Dissertationen zum Thema „Réplication d'ADN“

Les cellules souches embryonnaires (ES) et induites à la pluripotence (iPS) portent de grands espoirs pour la médecine régénératrice du fait de leur capacité d’auto-renouvellement et de différenciation. Une question cruciale est de savoir comment ces cellules mettent en place et maintiennent l’épigénome pluripotent. Les cellules ES et iPS ont un cycle cellulaire particulier, avec un temps de doublement rapide, une phase G1 courte et une phase S représentant 60-70% du cycle cellulaire. Au cours de ce projet, nous avons essayé de voir si les chromosomes dans les cellules ES murines et humaines étaient répliqués de façon particulière qui aiderait à maintenir l’état pluripotent.Les chromosomes mammifères sont dupliqués grâce au recrutement de ~20000 origines de réplication qui sont organisés dans des clusters. Ces clusters forment des foyers de réplication qui sont régulés dans le temps pendant la phase S et dans l’espace nucléaire. Certains de ces domaines topologiques changent leur timing de réplication pendant la différenciation ou la reprogrammation. Néanmoins les mécanismes exacts impliqués dans ce processus et leurs conséquences sur l’expression génique ne sont pas connus.Nous avons étudié la dynamique de réplication dans des cellules pluripotentes murines et humaines à l’échelle de molécules individuelles par la technique de peignage moléculaire de l’ADN. Nous avons comparé les vitesses de fourches, les distances inter-origines et la densité de fourches dans des cellules différenciées (MEF) et pluripotentes (mES), ainsi que pendant la différenciation de ces dernières. Les vitesses de fourches de réplication sont légèrement moins élevées dans les cellules souches embryonnaires que dans les fibroblastes (1.8 vs 2.0 kb/min), et les distances inter-origines intra-cluster sont équivalentes. Par contre, la densité globale instantanée de fourches est divisée par deux dans les cellules ES (1 fourche/Mb) par rapport aux fibroblastes. Un résultat similaire est retrouvé dans les cellules souches embryonnaires humaines (H9) comparées aux fibroblastes (BJ).Afin de tester si cette densité de fourches basse est compensée par un allongement de la phase S, nous avons développé une technique basée sur deux marquages aux analogues de la thymidine. Elle permet une mesure de la durée de la phase S sur des populations asynchrones de cellules. Nous avons trouvé que la phase S a la même durée dans les cellules mES et MEF (~8.4h). Une question intéressante est donc comment les cellules ES peuvent répliquer la même quantité de l’ADN, dans la même durée mais en utilisant deux fois moins de fourches ? Nous proposons que la plus faible densité instantanée en origines serait compensée par une fréquence plus élevée de l’activation des foyers de réplication. Cette fréquence élevée pourrait participer au maintien de la structure épigénétique responsable de la pluripotence ou de l’auto-renouvellement
Embryonic stem (ES) and induced pluripotent stem (iPS) cells have a great potential for regenerative medicine due to their capacity to self-renew indefinitely and to generate multiple cell types, but the key question of how they establish and maintain a pluripotent epigenome is not resolved. Interestingly all ES and iPS cells display a peculiar cell cycle with rapid doubling time, very short G1, and S phase representing 60-70% of the total cell cycle. In this work we tried to see whether chromosomes in mouse and human ES cells are replicated in a special way that might be used to set up the pluripotency state or to define cell identity. Mammalian genomes are duplicated by the firing of ~20,000 replication origins, organized in ~3000 small clusters forming replication foci that are spatially and temporally regulated during S phase. It has been shown that many of these topologically-associated domains change their replication time upon cell differentiation or reprogramming, but the exact mechanisms involved remain poorly understood. Here we used DNA combing to compare fork velocity (FV), local inter-origin distances (IOD) and global instant fork density (GIFD) between pluripotent mouse ES cells and fibroblasts (MEF), as well as during the differentiation of mES cells into embryoid bodies (EB) and neural precursors. We found that FV is slightly reduced (1.8 vs 2.0 kb/min) and IOD basically unchanged in mES compared to MEF. In contrast GIFD, which represents the density of forks active at any moment during S phase, shows a strong reduction from 2 forks/Mb in MEF to 1 fork/Mb in mES cells. We found a similar drop in GIFD in human ES cells (H9) compared to fibroblasts (BJ). To test whether this lower fork density is compensated by an extension of S phase, we developed a dual pulse/chase protocol to measure S-phase length in asynchronous populations by FACS. Using this assay, we found that S-phase length is identical (~8.4 hr) in both mES and MEF cells, despite the GIFD drop in the former. This raises an interesting question: how can ES cells replicate the same amount of DNA, in the same time and with similar fork velocity, but using a 2-fold lower instant fork density? We propose that the lower GIFD (amplitude) is compensated by a higher frequency of replication foci activation, which is not detected by the GIFD pulse protocol. This higher frequency of replication foci activation could play a role in the establishment and/or maintenance of a chromatin structure permissive for pluripotency or self-renewal

Cette thèse étudie l'effet de deux processus cellulaires essentiels, la réplication et la transcription, sur la composition en nucléotides des séquences d'ADN. Ces mécanismes ont un fonctionnement asymétrique par rapport aux deux brins d'ADN, et ils ont comme conséquence une composition asymétrique dans les séquences.
Nous avons étudié la co-orientation entre réplication et transcription chez les procaryotes. Nous proposons une méthode pour l'étude des biais de composition qui découple ces deux sources d'asymétrie. Nous montrons que les biais associés à la réplication sont très variables, même entre espèces proches.

Nous avons ensuite analysé le patron de substitution dans les régions transcrites et autour des origines de réplication du génome humain, et notamment l'effet du contexte 5'-3'. Les biais de voisinage sont similaires pour l'asymétrie associée à la réplication et à la transcription. La variation des taux de substitutions en fonction du patron d'expression des gènes suggère qu'un biais de réparation asymétrique et contexte-dépendant pourrait être en jeu.

Enfin, nous avons proposé une méthode de calcul du patron de substitution dans des séquences à composition biaisée: les microsatellites. Nous avons démontré que les microsatellites transcrits sont sujets au mêmes processus asymétriques que les régions non-répétées.

Au cours de cette thèse , nous avons étudié le fonctionnement des topoisomérases de type II en utilisant un dispositif de micromanipulation de molécules uniques d'ADN. Les topoisomérases sont des enzyme responsables de la régulation de la topologie de l'ADN in vivo, en particulier lors de la réplication, la transcription et la condensation des chromosomes. Dans une première partie, nous introduisons le formalisme topologique nécessaire à la compréhension de la structure adoptée à grande échelle par la molécule d'ADN, puis nous présentons les techniques usuelles qui permettent d'étudier la topologie de ces molécules. Dans une seconde partie, nous présentons le dispositif de micromanipulation d'ADN que nous avons utilisé. Celui-ci, basé sur l'utilisation de pinces magnétiques, permet de sonder directement les propriétés élastiques en tension et en torsion d'une molécule unique d'ADN, mais aussi d'étudier la caténation ou le tressage de molécules d'ADN. Ainsi, il offre la possibilité d'étudier en temps réel l'activité d'enzymes appelées topoisomérases qui décatènent ou modifient l'état de super-enroulement de l'ADN. Dans la troisième partie, nous présentons les résultats que nous avons obtenus sur différentes enzymes de la classe des topoisomérases de type II. Nous montrons que les expériences de molécules unique permettent une étude très fine du cycle enzymatique des topoisomérases. Par ailleurs, nous mettons en évidence le fait que la topoisomérase 4 opère une reconnaissance de son substrat, basée sur l'angle entre segments dans un croisement d'ADN. Enfin, nous présentons des expériences qui visent à comprendre les propriétés thermodynamiques particulières de ces enzymes.

La molecule d'adn, constitutive du chromosome eucaryote, est organisee en boucles dont les bases sont ancrees dans un reseau proteique interne nomme scaffold. L'implication des sites d'attachement de la molecule d'adn au scaffold (=sar) dans les mecanismes de replication a ete etudiee dans deux regions distinctes du genome de la drosophile: la region 14b-15b du chromosome x, mesurant 800 kb, qui a ete clonee dans le laboratoire et dont l'organisation en boucles a ete determinee lors d'une etude anterieure, et l'unite des genes codant pour les arns ribosomiques. Dans une premiere etape, l'activite de replication autonome (=ars) de fragments de restriction representatifs de la region 14b-15b a ete testee par transformation heterologue de levure. 27 fragments manifestent une activite ars. 25 d'entre eux sont des sars. Il existe donc une correlation entre les deux types d'activites: une sous-classe de sars de drosophile est impliquee dans les mecanismes de replication extrachromosomique chez la levure. De plus, l'association au scaffold est conservee entre les deux especes: lors d'un test de re-association in vitro, 61% des sars testes sont capables de s'associer a des scaffolds de levure. Dans une deuxieme etape, l'existence d'une relation entre sites d'attachement, sequences ars dans la levure et origines de replication chromosomiques a ete abordee. Pour cela, l'organisation en boucles de l'unite repetee des genes ribosomiques a ete determinee. Trois sars ont ete identifies a l'interieur des trois espaceurs presents dans l'unite. Ils definissent trois boucles d'adn contenant la region codant pour l'arn 18s, une partie de la region codant pour l'arn 28s et une region entourant le site +1 de transcription, respectivement. Ces 3 sars de drosophile sont egalement capables de s'associer a des scaffolds de levure. Trois regions de l'unite sont impliquees dans les mecanismes de replication extrachromosomique chez la levure. Elles correspondent aux regions en interaction avec le scaffold. De plus, la technique d'electrophorese bidimensionnelle neutre/neutre a permis de localiser une origine de replication chromosomique dans un fragment d'adn couvrant deux des espaceurs. Ces resultats montrent donc qu'au moins dans un cas, une proximite topologique existe entre des sequences impliquees dans l'association de la molecule d'adn au scaffold, dans la replication extrachromosomique chez la levure et dans l'initiation de la replication chromosomique. Cela suggere une relation fonctionnelle etroite entre ces trois types de sequences

Les mitochondries sont des organelles semi-autonomes : leur biogenèse nécessite une contribution importante du génome nucléaire. Celui-ci code non seulement pour une très grande majorité des protéines de structure des mitochondries mais aussi pour l'ensemble des protéines nécessaires à la réplication et à l'expression de l'ADNmt. Ce manuscrit présente une étude en trois parties de la biogenèse mitochondriale : - durant l'ovogénèse chez Xenopus laevis une approche cytologique décrit la mise en place, l'évolution spatiale et l'activité de réplication de deux populations mitochondriales durant la croissance de l'ovocyte. Cette étude montre que la probabilité de réplication d'une mitochondrie dépend de sa localisation dans la cellule. - les chondrocytes articulaires sont les constituants cellulaires du cartilage. Les activités de réplication et de transcription du génome mitochondrial étudiées par hybridation moléculaire, montrent une forte augmentation lors de la mise en culture de ces cellules. L'analyse suggère la présence de contrôles transcriptionnels et post-transcriptionnels de la biogénèse mitochondriale. - la seule grande région non-codante de l'ADNmt contient l'origine de transcription du brin L et les origines de transcription et de réplication du brin H. Le clonage de l'ADNmt du lapin "Fauve de Bourgogne" et la séquence de sa région non-codante mettent en évidence une organisation originale de celle-ci. La présence de deux groupes de répétitions directes (20 pb et 153 pb) fait l'objet de remaniements séquentiels chez E. Coli et est responsable de l'hétéroplasmie rnitochondriale du lapin.

Les chromosomes sont organisés en plusieurs niveaux hiérarchiques de repliements de la chromatine. Cette organisation spatiale de la chromatine dans le noyau a été impliquée dans la régulation de nombreux processus cellulaires comme la réplication ou la transcription. En effet, différentes expériences suggèrent que la chromatine est organisée en boucles, dont les bases seraient maintenues attachées ensemble, formant une structure qui serait un soutien structurel de la chromatine.Mon projet de thèse a visé à identifier les séquences d'ADN constituant la base de ces boucles de la chromatine par hybridation sur puces. Notre étude a été réalisée sur des MEF asynchrones et synchronisées en G0/G1 afin d'établir la dynamique des MARs au cours du cycle cellulaire.Nos résultats montrent que les MARs constituent des grands domaines, qui sont associés de façon significative avec les domaines d'ADN liées à la Lamine B1 et les domaines tardifs du timing de réplication. L'analyse des MARs ayant été réalisée sur des MEFs synchronisées en G0, les domaines de timing seraient donc déjà définis en G0/G1. L'analyse de plusieurs marques des histones suggère que les MARs sont associées à la chromatine transcriptionnellement inactive. En parallèle, nous avons réalisé une analyse protéomique de la matrice. Celle-ci a permis de valider notre approche expérimentale mais nous a aussi donné l'opportunité de caractériser la matrice nucléaire d'un point de vue protéique.L'ensemble de nos résultats révèle que les séquences d'ADN liées à la matrice nucléaire constituent une zone de répression, tant au niveau transcriptionnel que réplicatif
Chromosomes are organised into several hierarchical levels of chromatin compaction. This spatial organization of chromatin in the nucleus has been involved in regulating many cellular processes such as DNA replication and transcription. Indeed, different experiments suggest that chromatin is organized in loops, whose bases are kept attached together, forming a structure, often called the nuclear matrix, acting as a structural support of the chromatin. My project was to identify the DNA sequences that belong to the bases of these chromatin loops. Matrix-attached regions (MARs) were mapped by hybridization on microarrays. This study was performed on asynchronous as well as G0/G1-phase synchronized MEFs to establish the dynamics of MARs during the cell cycle. MARs were found in megabase-sized domains, with sequences significantly related to previously-published Lamin B1 associated domains and replication timing domains. Since our analysis of MARs was performed on G0-synchronized MEFs, our data strongly suggest that the timing domains might already be defined in G0/G1. Analysis of several histone marks suggested that MARs were associated with transcriptionally-repressed chromatin. In parallel, we also performed a proteomic analysis of our matrix preparations, and found known "matrix-attached" proteins, thus validating our experimental approach, plus other components that permitted a better characterization of the nuclear matrix. Taken together, our results show that DNA sequences bound to the nuclear matrix constitute a repressive zone, at the transcription and replication levels

La réplication de l'ADN est régulée par l'emplacement et le moment de l'initiation de la réplication. Par conséquent, beaucoup d'efforts ont été investis dans l'identification et l'analyse des sites d'initiation de la réplication dans les cellules humaines. Cependant, la nature hétérogène de la cinétique de réplication eucaryote et la faible efficacité de l'utilisation du site d'initiation individuelle chez les métazoaires a rendu difficile la cartographie de l'emplacement et du moment de l'initiation de la réplication dans les cellules humaines. Une solution potentielle au problème de la cartographie de la réplication humaine est l'analyse dans les molécules uniques. Cependant, les approches actuelles ne fournissent pas le débit requis pour les expériences à l'échelle du génome humaine. Pour relever ce défi, nous avons développé la cartographie de réplication optique (Optical Replicaiton Mapping - ORM), une approche de molécule unique à haut débit pour cartographier l'ADN nouvellement répliqué, et l'avons utilisée pour cartographier les événements d'initiation précoce dans les cellules humaines. La nature de molécule unique de nos données, et une couverture totale de plus de 2000 fois du génome humain sur 27 millions de fibres d'une longueur moyenne d'environ 300 kb, nous permettent d'identifier les sites d'initiation et leur probabilité d’initiation avec une grande confiance. En particulier, pour la première fois, nous sommes en mesure de mesurer à l'échelle du génome humain l'efficacité absolue de l'initiation de la réplication. Nous constatons que la distribution de l'initiation de la réplication humaine est cohérente avec l'initiation inefficace et stochastique de complexes d'initiation potentiels distribués de manière hétérogène enrichis en chromatine accessible. En particulier, nous constatons que les sites d'initiation de la réplication humaine ne sont pas limités à des origines de réplication bien définies, mais sont plutôt répartis sur de larges zones d'initiation constituées de nombreux sites d'initiation. De plus, nous ne trouvons aucune corrélation des événements d'initiation entre les zones d'initiation voisines. Bien que la plupart des événements d'initiation précoce se produisent dans les régions à réplication précoce du génome, un nombre significatif se produit dans les régions tardives. Le fait que les sites d'initiation dans les régions tardive aient une certaine probabilité d’initiation au début de la phase S suggère que la principale différence entre les événements d'initiation dans les régions à réplication précoce et tardive est leur probabilité intrinsèque d’initiation, et n’est pas due à une différence qualitative dans leur distribution de temps d’initiation. De plus, la modélisation de la cinétique de réplication démontre que la mesure de l'efficacité d’initiation de la zone d'initiation au début de la phase S suffit pour prédire le temps d’initiation moyen de ces zones tout au long de la phase S, ce qui suggère en outre que les différences entre les temps d’initiation des zones d'initiation précoce et tardive sont quantitatives plutôt que qualitatives. Ces observations sont cohérentes avec les modèles stochastiques de la régulation de l'initiation et suggèrent que la régulation stochastique de la cinétique de réplication est une caractéristique fondamentale de la réplication chez eucaryotes, conservée de la levure à l'homme
DNA replication is regulated by the location and timing of replication initiation. Therefore, much effort has been invested in identifying and analyzing the sites of human replication initiation. However, the heterogeneous nature of eukaryotic replication kinetics and the low efficiency of individual initiation site utilization in metazoans has made mapping the location and timing of replication initiation in human cells difficult. A potential solution to the problem of human replication mapping is single-molecule analysis. However, current approaches do not provide the throughput required for genome-wide experiments. To address this challenge, we have developed Optical Replication Mapping (ORM), a high-throughput single-molecule approach to map newly replicated DNA and used it to map early initiation events in human cells. The single-molecule nature of our data, and a total of more than 2000-fold coverage of the human genome on 27 million fibers averaging ~300 kb in length, allow us to identify initiation sites and their firing probability with high confidence. In particular, for the first time, we are able to measure genome-wide the absolute efficiency of human replication initiation. We find that the distribution of human replication initiation is consistent with inefficient, stochastic initiation of heterogeneously distributed potential initiation complexes enriched in accessible chromatin. In particular, we find sites of human replication initiation are not confined to well-defined replication origins but are instead distributed across broad initiation zones consisting of many initiation sites. Furthermore, we find no correlation of initiation events between neighboring initiation zones. Although most early initiation events occur in early-replicating regions of the genome, a significant number occur in late replicating regions. The fact that initiation sites in typically late-replicating regions. The fact that initiation sites in typically late-replicating regions have some probability of firing in early S phase suggests that the major difference between initiation events in early and late replicating regions is their intrinsic probability of firing, as opposed to a qualitative difference in their firing-time distributions. Moreover, modeling of replication kinetics demonstrates that measuring the efficiency of initiation-zone firing in early S phase suffices to predict the average firing time of such initiation zones throughout S phase, further suggesting that the differences between the firing times of early and late initiation zones are quantitative, rather than qualitative. These observations are consistent with stochastic models of initiation-timing regulation and suggest that stochastic regulation of replication kinetics is a fundamental feature of eukaryotic replication, conserved from yeast to humans

La réplication de l'ADN est un processus cellulaire crucial, qui garantit que chaque division cellulaire aboutit à une duplication précise du génome, composé de plus de 6 milliards de paires de bases chez l'homme. Ce processus repose sur l'activation précise de milliers d'origines de réplication dans un ordre temporel défini, appelé programme Replication Timing (RT). Ce programme est étroitement lié à l'organisation de la chromatine et sa dérégulation peut conduire à l'instabilité du génome, à des mutations et au développement des maladies telles que le cancer. Cependant, la nature hétérogène et stochastique de l'activation des origines dans les cellules de mammifères pose des défis importants à notre compréhension de l'initiation de la réplication de l'ADN chez l'homme. L'organisation de la chromatine et la RT sont intimement liées à la fonction du génome. La protéine RIF1, conservée au cours de l'évolution, joue un rôle clé dans le contrôle de ces processus. Bien que l'importance de RIF1 dans la régulation de la chronologie de la réplication de l'ADN et de l'organisation de la chromatine soit bien étudiée, la question de savoir si RIF1 affecte la localisation et l'efficacité des sites d'initiation de la réplication n'a pas été élucidée. Dans ce travail, pour étudier l'impact détaillé de RIF1 sur l'initiation et la dynamique des origines de réplication, nous avons appliqué la cartographie optique de la réplication (ORM) - une approche à haut débit et à molécule unique récemment développée par notre équipe, qui combine la détection fluorescente des origines actives marquées in vivo sur de longues molécules d'ADN individuelles et leur cartographie optique sur le génome en utilisant la technologie Bionano Genomics. Nos résultats obtenus à partir de cellules HCT116 en phase S précoce comblent ce manque de recherche en démontrant que la déplétion de RIF1 entraîne un changement radical dans la localisation des origines et l'efficacité des tirs, montrant un tir plus homogène à travers le génome, et remettant en question les hypothèses antérieures sur la spécificité et l'efficacité des origines de réplication. Notamment, notre approche ORM améliorée a permis la découverte d'un grand nombre de nouvelles origines activées lors de la déplétion de RIF1, ainsi qu'une caractérisation détaillée des schémas de modification des histones associés. Nos résultats révèlent également les différences dans l'initiation des origines par rapport aux nouveaux états de la chromatine : nous avons observé que l'absence de RIF1 n'avait pas d'impact uniforme sur tous les états de la chromatine. Plus précisément, la déplétion de RIF1 augmente significativement l'initiation de la réplication dans le nouvel état B0, caractérisé par un enrichissement en H3K9me2 et H2A.Z et des préférences d'interactions neutres pour les compartiments A et B, et n'affecte que très peu l'hétérochromatine B4 qui se réplique tardivement. Pour avancer l'étude des régions de réplication tardive, nous avons amélioré la méthode ORM en améliorant l'efficacité du marquage, ce qui nous a permis de calculer un profil de directionnalité de la fourche de réplication (RFD) à haute résolution directement à partir des cellules asynchronisées. Les profils RFD ont révélé la dynamique d'initiation dans les régions tardives, y compris les sites fragiles communs (CFS), et ont confirmé l'activation d'origines de réplication tardives précédemment absentes.En combinant des approches multi-omiques et ORM, ce travail démontre pour la première fois que RIF1 ne modifie pas seulement la RT mais que son absence conduit également à l'activation de nouvelles origines, fournissant un support important pour comprendre davantage les mécanismes moléculaires gouvernant la réplication de l'ADN et l'organisation du génome
DNA replication is a crucial cellular process, ensuring that each cell division results in an accurate duplication of genome composed of > 6 billion base pairs in humans. This process relies on the precise activation of thousands of replication origins in a defined temporal order called Replication Timing (RT) program. This program is tightly linked to chromatin organization and its deregulation can lead to genome instability, mutations and development of diseases, such as cancer. However, heterogeneous and stochastic nature of origins activation in mammalian cells poses significant challenges to our understanding of DNA replication initiation in humans. Chromatin organization and RT are intricately linked to genome function, with theevolutionary conserved protein RIF1 playing a key role in controlling these processes. Although the importance of RIF1 in regulating the timing of DNA replication and the chromatin organization is well studied, whether RIF1 affects the location and efficiency of replication initiation sites remained unclear. In this work, to investigate the detailed impact of RIF1 on replication origins initiation and dynamics, we applied Optical Replication Mapping, (ORM) - a high-throughput, single-molecule approach recently developed by our team, that combines the fluorescent detection of in vivo labelled active origins over long individual DNA molecules and their optical mapping to the genome using Bionano Genomics technology. Our results obtained from early S-phase HCT116 cells addresses the research gap by demonstrating that RIF1 depletion let to a dramatic change in origin location and firing efficiency, showing a more homogeneous firing across the genome, and challenging previous assumptions about replication origin specificity and efficiency. Notably, our enhanced ORM approach enabled the discovery of large number of new origins activated upon the depletion of RIF1, alongside a detailed characterization of the associated histone modification patterns. Our results also uncover the differences in origins initiation in relation to the newly classified chromatin states: we observed that the absence of RIF1 did not uniformly impact all chromatin states. Specifically, RIF1 depletion significantly enhances the replication initiation in the newly characterized B0 state, characterized by enriched H3K9me2 and H2A.Z and neutral interaction preferences for A and B compartments, and minimally affects the late-replicating B4 heterochromatin. To advance the study of late replication regions, we have upgraded the ORM method by improving the labelling efficiency that allowed us to compute a high-resolution Replication Fork Directionality profile (RFD) directly from the asynchronized cells. RFD profiles revealed the initiation dynamics in late regions including Common Fragile Sites (CFSs) and confirmed that the activation of previously absent late replication origins. Through combination of multi-omics and ORM approaches, this work for the first time demonstrates that RIF1 not only alters RT but it's absence also leads to the activation of new origins, providing an important support for further dissecting the molecular mechanisms governing DNA replication and genome organization

Le facteur d'assemblage CAF-1 (Chromatin Assembly Factor 1, constitué des sous-unités p150, p60 et p48), m'a particulièrement intéressée pour déterminer (i) la régulation de sa fonction d'assemblage et (ii) son rôle dans le contrôle de la phase S du cycle cellulaire dans des cellules proliférantes. Le couplage unique entre l'assemblage en chromatine par CAF-1 et la synthèse d'ADN dépend d'un lien moléculaire entre la sous-unité p150 et PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen, facteur auxiliaire des ADN polymérases). Nous montrons que la phosphorylation de la p150 par la kinase réplicative Cdc7-Dbf4 et la capacité de la p150 à dimériser contrôle l’interaction p150-PCNA. La p150 interagit avec les protéines HP1 (Heterochromatine Protein 1) lors de la réplication. Notre étude montre que l’interaction p150-HP1 est critique pour la progression de la phase S. Cette réponse cellulaire peut soit être dûe à une gêne par encombrement stérique dans les régions d'hétérochromatine péricentrique lorsque les protéines HP1 ne peuvent être prises en charge par p150, soit dû à un rétrocontrôle arrêtant la réplication quand la remise en place des protéines HP1 est compromise.

La protéine PCNA est un facteur d'échafaudage polyvalent pour plus de cinquante protéines impliquées dans le métabolisme d'ADN, notamment dans la réplication et la réparation. Comment les échanges entre les partenaires de PCNA sont régulés est actuellement mal compris. Parmi ses partenaires, CDT1, p21 et PR-Set7/Set8 possèdent un motif d'interaction avec PCNA particulier, nommé « PIP degron », qui favorise leur protéolyse d'une manière dépendante de l'E3 ubiquitine ligase CRL4Cdt2. Après irradiation aux UV-C, le facteur d'initiation de la réplication CDT1 est rapidement détruit d'une manière dépendante de son PIP degron, mais le rôle de cette dégradation est inconnu. Dans cette étude, j'ai analysé la fonction du PIP degron de CDT1 et fourni des évidences expérimentales qui montrent que l'inhibition de la dégradation de Cdt1 par CRL4Cdt2 dans les cellules de mammifères compromet la relocalisation de l'ADN polymérase translesionnelle eta en foyers nucléaires induits par les irradiations UV-C. En élargissant cette étude à d'autres partenaires de PCNA, nous avons constaté que seuls les protéines qui contiennent un PIP degron, et pas un PIP box canonique comme celui de FEN1 et p15 (PAF), interfèrent avec la formation de foyers de pol eta. La mutagenèse du PIP degron de CDT1 a révélé qu'un résidu de thréonine conservé parmi les PIP degrons est essentiel pour l'inhibition de la formation des foyers de pol eta. Les résultats obtenus suggèrent que l'élimination de protéines contenant des PIP degrons par la voie CRL4Cdt2 régule le recrutement de pol eta au niveau des sites de dommages induits par les UV-C
The sliding clamp PCNA is a versatile scaffold for more than fifty proteins involved in DNA metabolism such as replication and repair. How the switch between PCNA partners is regulated is currently not fully understood. Among its partners, Cdt1, p21 and PR-Set7/Set8 contain a specialized PCNA-binding motif named « PIP degron » that promotes their proteolysis in a fashion dependent on the E3 ubiquitin ligase CRL4Cdt2. Upon UV-irradiation, the replication initiation factor Cdt1 is rapidly destroyed in a PIP degron-dependent manner but the role of this degradation is unknown. Here we have analyzed the function of Cdt1 PIP degron and we provide evidence that interference with CRL4Cdt2-mediated destruction of Cdt1 in mammalian cells compromises PCNA-dependent relocalisation of the DNA translesion polymerase eta into UV-induced nuclear foci. By extending this analysis to other PCNA partners, we found that only PIP degrons, as compared to canonical PCNA-binding motifs of Fen1 and p15(PAF), interfere with pol eta focus formation. Mutagenesis of Cdt1 PIP degron revealed that a threonine residue conserved in PIP degrons is critical for inhibition of pol eta focus formation. Our results suggest that removal of high-affinity PIP degron-containing proteins from PCNA by CRL4Cdt2 pathway regulates pol eta recruitment to sites of UV-damage

Cette thèse porte sur la mise en place et le développement d’une approche expérimentale pour l’étude de la dynamique spatio-temporelle de réseaux de réactions à base d’ADN. Nos résultats démontrent la capacité des réseaux d’ADN à se spatialiser sous la forme d’ondes progressives. Nous avons également pu obtenir des motifs stationnaires à base d’ADN et d’assemblages de billes. Ce travail contribue donc à la conception de motifs spatio-temporels de réactions chimiques et de matériaux par le biais de réseaux réactionnels biochimiques programmables. Nous apportons également de nouvelles données sur l’émergence d’ordre spatio-temporel à partir de processus de réaction-diffusion. De ce fait, cette étude contribue à une meilleure compréhension des principes fondamentaux qui régissent l’apparition d’une auto-organisation moléculaire dans un système chimique hors-équilibre. De plus, la combinaison de réseaux synthétiques d’ADN, du contrôle du coefficient de diffusion de plusieurs espèces d’ADN et de la micro-fluidique peut donner lieu à des motifs spatiaux stables, comme par exemple, les fameuses structures de Turing, ce qui tend à confirmer le rôle de celles-ci dans la morphogénèse
This PhD work is devoted to developing an experimental framework to investigate chemical spatiotemporal organization through mechanisms that could be at play during pattern formation in development. We introduce new tools to increase the versatility of DNA-based networks as pattern-forming systems. The emergence of organization in living systems is a longstanding fundamental question in biology. The two most influential ideas in developmental biology used to explain chemical pattern formation are Wolpert's positional information and Turing's reaction-diffusion self-organization. In the case of positional information, the pattern emerges from a pre-existing morphogen gradient across space that provides positional values as in a coordinate system. Whereas, the Turing mechanism relies on self-organization by driving a system of an initially homogeneous distribution of chemicals into an inhomogeneous pattern of concentration by a process that involves solely reaction and diffusion. Although numerical simulations and mathematical analysis corroborate the incredible potential of reaction-diffusion mechanisms to generate patterns, their experimental implementation is not trivial. And despite of the exceptional achievements in pattern formation with Belousov–Zhabotinsky systems, these are difficult to engineer, thus limiting their experimental implementation to few available mechanisms. In order to engineer reaction-diffusion systems that display spatiotemporal dynamics the following three key elements must be controlled: (i) the topology of the network (how reactions are linked to each other, i.e. in a positive or negative feedback manner), (ii) the reaction rates and (iii) the diffusion coefficients. Recently, using nucleic acids as a substrate to make programmable dynamic chemical systems together with the lessons from synthetic biology and DNA nanotechnology has appeared as an attractive approach due to the simplicity to control reaction rates and network topology by the sequence. Our experimental framework is based on the PEN-DNA toolbox, which involves DNA hybridization and enzymatic reactions that can be maintained out of equilibrium in a closed system for long periods of time. The programmability and biocompatibility of the PEN-DNA toolbox open new perspectives for the engineering of the reaction-diffusion chemical synthesis, in particular in two directions. Firstly, to study biologically-inspired pattern-forming mechanisms in simplified, yet relevant, experimental conditions. Secondly to build new materials that would self-build by a process inspired from embryo morphogenesis. We worked towards the goal of meeting the two requirements of Turing patterning, transferring chemical spatiotemporal behavior into material patterns, and imposing boundary conditions to spatiotemporal patterns. Therefore, the structure of this document is divided into four specific objectives resulting in four chapters. In chapter 1 we worked on testing a DNA-based reaction network with an inhibitor-activator topology. In chapter 2 we focused on developing a strategy to tune the diffusion coefficient of activator DNA strands. In chapter 3 we explored how chemical patterns determine the shape of a material. Finally, in chapter 4 we addressed the issue of controlling the geometry over a DNA-based reaction-diffusion system. Overall, we have expanded the number of available tools to study chemical and material pattern formation and advance towards Turing patterns with DNA

A l’heure actuelle, face à une menace de réémergence de la variole, les recherches se sont axées vers la sélection de molécules anti-poxvirus. Dans ce contexte, les travaux réalisés au cours de cette thèse décrivent la mise en place de la technologie de l’ARN interférence comme stratégie inhibitrice de la réplication des orthopoxvirus. Nous avons évalué l’activité antivirale de plusieurs petits ARN interférents (siRNA), ayant pour cible des transcrits de gènes codant des protéines essentielles à la réplication du virus de la vaccine (VACV). A la suite de cette sélection, trois siRNA ont été retenus : siD5R- 2, ciblant le gène codant la protéine nucléoside triphosphate D5 ; siB1R-2, dirigé contre le gène B1R codant la protéine kinase B1 ; et siG7L-1, dirigé contre le gène G7L codant une protéine clé, G7, de la morphogenèse virale. Une inhibition significative de plus de 90% de la réplication virale des virus VACV, du cowpox (CPXV) et du monkeypox (MPXV), dans différentes lignées cellulaires, a été observée avec chacun de ces siRNA. Nous avons démontré que cette action antivirale est spécifique : les siRNA n’induisent pas l’activation du système interféron, et ils diminuent uniquement l’expression du transcrit ciblé (D5R, B1R ou G7L), comme démontré par RT-PCR en temps réel. De plus, le pouvoir antiviral de ces siRNA, administrés par différentes voies, a été évalué in vivo dans un modèle souris d’infection intra-nasale avec le CPXV ou le VACV. Le cidofovir (Vistide®) reste la molécule de première intention recommandée en cas de réémergence de la variole. Nous avons ainsi démontré pour la première fois qu’une association du cidofovir avec chacun des trois siRNA sélectionnés avait un effet synergique contre la propagation du VACV in vitro. De plus, l’activité antivirale des trois siRNA a étéévaluée contre cinq souches du VACV connues pour être résistantes au cidofovir, et à l’un de ses dérivés diaminopurique, HPMPDAP, du fait de la présence de mutations dans le gène codant l’ADN polymérase virale (E9L). Enfin, nous avons développé un siRNA en tant qu’outil expérimental afin d’étudier le mécanisme d’action de la molécule anti-orthopoxvirus, ST-246. Un siRNA, siF13L, dirigé contre la protéine virale F13, cible de ST-246, nous a permis de confirmer que l’activité antivirale de la molécule ST-246 était dépendante du mode de propagation de l’orthopoxvirus ciblé. Ces travaux démontrent l’efficacité des siRNA contre la réplication virale des orthopoxvirus in vitro et suggèrent de poursuivre leur développement in vivo en tant qu’outil thérapeutique ou prophylactique pour traiter les infections par poxvirus
The potential release of the etiological agent of smallpox, Variola virus, by bioterrorists, has prompted renewed interest in the development of new therapeutic molecules that inhibit poxvirus replication. Here we report the use of the RNA interference technology as a sequence-specific inhibitory approach against orthopoxvirus replication in vitro and in vivo. We have assessed the antiviral activities of several siRNAs targeting different genes that are essential for viral replication of vaccinia virus (VACV). Three siRNAs have been selected : siD5R-2, siB1R-2 and siG7L-1 designed to target, respectively, the D5R gene encoding the DNA-independant nucleoside triphosphatase, the essential viral gene B1R (i. E. , protein kinase) and the G7L gene encoding the protein G7 involved in virus morphogenesis. Each siRNA led to a significant decrease of VACV, cowpox virus (CPXV) and monkeypox virus (MPXV) replication (i. E. , up to 90%) in different cell lines. Our results have also demonstrated the specificity of the antiviral effect of each siRNA: they only knocked down the transcripts of the targeted genes, as shown by real time RT-PCR, and they did not induce any interferon response. Moreover, the antiviral potencies of these three siRNAs, following several routes of administration (i. E. , intranasal, intratracheal, intravenous or topical), have been investigated in vivo in a mouse model of orthopoxvirus infection. To date, cidofovir (Vistide®) is permitted for use as an emergency treatment in the case of smallpox outbreak. Thus, for the first time, we demonstrated the synergistic effect of cidofovir combined with each siRNA against VACV growth in cell culture. Moreover, we evaluated the antiviral potencies of these siRNAs against five vaccinia virus strains bearing mutations in the viral DNA polymerase gene (E9L), which are know to confer resistance to cidofovir and to one of its derivative, HPMPDAP. We finally developed a siRNA as an experimental tool to investigate the mechanism of action of the novel anti-orthopoxvirus compound ST-246. A siRNA (siF13L) designed to silence the F13L gene encoding the viral F13 protein, target of ST-246, confirmed our previous hypothesis: orthopoxviruses exhibit different levels of sensitivity to ST-246 due to their way of propagation. Our findings demonstrate the anti-orthopoxvirus potency of siRNAs and suggest to pursue their development in vivo as therapeutics for the treatment of poxvirus infections

Ce travail de thèse a porté sur l’étude d’activités enzymatiques virales impliquées dans la réplication de deux genres viraux : les Flavivirus et les Coronavirus. Dans un premier temps, nous avons étudié des activités enzymatiques impliquées dans la formation de la structure coiffe des ARNm viraux. En effet, du fait de leur cycle réplicatif cytoplasmique, ces virus n’ont pas accès à la machinerie de formation de la coiffe cellulaire et expriment donc une machinerie dédiée. Le processus canonique de formation de la coiffe fait appel à quatre activités enzymatiques, une ARN 5’-triphosphatase, une guanylyltransférase et deux méthyltransférases.Chez les flavivirus, nous avons développé des outils permettant d’identifier l’activité guanylyltransférase ainsi que des essais enzymatiques nécessaires à la caractérisation des activités méthyltransférases. Ces outils nous ont notamment permis d’évaluer l’effet inhibiteur de molécules choisies par des méthodes de criblages virtuels sur les deux activités méthyltransférases de la protéine NS5 nécessaires à la formation de la coiffe.Chez les coronavirus, nous nous sommes intéressés à une activité méthyltransférase impliquée dans la formation de la coiffe et notamment à sa régulation par un partenaire viral. Nous avons démontré que le processus de méthylation de la coiffe suit un ordre obligatoire, initié par la méthylation de la position N7 par la protéine nsp14. Dans une seconde étape, les structures coiffe-0 (7MeGpppA) sont converties en coiffe-1 (7MeGpppA2’OMe) par la protéine nsp16 en complexe avec nsp10. Nous avons démontré que l’activité 2’O-méthyltransférase portée par la protéine nsp16 nécessite une interaction spécifique avec la protéine nsp10 qui joue probablement un rôle d’échafaudage.Dans un second temps, nous avons démontré que l’activité exoribonucléase portée par la protéine nsp14 est également régulée par la protéine nsp10. La stimulation de l’activité passe par une interaction directe entre les deux protéines et il semble que les surfaces d’interaction de nsp10 avec nsp14 et nsp16 soient chevauchantes. Enfin, la caractérisation de l’activité exoribonucléase confirme la possibilité de son implication dans un mécanisme de réparation des erreurs incorporées lors de la synthèse d’ARN par la polymérase virale
This work focused on enzymatic activities of two RNA virus genera, Flavivirus and Coronavirus.We first studied the mRNA cap synthesis machinery of these viruses. Indeed, as they replicate in the cytoplasm of the infected cell, these viruses encode their own mRNA cap-forming enzymes. The canonical mechanism of cap synthesis uses four enzymatic activities, a RNA 5’-triphosphatase, a guanylyltransferase and two methyltransferases.We tried to identify the guanylyltransferase activity involved in this process for flaviviruses and we developed enzymatic assays to characterize both guanylyltransferase and methyltransferase activities. We used the methyltransferase assay in order to test the inhibitor effect of molecules, selected by virtual screening, on the methyltransferase activities of the NS5 protein involved in the capping process.Concerning coronaviruses, we first focused on the methyltransferase activities of the nsp14 and nsp16 proteins. We have reconstituted the complete SARS-CoV mRNA cap methylation in vitro. We showed that mRNA cap methylation requires a third viral protein, nsp10, which acts as an essential trigger to complete RNA cap-1 formation. The obligate sequence of methylation events is initiated by nsp14, which first methylates capped RNA transcripts to generate cap-0 7MeGpppA-RNAs. The latter are then selectively 2′O-methylated by the 2′O-methyltransferase nsp16 in complex with its activator nsp10 to give rise to cap-1 7MeGpppA2′OMe-RNAs. Then, we took interest in the exoribonuclease activity of the nsp14 protein and found that this activity is also regulated by the same cofactor, the nsp10 protein. The interaction between the proteins is required to observe the stimulatory effect and it seems that the surface areas of nsp10 interacting with nsp14 and nsp16 overlap. The in vitro characterization of the nuclease activity of nsp14 is according with its potential implication in RNA proofreading mechanism

Les mitochondries sont impliquées dans de nombreuses voies métaboliques, et des mutations au sein de leur génome (ADNmt) conduisent à l’apparition de nombreuses pathologies. A l’heure actuelle, il n’existe aucun traitement contre ces affections mais différentes pistes thérapeutiques sont envisagées. L’objectif de ce travail a consisté en la mise au point d’une telle stratégie, dite anti-réplicative via l’exploitation de la voie d’import naturelle des ARN dans les mitochondries. De petits ARN artificiels importables dans les mitochondries humaines ont ainsi été utilisés comme vecteurs pour y importer une séquence capable de s’hybrider spécifiquement à l’ADNmt mutant et d’en stopper sa réplication. Les résultats obtenus ont permis de prouver la validité de cette stratégie vis-à-vis d’une large délétion et de mutations ponctuelles liées à divers cas pathologiques et de caractériser l’effet de modifications chimiques sur la stabilité, l’import et l’efficacité de ces ARN recombinants
Mitochondria are involved in many metabolic pathways, and mutations in their genome (mtDNA) can cause a wide range of human disorders. No efficient treatment against these pathologies is currently available. The objective of this work consisted in the development of a therapeutic approach, called anti-replicative, based on the use of the natural pathway of RNA import into mitochondria. Small artificial RNA molecules able to be imported into human mitochondria have been used as vectors to address oligoribonucleotides capable to hybridize specifically to mutant mtDNA and to stop its replication. The effect of various chemical modifications on the stability, import and efficiency of these recombinant RNA has been characterized. All the data obtained prove the validity of the anti-replicative strategy for mtDNA containing a large deletion or pathogenic point mutations and can be considered as an important step to further develop an efficient therapy of mitochondrial diseases

Depuis une décennie, GBF1 a émergé comme étant un facteur cellulaire essentiel à la réplication de plusieurs virus à ARN de polarité positive (ARN(+)), issus de différentes familles. GBF1 est un facteur d’échange nucléotidique de petites protéines G de la famille Arf, connu pour son action régulatrice des étapes précoces de la voie de sécrétion. En étudiant le virus de l’hépatite C (VHC) comme virus modèle, nous avons montré que le rôle de GBF1 dans la réplication virale est distinct de sa fonction régulatrice de la voie de sécrétion. En effet,GBF1 participe à la réplication du VHC par l’intermédiaire de la paire Arf4 et Arf5, alors que c’est la paire Arf1et Arf4 qui est impliquée dans la voie sécrétion. Pour déterminer si ce mécanisme d’action est conservé parmi les virus à ARN(+), nous avons d’abord montré que GBF1 est impliquée dans l’infection par le virus de la fièvre jaune (YFV), le virus sindbis (SINV), le coronavirus 229E humain (HCoV-229E) et le coxsackievirus B4(CVB4). Puis, nos résultats indiquent que les infections YFV, SINV et HCoV-229E dépendent, tout comme le VHC, des protéines Arf4 et Arf5. Toutefois, le YFV et le SINV utiliseraient également une autre paire d’Arf,Arf1 et Arf4, lors de leur cycle viral. Par ailleurs, l’infection par le coxsackievirus B4 (CVB4) est dépendante de GBF1 mais ne semble pas dépendre des protéines Arf. Bien que GBF1 soit un facteur crucial pour la réplication des virus ARN(+), son mécanisme d’action ne semble donc pas être conservé.La paire Arf4-Arf5 semble impliquée dans la réplication de plusieurs virus à ARN(+). Cependant, ces deux Arf ont été très peu étudiées, contrairement à la protéine Arf1. Nous faisons l’hypothèse que la paire Arf4-Arf5 agit en régulant une série d’effecteurs spécifiques qui sont importants pour la réplication virale. Nos résultats montrent que la déplétion simultanée de Arf4 et de Arf5 perturbe la morphologie de l’appareil de Golgi, qui devient condensé, et des gouttelettes lipidiques (GL), qui s’accumulent et grossissent en périphérie cellulaire.Toutefois, une analyse lipidomique de cellules déplétées de Arf4 et Arf5 montre une composition lipidique inchangée, ce qui suggère un effet sur la morphologie des GL et non pas sur le métabolisme des lipides. Une analyse transcriptomique nous a permis de mettre en évidence une série de protéines, dont l’expression est modulée, suite à la déplétion de Arf4 et Arf5. Nous avons évalué l’implication potentielle de certaines d’entre elles dans l’infection du VHC, mais aucune ne s’est révélée importante pour ce virus. En conclusion, nos résultats ont permis de mettre en évidence de nouvelles fonctions de GBF1, médiées par la paire de protéines Arf4 et Arf5. Arf4 et Arf5 sont impliquées dans la régulation de la morphologie de l’appareil de Golgi et des GL ainsi que dans la réplication de plusieurs virus à ARN(+). Il reste à évaluer si ces fonctions sont indépendantes les unes des autres ou liées entre elles et quels effecteurs spécifiques elles font intervenir
GBF1 has recently emerged as a cellular factor essential for the replication of single-stranded positive-sense RNA ((+)RNA) viruses from different families. GBF1 is a guanine-nucleotide exchange factor of small G proteins of the Arf family, known to regulate the early secretory pathway. By studying the hepatitis C virus (HCV) as a model, we have shown that the role of GBF1 in viral replication is distinct from its regulatoryfunction of the sercretory pathway. Indeed, GBF1 function in HCV replication is mediated by Arf4 and Arf5,whereas another pair, Arf1 and Arf4, mediates the regulation of the secretion. To determine if this mechanism ofaction is conserved among (+)RNA viruses, we showed that GBF1 is involved in yellow fever virus (YFV),sindbis virus (SINV), human coronavirus 229E (HCoV-229E) and coxsackievirus B4 (CVB4) infection. Our results indicate that YFV, SINV and HCoV-229E infections are Arf4 and Arf5 dependent, as we previouslyshowed for HCV. However, YFV and SINV would also use another Arf pair, Arf1 and Arf4, during their lifecycle. In addition, CVB4 infection depends on GBF1, but doesn’t seem to depend on any Arf. Although GBF1 is required for (+)RNA viruses replication, its mechanism of action appears not to be conserved.The Arf4-Arf5 pair appears to be involved in the replication of several (+)RNA viruses. However, these twoproteins have been poorly studied so far, contrary to Arf1. Our hypothesis is that the Arf4-Arf5 pair regulatesspecific effectors involved in viral replication. Our results indicate that Arf4 and Arf5 simultaneous depletionalters the morphology of the Golgi apparatus, which becomes condense, and of lipid droplets (LD), whichaccumulate and grow bigger at the cell periphery. However, a lipidomic analysis of Arf4 and Arf5 depleted cellsdisplayed an unaltered lipid composition, which suggests a morphologic impact on LD, rather than a disruptionof the lipid metabolism. A transcriptomic analysis identified proteins up- or down-regulated after Arf4 and Arf5 depletion. We assessed the function of some of these proteins in HCV replication, but none of them proved implicated.In conclusion, our results hightlighed new GBF1 functions, mediated by the pair Arf4-Arf5. Arf4 and Arf5 are involved in regulating the morphology of Golgi complex and of LDs, as well as the replication of (+) RNA viruses. It remains to assess if these functions are independent or related to each other, and which specific effectors they use