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Dissertationen zum Thema „Recombinant protéique“
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Rigo, Maxime. „Rôle de l'adaptateur protéique carma1 dans le mécanisme d'action de l'anticorps recombinant anti-cd4 13b8.2“. Thesis, Montpellier 1, 2010. http://www.theses.fr/2010MON13502/document.
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L'anticorps recombinant anti-CD4 13B8.2 a démontré des capacités de lyse dépendante du complément (CDC) et d'inhibition de la prolifération cellulaire dans le cadre du traitement des tumeurs hématopoïétiques CD4+. Bien qu'il ait été démontré que son action antiproliférative passe par une modulation du facteur de transcription NF-(kappa)B, les mécanismes précis y conduisant restent encore inexpliqués. Au sein du laboratoire, de précédentes études ont démontré que l'anticorps anti-CD4 13B8.2 induit une réorganisation et une modulation des protéines dans les rafts, en y concentrant le CD4 et en y excluant les protéines ZAP70, SLP76, PLC(nu)1 et Vav1. Nous avons tenté d'expliquer les mécanismes qui participent à la modulation des protéines au sein des microdomaines membranaires lipidiques, et nous proposons que la voie de signalisation Carma1 soit impliquée dans les effets observés sur le facteur de transcription NF-(kappa)B. Cette étude démontre que les effets biologiques de l'anticorps recombinant 13B8.2 passent par une modulation de la voie Carma1, Bcl10, MALT1. L'anticorps 13B8.2 induit une réorganisation de ces protéines en dehors des microdomaines membranaires lipidiques avec une dissociation du complexe qui ne peut plus transmettre la signalisation conduisant à l'activation de NF-(kappa)B. Nous avons également mis en évidence que les réorganisations protéiques au niveau de la membrane, induites par l'anticorps anti-CD4 13B8.2 s'accompagnent d'une modulation des espèces lipidiques des microdomaines. Ainsi, nous observons une augmentation du niveau des acides gras de type C18 :0, et une augmentation de l'activité d'une sphingomyelinase acide qui conduit à une augmentation du taux de céramide. Parallèlement l'augmentation de céramide, induite par une sphingomyelinase bactérienne induit la réorganisation de ZAP70 hors des microdomaines, de façon comparable à l'anticorps 13B8.2. Cette meilleure connaissance des mécanismes de signalisation de l'anticorps anti-CD4 13B8.2, permettra de dégager de nouvelles approches thérapeutiques en vue de la modulation de la prolifération des cellules T et de leur sensibilisation à la chimiothérapie. Ce travail ouvre la voie à des possibilités de thérapies ciblant les microdomaines lipidiquesThe recombinant anti-CD4 antibody 13B8.2 demonstrated capabilities complement dependent lysis (CDC) and inhibition of cell proliferation in the treatment of hematopoietic tumors CD4 +. Although it has been demonstrated that its antiproliferative activity through modulation of transcription factor NF-kB, the precise mechanisms leading to them remain unexplained. Within the laboratory, previous studies have shown that anti-CD4 13B8.2 induced a reorganization and modulation of proteins in rafts by concentrating CD4 and by excluding proteins ZAP70, SLP76, Vav1 and PLC(nu)1 . We tried to explain the mechanisms involved in the modulation of proteins within lipid microdomains, and we propose that the signaling pathway is involved in Carma1 observed effects on the transcription factor NF-kB. This study demonstrates that the biological effects of recombinant antibody 13B8.2 pass through a modulation of the channel Carma1, Bcl10, MALT1. 13B8.2 antibody induces a reorganization of these proteins outside the lipid membrane microdomains with a dissociation of the complex that can no longer transmit signals leading to activation of NF-kB. We also demonstrated that the protein reorganization at the membrane induced by anti-CD4 13B8.2 accompanied by modulation of lipid microdomains species. Thus, we see an increased level of fatty acids like C18: 0, and increased activity of acid sphingomyelinase leads to an increased rate of ceramide. Parallel increase of ceramide, induced by bacterial sphingomyelinase induced reorganization of ZAP70 outside microdomains similarly to the antibody 13B8.2. A better understanding of signaling mechanisms of the anti-CD4 13B8.2, will identify new therapeutic approaches for modulating the proliferation of T cells and their sensitization to chemotherapy. This work paves the way for potential therapies targeted to lipid microdomains
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Raingeaud, Joël. „Synthèse et purification d'un analogue du neuropeptide VIP (vasoactive intestinal peptide) par les technologies de l'ADN recombinant et du génie protéique“. Limoges, 1994. http://www.theses.fr/1994LIMO0006.
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Le vip (vasoactive intestinal peptide) est un peptide basique de 28 acides amines avec une extremite cooh aminee. Il appartient a la meme famille que la secretine et la glucagon et intervient principalement dans la vasodilatation, la relaxation des muscles lisses et la stimulation des secretions exocrines. Une strategie a ete envisagee permettant la production d'un analogue du vip par genie genetique. Afin de surmonter le probleme de l'instabilite de ce type de peptide exprime dans les systemes bacteriens recombinant notamment e. Coli, plusieurs unites du gene vip sont fusionnees pour former un concatemere. Les unites sont separees par des oligonucleotides de liaison codant pour une sequence en acides amines possedant des sites de clivage enzymatique (facteur xa) et chimique (hydroxylamine). Avec cette organisation, un gene multimetre de 16 vip a ete synthetise par addition sequentielle des genes, puis fusionne a un gene marqueur, celui de la glutathion s-transferase. La proteine hautement exprimee grace au plasmide pg 16v introduit dans la souche d'e. Coli jm 105, a ete purifiee et soumise a une double digestion. Seule l'utilisation du facteur xa a conduit a des formes physiquement caracterisees analogues du vip. Outre des formes polymeres, on obtient un peptide analogue du vip monomerique possedant du cote c-terminal une extre sequence de 5 ou 10 acides amines. Des experiences preliminaires sur l'activite biologique ont confirme 1) que ce peptide reconnait le recepteur du vip. 2) sa capacite a stimuler l'activite de l'adenylate cyclase et enfin 3) qu'il possede une activite relaxante sur un organe isole comparable a celle du cip naturel. Cette strategie de synthese et de purification, laisse envisager la production de derives agonistes et antagonistes du vip. Enfin, elle peut etre extrapolee ala production d'autres peptides a activite biologique d'une taille voisine
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Poenou, Géraldine. „Assemblage de la machinerie moléculaire de la coagulation : apprendre de l'évolution adaptative du Facteur X de venin de serpent“. Electronic Thesis or Diss., Sorbonne université, 2024. http://www.theses.fr/2024SORUS042.
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L'hémostase humaine est régulée par l'activité de complexes enzyme-cofacteurs macromoléculaires qui nécessitent une surface membranaire chargée négativement pour leur assemblage. Outre l'organisation spatiale des réactions de coagulation lors de lésions vasculaires, la formation du complexe FX / FV à la surface phospholipidique permet l'amplification de la conversion de la FIl en Flla. Cependant, les connaissances sur les mécanismes moléculaires précis du phénomène d'amplification de l'hémostase à la surface de membrane lipidique sont incomplètes. L'objectif est de préciser les connaissances des mécanismes moléculaires du peptide d'activation sur le FX, le rôle du domaine Gla de la sérine protéase le FXa et du variant résistant aux anticoagulants oraux directs (AOD) qui régulent l'assemblage des complexes enzyme-cofacteur, complexes conduisant à la coagulation sanguine. En particulier, dans ce travail de thèse est étudié : 1/ le rôle dans l'évolution de la longueur du peptide d'activation du FX du venin de serpent et notamment un rôle potentiel dans la vitesse d'activation du FX et de l'amplification du phénomène de coagulation. 2/ le rôle du domaine GLA de la sérine protéase le FXa lié à la surface des phospholipides, qui associé au facteur Va convertit la Flla en FIl, une étape clé de la coagulation sanguine. Des variantes de ces protéines présentant des propriétés procoagulantes améliorées peuvent être trouvées dans la nature, avec, comme exemple le plus frappant, les protéines FVa-Xa exprimées dans le venin du serpent commun australien Pseudonaja textilisHuman hemostasis is regulated by the activity of enzyme-cofactor complexes macromolecular molecules that require a negatively charged membrane surface for their assembly. In addition to the spatial organization of coagulation reactions during vascular lesions, the formation of the FX/FV complex on the phospholipid surface allows the amplification of the conversion of FIl to Flla. However, the knowledge on the precise molecular mechanisms of the phenomenon of amplification of hemostasis on the lipid membrane surface are incomplete. The objective is to clarify the knowledge of the molecular mechanisms of the peptide activation on FX, the role of the Gla domain of the serine protease Fa and the variant resistant to direct oral anticoagulants (DOACs) that regulate the assembly of enzyme-cofactor complexes, complexes leading to blood clotting. In this thesis is studied 1/ the role in the evolution of the length of the FX activation peptide of the venom of snake and in particular a potential role in the speed of activation of the FX and the amplification of the coagulation phenomenon. 2/ the role of the GLA domain of the serine protease FXa linked to the surface of phospholipids, which associated with factor Va converts Flla into Fil, a key step in blood clotting. Variants of these proteins exhibiting properties Enhanced procoagulants can be found in nature, with, as an example most strikingly, the FVa-Xa proteins expressed in common snake venom Australian Pseudonaja textilis
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Miladi, Baligh. „Développement d’outils moléculaires de production et de purification de protéines recombinantes par suivi en temps réel“. Thesis, Cergy-Pontoise, 2011. http://www.theses.fr/2011CERG0533/document.
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Les besoins en protéines recombinantes dans les diverses activités des bio-industries a considérablement augmenté ces dernières années. Cependant, les procédés de leur production sont encore limités par le manque de marqueurs permettant de suivre l'expression et la purification des protéines d'intérêt, la formation des corps d'inclusion et les faibles degrés de pureté.Afin de pallier à ces difficultés, nous avons développé et mis en œuvre un nouveau procédé de production et de purification de protéines recombinantes chez Escherichia coli. Ce procédé est basé sur l'utilisation d'une cassette d'expression appelée Multitags et sur le clivage par une TEV protéase immobilisée sur une matrice de streptavidine. Le Multitags comporte, à partir de son extrémité N-terminale, un double tag d'affinité (10xHis et SBP), le domaine de fixation de l'hème du cytochrome b5 et le site de clivage de la TEV protéase. En utilisant deux modèles différents de protéine d'intérêt (MyRIP et la Pfu DNA polymérase), nous avons montré l'efficacité du cytochrome b5 dans le suivi visuel et quantitatif par mesure d'absorbance des différentes étapes de production et de purification. Nous avons obtenu plus de 90% de chacune des deux protéines de fusion dans la phase soluble. L'application d'une chromatographie double via les deux tags d'affinité 10xHis et SBP a permis d'atteindre un degré de pureté du Multitags-MyRIP et du Multitag-Pfu de 99%. Nous avons construit des colonnes protéolytiques en produisant la TEV protéase sauvage et sa version mutée (S219V) en fusion avec le Streptag II et en immobilisant ces enzymes par affinité sur colonne de streptavidine-agarose. La caractérisation des colonnes protéolytiques et leur application aux protéines recombinantes d'intérêt modèles ont montré l'avantage de cette méthode d'immobilisation en termes d'activité protéase retenue, de stabilité des enzymes, de leur réutilisation et de simplification du schéma de purification et de récupération des protéines d'intérêt à haut degré de pureté. En conclusion, ces travaux de thèse ont permis de développer et de valider des outils innovants pour l'expression et la purification de protéines recombinantesIn recent years, the need for recombinant proteins has substantially increased in various bio-industry activities. However, actual recombinant processes are still limited by the lack of markers allowing real-time expression and purification monitoring of target proteins, by inclusion bodies formation and by low quality of purity of the products. To overcome these difficulties, we have developed a new process for production and purification of recombinant proteins in Escherichia coli. The method combines the use of a multifunctional expression cassette, termed Multitags and an immobilized modified TEV protease on a streptavidin matrix. The Multitags contains, its N-terminus, two affinity purification tags (10xHis and SBP) and as a marker tag, the heme-binding domain of cytochrome b5 followed by the TEV cleavage site. Using two model proteins (MyRIP and Pfu DNA polymerase), we have demonstrated the visual and the quantitative monitoring capability of the cytochrome b5 during the expression and purification steps. When expressed in E. coli KRX more than 90% of both fusion proteins were produced in a soluble form. In addition, high purity (99%) of Multitags-MyRIP and Multitags-Pfu was achieved after two consecutive affinity purification steps using the dual affinity tag. We also produced the wild-type and the S219V mutant TEV proteases fused to the Streptag II affinity sequence and realized their affinity immobilization on a streptavidin-agarose matrix. The characterization of the proteolytic columns and their application to the recombinant model proteins demonstrated the advantage of this immobilization method in terms of retaining activities, enzyme stabilities, possibility of reuse and simplification of the cleavage downstream steps.In conclusion, this study allowed the development and the validation of innovative tools for expression and purification of recombinant proteins
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Girard, Loïc. „Expression d'une protéine recombinante humaine dans des cellules végétales :le CD14“. Rennes 1, 2003. http://www.theses.fr/2003REN10108.
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Le travail réalisé durant cette thèse a permis de démontrer la possibilité de produire du CD14 par des cellules végétales cultivées en suspension. L'ADNc cd14 a été inséré dans le génome de la cellule végétale sous le contrôle du promoteur CaMV35S, a été transcrit et l'ARNm en résultant a été reconnu par la machinerie traductionnelle. Cette intégration du transgène dans le génome est un événement stable puisque la protéine a été détectée 2 ans après la transformation des cellules. Deux clones exprimant du CD14 ont été mis en évidence par western-blot et les distances de migration sur gel de polyacrylamide laissent à penser que ces protéines sont glycosylées. Les faibles taux d'expression constatés (entre 2,5 et 10 æg/L) ne permettent pas encore d'analyses complémentaires nécessaires pour déterminer l'intégrité et la fonctionnalité de la protéine. La sécrétion de la protéine semble effective, que ce soit en utilisant un peptide signal végétal ou humain.
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Byrne, Deborah. „Du gène à la protéine : une approche rationnelle pour concevoir des expériences d'expression des protéines recombinantes“. Thesis, Aix-Marseille 2, 2011. http://www.theses.fr/2011AIX22127.
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Protéines difficiles à exprimer: un goulot d'étranglement pour la plupart des biologistes. J'ai choisi d'utiliser comme modèle d’étude Acanthamoeba polyphaga Mimivirus. Ce virus géant à ADN possède des protéines subissant des modifications post-traductionnelles, des structures multi-protéiques ou encore des voies enzymatiques jamais identifiées auparavant dans un virus, ce qui en font un modèle idéal pour l’étude de protéines récalcitrantes. Le but ultime de cette thèse, était de produire les protéines de capsides de Mimivirus. Le rôle de la protéine de capside dans l’assemblage de la particule virale, son infectivité et ses caractéristiques moléculaires sont d’une grande importance. Pour aller du gène à la protéine, J’ai participé à la compréhension de ce qui gouverne la terminaison de la transcription de Mimivirus et également participé à l'analyse globale du transcriptome au cours du cycle d'infection des amibes par Mimivirus. Nous avons montré que les transcrits de Mimivirus sont systématiquement polyadénylés dans des régions formant une structure secondaire en tige-boucle, même s’il n’existe pas de signal de polyadénylation canonique en amont. Nous en avons conclu que la polyadénylation de Mimivirus suit exclusivement une règle «épingle à cheveux». De plus, l’étude du transcriptome a révélé 3 phases temporelles distinctes dans le cycle infectieux: précoce, intermédiaire et tardive. Les transcrits de capsides sont tous exprimés durant la phase tardive mais leur profil d’expression ne sont pas superposables dans le temps. Les données de transcriptomique ont révélées la présence de plusieurs glycosyltransférases chez Mimivirus, dans la phase tardive du cycle, concomitant avec la production de la protéine de capside. Les informations recueillies sur l'expression des gènes à différents temps post-infection ont contribué à la conception de protocoles pour la production des protéines de capsides (la protéine majeure de capside (MCP) et ses paralogues) dans de systèmes eucaryoteDifficult to express proteins: a bottleneck for most biologists. I have chosen to use Acanthamoeba polyphaga Mimivirus as my study model. This giant dsDNA virus possesses post-translationally modified proteins, multi-protein structures and enzyme pathways never before seen in a virus, which makes it ideal for refractory studies. The ultimate goal of my thesis was to produce the capsid proteins of Mimivirus. The role of the capsid protein in the assembly of the viral particle, its infectivity, and molecular features are of great importance. To go from gene to protein, I participated in the comprehension of what governs the post-transcriptional termination in Mimivirus and equally participated in the global analysis of the transcriptome during the infectious cycle of Acanthamoeba by Mimivirus. We have shown that the Mimivirus transcripts are systematically polyadenylated in the regions forming a stem-loop secondary structure; even when a canonical poyadenylation signal is absent We concluded that Mimivirus polyadenylation obeys a strict “Hairpin rule”. Moreover, the transcriptomic study revealed three distinct temporal phases: early, intermediate and late. The capsid transcripts are all expressed during the late phase but their expression profiles are not superimposable. The transcriptomic data also revealed the presence of several Mimivirus glycosyltransferases in the late temporal phase, concomitant with the capsid proteins. The expression data gathered throughout my thesis has contributed to the rational design of a protein production experiment to produce the major capsid protein and its three paralogs in eukaryotic systems
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Roux, Lauriane. „Développement et validation d’un modèle cellulaire de kératopathie associée à l’aniridie“. Thesis, Sorbonne Paris Cité, 2018. http://www.theses.fr/2018USPCC276.
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L’aniridie est une pathologie rare principalement due à des mutations hétérozygotes sur PAX6, le gène contrôlant le développement oculaire et le maintien de l’homéostasie cornéenne. Elle est caractérisée par une hypo/aplasie de l’iris, des atteintes de la rétine et du cristallin. La totalité des patients atteints développe aussi une kératopathie associée à l’aniridie (KAA), conduisant à une opacification progressive de leur cornée. La KAA a pour origine un déficit en cellules souches limbiques et diverses perturbations de l’épithélium et du stroma cornéens. Actuellement, il n’existe ni traitement pour soulager efficacement les patients, ni modèle cellulaire pour cette pathologie. Afin de pallier ces manques, le système CRISPR/Cas9 a été utilisé pour intégrer une mutation hétérozygote non-sens dans le gène PAX6 de cellules épithéliales limbiques immortalisées. Les cellules mutées présentent une expression réduite de PAX6 et une modulation de celle de ses gènes cibles, un ralentissement de la prolifération, de la clonogénicité et de la migration ainsi qu’une adhésion accrue. De plus, nous avons montré qu’un traitement de ces cellules avec une protéine recombinante PAX6, portant un peptide de pénétration cellulaire, permet une induction de l’expression endogène de PAX6 et également une restauration partielle du phénotype décrit précédemment. Cette réversion phénotypique valide le modèle d’haploinsuffisance développé et suggère l’implication de PAX6 dans les différentes fonctions restaurées. Les cellules mutées peuvent maintenant être utilisées pour le criblage d’outils thérapeutiques potentiels pour la KAA et pour d’autres défauts liés à une diminution du dosage de PAX6Aniridia is a rare panocular disease mainly due to PAX6 heterozygous mutations. PAX6 is the master gene of the eye development and it controls also the corneal homeostasis maintenance. Aniridia is characterized by an iris hypo/aplasia, retina and lens defects. All the aniridia patients will also develop an aniridia-related keratopathy (ARK) leading to a progressive corneal opacification. ARK is due to a limbal stem cell deficiency and alterations of corneal epithelium and stroma functions. Unfortunately, there is currently no efficient treatment to relief the patients and no cellular model for this pathology. To remedy these lacks, CRISPR/Cas9 system was used to insert a nonsense mutation into PAX6 gene of immortalized limbal epithelial cells. The mutated cells produce less PAX6 than the wild-type and PAX6 targets gene expression was modulated. They also display a marked slow-down proliferation, clonogenicity, migration and an enhanced adhesion. Moreover, we have shown that addition of recombinant PAX6 protein fused to a cell penetrating peptide to the culture medium was able to activate the endogenous PAX6 expression and to rescue some phenotypic defects of the mutated cells. Therefore, it validates the PAX6 haploinsufficiency model and suggests that PAX6 could be involved in all the rescued functions. The mutated cells can now be used to screen potential therapeutic tools for ARK and for other defects due to low levels of PAX6
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Iatmanen, Soria. „Production et caractérisation structurale et fonctionnelle de la protéine membranaire recombinante TSPO“. Thesis, Paris 6, 2014. http://www.theses.fr/2014PA066561/document.
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La TSPO préalablement connue sous le nom de récepteur périphérique aux benzodiazépines (PBR), est une protéine membranaire principalement impliquée dans le transport du cholestérol du cytosol vers la matrice des mitochondries, étape limitante dans la synthèse des stéroïdes et des sels biliaires.La production de la forme murine de la TSPO recombinante a été réalisée par un plasmide exprimé dans la bactérie Escherichia coli. La purification a été obtenue par colonne d'affinité grâce à l'étiquette polyhistidine codée dans le gène recombinant. Différents environnements mimétiques membranaires, détergents, lysodérivés, lipides ont été testés d'un point de vue structural et fonctionnel. Parmi les détergents étudiés, la dodécyl phosphocholine (DPC) a permis le meilleur repliement de la protéine. L'ajout de lysodérivés (LMPE) ou de phospholipides (DMPC/DMPE) a permis d'accroître la stabilité. La liaison des ligands spécifiques de la TSPO (PK 11195, cholestérol, protoporphyrine IX) a été observée dans plusieurs conditions étudiées par différentes approches biophysiques et biochimiques. Les trois approches structurales (ME, RX et RMN) ont pu être réalisées après optimisation des conditions de production et de stabilisation. Les résultats obtenus sont discutés en lien avec la structure de la TSPO publiée ces derniers mois. En parallèle à l'étude structurale, des mesures fonctionnelles par mutagenèse dirigée ont été réalisées afin d'obtenir des informations sur la liaison du ligand PK 11195. Ces données ont été confrontées à la structure récemment déterminée permettant de proposer un rôle pour les résidus mutés. Le mécanisme de transport du cholestérol par la TSPO est discutéTSPO previously named peripheral-type benzodiazepine receptor (PBR) is a membrane protein mostly involved in cholesterol transport from the cytosol to the matrix of mitochondria, a limiting step in steroids and bile salts biosynthesis.Production of recombinant mouse TSPO has been performed by plasmid expression in Escherichia coli bacteria. Purification has been obtained by immobilized affinity chromatography (IMAC) using polyhistidine tag encoded by recombinant gene. Various membranous mimetic environments such as detergents, lysoderivates, lipids have been tested from structural and functional point of view. Among tested detergents, dodecyl phosphocholine (DPC) has permitted the best protein refolding. The presence of lysoderivate (LMPE) or phospholipids (DMPC/DMPE) increased protein stability. Binding of TSPO high affinity ligands (PK 11195, cholesterol, protoporphyrin IX) has been measured in different conditions studied by biochemical and biophysical techniques. Three structural approaches (EM, XR and NMR) have been performed after optimization of production conditions and protein stabilization. Results gained have been discussed in line with TSPO atomic structure published within these last months. In parallel with structural studies, functional measurements have been carried out by site directed mutagenesis in order to gain data on binding site of PK 11195. These data have been faced with recently published TSPO atomic structure stabilized with this ligand and enabled to propose functional implication of mutated amino acids. Transport mechanism of cholesterol by TSPO is discussed
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Bransi, Ali. „Caractérisation fonctionnelle et structurale d'un homologue phagique de la protéine humaine RAD52“. Thesis, Université Laval, 2009. http://www.theses.ulaval.ca/2009/26338/26338.pdf.
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Ben, Rached Fathia. „Etude de la protéine Rab7 de Plasmodium“. Paris 7, 2011. http://www.theses.fr/2011PA077123.
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Lors de son cycle, P. Falciparum, agent du paludisme, envahit les globules rouges provoquant ainsi la phase symptomatique de la maladie. Cette localisation intracellulaire rend cruciale, pour le parasite, la mise en place d'un transport vésiculaire afin d'importer les nutriments nécessaires à son développement et d'exporter les métabolites de dégradation. Nous nous sommes intéressé, au cours de cette thèse, à la GTPase Rab7 une des protéines clés de la régulation du trafic vésiculaire. Dans un premier temps, nous avons démontré que l'inactivation du gène rab7 est létale pour le parasite au cours de la phase érythrocytaire. Nous avons, ensuite, montré que les protéines Rab7 et Atg8 (marqueur de l'autophagosome) colocalisent chez P. Falciparum suggérant qu'un des rôles essentiels de Rab7 pourrait être lié à son implication dans l'autophagie, mécanisme responsable du remodelage cellulaire du parasite qui subit de nombreuses transformations au cours de son développement. Par la suite, nous avons exploité les bases de données de S. Cerevisiae pour construire l'interactome des protéines Rab de P. Falciparum. Nous avons validé cet interactome in vitro et in vivo en confirmant l'interaction entre les protéines Rab7 et PKA-C, correspondant à la sous-unité catalytique de la PKA, protéine clé de la voie de régulation dépendante de l'AMPc. Enfin, nous avons démontré que Rab7 est phosphorylée in vitro par la PKA-C et identifiée la serine 72 comme site de phosphorylation. La compréhension du trafic vésiculaire et la caractérisation du rôle essentiel de Rab7 pourrait améliorer la lutte contre le paludisme car l'inhibition des interactions de Rab7 apparaissent comme des cibles thérapeutiques de choixDuring its life cycle P. Falciparum, the causative organism of malaria, invades red blood cells leading to the specific symptoms of the disease. Its intracellular localization prompts the parasite to utilize the vesicular transport machinery in order to import nutrients that are essential for its development and to export degraded metabolites. In the present study we were interested in the role of the GPTase Rab7, which represents a major component of the vesicular transport pathway. For the first time, we demonstrated that inactivation of the rab1 gene is lethal to the parasite during its erythrocytic stage. Rab7 and Atg8 (autophagosomal marker) proteins colocalize with P. Falciparum suggesting a potential role for Rab7 during autophagy, a process that is important for thé multiple cellular transformations being undergone by the parasite throughout its development. Furthermore, we took advantage of the S. Cerevisiae database to design a Rab protein interactome for P. Falciparum. This interactome was validated in vitro and in vivo by corroborating the interaction between Rab7 and PKA-C, the corresponding subunit of PKA that is involved in cAMP-dependent signaling pathways. Finally, we showed that in vitro phosphorylation of Rab7 by PKA-C occurs at its serine 72 residue. A profound understanding of the mechanisms associated with vesicular trafficking in the parasite cell and characterization of the role of Rab7 might contribute to the battle against malaria whereas drug-induced inhibition of interactions with Rab7 could represent a method of choice
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Chevalot, Isabelle. „Production d'une protéine membranaire humaine par cultures en réacteurs de cellules animales recombinantes : obtention de la lignée CHO recombinante et études cinétiques en réacteurs discontinus et semi-continus“. Vandoeuvre-les-Nancy, INPL, 1992. http://docnum.univ-lorraine.fr/public/INPL_T_1992_CHEVALOT_I.pdf.
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L'objectif général de ce travail est l'étude de la production d'une enzyme membranaire humaine à intérêt clinique (la gamma glutamyltransérase: GGT) par cultures en réacteurs de cellules animales CHO (Chinese Hamster Ovary) recombinantes. La première partie concerne l'obtention de la cellule CHO recombinante. Pour cela, la mise au point d'une technique de transfection par electroporation a été réalisée et évaluée par un test de permeébilisation membranaire, puis la stabilité de la production GGT par ces cellules recombinantes a été vérifiée pendant 18 passages. Les caractéristiques structurales et catalytiques de l'enzyme recombinante ont été déterminées et montrent l'obtention d'une enzyme active avec un taux d'expression très performant de 2U/mg de protéines. Les cinétiques de cultures en réacteur discontinu des cellules r-CHO n'ont pas montré de différences significatives dans leur comportement de prolifération, ni dans leur métabolisme de base par rapport aux cellules sauvages. La seconde partie traite de l'influence de l'adhérence cellulaire sur le comportement des cellules r-CHO en réacteur. Trois systèmes de culture ont été mis en œuvre: sur microporteurs, en agrégats ou en cellules individualisées. Il a été observé une vitesse spécifique de croissance deux fois plus élevée pour les cultures cultivées sur microporteurs; de plus, les cellules perdent leur capacité de synthèse de l'enzyme (d'un facteur 7) des qu'elles se trouvent en absence de support. Enfin, la mise en œuvre de réacteur semi-continu a permis de maintenir des concentrations cellulaires maximales pendant une période plus longue, facilitant ainsi la récupération de l'enzyme. En troisième partie, l'optimisation de la production de GGT a été envisagée, notamment par ajout d'un agent chimique inducteur. L'addition de butyrate de sodium dans une culture en réacteur semi-continu avec des cellules r-CHO sur microporteurs a permis de stimuler la production d'un facteur 1,5. L'extraction de l'enzyme membranaire est également présentéeThe aim of this work is to study the production of a human membrane enzyme (Gramma-glutamyltransferase (GGT) widely used in clinical chemistry, by culture of recombinant Chinese Hamster Ovary (CHO) cells. The first part of this report deals with the preparation of the recombinant CHO cell line. Among different gene transfer method, we have chosen and optimized the electroporation of the CHO cells. The stability of the GGT synthesis has been tested during 18 successive passages. Structural and catalytic features of the recombinant enzyme shows that this enzyme is active with a high level of expression (2 U/mg of protein). We have realized some comparative kinetic studies beetwen wild and recombinant CHO cells in batch culture. It was found that morphology, metabolism and proliferation rate are near the same for the two cell lines. In the second part, we have studied the influence of cellular adhesion and operating conditions on the rrecombinant CHO cells behavior. Three types of culture for these support-dependent cells have been compared : microcarriers, aggregates and suspension cells. The specific growth rate is two times higher for cells on microcarriers and a decrease in GGT production (factor 7) is observed in non-adherent states. The use of a fedbatch reactor allows a better stabilization of the maximum cell density and GGT concentration as compared to batch culture technique. In the third part, an optimization of the GGT production by cells on microcarriers has been carried out in a fed batch bioreactor using an induction of the GGT synthesis by butyrate. The enzyme extraction has also been considered
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Senay, Claire. „L'UDP-glucuronosyltransférase hépatique humaine, l'UGT1A6 : étude mécanistique et structurale de la protéine recombinante“. Nancy 1, 1997. http://www.theses.fr/1997NAN12165.
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Les UDP-glucuronosyltransférases appartiennent à une famille d'enzymes membranaires impliquées dans le métabolisme des médicaments de substances endogènes (hormones, bilirubine) et la synthèse de macromolécules polysaccharidiques (glycosaminoglycanes). Nous avons développé la caractérisation du site actif de l'UDP-glucuronosyltransférase hépatique humaine glucuronoconjuguant les composés phénoliques plans, l'UGT1A6. L'enzyme recombinante est exprimée de façon stable dans les cellules V79. Au cours de ce travail, la modification chimique de cette enzyme par des inhibiteurs irréversibles tels que les carbodiimides ou la butanedione à permis de mettre en évidence la présence de résidus arginine, aspartique/glutamique impliqués dans la réaction de glucuronoconjugaison. La position de ces acides aminés essentiels a été postulée par alignement de séquence d'après leur conservation entre isoformes. La mutagenèse dirigée de ces résidus a été réalisée. Elle a permis de confirmer la contribution importante des résidus His 54 et Arg 52 dans la réaction de glucuronoconjugaison, après caractérisation des mutants en termes cinétiques et immunologiques. [. . . ]
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Hajjar, Christine. „Etude fonctionnelle du coeur catalytique membranaire d'enzymes de la famille NOX : Identification de la première NADPH oxydase procaryote“. Thesis, Grenoble, 2014. http://www.theses.fr/2014GRENV032.
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La famille des NADPH oxydases est constituée de complexes multi protéiques, dont un des composants est la sous unité catalytique NOX. Il s'agit de protéine transmembranaire qui assure le transport des électrons à travers la membrane, à partir d'un donneur d'électrons, le NADPH, à un accepteur final, l'oxygène moléculaire. Il en résulte la production de superoxydes, précurseur d'espèces réactives de l'oxygène. Les NOX sont impliquées dans divers processus physiologiques et pathologiques qui les ont placés au rang des cibles thérapeutiques à forte valeur ajoutée.Les NOX sont reportées comme des protéines membranaires propres aux eucaryotes supérieures. Ainsi toutes les données fonctionnelles disponibles pour cette famille d'enzyme, ont été le fruit des études structure-fonction et de données putatives indirectes. D'où l'idée et l'intérêt d'identifier chez les procaryotes des candidats homologues aux Nox eucaryotes et susceptibles d'être de bons modèles pour des études structurales. En se servant d'outils bio-informatiques, nous avons définis des signatures de séquences propres aux NOX et avons identifié chez les procaryotes des centaines de séquences homologues. SpNox de chez Streptococcus Pneumoniae, a été sélectionnée et surexprimée chez E. Coli. SpNox a été purifiée et a fait l'objet d'une caractérisation fonctionnelle et biochimique approfondie. Au vue des résultats obtenus, SpNox se rapproche de part ses propriétés structurales et mechanistiques des NOX eucaryotes. Ainsi elle se présente comme le premier modèle procaryote de protéine NOX. Les premiers cristaux de cette famille de protéines ont été obtenus et son rôle in vivo reste à exploiter.En parallèle à l'approche procaryote, nous avons mené une étude structure-fonction sur la protéine NOX2 des neutrophiles PLB-985. Deux arginines conservées chez toutes les NOX eucaryotes ont été sélectionnées et leur rôle a été étudié par mutagenèse dirigée. Apres évaluation des propriétés enzymatiques des mutants NOX2, nous avons pu identifier l'arginine 513 comme étant impliquée dans la spécificité de NOX2 vis a vis du NADPH. Ces résultats nous ont permis de proposer une nouvelle orientation du NADPH dans son site d'ancrage à la protéine NOX2The NADPH oxidase complex was the first identified example of a system that generates reactive oxygen species in a dedicated manner. NOX are proteins involved in the transmembrane transfer of electrons to the molecular oxygen, resulting in the production of superoxides. In addition to ROS related damages, deregulation of Nox-dependant ROS production induces pathological consequences. Accordingly, the Nox family became a potential drug target, making the understanding of their function at molecular basis crucial.In the literature, it has always been reported that Nox proteins exist only in eukaryotes. Since eukaryotic membrane proteins have proven to be difficult to study, all the data available on Nox enzymes are obtained from putative assignments or structure-function studies.In our project, to overcome the difficulty of working on eukaryotic membrane proteins, we used an original approach based on bioinformatics tools. Through using specific filters and a novel program, we were able to identify hundreds of prokaryotic candidates. Among them, we selected SpNox, as a prokaryotic model from Streptococcus Pneumoniae. We have developed its expression in E. Coli as well as a multistep purification scheme. We also conducted an extensive enzymatic and mechanistic characterization of the purified enzyme. Our data support a strong structural and functional homology with known NOX enzymes. Finally, crystallization trials are performed leading to first crystals ever obtained for this family of protein. The understanding of Nox's physiological function in bacteria remains to investigate.In parallel to the prokaryotic approach, a structure-function study was conducted on the human model NOX2 in the PLB-985 neutrophils. Conserved arginines among eukaryotic Nox sequences were selected. Site directed mutagenesis followed by activity tests, lead us to identify a crucial role for arginine 513. It is implicated in the specificity towards NADPH as an electron donor for NOX2. With these data, we were able to suggest a new orientation of the NADPH, notably the phosphate moiety, in the binding site
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Benchabane, Meriem. „Modifications post-traductionnelles d’une serpine humaine recombinante exprimée chez les plantes“. Rouen, 2007. http://www.theses.fr/2007ROUES020.
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Les plantes ont la capacité de produire des protéines recombinantes mais des problèmes de N-glycosylation et de protéolyse persistent. Afin d’établir l’impact de la localisation sur la stabilité et la glycosylation d'une protéine recombinante, nous avons exprimé l’inhibiteur de protéase α1-antichymotrypsine (AACT) humaine dans quatre compartiments (RE, vacuole, apoplasme et cytosol) de cellules de tabac en culture. Le produit obtenu s'est avéré être plus hétérogène au sein du système de sécrétion, en raison d'une maturation de la N-glycosylation et d'une maturation protéolytique. Inversement, la protéine recombinante cytosolique non glycosylée montrait une plus grande stabilité et présentait une double localisation nucléaire et cytoplasmique. L’AACT a un site de liaison à l’ADN et une mutation de ce site a permis d'inhiber cette interaction et d'altérer en partie la localisation nucléaire, suggérant l'implication de la liaison à l’ADN dans la rétention nucléairePlants represent interesting production platforms for recombinant proteins. Protein post-translational modifications however, may not be adequate, with a possible negative impact on their commercial value. To assess this problem, we expressed human α1-antichymotrypsin (AACT), a glycosylated serine protease inhibitor, in cultured BY2 tobacco cells. The inhibitor was targeted to different subcellular compartments to assess the impact of cellular destination on its stability and glycosylation. Our results showed that AACT entering the secretory pathway was readily processed to lower molecular weight forms resulting from glycan maturation and proteolytic processing. Intriguingly, cytosolic expression generated more stable proteins, although not glycosylated, that accumulated mostly in the nucleus. We further demonstrated that mutation of AACT DNA binding site partially altered the nucleus distribution, thus suggesting a role of this DNA binding in nuclear retention
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Crombez, Laurence. „Le TIMP-1 humain, une protéine multifacette : production sous forme recombinante et intérêt thérapeutique“. Université Joseph Fourier (Grenoble), 2006. http://www.theses.fr/2006GRE10006.
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Les TIMPs (Tissue Inhibitor of Metalloprokinases) sont lès inhihiteurs spécifiques des métalloprokases matricielles (MMPs). Ils participent à la regulation du remodelage matriciel, mais présentent aussi des fonctions indépendantes de cette activité (facteur de croissance, facteur de survie). A travers ces multiples facettes, la protéine TIMP-1 est impliquée dans des processus phvsiologiques et pathologiques. Nos objectifs sont de caractériser et d'utiliser les propriétés biochimiques de TIMP-1 afin d'évaluer son potentiel thérapeutique. Nous avons établi un protocole d'expression en système mammifère puis un schéma de purification de la protéine rh-TIMP-1 (recombinant human TIMP-1) nous permettant d'obtenir 30 mg/l de TlMP-1 pure, dépassant largement les taux dejà décrits. Ceci nous a permis d'évaluer son efficacité en tant qu'agent thérapeutique dans un modèle murin d'arthrite au collagène (mimant la polyarthrite rhumatoïde). Des analvses cliniques et sérologiques suggèrent un effet bénéfique des injections de rh-TIMP-1 à dose élevée contrairement aux doses faibles. Des investigations supplémentaires sont nécessaires pour déterminer le réel effet de TIMP-1. En parallèle, nous avons étudié la propriété de transduction de TIMP-1 dans les cellules tumorales. Nous avons montré que les acides aminés C-terminaux portent cette propriété et désormais nous devons optimiser ce processus et tester le transport d'une protéine thérapeutique (p. 53). Ce travail confirme l'intérêt biotechnologique de la proteine TIMP-1 en tant que navette et suggère l'intérêt thérapeutique potentiel qui nécessite des investigations additionnelles en particulier dans d'autres modèles pathologiquesTissue Inhibitor of Metalloproleinases (TIMPs) are specifie inhibitors of metalloproleinases involved in the regulation ofmatrix remodeling. TIMPs also present functions independent to their inhibitory role (growth and survival factors). Through these multiple activitics, TIMP-1, a member of the TIMPs, is involved in many physiologieal and pathological processes. The aim of this thesis was to characterise and exploit the biochemical properties of TIMP-1 to ultimately evaJuale its therapeutic potentiaL 1 developed a methodology for the expression and purification of a recombinant human TIMP-1. L'sing this procedure a total of 30mg/l of highly pure TIMPs was purified which represents a 30-fold increase ofpreviously published data. Therefore this mcthod could be specifically applied for the expression and puri fication of seerekd proteins. TIMP-1 was used in a mouse model of collagen induced arthritis to evaluate its efficiency as therapeutic agent. Clinical observations and serological analysis suggest a benefit of the TIMP-1 injections at high level. On the contrary, low doses of TIMP-1 show an increase in inflammation. Further work is required in order to determine the real effects of TIMP-1. Moreover we studied the transduction properties of TIMP-1 by following its uptake of TIMP-1 into tumoral cells. 1 demonstrated that the last 60 amino-acids of TIMP-1 are required for cell entry. Further work will require first the optimisation of TIMP-1 transduction efficiency and secondly, the characterization of cellular uptake of a therapeutic protein (p. 53)
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Gervais, Stéphanie. „Influence des conditions de culture sur le contenu en protéine recombinante dans les feuilles du tabac sauvage Nicotiana benthamiana“. Master's thesis, Université Laval, 2020. http://hdl.handle.net/20.500.11794/40225.
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La moléculture végétale a connu un essor considérable ces dernières années, permis parnombre d’avantages pratiques associés aux plantes incluant une mise à l’échelle aisée pour la production de vaccins ou d’anticorps thérapeutiques en grandes quantités. De nombreuses études ont été réalisées, ces dernières années, pour optimiser les rendements en protéines d’intérêt médical chez Nicotiana benthamiana, une cousine sauvage du tabac.Ces études ont été menées, toutefois, sans tenir compte de la teneur foliaire en protéines endogènes, souvent considérées comme des contaminants majeurs au moment de la purification des protéines d’intérêt. Dans ce contexte, notre principal objectif de recherche pour cette étude a été d’évaluer l’influence de traitements culturaux variés aussi bien sur le rendement total en protéine recombinante dans des plants agroinfiltrés de N. benthamianaque sur la teneur relative en ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygénase (RuBisCO),principal contaminant endogène du tissu foliaire. Nos résultats confirment un impact souvent significatif des conditions culturales sur le rendement total en protéine recombinante dans la plante, mais peu d’effets sur la part relative en RuBisCO dans le tissu foliaire.Plant molecular farming has grown considerably in recent years, thanks to a number of benefits associated with plants including a convenient scaling-up of production settings that allow for the production of large quantities of vaccines or therapeutic antibodies. Numerous studies have been conducted in recent years to optimize the yields of medically valuable recombinant proteins in the wild tobacco relative Nicotiana benthamiana. Most of these studies, however, have not considered the host plant endogenous proteins, which oftenrepresent major contaminants during the downstream purification of recombinant proteins.In this context, our main research objective for this project has been to evaluate the relative impacts of cultural conditions on recombinant protein yield and relative content of ribulose1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase (RuBisCO), the major endogenous protein contaminant in leaf tissue. Our results confirm the influence of most cultural conditions on total recombinant protein yield, but a negligible effect of these conditions on the relative amount of RuBisCO in leaf tissue.
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Imam-Sghiouar, Naïma. „Etude protéomique de cellules T Jurkat après traitement par de la Galectine-1 recombinante“. Paris 7, 2003. http://www.theses.fr/2003PA077220.
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Nars, Guillaume. „Dynamique fonctionnelle des protéines : études d'une lipase et d'une protéine A de la membrane externe de bactérie“. Thesis, Toulouse 3, 2015. http://www.theses.fr/2015TOU30111/document.
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La compréhension de la fonction des protéines et des systèmes biologiques passe par une connaissance fine des mécanismes moléculaires sous-jacents. La cristallographie et la résonance magnétique nucléaire permettent d'appréhender ces mécanismes au niveau atomique en fournissant des informations sur la structure et sur la dynamique des macromolécules biologiques. Nous nous sommes ainsi intéressés à deux protéines, la lipase lip2 de la levure Yarrowia lipolytica et la protéine membranaire OmpA de la bactérie Klebsiella pneumoniae. Nous avons recherché des conditions d'expression de la protéine lip2 marquée uniformément ou spécifiquement sur une boucle (appelée " lid ") afin d'en étudier la dynamique. Des conditions de marquage uniforme à l'azote 15 de lip2 recombinante dans Yarrowia lipolytica ont été mises au point, mais le marquage acide aminé spécifique n'a pu être réalisé à cause de phénomènes de dilution isotopique trop importants dans cette levure. Nous avons résolu par cristallographie aux rayons X la structure du domaine C-terminal de la protéine OmpA et étudié sa dynamique en solution par RMN (techniques de relaxation 15N). Nous avons caractérisé la dynamique de son domaine N-terminal membranaire reconstitué en liposomes par RMN du solide : en utilisant la rotation à l'angle magique à 60kHz et à la détection 1H sur un spectromètre 1 GHz, nous avons pu attribuer une majorité des résonances du tonneau ? et établir un profil de paramètre d'ordre des vecteurs NH. Des expériences de protéolyse ménagée ont révélé par ailleurs un site de coupure unique à la trypsine au sein de la boucle extracellulaire L3. Enfin, une première caractérisation de la protéine complète exprimée dans la membrane externe d'Escherichia coli a été entreprise par RMN du solide sur membranes externes nativesUnderstanding the function of proteins and biological systems requires an accurate knowledge of the underlying molecular mechanisms. Crystallography and nuclear magnetic resonance provide a detailed description of these mechanisms, with an atomic resolution, by providing data on both structures and motions. We investigated two proteins, the lip2 lipase from the yeast Yarrowia lipolytica and the membrane protein OmpA from the bacteria Klebsiella pneumoniae. We tried to produce lip2 with uniform and amino-acid specific stable isotope labelling on its functional loop (the lid) for NMR experiments. The homologous recombinant expression in Yarrowia lipolytica turned out to be the most efficient for uniform labelling but failed for specific labelling due to extensive isotope scrambling. We solved the structure of OmpA C-terminal domain by X-ray crystallography, and analyzed its dynamics in solution by NMR (15N relaxation techniques). We characterized its transmembrane N-terminal domain in proteoliposomes by solid state NMR: using state of the art ultra-fast MAS (60 kHz), 1H detection and a 1 GHz spectrometer, we could assign most ?-barrel resonances and establish a NH order parameter profile. In a complementary approach, we used proteolysis to reveal a unique trypsin cleavage site on the extracellular loop 3. Finally, a first characterization of the full-length protein expressed in the outer membrane of Escherichia coli was initiated by solid state NMR on intact outer membranes
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Raymond, Frédérique. „Purification et caractérisation moléculaire de la protéine naturelle et recombinante P30 (SAG-1) de Toxoplasma gondii“. Lyon 1, 1998. http://www.theses.fr/1998LYO10053.
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Dans le domaine de la sante publique, la toxoplasmose est un probleme epidemiologique d'importance chez les femmes enceintes et les malades immunodeprimes. Le role antigenique majeur d'une proteine membranaire de toxoplasma gondii de 30 kda (p30 ou sag-1) a ete largement decrit. L'integration de cette proteine dans un kit de detection des immunoglobulines humaines antitoxoplasmiques presente un interet diagnostique. A cette fin, le gene de la p30 a ete clone et exprime chez la levure schizosaccharomyces pombe sous deux formes : p30 recombinantes glycosylee et non glycosylee (a 0,7 g/ml dans le milieu). Le but de ce travail a d'abord consiste a optimiser la culture de ces deux souches pour obtenir un niveau d'expression de proteines recombinantes acceptable. Ainsi, la fermentation en continu permet d'obtenir une biomasse superieure a celle observee lors de fermentations en batch. Puis les techniques chromatographiques (echange d'ions et immunoaffinite) permettant la capture et la purification des proteines a partir du milieu de fermentation ont ete testees a l'echelle analytique (5 a 50 ml). Pour l'industrialisation (2 a 4 litres) de ces deux etapes, trois strategies de purification ont ete comparees : - clarification et concentration du milieu avant les chromatographies ; - clarification et purification par chromatographies conventionnelles en colonne remplie ; - purification des milieux bruts, directement en sortie de fermenteur, par chromatographie en lit fluidise, en utilisant le systeme streamline. La premiere etape de purification sur sulfo-propyl permet d'obtenir un rendement variant de 50 a 95%, pour un facteur de purification de 3 a 100. La deuxieme etape de polissage par immunoaffinite presente un rendement d'environ 50% pour un facteur final de purification de 500 a 7000. La proteine est obtenue avec une purete de l'ordre de 80%. Enfin, la caracterisation moleculaire des p30 recombinantes et de la p30 native extraite de t. Gondii a ete realisee (etude serologique, electrophorese 2d, spectrometrie de masse, sequencage). Ce travail a permis d'une part le developpement de techniques de fermentation et de purification de p30 recombinantes transposables a l'echelle industrielle, et d'autre part l'evaluation de l'activite antigenique de p30 recombinante pour le diagnostic de la toxoplasmose.
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Juvin, Véronique. „Caractérisation pharmacologique du canal TRPV2 recombinant et analyse des fonctions de la protéine endogène dans les cellules immunitaires“. Montpellier 1, 2007. http://www.theses.fr/2007MON1T016.
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Les protéines constituant la famille des TRP (pour Transient Receptor Potential) sont des canaux cationiques non spécifiques perméables au calcium. Ils sont exprimés dans de nombreux tissus et jouent un rôle essentiel dans la régulation de multiples fonctions physiologiques, en particulier dans les cellules non excitables. Le canal TRPV2 appartient à la sous-famille des TRP vanilloïdes. Peu d'informations sont disponibles sur ses propriétés fonctionnelles et ses modes d'activation, notamment en raison du manque d'outils pharmacologiques spécifiques du canal. Le premier objectif de ce travail a donc été de caractériser le profil pharmacologique de la protéine recombinante. Le développement d'un modèle de criblage pharmacologique a permis de déterminer un ensemble de molécules capables d'inhiber l'activation du canal TRPV2 induite par le 2- aminoethoxydiphenyl borate (2APB). Les orthologues de souris, de rat et humains présentent cependant des différences de sensibilité au 2APB, en effet le canal humain est totalement insensible. L'étude structure-fonction basée sur la construction de chimères entre les canaux murins et humains a permis d'identifier les déterminants moléculaires responsables de la sensibilité au 2-APB du canal de souris. Ce criblage a aussi abouti à l'identification des premiers composés endogènes connus capables d'activer le canal, les lysophospholipides. En parallèle, nous avons mis au point des outils moléculaires spécifiques afin d'étudier la fonction de la protéine endogène exprimée dans les cellules immunitaires. Par la stratégie d'interférence ARN, nous avons révélé l'implication du canal TRPV2 humain dans la fonction de chimiotactisme des leucocytes.
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Gomord, Véronique. „Contrôle de l'adressage de la sporamine dans la cellule végétale“. Rouen, 1994. http://www.theses.fr/1994ROUES054.
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Le système endomembranaire ou système de sécrétion est constitué de compartiments spécifiques et distincts et de vésicules qui assurent le transport entre ces différents compartiments. Les protéines sécrétées, solubles ou membranaires, sont introduites de façon co-traductionnelle dans le réticulum endoplasmique (RE). Du RE, ces protéines sont transportées tout au long du système endomembranaire de sécrétion jusqu'à leur compartiment cible: l'appareil de Golgi, la vacuole le tonoplaste, la membrane plasmique ou le compartiment extracellulaire. Des travaux récents ont permis d'identifier des signaux spécifiques d'adressage et de rétention qui par leur interaction avec des récepteurs, permettent le transport de certaines protéines vers leur localisation finale. Nos travaux font appel aux approches de la biologie cellulaire et moléculaire pour l'étude du transport et de l'adressage des protéines dans le système endomembranaire de sécrétion chez les plantes. Nous avons modifié par mutagénèse dirigée les signaux d'adressage d'une protéine recombinante modèle, la sporamine. De plus nous avons développé un système d'expression stable de ces protéines recombinantes dans des cellules de tabac (nicotiana tabacum CV BY2). Nous avons ainsi obtenu des cellules transgéniques exprimant fortement une même protéine modèle transportée vers la vacuole (sporamine), vers le milieu extracellulaire (dpro-sporamine) ou retenue dans la fraction microsomale (SpoHDEL ou dproHDEL). L'étude de la localisation intracellulaire de SpoHDEL a permis de montrer l'accumulation de cette protéine dans un compartiment présentant une activité IDPase
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Souabni, Hager. „Modulation de l’activité du flavocytochrome b₅₅₈ : étude fonctionnelle“. Thesis, Paris 11, 2014. http://www.theses.fr/2014PA112036/document.
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Le complexe NADPH oxydase est un élément essentiel de l’immunité inné. Présent dans les cellules phagocytaires (neutrophile), sa fonction est de produire massivement, dans le phagosome, des anions superoxyde et générer ainsi des espèces encore plus réactives de l’oxygène qui vont détruire acides nucléiques, lipides et protéines des bactéries phagocytées. Le cœur membranaire catalytique du complexe NADPH oxydase est constitué d’un hétérodimère membranaire, le cytochrome b₅₅₈ (Cyt b₅₅₈). Après activation de celui-ci par les partenaires protéiques cytosoliques p47phox, p67phox, p40phox et Rac, une succession de réactions de transferts d’électron de part et d’autre de la membrane a lieu au sein du Cyt b₅₅₈ pour aboutir à la réduction du dioxygène de manière très contrôlée. Afin de mieux comprendre cette régulation, nous nous sommes d’abord intéressés aux stéreoisomères trans de l’acide arachidonique, activateur naturel de cet enzyme (cis), sur le fonctionnement de la NADPH oxydase et avons abordé cette étude parallèlement sur du Cytb₅₅₈ d’origine bovine présent dans des membranes de neutrophiles et dans des membranes de levures exprimant le Cytb₅₅₈ de manière hétérologue. Nous avons montré que la géométrie joue un rôle important sur l’activation du complexe enzymatique. Dans un deuxième temps, afin d’étudier le rôle de l’environnement membranaire sur le fonctionnement de la NADPH oxydase, nous avons déterminé les propriétés cinétiques et thermodynamiques de l’activité NADPH oxydase du Cytb₅₅₈ recombinant exprimé en levures, purifié, puis reconstitué en liposomes de composition lipidique variée. Après comparaison avec ces mêmes propriétés obtenues pour le Cytb₅₅₈ dans les membranes plasmiques et du réticulum endoplasmique de levures, nous avons montré que l’activité NADPH oxydase très sensible à la température peut être modulée par la composition et l’état physique de la membraneNADPH oxidase complex is a major actor of both antimicrobial host defense and inflammation by generating highly regulated superoxide anion, rapidly converted into reactive oxygen species (ROS). The NADPH oxidase complex consists of a heterodimeric integral membrane flavocytochrome b₅₅₈ and three cytosolic components p67phox, p47phox and p40phox, and the small GTP binding protein Rac. In response to a cellular stimulus, cytosolic proteins are recruited to the phagosomal membrane where they are assembled with the Cytb₅₅₈ to form the active NADPH oxidase. The aim of the work was to better understand the modulation of superoxide anion production by this enzyme. For this purpose, we performed experiments with both bovine neutrophil membranes and yeast membranes expressing the bovine recombinant Cytb₅₅₈. We first investigated the effect of the trans-isomerization of the cis-arachidonic acid, the activator of NADPH oxidase in vitro and showed that specific geometry of the activator plays an important role in the activation of the complex. We also studied the role of the membrane environment on the functioning of NADPH oxidase and determined the kinetics and thermodynamics of NADPH oxidase activity depending on the lipid composition of Cytb₅₅₈ proteoliposomes. Comparison with these properties obtained with recombinant Cytb₅₅₈ embedded into endoplasmic reticulum and plasma membranes, we showed that the NADPH oxidase activity is highly temperature dependent and can be modulated by the lipid environment and the physic state of the membrane
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Noizet, Mildred. „Etude d'une protéine recombinante impliquée dans la formation de structures menbranaires : expression de la protéine de fusion IBV M-GUS dans des cellules de tabac“. Compiègne, 2001. http://www.theses.fr/2001COMP1348.
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La production de protéines hétérologues dans les plantes est maintenant possible grâce à la technique de transfert de gènes. Néanmoins, le rendement reste faible et nécessite d'être amélioré. L'adressage et la séquestration dans un compartiment cellulaire particulier est un moyen de favoriser la stabilité des protéines recombinantes et donc d'augmenter leur taux de production. Un nouvel organite observé dans les cellules de tabac transformées par le gène chimérique ibv m- gus pourrait devenir un lieu de stockage intéressant. Cet organite est constitué de tubules de réticulum endoplasmique superposées et enroulées formant une structure concentrique de diamètre d'environ 1,5 pm. Sa formation serait la conséquence d'un mécanisme d'auto-assemblage induit par les propriétés de tétramérisation de la protéine GUS qui permettrait un rapprochement des membranes. Ce système, déjà mis en évidence par une autre équipe, a été reproduit sur le cultivar de tabac SRI. Différents tissus différenciés (feuilles et racines) et indifférenciés (cals) ont été étudiés afin de mettre en évidence la plus forte expression de la protéine 1BV M- GUS. Les tissus indifférenciés, sous forme de cals, semblent accumuler des organites artificiels en grandes quantités. Ce phénomène est particulièrement intéressant sachant la rapidité de croissance des cellules indifférenciées. Après la mise en suspension cellulaire des cals, l'étude de ces cellules au cours d'un cycle de culture a montré une augmentation de l'expression du gène ibv m-gus au cours de la culture avec une forte expression en phase stationnaire de croissance, correspondant à une accumulation des protéines 1BV M-GUS. Celles-ci semblent protégées des dégradations par leur insertion dans la membrane des organites adificiels. L'utilisation de ces compartiments cellulaires serait susceptible d'ouvrir de nouveaux horizons pour la production et la récupération de protéines recombinantes stables dans les plantes.
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Aïnciburu, Mireille. „Développement et caractérisation d'outils pour l'étude des kallicréines tissulaires humaines : application en recherche fondamentale et clinique“. Tours, 2007. http://www.theses.fr/2007TOUR3322.
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Al, Bazzal Ali. „Etude structurale et fonctionnelle de la protéine PB1-F2 de différents virus grippaux“. Paris 7, 2012. http://www.theses.fr/2012PA077102.
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La protéine PB1-F2 est codée par un cadre de lecture alternatif du segment codant PB1 des virus Influenza. PB1-F2 est impliquée dans l'induction de l'apoptose et ciblerait la mitochondrie en interagissant avec le complexe pore de transition de perméabilité mitochondrial (PTP). Dans ce travail, les variants PB1-F2 ont été produits sous forme recombinante et purifiés par gel filtration grâce à une étiquette His-tag. Le comportement de la protéine renaturée a été étudié par dichroïsme circulaire dans des milieux d'hydrophobicité croissante. PB1-F2 est désordonnée en milieu aqueux, elle adopte une structure en feuillet-ß et se polymérise lorsqu'on augmente l'hydrophobicité relative du milieu. PB1-F2 forme des fibres amyloïdes dans certaines conditions d'hydrophobicité et perméabilise des membranes lipidiques. PB1-F2 induit une ouverture du PTP des mitochondries. Cette ouverture a été inhibée par des inhibiteurs spécifiques des VDAC et de TANT. Cette protéine provoque un gonflement matriciel et une chute du potentiel de membrane mitochondrial (Δψm) dépendante de PTP. Les inhibiteurs des protéines du PTP empêchent la chute du potentiel de membranes mitochondrial et le gonflement matriciel induits par PB1-F2. Des formes tronquées de PB1-F2 dans sa région C-terminale ont montré des effets de dépolarisation et de gonflement des mitochondries différents, ce qui a permis d'identifier une région de PB1-F2 impliqué dans les effets observés sur les mitochondries. L'ensemble de ces résultats suggère que PB1-F2 se structure dans un environnement membranaire et exerce une activité mitochondriotoxique nécessitant l'ouverture du PTP, probablement en ciblant ANT et/ou VDACPB1-F2 protein is encoded by an alternative reading frame in the PB 1 segment of influenza virus. PB1-F2 is involved in the induction of apoptosis and would target the mitochondria by interacting with the pore permeability transition pore complex (PTP) of the mitochondrial. In this work, the variants of PB1-F2 were produced in bacteria and purified by gel filtration using a His-tag. The behavior of the renatured protein was studied by circular dichroism in media have an increasing hydrophobicity. PB1-F2 is disordered in an aqueous medium, it adopts a ß-sheet structure and polymerizes with increasing hydrophobicity of the medium. PB1-F2 forms a amyloid fibers under some hydrophobic conditions and permeabilizes lipid membranes. PB1-F2 induces PTP opening in mitochondria. This opening was inhibited by specific inhibitors of VDAC and ANT. This protein causes swelling matrix and a fall of mitochondrial membrane potential (Δψm)) dependent of PTP. The specific inhibitors of PTP proteins prevent the collapse of mitochondrial membrane potential and matrix swelling induced by PB1-F2. Truncated forms of PB1-F2 in its C-terminal region showed effects of depolarization and mitochondrial swelling different, which identified a region of PB1- F2 involved in the observed effects on mitochondria. All these results suggest that PB1-F2 structure in a membrane environment and carries out an mitochondriotoxic activity requiring PTP opening, probably by targeting ANT and / or VDAC
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Cabanes-Macheteau, Marion. „N-glycosylation d'un anticorps recombinant produit dans du tabac transgénique“. Rouen, 1998. http://www.theses.fr/1998ROUES071.
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La production de protéines recombinantes d'intérêt thérapeutique dans des plantes transgéniques connaît actuellement un essor considérable. En outre, des anticorps monoclonaux fonctionnels ont pu être exprimés dans du tabac transgénique. La plupart des protéines d'intérêt sont N-glycosylées et cette N-glycosylation est fondamentale à l'acquisition par la protéine de la conformation active. Afin d'évaluer la capacité des cellules de tabac à glycosyler des protéines recombinantes complexes, nous avons analysé dans un premier temps, la N-glycosylation de glycoprotéines endogènes de tabac, ainsi que la N-glycosylation d'une glycoprotéine modèle, l'invertase de carotte, exprimée de façon recombinante dans des cellules de tabac en culture. Puis, nous avons analysé la N-glycosylation d'un anticorps de souris, l'anticorps Guy's 13, dont l'expression dans du tabac transgénique a été réalisée par l'équipe de J. Ma (Guy's Hospital, Londres). Nous avons comparé la N-glycosylation des deux sites de N-glycosylation de l'anticorps Guy's 13 produit chez la souris ou dans du tabac transgénique. Cette étude a permis de démontrer que bien que les structures des N-glycannes diffèrent, la N-glycosylation introduit par la plante transgénique sur l'anticorps recombinant, est suffisante à l'acquisition d'une structure fonctionnelle. L'analyse structurale détaillée de l'anticorps recombinant associée aux résultats préliminaires obtenus par l'équipe de J. Ma sur l'activité biologique de cet anticorps, constitue la première étude comparée d'une glycoprotéine de mammifères produite dans une plante transgénique.
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Séguy, David. „Influence de l'hormone de croissance humaine recombinante sur l'absorption intestinale et le métabolisme protéique chez les patients adultes atteints d'un syndrôme de grêle court“. Paris 7, 2011. http://www.theses.fr/2011PA077094.
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L'hormone de croissance humaine recombinante (rhGH) associée ou non à la glutamine pourrait être bénéfique aux patients atteints de syndrome de grêle court (SGC) avec insuffisance intestinale Ce travail étudiait les effets de la rhGH chez ces patients. Douze patients âgés de 35±3 ans, atteint de SGC, hyperphagiques ont été randomisés en double aveugle croisé contre placebo. Ils recevaient la rhGH (0,05 mg/kg/j) et le placebo durant deux périodes de 3 semaines séparées par 1 semaine d'intervalle libre. Tous ont eu une étude de la masse non grasse et de l'absorption intestinale des macronutriments par la technique des plateaux dupliqués, tandis que 8/12 avaient et plus une étude de la cinétique de la leucine et de la glutamine par méthode des isotopes stables. Le rhGH augmentait la masse non grasse et l'absorption intestinale de l'énergie (+15±5%, P<0,002), de l'azote (+14±6%, P<0,04) et des hydrates de carbone (+10±4%, P<0,04). La leucine non oxydée disponible augmentait sous rhGH (P=0,012). En période nourri, la libération de leucine issue de la protéolyse était stable sous placebo et diminuait sous rhGH (P=0,012). A jeun comme nourri, le flux d'apparition (P<0,02), la synthèse de novo (P<0,02) et la concentration de glutamine augmentaient sous rhGH (P<0,03). Dans cette étude, la rhGH augmentait l'absorption intestinale des macronutriments, restaurait la diminution physiologique de la protéolyse à l'alimentation, et améliorait la disponibilité de la glutamine pour atteindre des seuils dépassant la norme. Ce bénéfice de la rhGH pouvait être atteint sans qu'il soit nécessaire de donner un apport supplémentaire de glutamine à ces patients hyperphagiques avec SGC sévèreRecombinant human growth hormone (rhGH) combined or not with glutamine might be beneficial in intestinal failure (IF) short bowel syndrome (SBS) patients. This work explored the effects of rhGH ir IF-SBS patients. Twelve IF-SBS (remnant length 48±37 cm) home parenteral nutrition-dependent hyperphagic patients aged of 35±11 years were randomized in a double-blind, placebo-controlled, crossover study. Patients received rhGH (0. 05 mg/kg/d) and placebo during two 3-week periods separated by 1 washout week. Fat-free mass and net intestinal absorption of macronutrients using 3-day duplicate diet method were assessed in the whole group and 8/12 underwent a measurement of whole body leucine and glutamine kinetics using stable isotope methodology. RhGH increased fat-free mass (P<0. 006), and intestinal absorption of energy (+15±5%, P<0. 002), nitrogen (+14±6%, PO. 04), carbohydrates (+10±4%, PO. 04) and fat (+12+8%, NS). Non oxidative leucine disposal was higher in both fasting and fed states with rhGH (P=0. 012). During the fed state, release of leucine from protein breakdown was unchanged with placebo but decreased with rhGH (P=0. 012). Both fasting and fed appearance rate (P<0. 02), de novo synthesis (P<0. 02), and plasma concentration of glutamine (P<0. 03) increased with rhGH upon placebo values. Thus in this study, rhGH increased intestinal absorption of macronutrients, restored the physiological decline in proteolysis to feeding, and enhanced glutamine availability towards the upper physiological range. This beneficit of rhGH could be achieved without the need of glutamine supplementation in IF-SBS hyperphagic patients
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Sans, Emmanuelle. „Étude du rôle de la protéine ICAM-1 dans l'extravasation des neutrophiles“. Grenoble 1, 2000. http://www.theses.fr/2000GRE10254.
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La diapedese leucocytaire est basee sur une cascade d'interactions adhesives etablies entre leucocytes et cellules endotheliales. L'adherence et la migration trans-endotheliale font intervenir des molecules adhesives de la superfamille des immunoglobulines, en particulier icam-1 dans l'adherence et pecam-1 dans la migration. La participation specifique de la proteine icam-1 a l'extravasation des leucocytes n'a jamais ete clairement demontree, du fait de son implication dans la phase precedente d'adherence, ainsi que de la multiplicite des recepteurs adhesifs presents sur l'endothelium. J'ai donc etabli un modele d'etude de l'adherence et de l'extravasation des neutrophiles, base sur l'utilisation de cellules cho recombinantes exprimant les proteines icam-1 et pecam-1 humaines, seules ou en combinaison. Ce modele m'a permis de demontrer le role specifique d'icam-1 dans la migration intercellulaire des neutrophiles et plus particulierement, l'implication de l'interaction fibriogene/icam-1 dans ce phenomene. La partie cytoplasmique d'icam-1 est indispensable pour cette fonction et met en jeu une voie de signalisation impliquant la proteine rho. Enfin, la mutation de l'acide amine d26 sur icam-1, qui est situe sur le site de liaison du fibrinogene, aboutit a l'inhibition de l'extravasation des neutrophiles.
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Jaunet, Titouan. „Modélisation et simulation de nouveaux inhibiteurs de Rad51 au sein d'une protéine de transport“. Thesis, Nantes, 2017. http://www.theses.fr/2017NANT4050/document.
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La protéine RAD51 est l’un des acteurs majeurs des mécanismes de la résistance et de la reconstruction des cellules cancéreuses. La modulation de son activité ouvre une nouvelle voie dans la lutte contre le cancer. De nouveaux inhibiteurs potentiels de RAD51 ont été recensés, notamment, les dérives du stilbène disulfonique (SD). Dans cette thèse, nous étudions ces inhibiteurs dans différents milieux (solvant et protéine). La première partie de cette thèse est dédiée à l’étude des propriétés physico-chimiques en solution des dérivés SD. À l’aide de spectres optiques expérimentaux et de simulations par calculs quantiques (DFT et TD-DFT), nous avons montré que les SD se présentent sous leur forme dianionique en condition physiologique et la prise en compte du couplage vibronique est cruciale pour simuler des bandes des spectres d’absorption. La seconde partie se focalise sur la modélisation du complexe SD2- en interaction avec la protéine de transport albumine sérique humaine (ASH), qui joue un rôle prépondérant dans le transport de molécule au sein du corps humain. Elle apparaît être un excellent candidat pour acheminer des inhibiteurs SD2- vers les cellules cancéreuses. Sans donnée cristallographique du complexe ASH-SD2-, la modélisation moléculaire est le seul outil prédictif utilisable pour obtenir des données structurales, et nous avons associé ici des méthodes de docking moléculaire et de dynamique moléculaire. Cette méthodologie nous a permis (i) d’identifier le(s) résidu(s) important(s), (ii) d'évaluer les énergies d'interaction par des calculs MM-GBSA et (iii) d'identifier les sites d’accueil les plus adéquats pour les composés de type SD2-In this PhD thesis, the SD behavior is studied in various environments (in solution and within protein). In the first part, the physico-chemical properties of SD molecules in solution are explored in a joint experimental and theoretical (DFT and TD-DFT) investigation. The latter demonstrates the dianionic nature of SD compounds in physiological conditions and indicates that accounting for vibronic coupling is crucial to reproduce the bandshape of the absorption spectra. The second part is focused on the modeling of SD2- complexes within a carrier protein, the human serum albumin (HSA), which is essential for the drug transport process through the human body. HSA appears to be an excellent candidate to carry SD2- compounds into cancer cells. Without any cristallographic structure of HSA-SD2- complex, molecular modelling is the only predictive tool to obtain structural data. We performed molecular docking and molecular dynamic methodology to (i) identify the key residues, (ii) investigate the complex energies by MM-GBSA calculations and (iii) determine the most potent binding sites to host SD2- derivatives
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Magellan, Hervé. „Chitine synthase IIIa de Botrytis cinerea : études structurale, fonctionnelle et recherche d'inhibiteurs“. Paris 6, 2008. http://www.theses.fr/2008PA066186.
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Dans la lutte contre le développement du champignon Botrytis cinerea, on a choisit de choisir comme cible d’étude l’une de ses 8 chitines synthase, la CHSIIIa dont la délétion du gène entraîne une perte de pathogénicité importance de 70%. Des motifs conservés qui seraient essentiels pour l’activité enzymatique ont été identifiés sans sa partie centrale, nommée CHSIIIa-423. La protéine tronquée CHSIIIa-423 a été produite chez E. Coli. Cette protéine ne possède pas d’activité CHS, en revanche un complexe spécifique CHSIIIa-423/UDP-GlcNAc est possible. L’importance des résidus supposés essentiels pour la formation du complexe a été étudiée par mutagenèse dirigée. D’autre part, il a également été envisagé de produire la CHSIIIa entière chez S. Cerevisiae dans le but de la caractériser biochimiquement et structurellement mais aussi de trouver des inhibiteurs spécifiques. Enfin le criblage d’une chimiothèque a été réalisé. Les molécules anti CHS les plus prometteuses ont été testées employées pour voir leur effet sur le développement de Botrytis cinerea.
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Guizani, Ikram. „Analyse biochimique de la protéine immortalisante du virus polyome et expression des oncogènes viraux à partir de recombinants vaccinaux“. Nice, 1986. http://www.theses.fr/1986NICE4012.
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Betemps, Dominique. „Production de protéines recombinantes en système colibacille pour le virus de l'immunodéficience bovine et la protéine prion“. Lyon 1, 2001. http://www.theses.fr/2001LYO10252.
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Nous avons utilisé le système colibacille pour produire des protéines de fusion avec un polypeptide de six histidines, dans le cas du virus de l'immunodéficience bovine et des maladies à prion. L'impact de l'infection par le VIB (Virus de l'Immunodéficience Bovine) sur le statut sanitaire des troupeaux est peu connu en France. Une protéine recombinante correspondant à la protéine p26 de la capside du (VIB) a été produite pour développer un test de dépistage sérologique des animaux infectés par ce virus. Le fragment du gène gag codant pour la protéine p26 a été cloné dans le vecteur d'expression pMH79, en aval d'une séquence codant pour six histidines, et a permis d'obtenir la protéine de fusion (His)6p26, purifiée par chromatographie sur résine par affinité avec des ions métalliques bivalents. Nos travaux montrent que la protéine (His)6-p26 recombinante est reconnue spécifiquement par des sérums issus de lapins et de bovins infectés expérimentalement avec la souche originelle R29 du VIB, en western blot ainsi qu'en l'ELISA. Dans le cas des sérums de bovins, les anticorps dirigés contre la protéine recombinante apparaissent dès la troisième semaine après l'inoculation, et se maintiennent à un taux détectable au moins un an après l'infection. Les Encéphalopathies Spongiformes Subaigue͏̈s Transmissibles (ESST), ou maladies à prion, sont des maladies neuro-dégénératives, touchant aussi bien l'homme que l'animal. L'agent infectieux responsable de ces maladies serait composé de la protéine PrPsc elle-même, qui s'accumule dans le cerveau de l'hôte. Cette protéine correspond à une forme anormale, résultant d'une modification post-traductionnelle d'une protéine PrPc (PrP cellulaire) codée par l'hôte. Nous nous sommes proposés de produire en colibacille les protéines prion ovine et murine, de les caractériser au niveau immunologique, et d'essayer d'obtenir une réponse anticorps chez des souris PrP0/0, dépourvues du gène prion. Nous avons mis en évidence des différences de réactivité des sérums polyclonaux produit chez la souris PrP0/0, vis-à-vis de la PrPres (PrP résistante à la protéinase K) de différentes espèces (bovine, ovine et murine). Ces deux sérums reconnaissent les trois glycoformes de PrPres, selon un profil différent de celui obtenu avec un sérum dirigé contre la séquence peptidique bovine 106-121.
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Schaeffer, Étienne. „Etude des modifications post-traductionnelles de la protéine ATF7“. Thesis, Strasbourg, 2014. http://www.theses.fr/2014STRAJ017/document.
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L’objectif de ces travaux de thèse est l’étude des modifications post-traductionnelles de la protéine ATF7. Cette protéine est phosphorylée sur les résidus thréonine (T) 51, T53 et T112 lorsque les cellules subissent un stress (UVs, choc osmotique). Cela permet à la protéine d’être active transcriptionnellement. En absence de stress une fraction de la protéine ATF7 est sumoylée et cela induit une inhibition de son activité transcriptionnelle. Le premier projet consiste à développer des outils qui permettent l’étude de la forme sumoylée de la protéine ATF7. Ces travaux ont permis l’élaboration de scFv-bispécifiques tétramériques qui permettent la reconnaissance simultanée de la protéine ATF7 et de la protéine SUMO1. L’autre projet principal était l’étude du rôle de la phosphorylation de la T112 en absence de stress. Les travaux menés au laboratoire ont permis de montrer que cette thréonine est phosphorylée pendant la phase M du cycle cellulaire et que cet événement est conduit par une autre voie de phosphorylation que la voie du stress et met en jeu la CDK1The objective of this thesis work was is the study of post-translationnal modifications (PTM) of the protein ATF7. This protein is phosphorylated on several threonine (T) residues upon stress (UVs, osmotic chock). This allows the protein to be transcriptionally active. In the absence of stress, a fraction of the protein is sumoylated resulting in an inhibition of its transcriptional activity. The first project raise to the development of tools that will enable the study of the sumoylated form of ATF7 protein. This work raise to the development of tetrameric bispecific scFv possessing a simultaneously recognizing ability of the proteins ATF7 and SUMO1. The other main project was the study of ATF7 T112 phosphorylation in the absence of stress. The experiments drove in the lab have shown that thus threonine is phosphorylated during mitosis by a specific pathway, which includes the CDK1
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Poupart, Pascale M. „Contribution à l'étude du rôle physiologique de la protéine 26 kDa humaine: régulation de l'expression du gène correspondant, production de la protéine recombinante et évaluation de ses activités biologiques“. Doctoral thesis, Universite Libre de Bruxelles, 1987. http://hdl.handle.net/2013/ULB-DIPOT:oai:dipot.ulb.ac.be:2013/213465.
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Montigny, Cédric. „Etudes fonctionnelles et structurales de l'ATPase-Ca2+ du réticulum sarcoplasmique de lapin et de la protéine recombinante exprimée chez Saccharomyces cerevisiae“. Paris 6, 2009. https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00430785v2.
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L’ATPase-Ca2+ SERCA1a est une protéine membranaire qui permet le transport actif de deux calcium depuis le cytosol vers la lumière du réticulum. L’obtention récente de nombreuses structures à résolution atomique a été un atout majeur pour comprendre son cycle catalytique, les formes cristallisées de cette enzyme en absence de calcium ayant été obtenues en présence d’un inhibiteur. Nous avons montré, que l’interaction de la protéine avec ces inhibiteurs, avait induit des biais significatifs dans certaines formes cristallisées jusqu’en 2006. Nos résultats ont stimulé la recherche de structures nouvelles, dont l’analyse a pleinement confirmé nos conclusions. L’utilisation de ces inhibiteurs pendant la cristallisation de la protéine solubilisée était jusque là jugée utile pour la stabiliser en présence de détergent. Utilisant le glycérol pour ralentir cette inactivation, nous avons mis en évidence des conséquences de l’interaction avec l’ATPase de deux détergents. Nous avons également étudié trois mutants de l’ATPase, purifiés après expression hétérologue dans la levure S. Cerevisiae. En parallèle, nous avons l’étudié les propriétés de fluorescence d’une forme particulière de l’enzyme SERCA1a marquée au FITC dans son site nucléotidique, montrant une phosphorylation inattendue du FITC lié, cette phosphorylation impliquant une réorganisation des domaines cytosoliques de l’ATPase lors du relargage des ions calcium. Dans nos conditions expérimentales, nous avons tenu compte de la possible chélation des cations divalents interagissant avec l’enzyme par les molécules anioniques présentes. Nous avons vérifié que le magnésium n’était PAS chélaté par le tampon MOPS, contrairement à ce qui était écrit dans certaines tables de constantes d’association. En collaboration, nous avons aussi précisé les complexes formés par association entre le cadmium et le glutathion réduit, afin de mieux comprendre quels complexes pourraient se former au cours de la détoxication cellulaire du cadmium.
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Laden, Christine. „Construction d'un vaccin anticancer de type glycoconjugué et évaluation des propriétés lectiniques de la protéine recombinante OmpA de Klebsiella pneumoniae“. Lille 1, 2001. https://pepite-depot.univ-lille.fr/LIBRE/Th_Num/2001/50376-2001-285-286.pdf.
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Les variations de glycosylation les plus fréquemment observées au niveau des cellules tumorales, sont portées par les O-glycosylprotéines de type mucine. Ces altérations donnent lieu à des glycosylations aberrantes conduisant à l'expression d'antigènes glucidiques, tels que l'antigène sialyl-Tn (NeuAca2-6GalNAca1-OSer/Thr). Fréquemment exprimés dans les tissus malins et rarement dans les tissus normaux, ils sont considérés comme marqueurs de tumeurs et sont très utilisés dans l'immunothérapie anticancéreuse. Dans un premier temps, nos études ont porté sur la construction d'une néoglycoprotéine utilisable dans une stratégie de vaccination anticancéreuse. Nous avons alors développé une procédure de purification de glycopeptides sialyl-Tn, basée sur une méthode de chromatographie séquentielle. Nous montrons que la néoglycoprotéine, préparée par la conjugaison des glycopeptides sialyl-Tn sur la protéine P40, protéine recombinante de l'OmpA de Klebsiella pneumoniae, est capable d'induire une réponse immune significative chez la souris. Nos résultats suggèrent que la protéine recombinante P40 est capable d'induire une réponse anticorps, dirigée contre des antigènes glucidiques marqueurs de tumeurs. Dans une deuxième étape, nous avons montré que la protéine recombinante P40 ne présentait pas de propriété lectinique, contrairement à ce que nous pouvions attendre d'une protéine bactérienne membranaire. Mais les propriétés immunologiques ainsi que celles de protéine porteuse de la protéine bactérienne recombinante P40, en font une alternative attractive pour son utilisation en vaccination anticancéreuse et anti-infectieuse.
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Alahmad, Youssef. „Développement et validation de méthodes reposant sur l'électrophorèse capillaire pour le contrôle qualité de protéines thérapeutiques : de l'albumine humaine issue du fractionnement plasmatique à l'interleukine-7 humaine recombinante“. Paris 11, 2010. http://www.theses.fr/2010PA114811.
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Les protéines thérapeutiques constituent une partie très importante des biomédicaments. Les protéines sont sujettes à des modifications structurales dues à une variété de mécanismes de dégradation. De plus, une protéine peut subir des modifications post-traductionnelles induisant une hétérogénéité structurale et fonctionnelle. Ainsi, le développement de méthodes analytiques capables de distinguer des formes structurellement très proches est nécessaire pour le contrôle qualité (CQ) de ces biomolécules. C’est donc dans ce contexte que l’électrophorèse capillaire (EC) s’implante progressivement dans les industries (bio)pharmaceutiques. Le but de cette thèse était de développer des méthodes séparatives reposant sur l’EC pour deux protéines d’intérêt thérapeutique, l’albumine du sérum humain et l’interleukine-7 humaine recombinante (rhIL-7). Ces méthodes doivent être capables de séparer et quantifier les différentes variants de l’albumine, ou les différentes glycoformes de rhIL- 7Therapeutic proteins are an important class of biopharmaceuticals. Proteins are prone to structural modifications due to a variety of degradation mechanisms. In addition, a protein may undergo during its biosynthesis numerous posttranslational modifications that induce a significant functional and structural heterogeneity. Thus, development of analytical methods able to distinguish similar structurally (related) forms must be implemented for the quality control (QC) of these biomolecules. In this context, a dramatic expands of capillary electrophoresis (CE) is observed in the biopharmaceutical industries. The aim of this thesis, focused on two therapeutic proteins, human serum albumin (HSA) from plasma fractionation and recombinant human interleukin-7 (rhIL-7, a glycoprotein), was to develop CE-based separation methods. These methods should be powerful and able to separate and quantify degraded forms of HSA, or rhIL-7 glycoforms for batch to batch consistency assessment
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Montigny, C. „Etudes fonctionnelles et structurales de l'ATPase-Ca2+ du réticulum sarcoplasmique de lapin et de la protéine recombinante exprimée chez Saccharomyces cerevisiae“. Phd thesis, Université Pierre et Marie Curie - Paris VI, 2009. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00430785.
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L'ATPase-Ca2+ du réticulum sarcoplasmique de muscle squelettique rapide (SERCA1a) est une protéine membranaire qui permet le transport actif de deux ions calcium depuis le cytosol jusque dans la lumière du réticulum. Depuis 2000, l'obtention de nombreuses structures à résolution atomique de cette enzyme a été un atout majeur pour comprendre son cycle catalytique (Toyoshima, Nakasako et al. 2000). Toutefois, avant 2007, les formes de cette enzyme cristallisées en absence de calcium avaient été obtenues en présence d'un inhibiteur fixé au domaine membranaire. Nous avons d'abord montré, notamment par des techniques de spectroscopie de fluorescence et de protéolyse ménagée, que l'interaction de la protéine avec ces inhibiteurs, qui rend l'ATPase incapable d'adopter certaines des conformations présentes au cours de son cycle catalytique, avait certainement induit des biais significatifs dans la structure de certaines des formes cristallisées avant 2007 (Montigny, Picard et al. 2007). Nos résultats ont stimulé la recherche de structures nouvelles, en absence ou en présence d'inhibiteurs, dont l'analyse a pleinement confirmé nos conclusions. L'utilisation de ces inhibiteurs pendant la cristallisation de la protéine solubilisée était jusque là jugée utile pour protéger celle-ci de son éventuelle inactivation irréversible en présence de détergent (Lund, Orlowski et al. 1989). Utilisant le glycérol pour ralentir cette inactivation, nous avons mis en évidence des conséquences inattendues de l'interaction de l'ATPase avec deux des détergents communément utilisés pour sa cristallisation, son isolement ou sa simple étude (Montigny, Arnou et al. 2008). En présence de glycérol, nous avons également pu étudier certains traits de fonctionnement de trois mutants de l'ATPase, purifiés après expression hétérologue dans la levure S. cerevisiae : un mutant d'un des sites de fixation du calcium (i.e. capable de fixer un seul des deux calciums) (Montigny, Arnou et al. 2008) et deux autres mutants bloquant l'enzyme dans des états particuliers du cycle catalytique (Marchand, Winther et al. 2008). Parallèlement à ces études, nous avons élucidé le mystère des propriétés de fluorescence anormales d'une forme particulière de l'enzyme SERCA1a marquée au FITC dans son site nucléotidique. Nous avons mis en évidence une phosphorylation imprévue du FITC lié, conduisant à une très faible fluorescence, particulièrement stable dans le temps. Les conditions de cette phosphorylation impliquent une réorganisation de l'orientation relative des domaines cytosoliques de l'ATPase lors de l'étape de relargage des ions calcium vers la lumière du réticulum (McIntosh, Montigny et al. 2008). Dans toutes nos études, il nous a fallu évidemment tenir compte de la possible chélation des cations divalents interagissant avec l'enzyme (calcium, magnésium, ...) par les anions présents. Par pH métrie et à l'aide de sondes colorées, nous avons vérifié que le magnésium n'était PAS chélaté par le tampon Mops classiquement utilisé, contrairement à ce qui était rapporté dans certaines tables de constantes d'association (Montigny and Champeil 2007). A cette occasion, mettant notre savoir-faire au service de collègues du laboratoire, nous avons également précisé les différents complexes formés par association entre le cadmium (Cd2+) et le glutathion réduit (GSH-) (Leverrier, Montigny et al. 2007), afin de mieux comprendre lesquels de ces complexes étaient le plus susceptibles de se former au cours de la détoxication cellulaire du Cd2+. Abréviations : ATPase, AdénosineTriPhosphatase ; SERCA1a, Sarco-Endoplasmic Reticulum Ca2+-ATPase, isoforme 1a ; FITC, fluorescéine isothiocyanate ; Mops, acide 4-morpholinopropanesulfonique.
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Roulet, Muriel. „Rôle du collagène V dans l'élaboration de matrice extracellulaire : production recombinante de la protéine, interactions moléculaires et tests fonctionnels in vivo“. Lyon 1, 2007. http://www.theses.fr/2007LYO10099.
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Le collagène V est faiblement représenté dans les tissus. Sa discrète présence tissulaire ne le confine cependant pas à un rôle insignifiant. De fait, des mutations sur ses gènes sont la cause chez l’homme de l’apparition du syndrome d’Ehlers-Danlos classique, caractérisé par une hyperétirabilité de la peau et une hypermobilité des articulations. Le projet de recherche qui m'a été confié visait à définir le rôle exact du collagène V dans l'élaboration de matrices extracellulaires fonctionnelles c'est-à-dire dont les propriétés biomécaniques et physiologiques sont préservées. Le développement de deux approches s’est avéré incontournable : (1) caractériser les interactions avec d'autres composants matriciels, en particulier les protéoglycannes, et définir leurs implications dans la fibrillogénèse, (2) générer des modèles murins par transgénèse pour mieux cerner le rôle de ce collagène in vivo au cours du développement. Un rôle isoforme- et tissu-spécifique a été dégagé pour ce collagèneAlthough being a quantitatively minor component of connective tissues, collagen V plays a crucial role in matrix organization. Mutations in human collagen V genes have been shown to be responsible for the classic type Ehlers-Danlos syndrome (EDS) which is characterised by skin laxity and joint hypermobility. The aim of my research project was to provide new insights on the role of collagen V in the elaboration of a functional extracellular matrix for which biomechanical and physiological properties are preserved. Two approaches that combine in vitro and in vivo experiments have been carried out : (1) interactions between collagen V and matrix components, namely the proteoglycans, were analyzed in order to determine their implication in fibrillogenesis regulation, (2) a functional analysis by generating transgenic mice has been performed to decipher the role of this collagen during development and in EDS pathophysiology. An isoform- and tissue-specific function has been drawn for this collagen
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Béchard-Dubé, Steffi-Anne. „Effets de l'environnement lumineux et de l'âge foliaire sur la croissance, la capacité photosynthétique et la production protéique chez Nicotiana benthamiana“. Master's thesis, Université Laval, 2015. http://hdl.handle.net/20.500.11794/26972.
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Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2015-2016Cette étude visait à caractériser la croissance, la capacité photosynthétique, la concentration en azote et protéines totales solubles, la production de protéines recombinantes (HA) ainsi que la quantité de lumière interceptée à différents stades de développement de plants de Nicotiana benthamiana afin d’optimiser la production de vaccins. L’évolution des réponses physiologiques étudiées fut similaire chez toutes les feuilles primaires, suggérant que le processus de sénescence s’initie et progresse de façon semblable indépendamment de leur ordre d’initiation. Toutefois, la superposition des patrons temporels de sénescence et de croissance foliaire a mené à un rendement HA maximal se situant invariablement dans la partie médiane du plant lorsqu’exprimé sur une base foliaire. À l’échelle du plant entier, nos résultats suggèrent qu’il est possible d’augmenter la production de vaccins en récoltant les plants à un stade de développement plus tardif, ou en augmentant la densité de culture et en récoltant ces plants plus tôt.
Nicotiana benthamiana is a wild relative of tobacco increasingly used as a plant protein expression platform to produce recombinant vaccine antigens against the influenza virus. Investigation on the physiological determinants of this production is essential to optimize and regulate vaccines production following a new flu outbreak. We examined the photosynthetic photon flux density, growth, light-saturated photosynthesis, total soluble protein, nitrogen content and recombinant protein production at different phenological stages. The similar evolution of the studied physiological responses suggested that the senescence process is initiated and progresses in a similar way in all primary leaves, regardless of the order of initiation. In contrast, the superposition of the time pattern of senescence with that of leaf growth shows that maximal HA yield expressed on a leaf basis is invariably located in the middle part of the plant. At the whole plant scale, our results suggest that it is possible to increase the production of antigens by harvesting plants at a later developmental stage, or by increasing plant density and harvesting these plants earlier.
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Moreau, Christophe. „Bases moléculaires et structurales de l’interaction entre deux calréticulines de parasite et la protéine humaine C1q“. Thesis, Université Grenoble Alpes (ComUE), 2015. http://www.theses.fr/2015GREAV021/document.
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Au cours de cette thèse, nous avons étudié plus particulièrement deux calréticulines de parasite et leur interaction avec la protéine C1q humaine, dans un contexte de détournement du système immunitaire. En effet, une stratégie de mimétisme moléculaire avec des cellules apoptotiques a été proposée pour l'exposition de calréticuline à la surface de la forme infectieuse du parasite Trypanosoma cruzi, agent vecteur de la maladie de Chagas. Dans le cas du parasite Entamoeba histolytica, agent vecteur de l'amibiase, l'interaction de C1q avec la calréticuline exposée à la surface de l'amibe est utilisée pour mieux phagocyter les cellules de l'hôte.La calréticuline est une protéine principalement localisée dans le réticulum endoplasmique où elle joue le rôle de protéine chaperonne en favorisant le repliement des protéines monoglucosylées. Une des fonctions extracellulaires de la calréticuline humaine est de favoriser l'élimination des cellules apoptotiques par les macrophages. Pour cela, la calréticuline est exposée à la surface des deux types cellulaires, à la surface desquelles elle est reconnue par C1q.Nous avons résolu la structure de fragments des deux CRTs de parasite. Des interactions de type chaperonne et un aperçu de la flexibilité du domaine P ont été observés dans l'empilement cristallin et approfondis par analyse de diffusion des rayons X aux petits angles. Ces fragments générés pour l'analyse structurale nous ont permis en plus d'identifier une région clé dans l'interaction des calréticulines avec C1q. Du côté de C1q, deux mutations dans les régions globulaires de C1q (GRC1q), inhibent l'interaction avec la CRT et les IgM, suggérant un site partagé. Pour approfondir la caractérisation de l'interaction, des études du complexe par RMN ont débuté et nous avons développé une première forme recombinante monocaténaire de GRC1q, dont nous avons déterminé la structure. Nos recherches peuvent aider à développer des traitements contre ces parasites, aussi bien qu'à décrypter le rôle de la CRT des mammifères présente à la surface des macrophages et des cellules apoptotiquesDuring this thesis, we were interested in two parasite calreticulin and their interaction with the human C1q protein in the context of the subversion of the immune system. Indeed, a molecular mimicry strategy with human apoptotic cells is suggested for the calreticulin exposure on the surface of the infectious form of the parasite Trypanosoma cruzi, which is responsible of Chagas' disease. In the case of the parasite Entamoeba histolytica, which is involved in amoebiasis, the interaction of C1q with the surface-exposed calreticulin is used to enhance phagocytosis of host cells.Calreticulin is mainly localised in the endoplasmic reticulum, where it acts as a chaperone protein to favour the folding of monoglycosylated proteins. Moreover one of the extracellular functions of human calreticulin is to enhance the clearance of apoptotic cells by macrophages. This function is mediated through C1q interaction with calreticulin exposed on the surface of both cells.We solved the structure of fragments of both parasite calreticulins. Chaperone-like interactions and an overview of the flexibility of the P domain were observed in the crystal packing and deepened using SAXS analyses. The fragments generated for X-ray crystallography studies allowed us to identify a key region of the interaction between C1q and the calreticulins. Two C1q mutations located in its globular regions (GRC1q) inhibit the interaction with calreticulin and IgM, suggesting a common binding area. To further characterise theses interactions, we started NMR experiments and we produced the first single-chain recombinant form of GRC1q, which allowed solving its structure at high-resolution. Our investigations could provide tools to develop therapies against these parasites, and to decipher the role of mammal CRT on the surface of macrophages and apoptotic cells
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Penna, Aubin. „Physiologie moléculaire du canal TRPV2 : analyse fonctionnelle de la protéine recombinante et implications du canal natif dans la biologie des cellules immunitaires“. Montpellier 1, 2005. http://www.theses.fr/2005MON1T011.
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Les sous-unités TRPs constituent une famille de canaux cationiques perméables au calcium dont les fonctions sont cruciales dans les cellules non excitables. Le canal TRPV2 appartient à la sous-famille des TRPs vanilloïdes, mais peu de données existent quant à ses fonctions. L'objectif de ce travail a été de caractériser les propriétés des canaux TRPV2 recombinants et natifs. L'analyse du canal TRPV2 recombinant a confirmé que son activité dépend de facteurs sériques et de la PI3-kinase ; son expression modifie l'homéostasie calcique conduisant à des phénotypes prolifératifs ou cytotoxiques. L'expression du canal TRPV2 natif est induite lors de l'activation des cellules immunitaires où il se localise dans les radeaux lipidiques et s'associe à un complexe supramoléculaire en relation avec la dynamique du cytosquelette d'actine. Des outils moléculaires ont été développés pour évaluer le rôle du canal TRPV2 dans l'homéostasie calcique des cellules immunitaires.
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Vallet, Virginie. „La sécrétogranine II dans l'hypophyse humaine : étude ontogénétique et caractérisation dans les adénomes hypophysaires par utilisation d'antisérums dirigés contre la protéine recombinante“. Rennes 1, 1995. http://www.theses.fr/1995REN10048.
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La secretogranine ii (sgii) est une proteine acide et sulfatee, contenue dans les granules de secretion de plusieurs glandes endocrines, dont l'hypophyse. L'adnc de la sgii humaine a ete isole et sequence en 1989 (gerdes et al. ) ; notre travail a ete consacre a l'expression de la sgii dans l'hypophyse saine et dans les adenomes hypophysaires humains. Nous avons isole un adnc de sgii humaine par pcr qui a ete caracterise par northern blot et sequencage. Une proteine de fusion gst-hsgii a pu alors etre exprimee en systeme bacterien et purifiee par chromatographie d'affinite. Nous avons prepare un antiserum contre la sgii humaine, par immunisation d'un lapin avec la gst-hsgii. Cet anticorps, caracterise dans un premier temps par western blot, a permis, dans un deuxieme temps une etude ontogenetique en immunohistochimie. Nous avons montre que la sgii est detectee de facon precoce au cours de la vie ftale, en meme temps que les premieres hormones hypophysaires, et que les cellules sgii-immunoreactives sont des cellules corticotropes. Cette localisation dans les cellules corticotropes a ete observee a tous les stades de developpement, y compris chez l'adulte. Par ailleurs, dans les cellules gonadotropes, l'immunoreactivite sgii apparait progressivement au cours de la vie ftale et ne semble pas retrouvee dans les cellules lactotropes a n'importe quel stade etudie. La meme distribution de la sgii a ete observee dans les cellules hypophysaires adultes ; concernant les autres types cellulaires, cette proteine n'a pas ete detectee dans les cellules somatotropes, mais l'a ete dans les cellules thyreotropes. Nous avons etudie l'expression de la proteine hsgii dans differents types d'adenomes hypophysaires. L'arnm a ete detecte dans tous les types de tumeurs alors que la proteine n'a pas ete retrouvee dans les adenomes lactotropes. Par ailleurs, nous avons detecte differentes proteines immunologiquement apparentees a la sgii (45 et 30 k). La preparation d'antiserums diriges contre differentes parties de la sgii nous a permis de montrer ulterieurement que ces peptides correspondent a des sequences centrales et c-terminales de la sgii. Enfin, nous avons mis en evidence, dans les adenomes non fonctionnels, une correlation de l'expression des genes sgii et sous-unite alpha, commune aux hormones glycoproteiques lh, fsh et tsh. Nous avons enfin realise une etude preliminaire sur des tumeurs neuroendocrines pancreatiques, duodenales et bronchiques. Notre etude suggere que la sgii pourrait constituer un marqueur ne supplementaire aux quelques marqueurs neuroendocrines actuellement utilises en anatomo-pathologie
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Le, Guillou-Guillemette Hélène. „Étude de la duplication du domaine V3 de la région NS5A du virus de l'hépatite C de génotype 1b : épidémiologie clinique et moléculaire et aspects fonctionnels“. Angers, 2014. https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-01784327/document.
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L'infection par le virus de l'hépatite C (VHC) est responsable d'hépatite chronique, de cirrhose et de carcinome hépatocellulaire. La protéine NS5A du VHC participe à la réplication et l'assemblage viral, et à l'oncogenèse. Notre étude a caractérisé un polymorphisme du domaine V3-NS5A du VI-IC de génotype 1b, découvert au laboratoire. Nous avons identifié une duplication en tandem sans rupture d'ORF du domaine V3 avec une prévalence de 3,050/0. La prévalence de cette souche augmentait avec la sévérité de la pathologie hépatique (de 3. 0% groupe sans cirrhose jusqu'à 9. 4% groupe cirrhose et CHC, p de tendance=0. 045). L'analyse des polymorphismes des séquences directes et clonales a montré que les souches dupliquées constituaient la totalité de la quasi-espèce et persistaient au moins 10 ans. Le mécanisme de duplication serait une recombinaison non-homologue entre souches de 2 populations sauvages. Nos résultats fonctionnels préliminaires ont suggéré des protéines partenaires spécifiques des protéines NS5A dupliquées par un crible en système double-hybride levure. Nous avons réalisé la production des protéines NS5A dupliquées en systèmes cellulaire et bactérien, avec une optimisation en système bactérien. Les premiers tests de pull down n'ont pas encore permis de valider les interactions. Nous avons identifié une duplication partielle V3-NS5A chez le VHC1b (i) potentiellement impliquée dans la carcinogenèse, (ii) présente durant l'intégralité de l'infection, (iii) issue d'une recombinaison non-homologue, évènement encore jamais décrit chez le VHC in vivo. Nos travaux ont aussi permis l'identification de partenaires cellulaires et la production des protéines NS5A dupliquéesThe hepatitis C virus (HCV) infection leads to chronic hepatitis, cirrhosis and hepatocellular carcinoma (HCC). The HCV NS5A protein has been shown to be involved in viral replication and assembly and in the liver carcinogenesis. We investigated a V3-NS5A polymorphism in HCV 1b identified in our laboratory. We found two \/3 domains tandemly duplicated without ORF disruption in 3. 05% of the HCV sequences. The prevalence of this duplication increased with liver disease severity (from 3. 0% in patients without cirrhosis to 9. 4% in patients with both cirrhosis and I-ICC, p for trend=O. 045). Direct sequencing and clonal analyzes showed that quasispecies were entirely composed by mutants strains that persisted at least for 10 years. These V3 duplications were likely resulting from a non-homologous recombination that occurred between two wild-type strains. Our preliminary functional results identified potential specific interactions between host-cell proteins and the V3-NS5A duplicated proteins using a yeast two-hybrid system. We expressed recombinant duplicated NS5A proteins in cell and bacterial cultures and developed an optimized protocol for bacterial cultures. A validation of the interactions has not been reached with the first pulldown assays. We identified a V3-NS5A duplication in HCV 1b for the first time (i) associated with unfavorable evolution of liver disease including a possible involvement in liver carcinogenesis (ii) always present during the HCV infection (iii) resulting from a non-homologous recombination, mechanism that has never been described in vivo in HCV. We also suggested potential specific protein-protein interactions and performed recombinant NS5A protein production
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Iochmann, Sophie. „Immunothérapie et immunoprophylaxie de la cryptosporidiose : expression de la protéine de 15/17 kda de Cryptosporium parvum en système procaryote et eucaryote et étude de la réponse immunitaire vis-a-vis de cette protéine recombinante“. Tours, 1995. http://www.theses.fr/1995TOUR3802.
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Kellermann, Guillaume. „Applications de la transduction des protéines : transfert de TPr-Met pour la transplantation cellulaire : identification d'un domaine de transduction dans la sous unité catalytique de la télomérase“. Paris 7, 2009. http://www.theses.fr/2009PA077028.
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Certaines protéines comme l'onconase ou le facteur TAT du virus du SIDA ont l'étonnante capacité de pouvoir pénétrer à l'intérieur des cellules malgré leur forte taille. Ces protéines, peuvent être internalisées spontanément par les cellules, car elles possèdent dans leur séquence, un domaine particulier appelé domaine de transduction. Dans la première partie de cette thèse, nous avons utilisé le domaine de transduction de TAT (VIH) pour vectoriser Tpr-Met, une protéine kinase qui agit sur la prolifération, la survie, la migration des cellules. Nous avons construit, exprimé et purifié une protéine chimérique TAT-Tpr-Met et avons mis au point sa renaturation in vitro. TAT-Tpr-Met pénètre dans plusieurs types cellulaires en culture et augmente la prolifération, la survie et la mobilité des cellules. Nous avons ensuite montré que le prétraitement de progéniteurs hépatiques avec cette molécule améliorait leur prise de greffe, après transplantation dans le foie de souris. Ce travail montre qu'il est possible d'utiliser un domaine de transduction pour modifier transitoirement les capacités d'intégration des cellules, sans altérer le génome. Dans la deuxième partie de cette thèse, nous avons construit une protéine fusion entre le domaine de transduction de TAT et la sous-unité catalytique de la télomèrase (hTERT). Au cours de ce travail, nous avons identifié un domaine de transduction naturel dans hTERT. Nous avons fait synthétisé ce domaine sous forme d'un peptide lié à FITC, et avons pu montrer qu'il avait la capacité d'être internalisé par les cellules humaines in vitro. Nous avons produit la sous unité catalytique de la télomèrase à partir de cellules d'insectes infectées par des baculovirus recombinants, et avons également mis au point un protocole pour purifier plusieurs milligrammes de cette protéine, ainsi que son variant dominant négatif, en l'exprimant dans la levure. Les études menées avec la protéine recombinante ont démontré que la protéine hTERT avait une capacité d'internalisation naturelle. Cette propriété suggère que la protéine hTERT, et son variant dominant négatif pourraient respectivement être utilisés comme activateur et inhibiteur de la télomèraseSome proteins such as onconase or TAT from the HIV have an amazing ability to penetrate inside the cells, despite their heavy size. These proteins can be internalized by the cells spontaneously, as they have in their sequence, a field called transduction domain. In the first part of this thesis, we used the domain of transduction from TAT (HIV) to vectorize TPR-Met, a protein kinase that acts on the proliferation, survival, cell migration. We built, expressed and purified chimeric protein TAT-TPR-Met and have developed its renaturation in vitro. TAT-TPR-Met enter s several cell types in culture and increases the proliferation, survival and mobility of cells. We then showed that pretreatment with liver progenitors of this molecule improved their presence into the liver after transplantation in the mouse. This work shows that it is possible to use a domain of transduction to change temporarily the integration capacity of cells, without altering the genome. In the second part of this thesis, we built a protein fusion between the protein transduction domain of TAT and the catalytic subunit of telomerase (hTERT) gene. During this work, we have identified a natural transduction domain in hTERT. We have made this area synthesized form of a peptide linked to FITC, and were able to show he had the ability to be internalized by human cells in vitro. We produced the catalytic subunit of telomerase from insect cells infected with recombinant baculovirus, and have also developed a protocol to purify several milligrams of this protein and its variant dominant negative, expressing in yeast. Studies with the recombinant protein showed that the protein hTERT had a natural ability to internalize. This property suggests that the protein hTERT and its dominant negative variant respectively could be used as activator and inhibitor of telomerase
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Hodroge, Ahmed. „Les mutations spontanées du gène Vkorc1 chez l’homme et le rat : réalité de la résistance“. Thesis, Lyon 1, 2011. http://www.theses.fr/2011LYO10281/document.
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Les anticoagulants antivitamines K (AVKs) sont des molécules qui par inhibition de l’activation des PVKDs, empêchent ou retardent la coagulation sanguine. Aujourd’hui, le traitement par AVKs est la première cause d’accidents iatrogènes médicamenteux chez l’homme. Cependant le bénéfice par rapport au risque étant largement supérieur. Elles sont également utilisées dans le contrôle des populations de rongeurs nuisibles. Les AVKs agissent en inhibant l’enzyme VKORC1. Des phénomènes d’hypersensibilité et de résistance aux AVKs sont apparus et plusieurs mutations spontanées ont été découvertes dans le gène vkorc1. Ces mutations ont alors été associées à la résistance sans que ce lien n’ait jamais été démontré. Le travail, présenté dans ce mémoire, a pour objectif de confirmer ou d’infirmer ces liens de causalité. Cette étude a permis de démontrer la responsabilité des mutations Leu120Gln, Leu128Gln et Tyr139Phe, Ser et Cys dans l’apparition du phénotype résistant aux AVKs de 1ère génération chez le rat sauvage. Les propriétés catalytiques expliquent de plus le coût biologique associé à l’apparition de cette résistance chez certaines lignées de rats sauvages. Ainsi, les mutations en position 139 sont responsables d’un détournement de la catalyse avec production majoritaire d’hydroxyvitamine K directement éliminable par l’organisme. Chez l’homme, 29 mutations sur 30 ont été caractérisées. Alors que ces mutations ont été observées chez des patients résistants aux AVKs, la causalité de ces mutations n’a été démontrée que pour 6 mutations (Ala26Pro, Val41Ser, Val54Leu, His68Tyr, Ile123Asn, Phe139His). Les autres mutations ne seraient pas responsables du phénotype observéThe antivitamines K (AVKs) are molecules which can be inhibiting the activation of PVKDs, preventing or delaying the blood clotting. Today, the treatment by AVKs is the first cause of iatrogenic accidents medicated in humans. In addition, the benefits are significantly higher than the risk so they are used to control the populations of rodent pests. The AVKs are acting as inhibitor for the enzyme VKORC1. The phenomena of hypersensitivity and the resistance to AVKs have been emerged and several spontaneous mutations have been discovered in the gene vkorc1. These mutations were associated with resistance despite the fact that this link has been never been demonstrated. The objective of this work is to confirm or deny these causal links. This study helps to demonstrate the responsibility of the mutations Leu120Gln, Leu128Gln and Tyr139Phe, Ser or Cys in the emergence of the phenotype resistant to AVKs 1ST generation among the wild rat. The catalytic property explains the biological cost associated with the emergence of this resistance in some strains of wild rats. Thus, the mutations at position 139 are responsible for the misappropriation of the catalysis with majority production of hydroxyvitamine K which is directly consumable by the body. In humans, 29 mutations out of 30 have been characterized. While these mutations have been observed in patients resistant to AVKs, the causality of these mutations has been demonstrated only for 6 mutations (Ala26Pro, Val41Ser, Val54Leu, His68Tyr, Ile123Asn, Phe139His) and the other mutations would not be responsible for the phenotype observed
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Brillet, Thomas. „Relations structure-fonction de l'alpha-hémoglobine et de sa protéine chaperon l'AHSP : octamères d'hémoglobine recombinante : application à la mise au point d'un transporteur d'oxygène artificiel“. Paris 7, 2010. http://www.theses.fr/2010PA077097.
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Ces travaux concernent l'étude de deux molécules d'hémoglobine (Hb) candidates à l'élaboration d'un transporteur artificiel d'oxygène et l'étude des relations structure-fonction de l'α-Hb et de sa protéine chaperon AHSP dans la cadre d'un mutant de l'AHSP décrit chez un patient présentant un syndrome thalassémique. La première partie du travail concerne le mutant α-HbH⁵⁸L, résidu clé de la poche de Thème, en vue de réduire l'auto-oxydation dans l'Hb. Celui-ci présente les mêmes caractéristiques spectrales quel que soit le ligand externe ajouté, contrairement à la protéine native. Dans ce mutant Thème semble être hexacoordonné avec un ligand endogène avec une forte affinité. La deuxième partie concerne les études d'octamères recombinants d'Hb réalisés par pontage intermoléculaire soit au niveau des sous-unités ß (ß octamère) ou a (α octamère). Ces octamères ont des propriétés fonctionnelles proches de THbA, mais avec une interaction avec l'haptoglobine (Hp) très diminuée. L'Hp et l'α octamère forment en quelques heures de grands complexes alors que le p octamère réagit nettement moins vite avec l'Hp, reflétant une plus grande stabilité de ce dernier La troisième partie concerne la caractérisation du complexe AHSP/α-Hb. Les constantes d'association, de dissociation de Tα-Hb vis à vis de son chaperon ont été déterminées. Pour le mutant AHSPV⁵⁶G, la constante de dissociation du complexe AHSP/α-Hb est diminuée 4 fois. L'AHSPV⁶⁵G seule est partiellement repliée à 37°C avec une stabilité thermique fortement diminuée alors que le complexe AHSPV⁵⁶G/α-Hb a une stabilité thermique proche de la normale. Au sein du complexe AHSPV⁵⁶G/α- Hb, l'α-Hb a également une fonction normaleThis work concerns the study of two candidate molecules of hemoglobin (Hb) in the development of an artificial oxygen carriers and the study of structure-function relationships of α-Hb and its chaperone AHSP in the context of a mutant AHSP described in a patient with thalassemia syndromes. The first part of the work concerns the mutant α-HbH⁵⁸L, a key residue of the heme pocket in order to reduce auto-oxidation in Hb. This mutant has the same spectral characteristics regardless of the external ligand added, unlike the native protein. This mutant appears to have a hexacoordinated heme with a high affinity endogenous ligand. The second part concerns the study of recombinant Hb octamers Hb, obtained by intermolecular disulfide bond of ß-Hb (ß octamer) or α-Hb (α octamer). These octamers have functional properties similar to HbA, but with a decreased interaction with haptoglobin (Hp). Hp and a octamer form within a few hours a large complex while the ß octamer reacts much more slowly with Hp, reflecting its greater stability. The third part concerns the characterization of the complex AHSP/α-Hb. Both association and dissociation rates of the α-Hb with its chaperone were determined. For the mutant AHSPV⁵⁶G, the dissociation rate of the complex AHSP/α-Hb is 4 times reduced. The AHSPV⁵⁶G appears to be partially folded at 37 ° C with a progressive thermal unfolding curve. However the complex AHSPV⁵⁶G/α-Hb has a thermal stability close to normal. Within the complex AHSPV⁵⁶G/α-Hb, the α-Hb displays a normal function
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Mevelec, Marie Noëlle. „Caractérisation du gène codant pour GRA4, protéine de granules dnses de Toxoplasma gondii et expression sous forme de protéines recombinantes procaryotes : antigénicité-immunogénicité“. Tours, 1995. http://www.theses.fr/1995TOUR3805.
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Montandon, Frédéric. „Intérêt du promoteur du gène de la protéine de choc thermique de 70 kDa et de l'oncogène cellulaire Ha-ras EJ pour la synthèse d'une protéine biogénétique par des cellules 3T3 recombinantes cultivées en biogénérateurs“. Dijon, 1992. http://www.theses.fr/1992DIJOS012.
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La lignée de cellules recombinantes EG6 a été clonée à partir de cellules NIH-3T3, co-transfectées par les plasmides pEJ porteur de l'oncogène cellulaire Ha-ras EJ et p17hGHdhfr vecteur du gène de l'hGH dont l'expression est placée sous le contrôle du promoteur du gène de la protéine de choc thermique de 70 kDa (hsp70). Nous avons étudié les différents paramètres qui régissent le développement des cultures dans des biogénérateurs de laboratoire et dans un biogénérateur pilote, sur des microporteurs de type Cytodex nd et Cultispher Gnd. La transformation des cellules EG6 qui fait suite à l'incorporation de l'oncogène Ha-ras EJ au sein du génome cellulaire permet d'obtenir un fort potentiel de croissance. Ainsi de larges inoculums atteignant 10 9 cellules sont préparés en une dizaine de jours, par multiplication in vivo après transplantation s. C. De 10 6 cellules chez une souris nude. La transformation cellulaire a rendu les cellules EG6 indépendantes des principaux facteurs de croissance hormis l'insuline biogénétique, ce qui autorise des cultures dans un milieu sans sérum et sans protéine (SPFM). Les meilleurs taux de synthèse de l'hGH induits après un choc thermique sont de l'ordre du mg/1/24 h. L'établissement d'un profil de chocs thermiques appliqués à la même culture permet une sécrétion de l'hGH de manière répétitive tout en maintenant une très bonne viabilité cellulaire. Le promoteur hsp70 est donc tout a fait compatible avec la culture de cellules en masse et la production de fortes quantités d'hGH dans le SPFM.