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Zeitschriftenartikel zum Thema "Recombinant protéique"
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Barbet, Anthony F., Travis McGuire, and Suman M. Mahan. "Séquence, expression élevée et purification d’une protéine recombinante de 21 kDa de Cowdria raminantium, à partir d’ Escherichia coli." Revue d’élevage et de médecine vétérinaire des pays tropicaux 46, no. 1-2 (1993): 165. http://dx.doi.org/10.19182/remvt.9353.
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Un des buts de notre projet est de fournir une source commode, économique et pure de protéine pour être testée dans des réactions diagnostiques et dans des vaccins contre la cowdriose. L'insertion d'ADN dans E. coli recombinante de la colonie F5.2, exprimant une protéine immunodominante de Cowdria ruminantium, a été séquencée. L'ADN était riche en A et T (74 p. 100), et hybridait avec tous les isolats de C. ruminantium testés et non pas avec de l'ADN bovin ou d'Anaplasma marginale. Il contient deux longs cadres ouverts de lecture (COL) de 627 et 831 paires de bases. Les COL étaient plus riches en G et C, comparés à la composition globale en bases et les deux COL codaient potentiellement pour des protéines contenant un peptide N-terminal. Des expériences de délétion suivies par des tests d'expression suggéraient que le COL de 627 paires de bases codait pour la protéine immunodominante de C. ruminantium reconnue par des sérums d'animaux infectés. Le COL pour ce polypeptide mature a été amplifié par réaction en chaîne de la polymérase et inséré dans un vecteur d'expression élevée où il a été exprimé comme protéine de fusion. Le peptide de fusion attaché, de 9 acides aminés, a permis une purification rapide de la protéine recombinante de C. ruminantium.
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ELOIT, M. "Vaccins traditionnels et vaccins recombinants." INRAE Productions Animales 11, no. 1 (1998): 5–13. http://dx.doi.org/10.20870/productions-animales.1998.11.1.3912.
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Différents types de vaccins sont actuellement disponibles ou en cours de développement. Ils peuvent être divisés en deux catégories : vaccins vivants et vaccins inertes. Les vaccins vivants traditionnels incluent des souches atténuées par des moyens conventionnels, comme la croissance dans des conditions de culture inhabituelles (bactéries), ou dans des cellules ou des animaux vis-à-vis desquels les souches ne sont pas initialement adaptées (virus). Les nouvelles générations de vaccins vivants utilisant les techniques de recombinaison génétique (vaccins recombinants) peuvent être fabriquées par mutagénèse dirigée de gènes de virulence, ou par clonage de gènes de protéines immunogènes dans des vecteurs viraux ou bactériens qui possèdent les propriétés souhaitées d’innocuité et d’efficacité. Les vaccins inactivés conventionnels sont fabriqués par traitement des microorganismes par des agents physiques ou chimiques. Dans la mesure où les fractions immunogènes des microorganismes sont de mieux en mieux connues, elles peuvent être utilisées pour fabriquer des vaccins ne comprenant que ces fractions immunogènes majeures (vaccin subunitaires) par purification, ou par expressionin vitro de protéines (un autre type de vaccin recombinant) ou enfin synthèse chimique de peptides. Récemment, il a été démontré, chez différentes espèces, que l’inoculation directe dans le muscle d’un gène codant pour une protéine immunogène (immunisation génétique) permettait d’induire une réponse immune cellulaire et humorale. Cette méthode correspond à un dernier type de vaccin recombinant. L’immunité systémique et muqueuse obtenue après injection de vaccin vivant est comparée à celle obtenue après injection de vaccin inerte.
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de Monti, Mireille, Sylvie Miot, Pascale Le Goff, and Jacques Duval. "Caractérisation d'une hémopexine sérique de truite par utilisation d'une protéine recombinante." Comptes Rendus de l'Académie des Sciences - Series III - Sciences de la Vie 321, no. 4 (1998): 299–304. http://dx.doi.org/10.1016/s0764-4469(98)80055-3.
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Labie, D. "Peut-on augmenter l'efficacité du BCG en l'utilisant comme vecteur d'une protéine recombinante ?" médecine/sciences 17, no. 5 (2001): 667. http://dx.doi.org/10.4267/10608/1987.
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Salih Alj Debbarh, H., H. Hasnaoui, A. Souriau, A. Belhouari, R. Saïle, and A. Rodolakis. "Chlamydiose abortive des petits ruminants au Maroc : valeur épidémiologique d’un kit Elisar de Chlamydophila abortus (Chlamydia psittaci sérotype 1)." Revue d’élevage et de médecine vétérinaire des pays tropicaux 54, no. 3-4 (2001): 201. http://dx.doi.org/10.19182/remvt.9773.
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Le test Elisa recombinant (Elisar) utilisant la protéine de 80 à 90 kDa spécifique de Chlamydophila abortus, développé à l’Inra de Nouzilly en France, a été évalué au Maroc. Trois cent sept sérums appartenant à cinq groupes d’ovins et de caprins, provenant d’élevages aux taux d’avortements élevés ou bien présentés pour contrôle vétérinaire, ont été testés. La comparaison des résultats obtenus avec le test de fixation du complément (Tfc) a montré une grande discordance entre les deux techniques. En effet, seulement 16 sérums ont été positifs avec Elisar contre 130 positifs avec Tfc. En particulier, parmi les 55 sérums provenant d’animaux avortés, 48 ont été positifs avec Tfc et 16 avec Elisar. Ceci soulève avec acuité la problématique du rôle de Chlamydophila pecorum dans les avortements des petits ruminants au Maroc. La recherche différentielle des pathologies à Chlamydophila abortus et Chlamydophila pecorum est nécessaire pour préciser l’origine des divergences observées entre Elisar et Tfc.
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Le Quellec, Sandra. "Intérêt de la protéine de fusion recombinante facteur VIII-Fc chez les patients hémophiles A sévères." Hématologie 20, no. 6 (2014): 304–6. http://dx.doi.org/10.1684/hma.2014.0976.
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Jongejan, Frans, N. De Vries, J. Nieuwenhuijs, A. H. M. Van Vliet, and L. A. Wassink. "La protéine immunodominante de Cowdria ruminantium Cr32 conservée dans le genre Ehrlichia." Revue d’élevage et de médecine vétérinaire des pays tropicaux 46, no. 1-2 (1993): 145–52. http://dx.doi.org/10.19182/remvt.9350.
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Les tests sérologiques pour la cowdriose sont perturbés par des réactions croisées dues à des anticorps présents chez des animaux soupçonnés d'être infectés par Ehrlichia spp. On a contrôlé des infections expérimentales par Ehrlichia bovis, E. ovina, E. canis et E. phagocytophila, par l'ELISA de compétition, le western blotting et l'immunofluorescence, utilisant des antigènes de cultures de cellules endothéliales infectées de Cowdria. Les réactions croisées par des anticorps contre Ehrlichia sont attribuables à leur reconnaissance d'épitopes sur la protéine immunodominante de Cowdria, Cr32. Ceci est surtout vrai pour E. canis et E. ovina, beaucoup moins pour E. bovis, mais pas du tout pour E. phagocytophila. De plus, une réaction croisée forte a été démontrée entre Cowdria et des anticorps contre E. chaffeensis. Ces résultats concordent avec les relations phylogénétiques trouvées récemment entre Cowdria et d'autres membres de la tribu des Ehrlichieae par Van Vliet et al. en 1992, qui montrent que Cowdria est étroitement apparentée à E. canis et également à E. chaffeensis. Il est proposé d'étudier des antigènes recombinants de Cowdria pour le développement de tests sérologiques de deuxième génération pour la maladie
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OTSMANE, B., G. DOSSET, J.-P. LEBEAU, and H. WATIER. "LES ANTICORPS MONOCLONAUX ANTI-SARS-COV-2 ET LE ROLE ESSENTIEL DES MEDECINS GENERALISTES DANS CETTE NOUVELLE APPROCHE THERAPEUTIQUE." EXERCER 32, no. 172 (2021): 166–72. http://dx.doi.org/10.56746/exercer.2021.172.166.
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Depuis l’émergence du Sars-CoV-2, le monde scientifique s’est mobilisé dans un effort sans précédent pour développer de nouveaux traitements spécifiques de la Covid-19. Après le développement des vaccins prophylactiques, des anticorps monoclonaux recombinants ont été mis au point dans des délais extrêmement courts pour le traitement curatif des formes précoces de la maladie. Le bamlanivimab, suivi des cocktails bamlanivimab-étésévimab et casirivimab-imdévimab viennent de se voir octroyer par l’Agence nationale de sécurité du médicament et des produits de santé (ANSM) une autorisation temporaire d’utilisation (ATU) de cohorte pour le traitement des formes symptomatiques légères à modérées de Covid-19 chez les patients à risque élevé d’évolution vers une forme grave. Leur fonction de neutraliser le Sars-CoV-2 en se liant à la protéine Spike a permis de réduire la charge virale et le risque d’hospitalisation dans des essais préliminaires. Les médecins généralistes (MG) devront se saisir de cette opportunité en organisant le dépistage et la prise en charge des patients éligibles à ces traitements. Ceci nécessite une meilleure connaissance de ces thérapies innovantes et le développement d’un effort collaboratif avec les autres spécialités médicales.
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Launay, O., E. Konate, M. Cachanado, et al. "Persistance des anticorps neutralisants induits par le vaccin à protéine recombinante souche B1.531 contre les variants Omicron du SARS-COV-2." Médecine et Maladies Infectieuses Formation 2, no. 2 (2023): S23. http://dx.doi.org/10.1016/j.mmifmc.2023.03.056.
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Fournet, X., P. Dubernet-Gaudiot, M. Treilhaud, and Y. Blanloeil. "Utilisation de protéine C activée recombinante (rPCa) humaine (Xigris®) pour sepsis sévère en présence d'un épanchement péricardique après chirurgie cardiaque récente." Annales Françaises d'Anesthésie et de Réanimation 24, no. 4 (2005): 435–36. http://dx.doi.org/10.1016/j.annfar.2005.02.005.
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Rigo, Maxime. "Rôle de l'adaptateur protéique carma1 dans le mécanisme d'action de l'anticorps recombinant anti-cd4 13b8.2." Thesis, Montpellier 1, 2010. http://www.theses.fr/2010MON13502/document.
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L'anticorps recombinant anti-CD4 13B8.2 a démontré des capacités de lyse dépendante du complément (CDC) et d'inhibition de la prolifération cellulaire dans le cadre du traitement des tumeurs hématopoïétiques CD4+. Bien qu'il ait été démontré que son action antiproliférative passe par une modulation du facteur de transcription NF-(kappa)B, les mécanismes précis y conduisant restent encore inexpliqués. Au sein du laboratoire, de précédentes études ont démontré que l'anticorps anti-CD4 13B8.2 induit une réorganisation et une modulation des protéines dans les rafts, en y concentrant le CD4 et en y excluant les protéines ZAP70, SLP76, PLC(nu)1 et Vav1. Nous avons tenté d'expliquer les mécanismes qui participent à la modulation des protéines au sein des microdomaines membranaires lipidiques, et nous proposons que la voie de signalisation Carma1 soit impliquée dans les effets observés sur le facteur de transcription NF-(kappa)B. Cette étude démontre que les effets biologiques de l'anticorps recombinant 13B8.2 passent par une modulation de la voie Carma1, Bcl10, MALT1. L'anticorps 13B8.2 induit une réorganisation de ces protéines en dehors des microdomaines membranaires lipidiques avec une dissociation du complexe qui ne peut plus transmettre la signalisation conduisant à l'activation de NF-(kappa)B. Nous avons également mis en évidence que les réorganisations protéiques au niveau de la membrane, induites par l'anticorps anti-CD4 13B8.2 s'accompagnent d'une modulation des espèces lipidiques des microdomaines. Ainsi, nous observons une augmentation du niveau des acides gras de type C18 :0, et une augmentation de l'activité d'une sphingomyelinase acide qui conduit à une augmentation du taux de céramide. Parallèlement l'augmentation de céramide, induite par une sphingomyelinase bactérienne induit la réorganisation de ZAP70 hors des microdomaines, de façon comparable à l'anticorps 13B8.2. Cette meilleure connaissance des mécanismes de signalisation de l'anticorps anti-CD4 13B8.2, permettra de dégager de nouvelles approches thérapeutiques en vue de la modulation de la prolifération des cellules T et de leur sensibilisation à la chimiothérapie. Ce travail ouvre la voie à des possibilités de thérapies ciblant les microdomaines lipidiques<br>The recombinant anti-CD4 antibody 13B8.2 demonstrated capabilities complement dependent lysis (CDC) and inhibition of cell proliferation in the treatment of hematopoietic tumors CD4 +. Although it has been demonstrated that its antiproliferative activity through modulation of transcription factor NF-kB, the precise mechanisms leading to them remain unexplained. Within the laboratory, previous studies have shown that anti-CD4 13B8.2 induced a reorganization and modulation of proteins in rafts by concentrating CD4 and by excluding proteins ZAP70, SLP76, Vav1 and PLC(nu)1 . We tried to explain the mechanisms involved in the modulation of proteins within lipid microdomains, and we propose that the signaling pathway is involved in Carma1 observed effects on the transcription factor NF-kB. This study demonstrates that the biological effects of recombinant antibody 13B8.2 pass through a modulation of the channel Carma1, Bcl10, MALT1. 13B8.2 antibody induces a reorganization of these proteins outside the lipid membrane microdomains with a dissociation of the complex that can no longer transmit signals leading to activation of NF-kB. We also demonstrated that the protein reorganization at the membrane induced by anti-CD4 13B8.2 accompanied by modulation of lipid microdomains species. Thus, we see an increased level of fatty acids like C18: 0, and increased activity of acid sphingomyelinase leads to an increased rate of ceramide. Parallel increase of ceramide, induced by bacterial sphingomyelinase induced reorganization of ZAP70 outside microdomains similarly to the antibody 13B8.2. A better understanding of signaling mechanisms of the anti-CD4 13B8.2, will identify new therapeutic approaches for modulating the proliferation of T cells and their sensitization to chemotherapy. This work paves the way for potential therapies targeted to lipid microdomains
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Raingeaud, Joël. "Synthèse et purification d'un analogue du neuropeptide VIP (vasoactive intestinal peptide) par les technologies de l'ADN recombinant et du génie protéique." Limoges, 1994. http://www.theses.fr/1994LIMO0006.
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Le vip (vasoactive intestinal peptide) est un peptide basique de 28 acides amines avec une extremite cooh aminee. Il appartient a la meme famille que la secretine et la glucagon et intervient principalement dans la vasodilatation, la relaxation des muscles lisses et la stimulation des secretions exocrines. Une strategie a ete envisagee permettant la production d'un analogue du vip par genie genetique. Afin de surmonter le probleme de l'instabilite de ce type de peptide exprime dans les systemes bacteriens recombinant notamment e. Coli, plusieurs unites du gene vip sont fusionnees pour former un concatemere. Les unites sont separees par des oligonucleotides de liaison codant pour une sequence en acides amines possedant des sites de clivage enzymatique (facteur xa) et chimique (hydroxylamine). Avec cette organisation, un gene multimetre de 16 vip a ete synthetise par addition sequentielle des genes, puis fusionne a un gene marqueur, celui de la glutathion s-transferase. La proteine hautement exprimee grace au plasmide pg 16v introduit dans la souche d'e. Coli jm 105, a ete purifiee et soumise a une double digestion. Seule l'utilisation du facteur xa a conduit a des formes physiquement caracterisees analogues du vip. Outre des formes polymeres, on obtient un peptide analogue du vip monomerique possedant du cote c-terminal une extre sequence de 5 ou 10 acides amines. Des experiences preliminaires sur l'activite biologique ont confirme 1) que ce peptide reconnait le recepteur du vip. 2) sa capacite a stimuler l'activite de l'adenylate cyclase et enfin 3) qu'il possede une activite relaxante sur un organe isole comparable a celle du cip naturel. Cette strategie de synthese et de purification, laisse envisager la production de derives agonistes et antagonistes du vip. Enfin, elle peut etre extrapolee ala production d'autres peptides a activite biologique d'une taille voisine
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Poenou, Géraldine. "Assemblage de la machinerie moléculaire de la coagulation : apprendre de l'évolution adaptative du Facteur X de venin de serpent." Electronic Thesis or Diss., Sorbonne université, 2024. http://www.theses.fr/2024SORUS042.
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L'hémostase humaine est régulée par l'activité de complexes enzyme-cofacteurs macromoléculaires qui nécessitent une surface membranaire chargée négativement pour leur assemblage. Outre l'organisation spatiale des réactions de coagulation lors de lésions vasculaires, la formation du complexe FX / FV à la surface phospholipidique permet l'amplification de la conversion de la FIl en Flla. Cependant, les connaissances sur les mécanismes moléculaires précis du phénomène d'amplification de l'hémostase à la surface de membrane lipidique sont incomplètes. L'objectif est de préciser les connaissances des mécanismes moléculaires du peptide d'activation sur le FX, le rôle du domaine Gla de la sérine protéase le FXa et du variant résistant aux anticoagulants oraux directs (AOD) qui régulent l'assemblage des complexes enzyme-cofacteur, complexes conduisant à la coagulation sanguine. En particulier, dans ce travail de thèse est étudié : 1/ le rôle dans l'évolution de la longueur du peptide d'activation du FX du venin de serpent et notamment un rôle potentiel dans la vitesse d'activation du FX et de l'amplification du phénomène de coagulation. 2/ le rôle du domaine GLA de la sérine protéase le FXa lié à la surface des phospholipides, qui associé au facteur Va convertit la Flla en FIl, une étape clé de la coagulation sanguine. Des variantes de ces protéines présentant des propriétés procoagulantes améliorées peuvent être trouvées dans la nature, avec, comme exemple le plus frappant, les protéines FVa-Xa exprimées dans le venin du serpent commun australien Pseudonaja textilis<br>Human hemostasis is regulated by the activity of enzyme-cofactor complexes macromolecular molecules that require a negatively charged membrane surface for their assembly. In addition to the spatial organization of coagulation reactions during vascular lesions, the formation of the FX/FV complex on the phospholipid surface allows the amplification of the conversion of FIl to Flla. However, the knowledge on the precise molecular mechanisms of the phenomenon of amplification of hemostasis on the lipid membrane surface are incomplete. The objective is to clarify the knowledge of the molecular mechanisms of the peptide activation on FX, the role of the Gla domain of the serine protease Fa and the variant resistant to direct oral anticoagulants (DOACs) that regulate the assembly of enzyme-cofactor complexes, complexes leading to blood clotting. In this thesis is studied 1/ the role in the evolution of the length of the FX activation peptide of the venom of snake and in particular a potential role in the speed of activation of the FX and the amplification of the coagulation phenomenon. 2/ the role of the GLA domain of the serine protease FXa linked to the surface of phospholipids, which associated with factor Va converts Flla into Fil, a key step in blood clotting. Variants of these proteins exhibiting properties Enhanced procoagulants can be found in nature, with, as an example most strikingly, the FVa-Xa proteins expressed in common snake venom Australian Pseudonaja textilis
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Miladi, Baligh. "Développement d’outils moléculaires de production et de purification de protéines recombinantes par suivi en temps réel." Thesis, Cergy-Pontoise, 2011. http://www.theses.fr/2011CERG0533/document.
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Les besoins en protéines recombinantes dans les diverses activités des bio-industries a considérablement augmenté ces dernières années. Cependant, les procédés de leur production sont encore limités par le manque de marqueurs permettant de suivre l'expression et la purification des protéines d'intérêt, la formation des corps d'inclusion et les faibles degrés de pureté.Afin de pallier à ces difficultés, nous avons développé et mis en œuvre un nouveau procédé de production et de purification de protéines recombinantes chez Escherichia coli. Ce procédé est basé sur l'utilisation d'une cassette d'expression appelée Multitags et sur le clivage par une TEV protéase immobilisée sur une matrice de streptavidine. Le Multitags comporte, à partir de son extrémité N-terminale, un double tag d'affinité (10xHis et SBP), le domaine de fixation de l'hème du cytochrome b5 et le site de clivage de la TEV protéase. En utilisant deux modèles différents de protéine d'intérêt (MyRIP et la Pfu DNA polymérase), nous avons montré l'efficacité du cytochrome b5 dans le suivi visuel et quantitatif par mesure d'absorbance des différentes étapes de production et de purification. Nous avons obtenu plus de 90% de chacune des deux protéines de fusion dans la phase soluble. L'application d'une chromatographie double via les deux tags d'affinité 10xHis et SBP a permis d'atteindre un degré de pureté du Multitags-MyRIP et du Multitag-Pfu de 99%. Nous avons construit des colonnes protéolytiques en produisant la TEV protéase sauvage et sa version mutée (S219V) en fusion avec le Streptag II et en immobilisant ces enzymes par affinité sur colonne de streptavidine-agarose. La caractérisation des colonnes protéolytiques et leur application aux protéines recombinantes d'intérêt modèles ont montré l'avantage de cette méthode d'immobilisation en termes d'activité protéase retenue, de stabilité des enzymes, de leur réutilisation et de simplification du schéma de purification et de récupération des protéines d'intérêt à haut degré de pureté. En conclusion, ces travaux de thèse ont permis de développer et de valider des outils innovants pour l'expression et la purification de protéines recombinantes<br>In recent years, the need for recombinant proteins has substantially increased in various bio-industry activities. However, actual recombinant processes are still limited by the lack of markers allowing real-time expression and purification monitoring of target proteins, by inclusion bodies formation and by low quality of purity of the products. To overcome these difficulties, we have developed a new process for production and purification of recombinant proteins in Escherichia coli. The method combines the use of a multifunctional expression cassette, termed Multitags and an immobilized modified TEV protease on a streptavidin matrix. The Multitags contains, its N-terminus, two affinity purification tags (10xHis and SBP) and as a marker tag, the heme-binding domain of cytochrome b5 followed by the TEV cleavage site. Using two model proteins (MyRIP and Pfu DNA polymerase), we have demonstrated the visual and the quantitative monitoring capability of the cytochrome b5 during the expression and purification steps. When expressed in E. coli KRX more than 90% of both fusion proteins were produced in a soluble form. In addition, high purity (99%) of Multitags-MyRIP and Multitags-Pfu was achieved after two consecutive affinity purification steps using the dual affinity tag. We also produced the wild-type and the S219V mutant TEV proteases fused to the Streptag II affinity sequence and realized their affinity immobilization on a streptavidin-agarose matrix. The characterization of the proteolytic columns and their application to the recombinant model proteins demonstrated the advantage of this immobilization method in terms of retaining activities, enzyme stabilities, possibility of reuse and simplification of the cleavage downstream steps.In conclusion, this study allowed the development and the validation of innovative tools for expression and purification of recombinant proteins
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Girard, Loïc. "Expression d'une protéine recombinante humaine dans des cellules végétales :le CD14." Rennes 1, 2003. http://www.theses.fr/2003REN10108.
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Le travail réalisé durant cette thèse a permis de démontrer la possibilité de produire du CD14 par des cellules végétales cultivées en suspension. L'ADNc cd14 a été inséré dans le génome de la cellule végétale sous le contrôle du promoteur CaMV35S, a été transcrit et l'ARNm en résultant a été reconnu par la machinerie traductionnelle. Cette intégration du transgène dans le génome est un événement stable puisque la protéine a été détectée 2 ans après la transformation des cellules. Deux clones exprimant du CD14 ont été mis en évidence par western-blot et les distances de migration sur gel de polyacrylamide laissent à penser que ces protéines sont glycosylées. Les faibles taux d'expression constatés (entre 2,5 et 10 æg/L) ne permettent pas encore d'analyses complémentaires nécessaires pour déterminer l'intégrité et la fonctionnalité de la protéine. La sécrétion de la protéine semble effective, que ce soit en utilisant un peptide signal végétal ou humain.
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Byrne, Deborah. "Du gène à la protéine : une approche rationnelle pour concevoir des expériences d'expression des protéines recombinantes." Thesis, Aix-Marseille 2, 2011. http://www.theses.fr/2011AIX22127.
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Protéines difficiles à exprimer: un goulot d'étranglement pour la plupart des biologistes. J'ai choisi d'utiliser comme modèle d’étude Acanthamoeba polyphaga Mimivirus. Ce virus géant à ADN possède des protéines subissant des modifications post-traductionnelles, des structures multi-protéiques ou encore des voies enzymatiques jamais identifiées auparavant dans un virus, ce qui en font un modèle idéal pour l’étude de protéines récalcitrantes. Le but ultime de cette thèse, était de produire les protéines de capsides de Mimivirus. Le rôle de la protéine de capside dans l’assemblage de la particule virale, son infectivité et ses caractéristiques moléculaires sont d’une grande importance. Pour aller du gène à la protéine, J’ai participé à la compréhension de ce qui gouverne la terminaison de la transcription de Mimivirus et également participé à l'analyse globale du transcriptome au cours du cycle d'infection des amibes par Mimivirus. Nous avons montré que les transcrits de Mimivirus sont systématiquement polyadénylés dans des régions formant une structure secondaire en tige-boucle, même s’il n’existe pas de signal de polyadénylation canonique en amont. Nous en avons conclu que la polyadénylation de Mimivirus suit exclusivement une règle «épingle à cheveux». De plus, l’étude du transcriptome a révélé 3 phases temporelles distinctes dans le cycle infectieux: précoce, intermédiaire et tardive. Les transcrits de capsides sont tous exprimés durant la phase tardive mais leur profil d’expression ne sont pas superposables dans le temps. Les données de transcriptomique ont révélées la présence de plusieurs glycosyltransférases chez Mimivirus, dans la phase tardive du cycle, concomitant avec la production de la protéine de capside. Les informations recueillies sur l'expression des gènes à différents temps post-infection ont contribué à la conception de protocoles pour la production des protéines de capsides (la protéine majeure de capside (MCP) et ses paralogues) dans de systèmes eucaryote<br>Difficult to express proteins: a bottleneck for most biologists. I have chosen to use Acanthamoeba polyphaga Mimivirus as my study model. This giant dsDNA virus possesses post-translationally modified proteins, multi-protein structures and enzyme pathways never before seen in a virus, which makes it ideal for refractory studies. The ultimate goal of my thesis was to produce the capsid proteins of Mimivirus. The role of the capsid protein in the assembly of the viral particle, its infectivity, and molecular features are of great importance. To go from gene to protein, I participated in the comprehension of what governs the post-transcriptional termination in Mimivirus and equally participated in the global analysis of the transcriptome during the infectious cycle of Acanthamoeba by Mimivirus. We have shown that the Mimivirus transcripts are systematically polyadenylated in the regions forming a stem-loop secondary structure; even when a canonical poyadenylation signal is absent We concluded that Mimivirus polyadenylation obeys a strict “Hairpin rule”. Moreover, the transcriptomic study revealed three distinct temporal phases: early, intermediate and late. The capsid transcripts are all expressed during the late phase but their expression profiles are not superimposable. The transcriptomic data also revealed the presence of several Mimivirus glycosyltransferases in the late temporal phase, concomitant with the capsid proteins. The expression data gathered throughout my thesis has contributed to the rational design of a protein production experiment to produce the major capsid protein and its three paralogs in eukaryotic systems
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Roux, Lauriane. "Développement et validation d’un modèle cellulaire de kératopathie associée à l’aniridie." Thesis, Sorbonne Paris Cité, 2018. http://www.theses.fr/2018USPCC276.
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L’aniridie est une pathologie rare principalement due à des mutations hétérozygotes sur PAX6, le gène contrôlant le développement oculaire et le maintien de l’homéostasie cornéenne. Elle est caractérisée par une hypo/aplasie de l’iris, des atteintes de la rétine et du cristallin. La totalité des patients atteints développe aussi une kératopathie associée à l’aniridie (KAA), conduisant à une opacification progressive de leur cornée. La KAA a pour origine un déficit en cellules souches limbiques et diverses perturbations de l’épithélium et du stroma cornéens. Actuellement, il n’existe ni traitement pour soulager efficacement les patients, ni modèle cellulaire pour cette pathologie. Afin de pallier ces manques, le système CRISPR/Cas9 a été utilisé pour intégrer une mutation hétérozygote non-sens dans le gène PAX6 de cellules épithéliales limbiques immortalisées. Les cellules mutées présentent une expression réduite de PAX6 et une modulation de celle de ses gènes cibles, un ralentissement de la prolifération, de la clonogénicité et de la migration ainsi qu’une adhésion accrue. De plus, nous avons montré qu’un traitement de ces cellules avec une protéine recombinante PAX6, portant un peptide de pénétration cellulaire, permet une induction de l’expression endogène de PAX6 et également une restauration partielle du phénotype décrit précédemment. Cette réversion phénotypique valide le modèle d’haploinsuffisance développé et suggère l’implication de PAX6 dans les différentes fonctions restaurées. Les cellules mutées peuvent maintenant être utilisées pour le criblage d’outils thérapeutiques potentiels pour la KAA et pour d’autres défauts liés à une diminution du dosage de PAX6<br>Aniridia is a rare panocular disease mainly due to PAX6 heterozygous mutations. PAX6 is the master gene of the eye development and it controls also the corneal homeostasis maintenance. Aniridia is characterized by an iris hypo/aplasia, retina and lens defects. All the aniridia patients will also develop an aniridia-related keratopathy (ARK) leading to a progressive corneal opacification. ARK is due to a limbal stem cell deficiency and alterations of corneal epithelium and stroma functions. Unfortunately, there is currently no efficient treatment to relief the patients and no cellular model for this pathology. To remedy these lacks, CRISPR/Cas9 system was used to insert a nonsense mutation into PAX6 gene of immortalized limbal epithelial cells. The mutated cells produce less PAX6 than the wild-type and PAX6 targets gene expression was modulated. They also display a marked slow-down proliferation, clonogenicity, migration and an enhanced adhesion. Moreover, we have shown that addition of recombinant PAX6 protein fused to a cell penetrating peptide to the culture medium was able to activate the endogenous PAX6 expression and to rescue some phenotypic defects of the mutated cells. Therefore, it validates the PAX6 haploinsufficiency model and suggests that PAX6 could be involved in all the rescued functions. The mutated cells can now be used to screen potential therapeutic tools for ARK and for other defects due to low levels of PAX6
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Iatmanen, Soria. "Production et caractérisation structurale et fonctionnelle de la protéine membranaire recombinante TSPO." Thesis, Paris 6, 2014. http://www.theses.fr/2014PA066561/document.
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La TSPO préalablement connue sous le nom de récepteur périphérique aux benzodiazépines (PBR), est une protéine membranaire principalement impliquée dans le transport du cholestérol du cytosol vers la matrice des mitochondries, étape limitante dans la synthèse des stéroïdes et des sels biliaires.La production de la forme murine de la TSPO recombinante a été réalisée par un plasmide exprimé dans la bactérie Escherichia coli. La purification a été obtenue par colonne d'affinité grâce à l'étiquette polyhistidine codée dans le gène recombinant. Différents environnements mimétiques membranaires, détergents, lysodérivés, lipides ont été testés d'un point de vue structural et fonctionnel. Parmi les détergents étudiés, la dodécyl phosphocholine (DPC) a permis le meilleur repliement de la protéine. L'ajout de lysodérivés (LMPE) ou de phospholipides (DMPC/DMPE) a permis d'accroître la stabilité. La liaison des ligands spécifiques de la TSPO (PK 11195, cholestérol, protoporphyrine IX) a été observée dans plusieurs conditions étudiées par différentes approches biophysiques et biochimiques. Les trois approches structurales (ME, RX et RMN) ont pu être réalisées après optimisation des conditions de production et de stabilisation. Les résultats obtenus sont discutés en lien avec la structure de la TSPO publiée ces derniers mois. En parallèle à l'étude structurale, des mesures fonctionnelles par mutagenèse dirigée ont été réalisées afin d'obtenir des informations sur la liaison du ligand PK 11195. Ces données ont été confrontées à la structure récemment déterminée permettant de proposer un rôle pour les résidus mutés. Le mécanisme de transport du cholestérol par la TSPO est discuté<br>TSPO previously named peripheral-type benzodiazepine receptor (PBR) is a membrane protein mostly involved in cholesterol transport from the cytosol to the matrix of mitochondria, a limiting step in steroids and bile salts biosynthesis.Production of recombinant mouse TSPO has been performed by plasmid expression in Escherichia coli bacteria. Purification has been obtained by immobilized affinity chromatography (IMAC) using polyhistidine tag encoded by recombinant gene. Various membranous mimetic environments such as detergents, lysoderivates, lipids have been tested from structural and functional point of view. Among tested detergents, dodecyl phosphocholine (DPC) has permitted the best protein refolding. The presence of lysoderivate (LMPE) or phospholipids (DMPC/DMPE) increased protein stability. Binding of TSPO high affinity ligands (PK 11195, cholesterol, protoporphyrin IX) has been measured in different conditions studied by biochemical and biophysical techniques. Three structural approaches (EM, XR and NMR) have been performed after optimization of production conditions and protein stabilization. Results gained have been discussed in line with TSPO atomic structure published within these last months. In parallel with structural studies, functional measurements have been carried out by site directed mutagenesis in order to gain data on binding site of PK 11195. These data have been faced with recently published TSPO atomic structure stabilized with this ligand and enabled to propose functional implication of mutated amino acids. Transport mechanism of cholesterol by TSPO is discussed
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Bransi, Ali. "Caractérisation fonctionnelle et structurale d'un homologue phagique de la protéine humaine RAD52." Thesis, Université Laval, 2009. http://www.theses.ulaval.ca/2009/26338/26338.pdf.
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Ben, Rached Fathia. "Etude de la protéine Rab7 de Plasmodium." Paris 7, 2011. http://www.theses.fr/2011PA077123.
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Lors de son cycle, P. Falciparum, agent du paludisme, envahit les globules rouges provoquant ainsi la phase symptomatique de la maladie. Cette localisation intracellulaire rend cruciale, pour le parasite, la mise en place d'un transport vésiculaire afin d'importer les nutriments nécessaires à son développement et d'exporter les métabolites de dégradation. Nous nous sommes intéressé, au cours de cette thèse, à la GTPase Rab7 une des protéines clés de la régulation du trafic vésiculaire. Dans un premier temps, nous avons démontré que l'inactivation du gène rab7 est létale pour le parasite au cours de la phase érythrocytaire. Nous avons, ensuite, montré que les protéines Rab7 et Atg8 (marqueur de l'autophagosome) colocalisent chez P. Falciparum suggérant qu'un des rôles essentiels de Rab7 pourrait être lié à son implication dans l'autophagie, mécanisme responsable du remodelage cellulaire du parasite qui subit de nombreuses transformations au cours de son développement. Par la suite, nous avons exploité les bases de données de S. Cerevisiae pour construire l'interactome des protéines Rab de P. Falciparum. Nous avons validé cet interactome in vitro et in vivo en confirmant l'interaction entre les protéines Rab7 et PKA-C, correspondant à la sous-unité catalytique de la PKA, protéine clé de la voie de régulation dépendante de l'AMPc. Enfin, nous avons démontré que Rab7 est phosphorylée in vitro par la PKA-C et identifiée la serine 72 comme site de phosphorylation. La compréhension du trafic vésiculaire et la caractérisation du rôle essentiel de Rab7 pourrait améliorer la lutte contre le paludisme car l'inhibition des interactions de Rab7 apparaissent comme des cibles thérapeutiques de choix<br>During its life cycle P. Falciparum, the causative organism of malaria, invades red blood cells leading to the specific symptoms of the disease. Its intracellular localization prompts the parasite to utilize the vesicular transport machinery in order to import nutrients that are essential for its development and to export degraded metabolites. In the present study we were interested in the role of the GPTase Rab7, which represents a major component of the vesicular transport pathway. For the first time, we demonstrated that inactivation of the rab1 gene is lethal to the parasite during its erythrocytic stage. Rab7 and Atg8 (autophagosomal marker) proteins colocalize with P. Falciparum suggesting a potential role for Rab7 during autophagy, a process that is important for thé multiple cellular transformations being undergone by the parasite throughout its development. Furthermore, we took advantage of the S. Cerevisiae database to design a Rab protein interactome for P. Falciparum. This interactome was validated in vitro and in vivo by corroborating the interaction between Rab7 and PKA-C, the corresponding subunit of PKA that is involved in cAMP-dependent signaling pathways. Finally, we showed that in vitro phosphorylation of Rab7 by PKA-C occurs at its serine 72 residue. A profound understanding of the mechanisms associated with vesicular trafficking in the parasite cell and characterization of the role of Rab7 might contribute to the battle against malaria whereas drug-induced inhibition of interactions with Rab7 could represent a method of choice
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(Editor), Juan A. Asenjo, and Barbara A. Andrews (Editor), eds. Recombinant DNA Biotechnology III: The Integration of Biological and Engineering Sciences (Annals of the New York Academy of Sciences). New York Academy of Sciences, 1996.
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(Editor), Juan A. Asenjo, and Barbara A. Andrews (Editor), eds. Recombinant DNA Biotechnology III: The Integration of Biological and Engineering Sciences (Annals of the New York Academy of Sciences). New York Academy of Sciences, 1996.
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Recombinant DNA biotechnology III: The integration of biological and engineering sciences. New York Academy of Sciences, 1996.
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