Dissertationen zum Thema „Récepteurs des chimiokines“

Mécanismes d’activation et conséquences fonctionnelles de la dimérisation des récepteurs aux chimiokines

Les chimiokines sont de petites protéines qui régulent la migration des cellules immunitaires. Elles exercent leur action en se liant à des récepteurs appartenant à la famille des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) dont la fonction est intimement liée à la régulation des cellules immunitaires. Notre laboratoire étudie depuis plusieurs années les relations reliant la structure et la fonction des récepteurs aux chimiokines. Ces dernières années, un nouveau concept est venu révolutionner le mode de fonctionnement des RCPGs. En effet, des travaux ont montré que la plupart des RCPGs sont capables de former des dimères. Le but de cette thèse de doctorat est d’étudier de manière systématique la dimérisation des récepteurs aux chimiokines et d’analyser les conséquences fonctionnelles de la dimérisation.

Dimérisation des récepteurs humains aux chimiokines et conséquences fonctionnelles

En utilisant une technique biophysique basée sur un transfert d’énergie de luminescence (BRET) nous avons montré au cours de ce travail de thèse que les récepteurs CCR1, CCR2, CCR5, CCR7 et CXCR4 sont capables de former des homodimères et des hétérodimères. De plus, une dimérisation entre ChemR23, dont le ligand naturel, la chémérine, est structurellement différent des chimiokines, et les récepteurs CCR7 et CXCR4, a également été identifiée.

D’un point de vue fonctionnel, des expériences réalisées au laboratoire dans le cadre d’un autre travail de thèse ont identifié une forme de compétition croisée entre CCR2, CCR5 et CXCR4 où la liaison de ligands (agonistes ou antagonistes) spécifiques de l'un des deux récepteurs inhibe la liaison des ligands spécifiques de l’autre. Ces effets ont été démontrés sur des cellules recombinantes mais aussi sur des cellules immunes et dans un modèle in vivo. (El-Asmar, 2005; Springael, 2006; Sohy, 2007; Sohy, 2009). Au cours de ce travail, nous nous sommes dans un premier temps focalisés sur les

hétéromères de ChemR23 avec CXCR4 et CCR7 et nous avons ensuite étudié plus en profondeur les hétéromères de CCR7. Concernant la dimérisation de ChemR23 avec les récepteurs aux chimiokines CCR7 et CXCR4, nous avons pu mettre en évidence une coopérativité négative de liaison entre les agonistes des récepteurs comme cela avait pu être démontré pour CCR2/CCR5/CXCR4. Par contre, nous n’avons observé aucun effet de compétition hétérologue ou d’inhibition fonctionnelle croisée de l’AMD3100 sur ChemR23 quand il est coexprimé avec CXCR4. De manière additionnelle, nous avons pu observer cette compétition croisée sur des cellules dendritiques murines immatures, démontrant l’existence des effets de l’hétérodimérisation lorsque les récepteurs sont exprimés à un niveau physiologique. Lors de l’étude approfondie des hétéromères de CCR7, nous avons montré que les conséquences fonctionnelles de l’hétérodimérisation de CCR7 sont différentes suivant le récepteur avec lequel il interagit. Pour l’hétérodimère CCR7/CCR2, nous avons identifié une forme de compétition croisée, où la liaison de ligands spécifiques de l'un des deux récepteurs inhibe la liaison des ligands spécifiques de l’autre, rejoignant les effets mis en évidence pour les hétéromères CCR2/CCR5/CXCR4. Ensuite, nous avons montré pour l’hétérodimère CCR7/CCR5 que les ligands de CCR7 sont capables d’inhiber la liaison des ligands spécifiques sur CCR5 mais que l’inverse n’est pas vrai. Enfin, pour l’hétérodimère CCR7/CXCR4, nous n’avons pas pu mettre en évidence d’inhibition croisée, que ce soit dans un sens ou dans l’autre. D’autre part, un effet inhibiteur de CCR7 a également été identifié pour les hétéromères CCR7/CCR5 et CCR7/CXCR4. Nous avons pu montrer que l’expression de CCR7 exerce un effet négatif sur la réponse fonctionnelle de certains récepteurs hétérologues comme CCR5 et CXCR4 mais pas CCR2 ou ChemR23.

L’ensemble de ces données permet de mieux comprendre les interactions entre récepteurs et pourrait mener à l’identification de nouvelles cibles pour les programmes de recherche de molécules thérapeutiques, qui, jusqu’à présent, ciblaient presque exclusivement un seul et unique récepteur.

Etude du mécanisme d’activation du récepteur CCR5 et étude de la relation entre activité constitutive et dimérisation.

De nombreux travaux ont été menés ces dernières années afin de mieux comprendre les mécanismes moléculaires à la base de l’activation des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG). Il apparaît que les RCPGs peuvent se trouver dans plusieurs états conformationnels, dont certains sont favorisés par la présence d’agonistes ou d’antagonistes, ou encore d’anticorps reconnaissant des épitopes conformationnels. Certaines mutations peuvent également induire la stabilisation de certaines conformations, actives ou inactives. Pour les RCPGs appartenant à la famille de la rhodopsine, il en a résulté un modèle selon lequel les récepteurs sont maintenus dans une conformation inactive par un ensemble d’interactions ioniques impliquant l’arginine (R3.50) d’un motif DRY conservé, présent à l’extrémité cytosolique du troisième segment transmembranaire. Les interactions responsables de ce qu’on appelle le « DRY-lock » feraient intervenir notamment l’aspartate (D3.49) adjacent de l’arginine et un aspartate ou glutamate (D/E6.30) localisé au sein de l’hélice 6. Selon ce modèle, la liaison d’un agoniste, ainsi que certaines mutations, favoriseraient la rupture de ces interactions ioniques, et une conformation permettant aux récepteurs de se coupler plus efficacement aux protéines G. Des résultats du laboratoire indiquent cependant que ce modèle ne serait pas transposable complètement au récepteur CCR5.

CCR5 possède intrinsèquement une activité constitutive en absence d'agoniste. Cette activité peut être mise en évidence par l'action d'un des antagonistes de CCR5, le TAK-779, qui s'est révélé posséder une activité de type agoniste inverse. D'autre part, CCR5 possède au sein de l'hélice 6 une arginine en position 6.30 et non pas un glutamate ou un aspartate. Une arginine à cette position ne peut donc contribuer au maintien d’une conformation inactive par interaction avec R3.50 .Dans le but de tester le modèle de « DRY-lock » sur CCR5 et de mieux comprendre les interactions moléculaires impliquées dans l’activation du récepteur, plusieurs récepteurs mutants ont été construits au laboratoire. Tout d’abord, l’arginine 3.50 du motif DRY a été mutée en Asn (R3.50N) afin de rompre les interactions ioniques de ce résidu. L’aspartate 3.49 a été muté en Asn (D3.49N) ou en Val (D3.49V), afin de neutraliser une des interactions du « DRY-lock » (Lagane, 2005). L’arginine 6.30 a été mutée d’une part en Asp (R6.30D) ou en Glu (R6.30E), afin de rétablir une possibilité d’interaction avec R3.50, d’autre part en Ala (R6.30A) et en Gln (R6.30Q) afin de mieux cerner le rôle de la charge de l’arginine. Afin de tester l’hypothèse d’interaction entre le résidu 6.30 et le résidu 2.40, l’aspartate 2 .40 a été mutée en Ala (D2.40A) ou en Arg (D2.40R) et des récepteurs présentant les deux mutations ont également construits (D2.40A/R6.30A et D2.40R/R6.30D). L’ensemble des résultats obtenus par l’analyse de ces mutants a permis de montrer que la nature des interactions entre l’extrémité cytosolique des hélices 3 et 6 influence l’activité du récepteur CCR5 (Springael, 2007). Une interaction forte conduit à une forme de récepteur inactif alors qu’une interaction faible s’accompagne d’une augmentation d’activité constitutive. Cette propriété de CCR5 serait donc partagée avec d’autres récepteurs appartenant à la famille de la rhodopsine. Cependant les interactions inter-hélice stabilisant ces conformations seraient différentes pour CCR5. D’autre part, l’étude de la position 2.40 laisse supposer l'importance du résidu aspartate 2.40 dans le maintien d'une conformation permettant l'activité constitutive du récepteur. Nous avons également testé s’il existait une corrélation entre activité constitutive et capacité du récepteur CCR5 à former des dimères, mais les résultats ne nous ont pas permis de mettre en évidence une quelconque relation entre activité et dimérisation.

Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques
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Les chimiokines sont des petites protéines qui régulent la migration et le "homing" des cellules leucocytaires. Elles jouent également un rôle clef dans le développement de certains cancers en régulant les phénomènes de prolifération, d'angiogenèse ou encore de migration des cellules métastatiques. À ce jour, environs 40 chimiokines et plus de 19 récepteurs appartenant à la famille des récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) ont été répertoriés. De nombreuses études ont montré que les récepteurs liant les chimiokines pouvaient s'associer sous forme de complexes homo et hétéromériques. Les conséquences fonctionnelles associées à l'hétéromérisation sont diverses et fonction de la nature des récepteurs étudiés, du type de cellules sur lesquelles ces récepteurs sont exprimés et de l'expression relative des récepteurs. Cependant, le rôle physiologique exact de l’hétéromérisation des récepteurs aux chimiokines, et des RCPGs de manière générale, resteencore peu connu. Nous avons tenté de répondre à cette question dans ce travail de doctorat en étudiant plus particulièrement l’hétéromérisation de CXCR4 et CCR7 au cours du développement des lymphocytes B. Nous avons montré que le récepteur CXCR4 est exprimé à la surface des lymphocytes B à tous les stades de leur développement et qu’une diminution de l’expression de CXCR4s’opère lors de la transition du stade Pré-B vers les stades B immatures et matures. Cette transition s’accompagne d’une «uprégulation » du récepteur CCR7 qui est le plus fortement exprimé à la surface des lymphocytes B matures. Nous avons par ailleurs montré que la transition du stade Pré-B vers les stades B immatures et matures s’accompagne d’une forte inhibition de CXCR4, les cellules B matures étant totalement réfractaires à la migration dans un gradient de CXCL12. Cette perte totale de fonctionnalité ne pouvant pas s’expliquer par la diminution partielle de l’expression de CXCR4, nous avons testé si l’expression du récepteur CCR7 pouvait contribuer à la perte de fonction de CXCR4 observée. Dans un premier temps, nous avons comparé la capacité de CXCR4 à induire la chimiotaxie des lymphocytes B matures provenant de souris sauvages ou de souris CCR7KO déficientes pour l’expression de CCR7. Nous avons montré que l’absence de CCR7 permet de récupérer une migration significative des lymphocytes B matures dans un gradient de CXCL12. De manière intéressante, l’absence de CCR7 affecte spécifiquement la fonction de CXCR4 mais pas celle des récepteurs CXCR5 et CCR6 également exprimés à la surface des lymphocytes B matures. De plus, l’inhibition de CCR7 des lymphocytes B matures sauvages par des anticorps bloquant ne permet pas de reproduire l’effet de l’absence de CCR7. Ce résultat suggère que la signalisation du récepteur CCR7 ne serait pas impliquée. Nous avons également montré que l’absence de CCR7 s’accompagne d’un nombre plus important de lymphocytes B matures dans la moelle osseuse des souris CCR7KO, en parfait accord avec le rôle connu de CXCR4 dans la rétention des progéniteurs hématopoïétiques au sein de la moelle osseuse. Nous avonségalement montré que l’expression du récepteur humain CCR7 dans la lignée lymphocytaire Pré-B humaine Nalm-6 ou dans des cellules CHO-K1 exprimant le récepteur CXCR4 suffit à induire une perte de fonctionnalité de CXCR4. Tout comme pour les lymphocytes B maturesmurins, cette inhibition s’exerce en absence de toute stimulation de CCR7. Nous avons aussi montré que l’expression de récepteurs CCR7 mutants incapables de lier les chimiokines CCL19 et CCL21 (mutant CCR7NT) ou d’induire une signalisation (mutants CCR7D(R/A)Y et CCR7(N/A)PXXY) sont toujours capables d’induire l’inhibition de CXCR4, ce qui confirme qu’une signalisation CCR7 n’est pas nécessaire pour induire le phénomène de la régulation de CXCR4. Ce résultat montre aussi que les fonctions de signalisation et de régulation de CCR7peuvent être découplées.Nous avons également tenté d’identifier le mécanisme moléculaire associé à l’inhibition de CXCR4 par CCR7. Grâce à l’utilisation de biosenseurs BRET mesurant l’activation des protéines G, nous avons montré que l’expression de CCR7 inhibe fortement l’activation de la protéine Gαi2 connue pour jouer un rôle important dans la migration des lymphocytes. Ce résultat permet donc d’expliquer la perte de migration détectée dans les lymphocytes B coexprimant CXCR4 et CCR7. Cependant, nous avons aussi montré que l’expression de CCR7 n’empêche pas l’interaction physique de la protéine Gαi2 avec le récepteur CXCR4. Nous avons alors émis l’hypothèse que CCR7 exercerait son effetinhibiteur sur CXCR4 en interagissant physiquement avec lui et en altérant sa capacité à activer la protéine Gαi2. Nous avons montré par différentes techniques que le récepteur CCR7 interagit avec CXCR4 et que la conformation du complexe formé par CXCR4 et la protéineGαi2 est différente suivant que cette interaction a lieu au sein d’un homomère CXCR4/CXCR4 ou d’un hétéromère CXCR4/CCR7. L’ensemble de ces données suggère donc que l’hétéromérisation de CXCR4 avec CCR7 change la conformation du complexe CXCR4/Gαi2 et la capacité de CXCR4 à activer la protéine Gαi2. De manière intéressante, l’hétéromérisation de CXCR4 avec CCR7 inhibe également l’activation de la protéine Gαi1 mais pas celle de la protéine Gαi3. Ce résultat très intéressant suggère que l’hétéromérisation CXCR4/CCR7 ne serait pas simplement associée à une inhibition de la fonction de CXCR4 mais plutôt à une modulation de son profil d’activation. Cette hypothèse suggère donc que le récepteur CCR7 jouerait le rôle de modulateur allostérique endogène de CXCR4 capable de moduler l’activation de certaines voies de signalisation tout en en laissant d'autres fonctionnelles. Cependant, le manque de temps ne nous a pas permis de confirmer le maintiend’un signal dépendant de Gαi3 dans les cellules coexprimant CXCR4 et CCR7.L’ensemble de ces résultats suggèrent que le récepteur aux chimiokines CCR7 exercerait le rôle de modulateur allostérique de CXCR4 au cours du développement des lymphocytes B et que cette fonction nécessiterait l’interaction physique de CXCR4 et CCR7.À notre connaissance, ces résultats constituent la première indication que l’hétéromérisation de récepteurs aux chimiokines peut jouer un rôle dans un processus physiologique.
Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine)
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Le sepsis est la réaction inflammatoire généralisée secondaire à une infection. C’est une pathologie fréquente et grave qui fait intervenir le système immunitaire. L’action de l’immunité innée se fait par l’activation et le recrutement des monocytes, des cellules mononuclées circulantes qui modulent le phénomène inflammatoire. La mobilisation des monocytes fait intervenir les cytokines chimiotactiques (chimiokines) et leurs récepteurs. Nous nous sommes spécifiquement intéressé dans ce travail au rôle de l’expression monocytaire des récepteurs aux chimiokines CCR2 et CX3CR1 au cours du sepsis. Pour ce faire, nous avons utilisé des modèles murins de sepsis et analysé le rôle d’un polymorphisme génétique de CX3CR1 dans une cohorte de malades atteints de sepsis. Nous avons montré qu’au cours du sepsis, les monocytes présentaient une augmentation de l’adhérence aux parois vasculaire contrôlée par le récepteur CX3CR1. Nous avons également montré que les monocytes inflammatoires jouaient un rôle essentiel dans la régulation du phénomène inflammatoire au cours du sepsis en protégeant le rein des lésions septiques. Cette protection est médiée par l’expression de CX3CR1. L’allèle I249 du gène Cx3cr1, à l’origine d’une augmentation des propriétés adhésives du couple CX3CR1/CX3CL1, est un facteur protecteur dans la survenue d’insuffisance rénale aiguë chez le malade atteint de sepsis. Collectivement, ces travaux confirment un rôle régulateur des monocytes inflammatoires au cours du sepsis et identifient de potentielles nouvelles cibles thérapeutiques
Sepsis is the generalized inflammatory response secondary to an infection. This is a common and serious condition that involves the immune system. The action of innate immunity in sepsis is mediated by the activation and recruitment of monocytes, which are mononuclear circulating cells, which modulate the inflammatory process. The mobilization of monocytes involves chemotactic cytokines (chemokines) and their receptors. This work was specifically focused on the role of monocyte expression of chemokine receptors CCR2 and CX3CR1 in sepsis. To this end, we used mouse models of sepsis and analyzed the role of a common genetic polymorphism of CX3CR1 in a cohort of patients with sepsis.We have shown that in sepsis, monocytes’ motility was modified with an increase of their adhesion to vascular walls that was controlled in part by CX3CR1. We have also shown that inflammatory monocytes play a key role in the regulation of the inflammatory phenomenon in sepsis and that they protected the kidney from septic lesions via a CX3CR1 mediated adhesion mechanism. The I249 allele of CX3CR1, confering increased adhesive properties to monocytes, is a protective factor regarding the occurrence of acute kidney injury in septic patients. Collectively, these data confirm a a regulatory role for inflammatory monocytes during sepsis and identify potential new therapeutic targets

La dimérisation des récepteurs couplés aux protéines G est un nouveau concept apparu dans la littérature au cours des quelques années qui ont précédé le début de notre travail. Bien qu’il soit clairement établi que les récepteurs sont capables de former des homo et des hétérodimères, les conséquences fonctionnelles de telles interactions demeurent souvent peu claires. Dans une étude précédente, le laboratoire d’accueil a montré que les récepteurs aux chimiokines CCR2 et CCR5 forment des homo et des hétérodimères de manière constitutive et identifié une coopérativité négative de liaison de nature allostérique entre les deux sites de liaison de CCR2 et CCR5 dans des cellules co-exprimant les deux récepteurs. Dans ce travail, nous avons étendu cette étude au récepteur CXCR4, structurellement plus éloigné que CCR2 et CCR5 entre eux. Nous montrons par une méthode biophysique se basant sur le transfert d’énergie de bioluminescence (le BRET) que CCR2, CCR5 et CXCR4 forment des homodimères et des hétérodimères de manière constitutive. De plus nous démontrons une coopérativité négative de liaison de nature allostérique des deux sites de liaisons pour les hétérodimères CCR2/CXCR4 et CCR5/CXCR4. lorsque CXCR4 est co-exprimé avec CCR2 ou CCR5, la chimiokine spécifique de CXCR4 (SDF-1α) inhibe la liaison du traceur spécifique de CCR2 (MCP-1) ou du traceur spécifique de CCR5 (MIP-1β), et vice-versa. La nature allostérique de ces interactions est démontrée par des expériences mesurant la dissociation de traceurs en présence ou non de compétiteurs. La coopérativité négative de liaison de nature allostérique des deux sites de liaisons est montrée également dans des cellules primaires, excluant tout effet indésirable dû à la surexpression de récepteurs. Nous montrons également que l’antagoniste spécifique de CXCR4 (AMD3100) inhibe la liaison du traceur spécifique de CCR2 (MCP-1) ou du traceur spécifique de CCR5 (MIP-1β), et vice-versa (TAK-779 vs SDF-1α), uniquement quand CXCR4 est co-exprimé respectivement avec CCR2 ou CCR5. Il s’agit là de la première preuve montrant que les interactions allostériques au sein d’hétérodimères de récepteurs aux chimiokines impliquent aussi des antagonistes, et qu’un antagoniste de récepteur aux chimiokines influence la réponse fonctionnelle d’un autre récepteur aux chimiokines auquel il ne se lie pas. De tels effets fonctionnels ont été montré dans des expériences de mobilisation de Ca++, de chimiotactisme sur lymphoblastes et dans des expériences d’air pouch in vivo.
Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques
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Les chimiokines sont impliquées dans la chimioattraction. Dans le domaine cardiovasculaire, des études ont suggéré que les chimiokines pourraient être des médiateurs de la fonction cardiaque. L’objectif de ma thèse a été de définir dans le tissu cardiaque, le rôle de la chimiokine CXCL12 à travers sa liaison à chacun de ses récepteurs : CXCR4 et CXCR7. Les travaux présentés dans ce mémoire ont permis de mettre en évidence pour la première fois : l’expression protéique et la localisation dans les cardiomyocytes de l’isoforme spécifique CXCL12g et des récepteurs CXCR4, CXCR7, suggérant que cette chimiokine pourrait à travers ses récepteurs agir selon un système autocrine/paracrine. CXCL12 via ses deux récepteurs CXCR4 et CXCR7 apparaît comme un acteur incontournable dans l’organogenèse comme dans la fonction normale et pathologique du cœur
Chemokines are involved in chemoattraction. Some studies realized on normal heart and during cardiac pathological condition suggested that these proteins could be considered as key protein of cardiac fonction. The purpose of my thesis was to define in cardiac tissue the role of the chemokine CXCL12 via its interaction with these two receptors: CXCR4 and CXCR7. Findings presented in this report show for the first time that the protein expression and localization of CXCL12g isoforme and CXCR4 CXCR7 receptors in cardiac myocytes suggested that CXCL12 could acts via these two receptors as an autocrine/paracrine system. The chemokine CXCL12 via its two receptors CXCR4 and CXCR7 represented a key protein in the cardiac organogenesis as in normal and pathological cardiac function

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) sont la famille de récepteurs membranaires la plus représentée chez les vertébrés, et la plus grande cible thérapeutique chez l'Homme. L'évolution du paradigme initial qui énonçait une stœchiométrie récepteur : protéine G : effecteur de 1 :1 :1 sera présentée sur le modèle des récepteurs aux chimiokines CXCR4 et CCR2. Grâce à la technique de transfert d'énergie par bioluminescence (BRET), les travaux réalisés durant cette thèse montrent (1) que c'est par un couplage alternatif de CXCR4 à Gα13 au lieu de la voie classique Gαi que les cellules de cancer du sein migrent pour former des métastases, (2) que la désensibilisation de CXCR4 implique le recrutement d'une combinaison définie de protéines (GRK et arrestines) permettant l'arrêt sélectif des multiples voies engagées en réponse à l'agoniste, et (3) que le protomère CXCR4 a un rôle déterminant dans l'engagement de la protéine Gαi et le recrutement de la β-arrestine par l'hétéro-oligomère CXCR4/CCR2 lorsque CCR2 est activé. Dans cette dernière et principale étude, les résultats montrent également que le dimère CCR2 peut s' assembler au dimère CXCR4 pour former un tétramère, et que l'activation de CCR2 influence la conformation du dimère CXCR4. Les phénomènes de coopérativité et d'activation asymétrique déjà rapportés pour cet hétérodimère pourraient donc impliquer l'interaction de quatre protomères. En conclusion les travaux effectués durant cette thèse démontrent une régulation supplémentaire de l'activité des récepteurs chimiokines au niveau de leur structure quaternaire, de leur signalisation, et de l'arrêt de cette signalisation
G protein coupled receptors (GPCR) are the most represented cell surface receptors among vertebrates, and the major therapeutic target in humans. The initial paradigm stating a 1 :1 :1 stoichiometry for receptor :G protein :effector has evolved to a more complex model, as illustrated here with the example of the chemokine receptors CXCR4 and CCR2. Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) was used to demonstrate that (1) CXCR4 is able to couple Gα13 instead of Gαi to promote breast cancer metastasis, (2) the multiple pathways engaged by stimulation of CXCR4 are selectively desensitized by the specific recruitment of a defined combination of proteins (GRKs and arrestins) and (3) the CXCR4 protomer plays a crucial role during Gαi engagement and β-arrestin recruitment by the CXCR4/CCR2 heterodimer upon CCR2 activation. In this last and main study, the results shown also demonstrate that CCR2 dimers could assemble with CX CR4 dimers into hetero-tetramers, and that CCR2 activation leads to a conformational change in the CXCR4 dimer. Former results showing cooperativity and asymmetric activation of a simple CXCR4/CCR2 heterodimer could then be applied to a tetramer. To conclude, the work done during this thesis demonstrates a more sophisticated regulation of chemokine receptors than previously suspected at 3 different levels: quaternary structure of the protomers, G protein signalling, and signalling termination

Les maladies à prions sont des affections neurodégénératives létales provoquées par la conversion posttraductionnelle d’une protéine constitutive de l’hôte, la PrPC en un isoforme conformationnelle pathogène, la PrPSc. La perspective de traiter ces affections par l’immunothérapie, de même que la maladie d’Alzheimer, suscite un espoir légitime. Elle laisse aussi entrevoir des difficultés dues à ce que l’antigène cible, la PrPSc, est un constituant du soi, donc pas ou peu immunogène et que l’action se situe dans le SNC, site peu accessible aux agents de l’immunité et sous haut risque. Entre le transfert passif d’anticorps et la vaccination par la PrP, deux stratégies qui ont jusqu’à présent montré une efficacité relative, le transfert cellulaire adoptif apparaît comme une alternative intéressante. Les cellules persistent chez l’hôte, elles peuvent être réactivées, elles franchissent sous certaines conditions la barrière hématoméningée et peuvent recruter d’autres populations effectrices. Nous avons produit une souris Tg exprimant la chaîne  d’un TCR anti-PrP. Malgré des réarrangements  libres, cette souris possède un répertoire CD4+ très enrichi en précurseurs d’intérêt. Vues par immunoscope, les chaînes  associées à la  Tg sont quasi monoclonales. Une première étude a consisté à comprendre le devenir de ces lymphocytes anti-PrP après transfert dans un environnement PrP+ soumis à la tolérance. Ils sont capables de s’activer et de proliférer en réponse au peptide d’intérêt. Dans un second temps nous avons transféré ces CD4 Tg dans des souris déficientes en lymphocytes T infectées par une souche de prion. Ces transferts ont permis de retarder la maladie

Ce travail est composé de deux parties avec les voies dopaminergiques (DA) comme fil conducteur. La première partie est consacrée au rôle de la chimiokine CCL2 et de son récepteur CCR2 dans les voies DA. Nous avons montré chez le rat à l'état normal que CCL2 active la neurotransmission DA nigrostriée, modifiant le comportement moteur. Nous avons ensuite étudié l'implication de CCL2/CCR2 dans le phénomène de sensibilisation à la cocaïne. Ce phénomène est significativement diminué chez les souris KO CCR2-/-. La modulation d'expression du transporteur DA (DAT) par la cocaïne est également altérée chez les souris KO CCR2-/-. Enfin, l'activation de ERK dans le striatum est diminuée chez ces souris après injection aigue de cocaïne. Ces résultats suggèrent l'implication de CCL2/CCR2 dans des processus à court et à long terme impliquant les voies DA. La seconde partie est consacrée à des études translationelles vers la clinique des voies DA dans les mouvements anormaux en orthostatisme. Nous avons étudié 12 patients présentant un tremblement orthostatique (TO) primaire. Aucun ne présentait de perte DA objectivable à la scintigraphie cérébrale au 123I-FP-CIT (Marqueur du DAT). Ces résultats suggèrent que la perte DA n'est pas la règle dans le TO primaire. Enfin, nous avons décrit les mouvements anormaux en orthostatisme observés dans la maladie de Parkinson. Les caractéristiques électrophysiologiques des 11 patients ont permis de définir : un TO rapide, similaire au TO primaire, un TO lent et des myoclonies en orthostatisme. Ces travaux laissent entrevoir des possibilités thérapeutiques nouvelles dans la prise en charge des pathologies impliquant les voies DA.

Comprendre comment le cœur se forme au cours du développement est une étape essentielle pour mieux élucider les causes des maladies cardiaques congénitales. Les cellules de crêtes neurales cardiaques (CCN cardiaques) migrent à partir du tube neural et contribuent à la morphogenèse du cœur. Elles colonisent le cœur pour former la paroi des grandes artères, le septum aorticopulmonaire, qui sépare l’aorte du tronc pulmonaire, une partie du septum interventriculaire et l’innervation parasympathique du cœur. Un défaut de migration ou de différenciation des CCN cardiaques entraîne des phénotypes cardiovasculaires comme un tronc artériel commun, un défaut de formation du septum interventriculaire, un ventricule droit à double issue et des transpositions des vaisseaux cardiaques, anomalies communément observées dans les pathologies congénitales cardiaques chez l’homme. Les mécanismes par lesquels les CCN cardiaques contribuent à la morphogenèse du cœur ne sont pas réellement élucidés à l’heure actuelle. Des résultats récents suggèrent que les CCN cardiaques pourraient être guidées vers le cœur par un mécanisme de chimiotactisme. Les souris déficientes pour la chimiokine Sdf1 et pour les deux récepteurs de cette chimiokine, Cxcr4 et Cxcr7 présentent des défauts dans la formation du septum interventriculaire, suggérant que ces anomalies cardiaques pourraient être reliées à un défaut de migration des CCN cardiaques. Nos résultats montrent une expression spécifique et dynamique de la signalisation SDF1/CXCR4/CXCR7 au cours de la migration des CCN cardiaques chez le poulet. La perte de fonction de CXCR4 dans les CCN induit un retard de migration et une augmentation de l’apoptose des CCN cardiaques, ce qui entraîne des malformations cardiaques dont des ventricules droits à double issue et des défauts de septum interventriculaire. L’expression ectopique de SDF-1 induit une chimiotaxie des CCN cardiaques. Nos résultats démontrent donc que SDF-1 régule la migration des CCN cardiaques vers le cœur et qu’un défaut de cette signalisation entraîne des anomalies cardiaques importantes. De la région d’où émergent les CCN cardiaques proviennent également les CCN entériques qui colonisent le tube digestif. Ces deux populations de CCN empruntent des voies de migration distinctes et notre travail a permis de montrer que la chimiokine SDF-1 joue un rôle dans la ségrégation de ces deux populations de CCN. De plus, nos résultats montrent un rôle de SDF-1 et CXCR4 dans la migration des CCN crâniennes à l’origine de la formation de la mâchoire inférieure. L’ensemble de nos résultats, qui démontre une nouvelle fonction de la signalisation SDF-1 au cours du développement embryonnaire ouvre des perspectives nouvelles pour la compréhension et la détection de certaines formes de cardiopathies congénitales isolées ou syndromique chez l’homme
Understanding how the heart develops is an essential step for a better understanding of congenital heart diseases. Cardiac neural crest cells (CNC) originate from the neural tube and contribute to heart morphogenesis. They migrate through the heart by giving rise to mesenchymal cells of the outflow tract, to the ventricular septa and the semilunar valves, as well as to neuronal cells of the cardiac ganglia and smooth muscle cells of the great arteries. Failure in CNC migration or differentiation results in septation defects of the outflow and ventricular tracts, double outlet right ventricle and interrupted aortic arch, which are commonly observed in congenital heart diseases. The migration pathways of CNC have been well studied however, molecular mechanisms regulating these processes need to be more defined. Some recent results suggest that CNC could find their way to the heart by chemotaxis. Cardiac development is aberrant in the Sdf-1 chemokine knockout mice, as well as in knockout mice of its two receptors, Cxcr4 and Cxcr7. Mutant animals present ventricular septal defects, suggesting that cardiac abnormalities could be related to CNC. Our results show a specific expression of the SDF-1 signalling pathway in CNC in chick embryos. We have demonstrated, by gain and loss of function approaches in chick embryo, that SDF-1 play a role in CNC migration and a defect in SDF-1 pathway leads to major anomalies in heart development, which phenocopy those observed in mice deficient for these genes. From the region where arise the CNC, arise also the progenitors for enteric ganglia (Enteric Neural Crest ENC). CNC and ENC follow different migration pathway and our work demonstrate a role of SDF-1 signalling in the segregation of this two population of NC. Furthermore, we show that SDF-1 and CXCR4 are important for the migration of cephalic NC that give rise to the lower jaw. Our project demonstrates a novel function for SDF-1 signalling in embryonic development. We think that it will open new issues to investigate the role of Sdf-1, Cxcr4 and Cxcr7 genes in cardiac congenital pathologies

Le système des chimiokines coordonne la migration des leucocytes dans l'immunité et l'inflammation. Il est également impliqué dans la pathogenèse de nombreuses maladies humaines. Les variations génétiques naturelles dans les gènes codant pour les chimiokines et les récepteurs de chimiokines pourraient être responsables d'une dérégulation de leur expression ou de modifications de leur structure. Ainsi, ces variations peuvent moduler les réseaux de recrutement cellulaire, modulations qui peuvent alors devenir des facteurs de résistance ou de susceptibilité dans l'évolution clinique de certaines pathologies. Pour cette raison, nous avons étudié certains polymorphismes fonctionnels des chimiokines et de leurs récepteurs dans cette thèse dans deux pathologies inflammatoires liées à l'immunité: l'asthme et l'arthrite rhumatoïde. Le but de cette étude était de rechercher le rôle des chimiokines et de leurs récepteurs dans la susceptibilité à et/ou l'évolution clinique de l'asthme et l'arthrite rhumatoïde. Les fréquences alléliques des polymorphismes CCL2-2578G, CCL2-927C, CCR2-V64I,CX3CR1-V249I et CX3CR1-T280M ont été étudiées chez les enfants asthmatiques résidant en Tunisie. L’étude cas-témoins et l'étude familiale ont suggéré un effet protecteur de l'allèle CCL2-2578G chez les enfants asthmatiques. La même approche a été appliquée dans une cohorte de patients d'origine caucasienne atteints d'arthrite rhumatoïde. Dans cette analyse, l'étude des génotypes et d'autres caractéristiques phénotypiques a révélé une association entre le génotype CX3CR1 T280M et le facteur rhumatoïde. L'étude a aussi permis de démontrer une interaction entre la présence du génotype T280M et le HLA-DR. Cependant, comme prévu, il y avait une forte association entre la présence du HLA-DR et de la présence du facteur rhumatoïde. En outre, des associations significatives ont été observées entre le génotype CX3CR1 249I et le score Larsen. Ces résultats sont compatibles avec le rôle fonctionnel connu de CX3CL1 dans la pathogenèse de l'arthrite rhumatoïde. Le blocage du recrutement des leucocytes dans les tissus pathologiques serait bénéfique aux personnes souffrant de maladies inflammatoires et auto-immunes. CX3CL1 participe à divers processus inflammatoires, notamment l'athérosclérose artérielle et cérébrale ainsi qu'à l'inflammation rénale. En utilisant une stratégie «phage display», nous avons conçu un analogue hCX3CL1 avec un domaine N-terminal modifié. Les propriétés biochimiques et pharmacologiques de cette molécule ont été testées in vitro et in vivo. Cet antagoniste du CX3CR1 pourrait être utile dans des conditions inflammatoires où l'axe CX3CL1/CX3CR1 est engagé

L'ischémie tissulaire associée à certaines pathologies déclenche un processus de néovascularisation et de remodelage tissulaire dont le but est de favoriser la survie et la fonction des tissus atteints. Le développement d'une réaction inflammatoire est un élément prépondérant de ce remodelage tissulaire. Cependant, une réaction inflammatoire exagérée peut provoquer des dommages tissulaires. Notamment, dans un contexte d'infarctus du myocarde, une réaction inflammatoire mal contrôlée participe au mauvais remodelage du ventricule gauche. Dans un premier travail, nous avons étudié le rôle de voies de signalisation dépendantes des chimiokines dans la mobilisation et le recrutement de deux sous types monocytaires, Ly6Chi et Ly6Clo, dans un modèle murin d'ischémie des membres inférieurs. Nous avons démontré que la signalisation dépendante de la chimiokine CCL2 et de son récepteur CCR2, contrôlait la mobilisation de monocytes proangiogéniques Ly6Chi depuis la moelle osseuse vers le sang, modulant en conséquence l'étendue du processus de néovascularisation. Dans une seconde étude, nous avons démontré, dans un modèle murin d'infarctus du myocarde, que le récepteur leurre aux chimiokines D6, ayant la capacité de lier et internaliser les chimiokines inflammatoires de la famille CC, limitait l'accumulation locale et systémique de la chimiokine CCL2, contrôlant ainsi l'étendue de la réaction inflammatoire dans le myocarde ischémique. L'absence de D6 conduit à une réaction inflammatoire exacerbée, associée à une mortalité post-infarctus accrue et provoquant un remodelage cardiaque délétère
Tissue ischemia triggers a process of tissue remodelling and neovascularization whom goal is to promote survival and function of the injured tissue. Inflammation has a major role in this process. Nevertheless, overwhelming inflammation can exacerbate ischemia-associated tissue damage. Of note, in a setting of myocardial infarction, excessive inflammation promotes adverse left ventricle remodelling. In a first line of work, we have analyzed the role of several chemokine dependent signaling pathway in the mobilization and recruitment of two monocyte subsets, namely Ly6Chi and Ly6Clo, in a murine model of hindlimb ischemia. We have shown that CCL2/CCR2 signaling controled mobilization of proangiogenic Ly6Chi monocytes from the bone marrow to the bloodstream, subsequently modulating post-ischémic vessel growth. In a second study, we have shown, in a murine model of myocardial infarction, that the chemokine decoy receptor D6, which has the ability to bind and internalize inflammatory CC-Chemokines, was able to limit local and systemic accumulation of CCL2. Hence, D6 controlled the extent of inflammation after myocardial infarction, and D6 deletion led to adverse left ventricle remodelling and cardiac rupture

Lors de réactions inflammatoires du testicule, une infiltration leucocytaire est observée. Le but de notre étude a été de déterminer si les cellules testiculaires pouvaient produire des chimiokines, molécules responsables de l'attraction des leucocytes. Nos résultats montrent que les cellules somatiques du testicule sont capables de produire les chimiokines MCP-1, GRO, IP-10 et fractalkine en réponse à des cytokines pro-inflammatoires ou à du LPS. De plus, la fractalkine est également présente en conditions basales et possède, au sein du testicule, un deuxième transcrit que nous avons caractérisé. D'autre part, de nombreuses observations font du testicule une cible potentielle du VIH. Nous avons donc a donc recherché les principaux récepteurs du VIH : CD4, CCR5, CXCR4 et CCR3 dans le testicule. Nous démontrons la présence de CD4, CCR5 et CXCR4 uniquement au niveau des macrophages résidents testiculaires. Ainsi, ces cellules deviennent des cibles du virus et une voie d'infection et de réplication au sein du testicule.

Avec 42 000 nouveaux cas diagnostiqués en 2012, le cancer colorectal (CCR) représente en France le troisième cancer en termes d’incidence. Les métastases, qui surviennent principalement au niveau du foie et des poumons, en constituent la principale cause de décès. Malgré les progrès récents de la chimiothérapie et des agents ciblés, le taux de survie à 5 ans des patients présentant un CCR métastasé reste faible. Aujourd’hui, la résection chirurgicale est le seul traitement curatif, cependant moins de 20% des patients porteurs de métastases sont opérables. Il existe donc un grand nombre de patients présentant un CCR métastasé pour lequel aucun traitement curatif ne peut être proposé. La formation des métastases à partir d’une tumeur primaire résulte d’une longue série d’étapes séquentielles liées les unes aux autres. L’issue de ce processus dépend à la fois des propriétés intrinsèques des cellules tumorales et de la réponse de l’hôte. Il a récemment été montré que les couples chimiokines/récepteurs interviennent dans le contrôle des différentes étapes de la progression tumorale.Le projet de recherche développé au cours de mon travail de thèse avait pour objectif d’utiliser les chimiokines et leurs récepteurs dans de nouvelles stratégies thérapeutiques pour bloquer et/ou éradiquer les métastases hépatiques et pulmonaires des CCRs. Le travail s’est articulé selon deux axes dans lesquels nous avons montré d’une part que, le blocage du récepteur de chimiokines CXCR7 permet de limiter les métastases pulmonaires de CCRs et d’autre part que, le transfert de gène codant CX3CL1 au niveau du foie entraîne une réponse anti-tumorale efficace dans les métastases hépatiques de CCRs
With 42 000 newly-diagnosed patients in 2012, the colorectal cancer (CRC) represents the third type of cancer in terms of incidence in France. The leading cause of death from CRC is the development of metastases and these metastases will occur mostly within the liver (50% of the patients) and within the lungs (15%). Despite recent progress, notably in the chemotherapies now used and the targeted agents, the rate of 5-years survival for late stage CRC remains low. Nowadays, the surgical resection is the only curative treatment proposed to patients with metastatic CRC, however less than 20% of them have an operable tumour. There is therefore a high number of patients for whom no cure is currently available. A primary tumour’s dissemination to a second organ is the result of a long process made of numerous cross-linked steps. The final outcome of this process depends on the intrinsic properties of tumour cells as well as the host response. Recently, it has been shown that the chemokine-chemokine receptor pairs (initially described as regulating the leukocyte migration) play crucial roles in the various stages involved in tumour progression. The aim of the research project developed during my PhD was to assess the use of the chemokines and their receptors in new therapeutic strategies to block and/or eradicate the hepatic and pulmonary metastases of CRC. Our work has been organized along two main lines of approach. We have shown that the blockage of the CXCR7 chemokine receptor enables the limitation of the CRC metastases within the lungs and that the CX3CL1 gene transfer into the hepatocytes leads to an efficient anti-tumor response in the CRC metastases within the liver

Avec 42 000 nouveaux cas diagnostiqués en 2012, le cancer colorectal (CCR) représente en France le troisième cancer en termes d'incidence. Les métastases, qui surviennent principalement au niveau du foie et des poumons, en constituent la principale cause de décès. Malgré les progrès récents de la chimiothérapie et des agents ciblés, le taux de survie à 5 ans des patients présentant un CCR métastasé reste faible. Aujourd'hui, la résection chirurgicale est le seul traitement curatif, cependant moins de 20% des patients porteurs de métastases sont opérables. Il existe donc un grand nombre de patients présentant un CCR métastasé pour lequel aucun traitement curatif ne peut être proposé. La formation des métastases à partir d'une tumeur primaire résulte d'une longue série d'étapes séquentielles liées les unes aux autres. L'issue de ce processus dépend à la fois des propriétés intrinsèques des cellules tumorales et de la réponse de l'hôte. Il a récemment été montré que les couples chimiokines/récepteurs interviennent dans le contrôle des différentes étapes de la progression tumorale.Le projet de recherche développé au cours de mon travail de thèse avait pour objectif d'utiliser les chimiokines et leurs récepteurs dans de nouvelles stratégies thérapeutiques pour bloquer et/ou éradiquer les métastases hépatiques et pulmonaires des CCRs. Le travail s'est articulé selon deux axes dans lesquels nous avons montré d'une part que, le blocage du récepteur de chimiokines CXCR7 permet de limiter les métastases pulmonaires de CCRs et d'autre part que, le transfert de gène codant CX3CL1 au niveau du foie entraîne une réponse anti-tumorale efficace dans les métastases hépatiques de CCRs.

L’obésité est maintenant reconnue comme présentant une inflammation chronique et est caractérisée par une augmentation de l’infiltration de macrophages dans le tissu adipeux. Cette infiltration est réflètée par l’activation du système du complément qui agit comme élément déclencheur et précurseur aux autres fonctions immunitaires. Le C5L2 (C5aR-like receptor 2) a récemment été identifié comme récepteur pour la protéine stimulant l’acylation (ASP) ainsi que pour le facteur inflammatoire C5a (capable quant à lui d’aussi se lier au C5aR). Cette thèse porte sur: (i) l’interaction entre C5L2 et C5aR suite à l’activation de ceux-ci par leurs ligands respectifs dans des lignées cellulaires adipocytaires (3T3-L1) et de macrophages (J774), (ii) la contribution du C5aR au métabolisme et à la réponse immunitaire d’adipocytes provenant de modèles murins et (iii) l’association entre C5L2 et C5aR avec des facteurs reliés à l’obésité chez l’humain. Les récepteurs C5L2 et C5aR s’associent entre-eux de façon constitutive en homo- et hétérodimères et l’ajout de ligand à des cultures d’adipocytes 3T3-L1 ou de macrophages J774 augmente cette colocalisation. Autant l’ASP que le C5a ont réussi à induire une réponse fonctionnelle chez des adipocytes primaires. Lorsque des adipocytes primaires provenaient de souris invalidées pour le C5aR, les effets d’un traitement avec C5a étaient perturbés tandis que les effets médiés par un traitement à l’ASP étaient maintenus. De plus, l’addition de C5a bloquait la signalisation et la réponse fonctionnelle causées par un traitement à l’ASP chez les adipocytes primaires provenant de souris C5aRKO et de type sauvage. Finalement, l’expression des gènes C5L2 et C5aR dans le tissu adipeux de femmes obèses morbides était associée avec une adiposité croissante. De façon interessante, les ratios ASP/C5L2 et C5L2/C5aR augmentaient de façon significative avec l’obésité abdominale. Lorsque pris ensemble, l’interaction fonctionelle, physiologique et la proximité physique des récepteurs C5L2 et C5aR chez les adipocytes suggèrent un rôle potentiel de ceux-ci sur l’immunométabolisme du tissu adipeux. De surcroit, cette interaction met en valeur les liens qui existent entre le tissu adipeux et les protéines et récepteurs du complément tout en démontrant comment une réponse excessive au niveau immuno-métabolique pourrait exacerber le développement du niveau d’adiposité chez l’individu.
From the convergence of metabolism and immune research has emerged a new research field, termed “Immunometabolism”. Obesity, an immunometabolic disease, is associated with a state of low-grade inflammation and is characterized by increased infiltration of macrophages into adipose tissue. Complement activation can act as an early trigger and precursor of other immune functions. C5aR-like receptor 2 (C5L2) has been identified as a receptor for Acylation Stimulating Protein (ASP) and the inflammatory factor C5a (which can also bind C5aR). This thesis sequentially evaluates (i) ligand-induced C5L2 and C5aR interaction in cultured 3T3-L1 adipocytes and J774 macrophages, (ii) the C5aR contribution in adipocyte metabolic and immune responses in mouse models, (iii) as well as C5L2 and C5aR association with obesity-related factors in humans. The immunometabolic receptors, C5L2 and C5aR, constitutively self-associate into homo-/heterodimers and ligand treatment of 3T3-L1 adipocytes and J774 macrophages increased their colocalization. Both C5a and ASP directly induced primary adipocyte signaling and function. However, in C5aRKO primary adipocytes, C5a effects were disrupted, while stimulatory effects of ASP were mostly maintained. Moreover, addition of C5a completely blocked ASP signaling and activity in both C5aRKO and WT primary adipocytes. Finally, C5L2 and C5aR expression in adipose tissue from morbidly obese women was associated with increased adiposity. Interestingly, ASP/C5L2 and C5L2/C5aR ratio markedly increased with abdominal obesity. Taken together, the closely linked physical, functional and physiological interaction between C5L2 and C5aR in adipocytes suggests a potential role in adipose tissue immunometabolism. This further highlights the important new links between adipose tissue and complement proteins/receptors and demonstrates how excessive immunometabolic responses may exacerbate adiposity.

Depuis plusieurs années, il est clairement établi que les chimiokines et leurs récepteurs, initialement décrits pour réguler la migration des leucocytes, jouent un rôle important dans la progression et l’invasion tumorale. L’expression de plusieurs récepteurs de chimiokines a été rapportée dans de nombreux cancers dont l’ostéosarcome. De plus, il s’avère que certains ligands de ces récepteurs sont exprimés dans les organes notamment les poumons qui représentent le site préférentiel d’apparition des métastases des ostéosarcomes. L’objectif de ma thèse a été, dans un premier temps, de démontrer le rôle des couples chimiokines-récepteurs dans le processus de mise en place et de développement des métastases pulmonaires d’ostéosarcome. L’utilisation d’antagonistes spécifiques de récepteurs de chimiokines dans des modèles expérimentaux de métastases pulmonaires d’ostéosarcome chez la souris a permis de montrer, in vivo, que le blocage de certains couples de chimiokines-récepteurs diminue de manière significative l’implantation et le développement des métastases au niveau des poumons. Ces résultats peuvent être expliqués par les expériences réalisées in vitro qui montrent que le blocage des interactions entre ces chimiokines et leurs récepteurs perturbe les mécanismes de migration, de survie et de mort cellulaire des cellules tumorales ainsi que la production et l’activation de certaines métalloprotéases. La deuxième partie de mon travail concerne une étude pré-clinique d’immunothérapie génique qui met à profit les propriétés d’une chimiokine, à recruter certaines cellules du système immunitaire et à déclencher une réponse anti-tumorale de l’hôte
Metastasis continues to be the leading cause of mortality for patients with cancer. Several years ago, it became clear that chemokines and their receptors could control the tumor progress. Expression of many chemokines receptors have now been identified in many cancers including osteosarcoma. Corresponding ligands were expressed by lungs that are the primary sites to which this tumor metastasize. This study tested the hypothesis that disruption of interaction between chemokine and this cognate receptors could lead to a decrease in lungs metastasis. The experimental design involved the use of pecific antagonist in two murine models of osteosarcoma lung metastases. Mice that were systematically treated with the antagonist had a significant reduction in metastatic disease. These results can be explained by experiments realized in vitro which show that the blocking of the chimiokines-receptors interaction decreased migration, decreased matrix metalloproteinase activity, decreased proliferation/survival and increased caspase-independent death. The second part concerns a preclinical study of immunotherapy which use the properties of a chimiokine, to recruit certain cells of the immune system and to activate an antitumoral host response

Dans le glaucome (GPAO), la dégénérescence du nerf optique est associée à une augmentation de la pression intraoculaire (PIO) causée par la dégénérescence du trabéculum. Nous avons montré que cette chimiokine et son récepteur CX3CR1 sont exprimés au niveau de trabéculums de patients ainsi que dans une lignée humaine trabéculaire. Nous avons montré in vitro que cette chimiokine est impliquée dans la prolifération et la migration des cellules trabéculaires. Les propriétés chimio-attractantes de CX3CL1 nous ont conduits à étudier son implication dans l’infiltration leucocytaire de la conjonctive. Nous avons montré que les cellules conjonctivales de patients exposés au chlorure de benzalkonium (BAK), un conservateur toxique des collyres, surexpriment CX3CL1. Des expériences in vitro sur des lignées humaines conjonctivales et in vivo sur des souris témoins et déficientes pour le récepteur CX3CR1 ont montré que CX3CL1, en présence de BAK, induit une infiltration de certains phénotypes leucocytaires. De plus, nous avons montré que des trabéculums humains ainsi qu’une lignée cellulaire trabéculaire in vitro expriment CXCL12 et sa forme tronquée, le SDF-1(5-67). Des études in vitro ont mis en évidence le rôle protecteur de CXCL12 via le récepteur CXCR4, ainsi que l’action délétère de SDF-1(5-67) via le récepteur CXCR3. Nous avons montré in vivo sur des rats témoins et des rats rendus hypertones par chirurgie que SDF-1(5-67) est responsable d’une augmentation de la PIO et que le blocage de CXCR3 permet une restauration de la filtration trabéculaire. Ces trois études mettent en évidence l’existence d’un système «chimiokinergique» qui participe à la physiopathologie du GPAO
In primary open-angle glaucoma (POAG), retinal nerve degeneration is associated with pathological ocular hypertension (OHT) due to the degeneration of the trabeculum. We showed that human trabeculum obtained by surgery from glaucomatous patients and a human trabecular cell line express CX3CL1 and its receptor CX3CR1. We showed that CX3CL1 enhanced both proliferation and migration of trabecular cells. The chemoattracting abilities of CX3CL1 led us to investigate its implication in the leukocytic infiltration of conjunctival tissue during inflammation. This tissue was exposed to a toxic preservative present in ophthalmic medications: benxalkonium chloride (BAK). We showed that conjunctival cells from patients exposed to BAK overexpress CX3CL1. In vitro experiments on human conjunctival epithelial cell lines demonstrated that CX3CL1, in the presence of BAK, induces a selective attraction of leukocytes subsets. This observation was verified in vivo using CX3CR1-deficient mice as compared to CX3CR1+/+ controls. We identified the expression of both forms CXCL12 and SDF-1(5-67) in human glaucomatous trabecular tissue as well as in HTM cells. We performed in vitro experiments and demonstrated that CXCL12 acts as a protective chemokine via its CXCR4 receptor whereas the processing of CXCL12 into SDF-1(5-67) has a deleterious effect via CXCR3 receptor. We showed that SDF-1(5-67) induces apoptosis via CXCR3. We also demonstrated that in vivo blockade of CXCR3 by a specific antagonist can restore trabecular filtrating function. These three studies present evidence of a chemokinergic system that plays a role in the cellular physiopathology of POAG

Les chimiokines, petites protéines sécrétées par de nombreux types cellulaires, régulent le trafic et la fonction des populations leucocytaires en interagissant avec leurs récepteurs spécifiques, qui appartiennent à la superfamille des récepteurs à 7 domaines transmembranaires couplés aux protéines G. Dans le contexte tumoral, les chimiokines jouent des rôles ambivalents, en régulant le recrutement des leucocytes, ainsi que la croissance et l’angiogenèse des tumeurs. Aussi, les chimiokines semblent également contribuer à déterminer les sites métastatiques des tumeurs malignes.

Notre travail porte sur l’étude du rôle de chimiokines et récepteurs, fréquemment exprimés au sein de tumeurs, dans un modèle tumoral chez la souris, la lignée cellulaire LLC (Lewis Lung Carcinoma). Chaque gène d’intérêt (CCR3, CCR6, CCR7, CXCR4, CXCR5, CCL19, CCL20, CCL21, CXCL13) a été exprimé dans la lignée LLC, ces différentes lignées ont été greffées à des souris syngéniques, et les caractéristiques phénotypiques des tumeurs ont été analysées, notamment la croissance tumorale, la fréquence et la distribution des métastases, et l’importance des réactions immunitaires de l’hôte.

Nous avons montré que la croissance tumorale n’est pas affectée par l’expression des différents récepteurs étudiés, ni par celle des chimiokines CCL19 et CCL21, alors que l’expression de CXCL13 et de CCL20 par les cellules LLC réduit leur croissance in vivo. La quantification des métastases pulmonaires a montré que l’expression de CCR3, CXCR5, CCR7, CCL19 ou CCL21 par les cellules tumorales n’affecte pas significativement le potentiel métastatique des cellules LLC. Par contre, l’expression de CXCR4 entraîne une augmentation, et CCR6 une diminution, du nombre de métastases pulmonaires. La diminution du potentiel métastatique des tumeurs LLC/CCR6 implique notamment l’augmentation des propriétés d’adhésion de ces cellules. Les cellules LLC produisent naturellement de petites quantités du ligand CCL20. Nous postulons que la stimulation autocrine de CCR6 par CCL20 dans ces cellules in vivo augmente leurs propriétés d’adhésion et diminue leur potentiel métastatique. Dans le contexte de l’implication des chimiokines et récepteurs dans la détermination des sites métastatiques, nous proposons dès lors un modèle plus général :les récepteurs aux chimiokines dirigent les cellules tumorales vers les sites métastatiques où est produit le ligand correspondant ;cependant, si le ligand est produit au niveau de la tumeur, il favorise le maintien des cellules tumorales au niveau du site primaire.

L’effet anti-tumoral de CCL20 ne dépend apparemment pas d’un recrutement plus important de cellules dendritiques, de lymphocytes T et de cellules NK exprimant le récepteur CCR6. Nos observations suggèrent plutôt un effet de CCL20 sur l’angiogenèse tumorale.

Doctorat en Sciences médicales
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La dysfonction endothéliale semble précéder ou accompagner presque toutes les formes d’HTAP. Comme montré dans différents modèles de lésion vasculaire, quelle que soit la cause (inflammatoire, hémodynamique. . . ) l'altération phénotypique de l'endothélium qui en déroule, se caractérise par une altération de la vasorégulation, un potentiel prothrombotique un processus inflammatoire et une réponse fibroproliférative. La première partie de ce travail a consisté à évaluer le rôle de la composante inflammatoire dans la physiopathologie de l'HTAP primitive. Nous avons évoqué la participation des cytokines proinflammtatoires IL-l et 1β-5 comme potentiels médiateurs de l'activation endothéliale ou à l’origine d’une réaction immune-inflammatoire médiée par cellules mononuclées périphériques. Par dosage immunoenzymatique, nous avons mis en évidence une augmentation significative des concentrations sériques de l'IL-1β et d'lL-6 chez les patients porteurs d'HTAP primitive par rapport aux patients souffrant d'HTAP secondaire à une insuffisance respiratoire chronique et aux sujets sains contrôlés. A côté de la production des cytokines, la régulation de la réponse inf1ammatoire implique aussi l'expression des molécules d’adhésion et la production des chimiokynes. Nous nous sommes donc intéressés à l’étude de médiateurs qui pouvaient être impliqués dans la constitution des infiltrats inflammatoires péri-vasculaires observés au cours de l’HTAP. Nous avons observé une augmentation significative de concentrations plasmatiques des molécules d'adhésion (IOAM-I et VCAM-I) associée à une expression endothéliale pulmonaire chez les patients atteints d'HTAP. Les taux plasmatiques de ces molécules d'adhésion corrélaient positivement avec ceux du vWF, un marqueur d'activation endothéliale considérée comme un facteur de mauvais diagnostic au cours de l'HTAP. Des arguments supplémentaires pour l’existence d'une composante inflammatoire sont apportés par les études sur l’expression des chimiokynes MIP-lα : et RANTES au cours de cette vasculopathie. Par les techniques de RT-PCR quantitative, d'hybridation in situ et d’immunohistochimie nous avons mis en évidence l'expression du gène de RANTES et sa synthèse par les cellules endothéliales au niveau des lésions prolifératives vasculaires au cours de l'HTAP. L'expression génique de la chimiokine MIP-lα était également augmentée sur les biopsies pulmonaires des patients souffrants d’HTAP. La deuxième partie de ce travail a été consacrée à l’étude du facteur de croissance PDGF et de ses récepteurs, comme un acteur potentiel du remodelage vasculaire au cours de cette vasculopathie. Nous avons démontré par RT PCR une augmentation de l’expression du gène du PDGF et des protéines qui en résultent au niveau des lésions prolifératives de l'HTAP. L’analyse immunohistochimique a montré que les cellules endothéliales étaient les principales sources du PDGF. Les récepteurs α et β du FDGF sont également exprimés par l'endothélium des vaisseaux lésés. L'expression coordonnée de deux isoformes du PDGF et de ses récepteurs par les cellules endothéliales suggère un mécanisme de régulation autocrine de la prolifération endothéliale. En conclusion, nos études en faveur du rôle de l’inflammation dans l’initiation et/ou des lésions vasculaires pulmonaires dans l’HTAP, la cellule endothéliale semble jouer un rôle clé dans les phénomènes inflammatoires mais également dans la réponse fibroproliférative au cours de cette vasculopathie.

Les récepteurs de chimiokines sont des régulateurs essentiels de la migration cellulaire dans le cadre de la surveillance immunitaire, et le développement. Les récepteurs CCR5 et CXCR4 sont de plus spécifiquement impliqués dans les métastases cancéreuses et l'infection par le VIH. Nous avons développé un système permettant de sur-exprimer ces deux RCPGs. Afin de s'affranchir des problèmes de toxicité inhérents à l'expression des protéines membranaires en bactérie notre approche de production consiste à adresser les protéines vers les corps d'inclusion d'E. coli grâce à une fusion protéique N-terminale permettant de hauts niveaux d'expression. Après purification en conditions dénaturantes, les protéines sont alors repliées en présence de surfactants originaux, les amphipoles. La validation de cette nouvelle approche pour les récepteurs des chimiokines représente un des objectifs principaux de ce travail. Afin de tester la fonctionnalité des protéines repliées, une série d'outils a été développée : des versions modifiées des chimiokines ont été produites (RANTES pour CCR5 et SDF 1a pour CXCR4). La fonctionnalité des chimiokines a été évaluée au niveau moléculaire et cellulaire. L'interaction entre le récepteur replié en amphipole et son ligand a été testé par résonance de plasmons de surface (SPR). Différents types de surfaces fonctionalisées avec le récepteur de chimiokine replié en amphipole ont été explorés au cours de ce travail. A la fin de ce projet, la production des chimiokines et de leur récepteur a été mise au point. L'accès à ces outils ouvre la voie à de futures études moléculaires telles que la compréhension de la dimérisation du récepteur ou la détermination de la stoechiométrie du complexe.

Les récepteurs de chimiokines sont des régulateurs essentiels de la migration cellulaire dans le cadre de la surveillance immunitaire, et le développement. Les récepteurs CCR5 et CXCR4 sont de plus spécifiquement impliqués dans les métastases cancéreuses et l'infection par le VIH. Nous avons développé un système permettant de sur-exprimer ces deux RCPGs. Afin de s'affranchir des problèmes de toxicité inhérents à l'expression des protéines membranaires en bactérie notre approche de production consiste à adresser les protéines vers les corps d'inclusion d'E. coli grâce à une fusion protéique N-terminale permettant de hauts niveaux d'expression. Après purification en conditions dénaturantes, les protéines sont alors repliées en présence de surfactants originaux, les amphipoles. La validation de cette nouvelle approche pour les récepteurs des chimiokines représente un des objectifs principaux de ce travail. Afin de tester la fonctionnalité des protéines repliées, une série d'outils a été développée : des versions modifiées des chimiokines ont été produites (RANTES pour CCR5 et SDF 1a pour CXCR4). La fonctionnalité des chimiokines a été évaluée au niveau moléculaire et cellulaire. L'interaction entre le récepteur replié en amphipole et son ligand a été testé par résonance de plasmons de surface (SPR). Différents types de surfaces fonctionalisées avec le récepteur de chimiokine replié en amphipole ont été explorés au cours de ce travail. A la fin de ce projet, la production des chimiokines et de leur récepteur a été mise au point. L'accès à ces outils ouvre la voie à de futures études moléculaires telles que la compréhension de la dimérisation du récepteur ou la détermination de la stoechiométrie du complexe
Chemokine receptors are critical regulators of cell migration in the context of immune surveillance, inflammation and development. The GPCRs (G protein-coupled receptors) CCR5 and CXCR4 are specifically implicated in cancer metastasis and HIV-1 infection. An expression system to over-express these two GPCRs was developed. To overcome the toxicity problem of membrane protein expression in bacterial system, the production approach consists in targeting the proteins towards E. coli inclusion bodies thanks to a N-terminal fusion allowing a high yield expression. After purification under denaturing conditions, these GPCRs were then folded using original polymeric surfactants: the amphipols. The validation of this new approach for the chemokine receptor production is one of the goals of this work. In order to assess the functionality of the folded proteins, series of tools have been developed: engineered chemokine ligands (RANTES for CCR5 and SDF1a for CXCR4) were produced. The functionality of chemokines was evaluated at cellular and molecular levels. Interaction between the receptor folded in amphipols and its ligand was evaluated using Surface Plasmon Resonance (SPR) technique. Several types of surfaces, functionalized with the chemokine receptor/amphipol complex have been explored in this work. At the end of this project the productions of chemokines and their receptors has been set up. These established tools open the way to future studies, at the molecular level, in order to, for instance, investigate receptor dimerization and complex stoichiometry

Lors de la maturation de la réponse humorale aux Ag T-dépendant nous avons montré que l'engagement du récepteur à l'Ag du lymphocyte B (BCR) induit de façon sélective la production de MI P-l α/et de la fractalkine, des chimiokines activent sur les lymphocytes T+ de type effecteur/mémoire. Les expériences de blocage suggèrent l'existence d'autres chimiokines à activité comparable produites par les cellules B spécifiques de l'Ag. In vitro, l'expression de la fractalkine est induite également par l'engagement de CD40 et in situ dans le tissue lymphoïde secondaire, son expression est restreinte aux centres germinatifs et aux cellules dendritiques (DC) interdigitées. Par ailleurs, nous avons montré qu'au sein de la lignée B, l'expression de CCR6 (le récepteur de MIP-α/LARC et de β-défensines) est restreinte au pool de cellules matures. Dans les tests fonctionnels in vitro de microchimiotactisme et de la polymérisation de F-actine, MIP-3a semble agir préférentiellement sur les cellules B mémoires CCR6(high). INFα, une cytokine de la réponse immunitaire naturelle, augmente fortement la réponse migratoire des lymphocytes B à MIP-3α. L’ensemble de ces résultats contribue à préciser le rôle des chimiokines produites par les cellules B spécifiques de l'Ag dans le recrutement des cellules T CD4+ auxiliaires et la mise en place des interactions T/B(DC?) de type " cognate " au cours de la maturation de la réponse lymphocytaire B
Maturation of the B cell response to peptide antigens mostly depends on the limiting amount of T cell help. Lt depends on both, the availability of Ag-specifie T cells and on the ability of Ag-binding B cells to efficiently recruit them. We showed that B-cell Ag receptor (BCR) engagement on ali functional subsets of mature B ce lis selectively induces the production of MIP-lα/ β and fractalkine, chemokines which elicit migratory response in CD4+ T cells of memory/etfector phenotype. The blocking experiments strongly suggest that BCR-activated B cells produce other chemokines with activity towards T cells by. In vitro, fractalkine expression in B cells was also induced by CD40 triggering. In situ, it was found in germinal centers of secondary follicles and dendritic cells (DC) within T cell area. Furthermore, we have demonstrated that within the B cell lineage, CCR6 chemokine receptor (MIP-3α/LARC β and -defensins receptor) is a marker of peripheral mature B cell pool but is absent within in central pro-, pre-B compartement and germinal center B cells and plasma cells in the periphery. In Boyden-type microchamber chemotaxis and F-actin polimerization assays, MIP-3α is a potent B-cell hemoattractant but seems to be only functional on CCR6(high) memory B cells. MIP-3α responsiveness in B cell is strongly enhanced by INFα, the cytokine of the innate immune response. Altogether, these data provide new insides in the role of chemokines gradients and direct cell-cell interactions during maturation of the B cell reponse

Les 39 millions de personnes infectées par le VIH/SIDA dans le monde, le coût des traitements, l’émergence de souches virales résistantes et les effets secondaires lourds soulignent la nécessité de trouver rapidement de nouveaux traitements. Une stratégie serait de bloquer l’entrée du virus dans les cellules de l’hôte. Parmi les différents partenaires impliqués dans l’entrée du virus, les récepteurs de chimiokines CCR5 et CXCR4, appartenant à la superfamille des RCPG, sont les deux principaux co-récepteurs du VIH-1. La conception de molécules à effet thérapeutique assistée par ordinateur est l’une des voies envisageables. Cette approche nécessite toutefois d’obtenir la structure 3D de la protéine, ce qui s’avère très complexe dans les cas des RCPG. En effet, ces récepteurs sont naturellement très faiblement exprimés, d’où la nécessité de développer des systèmes d’expression permettant d’obtenir les quantités de protéine pures et actives nécessaires aux études structurales envisagées. Ces récepteurs ont d’abord été exprimés dans la levure méthylotrophe H. Polymorpha, en adressant les protéines surexprimées vers les membranes des péroxisomes. Même si les taux d’expression semblaient prometteurs, les récepteurs produits dans ce système ne lient pas leurs ligands, et semblent former des agrégats indissociables après solubilisation. Nous avons donc testé un nouveau système, basé sur une expression stable et inductible dans les cellules S2 de D. Melanogaster. Les récepteurs ont été fusionnés à l’EGFP pour faciliter les étapes de détection, de quantification et de purification, mais aussi pour développer un test FRET afin de vérifier la fonctionnalité des récepteurs ainsi produits. Le FRET détecté entre EGFP. CXCR4 et SDF-1. TR prouve que les récepteurs sont produits sous forme fonctionnelle dans ce système. Par ailleurs, les récepteurs sont solubilisés par le NP-40 et les quantités de récepteurs obtenus (mg/L) sont compatibles avec les études structurales envisagées
The 39 millions AIDS infected patients worldwide, the cost of the treatments, the emergence of resistant viral strains and the heavy side effects underline the need for finding new treatments. A new strategy could be to block the virus entry in the host cells. Among the different molecular partners involved in the virus entry, the chemokine receptors CCR5 and CXCR4 belonging to the GPCR superfamily are known to act as the principal HIV-1 co-receptors. These receptors are thus representing ideal targets for entry-blocking drugs and computer-assisted drug design could be a way of choice to discover such molecules. This approach requires however to obtain the 3D structure of the proteins, which is very complex especially in the case of GPCR. Actually, these receptors are naturally very poorly expressed, and efficient and reliable heterologous expression systems are still to be developed to obtain the large quantities of pure and active proteins needed for the structural studies considered. These receptors were first produced in the methylotrophic yeast H. Polymorpha, by targeting the overexpressed proteins towards the membranes of peroxisomes. Even if the expression levels were rather promising, ligand-binding activities of the produced receptors were not measurable and moreover, the receptors were always aggregating after solubilization attempts. Therefore we tested a new system, based on a stable and inducible expression in D. Melanogaster S2 cells. The receptors were N-terminally fused to EGFP as a tag, in order to facilitate the steps of detection, quantification and purification, but also to develop a FRET test in order to check the functionality of the receptors thus produced. The FRET detected between EGFP. CXCR4 and SDF-1. TR proved that the receptors can be functionnaly expressed in this system. Moreover, the receptors could be solulilized by NP-40, and the amounts of protein obtained in this system (mg/L) are compatible with the structural studies considered

Le système des chimiokines et de leurs récepteurs permet aux leucocytes de migrer à l'endroit approprié afin de mettre en oeuvre une réponse immunitaire efficace. Notre hypothèse de travail est que le nombre moyen de récepteurs en surface d'une cellule, ou densité membranaire, détermine l'efficacité de sa fonction de migration. Nous nous intéressons plus particulièrement au récepteur CCR5, également corécepteur du virus de l'immunodéficience humaine (VIH). Nous avons montré que la densité membranaire en CCR5 conditionne l'intensité de migration de lymphocytes primaires vers CCL5 (RANTES), son principal ligand. Nous avons également vérifié notre hypothèse en conditions physiopathologiques au cours d'une maladie auto-immune, la polyarthrite rhumatoïde, et montré que la densité membranaire conditionne l'intensité de migration de lymphocytes T vers du surnageant de synoviocytes activés de patients. Ce phénomène a une implication physiopathologique importante puisque la densité membranaire en CCR5 varie de manière significative entre les individus. Nos résultats impliquent qu'il pourrait y avoir un polymorphisme dans la capacité individuelle de réponse aux CC chimiokines, et par conséquent, dans la survenue et/ou le déroulement des pathologies où ces chimiokines sont impliquées. Ces travaux suggèrent en outre que des molécules antagonistes de CCR5 pourraient avoir un effet bénéfique dans la PR et de manière plus générale, au cours des situations inflammatoires dans lesquelles CCR5 joue un rôle.

L'athérosclérose est une maladie chronique inflammatoire des grosses artères dont la compréhension des processus fondamentaux s'avère nécessaire afin d'élaborer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Plusieurs études ont suggéré l'importance des chimiokines dans le développement de l'athérosclérose. Ce travail de thèse éclaire le rôle des chimiokines et de leurs récepteurs dans cette maladie. Il apporte, par ailleurs, de nouvelles notions concernant l'inflammation associée à l'athérosclérose. En effet, nous montrons que la déficience en CX3CR1 induit une diminution importante de la taille des plaques. Nous mettons également en évidence le fait que certains récepteurs peuvent influencer de façon majeure le phénotype des plaques en modulant les réponses inflammatoires. Ainsi, nous montrons que la déficience en CCR5 induit une diminution de l'infiltration locale des macrophages et module l'inflammation systémique via l'induction accrue de la synthèse d'IL-10. De façon inverse, il se dégage de la troisième étude que le récepteur de chimiokines CCR1 exerce un effet anti-athérogène protecteur. Dans ce travail de thèse, nous proposons par ailleurs un nouveau concept qui repose sur l'idée que deux couples de chimiokines/récepteurs présentant des mécanismes d'action différents peuvent jouer des rôles complémentaires dans l'athérosclérose. Ainsi, la déficience simultanée en MCP-1 et en CX3CR1 induit une diminution drastique de la taille des plaques. Nous montrons que cet effet peut s'expliquer par un rôle fondamental du MCP-1 leucocytaire sur l'adhérence de ces mêmes cellules et par une action importante du CX3CR1 sur l'inflammation de la plaque. L'ensemble de ce travail montre donc l'importance des chimiokines et de leurs récepteurs dans les différentes étapes du développement de l'athérosclérose et leur confère un intérêt grandissant dans l'élaboration de nouvelles stratégies thérapeutiques pour la lutte contre l'athérosclérose
Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease of the arterial wall. The comprehension of its basic processes is essential to elaborate new therapeutic strategies. Several studies have suggested the importance of chemokines in the development of atherosclerosis. Chemokines are responsible for leukocyte migration to inflammation sites. This work highlights thé role of several chemokines and chemokine receptors in this pathology. Furthermore, it brings new findings regarding the implication of these proteins in the modulation of inflammatory responses associated to atherosclerosis. We showed that CX3CR1 deficiency leads to a significant decrease of plaque size through a reduction of macrophage accumulation within the plaque. We also demonstrated that some chemokine receptors could have minoreffect on plaque size but major influence on plaque composition, which appears to be very important in term of plaque stability. Thus, CCR5 deficiency induces a decrease of macrophage infiltration into the plaque and restrains systemic inflammation through an IL-10 induction. On the contrary, our third study reveals the anti-inflammatory potential of chemokine receptors CCR1. Finally, in the last study we propose a new concept based on the capacity of two chemokine/receptor couples to interact and to favor atherosclerosis through thé generation of different but complementary mechanisms. Indeed, leukocyte CCL2 appears to be essential in leukocyte adhesion on the vascular wall, whether CX3CR1 is more implicated in systemic inflammation. This work contributes to demonstrate that chemokines are involved in all the stages that characterize atherosclerotic plaque formation. Indeed, chemokine receptors appear to be of major importance in atherogenesis since they contribute to leukocytes migration and inflammation. Therefore, chemokines are thought to be an interesting new target in the élaboration of therapeutic strategies against atherosclerosis

Ce travail de thèse repose sur la caractérisation, par l’étude du profil d’expression des récepteurs de chimiokines, de l’activation et de la différentiation périphérique des lymphocytes T dans un contexte normal ou pathologique lié à l’infection par le Virus de l’Immunodéficience Humaine. Dans une première étude, nous avons déterminé le rôle du couple CCR6/CCL20 dans l’homéostasie des LT. CCR6 permet de discriminer des populations ayant des capacités de production cytokinique particulière. Ces cellules sont sélectivement éliminées du sang périphérique des patients infectés par le VIH et sont séquestrées dans la rate où elles entrent en apoptose. Une seconde étude a été menée par une analyse transcriptomique de sous-populations lymphocytaires exprimant ou non le marqueur CD57 ches les patients infectés ou non par le VIH. Nous avons mis en évidence que les cellules T CD8 CD57+ sont des cellules effectrices mémoires ayant rencontrées l’antigène caractérisées par des potentiels de survie et prolifératifs limités mais ayant des capacités migratoires et d’interaction intercellulaire élevées

Cette thèse s’inscrit dans le cadre de la recherche d’agonistes et d’antagonistes de récepteurs de chimiokines d’intérêt thérapeutique chez des champignons et des levures pathogènes pour l’homme ou l’animal.

Un screening préliminaire réalisé sur 88 souches de microorganismes a permis de sélectionner trois extraits de champignons présentant une activité compétitrice.

Des champignons Aspergillus ochraceus et Microsporum cookei, nous avons isolé une substance possédant une activité compétitrice sur le récepteur CCR5. Des chromatographies d’exclusion effectuées sur les lyophilisats des milieux conditionnés (CO.4) ont conduit à l’isolement d’une fraction active dont les constituants ont une masse moléculaire comprise entre 30 et 80 kDa. L’étude de ces substances n’a pas été poursuivie plus en détail.

Par contre, de l’extrait dichlorométhane (CO.1) du champignon Trichoderma virens, nous avons isolé la gliotoxine [102] qui possède une activité antagoniste sur les récepteurs CCR2b et CCR5. Différents essais de culture de Trichoderma virens et d’Aspergillus fumigatus, connus pour synthétiser cette toxine, ont été entrepris en vue d’améliorer la quantité de gliotoxine produite. Malheureusement, ceux-ci n’ont pas abouti.

A partir des faibles quantités de gliotoxine isolées, nous avons synthétisé deux analogues, la déthiogliotoxine [133] et la déhydrogliotoxine [134]. La comparaison des résultats des tests de compétition de ceux-ci sur le récepteur CCR2b démontre l’importance du pont disulfure pour l’observation de cette activité.

Nous avons ensuite synthétisé les épidithiopipérazinediones (ETP) reprises ci-dessous, afin d’évaluer l’importance de cet élément structural pour l’activité compétitrice vis-à-vis des récepteurs CCR2b et CCR5.

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Doctorat en sciences, Spécialisation chimie
info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les chimiokines (CK) et leurs récepteurs (RCK) régulent l’homéostasie leucocytaire et sont également des partenaires actifs dans la physiopathologie du syndrome WHIM et du lupus systémique (LS).Le syndrome WHIM est un déficit immuno-hématologique rare qui se caractérise notamment par une profonde lympho-neutropénie périphérique. Ce déficit est expliqué par un gain de fonction du RCK CXCR4, qui entraîne un défaut de désensibilisation du récepteur et une hyper-sensibilité à son ligand CXCL12. Malgré la lymphopénie caractéristique, les patients parviennent à générer une réponse immune humorale mais celle-ci n’est pas maintenue dans le temps. Afin de mieux comprendre la physiopathologie du syndrome WHIM, notre laboratoire a développé le modèle murin Cxcr4+/1013 qui présente une mutation gain de fonction de Cxcr4 similaire à celle observée chez certains patients. La première partie de ma thèse s’est intéressée à l’impact de ce gain de fonction de Cxcr4 sur la réponse immune. L’immunisation des souris Cxcr4+/1013 a permis de montrer que la désensibilisation de Cxcr4 limitait la différenciation des cellules productrices d’anticorps (Ac) appelées plasmocytes (PC). De plus, le gain de fonction de Cxcr4 est associé à une migration aberrante des PC et un défaut de leur maintien au long cours dans la moelle osseuse, pouvant ainsi expliquer la réponse vaccinale défectueuse observée chez les patients.La seconde partie de ma thèse a été consacrée à la caractérisation du profil migratoire des PC dans le LS. Le LS est une maladie auto-immune systémique, qui évolue par poussées et rémissions, et qui affecte plusieurs organes (peau, rein, système nerveux central…). L’initiation et l’exacerbation du LS sont médiées par les auto-Ac sécrétés par les PC autoréactifs. A ce jour, de par l’absence d’identification de marqueur spécifique de cette population, aucune thérapie ne parvient à cibler spécifiquement ces cellules. Une stratégie alternative consiste en la dérégulation de la domiciliation des PC autoréactifs dans les tissus enflammés, à l’origine même des dommages tissulaires. Ce projet s’est intéressé à l’identification du code migratoire des PC circulants de patients lupiques. J’ai cherché à savoir si les PC circulants de patients lupiques présentaient un profil d’expression de RCK distinct de ceux d’individus sains, pouvant ainsi expliquer le recrutement aberrant de ces cellules dans les tissus enflammés. Ces études ont été effectuées chez des patients en phases de poussée et de rémission mais également dans le modèle murin lupique NZB/W F1. Ces travaux suggèrent que les patients peuvent être stratifiés selon les RCK exprimés par les PC circulants
The chemokines (CK) and their receptors (CKR) are essential for leukocyte homeostasis. They are also involved in the pathophysiology of several diseases including the WHIM syndrome and systemic lupus erythematosus (SLE).The WHIM syndrome is a rare immunodeficiency characterised by a severe peripheral lympho-neutropenia. It is caused by a gain-of-function of the CKR CXCR4, leading to a defect in desensitization of this receptor and a hyper-responsiveness to its ligand CXCL12. To better understand the pathophysiology of the WHIM syndrome, our laboratory developed the mouse model Cxcr4+/1013 harboring a natural mutation observed in some patients. Despite the lymphopenia, WHIM patients can mount a potent humoral immune response but that is not sustained over time. The maintenance of long-term antibody (Ab) titers is guaranteed by plasma cells (PCs) in the bone marrow (BM). The first part of my thesis was thus dedicated to the analysis of the role of a gain-of-function of Cxcr4 on PC differentiation and migration. The analysis of humoral response of Cxcr4+/1013 mice revealed a defect in the persistence of specific antibody titres in the absence of Cxcr4 desensitization. Furthermore, this was associated with an abnormal accumulation of a population of immature PCs in the BM.The second part of my work aimed to characterize the migratory potential of circulating PCs from SLE patients. SLE is a systemic autoimmune disease which can affect several organs like the skin, the kidneys or the central nervous system. SLE evolves in flare and remission phases and auto-Ab secreted by autoreactive PCs contribute to its pathophysiology and severity. Today, no specific treatment against autoreactive PCs exist. Targeting their migratory capacity to the inflamed tissues could be an alternative strategy. The objective of this project was to identify the migratory potential of SLE PCs. These studies were processed on samples from SLE patients during flare or remission, and on the lupus mouse model, the NZB/W F1 mice. We observed that the expression of different combinations of surface CKR may stratify several groups of SLE patients

La sulfatation protéique est une modification post-traductionnelle qui intervient principalement sur les récepteurs cellulaires. Parmi eux, le récepteur CXCR4 est particulièrement étudié en raison de son implication dans de nombreux processus physiopathologiques (réponse immunitaire, infection au VIH). Le domaine extracellulaire de 38 acides aminés de CXCR4 (le peptide P38), contenant trois tyrosines connues pour être sulfatées, est important pour l’interaction avec son ligand spécifique, la chimiokine SDF-1α/CXCL12 (Stromal Cell-Derived Factor-1α). Le rôle de la sulfatation de CXCR4 dans cette interaction est encore méconnu.Le peptide P38 a été synthétisé et sulfaté de façon régiosélective sur toutes les tyrosines (peptides mono-, di- ou tri-sulfatés, soit 7 combinaisons). L’impact du nombre et de la position des groupements sulfate le long du peptide P38 sur son interaction avec SDF-1α a été étudié par électrophorèse capillaire d’affinité (ACE) couplée ou non à la spectrométrie de masse électrospray (ESI-MS). Une interaction entre P38 et SDF-1α a été mise en évidence par ACE. Une augmentation de l’affinité peut être associée à l’augmentation du degré de sulfatation de P38. La stœchiométrie des complexes a ensuite été déterminée en utilisant l’ACE-MS, qui a mis en évidence une majorité de complexes 1:1, quel que soit le peptide étudiéCes travaux ouvrent la voie à l'étude d'une interaction à trois partenaires avec des glycosaminoglycanes
Sulfation is one of the most important post-translational modifications of proteins. The known sulfated proteins are mostly cell receptors and among them, CXCR4 attracts growing attention because of its involvement in numerous physio-pathological processes (immune response, HIV infection). The 38 amino-acid extracellular domain of CXCR4 (P38 peptide), containing three tyrosine residues known to be sulfated, is important for the interaction with its specific ligand, the SDF-1α/CXCL12 chemokine (Stromal cell-derived factor-1α). The role of sulfation in this interaction remains to be established.The P38 peptide was chemically synthesized and regioselectively sulfated on all the tyrosines (mono-, di- or tri-sulfated peptides, 7 combinations). The impact of both distribution and position of sulfate groups on the interaction between P38 and SDF-1α was studied by affinity capillary electrophoresis (ACE) hyphenated to electrospray mass spectrometry (ESI-MS).An interaction between P38 and SDF-1α was highlighted by ACE. It was strongly enhanced by the increase of P38 sulfation degree. The complex stoichiometry was then determined by ACE-MS, and 1:1 complexes were predominantly obtained, with all the peptides. This work opens the orad to the three-partner interaction studies involving glycosaminoglycans

L' @asthme est une affection des voies respiratoires caractérisée par l’association d’une broncho-constriction et un remodelage bronchique. Les crises d’asthme répétées entraînent un épaississement permanent des couches musculaires lisses de la paroi des voies respiratoires. La démonstration de la contraction des cellules musculaires lisses bronchiques (CMLB) en présence de l’histamine, des éicosanoïdes et des cytokines proinflammatoires, renforce le concept de cellules cibles dans l’asthme. Cependant, des recherches récentes ont suggéré également une participation de ces cellules dans certaines les étapes de la réponse allergique grâce à leur production de plusieurs médiateurs, notamment les cytokines de types Th1 et Th2 et les chimiokines. Des travaux menés dans notre laboratoire ont montré que les CMLB pourraient exprimer certains récepteurs de chimiokines (notamment le CCR3). L’ensemble de ces données nous ont permis d’orienter nos recherches vers l’analyse de l’expression d’autres récepteurs par ces cellules. Les expériences de RT-PCR quantitative et de cytométrie en flux nous ont permis de montrer que les CMLB expriment les récepteurs de chimiokines CCR2, CCR4 et CCR5. De plus, l’activation des ces récepteurs par les chimiokines (MCP1, MDC et MIP-1β) induit une mobilisation de calcium intracellulaire et un chimiotactisme des CMLB. La stimulation de ces cellules par les cytokines pro-inflammatoires (TNF-α et IL1-β) régule l’expression des CCR4 et CCR5 et ne semble pas avoir d’effet sur celle de CCR2. Ces travaux suggèrent un rôle potentiel de certains récepteurs de chimiokines dans le remodelage bronchique constaté chez les patients asthmatiques. Bien que le virus respiratoire syncytial (VRS) soit la cause principale de l’infection des voies respiratoires inférieures chez les enfants, l’effet de ce pathogène sur les CMLB n’a pas été suffisamment étudiée. Ainsi, nous avons émis l’hypothèse de la possibilité de l’infection des CMLB par le VRS. L’influence du VRS sur la libération de différents médiateurs par les CMLB a été déterminée par des expériences de RT-PCR et d’ELISA. Nos résultats démontrent que les CMLB sont sensibles à l'infection par le VRS in vitro et ne manifestent pas d’effet cytopathique comparable à celui habituellement observé sur les cellules épithéliales bronchiques. Nous avons montré également que, suite à l’infection des CMLB par le VRS, l'expression des cytokines pro-inflammatoires TNFα, IL-1β et l'IL6 est augmentée de façon significative. Une forte expression de l'IL-8 est constatée notamment 48h post-infection, tant au niveau ARNm qu’au niveau protéique. De plus, les expériences de chimiotactisme des neutrophiles en chambre de Boyden en réponse aux surnageants des CMLB infectées par le VRS ont montré une migration cellulaire. L’ensemble de ces résultats suggèrent que les CMLB pourraient être des cellules hôtes du VRS et jouer un rôle dans la réponse immunitaire en sécrétant des médiateurs inflammatoires souvent présents en grande quantité dans les muqueuses bronchiques et les LBA de patients asthmatiques ou ayant une exacerbation viro-induite par le VRS.

L’infection du système nerveux central (SNC) par le virus herpès simplex 1 (VHS-1) peut mener au développement d’une encéphalite herpétique qui représente l’infection cérébrale sporadique la plus répandue dans les pays développés. Cette infection dévastatrice a une prévalence de 1/250 000 individus, et atteint un taux de mortalité de 30% malgré l’administration d’un traitement antiviral à base d’acyclovir. De plus, la majorité des patients qui survivent à l’infection conservent des séquelles neurologiques graves et permanentes. Il est suggéré, qu’en plus des dommages causés par la réplication virale, la réponse immunitaire inflammatoire induite par l’infection serait responsable de l’exacerbation de l’encéphalite herpétique. Cette réponse inflammatoire est initiée par les macrophages résidents du SNC, nommés microglies. Dans certains désordres neurologiques, Il est proposé qu’en plus des microglies, les monocytes sanguins pourraient infiltrer le SNC et participer à la réponse immunitaire. Les connaissances concernant le recrutement des monocytes périphériques au SNC et leur rôle dans l’élaboration de la réponse immunitaire durant l’encéphalite herpétique sont très limitées. Une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans cette réponse dirigée contre l’infection du cerveau par le VHS-1 pourrait permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et mener au développement de nouvelles stratégies combinant des antiviraux et des agents immunomodulateurs pour contrôler à la fois la propagation du virus et l'état inflammatoire dans le SNC. Les travaux présentés dans le cadre de cette thèse s’intéressent à l’implication des monocytes périphériques recrutés au niveau du cerveau dans la réponse immunitaire innée développée dans un modèle murin d’encéphalite herpétique. Pour atteindre nos objectifs, nous avons d’abord utilisé des souris chimériques dont les précurseurs myéloïdes dérivés de la moelle osseuse et les leucocytes sanguins expriment la protéine fluorescente verte (GFP pour «green fluorescent protein»). Ce modèle nous a principalement permis de distinguer les macrophages d’origine hématopoïétique des microglies résidentes du SNC car il n’existe aucun marqueur naturel permettant de différencier ces deux populations cellulaires. Cette stratégie nous a aidé à mieux caractériser la cinétique d’infiltration des monocytes, leur localisation dans le cerveau, et leur participation à la réponse immunitaire suite à l’infection du SNC par le VHS-1. La deuxième partie des travaux porte sur les mécanismes impliqués dans le recrutement de ces monocytes et dans le contrôle de l’état inflammatoire au niveau du SNC durant l’encéphalite herpétique. Plus précisément, les expériences réalisées s’intéressent aux rôles de la signalisation via les récepteurs de chimiokines CCR2 et CX3CR1, exprimés à la surface des monocytes sanguins et des microglies, dans la protection ainsi que dans le recrutement des deux sous-types de monocytes sanguins, soient les monocytes «inflammatoires» et «patrouilleurs», au cours de l’encéphalite herpétique. Nos résultats ont montré pour la première fois que les monocytes sanguins infiltraient le SNC pour donner naissance à des macrophages ayant le même profil que les microglies résidentes et que ces cellules participaient à la réponse immunitaire suite à l’infection par le VHS-1. Nous avons également démontré, en utilisant des souris chimériques ayant des déficiences compartimentées en récepteurs CX3CR1 et CCR2 au niveau du SNC au niveau du système hématopoïétique, que les voies de signalisation via CX3CR1 au niveau des cellules résidentes du cerveau et de CCR2 au niveau des cellules hématopoïétiques étaient importantes pour la survie des souris, pour le contrôle de la réplication virale ainsi que pour contenir la réponse inflammatoire cérébrale durant l’encéphalite herpétique expérimentale.
Herpes simplex virus 1 (HSV-1) is the main cause of sporadic viral encephalitis in developed countries with an annual incidence of 1/250 000 individuals per year. Despite the use of acyclovir that aimed at blocking virus replication, the mortality rate associated with HSV encephalitis (HSE) is still high (i.e., 30%), with the majority of surviving patients developing severe neurological sequelae. It is believed that the high mortality rate and neurological disorders attributable to HSE could involve both virally- and immune-induced damages of the central nervous system (CNS). The inflammatory response is initiated by the resident macrophages of the brain, namely microglia. In addition, blood leukocytes, particularly monocytes, are thought to infiltrate the CNS and contribute to the control of viral infection together with microglia. However, it is also argued that these cells may also amplify the inflammatory response, thereby contributing to brain damages. Knowledge concerning the recruitment of peripheral monocytes to the CNS and their role in the immune response during HSE is limited. A better understanding of the mechanisms involved in their dynamic of recruitment might lead to the identification of new therapeutic targets and the development of new strategies combining antiviral agents and immunomodulatory molecules to better control both HSV replication as well as the inflammatory environment in the CNS. The studies presented in this thesis are intended to better evaluate the involvement of monocytes-derived macrophages, together with microglia, in the cerebral innate immune response during experimental HSE. To achieve our goals, we first used chimeric mice in which bone marrow progenitor cells and blood leukocytes express the green fluorescent protein (GFP). This model allowed us to better characterize the kinetics of infiltration of blood monocytes into the CNS, their distribution in different anatomical areas of the brain and their involvement in the immune response during experimental HSE. The second part of the work focuses on the mechanisms involved in the recruitment of monocytes into the CNS and in the control of the inflammatory state in mouse brain following HSV-1 infection. More precisely, experiments aimed at characterizing the role of signaling pathways through chemokine receptors CCR2 and CX3CR1, expressed on the surface of blood monocytes and microglia, in protecting and modulating the recruitment of the two blood monocytes subtypes, namely the "inflammatory" and "patrolling" monocytes, during HSE. To achieve this aim, we used chimeric mouse models of CCR2- and CX3CR1-deficient animals, in which the lack of either receptor was restricted to the hematopoietic system (blood monocytes) or the CNS (microglia). Our results showed that blood monocytes are recruited to the CNS following HSV-1 infection and give rise to microglia-like macrophages. These cells are involved in the immune response together with microglia by performing immunological functions including phagocytosis and antigen presentation. Furthermore, we showed that CX3CR1 and CCR2 expressed on cells of the CNS and in the hematopoietic system, respectively, are important for mouse survival, viral replication control and in maintaining an appropriate inflammatory response during experimental HSE.

LE RECEPTEUR AUX CHIMIOKINES CXCR4 APPARTIENT A LA FAMILLE DES RECEPTEURS COUPLES AUX PROTEINES G HETEROTRIMERIQUES (RCPGs). LE SEUL LIGAND NATUREL QUI LUI SOIT ACTUELLEMENT CONNU EST LA CHIMIOKINE SDF-1. CXCR4 EST PAR AILLEURS UN CORECEPTEUR MAJEUR DU VIH-1 AYANT UN TROPISME POUR LES LIGNEES CELLULAIRES T. LES VIRUS X4, A TROPISME POUR LES LIGNEES T, APPARAISSENT AU COURS DE L'EVOLUTION DE LA PATHOLOGIE, ET CETTE EMERGENCE EST ASSOCIEE A UNE FORTE DEPLETION DES LYMPHOCYTES T CD4+, QUI SERAIT DUE, EN PARTIE AU MOINS, A DES PHENOMENES D'APOPOSE DES LYMPHOCYTES T NON INFECTES. AVANT MON ARRIVEE AU LABORATOIRE, UNE PARTIE DE LA CASCADE APOPTOTIQUE ACTIVEE LORS DE L'INTERACTION DES GLYCOPROTEINES D'ENVELOPPE PRESENTEES A LA SURFACE DES CELLULES, AVEC CXCR4, AVAIT ETE MISE EN EVIDENCE. IL AVAIT NOTAMMENT ETE MONTRE QUE CETTE APOPTOSE INDUIT LA DEPOLARISATION DE LA MEMBRANE MITOCHONDRIALE, LE RELARGAGE DE CYTOCHROME C DE LA MITOCHONDRIE VERS LE CYTOSOL, ET L'ACTIVATION DES CASPASES 9 ET 3. IL NOUS PARAISSAIT ALORS INTERESSANT DE CARACTERISER CETTE CASCADE DE SIGNALISATION PLUS EN AMONT, ET DE DETERMINER LE ROLE JOUE PAR LES DOMAINES CYTOPLASMIQUES DE CXCR4 DANS LES VOIES DE SIGNALISATION INDUITES PAR CE RECEPTEUR EN SITUATION PHYSIOLOGIQUE. AFIN DE REPONDRE A CETTE PROBLEMATIQUE, NOUS AVONS CONSTRUIT DES MUTANTS DE CHACUN DES DOMAINES CYTOPLASMIQUES DE CXCR4. NOUS AVONS AINSI MIS EN EVIDENCE QUE, APRES LIAISON DE SDF-1, SEULE LA TROISIEME BOUCLE INTRACELLULAIRE DE CXCR4 EST REQUISE POUR L'OBSERVATION DES SIGNAUX DEPENDANTS DES PROTEINES Gi, MAIS QUE CETTE BOUCLE N'A AUCUN ROLE DANS L'INTERNALISATION DU RECEPTEUR, SIGNAL STRICTMENT DEPENDANT DE LA PARTIE C-TERMINALE DE CXCR4. NOUS AVONS EGALEMENT DETERMINE QUE LE CHIMIOTACTISME EST UN EVENEMENT PLUS COMPLEXE QUI IMPLIQUE LES DEUXIEME ET TROISIEME BOUCLES CYTOPLASMIQUES DE CXCR4 AINSI QUE SON DOMAINE C-TERMINAL. GRACE AUX MUTANTS DES DOMAINES CYTOPLASMIQUES DE CXCR4, ET AVEC DES MUTANTS PONCTUELS DES TYROSINES CYTOPLASMIQUES, NOUS AVONS ENSUITE DETERMINE QUE, APRES ACTIVATION PAR SDF-1, LA PARTIE N-TERMINALE DE LA TROISIEME BOUCLE CYTOPLASMIQUE DE CXCR4 EST IMPLIQUEE DANS LA PHOSPHORYLATION DE JAK2, ET QUE LA TYROSINE 157 EST RESPONSABLE DE L'ACTIVATION DE STAT3. A PLUS LONG TERME, CE TRAVAIL POURRAIT PERMETTRE DE DISSOCIER AU NIVEAU FONDAMENTAL LES SIGNAUX INDUITS PAR CXCR4 APRES LIAISON DE SDF-1 DE CEUX INDUITS APRES INTERACTION DES GLYCOPROTEINES D'ENVELOPPE DU VIH-1, ET AINSI POUVOIR APPORTER DE NOUVELLES PERSPECTIVES DE TRAITEMENT EN INHIBANT L'APOPTOSE DEPENDANTE DU VIRUS SANS INTERFERER AVEC LE ROLE PHYSIOLOGIQUE DE CXCR4.

Dans cette étude, par une approche de type "génome entier", les profils d'expression génique des macrophages du tissu adipeux viscéral (ATM) et ceux des macrophages issus de la différenciation in vitro de monocytes (MDM) circulants, provenant d’un même individu obèse, ont été comparés à l'état basal. Nos résultats ont permis d’identifier plusieurs voies de signalisation différemment exprimées entre ces deux types cellulaires. En particulier des cytokines inflammatoires et leurs récepteurs, des composants de la matrice extracellulaire de même que des molécules attractantes telles que les chimiokines de type CCL et CXCL, sont fortement exprimés dans les ATM. Fait intéressant, les protéines appartenant à ces voies ont été retrouvées sécrétées dans le milieu conditionné provenant de la culture des ATM, ou en concentrations élevées dans le sérum des patients obèses comparés à celui de patients minces. Nous avons voulu valider les différences observées, en reconstituant l’environnement obésogène des ATM dans le TA grâce à l’utilisation de "co-cultures" indirectes de préadipocytes et de MDM. Dans leur ensemble, nos résultats montrent que les ATM ont un profil génomique et fonctionnel qui ressemble à celui des macrophages associés aux tumeurs (TAM). De plus, nous retrouvons au sein des gènes spécifiquement exprimés par les ATM une surexpression et une activation des facteurs de transcription NF-kB, HIF1a et STAT-3, connus comme impliqués dans le développement des cancers et qui sont à l’origine de la plasticité des TAM. Dans ce contexte, les Liver X Receptors (LXR) a et b, de même que les Peroxisomes Proliferator-Ativated Receptor gamma (PPARg) sont des récepteurs nucléaires exprimés dans les MDM qui apparaissent comme des cibles thérapeutiques de grand intérêt du fait de leurs propriétés anti-inflammatoires. Le second objectif de notre étude a été de savoir, toujours par une approche de type "génome entier", si les ATM et les MDM répondent différemment aux agonistes de LXR. De nouveaux gènes cibles de LXR spécifiques des ATM, ont été identifiés et en particulier nous montrons que les chimiokines ligands CXCL5 et CXCL11 surexprimés dans les ATM (et impliquées dans les cancers), sont négativement régulés par les agonistes de LXR. De plus, notre étude nous a permis d’analyser le rôle des LXR dans la modulation du "cross-talk" entre ATM et adipocytes en évaluant l’influence des facteurs sécrétés par les ATM, préalablement traités ou non par les agonistes des LXR, sur le métabolisme adipocytaire. En effet, nos travaux démontrent que le milieu conditionné des ATM traités par les ligands de LXR restaure partiellement l'expression de gènes impliqués dans la lipogenèse et le métabolisme du glucose e diminue l’expression des gènes impliqués dans la réponse inflammatoire dans les adipocytes.Dans une autre partie de notre étude, la capacité de PPARg et/ou de LXR à réguler l’expression de la visfatine dans les macrophages a été analysée, de même que l’influence de cette régulation sur sa sécrétion et sur la production intracellulaire de NAD+. Au sein du TA, les ATM sont la principale source de visfatine dont l'implication dans le développement de certaines pathologies dont le DT2 est largement reconnue. La visfatine (Nampt) est une adipokine pro-inflammatoire mais aussi une enzyme assurant la synthèse du NAD+, cofacteur ou substrat de nombreuses enzymes cellulaires. Nos résultats permettent de montrer que l’activation de LXR ou de PPARg par leurs ligands entraîne respectivement une diminution ou une augmentation de l'expression génique de la visfatine. L’augmentation de l’expression de l’ARNm de la visfatin suite à l’activation de PPARg s’accompagne d’une augmentation de l’expression protéique et de la sécrétion
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Les cellules dendritiques (dc), sentinelles de l'organisme, sont specialisees dans la capture et la presentation de l'antigene et sont necessaires a l'initiation d'une reponse immunitaire specifique. Nous avons demontre que la migration induite par les chimiokines est etroitement correlee au stade de developpement de la dc via une regulation sequentielle de l'expression des recepteurs a ces chimiokines. Lors de la presence d'un signal danger, le site d'inflammation induit la production de chimiokines dont mip-3, qui permet le recrutement des dc immatures au site d'entree du pathogene et la capture de celui-ci. Dans cet environnement inflammatoire, la dc s'engage dans un processus de maturation incluant la perte de la reponse a ce premier groupe de molecules. De facon concomitante, elle acquiert le recepteur ccr7 et emigre via les vaisseaux lymphatiques exprimant 6ckine, puis se fixe dans les zones t des organes lymphoides secondaires en reponse a mip-3 pour presenter l'antigene aux lymphocytes t. La regulation de l'expression de ccr7 joue donc un role crucial dans l'initiation des reponses immunitaires. Ainsi, une meilleure connaissance de la migration des dc pourrait ouvrir de nouvelles opportunites quant a leurs manipulations dans des essaies therapeutiques visant a supprimer ou stimuler les reponses immunitaires. D'autre part, mip-3 : 1 - est selectivement produit par les epitheliums, 2 - reste la seule chimiokine qui induit la migration des cellules de langerhans et 3 - l'expression de son recepteur ccr6 est controlee par des cytokines immunomodulatrices suggerant un role du couple mip-3/ccr6 dans l'immunite acquise des epitheliums et des muqueuses. L'etude de pathologies montre que mip-3 est effectivement exprime par les cellules epitheliales au cours de l'inflammation (psoriasis) ainsi que dans certains cancers. Des etudes sont actuellement en cours pour determiner la pertinence de nos observations dans l'initiation et le developpement de pathologies.

L’objectif de ma thèse a été d’étudier l’expression et l’activité de deux récepteurs de chimiokine dans deux désordres immunitaires, CCR1 dans le modèle murin NZB/W de néphrite lupique et CXCR4 dans la Lymphopénie T CD4+ Idiopathique (LCI), un déficit immunitaire rare chez l’Homme. Le Lupus Erythémateux Disséminé est une maladie autoimmune, chronique et inflammatoire dont le développement est caractérisé par une perte progressive de la fonction rénale associé notamment à une infiltration leucocytaire. Je me suis intéressé à la contribution de CCR1 et de ses ligands CCL3/CCL5 au recrutement leucocytaire intra-rénal chez la souris NZB/W néphritique. Nos résultats révèlent une augmentation de l’expression et de la fonction de CCR1 à la surface des cellules T (LT), des phagocytes et des neutrophiles issues de souris néphritiques. Un traitement aigu par un antagoniste non-peptidique de CCR1 administré par voie orale a réduit l’infiltration rénale des LT et des macrophages. L’inhibition de CCR1 à long terme a permis de diminuer l’accumulation rénale des LT CD4+ effecteurs/mémoires, des monocytes inflammatoires Ly6C+ et des macrophages polarisés M1 ou M2, a amélioré les atteintes tubulo-interstitielles et glomérulaires, a retardé l’apparition d’une protéinurie fatale et in fine a prolongé la survie des souris NZB/W. Ainsi, la combinaison d’approches pharmacologiques et fonctionnelles nous a permis de dévoiler un rôle pathogénique de CCR1, dans la progression de la néphrite lupique chez la souris NZB/W. La LCI est un déficit immuno-hématologique hétérogène et d’étiologie inconnue associant un nombre faible et persistant de LT CD4+ circulants et des infections opportunistes sévères en particulier d’origine fongique. Nos analyses multi-paramétriques par cytométrie en flux ont permis de révéler une perte d’expression et de fonction de CXCR4 à la membrane des LT de 17 des 20 patients étudiés. Ces données suggèrent que l’anomalie de CXCR4 constitue un trait biologique commun de la LCI. Notre approche transcriptomique a également permis d’identifier des signatures spécifiques de l’expression de gènes associés au seuil d’activation du TCR et à l’immuno-sénescence dans la LCI. Nos analyses phénotypiques et fonctionnelles ont confirmé ces observations et rapportent pour la première fois que les LT circulants résiduels de patients présentent un profil sénescent (exemple : perte d’expression des molécules de co-stimulation CD27 et CD28), des anomalies de réponse du TCR in vitro et une érosion des télomères. Sur un plan mécanistique, nous avons montré que les anomalies de signalisation intrinsèque aux LT des patients sont causées par l’expression accrue de la DUal-Specific Phosphatase 4 (DUSP4). Par conséquent, nos travaux révèlent une sénescence précoce des LT de patients souffrant de LCI, qui pourrait résulter d’une hyperstimulation chronique. Ce phénomène semble dépendre de la surexpression de DUSP4, dont la modulation pourrait constituer une piste thérapeutique dans la LCI afin d’améliorer les stratégies vaccinales
My PhD works focused on the expression and function of chemokine receptors in two immune disorders, namely CCR1 in the lupus-prone NZB/W mouse model and CXCR4 in the Idiopathic CD4+ T-cell lymphopenia, a rare human immune defect.Systemic lupus erythematosus is a chronic inflammatory autoimmune disease, the development of which is characterized by a progressive loss of renal function. Such dysfunction is associated with renal leukocyte infiltration. During my PhD, I investigated the role of the CCR1 chemokine receptor in this process during the progression of nephritis in NZB/W mice. We found that peripheral T-cells, mononuclear phagocytes and neutrophils from nephritic NZB/W mice were more responsive to CCR1 ligands than the leukocytes from younger prenephritic mice. Short-term treatment of nephritic NZB/W mice with a orally available CCR1 antagonist decreased renal infiltration by T-cells and macrophages. Longer Ccr1 blockade decreased kidney accumulation of effector/memory CD4+ T-cells, Ly6C+ inflammatory monocytes, and both M1 and M2 macrophages; reduced tubulointerstitial and glomerular injuries; delayed fatal proteinuria; and prolonged animal lifespan. Altogether, these findings highlight a pivotal role for CCR1 in the recruitment of T and mononuclear phagocyte cells to inflamed kidneys of NZB/W mice, which in turn contribute to the progression of renal injury.ICL is heterogeneous immunological syndrome of unclear molecular mechanisms, characterized by a profound and persistent CD4+ T-cell defect and by opportunistic infections in particular of fungal origin. We detected using multiparametric flow-cytometry analyses, reduced levels of CXCR4 expression and chemotactic function on T-cells from 17 of 20 ICL patients. These results suggest that the impaired membrane expression and function of CXCR4 is a common biologic trait of ICL. Using a transcriptomic approach, we also identified an ICL-specific T-cell gene expression signature characteristic of low TCR sensitivity and accelerated T-cell aging. Phenotypic and functional analyses of circulating T cells confirmed these observations and extended them to include an expansion of terminally-differentiated T cells with hallmarks of aging including loss of the co-stimulatory molecules CD27 and CD28, defective in vitro TCR responses, and telomere erosion. Mechanistically, we further showed that intrinsic T-cell signaling defects were caused by higher expression of DUal-Specific Phosphatase 4 (DUSP4). These findings suggest that premature T-cell senescence occurs in ICL as a result of chronic T-cell activation. This is in part due to abnormally high DUSP4 expression in CD4+ T cells, the modulation of which may constitute a novel therapeutic avenue in ICL to improve vaccination strategies

La réponse immunitaire antitumorale nécessite la mise en place de mécanismes effecteurs dépendant des lymphocytes T CD8+ cytotoxiques spécifiques. Cependant, leur présence n'est pas toujours suffisante pour induire une régression tumorale dépendant de plusieurs étapes: la migration des lymphocytes T au site tumoral, l'infiltration, l'établissement de contacts avec le cible cancéreuse et l'activation in situ. Les chimiokines sont impliquées dans la circulation des cellules immunocompétentes. Bien que leur rôle dans la progression tumorale soient bien établi, les chimiokines sont également responsable de la modulation du microenvironnement tumoral permettant l'infiltration des lymphocytes et la potentialisation de leurs fonctions effectrices. Nous avons démontré que les effecteurs T cytotoxiques peuvent être recrutés par la tumeur autologue de façon dépendante du récepteur aux chimiokines CCR5. Une fois dans microenvironnement tumorale riche en TGF-β, ils subissent un processus d'adaptation résultant en l'induction de l'expression du récepteur aux chimiokines CCR6 et de l'intégrine aEβ7, ainsi qu'en la potentialisation de leur activité cytotoxique. L'engagement de l'intégrine aEβ7 conduit au recrutement de CCR5 dans la synapse immunologique, provoquant ainsi la désensibilisation des lymphocytes T au gradient de CCL5. Nos travaux ont mis en évidence le rôle majeur des chimiokines dans le développement de la réponse immunitaire antitumorale dépendante de lymphocytes T cytotoxiques. Dans cette optique, l'identification des mécanismes moléculaires induits par les chimiokines correspond à un enjeu important pour l'optimisation des protocoles d'immunothérapie antitumorale
The immune system-mediated eradication of cancer cells requires effector mechanisms associated with the presence of tumor-specific T cells. However, the successful generation of tumor-specific effector cells does not necessarily result in tumor regression. Cytotoxic T lymphocytes (CTL) must first be able to migrate to tumor sites, traverse the interstitial space and fmally interact with their target resulting in triggering of effector fonctions. Chemokines are involved in circulation of immunocompetent cells. Although some of them are known to contribute to tumor progression, others are responsible for changes in the tumor microenvironment that allow the infiltration of lymphocytes. In this study, we demonstrate that CTLs can be efficiently recruited into the tumor in a CCR5-dépendent manner. Once in the TGF-pl-rich autologous tumor site, they undergo an intratumoral adaptation process resulting in upregulation of the chemokine receptor CCR6 and the integrin aEß7 as well as the enhancement of T-cell receptor (TCR)-mediated cytotoxicity. The engagement of aEβ₇ leads to CCR5 recruitment at the IS and reduced T-cell responsiveness to a CCR5 ligand chemotactic gradient, suggesting a role of aEß7 in T-cell rétention at the tumor by a CCR5-dépendent mechanism. Altogether, these results show an important role of the chemokine/chemokine receptor network at multiple levels of CTL-mediated antitumor immune response. In consequence, the identification of chemokine-medjated molecular mechanisms can be important for the development of innovative immunotherapeutic approaches and may offer new opportunities to optimize existing protocols of cancer therapy

Les cellules primaires du trophoblaste (CT) de placenta humain restent en contacte avec le sang et les tissues maternelles. L’IFNg, l’IL-6, l’IL-10, et le TNFa, sont des cytokines produites à l’interface materno fœtale. CXCR4 et CCR5 sont des récepteurs aux chimiokines (CKR) ainsi que les co-récepteurs du virus VIH-1, et leur expression dans les CT a été mise en évidence. Une modulation de l’expression de ces récepteurs par les cytokines reste encore à étendre aux TCs. Nous avons défini l’expression intracellulaire et membranaire de CXCR4 et CCR5 par les CT et nous avons observé qu’il y a une expression prédominante de CXCR4. Nous avons posé comme hypothèse de travail que celle-ci pouvait être modulée par les cytokines inflammatoires et nous avons donc étudié l’effet de l’IFNg, l’IL-6, l’IL-10, et du TNFa, sur cette expression. L’addition des cytokines sous citées, hors quelques cas rares de réponse individuelle, ne modifie pas significativement l’expression de CXCR4 ni de CCR5. Ces résultats sont à replacer dans le contexte de la controverse sur le compromis de l’expression des CKR par les CT immunopurifiées et leur susceptibilité à l’infection in vitro par le VIH-1.

La liaison de CXCL12 à ses récepteurs CXCR4 et CXCR7 peut-être bloquée par un neutraligand de CXCL12, la chalcone 4, qui présente une activité anti-inflammatoire dans un modèle d’asthme chez la souris. Notre travail a consisté à proposer des stratégies permettant le développement de molécules biodisponibles et actives localement, et d’étudier le mécanisme d'action in vivo des neutraligands de CXCL12. Nous avons développé un modèle court et reproductible d'asthme allergique chez la souris, adapté à une évaluation rapide de l’activité anti-inflammatoire des nouveaux composés et un développement raisonné des stratégies envisagées. Nous avons synthétisé trois prodrogues solubles, adaptées à une administration locale, inactives et rapidement clivées en chalcone 4 active. In vivo, les prodrogues sont anti-inflammatoires à des doses susceptibles de limiter les effets indésirables. Pour favoriser davantage l'action anti-inflammatoire locale du neutraligand de CXCL12, nous avons synthétisé une ante-drogue, la carbonitrile-chalcone 4, active in vivo par administration locale et rapidement dégradée en deux composés inactifs avant sa distribution dans l'organisme. Enfin, l'étude de la chalcone 4 a mis en évidence une activité antiasthmatique significative, liée à l'élimination rapide de la chimiokine CXCL12 du poumon. La capture de CXCL12 par le neutraligand réduit la différenciation des macrophages M1 et leur libération de cytokines pro-inflammatoires, ainsi que le recrutement des éosinophiles et des lymphocytes CXCR4+. En conclusion, nos travaux ont permis de conforter les rôles de la chimiokine CXCL12 dans l'asthme et présenter deux stratégies aptes à limiter les effets indésirables
The binding of the chemokine CXCL12 to its receptors CXCR4 and CXCR7 may be prevent by a CXCL12 neutraligand, chalcone 4, having an anti -inflammatory activity in a mouse model of allergic asthma. Our work consisted in proposing strategies for the development of active and bioavailable molecules, able to promote local action, and to study the in vivo mechanism of action of the CXCL12 neutraligands. We initially developed a short and reproducible mouse model of allergic asthma, suitable for a rapid assessment of the anti -inflammatory activity of new compounds, in order to ensure rational development of the proposed strategies. We developped three soluble prodrugs, adapted to local administration, inactive but rapidly cleaved in active chalcone 4. In vivo, the prodrugs have an anti-inflammatory activity at suitable doses to minimize side effects. To promote the benefit of local anti-inflammatory action of CXCL12 neutraligand, we synthesized an antedrug, carbonitrile-chalcone 4, active locally in vivo after local administration and rapidly degraded before its distribution in the body.Finally, the study of chalcone 4 allowed us to highlight a significant asthma activity. An activity related to the rapid elimination of the CXCL12 chemokine from the lung. The trapping of CXCL12 by the neutraligand reduced M1 macrophage activation and their release of pro inflammatory cytokines, as decreases the recruitment of CXCR4+ eosinophils and lymphocytes. In conclusion, our work provided mechanistic elements related to the roles of the chemokine CXCL12 in asthma, and present two interesting strategies adapted to local administration to limit adverse effects

CCR5 est un récepteur de chimiokine appartenant à la famille des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG), jouant un rôle important dans l'entrée du VIH, en association avec la glycoprotéine CD4. Nous avons pu démontrer que la grande majorité de CCR5 (90%) était maintenue à l'état fonctionnel dans les compartiments intracellulaires des cellules immunitaires humaines et des fibroblastes transfectés. CCR5 est particulièrement localisé dans le réticulum endoplasmique (RE) et le Golgi. Les mécanismes moléculaires qui régulent l'export de CCR5 en provenance des compartiments intracellulaires s'avèrent différents dans le RE et le Golgi. La progression de CCR5 hors du RE est lente, et favorisée par son association avec CD4, qui fonctionne comme une protéine d'escorte et régule l'adressage de CCR5 vers la membrane plasmique. D'un point de vue mécanistique, CD4 induirait un changement conformationnel de CCR5, permettant de lever sa rétention dans le RE par PRAF2, une protéine résidente de ce compartiment. Dans le Golgi, la libération de CCR5 est beaucoup plus rapide (5-10min) et contrôlée par des signaux extracellulaires initiés par l'adhésion cellulaire. La rétention dans les compartiments intracellulaires de CCR5 et, plus généralement, des RCPG, pourrait constituer un système d'adaptation permettant de maintenir une réponse physiologique prolongée, dans des contextes cellulaires qui requièrent une réactivité de réponse soutenue, comme au cours du chimiotactisme des leucocytes, via le remplacement progressif des récepteurs de surface désensibilisés et internalisés
CCR5 a chemokine receptor belonging to the G protein-coupled receptor (GPCR) family, plays a major role in HIV entry, by forming the viral receptor in association with the glycoprotein CD4. We report that the vast majority of fully functional CCR5 (=90%) is maintained within the intracellular compartments of human immune cells and of transfected fibroblasts. Intracellular CCR5 is mostly localized in the endoplasmic reticulum (ER) and the Golgi apparatus. The molecular mechanisms which control the export of CCR5 from the intracellular compartments are different in the ER and the Golgi. In the ER, the progression of CCR5 is slow and depends on its association with CD4 which functions as an escort protein and controls the CCR5 exit. Association with CD4 would induce a conformational change of CCR5, which would release the receptor from its retention in the ER by a resident protein, PRAF2. In the Golgi, the release of CCR5 is faster (5-10min) and is controlled by extracellular signals promoted by cell adhesion. The intracellular retention of CCR5 and, more generally, of GPCRs could represent an adaptive mechanism to maintain a prolonged physiological response. In particular contexts, which require sustained receptor response such as leukocyte chemotaxis, intracellular receptors would allow the permanent replacement of cell surface desensitized and internalized receptors

Il existe deux types de souches de VIH, celles utiliant le corécepteur CCR5, appelées R5 et celles utilisant le corécepteur CXCR4, appelées X4. Les souches R5 sont retrouvées tout au long de l'infection, alors que les souches X4 n'émergent que chez 30 à 50% des patients infectés et ce 7 à 10 ans après le début de l'infection. Plusieurs hypothèses ont tenté d'expliquer cette prédominance des souches R5, mais toutes se sont révélées incorrectes. Nous avons montré que la voie de signalisation induite par les souches X4 lors de leur fixation sur leur corécepteur CXCR4, passant par les protéines Gαi et les kinases ERK1/2, de même que celle déclenchée par les souches R5 via CCR5, favorisait la rétrotranscription du virus. Nous avons également mis en évidence que la densité en CXCR4 à la surface des cellules cibles influençait l'efficacité de réplication des souches X4. Ensuite nous avons comparé, in vitro, l'efficacité de réplication des souches R5 et X4 dans des lymphocytes TCD4+ (LTCD4+) du sang périphérique. La mise en culture de ces cellules induit une sur-expression membranaire de CXCR4, due à l'absence de son ligand CXCL12 provoquant son internalisation. Nous avons alors cocultivé les LTCD4+ avec des cellules produisant CXCL12, ce qui a maintenu la densité membranaire de CXCR4 à un niveau physiologique. Dans ces conditions, les souches R5 se sont révélées plus réplicatives que les souches X4, ce qui pourrait être une des causes de la prédominance des souches R5 in vivo. Nous avons enfin étudié in vitro, si les densités respectives en corécepteur influençaient l'apparition des souches X4 à partir des souches R5. Nous montrons que le délai d'émergence des souches X4 est dépendante d'une forte quantité de corécepteur CXCR4 à la membrane des cellules et indépendant de la densité en CCR5. Ce résultat suggère qu'in vivo, une sur-expression de CXCR4 à la surface des cellules LTCD4+ pourrait favoriser l'émergence des souches X4.

Selon les données de l'Organisation mondiale de la Santé (OMS), l'obésité a atteint des proportions pandémiques dans le monde entier, avec plus d'un milliard d'adultes qui présentent un surpoids (indice de masse corporelle (IMC) > 25 kg/m2) dans le monde entier, et au moins 300 millions cliniquement obèses (IMC > 30 kg/m ). L'obésité est un trait complexe qui ne suit pas un mode de transmission mendélienne classique, ce qui implique qu'elle est influencée par l'interaction entre les gènes, l'environnement et le mode de vie. L'obésité est également reconnue pour être associée à une composante inflammatoire caractérisée par une production anormale de cytokines et l'activation de voies de signalisation inflammatoires dans le tissu adipeux. Le gène CX3CR1 code pour le récepteur de la fractalkine (CX3CR1) et possède deux polymorphismes nucléotidiques simples (Single Nucleotide Polymorphisms : SNPs), V249I et T280M, situés dans une région codante, et qui ont été associés à un risque moins élevé de présenter certaines maladies inflammatoires telles que les maladies coronariennes et l'asthme. Dans le but de déterminer si CX3CR1 est associé à l'obésité, nous avons procédé au génotypage des polymorphismes V249I et T280M du gène CX3CR1 chez des sujets ayant un IMC > 30 kg/m2 et des témoins non obèses avec un IMC <30 kg/m2. Les analyses ont révélé que le génotype 280MM est associé à l'obésité (p = 0,022). Pour les deux polymorphismes, et ce de manière indépendante, les femmes portant deux copies de l'allèle mineur avait un tour de taille qui était en moyenne significativement plus élevé que celles qui ne portent qu'une seule copie de l'allèle mineur (MM> TM, P = 0,031; II> VI, P = 0,013), ou celles qui étaient homozygotes pour l'allèle majeur (MM> TT, p = 0,005; II> VV, P = 0,006). Nous avons également observé un tour de taille en moyenne significativement supérieur chez les hommes portant une copie de l'allèle mineur par rapport à ceux qui étaient homozygotes pour l'allèle majeur pour le polymorphisme T280M (TM> TT, P = 0,029). Cette étude suggère que CX3CR1 constitue une cible potentielle d'investigation sur le rôle de l'inflammation dans l'expression de phénotypes de l'obésité.