Auswahl der wissenschaftlichen Literatur zum Thema „Récepteurs RIG-I“

Les infections virales peuvent avoir des conséquences dévastatrices pour l'hôte et doivent donc être contrôlés rapidement et efficacement par l'immunité innée antivirale. Les récepteurs de type Rig-I-like (RLR: Rig-I, MDA5 et LGP2) sont en première ligne de la course de l'évolution entre les virus et le système immunitaire de l'hôte. Ils jouent un rôle majeur dans la détection des infections par les virus à ARN pour initier et moduler l'immunité antivirale. Lors de la liaison de l'ARN, les RLR déclenchent une cascade de signalisation en aval résultant dans l'expression des interférons de type I, de cytokines pro-inflammatoires et d'un ensemble diversifié de gènes antiviraux. Une décennie après leur découverte, la cascade de signalisation impliquée dans la réponse RLR est bien connue, cependant, les mécanismes moléculaires qui conduisent à leur activation ont encore besoin d'être éclaircis. En effet, à l'intérieur d'une cellule infectée, les RLR interagissent avec des ARNs viraux, mais aussi avec des partenaires protéiques cellulaires. La plupart d'entre eux sont encore méconnus. Ainsi des stratégies novatrices sont nécessaires pour identifier les réseaux spatio-temporels d'interactions moléculaires des RLR à l'intérieur des cellules infectées. Afin d'éclaircir la nature des agonistes et des partenaires protéiques des RLR lors d'une infection virale, nous avons généré un ensemble de lignées cellulaires stables exprimant Rig-I, MDA5 et LGP2 marqués. Des approches biochimiques modernes basées sur la purification par chromatographie d'affinité des RLR suivie du séquençage à haut débit des ARNs co-purifiés, et l'analyse par spectrométrie de masse des complexes protéiques co-précipités, ont été utilisées. Comme une preuve de concept, un virus à ARN de polarité négative (virus de la rougeole, MV) et un virus de polarité positive (virus du chikungunya, CHIKV) ont été choisis. Nous avons obtenu une liste exhaustive d'interactions spécifiques virus-hôte des RLRs. Les analyses de séquençage ont révélé que des régions distinctes des génomes de MV et CHIKV sont spécifiquement reconnues. Nos résultats suggèrent que lors de l'infection MV, Rig-I reconnaît les génomes défectifs lorsque la souche virale utilisée en produit. Par contre, MDA5 et LGP2 s'associent spécifiquement avec des ARN provenant de la région codant le gène de la nucléoprotéine. Lors de l'infection CHIKV, seulement Rig-I s'associe spécifiquement à la région 3 'du génome viral. Par notre approche protéomique, nous avons établi trois listes abondantes de protéines cellulaires interagissant directement ou indirectement avec chacun des trois RLRs. Ces interactions protéine-protéine sont hautement spécifiques à la fois des RLR et des conditions. En outre plusieurs partenaires des RLR décrits précédemment ont été retrouvés dans nos listes de protéines. À notre connaissance, cette étude fournit la première visualisation simultanée des agonistes ARN et des partenaires protéiques des trois RLRs dans des cellules vivantes et en présence d'infection par différents virus à ARN
Virus infections can have deVastating consequences for the host and must therefore be controlled rapidly and effectively by antiviral innate immunity. The Rig-I-like receptors (RLRs: Rig-I, MDA5 and LGP2) are at the frontline of the evolutionary race between viruses and the host immune system. They play a major role in sensing RNA virus infection to initiate and modulate antiviral immunity. Upon RNA binding, RLRs trigger a downstream signalling cascade resulting in the expression of type-I interferons, proinflammatory cytokines and a diverse set of antiviral genes. One decade after RLRs discovery, much is known on the signalling cascade involved in their response, however molecular mechanisms that lead to RLRs activation still need further elucidation. Indeed, inside an infected tell RLRs interact with particular signatures of viral RNA but also with cellular protein partners, most of them being still unknown. Thus, innovative strategies are needed to obtain spatiotemporal networks of macromolecular interactions involving RLRs inside infected tells. In order to shed light on RNA and protein partners of RLRs in physiological conditions during an active viral infection, we generated a set of stable tell fines expressing tagged Rig-I, MDA5 and LGP2 proteins. Modern biochemical approaches based on affinity purification of tagged proteins, next-generation sequencing (NGS) of RNA molecules and mass spectrometry analysis (LC-MS/MS) of protein complexes were applied. As a proof of principle one negative-sense (measles virus, MV) and one positive-sense (chikungunya virus, CHIKV) viruses were chosen. We obtained an extensive list of specific virus-host interactions between RLRs and both protein and RNA molecules. NGS analysis fi revealed that distinct regions of the MV and CHIKV genomes were specifically recognized in an RLR-dependent manner. Our findings suggests that during MV infection, Rig-I recognizes defective interfering genomes only if the viral strain produces them, whereas MDA5 and LGP2 specifically associate with RNA species originating from the MV nucleoprotein coding region. During CHIKV infection, only Rig-I was found to bind specifically the 3' untranslated region of the viral genome. Using our proteomic approach we established three prosperous lists of cellular proteins interacting either directly or indirectly with each of the three RLRs. These protein-protein interactions were highly specific because they were RLR-specific and conditions-dependent. Additionally, several previously described specific RLR partners were present in our protein lists. To our knowledge this study provides the first simultaneous visualisation of specific RNA and protein partners for Rig-I, MDA5 and LGP2 in living tells in the presence of different RNA viruses

Le système immunitaire inné constitue la première barrière de défense du corps humain contre les agents infectieux. Constitue d'une poignée de récepteurs seulement (approximativement 50), ce système est capable de détecter la plupart des agents pathogènes et d'activer le système immunitaire adaptatif. Dans le cas d'une infection virale, deux classes de récepteurs sont mobilisées : les RLRs (Retinoic acid Like Récepteurs) et les TLRs (Toll Like Receptors). La famille des RLRs comprend notamment trois protéines, RIG-I, MDA-5 et LGP2, qui reconnaissent la présence d'ARN viral dans le cytosol. Dans la première partie de cette thèse, nous discuterons de la voie d'activation de RIG-I : avec quels types d'ARN et de quelle manière RIG-I interagit-il ? L'état d'oligomérisation de RIG-I change-t-il lors de l'interaction avec l'ARN ? De quelle manière RIG-I est-il influence par l'ubiquitine et sa ligase E3, TRIM25 ? Nous présenterons également la structure du domaine PRYSPRY de TRIM25, domaine minimum nécessaire à l'interaction avec RIG-I. Nous d'écrirons également les travaux préliminaires obtenus sur un complexe constitue de MDA5 et une molécule d'inhibition virale. L'ARN des virus de la grippe est un des activateurs du récepteur RIG-I. Les virus de la grippe appartiennent 'a la famille des Orthomyxoviridae qui touche les mammifères et les aves créant des épidémies saisonnières. Ces dernières peuvent causer jusqu'à plusieurs millions de morts lors de pandémies, soulignant le besoin de trouver de nouvelles solutions thérapeutiques. Dans la seconde partie de ma thèse, nous nous intéresserons à l'activité endonucléase de l'ARN polymérase du virus A/California/04/2009-H1N1 de la grippe porcine comme une cible pour de nouvelles molécules antivirales. Les structures de quatre inhibiteurs en complexe avec ce domaine seront présentées. Nous présenterons également la structure de PA-Nter avec les substrats rUMP et dTMP co-cristallisés dans le site actif. Toutes ces structures atomiques forment une base pour l'optimisation et la synthèse d'inhibiteurs
The first line of defense against invading pathogens in the human body is the innate immune system. Astonishingly, with only a handful of different pathogen recognition receptors (around 50), the innate immune system is able to detect a remarkably broad variety of pathogen specific molecules to trigger protective pathways and to activate the adaptive immune system. In the case of intruding viruses, two families of pattern recognition receptors (PRRs) are active: retinoic acid-inducible gene I (RIG-I)-like receptors (RLRs) and Toll-like receptors (TLRs). The family of RIG-I like receptors includes the proteins RIG-I, MDA5 and LGP2, which recognize viral RNA in the cytosol. In the first part of this thesis, aspects of the RIG-I pathway are discussed: With which RNA does RIG-I interact and how? Does the oligomeric state of RIG-I change upon RNA binding in or- der to trigger signaling? How is RIG-I regulated by ubiquitin and its E3 ubiquitin ligase TRIM25? The structure of the PRYSPRY domain of TRIM25, its putative RIG-I binding domain, will be presented. Furthermore, preliminary work on the second receptor MDA5 in complex with parainfluenza virus V, which inhibits the MDA5 pathway, protein will be shown. One of the activators of the receptor RIG-I is the RNA of influenza virus. Influenza viruses belong to the family of Orthomyxoviridae that affect birds and mammals and spread in seasonal epidemics. In pandemic years, this can result in up to millions of deaths worldwide, underlining the need for research on efficient novel anti-viral drugs. In the second part of the thesis (appended as an article manuscript), the A/California/04/2009- H1N1 "swine flu" influenza RNA polymerase will be investigated as a novel antiviral drug target. Crystal structures of the endonuclease domain (PA-Nter) of the polymerase with four different inhibitors are presented. Moreover, the atomic structures of H1N1 PA-Nter with rUMP and dTMP, elements of the nucleic acid substrate, in the active site are discussed. These high-resolution structures will serve as a basis for structure-based inhibitor optimization

Des ARN génomiques d’Entérovirus du groupe-B (EV-B)) tronquées en région 5’ non-codante ont été associés au développement de cardiomyopathies humaines. L’impact de ces ARN génomiques viraux sur l’activation de la réponse interféron (IFN) de type I dans les cellules cibles reste inconnu. Dans des cas de myocardite humaine ou expérimentale à EV-B, nous avons identifié par RACE-PCR différentes formes d’ARN tronquées dont les proportions étaient corrélées positivement ou négativement aux niveaux IFN-β dans les tissus cardiaques. Par transfection d'ARN synthétique complet (FL) ou tronquée en région 5’ (5’TD) CVB-3/28 seules ou dans des proportions similaires à celles observées dans le sang, nous avons démontré que la structure "d" du domaine I de l'ARN EV-B possède un motif immunomodulateur de cinq nucléotides responsable de l'induction de la voie IFN-β. En utilisant des cellules STING-37 knockdown pour chaque RLR (RIG-I ou MDA5), nous avons montré que la détection des formes d'ARN 5'TD caractérisées par la perte de ce motif nucléotidique était dépendante de RIG-I et associée à un rétrocontrôle négatif de LGP2, ce qui entraîne une diminution de la réponse IFN-β dans les cellules infectées. En revanche, la détection immunitaire innée des formes FL ou 5'TD avec une tige-boucle "d" conservée était dépendante de MDA5 et associée à des niveaux plus élevés d'IFN-β. Les délétions naturelles de nucléotides affectant le domaine I de la région 5'NC du génome EV-B modulent la détection immunitaire de l'ARN viral par les RLRs. Ces données ouvrent de nouvelles perspectives d’immunothérapie ciblées visant à induire une clairance des tissus cardiaques humains infectées par les EV-B
Group-B Enterovirus (EV-B) genomic RNA forms with deletions in 5' non-coding region (5'NC) have been associated with the development of acute or chronic human cardiomyopathies. The impact of 5’terminally deleted (5’TD) viral genomic RNA populations on type I interferon response activation in target cells remains unknown. In human and murine cardiac biopsies collected during EV-B myocarditis, we identified by a RACE-PCR approach different natural 5’NC deleted RNA forms whose proportions were correlated positively or negatively to IFN-β levels in cardiac tissues. Through transfection of synthetic full-length (FL) or 5’TD CVB-3/28 RNA forms alone or in similar proportions to those observed in blood, we demonstrated that stem-loop "d" structure of EV-B RNA domain I possesses an immunomodulatory five nucleotide motif responsible for IFN-β pathway induction. Using STING-37 knockdown cells for each RLRs (RIG-I or MDA5), we evidenced that the sensing of 5’TD RNA forms characterized by the loss of this nucleotide motif was RIG-I-dependent and associated with an LGP2 negative feedback, resulting in IFN-β response decrease in infected cells. By contrast, the innate immune sensing of FL or 5’TD forms with conserved stem-loop “d” structure was MDA5-dependent sensing and associated with higher IFN-β levels. Natural nucleotide deletions affecting domain I of 5'NC region of EV-B genome modulate the immune sensing of viral RNA by RLRs. These data should stimulate the development of target immunotherapies to restore an efficient antiviral innate immune response and potentially to achieve a viral clearance of human EV-B infected heart tissues

Lors d'une infection virale, l'hôte déclenche une réponse rapide, la rémonse immunitaire innée, dont l'interféron (IFN) de type I est la cytokine centrale. Des motifs moléculaires associés aux micro-organismes (MAMP) sont déteectés par de nombreux récepteurs dédiés, dont les récepteurs cytoplasmiques de type RIG-I (RLR) identifiés à partir de 2004. Les RLR, au nombre de trois, RIG-I, MAD5 et LGP2, sont les ARN-hélicases composées de deux ou trois types de domaines : deux domaines CARD, resposables du recrutement de la cascade de signalisation, un domaine C-terminal CTD, site de liaison initial de l'ARN viral, et le domaine central hélicase, site secondaire de liaison àl'ARN et possédant également une activité enzymatiques ATP-dépendante. RIG-I est impliqué dans la détection de plusieurs virus dont ceux de l'ordre des mononegavirales (virus de la rage, de la rougeole, Ebola). Ce récepteur reconnait des ARN viraux possédant une région double brin adjacente à une extrémité 5'-triphosphate. Les nombreuses études menées n'ont cepnedant pas encore permis de dégager un mécanisme complet et cohérent de l'activation de RIG-I. Notre objectif était donc d'apporter des réponses molécualires quant au mécanismes d'activation de RIG-I. Dans un premier temps, l'élucidation de la structure de la protéine entière RIG-I de canard, par l'équipe de Stephen Cusack, leur a permis d'identifier une conformation auto-réprimée de la protéine. En l'absence d'ARN le domaine CARD2 interagit avec le sous domaine Hel2i du domaine hélicase. Nous avons apporté une preuve fonctionelle de cette observation. Les mutations F540 A/D, du résidu situé dans le sous domaine Hel2i, inhibent l'interaction CARD2-Hel2i et produisent des mutant constituvement actifs. A l'opposé, les mutations correspondantes dans le domaine CARD2 rendent RIG-I inactif. L'interaction CARD2-Hel2i semble donc impliquer une double auto-répression via (i) le masquage du site de liaison à l'ARN du sous-domaine Hel2i, et (ii) le masquage de résidus du domaine CARD2 impliqués dans le recrutement d'intermédiaires requis pour la transduction du signal. Par ailleurs, l'étude de mutants impliqués dans la liaison et l'hydrolyse de l'ATP nous a permis de proposer un nouveau rôle régulateur pour cette activité enzymatique. Dans un deuxième temsp, l'étude de la nécessité de l'oligomérisation de RIG-I pour l'activation de la réponse IFN a été menée. Eva Kowalinski, en thèse dans l'équipe de Stephen Cusack, n'observe la formation de dimères de RIG-I, in vitro, qu'en présence d'un ARN synthétique possédant deux extrémités 5'-triphosphate. Nous avons complété cette observation avec des analyse montrant que des ARN synthéttiques leader incapables d'induire la dimérisation de RIG-I in viro, activent néanmoins ce récepteur in cellula. Par ailleurs, nim'utilisation de la technique de co-immunoprécipitation, ni celle du test de complémentation basé sur la luciférase Gaussia, avec ou sans activiation par un ARN ou une infection virale, n'ont permis d'observer d'oligomérisation de RIG-I. L'auto-association de RIG-I ne semble donc pas être indispensable pour son activation
Vertebrate are permanently threatened by infections that they manage to counteract using a dedicated system. The innate immunity allows a rapid response against viral infection, mainly through the type I interferon (IFN) production. Dedicated receptors detect microbe-associated molecular patterns (MAMPs), and among them the RIG-likereceptors (RLRs), RIG-I, MDA5 and LGP2, can sense viral RNA into the cytoplasm. RLRs are compossed of two or three different domains : two N-terminal CARDs domains are resposible for signal transduction, a C-terminal domains is the first RNA binding site, and a central helicase domainis the second RNA binding site and possesses an ATP-dependent activity. RIG-I is important for sensing of several mononegavirales, such as rabies, measle and Ebola viruses, and recongnized 5'-triphosphorylated double stranded RNA. Despite intensive studies, a full and comprehensive model of the mechanismof RIG-I activation is still lacking. Our aim was to clarify the first molecular steps of RIG-I activation. First, Stephen Cusack's team elucidated the structure of the full lenght duck RIG-I protein and identified the principle of RIG-I auto-repressed conformation. In absence of ligand RNA, CARD2 domain interacts with Hel2i subdomain of helicase domain. We confirmed this conformation with functional evidence. Mutaions F540A/D, in Hel2i subdomain, inhibits CARD2:Hel2i interaction and renders RIG-I constitutively active. In contrast, the corresponding mutations in the Hel2i contacting site of CARD2 domain produce inactive mutants. Thus CARDS;Hel2i interactio induces an auto-repressed state through a deual masking of both Hel2i RNA binding site and CARD2 residus necessary for signal transduction. Moreover, study of mutants involved in ATP binding and hydrolysis reealed a portential unsuspected regulatory role for the ATP-dependent enzymatic activity of RIG-I. Second, we studied the necessity of RIG-I oligomerization for RIG-I activation. Eva Kowalinski, PhD student in Stephen Cusack's team, observed RIG-I dimers in vitro, only in presence of synthetic RNA with two 5'triphosphorylated ends. We complete this observation with functional assays showing that synthetic leader RNA incapable to induce RIG-I oligomerization in vitro, did activate RIG-I in cellula. Moreover, we did not observe RIG-I oligomerization using either co-immunoprecipitation or Gaussia Luciferase-based-protein complementation assay, after activation with cognate RNA or viral infection. Altogether our results indicate that the self-oligomerization og RIG-I is either dispensable or very transient for signal transduction

Le système immunitaire inné constitue la première barrière de défense du corps humain contre les agents infectieux. Constitue d'une poignée de récepteurs seulement (approximativement 50), ce système est capable de détecter la plupart des agents pathogènes et d'activer le système immunitaire adaptatif. Dans le cas d'une infection virale, deux classes de récepteurs sont mobilisées : les RLRs (Retinoic acid Like Récepteurs) et les TLRs (Toll Like Receptors). La famille des RLRs comprend notamment trois protéines, RIG-I, MDA-5 et LGP2, qui reconnaissent la présence d'ARN viral dans le cytosol. Dans la première partie de cette thèse, nous discuterons de la voie d'activation de RIG-I : avec quels type d'ARN et de quelle manière RIG-I interagit-il ? L'etat d'oligomerisation de RIG-I change-t-il lors de l'interaction avec l'ARN ? De quelle manière RIG-I est-il influence par l'ubiquitine et sa ligase E3, TRIM25 ? Nous présenterons egalement la structure du domaine PRYSPRY de TRIM25, domaine minimum nécessaire à l'interaction avec RIG-I. Nous d'écrirons également les travaux préliminaires obtenus sur un complexe constitue de MDA5 et une molecule d'inhibition virale. L'ARN des virus de la grippe est un des activateurs du récepteur RIG-I. Les virus de la grippe appartiennent 'a la famille des Orthomyxoviridae qui touche les mammifères et les aves créant des épidémies saisonnières. Ces dernières peuvent causer jusqu'à plusieurs millions de morts lors de pandémies, soulignant le besoin de trouver de nouvelles solutions thérapeutiques. Dans la seconde partie de ma thèse, nous nous intéresserons à l'activité endonucléase de l'ARN polymérase du virus A/California/04/2009-H1N1 de la grippe porcine comme une cible pour de nouvelles molécules antivirales. Les structures de quatre inhibiteurs en complexe avec ce domaine seront présentés. Nous présenterons également la structure de PA-Nter avec les substrats rUMP et dTMP co-cristallisés dans le site actif. Toutes ces structures atomiques forment une base pour l'optimisation et la synthèse d'inhibiteurs.