Dissertationen zum Thema „Reconnaissance spécifique protéine/ARN“

La famille des protéines THAP est caractérisée par la présence d'un motif protéique, le domaine THAP. Le domaine THAP de la protéine hTHAP1 défini un nouveau motif de coordination du zinc de type C2CH responsable de l'activité de liaison à l'ADN nécessaire pour la fonction de facteur de transcription de la protéine hTHAP1, plus particulièrement impliqué dans la régulation de la prolifération cellulaire. Le domaine THAP est caractérisé sur le plan structural par un repliement atypique présentant une coordination tétraédrique du zinc et une longue insertion entre les deux paires de ligand du zinc adoptant un repliement de type ßaß. Le mode de reconnaissance spécifique de l'ADN du domaine THAP a été élucidé par Résonance Magnétique Nucléaire. Ce domaine reconnaît la cible ADN consensus 5'-TXXGGGCA-3' en établissant des contacts bases spécifiques par l'intermédiaire de son extrémité N-terminale, son brin ß, la boucle L3 et la boucle L4. La résolution de structure du complexe THAP-ADN permet de comprendre comment le domaine THAP va reconnaître spécifiquement l'ADN, l'étape initiale permettant la régulation transcriptionnelle réalisée par hTHAP1. Récemment, des mutations sur le gène de hTHAP1 ont été génétiquement reliées à l'apparition d'une maladie neurodégénérative, la dystonie DYT6. Certaines de ces mutations perturbent la fonction du domaine THAP de hTHAP1 mettant ainsi en évidence que l'activité de liaison à l'ADN de hTHAP1 et la fonction de hTHAP1 sont cruciales pour le maintien de l'intégrité des voies neuronales motrices
The THAP protein family is characterized by the presence of a protein motif designed the THAP domain. The THAP domain of hTHAP1 defines a new C2CH zinc coordination motif responsive of the DNA binding essential for transcription factor function of the hTHAP1 protein implicated in cell proliferation regulation. On the structural frame, the THAP domain is characterized by an atypical fold including C2CH zinc coordination and the long insertion between the two zinc ligand pairs adopt a ßaß fold. Specific DNA binding mode has been structurally characterized using Nuclear Magnetic Resonance. This domain binds to 5'-TXXGGGCA-3' consensus DNA target establishing bases specific contacts using its N-terminal loop, its ß-sheet, its loop L3 and its loop L4. Solution structure of the THAP-DNA complex explain how the THAP domain binds specifically to DNA, the first step of the transcriptional regulation mediated by hTHAP1. Recently, mutations in hTHAP1 gene have been genetically linked to the development of dystonia DYT6, a neurodegenerative disease. Some of these mutations disrupt THAP domain of hTHAP1 function highlighting that the DNA binding activity of hTHAP1 and hTHAP1 function are essential to maintain motor neuronal ways

Au sein des Archaeplastida (eucaryotes photosynthétiques ayant acquis un chloroplaste suite à une endosymbiose avec une cyanobactérie ancestrale) les génomes chloroplastiques et mitochondriaux des algues vertes et des plantes terrestres sont régulés de manière post-transcriptionnelle, principalement par des protéines à solénoïde alpha codées dans le noyau. Ces facteurs nucléaires sont composés de motifs répétés dégénérés (protéines PPR et OPR, respectivement pentatricopeptide repeat et octatricopeptide repeats) interagissant de façon spécifique avec une partie de la séquence de leur ARN cible et forment de grandes familles de paralogues. Les protéines PPR sont très abondantes chez les plantes terrestres tandis que les OPR le sont chez les algues vertes. Ces expansions différentielles, en parallèle de l'évolution du métabolisme des ARN dans les organites pourraient refléter des adaptations génétiques préservant la phototrophie dans diverses conditions et niches écologiques. Chez les autres Archaeplastida (algues rouges et Glaucophytes) et chez les eucaryotes issus d'une endosymbiose avec une microalgue ancestrale comme les Diatomées, la régulation des génomes des organites reste peu explorée. Un premier objectif de ma thèse a été de décrire la diversité et la dynamique évolutive des protéines à solénoïde alpha connues ou candidates pour la régulation de l'expression du génome des organites et ce, dans l'ensemble des eucaryotes photosynthétiques. Pour les identifier, j'ai développé une approche combinant détection d'homologie lointaine de séquence et classification indépendante de la similarité entre séquences. J'ai validé cette approche en retrouvant et complétant les familles OPR et PPR connues chez les espèces modèles Chlamydomonas reinhardtii et Arabidopsis thaliana. J'ai montré que les expansions d'OPR étaient restreintes au sein des Chlorophytes et qu'en dehors des algues vertes et des plantes terrestres, les protéines à PPR et à OPR étaient peu nombreuses, suggérant que d'autres acteurs de la régulation de l'expression des génomes des organites restent à découvrir. J'ai également identifié plusieurs dizaines d'autres familles de protéines à solénoïde alpha adressées aux organites dans tous les protéomes étudiés, certaines aux fonctions encore inconnues et dont la caractérisation expérimentale dans des organismes modèles serait pertinente. Dans un second temps, j'ai utilisé des approches de dynamique moléculaire pour mieux comprendre l'affinité et la spécificité des liaisons entre les PPR et leurs ARN cibles. J'ai notamment étudié la dynamique des motifs répétés et la géométrie des sites de liaison des nucléotides en fonction de leur position dans la séquence des motifs PPR, y compris les effets du nombre de répétitions et de la présence ou non des domaines N- et C-terminaux, en plus de l'évolution de la conformation globale de la protéine. Nos résultats suggèrent le rôle de la flexibilité des protéines PPR, tant au niveau de la protéine que du motif dans la liaison à sa cible ARN et sa pertinence pour l'affinité et la spécificité de la reconnaissance des nucléotides
In Archaeplastida (photosynthetic eukaryotes that acquired a chloroplast following endosymbiosis with an ancestral cyanobacterium) the chloroplast and mitochondrial genomes of green algae and land plants are regulated post-transcriptionally, mainly by alpha-solenoid proteins encoded in the nucleus. These nuclear factors are composed of degenerate repeat motifs (PPR and OPR proteins, respectively pentatricopeptide repeat and octatricopeptide repeats) that interact specifically with part of their target RNA sequence and form large families of paralogs. PPR proteins are very abundant in terrestrial plants while OPRs are abundant in green algae. These differential expansions, in parallel with the evolution of RNA metabolism in organelles, may reflect genetic adaptations that preserve phototrophy under different conditions and ecological niches. In other Archaeplastids (red algae and Glaucophytes) and in eukaryotes that originate from endosymbiosis with an ancestral microalga such as the Diatoms, the regulation of organelle genomes remains poorly explored. A first objective of my thesis was to describe the diversity and evolutionary dynamics of known or candidate alpha-solenoid proteins for the regulation of organelle genome expression in all photosynthetic eukaryotes. To identify them, I developed an approach that combines distant sequence homology detection and sequence similarity independent classification. I validated this approach by finding and completing the known OPR and PPR families in the model species Chlamydomonas reinhardtii and Arabidopsis thaliana. I showed that OPR expansions were restricted within Chlorophytes and that outside of green algae and land plants, PPR and OPR proteins were few in number, suggesting that other players in the regulation of organelle genome expression remain to be discovered. I also identified several dozen other families of organelle-addressed alpha-solenoid proteins in all the proteomes studied, some of which have as yet unknown functions and whose experimental characterisation in model organisms would be relevant. In a second step, I used molecular dynamics approaches to better understand the affinity and specificity of binding between PPRs and their target RNAs. In particular, I studied the dynamics of the repeat motifs and the geometry of the nucleotide binding sites as a function of their position in the PPR motif sequence, including the effects of the number of repeats and the presence or absence of N- and C-terminal domains, in addition to the evolution of the overall conformation of the protein. Our results suggest the role of PPR protein flexibility, both at the protein and motif level, in binding to its RNA target and its relevance to the affinity and specificity of nucleotide recognition

Mis à part les liaisons hydrogène, d’autres interactions non covalentes participent dans les réseaux de reconnaissance ARN et ARN protéines. Parmi celles-ci, j’ai étudié les interactions oxygène-pi. Cette interaction prend la forme phosphate-pi dans les U turns et O4'-pi dans les motifs ARN-Z. Je propose une nouvelle classification des boucles de quatre nucléotides, décrivant les U turn et les Z turn à partir d’interactions oxygène-pi. De plus, les motifs "Z like" présents dans tous les ARN, sont aussi reconnus par certaines protéines immunologiques. Pour mieux comprendre les réseaux de reconnaissance biomoléculaire, nous avons examiné les interactions entre cations/anions et ARN. Nous avons trouvé de nombreuses erreurs dans les structures de la PDB et proposé des règles pour améliorer l'attribution d’espèces ioniques. Les résultats de cette thèse amélioreront notre connaissance des réseaux de reconnaissance biomoléculaire et aideront aux techniques de modélisation structurale des ARN
Together with hydrogen bonds, uncommon non-covalent interactions are fundamental for recognition networks in RNA and RNA-protein systems. Among them, I focused on oxygen-pi stacking. This interaction takes the form of phosphate-pi within U-turns and of ribose O4’-pi within “Z-RNA” motifs. In that respect, a novel classification of tetraloops is proposed, defining U-turns and Z-turns based on their oxygen-pi stacking properties. Further, “Z-like” motifs are found to pervade small and large RNAs, being also a recognition pattern for immunology-related proteins. To better understand biomolecular recognition networks, we reviewed the binding of metal ions and anions within RNA, finding many examples of ions misattribution in PDB structures. We propose rules to avoid attribution errors. The results of this thesis will improve our knowledge and understanding of biomolecular recognition networks, as well as assist structural determination and structural modelling techniques of RNA systems

De nombreux processus cellulaires reposent sur des interactions spécifiques entre les ARN et les protéines. Leur étude est fondamentale pour la compréhension des mécanismes intervenant dans le contrôle de l'expression des gènes. Nous avons ainsi étudié deux systèmes de régulation faisant intervenir ces phénomènes de reconnaissance entre ARN et protéines. L'endoribonucléase RegB du bactériophage t4 participe à la dégradation d'ARN messagers précoces. RegB clive spécifiquement les motifs ggag, entre le second g et le a. Tous les sites ne sont pas reconnus de façon équivalente. En outre, l'activité de RegB est stimulée en présence de la protéine ribosomique s1. Nous avons effectue des cinétiques enzymatiques, en présence de RegB, avec et sans s1, sur différents substrats. Nous avons mis en évidence que l'activité de RegB est influencée par la structure dans laquelle est implique le site ggag. L'analyse de certains de ces substrats par rmn, nous a permis de compléter cette étude. Nous avons montre que RegB reconnaît un motif particulier au sein des arn, dans lequel le ggag est implique dans une paire de bases, et au voisinage de deux boucles. Il est également apparu que s1 ne stimule pas de façon uniforme l'activité de RegB : s1 est également sensible a la structure et a la séquence des substrats. La protéine ribosomique l20, localisée à la surface de la sous-unité 50s du ribosome, intervient dans l'assemblage de cette sous-unité, en se liant avec l'arn 23s. L20 participe à la régulation de l'expression de différents gènes en se liant directement a l'arnm, en particulier un pseudonud. Nous avons entrepris d'identifier le mécanisme de fixation de l20 a l'arn. L'étude structurale de l20 par rmn, et la modélisation moléculaire qui a suivi, nous ont permis de montrer que l20 est constituée de deux domaines, et que la partie c-terminale est formée principalement de trois hélices.

La protéine SI est la plus grande des protéines du ribosome d' Escherichia coli. Cette protéine modulaire est composée de six répétitions d'un domaine conservé. SI joue un rôle essentiel dans le démarrage de la traduction en permettant l'initiation de la traduction des messagers procaryotes (gram négatif) dont la région Shine-Dalgamo (SD) est dégénérée ou absente. SI est aussi utilisée par plusieurs bactériophages. Entre autre, elle est capable d'accélérer l'activité de l'endoribonucle��ase RegB du bactériophage T4, dont la fonction est d'inactiver certains messagers du phage en les clivant au milieu de leur séquence SD. Il a été montré que les fonctions de SI, dans la traduction et dans l'activation de RegB, sont portées par la même région (fragment F345) et semblent correspondre au même mécanisme moléculaire. Cependant, son mode d'action reste inconnu. Notre objectif est donc d'étudier par RMN l'organisation de cette région de SI et d'analyser ses interactions avec différents ARN afin de proposer un mécanisme moléculaire. J'ai caractérisé par RMN les surfaces d'interactions entre les domaines 3, 4 et 5 au sein du fragment F345 ce qui m'a permis de proposer un modèle d'organisation de cette région. Les données trouvées dans la littérature associées aux résultats issus des études d'interactions de SI avec différents ARN ont permis de faire l'hypothèse que la fonction de SI ne serait pas simplement de reconnaître une région particulière de l'ARN. SI serait capable de se lier à n'importe quel ARN et d'induire une déformation favorisant l'interaction de la séquence avec un troisième partenaire (le ribosome dans le cadre de la traduction ou encore la ribonucléase RegB)
SI protein is the largest ribosomal protein of Escherichia coli. This modular protein is. Composed of six identical motifs. SI plays a key role in the translation initiation of prokaryote messengers when the Shine-Dalgamo sequence is degenerated or lacks. SI is used by several phages. This protein is able to accelerate the endoribonuclease RegB activity which function is to inactivate sorne of the phage messengers by cleaving them at the rniddle of their SD sequences. One SI region (F345) presents SI functions of translation and RegB activation, it corresponds to the same molecular mechanism but its role remains unknown. Our aim is to study, by NMR, the organisation of SI region and analyse the interactions with several RNA to suggest a molecular mechanism. 1 characterized, by NMR, interactions surfaces between domains 3, 4 and 5 in the F345 fragment, which allows us to suggest an organisation model of this region. Data found in the bibliography associated to the results of SI interaction studies with different RNA show that SI is able to bind any RNA and to induce a deformation that promotes the interaction with a third partner (Ribosome in the case of translation or RegB ribonuclease)

Certaines protéines régulatrices dites nucléo-cytoplasmique naviguent entre le noyau et le cytoplasme. En réponse à une perturbation de l'environnement de la cellule, ces protéines relocalisent massivement dans le noyau pour y activer des mécanismes permettant la survie cellulaire. Chez la levure S. pombe, 285 protéines présentent la particularité d'être nucléo-cytoplasmiques. Une étude exhaustive de certaines de ces protéines a été ici entreprise. L'objectif était d'identifier celles présentes chez S. cerevisiae qui sont vitales dans la réponse aux stress endommageant l'ADN. Parmi les protéines candidates, celles i) étant les plus conservées chez l'ensemble des organismes eucaryotes, ii) de fonction inconnue ou peu décrite et iii) dont la répartition nucléo-cytoplasmique change après stress ont été sélectionnées à l'aide d'un crible génétique mis au point chez S. cerevisiae. Douze protéines ont été identifiées comme relocalisant au noyau sous l'effet du stress radiatif ou métaux lourds. Parmi elles, la protéine Pat1 (YCR077C) décrite à ce jour comme un activateur de la dégradation cytoplasmique des ARNs messagers a été choisie et une étude plus approfondie de son activité entreprise. Par une approche TAP-tag couplée à une stratégie de protéomique de type shotgun, le réseau de partenaires protéiques de Pat1 a été établi en absence de stress et en condition de stress UV. La région potentiellement impliquée dans la localisation cellulaire de la protéine Pat1 est sujette à de multiples phosphorylations dont le degré augmente après stress UV. Enfin, les résultats sur les partenaires spécifiques de Pat1 identifiés par protéomique en condition de stress ont été corroborés par une analyse de sa relocalisation chez les différents mutants correspondants. L'ensemble de nos résultats mettent en exergue une nouvelle fonctionnalité pour la protéine Pat1 spécifiquement menée au noyau des cellules qu'il reste désormais à préciser
Some regulatory proteins called nucleo-cytoplasmic proteins, shuttle between the nucleus and the cytoplasm. Upon environmental stress, these proteins relocate massively to the nucleus where they activate pro-survival mechanisms. In the yeast S. pombe, 285 proteins are nucleo-cytoplasmic. An exhaustive study of some of these proteins was carried out herein. The goal was to identify the ones that are present in S. cerevisiae and vital in the DNA damage response. Among the candidate proteins, the ones i) that are the most conserved in the eukaryotic cells, ii) with unknown function or poorly characterized, and iii) whose nucleo-cytoplasmic repartition changes upon stress were selected by the use of a genetic screen monitored in S. cerevisiae. Twelve proteins were found to accumulate in the nucleus upon irradiating or heavy metal stresses. Pat1 (YCR077C) currently described as a cytosolic mRNA decay activator was chosen and a more complete investigation about its activity was undertaken. By the mean of a TAP-tag approach combined with a shotgun proteomic analysis, the Pat1 interaction network was established without any stress and after UV stress illumination. Pat1 exhibits a domain potentially involved in its relocation that is subjected to multiple phosphorylations whose state enhances after UV stress. Finally, the data about the specific partners of Pat1 identified by proteomic analysis in stress condition were confirmed by the study of Pat1 relocation in the corresponding deleted strains. Altogether, our data suggest a novel function for the Pat1 protein that needs to be further investigated

Terminaison de la transcription. Rho se fixe aux transcrits naissants au niveau d’un site Rut (Rhoutilization) libre à partir duquel il transloque le long de l’ARN (5’→3’) de façon ATP-dépendante pour rattraper le complexe d’élongation de la transcription et induire la dissociation de celui-ci. Il est généralement admis que les sites de fixation de Rho présentent une richesse en Cytosines et une pauvreté en Guanines, ainsi qu’une relative pauvreté en structures secondaires. Les études génomiques ou transcriptomiques n’ont pas dégagé d’éléments consensus ou de règles permettant de prédire les sites de terminaison Rho-dépendants. En combinant approches biochimiques et bioinformatiques, j’ai tenté de comprendre les mécanismes par lesquels Rho reconnait les transcrits.J’ai identifié un ensemble de déterminants de séquence qui, pris ensemble, possèdent un bon pouvoir prédictif et que j’ai utilisé pour construire le premier modèle computationnel capable de prédire la terminaison Rho-dépendante à l’échelle des génomes d’E. coli et Salmonella. J’ai caractérisé in vitro certains de ces terminateurs, en particulier dans les régions 5’UTR, avec l’espoir qu’ils soient impliqués dans des mécanismes de régulation conditionnelle. J’ai identifié des candidats dont l’activité pourrait être sous le contrôle de facteurs comme des petits ARN non codants (sRNA) ou latempérature. J’ai également développé une méthode fluorogénique pour détecter facilement la terminaison Rho-dépendante in vitro et ai commencé à adapter l’approche CLIP-seq à l’étude du transcriptome Rho-dépendant chez Salmonella. Collectivement, mes travaux offrent de nouveaux outils d’analyse et de prédiction de la terminaison Rho-dépendante, une meilleure cartographie des sites d’action de Rho chez E. coli et Salmonella, ainsi que de nouvelles pistes d’étude du rôle de Rhodans l’expression conditionnelle du génome
Transcripts at a free Rut (Rho-utilization) site from which Rho moves along the RNA in an ATP dependentfashion to catch up with and dissociate the transcription elongation complex. It is generally believed that the Rut sites are, respectively, rich and poor in Cytosines and Guanines as well as relatively poor in secondary structures. Studies at the genomic or transcriptomic scale have notrevealed any stronger consensus features or rules for predicting potential Rho-dependent termination sites. By combining biochemical and bioinformatics approaches, I have explored the mechanisms by which Rho recognizes transcripts to induce transcription termination. I have identified a complex set of sequence determinants which, taken together, have good predictive power and which I used to build the first computational model able to predict Rho-dependent termination at the scale of Escherichiacoli and Salmonella genomes. I have characterized in vitro some of these terminators, particularly in 5'UTRs, with the hope that they will be involved in conditional regulatory mechanisms. I have identified several candidates whose activity may be under the control of factors such as small non-coding RNAs(sRNA) or temperature. I have also developed a fluorogenic method to easily detect Rho-dependent termination in vitro and have begun to adapt the CLIP-seq approach to the study of the Rhodependent transcriptome in Salmonella. Collectively, my work offers new tools for the analysis and prediction of Rho-dependent termination, a better mapping of the sites of probable Rho action in E.coli and Salmonella, as well as several lines of investigation of the role of Rho in the conditional expression of bacterial genomes

L'IRES du VHC est organisé en une structure secondaire, complexe et hautement conservée, qui comprend quatre domaines distincts (I-IV). Cette organisation permet la liaison directe du facteur d'initiation eucaryote eIF3 et de la sous-unité 40S du ribosome. Le facteur d'initiation eucaryote eIF3 est un complexe de 13 protéines (~ 800 kDa). Certaines de ses sous-unités montrent une affinité pour l'ARN, et parmi elles deux possèdent des motifs de reconnaissance à l'ARN (MRR) : eIF3b (aa : 185-268) et eIF3g (aa : 239-317). Afin de déterminer l'implication de ces motifs dans l'interaction ARN-protéine, nous avons cloné les domaines contenant ces motifs MRR, ainsi que les protéines entières eIF3b et eIF3g. Nous avons ensuite étudié l'interaction de l'ARN et/ou domaines d'ARN avec le complexe eIF3 et/ou protéines ou domaines protéiques en utilisant la méthode de rétention sur filtre. Nous avons ainsi calculé les différentes constantes apparentes de dissociation entre : eIF3/IRES, eIF3b/IRES et MRR-eIF3b/IRES. Ces résultats montrent que la sous-unité eIF3b se lie directement au domaine III de l'IRES via son motif MRR situé dans le domaine N-terminal. Dans un deuxième temps, nous avons utilisé la spectroscopie RMN pour identifier précisément les acides aminés impliqués dans la reconnaissance de l'ARN viral. En utilisant différentes techniques telles que FBA, RMN et SAXS, il s'avère que le domaine IIId (30 nucléotides) représente le motif minimum impliqué dans l'interaction MRR-eIF3b/IRES. Enfin, la technique de SAXS a été mise à profit pour étudier la structure tridimensionnelle de l'IRES libre en solution.

Les aminoglycosides, des dérivés aminés de saccharides, interfèrent avec le mécanisme de synthèse des protéines chez les bactéries en se fixant au site de décodage de l'ARN de transfert aminoacylé (site A) situé en 3' de l'ARN ribosomique 16S. Au cours de ce travail de thèse, les structures de trois complexes entre des fragments d'ARN incorporant le site A et les aminoglycosides paromomycine, tobramycine et généticine, ont été résolues par cristallographie aux rayons X à 2,40-2,54 Å. L'analyse des structures montre que la reconnaissance et la fixation spécifiques des aminoglycosides au site A font intervenir de nombreuses liaisons hydrogène directes et pontées par des molécules d'eau. Dans ces structures, la partie néamine commune aux aminoglycosides (cycles I et II) s'intercale dans l'hélice de manière similaire : le cycle I (non plan) forme une pseudo paire de bases avec l'adénine 1408 ; la néamine oblige les adénines 1492 et 1493 à pointer hors de l'hélice. La comparaison des structures 3D de ces trois complexes offre des explications moléculaires aux différents résultats de biochimie et de microbiologie, ainsi qu'à certains phénomènes de résistances et de toxicités. Les conformations du site A et des aminoglycosides au sein de ces complexes sont similaires à celles du site A et de la paromomycine au sein de la sous-unité ribosomique 30S. Ainsi, la stratégie développée permet une description des interactions et des modes de fonctionnement des aminoglycosides proche du contexte naturel mais plus précise, essentielle à notre connaissance du système ARN/aminoglycoside. De ces résultats découlent des lignes directrices laissant envisager sous un jour nouveau la conception d'antibiotiques moins sujets aux résistances et moins toxiques.

Les ARN double brin (ARNdb) sont les molécules clés initiatrices du RNA silencing, à partir desquelles les différentes classes de petits ARN (sRNAs), conférant la séquence spécificité de ce mécanisme, vont être produit. Chez la plante modèle Arabidopsis thaliana, le clivage des divers ARNdb en sRNAs est opéré par quatre enzymes de type RNase III, nommées DCL1 à DCL4, dont l’activité peut être assistée par des protéines fixant l’ARNdb (DRBs). Au cours de cette thèse, j’ai pu caractériser la fonction d’une nouvelle DRB, DRB7.2. Les résultats obtenus m’ont permis de démontrer que cette protéine régule la production d’une classe particulière de sRNAs endogènes, les endoIR-siRNAs, en séquestrant spécifiquement leurs précurseurs ARNdb, inhibant ainsi leur clivage par les différents DCLs. En parallèle, j’ai également développé des outils moléculaires afin d’étudier le mode d’action du DCL le plus polyvalent chez les plantes, DCL4. La caractérisation détaillée de ces outils a permis de révéler le rôle clé de déterminant structuraux distinct (protéiques ou nucléiques) impliqués dans la spécificité de reconnaissance et de clivage des divers substrats ARNdb par cette enzyme
RNA silencing is initiated by double-stranded RNA (dsRNA) molecules that will be processed into various classes of small RNAs (sRNAs), which confer the sequence-specificity of this mechanism. In the model plant Arabidopsis thaliana, dsRNA processing is mediated by four distinct RNaseIII-like enzymes, named DCL1 to DCL4, which can be assisted by dsRNA-binding proteins (DRBs). During my PhD, I was able to characterize in details the function of a new DRB protein, DRB7.2. Our results revealed that this protein regulates the accumulation of a specific class of endogenous sRNAs, the endoIR-siRNAs, by selectively sequestering their dsRNA precursors and inhibiting their cleavage by the DCLs. In parallel, I also developed molecular tools to study the mode of action of the most versatile DCL in plants, DCL4. Detailed characterization of these tools revealed key roles of distinct structural determinants (at the protein or RNA level), implicated in the specificity and cleavage efficiency of the various dsRNA susbtrates by DCL4

Les caractéristiques structurales et les interactions intra et/ou intermoléculaires non-covalentes jouent un rôle primordial dans l'activité des molécules d'intérêt biologique, notamment lors de la reconnaissance moléculaire entre un médicament et son récepteur. Par ailleurs, on peut connaître par les études en phase gazeuse (sans les effets du solvant) les propriétés intrinsèques des systèmes moléculaires. Des calculs de chimie quantique élaborés peuvent ainsi être comparés aux résultats des expériences pour en tirer des informations précises. L'équipe AMIBES tente ainsi de décrire les structures de peptides, d'oligonucléotides ou de complexes d'intérêt pharmaceutiques. Pour cela, nous prenons appui sur deux techniques expérimentales complémentaires, la spectroscopie IRMPD et la spectrométrie de mobilité ionique, dont les résultats sont comparés avec des simulations. Dans ce travail de thèse, j'ai d'abord testé les prédictions d'une méthode QM/MM en ce qui concerne le calcul des spectres IR d'espèces d'intérêt biologique isolées. J'ai ensuite utilisé cette méthode pour simuler les spectres IR de brins de la protéine amyloïde β en phase gazeuse. Il ressort de ces études que leur structure secondaire varie selon l'état de protonation et le solvant dans lequel ils sont dissous: un solvant polaire favorise les structures globulaires, alors qu'une constante diélectrique plus basse permet de conserver une structure en hélice α. Je me suis également intéressé aux changements de structure induits par la complexation d'un antibiotique, la vancomycine, avec un modèle de son récepteur. En mode positif, le site de fixation de celui-ci est différent de celui révélé par la cristallographie, mais les interactions spécifiques responsables de la grande constante d'affinité en solution sont conservées dans le complexe déprotoné.

Le RNA silencing est un mécanisme de régulation génique qui contrôle de nombreux processus biologiques chez les eucaryotes. Il se caractérise par la production de petits ARNs en association avec des protéines Argonaute (AGO) dans un complexe effecteur de silencing nommé RISC (AGO-containing RNA-Induced Silencing Complex). Les partenaires des AGO présentent souvent un motif appelé AGO-HOOK, enrichi en répétitions WG/GW et très conservé chez les eucaryotes. Une approche informatique a permis d'identifier des protéines présentant de potentiels domaines AGO-HOOK chez Arabidopsis thaliana parmi lesquelles quatre appartiennent à une famille de protéines à motif de liaison à l’ARN de type RRM (pour RNA Recognition Motif), objet de cette thèse et que nous avons nommées RAHP (pour RRM and AGO-HOOK containing Proteins). Nos travaux ont permis de montrer que les gènes RAHPs sont exprimés et que les protéines correspondantes sont localisées dans le cytoplasme et le noyau. La nature AGO-HOOK des protéines RAHP a été validée par la mise en évidence d’une association préférentielle avec AGO1 in vivo. L’identification de lignées perte de fonction des gènes RAHPs et l’obtention de mutants multiples ont révélé des phénotypes développementaux tels qu’une altération du gravitropisme racinaire, une sénescence précoce des feuilles, un développement altéré des rosettes et une perte de rigidité de la tige. Une étude génétique indique que RAHP 2 et -4 agissent de façon redondante dans le contrôle de ces processus développementaux. L’importance des domaines RRM, mais pas des motifs AGO-HOOK, dans l’activité de ces protéines a été démontrée par complémentation fonctionnelle. L’étude approfondie du phénotype de rigidité de la tige révèle une perte d’accumulation de lignine chez le mutant rahp2/4. Une analyse RNA-seq a permis d’identifier des gènes candidats dont l’expression est augmentée dans le mutant rahp2/4 et qui appartiennent principalement aux catégories des gènes de défense et des gènes du catabolisme des polysaccharides. Ce travail ouvre des perspectives d’analyse quant à la fonction des protéines RAPH in vivo
RNA silencing is a conserved molecular mechanism which plays important roles in different biological processes. It is characterized by the production of small RNAs that associate with Argonaute (AGO) proteins forming the so-called RNA-Induced Silencing Complex (RISC). The AGO partners generally harbor a motif enriched in WG/GW repeats named AGO-HOOK. Such domains are highly conserved in eukaryotes and a bioinformatic approach allowed us to identify, in the Arabidopsis genome, about 40 encoded proteins containing a potential AGO-HOOK domain. Among these candidates, a family of four proteins contains also an RNA Recognition Motif (RRM) domain. Interestingly, these proteins have been recently identified in Arabidopsis messenger RNA proteome. My thesis work consisted in studying the function of these four proteins, called RAHP for RRM and AGO-HOOK containing Proteins. We have shown that RAHP genes are expressed and that the corresponding proteins are localized in the cytoplasm and nuclei. Biochemical analysis suggests that RAHP proteins could interact with AGO1 in vivo. The identification of knock-out lines and the production of multiple mutants (double, triple and quadruple) reveal a dominant and redundant role of RAHP2 and RAHP4 proteins in vivo. The mutants present pleiotropic defects affecting root gravitropism, leaf senescence, rosette development and stem rigidity. Mutations of RAHP domains reveal the importance of RRM but not the AGO-hook domain in the developmental function of these proteins. We focused our work on the study of the pendant stem phenotype showing that it correlates with modifications of the secondary cell wall and a loss of lignin. RNA-seq analysis performed on the stem identified several genes whose expression is up-regulated in the mutants and that belong to the defense and polysaccharide catabolism gene categories. This work opens perspectives regarding the function of RAHP proteins in Arabidopsis

Chez Escherichia coli, la glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase (GAPDH), qui est une enzyme clé du métabolisme du glucose est codée par le gène gapA. La transcription de ce gène est initiée au niveau de 4 promoteurs et majoritairement au niveau du promoteur gapA P1 en phase exponentielle de croissance. Nous avons montré qu'il a la particularité d'avoir une boîte -10 étendue, mais de nécessiter la présence d'une boîte -35 pour être efficace. La méthionine sulfoxyde réductase de type B (MsrB) est codée par le gène yeaA situé en amont et en sens opposé à gapA. Nous avons montré que des éléments de séquences inter-ORF régulent chacun des deux gènes soit dans le même sens, soit en sens opposé et nous avons obtenu des arguments en faveur d'une régulation traductionnelle de l'expression de la protéine MsrB par le petit ARN non codant RyhB. Nous avons développé l'approche puces à ADN pour tester l'effet de l'inactivation du transporteur EIIBCGlc sur le transcriptome d'E. Coli. Nous avons ainsi montré que l'expression de gènes permettant la formation de pores de plus grande taille dans la membrane externe et de flagelles favorisant la motilité de la bactérie était augmentée
In Escherichia coli, the glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) is a key enzyme for glucose metabolism and is encoded by the gapA gene. The transcription of this gene is initiated at 4 promoters and mainly at the gapA P1 promoter in the exponential phase of growth. We found that altought beeing a promoter of the -10 extended class, promoter P1 needs a -35 hexamer for activity. The E. Coli methionine sulfoxide reductase of the B type (MsrB) is encoded by the yeaA gene which is located upstream and in the opposite direction of gapA. We showed that elements of the gapA-yeaA inter-ORF sequence are involved in the regulation of the two genes, either activating both genes or having opposite effects on them and we obtained data in favor of a translation regulation by the small non-coding RNA RyhB of the MsrB protein expression. We developped a DNA macroarray approach to test for the effect of the inactivation of the EIIBCGlc protein on the E. Coli transcriptome. We showed that the expression of genes allowing formation of large pores in the external membrane and flagella were upregulated. We demonstrated the increased motility of the bacteria

L’infection virale compatible des plantes est une cause majeure des pertes de rendements des récoltes. Nousavons analysé, suite à une infection par les tobamovirus, les réponses de l’hôte au niveau de la régulation del’expression des gènes ainsi qu’au niveau des mécanismes moléculaires déterminant l'infection. Des plantesd'Arabidopsis infectées par le Virus de la mosaïque du colza (ORMV) ont été utilisées pour étudier leschangements d’expression des gènes induits par le virus. Conformément à l'expression d'un suppresseur desilencing par le virus, les forts changements de populations d’ARNs ne corrèlent pas d’une façon significativeavec les changements de taux d’ARNm cibles. En se concentrant sur les altérations des processusphysiologiques, deux gènes potentiellement impliqués dans les réponses à l'infection virale ont étéfonctionnellement caractérisés. Le premier gène code pour CIPK12. L’ARNm issu de ce gène montre uneaccumulation suite à une infection par ORMV. De plus, l'expression transitoire de CIPK12 dans des feuilles deN. benthamiana semble inhiber la propagation de l’ORMV dans cet hôte. La deuxième protéine étudiée dansce travail est CDC48B qui s'accumule suite à une infection tobamovirale et agit dans la maintenance desmembranes du réticulum endoplasmique (RE). De plus, CDC48B interagit avec la MP virale qui s’accumuledans des inclusions associées aux membranes du RE en vue d’améliorer son extraction des membranes et salocalisation au niveau des microtubules et dans le cytosol. Ainsi, deux protéines induites par l’infection viraleavec un potentiel d'interagir avec la MP virale et d'influer sur son activité lors de l'infection, sont décrites danscette thèse
Infection of crop plants with compatible viruses is a major cause of losses in harvest yield. Here, we analyzedhost responses to tobamovirus infection at the level of gene regulation and expression, and at the level ofmolecular mechanisms determining the outcome of infection. ORMV-infected Arabidopsis plants were used toaddress virus-induced changes in gene expression. Consistent with the expression of a silencing suppressor bythe virus, strong changes in sRNA populations in virus-infected plants are not significantly correlated withcorresponding changes in the levels of the corresponding mRNA targets. Focusing on altered physiologicalprocesses, two genes with potential involvement in responses to virus infection were functionallycharacterized. The first gene encodes CIPK12, a (CBL)-interacting protein kinase, involved in decodingcalcium signatures. The mRNA of this gene accumulates upon ORMV infection and further observationsprovide evidence indicating that the regulation of the CIPK12 mRNA level occurs at the post-transcriptionallevel. Transient expression of CIPK12 in N. benthamiana leaves appears to inhibit the cell-to-cell spread ofORMV in this host. The second protein addressed in this work is CDC48B. CDC48B accumulates upontobamoviral infection and functions in ER-membrane maintenance. Consistent with this function it interactswith virus-accumulated MP in ER-associated inclusions to promote its extraction form the membrane and itslocalization to the cytosol. Thus, in this thesis I describe two virus-induced proteins with potential to interactwith viral MP and to influence the subcellular localization of this protein during infection

Cette thèse a été réalisée dans le cadre d'un projet Européen plus vaste (ITN RNAct) dans lequel des approches informatiques et biologiques étaient combinées pour progresser vers la synthèse de nouveaux domaines protéiques capables de se fixer sur des séquences spécifiques d'ARN. L'objectif spécifique de cette thèse était de concevoir et développer des outils informatiques pour mieux exploiter les connaissances existantes sur les domaines à Motif de Reconnaissance de l'ARN (RRM) lors de la modélisation 3D des complexes RRM-ARN. Les domaines RRMs représentent 50% de toutes les protéines fixant l'ARN et sont trouvées dans environ 2% de toutes les régions codantes du génome humain. Cependant, du fait de la grande diversité des domaines RRMs, il n'y a eu jusqu'à présent que très peu de succès rapportés dans la conception de nouveaux domaines RRMs. La contribution centrale de cette thèse est la construction d'une base de données relationnelle appelée (InteR3M) qui intègre des informations de séquence, de structure et de fonction sur les domaines RRMs. La base de données InteR3M (href{https://inter3mdb.loria.fr/}{https://inter3mdb.loria.fr/}) contient 400,892 instances de domaines RRM (dérivées d'entrées UniProt) et 1,456 structures 3D déterminées expérimentalement (dérivées d'entrées PDB), qui correspondent à seulement 303 instances distinctes de domaines RRM. De plus, InteR3M contient 459,859 interactions atomiques entre RRM et acides nucléiques, dérivées de 656 structures 3D dans lesquelles le domaine RRM forme un complexe avec un ARN ou un ADN. Au cours du processus de collecte de données, des incohérences ont été détectées dans la classification de plusieurs instances de domaines RRMs dans les bases de données de domaines protéiques populaires CATH et Pfam. Ceci m'a conduit à proposer une approche originale (CroMaSt) pour résoudre ce problème, à partir de la mise en correspondance des instances structurales de domaines RRMs entre ces deux bases de données et de l'alignement structural des domaines sans correspondance avec une structure prototype du domaine RRM. Le workflow CroMast est disponible sur le Workflow Hub Européen (href{https://workflowhub.eu/workflows/390}{https://workflowhub.eu/workflows/390}). Les informations de séquence et de structure intégrées dans la base de données InteR3M ont ensuite été utilisées pour aligner entre eux tous les domaines RRM et cartographier toutes les interactions RRM-ARN sur cet alignement en vue d'identifier les différents modes de liaison de l'ARN aux domaines RRM. Ceci a conduit au développement, avec nos partenaires RNAct de VUB (Vrije Universiteit Brussel), de l'outil `RRMScorer'. Cet outil contribue au déchiffrage du code de reconnaissance RRM-ARN en calculant les probabilités de liaison entre les nucléotides de l'ARN et les acides aminés des domaines RRM à certaines positions de l'alignement. Les contacts atomiques entre RRMs et ARN ont aussi été utilisés pour identifier des motifs d'ancrage, c'est-à-dire des prototypes des positions 3D atomiques (relatives au squelette protéique) d'un nucléotide interagissant par empilement (`stacking') avec un acide aminé aromatique conservé. Ces ancres peuvent être utilisées comme des contraintes dans un protocole d'amarrage ancré (`anchored docking'). Le pipeline `RRM-RNA dock' est présenté ici et il intègre à la fois les motifs d'ancrage extraits de la base de données InteR3M et les scores de liaison de RRMScorer. Finalement, la simulation en dynamique moléculaire (MD) est un autre outil informatique testé dans cette thèse pour contribuer à la modélisation 3D des complexes RRM-ARN. Des protocoles MD préliminaires mais prometteurs sont décrits au titre d'essais visant à distinguer entre les complexes RRM-ARN à liaison forte ou faible
This thesis was carried out in the frame of a larger European project (ITN RNAct) in which computer science and biology approaches were combined to make progress towards the synthesis of new protein domains able to bind to specific RNA sequences. The specific goal of this thesis was to design and develop computational tools to better exploit existing knowledge on RNA Recognition Motif (RRM) domains using 3D modeling of RRM-RNA complexes. RRMs account for 50% of all RNA binding proteins and are present in about 2% of the protein-coding regions of the human genome. However, due to the large diversity of RRMs, there have been very few successful examples of new RRM design so far. A central achievement of this thesis is the construction of a relational database called `InteR3M' that integrates sequence, structural and functional information about RRM domains. InteR3M database (href{https://inter3mdb.loria.fr/}{https://inter3mdb.loria.fr/}) contains 400,892 RRM domain instances (derived from UniProt entries) and 1,456 experimentally solved 3D structure (derived from PDB entries) corresponding to only 303 distinct RRM instances. In addition, InteR3M stores 459,859 atom-atom interactions between RRM and nucleic acids, retrieved from 656 3D structures in which the RRM domain is complexed with RNA or DNA. During the data collection procedure, inconsistencies were detected in the classification of several RRM instances in the popular domain databases CATH and Pfam. This led me to propose an original approach (CroMaSt) to solve this issue, based on cross-mapping of structural instances of RRMs between these two domain databases and on the structural alignment of unmapped instances with an RRM structural prototype. The CroMaSt CWL workflow is available on the European Workflow hub at href{https://workflowhub.eu/workflows/390}{https://workflowhub.eu/workflows/390}. Sequence and structural information stored in InteR3M database was then used to align RRM domains and map all RRM-RNA interactions onto this alignment to identify the different binding modes of RNA to RRM domains. This led to the development, with RNAct partners at VUB (Vrije Universiteit Brussel), of the `RRMScorer' tool. This tool contributes to decipher the RRM-RNA code by computing binding probabilities between RNA nucleotides and RRM amino acids at certain positions of the alignment. Atomic contacts between RRMs and RNA were also used to identify anchoring patterns, i.e. prototypes of 3D atomic positions (relative to the protein backbone) of a nucleotide stacked on a conserved aromatic amino acid. These anchors can be used as constraints in anchored docking protocols. The `RRM-RNA dock' docking pipeline is presented here and integrates both anchoring patterns extracted from InteR3M and binding scores from RRMScorer. Finally, molecular dynamic (MD) simulation is another computational tool tested in this thesis to contribute to the 3D modeling of RRM-RNA complexes. Promising preliminary MD protocols are described as attempts to distinguish between strongly and weakly binding RRM-RNA complexes