Auswahl der wissenschaftlichen Literatur zum Thema „Protéines à domaine PDZ“

L’alimentation des ruminants : un problème d’actualitéDans la conduite et la réussite d’un système de production de Ruminants, l’alimentation du troupeau reste un domaine très important qui continue de poser de nombreuses questions à la fois pratiques et théoriques. Pour l’éleveur, les postes récolte des fourrages et des céréales, achats d’aliments et entretien des surfaces fourragères représentent plus de 50 % des charges opérationnelles de son exploitation. Nourrir quotidiennement son troupeau lui impose de faire des choix de types de rations et en amont des choix stratégiques de long terme, sur la conduite de son système fourrager en considérant ses contraintes de milieu naturel, de bâtiments ou de stockage. La gestion de l’alimentation est directement liée à tous les autres choix stratégiques de l’activité d’élevage, le niveau de croissance des jeunes animaux, la reproduction, l’allotement la quantité et la qualité de la production. Pour le chercheur en nutrition animale, les enjeux sont devenus multiples et son positionnement a évolué : la recherche de la production maximale soutenue par l’alimentation a fait place à la volonté d’atteindre un optimum à la fois biologique, technique et économique selon les milieux dans lequel l’élevage est conduit. Il doit faire en sorte que la ration calculée par ses modèles satisfasse les besoins de l’animal selon les objectifs de production de l’éleveur, mais qu’elle participe également au bon état sanitaire et de bien-être du troupeau, qu’elle garantisse la qualité des produits et minimise l’impact défavorable des rejets sur l’environnement. La recherche en nutrition et alimentation des ruminants porte à la fois sur les fourrages, la physiologie digestive et métabolique de l’animal et son comportement alimentaire. En tenant compte de la complexité des mécanismes biologiques, les modèles nutritionnels doivent pouvoir simuler avec le maximum de précisions les flux de matières à travers le tube digestif et les organes sur des pas de temps variables, à la fois de court et de long terme. Cela reste un sujet perpétuellement en évolution qui exige aussi de synthétiser les connaissances sous forme d’outils d’aide à la décision et qui soit capable de présenter la qualité de ces outils et leurs limites d’usage. Une recherche qui se développe avec l’INRALes recherches pour aider à déterminer les choix d’alimentation des animaux en condition de production se sont concrétisées au cours du 20ème siècle. Les systèmes d’alimentation en énergie, azote et minéraux ont été développés en France après 1945. A l’INRA, le département Elevage des Ruminants sous l’impulsion de R. Jarrige avait initié une révision majeure des principes et des unités pratiques de terrain en 1978 en proposant un système énergétique construit sur la base de deux unités fourragères, lait et viande (UFL, UFV), un système des Protéines Digestibles dans l’Intestin (PDI) et des Tables complètes à la fois des besoins des animaux et de la valeur alimentaire des aliments. C’est notamment dans le domaine de la valeur nutritionnelle des fourrages que ces travaux étaient particulièrement riches. Ces «systèmes INRA» avaient alors été complétés par la première ébauche d’un modèle complètement nouveau de prévision de l’ingestion (système des Unités d’Encombrements UE) qui sera fortement remanié et amélioré dix ans plus tard lors de la révision de 1988. Ce nouvel ensemble, prévision de l’ingestion, estimation des besoins nutritionnels, a également permis d’accroître l’offre d’outils pratiques de terrain. En complèment des Tables imprimées, un outil informatique d’accompagnement et de rationnement «INRAtion» a été proposé dès 1992. Celui-ci s’est ensuite enrichi de l’outil de calcul de la prévision de la valeur des aliments «Prevalim;» et tous deux sont devenus des réceptacles appliqués des nouveautés scientifiques concernant les systèmes INRA. Mais, près de vingt ans après le dernier «Livre Rouge de l’Alimentation des bovins, ovins et caprins», une mise à niveau des ouvrages écrits s’imposait également et il est apparu nécessaire de proposer une actualisation des connaissances des principes du rationnement des ruminants. Les travaux des équipes de recherches ont permis de progresser aussi bien sur la caractérisation de la valeur des fourrages et des matières premières, que sur l’estimation des besoins des animaux et des apports nutritionnels recommandés dans des situations très diverses. Au delà des recommandations statiques, focalisées sur l’objectif de satisfaire les besoins, les lois de réponses dynamiques des pratiques alimentaires sont mieux connues et quantifiées. Elles permettent de mieux simuler les conséquences de la diversité des situations. L’objectif de l’ouvrage «Alimentation des bovins, ovins et caprins - Tables INRA 2007», sorti en février aux éditions Quæ, est ainsi de remettre sous la forme connue et largement adoptée par tous les acteurs des filières de l’élevage ruminant ces nouveaux résultats. Des documents complémentairesCependant le niveau scientifique choisi de l’ouvrage récemment paru et sa taille volontairement réduite pour en faire un ouvrage facilement accessible ont contraint les auteurs à aller à l’essentiel, les frustrant sans aucun doute d’une description et d’une discussion de fond de leurs résultats.En reprenant l’exemple de 1987 où le «livre rouge» publié par INRA Editions était complété par un numéro détaillé du Bulletin CRZVde Theix, nous avons donc décidé de publier un dossier dans la Revue INRA Productions Animales qui complète l’ouvrage de février. Ce dossier regroupe majoritairement des présentations et les explications des choix qui ont prévalu au développement des nouveaux modèles sous-tendus dans les recommandations. Il comporte 5 articles qui éclairent des points clés des innovations introduites en 2007, et qui correspondent soit à des nouveaux modèles mécanistes des fonctions de l’animal, soit à des méthodes de prévision de la valeur des fourrages, soit à des remises en cause plus profondes de l’ensemble apports, besoins comme c’est le cas pour la nutrition minérale.Toutefois, ce dossier n’est pas exhaustif des «nouveautés» du livre 2007. Certaines avaient été déjà publiées, soit dans des revues scientifiques, soit dans des sessions des «Rencontres Recherches Ruminants». Sans aucun doute d’autres viendront encore les compléter par la suite.Ainsi sont étudiés successivement des apports scientifiques sur la valeur des aliments et sur les besoins des animaux :1 - La dégradabilité des protéines dans le rumen (DT) et la digestibilité réelle des protéines alimentaires dans l’intestin grêle (dr). La valeur azotée des fourrages repose sur la bonne estimation de ces deux paramètres, qui sont la clé du calcul du système des protéines digestibles dans l’intestin PDI (article de M.-O. Nozières et al).2 - Les nouvelles valeurs minérales et vitaminiques des aliments. La possibilité de raisonner en éléments phosphore et calcium absorbables apporte de nouvelles précisions et modifie considérablement les quantités recommandées. L’article précise et actualise les Apports Journaliers Recommandés (AJR) d’éléments minéraux majeurs. Les autres minéraux, oligo-éléments et vitamines sont également revus de façon systématique et approfondie (article de F. Meschy et al).3 - De nouvelles équations statistiques de prévision de la digestibilité de la Matière Organique (dMO) des fourrages par la méthode pepsine-cellulase établies sur une banque de données couvrant une gamme plus importante de fourrages et de modes de conservation. La valeur énergétique des fourrages dépend en effet étroitement de la digestibilité de leur matière organique. Son estimation sur le terrain peut se faire à partir de méthodes de laboratoire comme la digestibilité pepsine-cellulase, utilisée en France depuis plus de vingt ans. Cette méthode est proposée pour sa bonne précision (article de J. Aufrère et al).4 - La composition du gain de poids chez des femelles adultes en période de finition qui permet de calculer ensuite directement le besoin en énergie et en protéines de l’animal. Ce modèle est suffisamment souple pour proposer un besoin face à un objectif de croissance donné, mais il propose aussi un niveau de croissance pour une ration d’un niveau énergétique donné. Ce nouveau modèle a été spécifiquement développé pour tenir compte de la très grande variabilité des situations pratiques rencontrées : la race, l’âge, le format, l’état d’engraissement initial et la vitesse du gain attendu (article de F. Garcia et J. Agabriel).5 - La capacité d’ingestion d’aliments par les vaches laitières au cours de leur lactation complète. Ce tout nouveau modèle s’adapte à tous types de vaches primipares, multipares et propose le nouveau concept de «lait potentiel» pour mieux décrire cette capacité d’ingestion. Ce concept est nécessaire pour répondre aux diverses stratégies des éleveurs dans la conduite de leurs animaux et qui ne souhaitent pas nécessairement les mener à leur maximum de production. Le modèle tient en effet compte de l’état initial de la vache au vêlage et des modifications d’état corporel qui accompagnent obligatoirement la conduite de la lactation (article de P. Faverdin et al).La Rédaction de la Revue a estimé judicieux de publier dans ce même numéro d’INRA Productions Animales, un travail très récent sur la teneur en matière grasse du lait de vache et sa prévision, qui pourra dans les années à venir se traduire concrètement dans les outils d’accompagnement de nos recommandations (article de Rulquin et al).A l’occasion de la publication de ce dossier, nous voulons plus particulièrement remercier tous les participants des Unités et Installations Expérimentales de l’INRA sans qui ces résultats ne seraient pas, ainsi que tout le personnel des Unités de Recherches qui ont participé dans les laboratoires ou derrière leurs écrans : l’Unité de Recherches sur les Herbivores (URH) de Clermont-Ferrand-Theix, l’Unité Mixte de Recherches sur la Production Laitière (UMR PL) de Rennes, l’Unité Mixte de Recherches Physiologie et Nutrition Animale (UMR PNA) de Paris, l’Unité Mixte de Recherches sur les Ruminants en Région Chaude (UMR ERRC) de Montpellier.

La détection de protéines au sein de tissus/fl uides estaujourd’hui de pratique courante (ex : western blot oucytométrie en fl ux) et utilisée dans des domaines trèsdifférents, par exemple pour confi rmer une sérologieVIH positive ou réaliser un dosage toxicologique. Dansle domaine de la recherche, ces techniques sont également couramment utilisées notamment pour développerdes biomarqueurs d’intérêt diagnostic ou pronostic.L’objectif de cette fi che est de présenter les différentestechniques utilisées de façon courante pour la détectiondes protéines. La cytométrie en fl ux a fait l’objet d’uneprécédente publication. Quelle que soit la techniqueprésentée, la présence d’un contrôle positif et d’un contrôlenégatif est indispensable à l’interprétation des résultats

La consommation de protéines végétales présente plusieurs bénéfices sur le plan de la santé, de l’environnement et du développement du secteur agro-alimentaire. Malgré les avantages liés à la consommation de protéines végétales, la consommation de viande demeure souvent privilégiée. Cet article présente une revue de la littérature de presse visant à répertorier les interventions de promotion de la consommation de protéines végétales mises en place au Canada et dans des pays européens francophones. L’identification des documents s’est faite à partir de la banque de données Eureka pour les articles de journaux de quotidiens francophones en provenance du Canada et d’Europe et sur le moteur de recherche Google Actualités. Les articles publiés entre le 1er janvier 2015 et le 11 mai 2020 ont été retenus. Au total, 49 articles ont été inclus dans l’étude. Six types d’intervention ont été recensés (sensibilisation, conférences, législation, formation, partenariats/programmes de reconnaissance et offre d’un repas végétarien en restauration collective). L’intervention la plus populaire était l’offre de repas végétariens en restauration collective. Les barrières à l’implantation de ces interventions étaient souvent d’ordre organisationnel (ex : manque de temps), financier, matériel et culturel. Les forces des interventions impliquaient généralement le caractère participatif et volontaire du public cible et l’inclusion de diverses parties prenantes. Cette revue de la littérature de presse peut orienter les acteur.trices œuvrant dans le domaine de la nutrition afin de favoriser la mise en place d’actions de promotion de la consommation de protéines végétales.

Dans le cadre de l’unité d’enseignement « Rédiger en sciences » proposée par l’université d’Aix-Marseille, les étudiants du Master 2 de microbiologie se sont confrontés aux exigences de l’écriture scientifique. Quatre thématiques leur ont été proposées : les virus géants, les systèmes de sécrétion, la motilité bactérienne et la réparation des protéines oxydées. Après un travail préparatoire effectué avec l’équipe pédagogique et les auteurs des publications originales, les étudiants, organisés en groupes de trois ou quatre, ont rédigé une Nouvelle soulignant les résultats majeurs et l’originalité des quatre articles étudiés. Complété par un entretien avec les chercheurs auteurs de ces articles, l’ensemble offre un éclairage original sur la compréhension du vivant dans le domaine de la microbiologie.

La classe C des Récepteurs Couplés aux Protéines G (RCPG) comprend plusieurs membres aux fonctions physiologiques importantes comme par exemple les récepteurs des principaux neurotransmetteurs excitateurs (glutamate) et inhibiteurs (GABA) du système nerveux, les récepteurs des goûts umami et sucré et les récepteurs sensibles au calcium. Ces récepteurs possèdent une architecture moléculaire particulière, caractérisée par la présence d’un large domaine extracellulaire (ECD) relié à un domaine membranaire composé de 7 hélices transmembranaires (7TM). De plus, ils forment tous des dimères obligatoires, la dimérisation étant fondamentale pour leur fonction. La fixation d’agoniste dans l’ECD induit l’activation du récepteur. L’activité des agonistes peut être modulée de manière allostérique par des modulateurs positifs (PAM) ou négatifs (NAM), se liant au domaine 7TM. Il est important de comprendre comment les changements de conformation induits par la liaison des agonistes au sein du domaine extracellulaire sont transmis au domaine transmembranaire mais aussi de comprendre les bases structurales et moléculaires de la régulation allostérique des récepteurs de la classe C. Les progrès récents de la microscopie électronique en conditions cryogéniques (cryoEM) ont permis des avancées sans précédent dans le décryptage des bases structurelles et moléculaires des mécanismes d’activation des RCPG de classe C, et notamment du récepteur métabotropique du glutamate de type 5 (mGlu5). Le glutamate entraîne une fermeture et un changement d’orientation des domaines extracellulaires qui induit un mouvement important entre les sous-unités, rapprochant les 7TM et stabilisant la conformation active du récepteur. La diversité de conformations inactives pour les récepteurs de la classe C était inattendue mais propice à une activation possible par des PAM. Ces derniers stabilisent une conformation active des 7TM, indépendante des changements conformationnels induits par les agonistes, représentant un mode alternatif d’activation des récepteurs mGlu. Nous présentons et discutons ici les caractérisations structurales récentes des récepteurs de classe C, en soulignant les résultats qui rendent cette famille de récepteurs unique. La compréhension de la base structurelle de la signalisation des dimères de mGlu représente une réalisation historique et ouvre la voie à l’analyse de la signalisation des dimères de RCPG en général. Ces analyses structurales devraient également ouvrir de nouvelles voies pour la conception de médicaments ciblant cette famille de récepteurs qui sont aussi des cibles thérapeutiques.

L’alimentation des chèvres laitières est un domaine en évolution technique rapide qui demande de plus en plus de recommandations alimentaires précises. La dernière mise à jour a été effectuée en 2007 et une actualisation s’avérait nécessaire. Les caractéristiques zootechniques de base (variations de la production de lait, des taux butyreux et protéique et du poids vif) sont mieux connues et désormais modélisées au sein du logiciel INRAtion. Les valeurs des besoins en énergie, protéines et minéraux au cours du cycle gestation- lactation sont globalement confirmées ou légèrement modifiées. En revanche, les lois de réponses aux apports de concentrés ont été précisées, en relation notamment avec les apports et les bilans d’énergie. Dans le domaine des lipides, de nombreuses données ont été publiées récemment ce qui permet de disposer de nouvelles lois de réponses ayant une bonne précision. Les rejets d’éléments polluants (méthane et azote) ont été abordés et des équations de prévision simples et utilisables de ces flux sont proposées. Enfin, dans les domaines du comportement alimentaire, de l’acidose et des besoins en eau, des travaux récents permettant de disposer de valeurs repères applicables sur le terrain.

Les interactions protéine-protéine sont souvent contrôlées par de petits domaines protéiques qui régulent les chemins de signalisation au sein des cellules eucaryotes. Les domaines PDZ sont parmi les domaines les plus répandus et les plus étudiés. Ils reconnaissent spécifiquement les 4 à 10 acides aminés C-terminaux de leurs partenaires. Tiam1 est un facteur d'échange de GTP de la protéine Rac1 qui contrôle la migration et la prolifération cellulaire et dont le domaine PDZ lie les protéines Syndecan-1 (Sdc1), Caspr4 et Neurexine. Des petits peptides ou des molécules peptidomimétiques peuvent potentiellement inhiber ou moduler son activité et être utilisés à des fins thérapeutiques. Nous avons appliqué des approches de dessin computationnel de protéine (CPD) et de calcul d'énergie libre par simulations dynamique moléculaire (DM) pour comprendre et modifier sa spécificité. Le CPD utilise un modèle structural et une fonction d'énergie pour explorer l'espace des séquences et des structures et identifier des variants protéiques ou peptidiques stables et fonctionnels. Nous avons utilisé le programme de CPD Proteus, développé au laboratoire, pour redessiner entièrement le domaine PDZ de Tiam1. Les séquences générées sont similaires à celles des domaines PDZ naturels, avec des scores de similarité et de reconnaissance de pli comparables au programme Rosetta, un outil de CPD très utilisé. Des séquences contenant environ 60 positions mutées sur 90, ont été testées par simulations de DM et des mesures biophysiques. Quatre des cinq séquences testées expérimentalement (par nos collaborateurs) montrent un dépliement réversible autour de 50°C. Proteus a également déterminer correctement la spécificité de la liaison de quelques variants protéiques et peptidiques. Pour étudier plus finement la spécificité, nous avons paramétré un modèle d'énergie libre semi-empirique de Poisson-Boltzmann ayant la forme d'une énergie linéaire d'interaction, ou PB/LIE, appliqué à des conformations issues de simulations de DM en solvant explicite de complexes PDZ:peptide. Avec trois paramètres ajustables, le modèle reproduit correctement les affinités expérimentales de 41 variants, avec une erreur moyenne absolue de 0,4~kcal/mol, et donne des prédictions pour 10 nouveaux variants. Le modèle PB/LIE a ensuite comparé à la méthode non-empirique de calcul d'énergie libre par simulations alchimiques, qui n'a pas de paramètre ajustable et qui prédit correctement l'affinité de 12 complexes Tiam1:peptide. Ces outils et les résultats obtenus devraient nous permettre d'identifier des peptides inhibiteurs et auront d'importantes retombées pour l'ingénierie des interactions PDZ:peptide
Small protein domains often direct protein-protein interactions and regulate eukaryotic signalling pathways. PDZ domains are among the most widespread and best-studied. They specifically recognize the 4-10 C-terminal amino acids of target proteins. Tiam1 is a Rac GTP exchange factor that helps control cellmigration and proliferation and whose PDZ domain binds the proteins syndecan-1 (Sdc1), Caspr4, and Neurexin. Short peptides and peptidomimetics can potentially inhibit or modulate its action and act as bioreagents or therapeutics. We used computational protein design (CPD) and molecular dynamics (MD) free energy simulations to understand and engineer its peptide specificity. CPD uses a structural model and an energy function to explore the space of sequences and structures and identify stable and functional protein or peptide variants. We used our in-house Proteus CPD package to completely redesign the Tiam1 PDZ domain. The designed sequences were similar to natural PDZ domains, with similarity and fold recognition scores comarable to the widely-used Rosetta CPD package. Selected sequences, containing around 60 mutated positions out of 90, were tested by microsecond MD simulations and biophysical experiments. Four of five sequences tested experimentally (by our collaborators) displayed reversible unfolding around 50°C. Proteus also accurately scored the binding specificity of several protein and peptide variants. As a more refined model for specificity, we parameterized a semi-empirical free energy model of the Poisson-Boltzmann Linear Interaction Energy or PB/LIE form, which scores conformations extracted from explicit solvent MD simulations of PDZ:peptide complexes. With three adjustable parameters, the model accurately reproduced the experimental binding affinities of 41 variants, with a mean unsigned error of just 0.4 kcal/mol, andgave predictions for 10 new variants. The PB/LIE model was tested further by comparing to non-empirical, alchemical, MD free energy simulations, which have no adjustable parameters and were found to give chemical accuracy for 12 Tiam1:peptide complexes. The tools and insights obtained should help discover new tight binding peptides or peptidomimetics and have broad implications for engineering PDZ:peptide interactions

Le « Computational protein design » ou CPD est la recherche des séquences d’acides aminés compatibles avec une structure protéique ciblée. L’objectif est de concevoir une fonction nouvelle et/ou d’ajouter un nouveau comportement. Le CPD est en développement dans de notre laboratoire depuis plusieurs années, avec le logiciel Proteus qui a plusieurs succès à son actif.Notre approche utilise un modèle énergétique basé sur la physique et s’appuie sur la différence d’énergie entre l’état plié et l’état déplié de la protéine. Au cours de cette thèse, nous avons enrichi Proteus sur plusieurs points, avec notamment l’ajout d’une méthode d’exploration Monte Carlo avec échange de répliques ou REMC. Nous avons comparé trois méthodes stochastiques pour l’exploration de l’espace de la séquence : le REMC, le Monte Carlo simple et une heuristique conçue pour le CPD, le «Multistart Steepest Descent » ou MSD. Ces comparaisons portent sur neuf protéines de trois familles de structures : SH2, SH3 et PDZ. En utilisant les techniques d’exploration ci-dessus, nous avons été en mesure d’identifier la conformation du minimum global d’énergie ou GMEC pour presque tous les tests dans lesquels jusqu’à 10 positions de la chaîne polypeptidique étaient libres de muter (les autres conservant leurs types natifs). Pour les tests avec 20 positions libres de muter, le GMEC a été identifié dans 2/3 des cas. Globalement, le REMC et le MSD donnent de très bonnes séquences en termes d’énergie, souvent identiques ou très proches du GMEC. Le MSD a obtenu les meilleurs résultats sur les tests à 30 positions mutables. Le REMC avec huit répliques et des paramètres optimisés a donné le plus souvent le meilleur résultat lorsque toutes les positions peuvent muter. De plus, comparé à une énumération exacte des séquences de faible énergie, le REMC fournit un échantillon de séquences de grande diversité.Dans la seconde partie de ce travail, nous avons testé notre modèle pour la conception de domaines PDZ. Pour l’état plié,nous avons utilisé deux variantes d’un modèle de solvant GB. La première utilise une frontière diélectrique protéine/solvant effective moyenne ; la seconde, plus rigoureuse, utilise une frontière exacte qui fluctue le long de la trajectoire MC. Pour caractériser l’état déplié, nous utilisons un ensemble de potentiels chimiques d’acide aminé ou énergies de références. Ces énergies de références sont déterminées par maximisation d’une fonction de vraisemblance afin de reproduire les fréquences d’acides aminés des domaines PDZ naturels. Les séquences conçues par Proteus ont été comparées aux séquences naturelles. Nos séquences sont globalement similaires aux séquences Pfam, au sens des scoresBLOSUM40, avec des scores particulièrement élevés pour les résidus au cœur de la protéine. La variante de GB la plus rigoureuse donne toujours des séquences similaires à des homologues naturels modérément éloignés et l’outil de reconnaissance de plis Super family appliqué à ces séquences donne une reconnaissance parfaite. Nos séquences ont également été comparées à celles du logiciel Rosetta. La qualité, selon les mêmes critères que précédemment, est très comparable, mais les séquences Rosetta présentent moins de mutations que les séquences Proteus
Computational Protein Design, or CPD is the search for the amino acid sequences compatible with a targeted protein structure. The goal is to design a new function and/or add a new behavior. CPD has been developed in our laboratory for several years, with the software Proteus which has several successes to its credit. Our approach uses a physics-based energy model, and relies on the energy difference between the folded and unfolded states of the protein. During this thesis, we enriched Proteus on several points, including the addition of a Monte Carlo exploration method with Replica Exchange or REMC. We compared extensively three stochastic methods for the exploration of sequence space: REMC, plain Monte Carlo and a heuristic designed for CPD: Multistart Steepest Descent or MSD.These comparisons concerned nine proteins from three structural families: SH2, SH3 and PDZ. Using the exploration techniques above, we were able to identify the Global Minimum EnergyConformation, or GMEC for nearly all the test cases where up to10 positions of the polypeptide chain were free to mutate (the others retaining their native types). For the tests where 20positions were free to mutate, the GMEC was identified in 2/3 of the cases. Overall, REMC and MSD give very good sequences in terms of energy, often identical or very close to the GMEC. MSDperformed best in the tests with 30 mutating positions. REMCwith eight replicas and optimized parameters often gave the best result when all positions could mutate. Moreover, compared to an exact enumeration of the low energy sequences, REMC provided a sample of sequences with a high sequence diversity.In the second part of this work, we tested our CPD model forPDZ domain design. For the folded state, we used two variants ofa GB solvent model. The first used a mean, effective protein/solvent dielectric boundary; the second one, more rigorous, used an exact boundary that flucutated over the MCtrajectory. To characterize the unfolded state, we used a set of amino acid chemical potentials or reference energies. These reference energies were determined by maximizing a likelihoodfunction so as to reproduce the amino acid frequencies in naturalPDZ domains. The sequences designed by Proteus were compared to the natural sequences. Our sequences are globally similar to the Pfam sequences, in the sense of the BLOSUM40scores, with especially high scores for the residues in the core ofthe protein. The more rigorous GB variant always gives sequences similar to moderately distant natural homologues and perfect recognition by the the Super family fold recognition tool.Our sequences were also compared to those produced by the Rosetta software. The quality, according to the same criteria as before, was very similar, but the Rosetta sequences exhibit fewer mutations than the Proteus sequences

Les protéines à domaine PDZ, en très grand nombre dans le génome humain, sont impliquées dans des interactions protéine-protéine. Elles participent ainsi à véhiculer des signaux à l'origine de différentes pathologies (cancer, douleur....). L'interruption de l'interaction entre la protéine à domaine PDZ, PSD-95, et le récepteur de la sérotonine, 5-HT2A, entraîne une réduction de l'hyperalgie chez le rat neuropathique. Le développement de molécules capables d'inhiber cette interaction pourrait donc conduire à une nouvelle classe d'antalgiques.Nous avons réalisé, au cours de ces travaux, la synthèse de trois générations de ligands, comportant un noyau indolique, capables d'interagir avec le site S0, site très conservé des protéines à domaines PDZ. Dans un premier temps, nous avons préparé 15 biligands possédant un noyau indolique polysubstitué lié, via un espaceur de longueur variable (2 à 6 atomes de carbone), à différents acides aminés, dans le but d'interagir avec le site S1, montrant beaucoup de diversité en fonction du domaine. Nous avons ensuite, après une étude de relation structure/activité, développé deux autres générations d'indoles polysubstitués présentant notamment des substituants hydrophobes en position 5.Nous avons montré, par RMN HSQC 1H/15N et chromatographie d'affinité, que deux de ces composés sont des inhibiteurs de l'interaction PSD-95/5-HT2A et présentent de fortes interactions avec le site S0 de PSD-95. Ces molécules présentent également des propriétés antalgiques particulièrement intéressantes in vivo. Nous avons également déterminé, par RMN NOESY, la structure du complexe protéine/ligand pour ces deux composés. L'orientation d'une de ces molécules dans le site de la protéine nous permet d'envisager le développement d'une nouvelle génération d'indoles polysubstitués, pouvant interagir avec le site S1 de la protéine et permettant ainsi d'obtenir des inhibiteurs sélectifs de l'interaction PSD-95/5-HT2A.

L’infection par les papillomavirus humains de haut-risque est le facteur étiologique majeur du cancer cervical. L’oncoprotéine E6 des HPVs contribue à la cancérogenèse en partie par son activité de dégradation de la protéine p53, permettant l'inhibition de l'apoptose. Cette activité nécessite la formation d'un complexe entre les protéines E6, p53 et l'ubiquitine ligase E6AP. Ceci induit la polyubiquitination de p53 et sa dégradation par le protéasome 26S. Une autre activité de E6 correspond à sa capacité d’interagir avec certaines protéines à domaine PDZ. Cette interaction est liée à la présence d'un motif de liaison au domaine PDZ situé à l'extrémité C-ter de E6 des HPV muqueux de haut-risque. Les protéines à domaine PDZ sont impliquées dans divers processus cellulaires tels que le contrôle de la polarité, l’adhésion et la prolifération cellulaire. Cette thèse est centrée sur: 1/l’analyse d’un mutant de l’oncoprotéine E6 agissant en dominant-négatif pour la dégradation de p53 dans les cellules HPV-positives. Le mutant E6 F47R forme un complexe avec p53 et E6AP inactif pour l’ubiquitination de p53. L'expression de ce mutant dans les cellules HeLa, bloque leur prolifération et induit leur sénescence prématurée dépendante de p53. 2/l'identification de déterminants structuraux de l'interaction entre HPV16 E6 et le domaine PDZ1 de MAGI-1: les résidus situés en amont du motif de liaison au domaine PDZ, interviennent dans l'interaction avec le domaine. La lysine K499 et la boucle BC du domaine sont impliquées dans l'interaction avec E6. L’approche utilisée peut s’appliquer aux PDZ ciblés par E6, permettant ainsi d'établir les règles structurales communes aux interactions E6/PDZ
Infection by high-risk human papillomaviruses is the main etiological factor of cervical cancer. HPV E6 oncoprotein contributes to carcinogenesis in part by its activity of p53 degradation, allowing the apoptosis inhibition. This activity needs the formation of a trimeric complex between E6, p53 and the E6AP ubiquitine ligase which induced polyubiquitination of p53 and its degradation by proteasome 26 S. Another activity of E6 is related to its ability to interact with some PDZ-containing proteins. This interaction is due to the presence of PDZ-binding motif located at the C-terminus extremity of high-risk mucosal HPV E6 protein. PDZ-containing proteins are involved in several cellular processes such the control of cell polarity, adhesion and proliferation. This thesis is focused on: (1) the study of an E6 mutant which is dominant-negatif for the degradation of p53 in HPV-positive cell line (HeLa). E6 F47R mutant has the ability to form a complex with p53 and E6AP. This trimeric complex is not able to induce p53 ubiquitination. The mutant expression in HeLa cells, induce their proliferation inhibition and p53-dependant prematured senescence. (2) identification of structural determinants of specificity interaction between HPV16 E6 and MAGI-1 PDZ1 domain : residus located upstream the PDZ-binding motif are involved in the interaction with PDZ domain. Lysine K499 and BC loop of PDZ domain are implicated in the interaction with E6 protein. By applying the same approach to others PDZ domain which are targeted by E6, it will be possible to unravel common structural rules of E6/PDZ interaction

Le système de sécrétion de type II (T2SS) assure le transport de protéines sous une forme repliée du périplasme dans le milieu extracellulaire. Ce système est largement exploité par les bactéries à Gram négatif pathogènes des plantes, des animaux et de l'homme où il permet la sécrétion de facteurs de virulence (des toxines et des enzymes lytiques). La bactérie phytopathogène Dickeya dadantii utilise le T2SS appelé Out, pour sécréter une douzaine de pectinases qui dégradent les parois des cellules végétales. Les protéines sécrétées par le T2SS n'ont pas de motif de sécrétion apparent et leur sécrétion implique plusieurs interactions transitoires avec les composants du système. La nature moléculaire de ces interactions n'est pas connue. Afin de capter ces interactions transitoires lors du processus de sécrétion, j'ai utilisé le pontage dirigé in vivo. Cette technique repose sur l'incorporation d'un analogue photoréactif d'un acide aminé (le para-benzoyl Lphénylalanine, pBpa) à la place des résidus soupçonnés de faire partie d'un site d'interaction. Le pontage est ensuite activé par une courte exposition des cellules aux UV ce qui permet la formation des complexes protéiques. Tout d'abord, cette technique a été utilisée pour introduire le pBpa dans plusieurs régions exposées à la surface d'une exoprotéine, PelI. Cette stratégie a permis de mettre en évidence qu'un élément structural, la boucle 3 du domaine Fn3 de PelI, est impliquée dans l'interaction avec la sécrétine OutD, le composant du T2SS situé dans la membrane externe, et avec le domaine PDZ d'OutC, un composant de la membrane interne. Ces résultats suggèrent que la boucle 3 fait partie d'un motif de sécrétion. Deux autres régions ont été identifiées au sein de PelI : le linker entre les deux domaines de PelI qui est impliqué dans l'interaction avec OutD et une région exposée du domaine catalytique qui interagit avec la protéine OutC. La même approche a été utilisée pour introduire le pBpa dans les deux composants du T2SS, OutC et OutD. Ces expériences ont suggéré que le domaine PDZ d'OutC interagit avec une autre exoprotéine, PelB. Cette étude, de façon complémentaire à d'autres approches, nous a permis de démontrer certains détails moléculaires essentiels de la sécrétion par le T2SS
The type II secretion system (T2SS) transports folded proteins from the periplasm through the outer membrane into the milieu. In many pathogenic Gram-negative bacteria, the T2SS secretes various virulence factors in host tissue and is directly involved in pathogenesis. The phytopathogen Dickeya dadantii secretes a dozen of pectinases through a T2SS named Out. The secreted proteins are lacking an obvious common signal and secretion is thought to involve multiple transient interactions of folded exoproteins with several T2SS components. Molecular nature of these interactions remains unknown. To address this question we used an in vivo sitespecific photo-crosslinking approach to capture such transient interactions within the functional T2SS of D. dadantii. In this technique, the photo-crosslinker para-benzoyl-L-phenylalanine, pBpa, is introduced in vivo in place of a residue of interest and UV-irradiation of living cells provokes the formation of complexes between the protein of interest and its partners. First, in a systematic approach, pBpa was introduced at several surface-exposed sites of the secreted protein PelI. This strategy permitted us to identify that one structural element, loop 3 of Fn3 domain in PelI, interacts both with the secretin, the outer membrane T2SS component, and with the PDZ domain of OutC, an inner membrane T2SS component. These results suggest that this loop 3 is a part of the secretion motif. The same approach permitted us to identify two other regions of PelI interacting with the T2SS: a linker situated between the two domains of PelI, which interacts with OutD, and an exposed region of the catalytic domain of PelI interacting with OutC. In another approach, pBpa was introduced into the T2SS components, OutC and OutD. These experiments suggested that the PDZ domain of OutC interacts with the secreted protein PelB. This study, in complement with other approaches, allowed us to uncover some important molecular features of the protein secretion by the T2SS

Les virus du papillome humain infectent certaines cellules épithéliales et causent des lésions, allant de la simple verrue jusqu’au cancer. Deux oncoprotéines virales, E6 et E7, participent en synergie à de nombreux processus cellulaires, pouvant conduire à l’immortalisation, voire la transformation. Les fonctions les plus citées sont la dégradation de l’anti-oncogène p53 par E6 et de la protéine pRb par E7. E6 est impliquée majoritairement dans la phase tardive de progression maligne vers un cancer. Ceci corrèle avec son activité de dégradation de protéines contenant des domaines PDZ. Ces protéines à PDZ sont localisées aux jonctions cellulaires et forment des complexes de jonctions membranaires et de signalisation. La dérégulation de ces protéines induit souvent des phénotypes invasifs. Mon doctorat s’est articulé autour de l’étude de l’interaction entre la protéine à PDZ MAGI-1 et E6. J’ai produit et purifié le domaine PDZ1 de MAGI-1 et le domaine C-terminal de E6. Ensuite, j’ai mis au point deux techniques de mesure d’interactions protéine-protéine par Biacore ou par rétention différentielle sur chromatographie d’affinité, permettant de mesurer l’affinité du complexe. Enfin, j’ai étudié le complexe par RMN. Le calcul de structure de MAGI-1 PDZ1 lié à un peptide C-terminal de E6 sera achevé prochainement. L’analyse détaillée permettra de comprendre le mécanisme d’interaction et le design rationnel de molécules inhibitrices. Les techniques de mesure d’interaction mises au point permettront de cribler à moyen, voire haut débit, des molécules inhibant l’oncoprotéine E6 ou le PDZ avec l’objectif d’identifier de nouvelles molécules thérapeutiques
Human papilloma viruses infect distinct epithelial cells and cause lesions, which lead simple warts towards cancer. Two viral oncoproteins, E6 and E7, take part in a synergistical way in several cellular parthways, which can lead to immortalisation or transformation. The most cited functions are the degradation of the anti-oncogene p53 by E6 and of the protein pRb by E7. E6 is mainly implicated in the late stages of malign progression towards cancer. This correlates with its ability to degrade PDZ domain containing proteins. These proteins are located at cell-cell junctions and act as scaffolding molecules for building junction and signalisation complexes. Degradation of these proteins often induces invasive cell phenotypes. During my Ph. D. I studied the interaction between PDZ domain containing protein MAGI-1 and the C-terminal domain of E6. I produced the PDZ1 domain of MAGI-1 and the C-terminal domain of E6. Then I set up two methods for measuring protein-protein interactions by Biacore and by comparative chromatographic retention, which allowed to determine the affinity of the interaction. Finally I studied the complex by NMR. The structure calculations of the MAGI-1 PDZ1 bound to a C-terminal E6 peptide is near to completion. The detailed analysis will allow to understand the binding mechanism and the rational design of inhibitors. The interaction measurement techniques will allow to screen inhibitors directed against E6 or PDZ domains at a medium or high throughput for the aim of identifying new therapeutical molecules

Actuellement, les douleurs neuropathiques sont très difficiles à soulager et leur prise en charge thérapeutique est largement insatisfaisante en raison de leur résistance aux antalgiques classiques (paracétamol, anti-inflammatoires non stéroïdiens, opioïdes) et du manque d'efficacité des traitements actuels de référence (antidépresseurs et antiépileptiques). Aujourd'hui, les patients ont le choix entre deux stratégies thérapeutiques mais aucune des deux n'est satisfaisante : l'une soulage la douleur mais est associée à des effets indésirables importants, l'autre repose sur des molécules mieux tolérées mais avec une efficacité réduite. Il est donc urgent de proposer de nouvelles solutions thérapeutiques pour la prise en charge de ce type de douleurs. Mon projet de thèse propose une approche innovante pour soulager la douleur neuropathique et ses comorbidités qui ont un impact sur la mobilité et l'autonomie des patients. Cette dernière repose sur l'inhibition d'une interaction majeure entre des protéines impliquées dans la transmission de la douleur, en utilisant de nouveaux composés chimiques « first-in-class ». Les travaux antérieurs indiquent que des ligands capables d'interagir avec les protéines contenant des domaines PDZ, comme la protéine PSD-95, pour inhiber leur interaction avec les récepteurs sérotoninergiques 5-HT2A, pourraient constituer une alternative prometteuse. En effet, ces travaux ont montré que l'interaction entre la protéine PSD-95 et le récepteur 5-HT2A est responsable de la résistance à la sérotonine observée dans les douleurs neuropathiques. Une molécule indolique, capable d'inhiber cette interaction et produisant ainsi un effet antalgique, a été développée lors de ces travaux. Ce projet vise à développer une nouvelle approche pour traiter les douleurs neuropathiques en ciblant l'interaction entre le récepteur 5-HT2A et la protéine PSD-95 à l'aide de d'hétérocycles aromatiques azotés originaux. L'objectif est de développer et optimiser des voies d'accès à ces molécules, de démontrer leur capacité à se lier à la protéine PSD-95 et à inhiber son interaction avec le récepteur 5-HT2A in vitro et enfin à présenter un effet antalgique in vivo dans un modèle expérimental de douleur neuropathique
At present, neuropathic pain is arduous to relieve and its therapeutic management is largely unsatisfactory due to its resistance to conventional analgesics (paracetamol, non-steroidal anti-inflammatory drugs, opioids) and the lack of efficacy of current standard treatments (antidepressants and antiepileptics). Today, patients have a choice of two therapeutic strategies, neither of which is satisfactory: one relieves pain but is associated with significant adverse effects, while the other relies on molecules that are better tolerated but less effective. It is therefore urgent to propose therapeutic alternatives for the management of this type of pain.My thesis project proposes an innovative approach to alleviating neuropathic pain and its comorbidities, which have an impact on patient's mobility and autonomy. This approach is based on the inhibition of a major interaction between proteins involved in pain transmission, using new 'first-in-class' chemical compounds. Previous work indicates that ligands capable of interacting with proteins containing PDZ domains, such as the PSD-95 protein, to inhibit their interaction with serotonin 5-HT2A receptors, could be a promising alternative. This work has shown that the interaction between the PSD-95 protein and the 5-HT2A receptor is responsible for the serotonin resistance observed in neuropathic pain. An indole molecule capable of inhibiting this interaction and thus producing an analgesic effect was developed in the course of this work. The aim of this project is to develop a new approach to treating neuropathic pain by targeting the interaction between the 5-HT2A receptor and the PSD-95 protein using innovative aromatic nitrogen heterocycles. The aim is to develop and optimise routes of access to these molecules, to demonstrate their ability to bind to the PSD-95 protein and inhibit its interaction with the 5-HT2A receptor in vitro, and finally to exhibit an analgesic effect in vivo in an experimental model of neuropathic pain

Ce travail a porté sur les domaines PDZ, une famille de domaines globulaires reconnaissant des motifs de liaison aux PDZ (appelés PBM, pour ‘PDZ-Binding Motifs’) généralement situés à l'extrémité C-terminale de leurs protéines partenaires. Les réseaux domaines-motifs sont souvent modulés par des modifications post-traductionnelles réversibles (PTM). Nous avons utilisé des PBM synthétiques simulant différentes conditions: motifs sauvages de diverses longueurs, acétylés, phosphorylés ou portant des mutations ‘imitant’ les PTM. Ces peptides ont été utilisés pour des études d'interaction à l'aide du test ‘Hold-Up’, un test développé à l'origine dans notre laboratoire. Nous avons évalué l'impact de diverses modifications des complexes PBM/PDZ, qui conduisent à un changement global de leur capacité de liaison du PDZ. Ces résultats fournissent des informations quantitatives sur l'effet biologique que de telles modifications pourraient avoir dans le contexte des protéines entières
This thesis focuses on PDZ domains, a family of globular domains that bind to conserved PDZ-Binding Motifs (called henceforth PBMs) generally situated at the extreme C-terminus of their partner proteins. Domain-motif networks are often modulated by reversible post-translational modifications (PTMs). We used synthetized PBMs to reproduce different conditions, such as a wild-type, acetylation or phosphorylation, addition of extra exosites or residue mimication of PTM in the literature. These peptides were used for interaction studies using the holdup assay, an assay originally developed in our laboratory. We evaluated the impact of diverse modifications of the PBM/PDZ interactions, which led to a global change of the PDZ-binding capability. These results provided quantitative information on the biological effects that such modifications may have in the context of full-length proteins

Il existe de nombreux mécanismes impliqués dans le développement des tissus qui nécessitent que des cellules ou des groupes de cellules s’orientent et se polarisent. Les protéines de la voie de la polarité planaire (PP) s’associent pour former des complexes à la membrane et créer des asymétries proximo-distale. Vangl2 et Scrib1 ont été identifiés comme les deux premiers gènes impliqués dans la PP chez les mammifères. Lors de ma thèse, je me suis intéressé à ces deux protéines et à certains des complexes dans lesquelles elles sont impliquées. Dans un premier temps, nous avons montré l’implication directe de Scribble1 dans le trafic après endocytose des récepteurs NMDA. Scrib1 interagit avec les récepteurs NMDA grâce à ses domaines PDZ. Scribble1 peut interagir avec le complexe AP2 qui intervient dans l’endocytose des récepteurs. Cette étude a permis de définir un nouveau mécanisme dans lequel Scrib1 régule la quantité de récepteurs NMDA à la membrane et donc participe à la plasticité synaptique. Vangl2 est l’une des protéines transmembranaires les plus en amont de la voie de la PP. Nous avons identifié un nouveau partenaire nommé "Axin Interaction partner and Dorsalization Antagonist" (AIDA). Nous avons montré, par double hybride en levure et pull down, l’interaction de Vangl2 avec les deux isoformes de AIDA et leur colocalisation en COS7 et neurones. Ensemble, ces données présentent AIDA comme un très bon candidat pour le maintien de Vangl2 aux jonctions adhérentes et/ou pour son adressage à la membrane. Ces études nous ont permis d’améliorer notre compréhension des mécanismes impliquant les protéines de la polarité planaire
There are many mechanisms involved in the development of tissues that require cells or groups of cells orient and polarize. The proteins of the planar cell polarity (PCP) combine to form complexes with the membrane and create proximal-distal asymmetries. Vangl2 and Scrib1 have been identified as the first two genes involved in the PCP in mammals. In this study, I am interested in these two proteins and some of the complex in which they are involved. At first, using techniques of biochemistry, cell biology and biophysics, we showed the direct involvement of Scribble1 in traffic after endocytosis of NMDA receptors. Scrib1 interacts with NMDA receptors through its PDZ domains. Due to this binding motif between PDZ1 and PDZ2 of Scrib1, it can interact with the AP2 complex which is involved in receptor endocytosis. This study has identified a new mechanism in which Scrib1 regulates the amount of NMDA receptors on the membrane and is therefore involved in synaptic plasticity. Vangl2 is a transmembrane protein of the most upstream of the PCP pathway. We have identified a new partner named "Axin Interaction partner and Dorsalization Antagonist" (AIDA). We have shown, by yeast two-hybrid and pull down the interaction of Vangl2 with two isoforms of AIDA and collocation in COS7 and neurons. Together, these data show AIDA as a very good candidate for maintaining Vangl2 to adherens junctions and/or its membrane targeting. These studies have allowed us to improve our understanding of the mechanisms involving the planar polarity proteins