Auswahl der wissenschaftlichen Literatur zum Thema „Reconnaissance spécifique protéine/ARN“

Alors que, pour la plupart, les médicaments actuels sont de petites molécules inhibant l’action d’une protéine en bloquant un site d’interaction, la dégradation ciblée des protéines, découverte il y a une vingtaine d’années via les petites molécules PROTAC, connaît aujourd’hui un très grand développement, aussi bien au niveau universitaire qu’industriel. Cette dégradation ciblée permet de contrôler la concentration intracellulaire d’une protéine spécifique comme peuvent le faire les techniques basées sur les acides nucléiques (oligonucléotides antisens, ARNsi, CRISPR-Cas9). Les molécules PROTAC sont des chimères hétéro-bifonctionnelles capables de lier simultanément une protéine spécifique devant être dégradée et une E3 ubiquitine ligase. Les PROTAC sont donc capables de provoquer l’ubiquitinylation de la protéine ciblée et sa dégradation par le protéasome 26S. De nature peptidique, puis non peptidique, les PROTAC sont maintenant administrables par voie orale. Ce détournement du système ubiquitine protéasome permet aux molécules PROTAC d’élargir considérablement le champ des applications thérapeutiques puisque l’élimination de protéines dépourvues de poches ou de crevasses bien définies, dites difficiles à cibler, devient possible. Cette technologie versatile a conduit à la dégradation d’une grande variété de protéines comme des facteurs de transcription, des sérine/thréonine/tyrosine kinases, des protéines de structure, des protéines cytosoliques, des lecteurs épigénétiques. Certaines ligases telles que VHL, MDM2, cereblon et IAP sont couramment utilisées pour être recrutées par les PROTAC. Actuellement, le nombre de ligases pouvant être utilisées ainsi que la nature des protéines dégradées sont en constante augmentation. Deux PROTAC sont en étude clinique pour les cancers du sein (ARV471) et de la prostate (ARV110). La dégradation spécifique d’une protéine par le protéasome peut aussi être induite par d’autres types de molécules synthétiques : colles moléculaires, marqueurs hydrophobes, HaloPROTAC, homo-PROTAC. D’autres constituants cellulaires sont aussi éligibles à une dégradation induite : ARN-PROTAC pour les protéines se liant à l’ARN et RIBOTAC pour la dégradation de l’ARN lui-même comme celui du SARS-CoV-2. Des dégradations induites en dehors du protéasome sont aussi connues : LYTAC, pour des chimères détournant la dégradation de protéines extracellulaires vers les lysosomes, et MADTAC, pour des chimères détournant la dégradation par macroautophagie. Plusieurs techniques, en particulier des plates-formes de criblage, la modélisation mathématique et la conception computationnelle sont utilisées pour le développement de nouveaux PROTAC efficaces.

RÉSUMÉLes fibroblastes diploïdes humains subissent un nombre limité de dédoublements de population in vitro et sont largement utilisés comme modèle de vieillissement cellulaire. Malgré l'évidence grandissante que le vieillissement cellulaire est dû à une modification de l'expression du gène, l'activité des facteurs de transcription des cellules âgées est encore mal connue. Ici, nous rapportons que la réduction dramatique de l'expression du facteur de transcription fos durant le vieillissement cellulaire semble due à l'incapacité d'un autre facteur de transcription, le facteur réponse de sérum (FRS), de se lier à son site de reconnaissance appelé élément de réponse du sérum (ERS). Ce site est situé en amont de plusieurs gènes comprenant le gène humain c-fos. À l'opposé, les activités des protéines liées à la boîte TATA de la polymérase ARN ainsi qu'à l'élément réponse AMPc sont conservées chez les fibroblastes humains vieillissants. Nous présentons l'évidence que l'hyperphosphorilation du FRS induit une baisse du pouvoir de liaison observée au cours des dernières divisions cellulaires comme ceci a été précédemment suggéré pour la protéine fos.

La famille des protéines THAP est caractérisée par la présence d'un motif protéique, le domaine THAP. Le domaine THAP de la protéine hTHAP1 défini un nouveau motif de coordination du zinc de type C2CH responsable de l'activité de liaison à l'ADN nécessaire pour la fonction de facteur de transcription de la protéine hTHAP1, plus particulièrement impliqué dans la régulation de la prolifération cellulaire. Le domaine THAP est caractérisé sur le plan structural par un repliement atypique présentant une coordination tétraédrique du zinc et une longue insertion entre les deux paires de ligand du zinc adoptant un repliement de type ßaß. Le mode de reconnaissance spécifique de l'ADN du domaine THAP a été élucidé par Résonance Magnétique Nucléaire. Ce domaine reconnaît la cible ADN consensus 5'-TXXGGGCA-3' en établissant des contacts bases spécifiques par l'intermédiaire de son extrémité N-terminale, son brin ß, la boucle L3 et la boucle L4. La résolution de structure du complexe THAP-ADN permet de comprendre comment le domaine THAP va reconnaître spécifiquement l'ADN, l'étape initiale permettant la régulation transcriptionnelle réalisée par hTHAP1. Récemment, des mutations sur le gène de hTHAP1 ont été génétiquement reliées à l'apparition d'une maladie neurodégénérative, la dystonie DYT6. Certaines de ces mutations perturbent la fonction du domaine THAP de hTHAP1 mettant ainsi en évidence que l'activité de liaison à l'ADN de hTHAP1 et la fonction de hTHAP1 sont cruciales pour le maintien de l'intégrité des voies neuronales motrices
The THAP protein family is characterized by the presence of a protein motif designed the THAP domain. The THAP domain of hTHAP1 defines a new C2CH zinc coordination motif responsive of the DNA binding essential for transcription factor function of the hTHAP1 protein implicated in cell proliferation regulation. On the structural frame, the THAP domain is characterized by an atypical fold including C2CH zinc coordination and the long insertion between the two zinc ligand pairs adopt a ßaß fold. Specific DNA binding mode has been structurally characterized using Nuclear Magnetic Resonance. This domain binds to 5'-TXXGGGCA-3' consensus DNA target establishing bases specific contacts using its N-terminal loop, its ß-sheet, its loop L3 and its loop L4. Solution structure of the THAP-DNA complex explain how the THAP domain binds specifically to DNA, the first step of the transcriptional regulation mediated by hTHAP1. Recently, mutations in hTHAP1 gene have been genetically linked to the development of dystonia DYT6, a neurodegenerative disease. Some of these mutations disrupt THAP domain of hTHAP1 function highlighting that the DNA binding activity of hTHAP1 and hTHAP1 function are essential to maintain motor neuronal ways

Au sein des Archaeplastida (eucaryotes photosynthétiques ayant acquis un chloroplaste suite à une endosymbiose avec une cyanobactérie ancestrale) les génomes chloroplastiques et mitochondriaux des algues vertes et des plantes terrestres sont régulés de manière post-transcriptionnelle, principalement par des protéines à solénoïde alpha codées dans le noyau. Ces facteurs nucléaires sont composés de motifs répétés dégénérés (protéines PPR et OPR, respectivement pentatricopeptide repeat et octatricopeptide repeats) interagissant de façon spécifique avec une partie de la séquence de leur ARN cible et forment de grandes familles de paralogues. Les protéines PPR sont très abondantes chez les plantes terrestres tandis que les OPR le sont chez les algues vertes. Ces expansions différentielles, en parallèle de l'évolution du métabolisme des ARN dans les organites pourraient refléter des adaptations génétiques préservant la phototrophie dans diverses conditions et niches écologiques. Chez les autres Archaeplastida (algues rouges et Glaucophytes) et chez les eucaryotes issus d'une endosymbiose avec une microalgue ancestrale comme les Diatomées, la régulation des génomes des organites reste peu explorée. Un premier objectif de ma thèse a été de décrire la diversité et la dynamique évolutive des protéines à solénoïde alpha connues ou candidates pour la régulation de l'expression du génome des organites et ce, dans l'ensemble des eucaryotes photosynthétiques. Pour les identifier, j'ai développé une approche combinant détection d'homologie lointaine de séquence et classification indépendante de la similarité entre séquences. J'ai validé cette approche en retrouvant et complétant les familles OPR et PPR connues chez les espèces modèles Chlamydomonas reinhardtii et Arabidopsis thaliana. J'ai montré que les expansions d'OPR étaient restreintes au sein des Chlorophytes et qu'en dehors des algues vertes et des plantes terrestres, les protéines à PPR et à OPR étaient peu nombreuses, suggérant que d'autres acteurs de la régulation de l'expression des génomes des organites restent à découvrir. J'ai également identifié plusieurs dizaines d'autres familles de protéines à solénoïde alpha adressées aux organites dans tous les protéomes étudiés, certaines aux fonctions encore inconnues et dont la caractérisation expérimentale dans des organismes modèles serait pertinente. Dans un second temps, j'ai utilisé des approches de dynamique moléculaire pour mieux comprendre l'affinité et la spécificité des liaisons entre les PPR et leurs ARN cibles. J'ai notamment étudié la dynamique des motifs répétés et la géométrie des sites de liaison des nucléotides en fonction de leur position dans la séquence des motifs PPR, y compris les effets du nombre de répétitions et de la présence ou non des domaines N- et C-terminaux, en plus de l'évolution de la conformation globale de la protéine. Nos résultats suggèrent le rôle de la flexibilité des protéines PPR, tant au niveau de la protéine que du motif dans la liaison à sa cible ARN et sa pertinence pour l'affinité et la spécificité de la reconnaissance des nucléotides
In Archaeplastida (photosynthetic eukaryotes that acquired a chloroplast following endosymbiosis with an ancestral cyanobacterium) the chloroplast and mitochondrial genomes of green algae and land plants are regulated post-transcriptionally, mainly by alpha-solenoid proteins encoded in the nucleus. These nuclear factors are composed of degenerate repeat motifs (PPR and OPR proteins, respectively pentatricopeptide repeat and octatricopeptide repeats) that interact specifically with part of their target RNA sequence and form large families of paralogs. PPR proteins are very abundant in terrestrial plants while OPRs are abundant in green algae. These differential expansions, in parallel with the evolution of RNA metabolism in organelles, may reflect genetic adaptations that preserve phototrophy under different conditions and ecological niches. In other Archaeplastids (red algae and Glaucophytes) and in eukaryotes that originate from endosymbiosis with an ancestral microalga such as the Diatoms, the regulation of organelle genomes remains poorly explored. A first objective of my thesis was to describe the diversity and evolutionary dynamics of known or candidate alpha-solenoid proteins for the regulation of organelle genome expression in all photosynthetic eukaryotes. To identify them, I developed an approach that combines distant sequence homology detection and sequence similarity independent classification. I validated this approach by finding and completing the known OPR and PPR families in the model species Chlamydomonas reinhardtii and Arabidopsis thaliana. I showed that OPR expansions were restricted within Chlorophytes and that outside of green algae and land plants, PPR and OPR proteins were few in number, suggesting that other players in the regulation of organelle genome expression remain to be discovered. I also identified several dozen other families of organelle-addressed alpha-solenoid proteins in all the proteomes studied, some of which have as yet unknown functions and whose experimental characterisation in model organisms would be relevant. In a second step, I used molecular dynamics approaches to better understand the affinity and specificity of binding between PPRs and their target RNAs. In particular, I studied the dynamics of the repeat motifs and the geometry of the nucleotide binding sites as a function of their position in the PPR motif sequence, including the effects of the number of repeats and the presence or absence of N- and C-terminal domains, in addition to the evolution of the overall conformation of the protein. Our results suggest the role of PPR protein flexibility, both at the protein and motif level, in binding to its RNA target and its relevance to the affinity and specificity of nucleotide recognition

Mis à part les liaisons hydrogène, d’autres interactions non covalentes participent dans les réseaux de reconnaissance ARN et ARN protéines. Parmi celles-ci, j’ai étudié les interactions oxygène-pi. Cette interaction prend la forme phosphate-pi dans les U turns et O4'-pi dans les motifs ARN-Z. Je propose une nouvelle classification des boucles de quatre nucléotides, décrivant les U turn et les Z turn à partir d’interactions oxygène-pi. De plus, les motifs "Z like" présents dans tous les ARN, sont aussi reconnus par certaines protéines immunologiques. Pour mieux comprendre les réseaux de reconnaissance biomoléculaire, nous avons examiné les interactions entre cations/anions et ARN. Nous avons trouvé de nombreuses erreurs dans les structures de la PDB et proposé des règles pour améliorer l'attribution d’espèces ioniques. Les résultats de cette thèse amélioreront notre connaissance des réseaux de reconnaissance biomoléculaire et aideront aux techniques de modélisation structurale des ARN
Together with hydrogen bonds, uncommon non-covalent interactions are fundamental for recognition networks in RNA and RNA-protein systems. Among them, I focused on oxygen-pi stacking. This interaction takes the form of phosphate-pi within U-turns and of ribose O4’-pi within “Z-RNA” motifs. In that respect, a novel classification of tetraloops is proposed, defining U-turns and Z-turns based on their oxygen-pi stacking properties. Further, “Z-like” motifs are found to pervade small and large RNAs, being also a recognition pattern for immunology-related proteins. To better understand biomolecular recognition networks, we reviewed the binding of metal ions and anions within RNA, finding many examples of ions misattribution in PDB structures. We propose rules to avoid attribution errors. The results of this thesis will improve our knowledge and understanding of biomolecular recognition networks, as well as assist structural determination and structural modelling techniques of RNA systems

De nombreux processus cellulaires reposent sur des interactions spécifiques entre les ARN et les protéines. Leur étude est fondamentale pour la compréhension des mécanismes intervenant dans le contrôle de l'expression des gènes. Nous avons ainsi étudié deux systèmes de régulation faisant intervenir ces phénomènes de reconnaissance entre ARN et protéines. L'endoribonucléase RegB du bactériophage t4 participe à la dégradation d'ARN messagers précoces. RegB clive spécifiquement les motifs ggag, entre le second g et le a. Tous les sites ne sont pas reconnus de façon équivalente. En outre, l'activité de RegB est stimulée en présence de la protéine ribosomique s1. Nous avons effectue des cinétiques enzymatiques, en présence de RegB, avec et sans s1, sur différents substrats. Nous avons mis en évidence que l'activité de RegB est influencée par la structure dans laquelle est implique le site ggag. L'analyse de certains de ces substrats par rmn, nous a permis de compléter cette étude. Nous avons montre que RegB reconnaît un motif particulier au sein des arn, dans lequel le ggag est implique dans une paire de bases, et au voisinage de deux boucles. Il est également apparu que s1 ne stimule pas de façon uniforme l'activité de RegB : s1 est également sensible a la structure et a la séquence des substrats. La protéine ribosomique l20, localisée à la surface de la sous-unité 50s du ribosome, intervient dans l'assemblage de cette sous-unité, en se liant avec l'arn 23s. L20 participe à la régulation de l'expression de différents gènes en se liant directement a l'arnm, en particulier un pseudonud. Nous avons entrepris d'identifier le mécanisme de fixation de l20 a l'arn. L'étude structurale de l20 par rmn, et la modélisation moléculaire qui a suivi, nous ont permis de montrer que l20 est constituée de deux domaines, et que la partie c-terminale est formée principalement de trois hélices.

La protéine SI est la plus grande des protéines du ribosome d' Escherichia coli. Cette protéine modulaire est composée de six répétitions d'un domaine conservé. SI joue un rôle essentiel dans le démarrage de la traduction en permettant l'initiation de la traduction des messagers procaryotes (gram négatif) dont la région Shine-Dalgamo (SD) est dégénérée ou absente. SI est aussi utilisée par plusieurs bactériophages. Entre autre, elle est capable d'accélérer l'activité de l'endoribonucle��ase RegB du bactériophage T4, dont la fonction est d'inactiver certains messagers du phage en les clivant au milieu de leur séquence SD. Il a été montré que les fonctions de SI, dans la traduction et dans l'activation de RegB, sont portées par la même région (fragment F345) et semblent correspondre au même mécanisme moléculaire. Cependant, son mode d'action reste inconnu. Notre objectif est donc d'étudier par RMN l'organisation de cette région de SI et d'analyser ses interactions avec différents ARN afin de proposer un mécanisme moléculaire. J'ai caractérisé par RMN les surfaces d'interactions entre les domaines 3, 4 et 5 au sein du fragment F345 ce qui m'a permis de proposer un modèle d'organisation de cette région. Les données trouvées dans la littérature associées aux résultats issus des études d'interactions de SI avec différents ARN ont permis de faire l'hypothèse que la fonction de SI ne serait pas simplement de reconnaître une région particulière de l'ARN. SI serait capable de se lier à n'importe quel ARN et d'induire une déformation favorisant l'interaction de la séquence avec un troisième partenaire (le ribosome dans le cadre de la traduction ou encore la ribonucléase RegB)
SI protein is the largest ribosomal protein of Escherichia coli. This modular protein is. Composed of six identical motifs. SI plays a key role in the translation initiation of prokaryote messengers when the Shine-Dalgamo sequence is degenerated or lacks. SI is used by several phages. This protein is able to accelerate the endoribonuclease RegB activity which function is to inactivate sorne of the phage messengers by cleaving them at the rniddle of their SD sequences. One SI region (F345) presents SI functions of translation and RegB activation, it corresponds to the same molecular mechanism but its role remains unknown. Our aim is to study, by NMR, the organisation of SI region and analyse the interactions with several RNA to suggest a molecular mechanism. 1 characterized, by NMR, interactions surfaces between domains 3, 4 and 5 in the F345 fragment, which allows us to suggest an organisation model of this region. Data found in the bibliography associated to the results of SI interaction studies with different RNA show that SI is able to bind any RNA and to induce a deformation that promotes the interaction with a third partner (Ribosome in the case of translation or RegB ribonuclease)

Certaines protéines régulatrices dites nucléo-cytoplasmique naviguent entre le noyau et le cytoplasme. En réponse à une perturbation de l'environnement de la cellule, ces protéines relocalisent massivement dans le noyau pour y activer des mécanismes permettant la survie cellulaire. Chez la levure S. pombe, 285 protéines présentent la particularité d'être nucléo-cytoplasmiques. Une étude exhaustive de certaines de ces protéines a été ici entreprise. L'objectif était d'identifier celles présentes chez S. cerevisiae qui sont vitales dans la réponse aux stress endommageant l'ADN. Parmi les protéines candidates, celles i) étant les plus conservées chez l'ensemble des organismes eucaryotes, ii) de fonction inconnue ou peu décrite et iii) dont la répartition nucléo-cytoplasmique change après stress ont été sélectionnées à l'aide d'un crible génétique mis au point chez S. cerevisiae. Douze protéines ont été identifiées comme relocalisant au noyau sous l'effet du stress radiatif ou métaux lourds. Parmi elles, la protéine Pat1 (YCR077C) décrite à ce jour comme un activateur de la dégradation cytoplasmique des ARNs messagers a été choisie et une étude plus approfondie de son activité entreprise. Par une approche TAP-tag couplée à une stratégie de protéomique de type shotgun, le réseau de partenaires protéiques de Pat1 a été établi en absence de stress et en condition de stress UV. La région potentiellement impliquée dans la localisation cellulaire de la protéine Pat1 est sujette à de multiples phosphorylations dont le degré augmente après stress UV. Enfin, les résultats sur les partenaires spécifiques de Pat1 identifiés par protéomique en condition de stress ont été corroborés par une analyse de sa relocalisation chez les différents mutants correspondants. L'ensemble de nos résultats mettent en exergue une nouvelle fonctionnalité pour la protéine Pat1 spécifiquement menée au noyau des cellules qu'il reste désormais à préciser
Some regulatory proteins called nucleo-cytoplasmic proteins, shuttle between the nucleus and the cytoplasm. Upon environmental stress, these proteins relocate massively to the nucleus where they activate pro-survival mechanisms. In the yeast S. pombe, 285 proteins are nucleo-cytoplasmic. An exhaustive study of some of these proteins was carried out herein. The goal was to identify the ones that are present in S. cerevisiae and vital in the DNA damage response. Among the candidate proteins, the ones i) that are the most conserved in the eukaryotic cells, ii) with unknown function or poorly characterized, and iii) whose nucleo-cytoplasmic repartition changes upon stress were selected by the use of a genetic screen monitored in S. cerevisiae. Twelve proteins were found to accumulate in the nucleus upon irradiating or heavy metal stresses. Pat1 (YCR077C) currently described as a cytosolic mRNA decay activator was chosen and a more complete investigation about its activity was undertaken. By the mean of a TAP-tag approach combined with a shotgun proteomic analysis, the Pat1 interaction network was established without any stress and after UV stress illumination. Pat1 exhibits a domain potentially involved in its relocation that is subjected to multiple phosphorylations whose state enhances after UV stress. Finally, the data about the specific partners of Pat1 identified by proteomic analysis in stress condition were confirmed by the study of Pat1 relocation in the corresponding deleted strains. Altogether, our data suggest a novel function for the Pat1 protein that needs to be further investigated

Terminaison de la transcription. Rho se fixe aux transcrits naissants au niveau d’un site Rut (Rhoutilization) libre à partir duquel il transloque le long de l’ARN (5’→3’) de façon ATP-dépendante pour rattraper le complexe d’élongation de la transcription et induire la dissociation de celui-ci. Il est généralement admis que les sites de fixation de Rho présentent une richesse en Cytosines et une pauvreté en Guanines, ainsi qu’une relative pauvreté en structures secondaires. Les études génomiques ou transcriptomiques n’ont pas dégagé d’éléments consensus ou de règles permettant de prédire les sites de terminaison Rho-dépendants. En combinant approches biochimiques et bioinformatiques, j’ai tenté de comprendre les mécanismes par lesquels Rho reconnait les transcrits.J’ai identifié un ensemble de déterminants de séquence qui, pris ensemble, possèdent un bon pouvoir prédictif et que j’ai utilisé pour construire le premier modèle computationnel capable de prédire la terminaison Rho-dépendante à l’échelle des génomes d’E. coli et Salmonella. J’ai caractérisé in vitro certains de ces terminateurs, en particulier dans les régions 5’UTR, avec l’espoir qu’ils soient impliqués dans des mécanismes de régulation conditionnelle. J’ai identifié des candidats dont l’activité pourrait être sous le contrôle de facteurs comme des petits ARN non codants (sRNA) ou latempérature. J’ai également développé une méthode fluorogénique pour détecter facilement la terminaison Rho-dépendante in vitro et ai commencé à adapter l’approche CLIP-seq à l’étude du transcriptome Rho-dépendant chez Salmonella. Collectivement, mes travaux offrent de nouveaux outils d’analyse et de prédiction de la terminaison Rho-dépendante, une meilleure cartographie des sites d’action de Rho chez E. coli et Salmonella, ainsi que de nouvelles pistes d’étude du rôle de Rhodans l’expression conditionnelle du génome
Transcripts at a free Rut (Rho-utilization) site from which Rho moves along the RNA in an ATP dependentfashion to catch up with and dissociate the transcription elongation complex. It is generally believed that the Rut sites are, respectively, rich and poor in Cytosines and Guanines as well as relatively poor in secondary structures. Studies at the genomic or transcriptomic scale have notrevealed any stronger consensus features or rules for predicting potential Rho-dependent termination sites. By combining biochemical and bioinformatics approaches, I have explored the mechanisms by which Rho recognizes transcripts to induce transcription termination. I have identified a complex set of sequence determinants which, taken together, have good predictive power and which I used to build the first computational model able to predict Rho-dependent termination at the scale of Escherichiacoli and Salmonella genomes. I have characterized in vitro some of these terminators, particularly in 5'UTRs, with the hope that they will be involved in conditional regulatory mechanisms. I have identified several candidates whose activity may be under the control of factors such as small non-coding RNAs(sRNA) or temperature. I have also developed a fluorogenic method to easily detect Rho-dependent termination in vitro and have begun to adapt the CLIP-seq approach to the study of the Rhodependent transcriptome in Salmonella. Collectively, my work offers new tools for the analysis and prediction of Rho-dependent termination, a better mapping of the sites of probable Rho action in E.coli and Salmonella, as well as several lines of investigation of the role of Rho in the conditional expression of bacterial genomes

L'IRES du VHC est organisé en une structure secondaire, complexe et hautement conservée, qui comprend quatre domaines distincts (I-IV). Cette organisation permet la liaison directe du facteur d'initiation eucaryote eIF3 et de la sous-unité 40S du ribosome. Le facteur d'initiation eucaryote eIF3 est un complexe de 13 protéines (~ 800 kDa). Certaines de ses sous-unités montrent une affinité pour l'ARN, et parmi elles deux possèdent des motifs de reconnaissance à l'ARN (MRR) : eIF3b (aa : 185-268) et eIF3g (aa : 239-317). Afin de déterminer l'implication de ces motifs dans l'interaction ARN-protéine, nous avons cloné les domaines contenant ces motifs MRR, ainsi que les protéines entières eIF3b et eIF3g. Nous avons ensuite étudié l'interaction de l'ARN et/ou domaines d'ARN avec le complexe eIF3 et/ou protéines ou domaines protéiques en utilisant la méthode de rétention sur filtre. Nous avons ainsi calculé les différentes constantes apparentes de dissociation entre : eIF3/IRES, eIF3b/IRES et MRR-eIF3b/IRES. Ces résultats montrent que la sous-unité eIF3b se lie directement au domaine III de l'IRES via son motif MRR situé dans le domaine N-terminal. Dans un deuxième temps, nous avons utilisé la spectroscopie RMN pour identifier précisément les acides aminés impliqués dans la reconnaissance de l'ARN viral. En utilisant différentes techniques telles que FBA, RMN et SAXS, il s'avère que le domaine IIId (30 nucléotides) représente le motif minimum impliqué dans l'interaction MRR-eIF3b/IRES. Enfin, la technique de SAXS a été mise à profit pour étudier la structure tridimensionnelle de l'IRES libre en solution.

Les aminoglycosides, des dérivés aminés de saccharides, interfèrent avec le mécanisme de synthèse des protéines chez les bactéries en se fixant au site de décodage de l'ARN de transfert aminoacylé (site A) situé en 3' de l'ARN ribosomique 16S. Au cours de ce travail de thèse, les structures de trois complexes entre des fragments d'ARN incorporant le site A et les aminoglycosides paromomycine, tobramycine et généticine, ont été résolues par cristallographie aux rayons X à 2,40-2,54 Å. L'analyse des structures montre que la reconnaissance et la fixation spécifiques des aminoglycosides au site A font intervenir de nombreuses liaisons hydrogène directes et pontées par des molécules d'eau. Dans ces structures, la partie néamine commune aux aminoglycosides (cycles I et II) s'intercale dans l'hélice de manière similaire : le cycle I (non plan) forme une pseudo paire de bases avec l'adénine 1408 ; la néamine oblige les adénines 1492 et 1493 à pointer hors de l'hélice. La comparaison des structures 3D de ces trois complexes offre des explications moléculaires aux différents résultats de biochimie et de microbiologie, ainsi qu'à certains phénomènes de résistances et de toxicités. Les conformations du site A et des aminoglycosides au sein de ces complexes sont similaires à celles du site A et de la paromomycine au sein de la sous-unité ribosomique 30S. Ainsi, la stratégie développée permet une description des interactions et des modes de fonctionnement des aminoglycosides proche du contexte naturel mais plus précise, essentielle à notre connaissance du système ARN/aminoglycoside. De ces résultats découlent des lignes directrices laissant envisager sous un jour nouveau la conception d'antibiotiques moins sujets aux résistances et moins toxiques.