque le profil d'expression du gène inconnu reste le mŘme dans les trois souches nous pouvons conclure que ce gène est indépendant de l'AMPc. Les deux méthodes d'extraction du profil d'expression prédisent deux structures différentes du réseau complet. FA prédit que le gène manquant contrôle l'expression de fis, tandis que ICA prédit que le gène inconnu contrôle d'expression de crp
With the development of hight-throughput technologies, the investigation of the topologies and the functioning of genetic regulatory networks have become an important research topic in recent years. Most of the studies concentrate on reconstructing the local architecture of genetic regulatory networks and the determination of the corresponding interaction parameters. The preferred data sources are time series expression data. However, inevitably one or more important members of the regulatory network will remain unknown. The absence of important members of the genetic circuit leads to incorrectly inferred network topologies and control mechanisms. In this thesis we propose a method to infer the connection and expression pattern of these “missing genes”. In order to make the problem tractable, we have to make further simplifying assumptions. We assume that the interactions within the network are described by Hill-functions. We then approximate these functions by power-law functions. We show that this simplification still captures the dynamic regulatory behaviors of the network. The genetic control system can now be converted to linear model by using a logarithm transformation. In another word, we can analyze the genetic regulatory networks by linear approaches. In the logarithmic space, we propose a procedure for extracting the expression profile of a missing gene within the otherwise defined genetic regulatory network. The algorithm also determines the regulatory connections of this missing gene to the rest of the regulation network. The inference algorithm is based on Factor Analysis, a well-developed multivariate statistical analysis approach that is used to investigate unknown, underlying features of an ensemble of data, in our case the promoter activities and intracellular concentrations of the known genes. We also explore a second blind sources separation method, “Independent Component Analysis”, which is also commonly used to estimate hidden signals. Once the expression profile of the missing gene has been derived, we investigate possible connections of this gene to the remaining network by methods of search space reduction. The proposed method of inferring the expression profile of a missing gene and connecting it to a known network structure is applied to artificial genetic regulatory networks, as well as a real biologicial network studied in the laboratory: the acs regulatory network of Escherichia coli. In these applications we confirm that power-law functions are a good approximation of Hill-functions. Factor Analysis predicts the expression profiles of missing genes with a high accuracy of 80% in small artificial genetic regulatory networks. The accuracy of Factor Analysis of predicting the expression profiles of missing genes of large artificial genetic regulatory networks is 60%. In contrast, Independent Component Analysis is less powerful than Factor Analysis in extracting the expression profiles of missing components in small, as well as large, artificial genetic regulatory networks. Both Factor Analysis and Independent Component suggest that only one missing gene is sufficient to explain the observed expression profiles of Acs, Fis and Crp. The expression profiles of the missing genes in the △cya strain and in the △cya strain supplemented with cAMP estimated by Factor Analysis and Independent Component Analysis are very similar. Factor Analysis suggests that fis is regulated by the missing genes, while Independent Component Analysis suggests that crp is controlled by the missing gene

La grande majorité des essais cliniques de transfert de gènes in vivo utilise des vecteurs viraux. Si ces derniers sont efficaces, ils présentent des risques immunogènes, toxiques, voire mutagènes avérés. Les vecteurs synthétiques (non viraux), par leur grande modularité et leur faible toxicité représentent une alternative très prometteuse. Le principal frein à leur utilisation est leur manque d’efficacité. L’objectif majeur de ce travail de thèse a été de comprendre le mécanisme de transfert de gènes associé à différents complexes vecteurs synthétiques/ADN plasmidique, ce qui est indispensable pour une conception rationnelle de nouveaux vecteurs. Nous avons étudié, sur cellules en culture, le mécanisme de transfert de gènes associé à deux lipides cationiques ; le BGTC (bis(guanidinium)-tren-cholesterol) et la DOSP (DiOleylamine A-Succinyl-Paromomycine) qui sont connus pour être des vecteurs efficaces in vitro. Nous avons ainsi pu visualiser par microscopie électronique leurs voies d’entrée, leurs remaniements structuraux ainsi que leur échappement endosomal qui représente une étape clé du processus de transfert de gènes. L’identification non ambigüe des lipoplexes tout au long de leur trafic intracellulaire a été rendue possible grâce au marquage de l’ADN par des nanoparticules de silice dotées d’un cœur de maghémite (Fe2O3) dense aux électrons. Cette stratégie de marquage a également été appliquée à l’étude du mécanisme d’action d’un autre vecteur synthétique de type polymère, le copolymère à blocs non ionique P188 ou Lutrol. Contrairement à la plupart des vecteurs synthétiques, celui-ci présente une efficacité de transfection in vivo chez la souris par injection in situ pour le tissu musculaire ou en intra trachéale dans le poumon. En revanche, il est totalement inefficace in vitro. Nous avons montré que le Lutrol permet une augmentation de l’internalisation d’ADN par les cellules mais n’induit pas son échappement endosomal, ce qui expliquerait son absence d’efficacité in vitro. D’autres voies d’entrée sont alors à envisager in vivo pour comprendre son mécanisme d’action
The vast majority of clinical trials of gene transfer in vivo use viral vectors. Although they are effective, they induce immunogenic, toxic or mutagenic risks. Due to their high modularity and low toxicity, synthetic vectors (non viral), represent a promising alternative despite their lack of effectiveness. The major objective of this work was to understand the mechanism of gene transfer using two prototypic synthetic vectors, in the context of a rational design of new vectors. We studied on cultured cells, the mechanism of action of two cationic lipids; BGTC (bis(guanidinium)-tren-cholesterol) and DOSP (DiOleylamine A-Succinyl-Paromomycine) formulated with plasmid DNA (lipoplexes) which are in vitro efficient vectors. We have been able to visualize by electron microscopy, their intracellular pathways, their structural alterations and their endosomal escape, the latter being a key step in the process of gene transfer. The unambiguous identification of lipoplexes throughout their intracellular trafficking has been made possible thanks to the labelling of DNA by core-shell silica nanoparticles with an electron dense maghemite core (Fe2O3). The labeling strategy has also been applied to study the mechanism of action of a nonionic block copolymer (P188 or Lutrol). Interestingly, these synthetic vectors have an in vivo transfection efficiency in mice lung and muscle tissue while they are totally inefficient in vitro. We have shown that Lutrol induces an increase of DNA internalization into cells and fails to trigger endosomal escape, which would explain the lack of in vitro efficacy. These findings suggest that the in vivo mechanism of action of Lutrol would involve other internalization pathways

L’inférence des réseaux de régulation de gènes reste un challenge majeur en biologie des systèmes malgré de nombreux efforts. Aujourd’hui, grâce aux données multi-omiques en cellules uniques, aux modèles dynamiques et stochastiques de la régulation génétique, et à la puissance de calcul disponible, de nouvelles approches telles que WASABI permettront de surmonter toutes les difficultés de ce défi.