Dissertationen zum Thema „Récepteur alpha de l'acide rétinoïque“

Les récepteurs nucléaires de l'acide rétinoïque (AR) appelés RAR, se comportent comme des facteurs de transcription inductibles par le ligand. La transcription des gènes cibles induite par l'AR, nécessite la fixation des RAR au niveau de séquences spécifiques des promoteurs et met en jeu des changements conformationnels des récepteurs qui contrôlent l'association/dissociation de toute une panoplie de corégulateurs. Cependant, en plus de ce modèle génomique et nucléaire bien établi, l'équipe du Dr Cécile Rochette-Egly a montré récemment que l'AR a aussi des effets non-génomiques et induit rapidement la voie de signalisation p38MAPK/MSK1 qui ensuite cible les RAR pour des cascades de phosphorylations et module la transcription des gènes cibles. Pendant mon travail de thèse, j'ai mis en exergue trois nouveaux concepts originaux du mécanisme d'action du sous-type RARα. J'ai montré qu'une sous-population de RARα est présente dans des microdomaines membranaires, les radeaux lipiques ou "lipid rafts"où elle interagit avec les protéines Gαq. Cette interaction est le signal des effets non génomiques de l'AR, l'activation de la voie de la p38MAPK. Ces effets ont été corrélés à l'activité des gènes cibles de l'AR, prouvant ainsi leur nécessité. J'ai identifié un nouveau partenaire de RARα, la profiline IIA. J'ai analysé le mécanisme moléculaire de l'interaction et démontré qu'elle a lieu dans le noyau. La profiline IIA s'est révélée être un régulateur des effects génomiques de RARα et est recrutée avec RARα au niveau des promoteurs des gènes cibles. Finalement j'ai mis en évidence une nouvelle fonction de RARα dans le contrôle de l'adhésion et de l'étalement des cellules. D'où l'hypothèse de nouveaux effets génomiques de RARα avec la profiline IIA dans le contrôle de l'expression des protéines d'adhésion. Cependant, de manière inattendue, j 'ai identifié une nouvelle population de RARα dans le cytoplasme de ces cellules. D'où l'hypothèse de nouveaux effets non génomiques dans le cytoplasme, via l'interaction de RARα avec des protéines d'adhésion.

La vitamine A est un facteur nutritionnel qui est métabolisé en acide rétinoïque (RA). Au niveau moléculaire, la découverte des gènes codant pour les récepteurs de l'acide rétinoïque (RARs et RXRs) ont permis d'effectuer des progrès considérables dans la compréhension du mécanisme d'action de RA. Chaque classe de récepteur consiste en trois sous-types appelés [alpha], [beta] et [gamma] et leurs isoformes respectifs. [. . . ] Ce travail consistait à étudier le domaine de liaison (LBD) du récepteur humain de l'acide rétinoïque [alpha] (hRAR[alpha]) et plus particulièrement visait à répondre à trois questions : l)Y-a t-il une ou plusieurs cystéine(s) du hRAR[alpha]-LBD intervenant dans l'interaction récepteur-ligand ? 2)Y-a t-il un ou plusieurs résidu(s) arginine impliqué(s) dans cette interaction ? 3)Quelle est la région minimale du récepteur nécessaire pour garder l'interaction récepteur-ligand ? [. . . ]

Les retinoides, derives actifs de la vitamine a, jouent un role important de controle de la differenciation et de la proliferation cellulaires. L'un de ces derives, l'acide retinoique tout-trans, suscite un tres grand interet car il est implique dans la morphogenese et est propose pour la chimioprevention et le traitement de certains cancers. Le mecanisme d'action des retinoides met en jeu des recepteurs nucleaires (rar alpha, beta et gamma) appartenant a la superfamille des recepteurs steroidiens/thyroidiens. La comprehension du mecanisme moleculaire d'action des retinoides et la synthese de derives agonistes ou antagonistes specifiques d'un recepteur necessitent de bien connaitre le domaine de fixation au ligand des rar. La surexpression du domaine e de rar alpha, sous forme de proteine de fusion, dans un systeme bacterien nous a permis de proceder a sa purification et a sa caracterisation biochimique. La proteine recombinante est purifiee avec une activite specifique de 100 pmol/mg et un rendement de purification de 10%. La constante de dissociation mesuree, apres optimisation des conditions d'etude de l'interaction recepteur-ligand, est de 3,1 nm pour l'acide retinoique tout-trans, et 1,8 nm pour un derive de synthese, le cd367. Les reactifs specifiques des cysteines et des arginines provoquent une diminution de l'activite de liaison de rar alpha. Le ligand protege tres bien le site actif vis-a-vis de l'effet des reactifs des thiols. Cette protection est moins efficace en presence des reactifs des arginines. Ces observations suggerent que des residus cysteines et arginines sont localises dans le site actif du domaine e de rar alpha et participent a l'interaction recepteur-ligand. La caracterisation des cysteines situees dans, ou a proximite, du site actif a ete abordee par une approche indirecte qui utilise la spectrometrie de masse en mode electrospray. Nous presentons ici des resultats preliminaires de la premiere etape de notre etude qui consiste en l'analyse, en spectrometrie de masse, des peptides obtenus apres coupure chimique du domaine e de rar alpha.

Les leucémies aiguës promyélocytaires (LAP) sont caractérisées par une signature chromosomique, la translocation t(15;17) résultant en un gène de fusion associant PML au gène codant le récepteur [alpha] de l'acide rétinoïque (RARA). Dans de rares cas de LAP atypiques (LAP-L), RARA est fusionné à différents partenaires : PLZF, NPM et NuMA. Au cours de ce travail, nous avons réalisé l'étude moléculaire d'un der(17) associé à une LAP-L. Par la technique de 5' RACE PCR, nous avons identifié un cinquième partenaire de RARA, STAT5b qui appartient à la famille des facteurs de transcription cytosoliques (Signal Transducer and Activator of Transcription) activés par les tyrosine kinases JAK. [. . . ]
Acute promyelocytic leukaemia (APL) exhibits a characteristic t(15;17) translocation that fuses the PML gene on 15q22 to the retinoic acid receptor [alpha] (RARA) gene on 17q12-q21. 1. In a small subset of acute promyelocytic-like leukaemias (APL-L), RARA is fused to a different partner: PLZF, NPM or NuMA. We report on the molecular characterization of a RARA gene rearrangement in a patient with an APL-L associated with a der(17). Thanks to the 5' RACE PCR approach, we demonstrate that the Signal Transducer and Activator of Transcription STAT5b gene is fused to RARA; STAT5b belongs to a family of latent cytosolic transcription factors activated by JAK tyrosine kinases

L'acide rétinoïque, un dérive de la vitamine a, est un élément clef du contrôle de la prolifération et de la différenciation cellulaires. Son mécanisme d'action met en jeu l'activation de gènes cibles, notamment via deux récepteurs nucléaires. Dans cette étape, les récepteurs de l'acide rétinoïque tout-trans (rar) et de son dérive 9-cis (rxr) se lient sous forme d'heterodimeres à des éléments de réponse appelés rare. Le positionnement précis des deux récepteurs sur l’ADN cible est déterminé par plusieurs motifs structuraux qui forment des interfaces de mémorisation des récepteurs et d'interaction avec l’ADN. Nous avons mis au point une stratégie basée sur des modifications chimiques spécifiques d'amino-acides afin d'examiner le rôle des lysines, arginines, cystéines, histidines, tyrosines et tryptophane du rar dans ses fonctions de liaison a l’ADN, d'homodimerisation et d'heterodimerisation en présence et en absence d’ADN. Nous avons observé une implication différentielle de ces aminoacides dans les différentes fonctions testées. Dans un deuxième temps, le radio marquage des lysines accessibles du rar natif a permis de localiser ces résidus dans la 8#e heptad repeat au sein du domaine de liaison au ligand. Ces résultats fournissent une mise en évidence directe de l'implication différentielle de résidus a groupement basique, thiol ou aromatique dans les propriétés de liaison a l’ADN, homodimerisation et heterodimerisation du rar, et illustrent la mise en jeu de plusieurs interfaces de dimerisation.

Retinoic acid receptor-related orphan receptor-alpha (RORa) is a transcription factor from the nuclearreceptor superfamily expressed by immune and non-immune cells involved in the regulation of obesity, insulin resistance (IR) and non-alcoholic steatohepatitis (NASH). Cholesterol, cholesterol-sulfate, 7-oxygenated sterols and oxysterols have been identified as potential endogenous RORa ligands. Tobetter understand the mechanisms of macrophage-expressed RORa regulation in obesity and IR, we generated a macrophage-specific RORa-deficient (MKO) mouse line by using a LysM-Cre and floxedRORa mouse line. We report that RORa deletion in macrophages does not impact on HFD-induced obesity and IR. Surprisingly, we did not confirm an earlier report on the effect of HFD on NASHdevelopment upon HFD feeding nor in the more severe and obesity-independent choline-deficient, Lamino acid-defined diet model. We thus, suspected that LysM copy number may play a role in thisdiscrepancy, as the genotype at the LysM locus is a major difference between the two independent linesof work. The LysM-Cre mice carry an insertion of Cre recombinase into the Lyz2 gene, leading to Creexpression under the control of the Lyz2 promoter and enhancers, but abolishing endogenous Lyz2expression. While we intentionally maintained similar Cre and Lyz2 expression between WT and MKO by using only hemizygous animals for this locus (comparing Rora+/+Lyz2Cre/+ with Rorafl/flLyz2Cre/+),floxed mice (Rorafl/flLyz2+/+) were used as WT control and compared with MKO mice missing informationabout the Lyz2 locus (Rorafl/fLyz2Cre/?) in the earlier study. As, we hypothesized that the observed impact of RORa deletion in macrophages on NASH in the earlier study likely did not result from a specific effect of RORa deletion, but rather from a different Lyz2 copy number between WT and MKO mice, we decidedto verify this hypothesis experimentally. Surprisingly, our preliminary findings showed that the Lyz2-deficient mice exhibit slight protection, rather than a detrimental effect, in HFD-induced obesity and IR, as determined by lower body weight and adipose tissue masses, significantly improved glycemic control and decreased epiAT inflammation. Interestingly, whole body Lyz2 deficiency had no impact on hepaticsteatosis (NAFL) in HFD-fed mice. Nonetheless, our preliminary findings even suggest that Lyz2deficiency might protect against advanced and obesity-independent choline-deficient, L-amino aciddefined diet-induced NASH. Taken together, these preliminary findings indicate that different Lyz2 genecopy number in control mice is unlikely to account for the discrepancy between our work and the earlier study. Overall, our results show that RORa deletion in macrophages does not alter the development of obesity and IR and question its role in NASH. On the other hand, we believe that further investigations are of significant interest in the context of obesity, IR, and advanced NASH, as Lyz2 might possess atherapeutic value
RORa (Retinoic acid receptor-related orphan receptor-alpha) est un facteur de transcription de la superfamille des récepteurs nucléaires exprimé par des cellules immunitaires et non immunitaires impliqué dans le contrôle de l'obésité, de l'insulinorésistance (IR) et de la stéatohépatite non alcoolique(NASH). Le cholestérol, le cholestérol-sulfate, les stérols 7-oxygénés et les oxystérols ont été identifiés comme des ligands endogènes potentiels RORa. Pour mieux comprendre le rôle de RORa exprimé parles macrophages dans l'obésité et I’IR, nous avons généré une lignée de souris déficientes en RORa spécifiques aux macrophages (MKO) en utilisant des lignées de souris LysM-Cre et RORa foxée. Nous résultats montrent que l’inactivation de RORa dans les macrophages n'a pas d'impact sur l'obésité et l’insuline-résistance induites par une régime riche en graisses (HFD). Étonnamment, contrairement àdes travaux, notre étude ne montre pas d'effet sur le développement de la NASH ni suite à un régime HFD, ni dans le modelé d’alimentation défini par les acides aminés L, plus sévère et indépendant de l 'obésité et déficient en choline. Nous avons donc soupçonné que le nombre de copies de LysM pouvait jouer un rôle dans cette divergence, car le génotype des souris au l locus LysM est une différence majeure entre les deux études indépendantes. Les souris LysM-Cre portent une insertion de la recombinase Cre dans le gène Lyz2, ce qui conduit à l'expression de Cre sous le contrôle du promoteurLyz2 et ses activateurs, mais abolit l'expression endogène de Lyz2. Alors que nous avons intentionnellement maintenu une expression similaire de Cre et de Lyz2 entre WT et MKO en utilisant uniquement des animaux hémizygotes pour ce locus (en comparant Rora+/+Lyz2Cre/+ avec Rorafl/flLyz2Cre/+), des souris foxées (Rorafl/flLyz2+/+) ont été utilisées comme contrôle de WT et comparées avec des souris MKO pour lesquelles il manquait des informations sur le locus Lyz2(Rorafl/flLyz2Cre/ ?) dans l'étude antérieure. Aussi, nous avons émis l'hypothèse que l'impact observé de la délétion de RORa dans les macrophages sur la NASH dans l'étude précédente ne résultait probablement pas d'un effet spécifique de la délétion de RORa, mais plutôt d'un nombre de copies Lyz2différent entre les souris WT et MKO et avons décidé de vérifier cette hypothèse expérimentalement.De manière surprenante, nos résultats préliminaires ont montré que les souris déficientes en Lyz2présentent une légère protection, plutôt qu'un effet néfaste, dans l'obésité et l'IR induites par le HFD,comme le montre la diminution du poids corporel et des masses de tissu adipeux, l'amélioration significative du contrôle de la glycémie et la diminution de l'inflammation de l'épiAT. Il est intéressant de noter que la déficience totale en Lyz2 n'a eu aucun impact sur la stéatose hépatique (NAFL) chez les souris nourries au HFD. Néanmoins, nos résultats préliminaires suggèrent même que la carence enLyz2 pourrait protéger contre la NASH induite par le régime alimentaire, carence en choline. Dans leur ensemble, ces résultats préliminaires indiquent que le nombre différent de copies du gène Lyz2 chez les souris de contrôle n'explique probablement pas la différence entre notre travail et l'étude précédente.Globalement, nos résultats montrent que la délétion de RORa dans les macrophages ne modifie pas le développement de l'obésité et de l’IR et remettent en question son rôle dans la NASH. D'autre part,nous pensons que des recherches plus approfondies sur le rôle du lysozyme présentent un intérêt significatif dans le contexte de l'obésité, de l’IR et de la NASH avancée, car Lyz2 pourrait avoir un intérêt thérapeutique

Les retinoides sont des derives de la vitamine a qui jouent des roles cles dans de nombreux processus biologiques tels que la proliferation et la differenciation de nombreux types cellulaires. Les retinoides exercent leurs effets pleiotropiques par liaison a des recepteurs nucleaires, les recepteurs de l'acide retinoide tout trans (rars) et les recepteurs de l'acide 9-cis retinoique (rxrs) qui se lient generalement sous forme d'heterodimeres a des sequences specifiques d'adn pour reguler l'expression de leurs genes cibles. L'activite transcriptionnelle des recepteurs nucleaires peut etre controlee par la liaison de corepresseurs en l'absence de ligand et le recrutement de coactivateurs apres liaison du ligand. Elle peut etre aussi modulee par de nombreuses modifications post-traductionnelles dont la phosphorylation des recepteurs nucleaires. Dans ce travail, nous montrons que les isoformes alpha et gamma de pk-cs sont capables de phosphoryler hrar sur un seul residu, la serine 157. La modification de cette serine entraine une inhibition de l'activite transcriptionnelle du recepteur qui est correlee a une diminution de sa capacite a former des heterodimeres avec hrxr
Dans les cellules hela, nous avons egalement caracterise les isoformes de pk-cs presentes et demontre qu'un traitement prolonge par un ester de phorbol, le tpa, provoque non seulement une diminution d'expression des pk-cs et mais aussi une accumulation de la sous unite catalytique dans le noyau des cellules cibles. Nous montrons donc que hrar est une cible directe pour les pk-cs et qui controlent l'activite transcriptionnelle des recepteurs des retinoides pendant la proliferation et la differenciation cellulaire. La serine 157 est situee dans la boite t du recepteur, une region encore peu caracterisee mais soupconnee d'avoir un role dans les activites de liaison a l'adn et de dimerisation. Nous avons mute en alanine chacun des douze acides amines constituant la boite t et etudie l'effet de ces mutations sur l'activite transcriptionnelle des recepteurs et sur leurs activites de liaison a l'adn et de dimerisation. Nous montrons que ces mutations diminuent l'inductibilite transcriptionnelle vraisemblablement par modification de l'interaction avec les coactivateurs et les corepresseurs

Le syndrome de détresse respiratoire causé par une déficience du surfactant pulmonaire, de même que la bronchodysplasie pulmonaire, sont des complications fréquemment observées chez les prématurés. Certaines observations suggèrent que les stocks insuffisants d'acide rétinoïque sous la forme d'ester de rétinyl sont en grande partie responsables de ces pathologies. Cette déficience en acide rétinoïque pourrait elle-même affecter l'expression des récepteurs de l'acide rétinoïque et compromettre le processus de maturation pulmonaire, qui serait à l'origine du syndrome de détresse respiratoire. Par analogie chez les fumeurs, on observe une perte de l'expression du gène RAR[bêta] dès les premiers stades du processus néoplasique pulmonaire, suggérant que le RAR[bêta] joue un rôle clé durant le processus de tumorigénèse. L'acide rétinoïque (RA) est un dérivé de la vitamine A qui joue un rôle important dans le contrôle de la différenciation et de la prolifération cellulaire. L'action du RA s'effectue via deux familles de récepteurs nucléaires appelés RAR et RXR. Au laboratoire, nous nous intéressons au rôle joué par le récepteur RAR[bêta] dans le processus de la tumorigénèse et de la différenciation des cellules épithéliales pulmonaires. Afin d'étudier le rôle de RAR[bêta] dans ces processus, trois modèles de souris transgéniques précédemment générés par le docteur Bérard ont été utilisés. Ces animaux permettent la manipulation des niveaux d'expression de quatre des isoformes du RAR[bêta]. En conclusion, les résultats obtenus suggèrent que le RAR[bêta] est impliqué directement ou indirectement dans le contrôle de l'expression des différentes composantes du surfactant pulmonaire. Ces marqueurs de la différenciation cellulaire seront très utiles ultérieurement, lors des essais précliniques visant l'utilisation des rétinoïdes sélectifs comme agents de chimioprévention du cancer du poumon."--Résumé abrégé par UMI.

Les récepteurs de l’acide rétinoïque, RARα, β et γ sont des facteurs de transcription dépendants du ligand qui contrôlent l’expression de gènes spécifiques. Cependant, il s’avère depuis peu que les RAR ont aussi des effets non-transcriptionnels extranucléaires. Durant ma thèse, j’ai observé que (1) les fibroblastes invalidés pour tous les RAR ont un cytosquelette d’actine perturbé et ont perdu leurs propriétés d’adhésion (2) RARα interagit via son motif riche en proline N-terminal avec la profiline 2a (PFN2a) qui est un régulateur critique de l’élongation des filaments d’actine du cytosquelette. J’ai montré que : (1) Les RAR contrôlent la morphologie, l’adhésion et la migration des MEF via la régulation transcriptionnelle de l’expression de gènes codant pour des protéines d’adhésion (2) Dans le cytoplasme, RARα forme avec PFN2a des complexes dont le nombre contrôle le réseau d’actine et l’adhésion des MEF via un mécanisme non transcriptionnel. Ces observations mettent en exergue l’importance de la combinaison des effets génomiques et non-génomiques des RAR dans l’adhésion des cellules et ouvrent de nouvelles possibilités de dérégulation du fonctionnement des RAR dans certaines pathologies
Retinoic acid receptors, RARα, β and γ are ligand-dependent transcription factors that control the expression of specific genes. However, growing evidence indicates that RARs also have extranuclear and non transcriptional effects. During my thesis, I observed that (1) fibroblasts invalidated for all RARs depict a disrupted actin cytoskeleton and have lost their adhesion properties (2) RARα interacts through its N-terminal proline rich motif with profilin2a (PFN2a) a critical regulator of actin filaments elongation. I have shown that: (1) RARs control the morphology, adhesion and migration of MEFs via controlling at the transcriptional level the expression of adhesion genes (2) In the cytosol, RARα forms complexes with PFN2a. The number of these complexes controls the actin network and the adhesion of MEFs via a non-transcriptional mechanism. These observations highlight the importance of the combined genomic and non-genomic effects of RARs in cell adhesion, and open new avenues for RARs deregulations in certain pathology

L'acide rétinoique, un dérivé de la vitamine A, est un élément clef dans le contrôle de la prolifération et de la différenciation cellulaire. Son mécanisme d'action passe par l'activation de gènes cibles via deux récepteurs nucléaires, les rars et les rxrs, facteurs de transcription ligand dépendant. Par homologie avec les autres membres de la super famille, ces récepteurs peuvent être divises en six domaines distincts nommes de a à f. […]Dans ce travail, nous nous sommes intéresses aux mécanismes de l'interaction ligand/récepteur (hrar). Utilisant la technique de mutagenèse par délétion, nous avons pu identifier deux régions fonctionnellement importantes. La partie c-terminale du domaine d (aa 186 a 198) concourt a la stabilité du site de liaison tandis que la partie c-terminale du domaine e (aa 403 a 410) est impliquée directement dans la liaison au ligand. […] Cette étude s'est prolongée par l'introduction de mutations ponctuelles non conservatives au niveau de cette région. Nous avons pu ainsi évaluer la contribution de chaque résidus dans l'interaction avec le ligand naturel, l'atra, mais également pour d'autres rétinoides naturels ou synthétiques. L'importance des différents acides amines s'est avérée variable en fonction du ligand étudie suggérant une certaine flexibilité de la région. […]Certaines se sont montrées essentielles pour la pharmacologie du ligand avec en particulier la glycine 404 et la leucine 409 qui transforment le cd367 en un agoniste inverse. Par le même type d'expérience, nous avons montre que le domaine f n'est pas nécessaire pour l'effet antagoniste du ro41-5253 malgré des variations très importantes dans l'amplitude de la répression observée.

Les Récepteurs de l'Acide Rétinoïque (RAR) interagissent, de manière dépendante du ligand, avec beaucoup de corégulateurs qui participent à un large spectre de réponses biologiques, allant du développement embryonnaire au contrôle de la croissance cellulaire. La fonction transactivatrice de ces facteurs de transcription inductibles par leur ligand réside principalement, mais pas exclusivement, dans leur domaine de liaison du ligand (AF2) qui recrute ou se dissocie de corégulateurs de manière dépendante du ligand. Néanmoins, les fonctions du RAR AF2-indépendantes sont peu élucidées. Au cours de cette étude, nous avons identifié, par un crible double hybride dans la levure, deux nouveaux partenaires du RARa, les protéines PLZF (Promyelocytic Leukemia Zinc Finger) et PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen). Ces deux protéines interagissent physiquement et fonctionnellement avec le RARa et agissent en tant que répresseurs du RARa. Néanmoins, elles possèdent des fonctions bien distinctes et exercent leur effet répresseur par des domaines et des mécansimes différents. Dans ce travail, nous avons mis en évidence que PLZF interfère probablement avec la dimérisation RAR-RXR, alors que PCNA interagit avec l'hétérodimère RAR-RXR lié à son élément de réponse et réprime son activité transcriptionnelle de manière promoteur- et cellule-spécifique. Nos observations définissent donc de nouveaux mécanismes par lesquels l'activité du RARa est contrôlée, et nous permettent, par extrapolation, de faire le lien entre RARa, développement embryonnaire et hématopoïèse, dans le cas de PLZF d'une part, et entre RARa, cycle cellulaire et réparation de l'ADN, dans le cas de PCNA, d'autre part
The Retinoic Acid Receptors (RAR) interact, in a ligand-dependent manner, with many coregulators which are involved in a broad spectrum of biological responses, from embryonic development to cell growth control. The transactivation function of these ligand-inducible transcription factors resides mainly, but not exclusively, in their Ligand Binding Domain (AF2) which recruits or dissociates coregulators in a ligand-dependent manner. Nevertheless, the RAR AF2-independent functions are not much elucidated. In this study, we have identified, by yeast two-hybrid screen, new RARa two partners, the PLZF (Promyelocytic Leukemia Zinc Finger) and PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) proteins. These two proteins interact physically and functionally with the RARa and act as RARa repressors. In addition, they have very distinct functions and exert their repressor effect through different domains and via different mechanisms. We have demonstrated that PLZF interferes probably with RAR-RXR dimerization. In contrast, PCNA interacts with RAR-RXR heterodimer bound to its response element and represses its transcriptional activity in a promoter- and cell-specific manner. These observations demonstrate new mechanisms by which RARa activity is controlled, and suggest a link between RARa, embryonic development and hematopoiesis in the case of PLZF and between RARa, cell cycle and DNA repair in the case of PCNA

Les récepteurs nucléaires (RN) constituent une superfamille de facteurs de transcription ligand-dépendants jouant un rôle crucial dans la régulation de processus vitaux de la vie cellulaire (prolifération, différenciation, apoptose, homéostasie). De fait, ils constituent des cibles thérapeutiques de choix pour le traitement d'un grand nombre de pathologies (cancer, diabète, obésité. . . ). Ils se composent de 5/6 domaines fonctionnels dont trois principaux : le domaine A/B porte la fonction d'activation de la transcription AF1 dite autonome, le domaine C (DBD) est le domaine de liaison à l'ADN, et le domaine E (LBD), domaine de liaison au ligand, porte aussi la fonction AF2 ligand-dépendante. En 2000, les bases structurales de l'agonisme/antagonisme étaient clarifiées grâce aux nombreuses structures de LBD, mais aucune donnée structurale n'était disponible concernant la fonction AF1, et le recrutement du corépresseur. Ainsi, nous avons entrepris :- L'Etude biophysique et fonctionnelle préliminaire à l'étude structurale de l'interaction du récepteur des oestrogènes avec le coactivateur transcriptionnel TIF2 pour élucider les bases structurales de la fonction AF1. - L'Etude par cristallographie aux rayons X du complexe LBD du récepteur à l'acide rétinoïque  (RAR)/antagoniste BMS493/motif ID-1 du corépresseur N-CoR pour clarifier les bases structurales du recrutement du corépresseur. - Etude de la sélectivité isotypique du RAR et ligand RAR sélectifs. Nous avons résolu pour la première fois, la structure du LBD du RAR en complexe avec le TTNPB (agoniste) et sur la base d'expériences de modélisation, nous proposons les principes structuraux pour la synthèse rationnelle de ligands RAR sélectifs. Nous avons, de plus, caractérisé fonctionnellement un ligand RAR sélectif. De tels ligands doivent permettre de clarifier la contribution de chacun des trois isotypes du RAR dans la signalisation par les rétinoïdes, et devraient réduire les effets secondaires liés aux traitements par rétinoïdes
Nuclear receptors (NR) are ligand dependant transcription factors which share a common modular organization. The A/B domain bears the autonomous activation fonction AF1. The C domain is the DNA binding domain (DBD). The D domain contitutes a hinge between the C- and E domain. The E domain is the ligand binding domain (LBD) which also bears the ligand-dependant activation fonction AF2. NR plays an important role in the regulation of cell proliferation, differentiation, apoptosis and in cell homeostasis maintenance. Thus they are targeted by numerous treatment notably by cancer therapy, and by diabet and obesity treatments. Numerous studies uncovered the canonical three dimensional fold of LBD as well as the structural basis of agonism/antagonism. But at the begining of my PhD, the structural basis of corepresseur recruitment as well as the structural mechanism of AF1 fonction were unknown. To adress these questions we decided to undergo the two first projects of my PhD

Les rétinoïdes (dérivés actifs de la vitamine A) agissent via deux familles de récepteurs nucléaires : les RAR°(α, β et γ) et les RXR (α, β et γ). In vivo, le signal rétinoïque est transmis par des hétérodimères du type RAR/RXR qui se comportent comme des facteurs de transcription inductibles par leur ligand et se lient à des éléments de réponse (RARE) situés au niveau du promoteur des gènes cibles. L’équipe a démontré que des processus de phosphorylation ciblent deux domaines des RAR, le domaine N‐terminal (NTD) et le domaine de liaison du ligand (LBD), et jouent un rôle clé dans l’activité transcriptionnelle des récepteurs. Pour comprendre l’impact des phosphorylations sur le fonctionnement des RAR, je me suis particulièrement intéressé à étudier les dynamiques d’association/dissociation des RAR (α et γ) avec différents partenaires protéiques en fonction de leur état de phosphorylation. Dans le cas de RARα, j’ai participé à la mise en évidence des conséquences de la phosphorylation du LBD au niveau de la sérine 369, localisée à proximité du domaine de fixation de la cycline H. Via des changements conformationnels, cette phosphorylation améliore le recrutement de la cycline H associée à la kinase cdk7 du facteur général de transcription TFIIH. Cet effet est à la base d’une cascade aboutissant à la phosphorylation par cdk7 du NTD de RARα. J’ai aussi participé à l’étude d’un autre partenaire de RARα, SUG‐1, qui est une sous‐unité du protéasome. SUG‐1 joue un rôle double dans la transcription des gènes cibles de RARα en régulant la dynamique de la transcription en absence de protéolyse, et en signalisant sa fin via la dégradation du coactivateur SRC‐3. Dans le cas de RARγ, j’ai démontré que le motif riche en prolines (MRP) du NTD interagit directement avec un des domaines SH3 d’une protéine adaptatrice, la Vinexine β. Cette association a lieu uniquement lorsque le MRP n’est pas phosphorylé et maintient le récepteur en dehors de la chromatine. En réponse à l’AR, une des sérines du MRP devient phosphorylée, induisant la dissociation de la Vinexine β et finalement le recrutement de RARγ phosphorylé au niveau des promoteurs des gènes cibles de l’AR. Dans ce contexte, j’ai également effectué une recherche bioinformatique de nouveaux RARE fonctionnels à l’échelle du génome
The effects of Retinoids (active derivatives of Vitamin A) are mediated by two families of nuclear receptors, RAR (α, β and γ) and RXR (α, β and γ). In vivo, the RA signal is transmitted by RAR/RXR heterodimers, which function as ligand‐dependent transcriptional regulators and bind to RARE (Retinoic Acid Response Element) at the promoters of target genes. Our team demonstrated that two domains of RARs, the NTD (N‐terminal Domain) and the LBD (Ligand Binding Domain), are targets for phosphorylation processes that control RAR transcription. In order to decipher how phosphorylation controls RARs functions, I analyzed the dynamics of RAR (α and γ) association/dissociation with different protein partners depending on RARs phosphorylation state. In the case of RARα, I highlighted the consequences of LBD phosphorylation at serine 369, localized in close vicinity to the cyclin H docking site. This phosphorylation, via conformational changes, influences the recruitment of cyclin H associated to the cdk7 kinase of the general transcription factor TFIIH. This effect is at the basis of a cascade leading to the phosphorylation of the NTD by cdk7. I also participated to the study of another RARα partner, SUG‐1, a subunit of the proteasome. SUG‐1 plays a dual role in RARα target gene transcription by regulating the dynamic of transcription without proteolysis and by signaling the end of the RA response via the degradation of its coactivator, SRC‐3. In the case of RARγ, I demonstrated that the PRM (Proline Rich Motif) of the NTD interacts directly with one SH3 domain of Vinexin β, an adaptor protein. This association occurs only when the PRM is not phosphorylated and maintains the receptor outside of the chromatin. After RA addition, one of the serine of the PRM becomes phosphorylated, inducing the dissociation of Vinexin β, and finally the recruitment of phosphorylated RARγ to RA target‐genes. In this context, I also realized a “genome wide” bioinformatic search for finding new functional RAREs

L'acide rétinoïque (AR) joue un rôle important dans plusieurs processus cellulaires à travers la régulation de la différentiation cellulaire, de la prolifération et de l'apoptose. Ces propriétés sont à la base de l'utilisation de l'AR dans le traitement de plusieurs cancers dont la leucémie aiguë promyélocytaire. Décrypter comment l'AR contrôle l'expression de gènes spécifiques est un défi permanent pour l'étude des cancers. Les effets de l'AR sont médiés in vivo principalement par les récepteurs à l'acide rétinoïque (RARs). Il a été récemment démontré que la phosphorylation des RARs par différentes kinases est une étape nécessaire dans la régulation de leurs fonctions. Dans ce contexte, ma thèse a porté sur l’étude des mécanismes moléculaires de la régulation par phosphorylation des RARs. Nous nous sommes intéressés en particulier à deux aspects : l’effet de la phosphorylation sur le domaine de liaison au ligand (LBD) et sur le domaine N-terminal (NTD). Dans le cas du LBD, la phosphorylation induit la fixation de la Cycline H qui est une sous-unité du facteur de transcription TFIIH, alors que la phosphorylation du NTD induit une diminution d’affinité de liaison à la Vinexine beta qui est un co-répresseur. Nous avons étudié les effets de la phosphorylation par des simulations de dynamique moléculaire. Cette technique permet de caractériser la dynamique structurale et de quantifier les interactions qui stabilisent les états phosphorylés et non phosphorylés. Ce projet a permis de définir les bases moléculaires de la communication entre le RA et les cascades de phosphorylation et d’obtenir des informations originales sur des mécanismes régulateurs d’une grande importance
Retinoic Acid (RA) plays a critical role in many cellular processus through regulatory effects on cellular differentiation, proliferation and apoptosis. This proprety is at the basis of RA therapy in the treatment of several diseases and cancers such as Acute Promyelocytic Leukemia. Deciphering how RA controls the expression of specific subsets of genes is therefore a permanent challenge in oncology. The effects of RA are mediated in vivo by the retinoic acid receptor (RAR), which consistsof three subtypes. A new concept has recently emerged according to which phosphorylation of RARs by different kinases is a necessary step in the regulation of their function. In this context, the specific aim of this thesis was the elucidation of the molecular mechanisms of the regulation of RAR mediated by phosphorylation. In particular, we focused on two aspects, the effects of phosphorylation of the ligand binding domain (LBD) and the effects on the N-terminal domain (NTD). In the case of the LBD, phosphorylation enhanced binding to cyclin H, a component of the TFIIH transcription factor, while phosphorylation of the NTD decreased binding to vinexinB, a corepressor protein. We used molecular dynamics simulations to characterize the structural dynamics of these proteins in both phosphorylated and unphosphorylated states and to quantify theirinteractions. From this project, we were able to define the molecular basis of the communication between RA-induced phosphorylation cascades and regulatory mechanisms of high importance

Le récepteur LSR est un acteur important du métabolisme hépatique, puisqu'il joue un rôle dans la clairance des lipoprotéines à ApoB/ApoE riches en triglycérides durant la période postprandiale. Dans cette étude, nous avons montré qu'un traitement in vitro par DHA peut augmenter les niveaux de protéine et d'activité LSR dans les cellules d'hépatome de souris Hepa 1-6. En toute cohérence, un régime supplémenté en DHA a conduit à élever les niveaux de protéine LSR hépatique chez la souris. Mais aucune de ces deux études n'a montré de changement au niveau des ARNm. Ceci suggère que l'enrichissement en DHA influe positivement sur le microenvironnement de LSR et son ancrage à la surface de la cellule. Nous avons ensuite étudié le rôle du récepteur PPAR[alpha] dans la régulation du gène lsr. Une analyse in silico nous a permis d'identifier des éléments PPRE dans la région 5' régulatrice du gène humain et de ses homologues de souris et de rat. Des traitements pharmacologiques par des agoniste et antagoniste spécifiques de PPAR[alpha] ont montré que ce récepteur est impliqué dans la régulation transcriptionnelle de l'expression du LSR dans les cellules Hepa 1 6. Enfin, une analyse transcriptomique a révélé une diminution de l'expression de PPAR[alpha] et d'autres gènes impliqués dans le métabolisme lipidique hépatique chez la souris LSR+/- sous régime standard ou riche en graisses. En conclusion, toutes ces études indiquent que l'activité LSR hépatique est sous le contrôle de facteurs nutritionnels capables d'activer divers mécanismes de régulation, faisant du LSR une cible d'intérêt potentiel pour des stratégies nutritionnelles ou thérapeutiques destinées à prévenir ou traiter les dyslipidémies
Lipolysis stimulated lipoprotein receptor (LSR) plays an important role in the clearance of ApoB/ApoE containing triglyceride-rich lipoproteins during postprandial phase. In this study, we demonstrated that in vitro treatment of mouse hepatoma cells, Hepa 1-6, with docosahexaenoic acid (DHA) led to an increase in LSR protein levels as well as its activity. Furthermore, the mice placed on the diet supplemented with DHA showed an increase in hepatic LSR protein. However, the mRNA levels remained unchanged in both in vitro and in vivo studies, suggesting that DHA enrichment may result in changes in LSR microenvironment that could affect its anchorage at the surface of cell membrane. Specific peroxisome proliferator response elements were identified in the upstream region of human, mouse and rat lsr gene by in silico analysis. We therefore sought to determine the role of the transcription factor, peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR[alpha]), in LSR regulation. In vitro pharmacological studies using PPAR[alpha]-selective agonist and antagonist agents demonstrated that PPAR[alpha] is indeed involved in the transcriptional regulation of LSR expression. Furthermore, qPCR array analysis revealed the downregulation of PPAR[alpha] and various genes involved in hepatic lipid metabolism in LSR+/- mice on standard and high-fat diets. In conclusion, these studies show that the hepatic LSR activity is controlled by dietary factors that can activate various pathways involved in regulating lipid homeostasis, therefore representing LSR as a potential target for either nutritional or therapeutic strategies towards the prevention or treatment of dyslipidemia

L'acide tout-trans retinoique, principal derive actif de la vitamine a, presente des activites pleiotropiques comme l'inhibition de la proliferation cellulaire, l'induction de la differenciation cellulaire ou la regulation de l'apoptose. Il est donc utilise dans le traitement de certaines affections cutanees ou de certains cancers. L'activite des retinoides est controlee par des recepteurs nucleaires, rars et rxrs (, et ), qui regulent l'activation transcriptionnelle de genes cibles specifiques. Le developpement de nouveaux retinoides a permis d'aboutir a la synthese d'agonistes et d'antagonistes specifiques et selectifs des differentes classes de rars et des rxrs avec des applications therapeutiques mieux definies. La cristallographie du domaine de liaison au ligand de rar a permis de mettre en evidence la conformation et les acides amines de la poche de liaison de l'acide retinoique. Nous avons principalement cible notre etude sur les trois residus de tyrosine du domaine de liaison au ligand de rar et notamment sur le role determinant de la tyrosine 277. Nous avons note une inactivation dose dependante de la liaison rar-#3ht-ra apres traitement du recepteur au tetranitromethane, reactif specifique des tyrosines. Grace au couplage hplc-spectrometrie de masse, nous avons observe une protection par l'acide retinoique contre la nitration de la tyrosine 277. La mutation de ce residu par une alanine engendre une diminution de l'affinite de liaison de l'acide retinoique et de ligands synthetiques et reduit considerablement l'activite transactivatrice du recepteur. D'autres residus d'acides amines de la poche de liaison au ligand de rar ont egalement ete etudies. Les mutants obtenus ont des affinites de liaison et des activites de transactivation differentielles selon le ligand utilise. Ces acides amines semblent donc impliques dans le mecanisme d'activation agoniste et antagoniste de rar.

Au cours de cette thèse, nous nous sommes intéressés à la différenciation normale et pathologique des cellules germinales (CGs). Dans une première partie, la différenciation normale a été étudiée chez l'amphibien urodèle Pleurodeles waltl. L'acide rétinoïque (AcR) est impliqué dans l'induction de l'entrée en méiose des cellules germinales (CGs) chez les amniotes (Bowles et al., 2006 ; Smith et al., 2008). Nous avons voulu savoir si l'AcR était aussi impliqué dans ce processus chez le pleurodèle. Nous avons montré que l'expression de PwDmc1 (marqueur de méiose), survient plus précocement dans les gonades femelles (avant la métamorphose) que dans les gonades mâles (après la métamorphose). In vitro, l'application d'AcR sur des gonades mâles et femelles en culture organotypique ainsi que l'inhibition de la dégradation de l'AcR endogène induisent l'entrée en méiose des CGs. Nous avons également montré que la balance synthèse/dégradation l'AcR endogène est modulée par les hormones stéroïdes. Les mécanismes de différenciation des CGs décrits chez les mammifères semblent donc conservés chez les urodèles. La seconde partie de la thèse s'inscrit dans le contexte de la différenciation pathologique des CGs.De nombreuses études ont montré qu'une exposition in utero à des xénobiotiques pouvait provoquer des altérations de la différenciation des CGs. Ces cellules altérées restent en dormance pendant l'enfance. A la puberté, elles prolifèrent et donnent naissance aux tumeurs testiculaires, suggérant que le développement de ces tumeurs est hormono-sensible (McIntyre et al., 2008). Nous avons étudié les effets des hormones stéroïdes sur la prolifération des cellules séminomateuses humaines TCam2. L'oestradiol et la testostérone stimulent leur prolifération ainsi que l'expression d'une isoforme tronquée du récepteur alpha des oestrogènes ER[alpha]36. Ce récepteur est induit par la voie GPER-AMPc/PKA et semble nécessaire à l'expression du récepteur à l'EGF. Il pourrait donc constituer une cible thérapeutique potentielle
Retinoic acid (RA) is involved in germ cells meiosis onset (CGs) in amniotes (Bowles et al., 2006 ; Smith et al., 2008). The aim of the first part of our study was to determine if RA is able to induce meiosis entry in the urodele amphibian Pleurodeles waltl. Our data on PwDmc1 (meiosis marker) expression indicate an earlier meiosis onset in females compared with males depending on RA biosynthesis. In vitro, the treatment of male and female gonads with RA induces an earlier meiosis entry in both sexes. Moreover, we have shown that RA biosynthesis is regulated by steroid hormones. Therefore, the mechanisms which trigger GCs differentiation in mammals might be conserved in urodeles. Many studies indicated that in utero xenobiotic exposure is able to induce alterations in GCs differentiation. These neoplasic cells enter in a period of dormancy until after puberty where they proliferate and the testicular tumours emerge. This prepubertal dormancy suggests that the testicular cancer development is hormone sensitive (McIntyre et al., 2008). In the second part we studied the effects of steroid hormones on the proliferation of the seminoma cell line TCam2. Our results indicate that estradiol and testosterone can induce the proliferation of this cell line and the expression of ER[alpha]36, a truncated form of estrogen receptor alpha. This expression is stimulated by GPER-cAMP/PKA signalisation pathway and activates EGFR expression. ER[alpha]36 could be a potential therapeutic target

L’acide rétinoïque (AR) est le dérivé actif majeur de la vitamine A et a de multiples rôles au niveau cellulaire ainsi que pendant le développement. L’AR agit via deux familles de récepteurs nucléaires : les Récepteurs de l’Acide Rétinoïque (RAR) et les Récepteurs X des Rétinoïdes (RXR). Ces récepteurs sont des facteurs de transcription dépendants du ligand et leur activité est régulée par des phosphorylations via des kinases activées par l’AR. Durant ma thèse, je me suis intéressé à l’étude fonctionnelle et évolutive de la voie de l’AR et de la phosphorylation des RAR chez le poisson-zèbre Danio rerio. En étudiant l’activité des différents sous-types de RAR chez le poisson-zèbre, nous avons mis en avant qu’il existe une activité transcriptionnelle propre à chaque sous-type dans un embryon précoce de poisson-zèbre. De plus, mes travaux ont montré qu’au cours de l’évolution, l’acquisition d’un site de phosphorylation chez RARα permet une régulation fine de son activité chez les mammifères. Enfin, en étudiant les mécanismes moléculaires à l’origine de la diversification de la denture chez les poissons, mes travaux mettent en avant un rôle de la voie de l’AR dans la genèse de nouveaux traits phénotypiques
Retinoic acid (RA) is the main active metabolite of vitamin A and plays multiple roles in cellular processes but also during embryonic development. RA acts through two families of nuclear receptors: Retinoic Acid Receptors (RAR) and Retinoid X Receptors (RXR). Those receptors act as ligand-dependent transcription factors and their transcriptional activity is also regulated by phosphorylation processes through kinases activated by RA. During my PhD, I focused on the functional and evolutionary study of RA pathway and of the phosphorylation of RARs using zebrafish (Danio rerio). By studying the activity of the different RAR subtypes in zebrafish, we provide evidences that they can regulate gene expression in a subtype-specific fashion in the early zebrafish embryo. Furthermore, my work showed that during evolution, the acquisition of a phosphorylated residue in RARα promotes the fine-tuned regulation of its activity in mammals. Finally, aiming at deciphering the molecular mechanisms behind dentition diversification in fish, we propose a role for RA signaling in generating morphological novel traits during evolution

Le récepteur de l'acide rétinoïque RAR est une protéine de la superfamille des récepteurs nucléaires liant le ligand acide rétinoïque (AR). En présence de son ligand, RAR induit la transcription de ses gènes cibles alors qu'en son absence la transcription est inhibée. Le mécanisme de régulation de RAR est altéré dans les lignées cellulaires humaines de carcinome mammaire dû à une baisse de capacité de synthèse de l'AR. Aussi, l'expression des microARN (miR) est perturbée dans le cancer du sein et un grand nombre de gènes ont été identifiés, après une analyse in-silico, comme des cibles prédites des miRs. Ces derniers peuvent être régulés pas des facteurs de transcription et ils sont capables d'inhiber la prolifération cellulaire et d'induire l'apoptose via la régulation de leurs cibles. Ainsi, les miRs peuvent jouer un rôle dans le mécanisme de régulation de RAR et être impliqués dans des boucles de régulation avec ce récepteur. Dans le cadre de ce travail, nous décrivons une approche développée pour prédire et caractériser des circuits de régulation au niveau transcriptionnel et post-transcriptionnel dans le cancer du sein. Nous nous sommes intéressés aux boucles de régulation de type feed-forward où RAR régule un miR et en commun ils régulent un ensemble de gènes codants pour des protéines dans les cellules tumorales mammaires MCF7 et SKBR3. Ces circuits ont été construits en combinant des données de ChIP-chip de RAR et des données de micro-puces d'ADN tout en utilisant des outils in-silico de prédiction des gènes cibles de miRs. Afin de proposer le modèle approprié de régulation, une analyse in-silico des éléments de réponse de l'AR (RARE) dans les promoteurs des miRs est réalisée. Cette étape permet de prédire si la régulation par RAR est directe ou indirecte. Les boucles ainsi prédites sont filtrées en se basant sur des données d'expression de miR existantes dans des bases de données et dans différentes lignées cellulaires, en vue d'éliminer les faux positifs. De plus, seuls les circuits pertinents sur le plan biologique et trouvés enrichis dans Gene Ontology sont retenus. Nous proposons également d'inférer l'activité des miRs afin d'orienter leur régulation par RAR. L'approche a réussi à identifier des boucles validées expérimentalement. Plusieurs circuits de régulation prédits semblent être impliqués dans divers aspects du développement de l'organisme, de la prolifération et de la différenciation cellulaire. De plus, nous avons pu valider que let-7a peut être induit par l'AR dans les MCF7.
The retinoic acid receptor (RAR) is a type of nuclear receptor that is activated by the ligand retinoic acid (RA). In the presence of ligand, RAR induces the transcription of its targets whereas in the absence of ligand the transcription is blocked. The mechanism of regulation of RAR is altered in breast cancer cell lines due to a reduced capacity to synthesize RA. Also aberrant patterns of microRNA (miR) expression have been reported in human breast cancer and a number of genes involved in breast cancer progression have been identified by in-silico analysis to be targets of miRs. The miRs could be controlled by transcription factors and via the regulation of their mRNA targets, the miRs could promote apoptosis and even inhibit cell proliferation. Hence, the miRs may play a role in the mechanism of regulation of RAR and could be involved in regulatory loops with this receptor. In this work, we describe an approach developed for the prediction and characterization of mixed transcriptional and post-transcriptional regulatory circuits in breast cancer. We concentrated in particular on feed-forward loops, in which RAR regulates a miR, and together with it, a set of joint target protein coding genes in human breast cancer cell lines MCF7 and SKBR3. These loops are constructed by combining ChIP-chip datasets of RAR with datasets of DNA microarrays and by using miR target prediction tools. In order to predict the appropriate model of regulation, in-silico analysis was performed to look for retinoic acid response element (RARE) in miR promoter. This step could identify if the regulation by RAR is direct or indirect. The regulatory loops will be then filtered, in order to reduce the number of false positive, based on databases designed to represent human miR expression profiles in different tissues or cell types. Moreover, only biologically relevant circuits enriched in Gene Ontology were retained. Also, we propose to infer miR activity in order to detect their regulation by RAR. This approach was able to find some existing experimental data. Several regulatory circuits seem to be involved in various aspects of organism development, proliferation and cell differentiation. Furthermore, we were able to validate the induction of let-7a by RA in MCF7 cells.