Dissertationen zum Thema „Protéine SMN“

L’amyotrophie spinale (SMA) est causée par une réduction du taux de la protéine de Survie des MotoNeurones (SMN). Cette protéine est associée aux protéines Gemin 2 à Gemin 8 et unrip pour former le complexe SMN. Bien que la protéine SMN soit présente dans tous les types cellulaires, la pathologie SMA est exclusivement liée à un défaut des motoneurones. Récemment, il a été proposé que SMN puisse avoir des fonctions spécifiques dans le transport des ARNm et dans la régulation de la traduction dans les neurones. La protéine FMRP, défective dans le syndrome de l’X fragile, joue également un rôle dans le transport de particules messagères (mRNP) et dans leur traduction. Dans cette étude, nous avons mis en évidence un lien entre le complexe SMN et la protéine FMRP dans les cellules neuronales suggérant un rôle du complexe SMN dans ces mécanismes. Les connaissances sur la composition, les interactions et les fonctions du complexe SMN ont bien avancées ces dernières années. L’idée actuelle est que le complexe SMN agirait comme un chaperon macromoléculaire des RNP en augmentant l'efficacité et la fidélité des interactions ARN-protéines et en fournissant l’opportunité à ces interactions d’être régulées. Le deuxième volet de cette étude a été d’analyser l’implication du complexe SMN dans l’assemblage de RNP différentes des UsnRNP. Le défaut spécifique des motoneurones nous a conduit à considérer le rôle du complexe SMN dans l’assemblage de RNP spécifiques à ce type cellulaire et notamment la RNP BC200. Finalement, nous nous sommes également intéressé à l’implication du complexe SMN dans l’assemblage et/ou la fonction de la particule SRP, une particule ubiquitaire
Spinal muscular atrophy (SMA) is caused by reduced levels of the survival of motor neuron (SMN) protein. SMN protein is associated with the proteins Gemin 2 to 8 and unrip to form the SMN complex. Although the SMN protein is present in all cell types, SMA is restricted to a defect in motor neuron. SMN was recently proposed to have specific functions in mRNA transport and translation regulation in neuronal processes. The defective protein in Fragile X mental retardation syndrome (FMRP) also plays a role in transport of mRNPs and in their translation. In this study, we showed a link between the SMN complex and FMRP in neuronal cells suggesting a role for the SMN complex in these processes. Knowledges of the composition, interactions and functions of the SMN complex have advanced greatly in recent years. The emerging picture is that the SMN complex acts as a macromolecular chaperone of RNPs to increase the efficiency and fidelity of RNA–protein interactions, and to provide an opportunity for these interactions to be regulated. The second part of this study was to analyse the involvement of the SMN complex in the biogenesis of RNP different of UsnRNP. The specific defect of motor neuron led us to analyse the role of the SMN complex in the biogenesis of specific RNP to this cell types in particular the RNP BC200. Finally, we are also interested to the SMN complex involvement in the assembly and/or the function of the SRP particle, an ubiquitous particle

LES MUTATIONS DU GENE QUI CODE POUR LA PROTEINE SMN SONT RESPONSABLES DES AMYOTROPHIES SPINALES INFANTILES (SMA). LA PROTEINE SMN ENTRE DANS LA FORMATION D'UN COMPLEXE UBIQUITAIRE QUI PARTICIPE A L'ASSEMBLAGE ET AU TRAFIC DES SNRNPS DU SPLICEOSOME. LOCALISEE ESSENTIELLEMENT DANS LE CYTOPLASME, ELLE S'ACCUMULE EGALEMENT DANS DES CORPS NUCLEAIRES APPELES GEMS/CAJAL BODIES (CBS), OU TRANSITENT LES SNRNPS AVANT DE SE REDISTRIBUER DANS LE NOYAU. IL EXISTE UNE CORRELATION ETROITE ENTRE LE NOMBRE DE CELLULES AVEC DES GEMS/CBS ET LA SEVERITE DE LA MALADIE. NOUS AVONS MONTRE UN DEFAUT D'ACCUMULATION DES SNRNPS AU NIVEAU DES GEMS/CBS DE FIBROBLASTES ISOLES DE PATIENTS, TOUTES FORMES CONFONDUES DE SMA. L'EXPRESSION TRANSITOIRE DE LA PROTEINE SMN SUFFIT A RESTAURER DANS CES CELLULES L'ACCUMULATION DES SNRNPS AUX GESM/CBS. D'AUTRE PART, L'OBSERVATION SELON LAQUELLE LA PROTEINE SMN EST PRESENTE DANS DES GEMS/CBS DEPOURVUS DE SNRNPS, NOUS A CONDUIT A FAIRE L'HYPOTHESE QU'ELLE SERAIT CAPABLE DE FORMER DES CORPS NUCLEAIRES. PAR UNE CARTE DE DELETION DE LA PROTEINE SMN, NOUS AVONS MIS EN EVIDENCE QUE LA LOCALISATION AUX GEMS/CBS ETAIT GOUVERNEE PAR UNE COOPERATION DU DOMAINE TUDOR AVEC CHACUN DES DEUX DOMAINES D'OLIGOMERISATION. DE PLUS, NOUS AVONS MONTRE QUE PLUSIEURS DOMAINES JOUAIENT UN ROLE DANS LA DISTRIBUTION NUCLEOCYTOPLASMIQUE DE LA PROTEINE. ENFIN, LA DELETION DE L'EXON 7 DU GENE SMN, MUTATION LA PLUS FREQUEMMENT RENCONTREE CHEZ LES PATIENTS ATTEINTS DE SMA, ENTRAINE LA PRODUCTION D'UNE PROTEINE SMNDeltaT QUI FORME IN VITRO UN COMPLEXE DONT LES PROPORTIONS ENTRE SMN ET GEMINE 2 SONT MODIFIEES. EN CONCLUSION, LA MALADIE POURRAIT RESULTER D'UNE COMPOSITION ANORMALE DU COMPLEXE SMN
SPINAL MUSCULAR ATROPHY (SMA) GENE PRODUCT SMN IS PART OF THE UBIQUITOUS SMN COMPLEX, WHICH IS INVOLVED IN SPLICEOSOMAL SNRNPS ASSEMBLY AND TRAFFICKING. MOSTLY LOCATED IN THE CYTOPLASM, THE SMN PROTEIN ACCUMULATES IN NUCLEAR GEMS/CAJAL BODIES (CBS), WHERE SNRNPS TRANSIT PRIOR THEIR LOCATION WITHIN THE NUCLEOPLASM. A CLOSE CORRELATION EXISTS BETWEEN THE REDUCED NUMBER OF CELLS WITH GEMS/CBS AND THE SEVERITY OF THE SMA DISEASE. WE SHOWED A DEFECTIVE SNRNPS ACCUMULATION IN GEMS/CBS FROM FIBROBLASTS DERIVED FROM ALL THREE TYPES OF SMA PATIENTS. TRANSIENT EXPRESSION OF SMN PROTEIN IN SMA CELLS WAS SUFFICIENT TO RESTORE THE SNRNPS ACCUMULATION IN GEMS/CBS. THE OBSERVATION THAT SMN PROTEIN WAS PRESENT IN GEMS/CBS DEPLETED OF SNRNPS SUGGESTED TO US THAT SMN COULD FORM NUCLEAR BODIES ON ITS OWN. USING SMN DOMAIN DELETION MUTANTS, WE SHOWED THAT THE TUDOR DOMAIN COOPERATES WITH EACH OF THE TWO OLIGOMERIZATION DOMAINS FOR PROTEIN LOCALISATION IN GEMS/CBS. MOREOVER, WE SHOWED THAT SEVERAL SMN DOMAINS PLAY A ROLE IN THE NUCLEOCYTOPLASMIC DISTRIBUTION OF THE PROTEIN. FINALLY, THE MOST FREQUENT DISEASE-LINKED MUTANT PROTEIN SMNdelta? FORMED IN VITRO A COMPLEX THAT INCORPORATES ALTERED PROPORTIONS OF SMN PROTEIN AND GEMIN2 COMPARED TO THE FULL-LENGTH SMN PROTEIN. IN CONCLUSION, THE SMA DISEASE COULD RESULT FROM AN ABNORMAL COMPOSITION OF THE SMN COMPLEXES

L’infection par le virus de l’herpès simplex de type 1 (HSV-1), un virus pathogène humain majeur, engendre la déstabilisation des centromères. Cette déstabilisation est induite par la protéine virale ICP0, et entraîne la dégradation par ICP0, via le protéasome, des protéines CENP-A, -B et CENP-C. Des résultats obtenus au laboratoire ont mis en évidence le phénomène iCDR (pour interphase Centromere Damage Response) qui implique la redistribution de la coïline, fibrillarine et SMN dans ces structures centromériques déstabilisées par ICP0 mais également par des drogues ou des siRNAs dirigés contre des constituants protéiques essentiels pour la stabilité des centromères. Il a été étudié leur interdépendance dans la réponse iCDR. Il a été ainsi démontré que la redistribution de SMN aux centromères déstabilisés est dépendante de : 1) la présence de la coïline aux centromères, et 2) de son interaction, via son domaine TUDOR, avec l’histone H3 méthylée sur la lysine K79 par l’enzyme Dot1L. L’équipe suggère donc l’hypothèse que ces protéines ont pour rôle de protéger l’ADN nu se trouvant aux centromères après dégradation des histones pour empêcher les cellules de rentrer en apoptose. Ces résultats ont mené à démontrer l’implication de certaines des protéines de l’iCDR et notamment la coïline, dans une réponse apoptotique générale suite à un stress UV. Ces protéines pourraient donc faire partie d’un mécanisme de contrôle qui serait défini comme un checkpoint centromérique
Infection by Herpes Simplex Virus type 1, a major pathogenic virus in human, has been shown to cause centromere destabilization. The infected cell protein 0 (ICP0) induces centromere destabilization and lead to proteasomal-dependent degradation of the proteins of the centromeres, CENP-A, -B and CENP-C. Recent data, obtained in our laboratory, highlights the interphase Centromere Damage Response (iCDR) phenomena. This phenomena involves centromeric accumulation and redistribution of the Cajal body-associated coilin and fibrillarin as well as the Survival Motor Neuron (SMN) proteins by ICP0 or by other drugs or siRNA targeting several constitutive centromere proteins known to play a major role in centromeres stabilization. Our data shows that SMN reditribution in the destabilized centromere is dependent of : 1) centromeric presence and accumulation of the coilin, 2) its interaction, via the TUDOR domain, with the methylated (Lys K79) histone H3. This methylation occurs in the presence of the Dot-1L enzyme. We hypothesize that these proteins play a critical role in safeguarding centromeric DNA to prevent the cells from apoptosis after Histone degradation. These observations, demonstrate the implication of certain iCDR proteins, more specifically the coilin, in the apoptotic response following a UV stress. In conclusion, these proteins could be part of a safeguard mechanism considered as a centromeric checkpoint

Les particules ribonucléoprotéiques (RNP) à boîtes C/D et H/ACA sont impliquées dans la maturation des UsnRNA et des précurseurs des ARNr. L'assemblage de ces RNP dans les cellules est un processus complexe faisant intervenir de nombreux facteurs cellulaires dont NUFIP, commun aux deux RNP, et NAF1, spécifique aux RNP à boîtes H/ACA. Le complexe de Survie des Motoneurones (SMN) est essentiel à la survie cellulaire et est nécessaire à l'assemblage d'une autre RNP, les UsnRNP, composants des spliceosomes. Un déficit en protéine SMN conduit à une pathologie grave, l'amyotrophie spinale. Plusieurs études suggèrent que le complexe SMN puisse également jouer un rôle dans l'assemblage des RNP à boîtes C/D et H/ACA. Dans le but d'obtenir de plus amples informations, nous avons testé si des interactions existent entre les constituants du complexe SMN et i) les protéines associées aux RNP matures, ainsi que ii) les autres facteurs d'assemblage déjà connus. Ainsi, par une approche de double hybride chez la levure, nous avons observé des interactions fortes entre NAF1 et les protéines Gemin3 et Gemin8 du complexe SMN. Comme la protéine coeur GAR1 des RNP à boîte H/ACA interagit avec la protéine SMN, ces données suggèrent que le complexe SMN participe à l'échange de NAF1 par GAR1, qui est une étape clé de la biogenèse des RNP à boîtes H/ACA. De plus, nous avons mis en évidence des interactions entre Gemin3/NUFIP, Gemin4/NUFIP et Gemin6/NUFIP. L'étude de cette dernière interaction a été approfondie. Nous avons montré que l'interaction est directe, qu'elle existe dans les cellules de mammifères à la fois dans le cytoplasme et le noyau, et nous avons défini les domaines de chaque protéine nécessaires à l'interaction, en collaboration avec l'équipe d'E. Bertrand (IGM Montpellier). Ces résultats ouvrent de larges perspectives quant à un lien fonctionnel entre le complexe SMN et NUFIP dans l'assemblage des RNP à boîtes C/D et H/ACA, mais aussi dans l'assemblage de la snRNP U4 et dans le mécanisme de traduction localisée dans les cellules
Box C/D and H/ACA ribonucleoparticles (RNPs) are required for UsnRNA and ribosomal RNA maturation. Their assembly in cells is a complex process, which implicates numerous cellular factors, such as NUFIP, a common assembly factor, and NAF1, which is a specific factor for H/ACA box RNP assembly. The Survival of Motoneurons (SMN) complex is essential for cell survival and is required for the assembly of another class of RNPs, the UsnRNPs, which are essential components of the splicing machinery. Decreased levels of the SMN protein lead to a severe disease, the spinal muscular atrophy. Several studies led to the proposal that the SMN complex also plays a role in the assembly of box C/D and H/ACA RNPs. In order to obtain more information, we analyzed whether some interactions may exist between components of the SMN complex and i) core proteins of mature RNPs, or ii) factors already known to be involved in the assembly. Using a yeast two-hybrid approach, we observed strong interactions between NAF1 and the SMN complex components, Gemin3 and Gemin8. Since the core H/ACA protein GAR1 interacts with the SMN protein, our data suggest that the SMN complex participates to the exchange of NAF1 by GAR1, which is a crucial step of H/ACA box RNP biogenesis. Furthermore, we discovered strong interactions between Gemin3/NUFIP, Gemin4/NUFIP and Gemin6/NUFIP. Concerning the Gemin6/NUFIP interaction, we showed that is direct, that it exists in both compartments in mammalian cells and we defined domains of both proteins necessary for the interaction in collaboration with the E. Bertrand team (IGM Montpellier). These results open new perspectives concerning functional links between the SMN complex and NUFIP in box H/ACA and C/D RNP assembly, but also in U4 snRNP assembly and in the mechanism of localized translation

Introduction :Les amyotrophies spinales infantiles ou SMA pour spinal muscular atrophy sont des maladies neuromusculaires à transmission autosomique récessive caractérisées par une dégénérescence des motoneurones. On distingue 3 formes (SMA de type I, II ou III) classées selon la gravité de la maladie. La forme SMA I est la plus grave. Le gène responsable de la maladie est le gène SMN pour survival motor neuron, muté chez plus de 98 % des patients. Les modèles animaux de cette maladie ne sont disponibles que depuis 2000, donc nous utilisons au laboratoire un modèle d'étude in vitro constitué de cocultures hétérologues nerf-muscle. Lorsque cette structure est réalisée avec des cellules musculaires provenant de patients SMA I ou II (mais non SMA III), elle dégénère au bout de 3 semaines, alors qu'elle se maintient plus d'un an si les cellules satellites sont saines. Hypothèse : Ces observations nous ont amenés à émettre l'hypothèse d'une implication musculaire dans la pathogénie de la maladie. La dégénérescence étant due à une mutation du gène SMN, nous avons envisagé d'introduire la forme normale du gène dans des cellules malades et de suivre le comportement des cocultures suite à un tel traitement. Outils utilisés : La première étape a consisté à construire le plasmide pEGFP-C3/SMN porteur du gène SMN, cloné dans un système d'expression eucaryote Nous avons ensuite comparé différents vecteurs synthétiques de transfection afin de trouver le plus efficace mais le moins toxique pour des cellules musculaires humaines primaires. Celles-ci une fois transfectées au moyen de cet agent ont été sélectionnés au moyen du G418, puis après fusion, les myotubes résultant ont été innervés afin d'observer le comportement des cocultures. Résultats :Le plasmide pEGFP-C3/SMN a été validé par microscopie de fluorescence et confocale. Il a été utilisé pour transfecter les myoblastes humains primaires grâce au FuGENE, l'agent qui s'est révélé être le plus efficace et le moins toxique par rapport à l'Effectene et à l'ExGen 500. Après sélection des cellules transfectées, fusion et innervation, les cocultures réalisées à partir de cellules musculaires issues de patients SMA I transfectées par pEGFP-C3/SMN ne dégénèrent pas, et se comportent comme des cocultures témoins. Ce fait est confirmé par des dosages à l'annexine V des microparticules apoptotiques relarguées par les cocultures. Si le plasmide utilisé est le pEGFP-C3 seul, les cocultures se comportent comme des cocultures malades. Un autre aspect de ce sujet a consisté à étudier l'installation de la jonction neuromusculaire chez les cellules musculaires malades, et plus particulièrement les étapes les plus précoces de ce phénomène. En effet, nous avions observé un défaut dans la fusion des cellules musculaires ainsi que dans l'agrégation des récepteurs de l'acétylcholine chez les patients SMA I. Par des expériences de liaison spécifique, nous avons mis en évidence un déficit d'expression des récepteurs de l'acétylcholine plus de dix fois moindre dans les myotubes résultant de la fusion de cellules musculaires issues de SMA I par rapport aux myotubes témoin. Cette étude a été réalisée en l'absence de tout composant nerveux. Conclusion :Cette étude prouve d'abord que la SMA n'est pas uniquement une maladie du motoneurone, comme ce qui était admis depuis très longtemps, mais que le muscle joue un rôle très important dans la pathogénie. Et surtout, nous ouvrons la voie à de très nombreuses perspectives thérapeutiques à visée musculaire, ce tissu étant beaucoup plus accessible que le système nerveux
Spinal muscular atrophies are neuromuscular disorders with recessive autosomal transmission, characterized by a degeneration of the motoneurons. There are classified in three forms (SMA I, II or III) based on the severity of the symptoms. The SMA I form is the most severe one. The survival of motor neuron [SMN] is known to be responsible for the disease. It is mutated in 98 % of the patients. Animal models are available only since 2000, so we use in our laboratory a model of heterogenous nerve-muscle cocultures. When this structure is realized with muscle cells coming from SMA I or II patients (but not from SMA III), it degenerates after 3 weeks, whereas it can survive beyond one year when the muscle cells are from healthy origin. Based on these observations, we have emitted the hypothesis of a muscle implication in the SMA pathogenesis. The degeneration of the cocultures is due to a mutation in the SMN gene, so we considered the transfection of the normal form of the gene in SMA cells as a possible therapeutic strategy [. . . ]

L'amyotrophie spinale (SMA) est une maladie neuromusculaire principalement causée par des mutations du gène SMN1 (Survival of Motor Neuron 1). SMN1 est exprimé de manière ubiquitaire et contrôle l'assemblage de petites ribonucléoprotéines nucléaires (snRNP), essentielles à l'épissage du pré-ARNm. Ce qui rend certains MN plus sensibles à l'épuisement de SMN1 n'est pas encore entièrement compris. Nous explorons les origines moléculaires de la sensibilité distincte de différents neurones à la perte de SMN1 dans un modèle de C. elegans en utilisant trois approches :- Nous avons utilisé l'ARNi spécifique des neurones pour éliminer sélectivement l'homologue de SMN1, smn-1, dans les motoneurones ou dans les neurones récepteurs tactiles (TRN) dans les souches qui expriment des rapporteurs fluorescents dans les cellules souhaitées. Dans les deux types de neurones, nous avons observé que lorsque le smn-1 est silencieux, les neurones nés après l'embryon semblent moins robustes que dans les témoins, tandis que les neurones nés à l'embryon présentent une dégénérescence axonale qui précède la disparition neuronale. Les résultats suggèrent le rôle du SMN dans le développement et la maintenance neuronale.-Nous avons exprimé le SMN-1 fusionné à TurboID dans les MN et les TRN pour identifier les interactions protéiques différentielles potentielles impliquées dans le développement/la survie des neurones. Nous avons capturé certaines des interactions connues du SMN-1 dans les deux types de neurones ainsi que d'autres protéines connues pour participer au traitement de l'ARN. L'analyse des résultats de la spectrométrie de masse est toujours en cours.-Les neurones TRN et VD/DD ciblés ont été isolés pour générer des bibliothèques d'ADNc spécifiques aux cellules pour le séquençage du transcriptome à l'aide de Nanopore. Nous sommes en train de préparer suffisamment d'ADNc à partir de cellules isolées pour atteindre l'entrée nécessaire au séquençage Nanopore et d'identifier les changements transcriptomiques en aval après l'épuisement du SMN-1
Spinal muscular atrophy (SMA) is a neuromuscular disease mainly caused by mutations in the SMN1 gene (Survival of Motor Neuron 1). SMN1 is ubiquitously expressed and controls the assembly of small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs), essential for pre-mRNA splicing. What makes some MNs more sensitive to SMN1 depletion is still not fully understood. We are exploring the molecular origins of the distinct sensitivity of different neurons to loss of SMN1 in a C. elegans model using three approaches:-We used neuron-specific RNAi to selectively knock-down the SMN1 homolog, smn-1, in motor neurons or in touch receptor neurons (TRNs) in strains that express fluorescent reporters in the desired cells. In both neuron types, we observed that when smn-1 is silenced, neurons that are born post embryonically appear less robustly than in controls, while neurons which are born embryonically display axonal degeneration that precedes neuronal disappearance. The results suggest the role of SMN both in neural development, and maintenance.-We expressed SMN-1 fused to TurboID in MNs and TRNs to identify potential differential protein interactions involved in neuron development/survival We captured some of the known interactions of SMN-1 in both neuron types as well as other proteins knowns to participate in RNA processing. Analysis of the mass spectrometry results are still ongoing.-Targeted TRN and VD/DD neurons have been isolated to generate cell-specific cDNA libraries for transcriptome sequencing using Nanopore. We are in the process of preparing sufficient cDNAs from isolated cells to reach the needed input for Nanopore sequencing, and identifying downstream transcriptomic changes following SMN-1 depletion

Les particules ribonucléoprotéiques (RNP) sont impliquées dans divers mécanismes cellulaires : les UsnRNP, la SRP, les RNP à boîtes C/D et H/ACA dans la modification des ARN et la maturation des ARN ribosomiques, et la télomérase dans le maintien des extrémités chromosomiques. L'assemblage de ces RNP est un processus complexe faisant intervenir de nombreux facteurs, dont le complexe SMN. Un déficit de l’une des protéines de ce complexe conduit à l’amyotrophie spinale. Il est essentiel à la survie cellulaire et est nécessaire à l’assemblage des UsnRNP et de la SRP. Il est suggèré que le complexe SMN joue un rôle dans la biogenèse des RNP à boîtes C/D et H/ACA. Nous avons montré des interactions in vitro et des associations in cellulo entre le complexe SMN et la protéine NUFIP (un facteur d’assemblage de ces RNP). Ces résultats suggèrent l’existence d’un lien fonctionnel entre le complexe SMN et NUFIP dans l'assemblage des RNP à boîtes C/D et H/ACA et de la snRNP U4. Des interactions in vitro entre le complexe SMN et la protéine NAF1 (un facteur d’assemblage des RNP à boîtes H/ACA) ont révélés, que le complexe SMN est capable de s’associer avec la RNP à boîtes H/ACA en formation. Si le complexe SMN intervient dans l’assemblage des RNP, on peut supposer que cet assemblage soit défectueux dans la SMA. Nous avons montré que certains ARN sont accumulés dans la moelle épinière et le cerveau de souris SMA. La télomérase est réactivée dans les cellules cancéreuses. En collaboration avec l’équipe de J-M Vignaud (CHU central, Nancy), nous avons montré une augmentation du taux des protéines cœur des RNP à boîtes H/ACA et de NUFIP dans les cellules tumorales
Ribonucleoprotein particles (RNPs) are involved in various cellular mechanisms in eukaryotic cells: UsnRNP, SRP, C/D and H/ACA box RNPs in RNA modifications and rRNA maturation and telomerase in the synthesis of the chromosome extremities. RNP assembly is a very complex process, which involves numerous factors. One of these factors is the SMN complex. Decreased level of one of its components leads to spinal muscular atrophy. It is essential for cell survival and necessary for UsnRNP and SRP assembly. It is suggested that the SMN complex plays a role in C/D and H/ACA RNP biogenesis. We showed in vitro interactions and in cellulo associations between the SMN complex and the protein NUFIP (an assembly factor of these RNP). These results suggest the existence of a functional link between the SMN complex and NUFIP in the assembly of the C/D and H/ACA box RNPs and the U4 snRNP. In vitro interactions between the SMN complex and the protein NAF1 (an assembly factor of the H/ACA boxes RNPs) revealed, that the SMN complex is capable of joining with the H/ACA boxes RNPs in formation. If the SMN complex intervenes in the RNPs assembly, we can suppose that this assembly is defective in the SMA. We showed that any ARN is accumulated in the spinal cord and the brain of SMA mouse. The telomerase is reactivated in cancer cells. In association with the team of J-M Vignaud (CHU central, Nancy), we showed an increase of H/ACA box RNP proteins and NUFIP in these cancer cells

L’épissage est un mécanisme assuré par les snRNPs dont la biogénèse est un processus complexe. D’abord les snRNAs U1, U2, U4 et U5 sont transcrits dans le noyau par l’ARN polymérase II. Après que leur extrémité 5’ ait été mono-méthylée, ils sont ensuite exportés vers le cytoplasme où ils s’y associent avec les protéines SmB, D1, D2, D3, E, F et G. Cette association est requise pour permettre le recrutement de l’hyperméthylase Tgs1 responsable de la triméthylation de la coiffe 5’ m7G des snRNAs en méthyl-2,2,7-guanosine (m3G). Ceci génère un signal de localisation nucléaire bipartite, formée par le complexe des protéines Sm et la coiffe m3G, permettant l’importation nucléaire de la particule. D’autres étapes, comme la modification de résidus interne des snRNAs et l’addition de protéines spécifiques vient compléter l’assemblage de snRNPs fonctionnelles. Nous avons montré que les extensions C-terminale des protéines SmD1 et SmD3 de mammifères possèdent des propriétés de localisation nucléaires et formeraient avec l’extension C-ter de SmB une protubérance basique portant le NLS des protéines Sm. L’assemblage des protéines Sm sur les snRNAs est assuré par le complexe SMN. Un niveau réduit de protéine SMN fonctionnelle est corrélé à une pathologie autosomale récessive : l’amyotrophie spinale. Nous avons montré que la déplétion par RNAi de la protéine SMN induit une accumulation cytoplasmique de la protéine fusion GFP-SmB, ainsi qu’une dissociation des Cajal bodies. D’autre part Nous avons caractérisé deux isoformes de l’hyperméthylase Tgs1 responsable de la tri-méthylation de la coiffe des snRNAs: Une isoforme pleine longueur principalement cytoplasmique et une isoforme courte retrouvée dans le noyau, produite par clivage protéolytique ubiquitine/protéasome dépendant. Cette dernière interagit avec une protéine de cœur des snoRNPs, la fibrillarine, suggérant qu’elle ait un rôle dans leur maturation
Splicing is process involving snRNPs of which biogenesis is a complex pathway. In a first step, U1, U2, U4 and U5 snRNA are transcribed by the RNA pol II in the nucleus. Co-transcriptionnally, snRNAs are mono-methylated at their 5’ ends and then exported to cytoplasm where they are assembled with SmB, D1, D2, D3, E, F et G proteins. This assembly is required for the further tri-methylation of the 5’ cap in methyl-2,2,7-guanosine (m3G) by the Tgs1 hypermethylase. These events generate a bi-partite nuclear localization signal composed of the Sm core complex and the tri-methylated cap. This bi-partite NLS promotes the import back into the nucleus of the newly synthesized snRNP particle. Once in the nucleus the snRNP particle undergoes further maturation events like bases modifications, and specific proteins assembly. In our work, we showed that C-terminal tails of SmD1 and SmD3 proteins possess nuclear localisation properties. We proposed that the C-terminal tails of SmB, SmD1 and SmD3 could form a basic protuberance carrying the nuclear localisation determinant of the Sm core complex. Sm core protein assembly is controlled by the SMN complex. A reduced level of functional SMN has been shown to be responsible of an autosomal recessive disease called Spinal Muscular atrophy (SMA). In our work, by using siRNA approach we showed that SMN depletion induces GFP-SmB fusion protein accumulation in the cytoplasm and a Cajal bodies structure disassembly. In addition, we characterized two isoforms of the Tgs1 hypermethylase: a full length isoform found mainly in the cytoplasm and a short isoform localized in the nucleus, produced by proteolytic clivage in a ubiquitin/proteasome dependent manner. The short Tgs1 isoform interacts with the core snoRNPs protein fibrillarin, suggesting that it could be involved in their maturation

Les petites particules ribonucléoprotéiques nucléaires (snRNPs) sont les composants majeurs du splicéosome, la machinerie responsable de l'épissage des pré-messagers. La biogenèse des snRNPs est un processus complexe qui fait intervenir de nombreux facteurs comme les protéines SMN et ICln. Au cours de ma thèse, je me suis intéressé à l'étude du rôle de ces deux protéines dans la maturation et la production des snRNPs du splicéosome.Dans la première partie de mon travail, les modifications internes des snRNAs ont été caractérisées dans des cellules dont les corpuscules de Cajal sont dispersés à cause d'une déficience de la protéine SMN. En effet, en plus de son rôle dans les étapes précoces de formation des snRNPs, la protéine SMN est également requise pour la formation des corpuscules de Cajal, structures nucléaires qui concentrent les scaRNAs impliqués dans le processus de modification post-transcriptionnelle des ARNs. Nous avons pu ainsi montrer que la protéine SMN et les corps de Cajal ne sont pas essentiels à la production des résidus 2'-O-methyl et pseudouridine dans les snRNAs majeurs et mineurs.La deuxième partie de mon travail a porté sur l'étude des relations fonctionnelles entre les protéines ICln et SMN in vivo en utilisant l'organisme modèle S. pombe. Après avoir caractérisé un homologue de la protéine humaine dans la levure fissipare, nous avons montré que la protéine ICln n'est pas essentielle mais est importante pour une croissance optimale des cellules de levure. Notre étude montre aussi que la modulation de l'activité de la protéine ICln ne permet pas de compenser les défauts dans la production de snRNPs observés dans les cellules portant un allèle muté de SMN. Finalement, l'utilisation d'une approche génomique montre que la délétion du gène ICln entraine des défauts différentiels d'épissage, indiquant que le choix des sites et la cinétique d'épissage sont fortement dépendants de la concentration des composants de base du splicéosome
Small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs) are the major components of the spliceosome, the machinery responsible for the splicing of pre-messenger RNAs. The biogenesis of snRNPs is a complex process that involves many factors such as the SMN and ICln proteins. During my thesis, I studied the role of these two proteins in the maturation and the production of the spliceosome snRNPs.The goal of the first part of my work was to characterize the internal modifications of snRNAs in SMN-deficient cells carrying disrupted Cajal bodies. Indeed, in addition to its role in the early stages of snRNPs assembly, the SMN protein is also required for the formation of Cajal bodies which are nuclear structures carrying the scaRNAs involved in the post-transcriptional modification process of RNAs. We could show that the SMN protein and Cajal bodies are not essential for the formation of 2'-O-methyl and pseudouridine residues in the major and minor snRNAs.In the second part of my work, the functional relationships between the ICln and SMN proteins were examined in vivo using the S. pombe model organism. We first identified a fission yeast homologue of the human ICln protein and found that the ICln protein is not essential but important for optimal growth of yeast cells. Our study also showed that the modulation of the activity of the ICln protein does not compensate for defects in the production of snRNPs observed in yeast cells carrying a SMN mutated allele. Finally, the use of a genome-wide approach allowed us to show that deletion of the ICln gene resulted in differential splicing defects, indicating that the choice of splice sites and the kinetics of splicing are strongly dependent on the concentration of the basic components of the spliceosome

Chez S. Pombe, sortie de mitose et cytokinèse sont coordonnées par la voie de signalisation SIN (Septation Initiation Network) dont les éléments centraux possèdent des orthologues chez A. Thaliana. Durant cette thèse, j’ai réalisé une analyse fonctionnelle des protéines G AtSGP1/2, orthologues de spg1p. La modification de l’expression des protéines AtSGPs (mutant, RNAi, surexpresseur) affecte la fertilité. Des fusions AtSGP-GFP ont été construites pour analyser la localisation intracellulaire. Nous avons observé une localisation des protéines G selon un réseau ponctué cytoplasmique, aussi bien dans les cellules de tabac BY-2 que dans les cellules de l'épiderme racinaire. Des approches pharmacologiques et cytologiques ont été effectuées pour préciser la nature du marquage. Les protéines AtSGP1 et AtSGP2 possèdent une extension amino-terminale spécifique des plantes. Fusionnée à la GFP, cette extension permet la même localisation que celle obtenue avec la protéine entière. Le profil d’expression d'AtSGP1 et AtSGP2 a été déterminé au cours du développement. Nos résultats révèlent que les promoteurs AtSGPs sont activés, pour AtSGP1, dans les cellules du centre quiescent et les cellules de garde des stomates, et pour AtSGP2, dans les atrichoblastes, les trichomes et les grains de pollen. Ces différents types de cellules différenciées possèdent des caractéristiques communes. En effet, leur mise en place provient soit d’une division asymétrique, soit d’un signal positionnel. Les protéines AtSGPs ne fonctionnent pas, comme spg1p, pour coordonner sortie de mitose et cytokinèse. Elles joueraient plutôt un rôle dans l’acquisition et/ou le maintien de la spécification cellulaire
The SIN (Septation Initiation Network) signalling pathway, from S. Pombe, ensures the proper coupling of mitotic exit to cytokinesis. In A. Thaliana, we previously identified and characterized signalling elements orthologues of the core SIN pathway elements. In the present work, the function of the monomeric G-proteins AtSGP1 and AtSGP2 was investigated. To achieve this goal, A. Thaliana plants in which AtSGP1 and AtSGP2 genes have been either disrupted, silenced or overexpressed, were generated and characterised. We found that variation in AtSGP gene expression decreased fertility. AtSGPs-GFP fusions were constructed to analyse the subcellular localization. We observed a punctuated fluorescent network in the cytoplasm both in BY-2 cells and root epidermal cells. Both pharmalogical and cytological approaches were used to characterise this network. The amino-terminal part of the AtSGPs, which is plant specific, was also fused to the GFP. The same subcellular localization was observed. AtSGP1 and AtSGP2 gene expression pattern was studied during plant development. Our data provide evidence that AtSGPs promoters are activated in specialized cell types: in the quiescent centre and stomata guard cells for AtSGP1, in atrichoblasts, trichomes and pollen grains for AtSGP2. These various cell types shared common features. AtSGPs expression is restricted either to cell types derived from an asymmetric cell division or to cells patterned through positional signalling. Our data demonstrate that the AtSGP proteins do not participate in the coupling of mitotic exit to cytokinesis, but rather are involved in cell type specification

Les protéines de type SMC (pour « Structural Maintenance of Chromosomes ») sont impliquées dans différents aspects de la dynamique du chromosome tels que la condensation, la ségrégation et la réparation de l’ADN. En effet, une souche de Bacillus subtilis dépourvue de SMC présente des phénotypes sévères tels qu’un défaut dans la compaction et le partitionnement du chromosome, une sensibilité accrue à certaines drogues endommageant l’ADN ainsi qu’à des inhibiteurs de gyrase. Une telle souche est incapable de croître en condition de croissance rapide. Pour comprendre l’étendue des phénotypes associés à la perte de ce gène, une identification génétique de nouveaux partenaires a été entreprise : des suppresseurs spontanés de la délétion de smc ont été isolés en condition de croissance rapide. Différentes classes de suppresseurs ont été mises en évidence, suggérant que différentes mutations pouvaient restaurer la viabilité d’une souche dépourvue de SMC. Leur caractérisation a révélé qu'ils permettaient de restaurer une partie des défauts que présente le mutant Δsmc, en particulier la résistance aux inhibiteurs de gyrase, et semblaient limiter la formation de cassures de l'ADN. Par séquençage du génome complet des suppresseurs, certaines de ces mutations ont pu être identifiées, et semblent causer une perturbation de la voie de biosynthèse des ARN de transfert. Cette perturbation permet de restaurer le défaut de croissance, et ce plus efficacement qu’une inhibition de la traduction par des drogues comme le chloramphénicol, ou par la réduction du pool de nucléotides par l’hydroxyurée. L’ensemble de ces résultats suggère que la réponse stringente pourrait être en partie responsable du phénotype suppresseur. Il est proposé qu’en dehors de la compaction du chromosome, le complexe SMC soit directement impliqué dans le maintien de l’intégrité des fourches de réplication
SMC proteins (for "Structural Maintenance of Chromosomes") are involved in different aspects of chromosome dynamic such as condensation, segregation and DNA repair. Indeed, a Bacillus subtilis mutant lacking the SMC complex shows severe phenotypes such as defects in condensation and chromosome partitioning, an increase in sensitivity DNA damaging drugs or gyrase inhibitors. The viability of such strain is limited to conditions of slow growth. To understand the range of phenotypes associated with loss of this gene, a genetic identification of new partners was undertaken: spontaneous suppressors of smc deletion were isolated in rapid growth conditions. Different classes of suppressors have been identified, suggesting that different mutations could restore the viability of a strain lacking SMC complex. Characterization of suppressors revealed they can restore some of the defects shown in Δsmc mutant, particularly resistance to gyrase inhibitors, and seemed to limit the formation of DNA breaks. By sequencing the complete genome of suppressors, some of these mutations have been identified and cause an alteration of the biosynthetic pathway of transfer RNA. This disruption can restore the growth defect more efficiently than inhibition of translation by drugs such as chloramphenicol, or by reducing the pool of nucleotides by hydroxyurea. Taken together, these results suggest that the stringent response could be partly responsible for the suppressor phenotype. It is proposed that apart from the compaction of the chromosome, the SMC complex is directly involved in maintaining the integrity of replication forks

Recruitment of mural cells, i.e. pericytes and smooth muscle cells (SMC), is essential to improve the maturation of newly formed vessels. One of the major factors involved in this process is the endothelial cell-secreted Platelet-Derived Growth Factor BB (PDGF BB). Sonic hedgehog (Shh) has also been suggested to promote the formation of larger and more muscularized vessels, but the underlying mechanisms involved have not yet been elucidated. We first identified Shh as a target of PDGF BB and found that SMC respond to Shh not only by upregulating the Gli1-dependent canonical pathway, but also by activating ERK1/2 and PI3K-dependent non-canonical pathways. Moreover, we found that PDGF BB-induced SMC migration, involves Shh-dependent PI3K, ERK1/2 and Gli1 activation. In the mouse model of corneal angiogenesis, PDGF BB and Shh were expressed by endothelial cells and mural cells of VEGF-induced newly formed blood vessels, respectively. PDGF BB inhibition reduced Shh expression, confirming that Shh is a target of PDGF BB, as demonstrated by in vitro experiments. Finally, we found that inhibition of either PDGF BB or Shh signaling reduced NG2+ mural cell recruitment into neovessels and subsequently reduced the neo-vessel lifespan. In this work, we demonstrate, for the first time, that Shh is a key mediator of PDGF BB-induced mural cell migration and recruitment into neo-vessels and elucidates the molecular signaling pathway involved in this process
Recruitment of mural cells, i.e. pericytes and smooth muscle cells (SMC), is essential to improve the maturation of newly formed vessels. One of the major factors involved in this process is the endothelial cell-secreted Platelet-Derived Growth Factor BB (PDGF BB). Sonic hedgehog (Shh) has also been suggested to promote the formation of larger and more muscularized vessels, but the underlying mechanisms involved have not yet been elucidated. We first identified Shh as a target of PDGF BB and found that SMC respond to Shh not only by upregulating the Gli1-dependent canonical pathway, but also by activating ERK1/2 and PI3K-dependent non-canonical pathways. Moreover, we found that PDGF BB-induced SMC migration, involves Shh-dependent PI3K, ERK1/2 and Gli1 activation. In the mouse model of corneal angiogenesis, PDGF BB and Shh were expressed by endothelial cells and mural cells of VEGF-induced newly formed blood vessels, respectively. PDGF BB inhibition reduced Shh expression, confirming that Shh is a target of PDGF BB, as demonstrated by in vitro experiments. Finally, we found that inhibition of either PDGF BB or Shh signaling reduced NG2+ mural cell recruitment into neovessels and subsequently reduced the neo-vessel lifespan. In this work, we demonstrate, for the first time, that Shh is a key mediator of PDGF BB-induced mural cell migration and recruitment into neo-vessels and elucidates the molecular signaling pathway involved in this process

Schistosoma mansoni est l'agent principal de la bilharziose chez l'homme. Dans le cadre de l'étude de la régulation de l'expression des gènes chez S. Mansoni, nous avons choisi d'analyser un gène qui code pour une enzyme essentielle pour la survie du parasite et qui est considérée comme un candidat vaccinal contre cette parasitose la glutathion S-transférase. L'analyse de l'expression tissulaire de cette enzyme nous a montré qu'elle est exprimée dans tous les stades de vie du parasite et que cette expression est tissu-spécifique. L'analyse de la région promotrice de ce gène nous a révélé l'existence de certaines séquences consensus d'ADN : HSE, AP-1, CCAAT. L'analyse de ces séquences par la technique du retard sur gel nous a montré la capacité de ces séquences à interagir avec les extraits nucléaires du parasite. A la base de ces données, nous avons développé une stratégie PCR qui nous a permis de cloner la sous unité NF-YA, du complexe de transcription NF-Y, chez S. Mansoni.

La membrane cellulaire est une partie vitale de la cellule dont l'architecture joue un rˆole crucial dans de nombreux processus cellulaires, comme la signalisation et le trafic, et dans diverses pathologies. Cette th'ese vise 'a sonder l'architecture membranaire via le mouvement de deux r'ecepteurs membranaires qui sont exploit'es par des toxines bact'eriennes. Les progr'es r'ecents des techniques de microscopie optique ont montr'e que certains r'ecepteurs membranaires ne diffusent pas librement dans la membrane, mais sont confin'es ou diffusent de fa¸con anomale. Actuellement, plusieurs mod'eles con- courent pour expliquer le confinement des r'ecepteurs, tel que le mod'e le Picket-Fence, les radeaux lipidiques et les agr'egats de prot'eines. Pour sonder la membrane, des nanoparticules (Y0.6Eu0.4VO4) dop'ees avec des lan- thanides sont coupl'ees 'a deux toxines peptidiques diff'erentes formant des pores dans la membrane, la toxine α de C. septicum et la toxine ǫ de C. perfingens. Le suivi de r'ecepteurs individuels sur lesquels sont fix'ees des toxines marqu'ees dans la mem- brane apicale de cellules MDCK avec un microscope 'a champ large permet de d'etecter le mouvement du r'ecepteur avec une r'esolution meilleure que la limite de diffrac- tion. Les r'ecepteurs de la toxine α et ǫ montrent une diffusion confin'ee avec des coefficients de diffusion similaires de 0.16 ± 0.14 µm2/s dans des domaines stables de 0.5 µm2. Pour analyser les trajectoires des r'ecepteurs, nous avons mis en oeuvre une nouvelle technique bas'ee sur une m'ethode d'inf'erence. Notre seule hypoth'ese est que le r'ecepteur se d'eplace selon l''equation de Langevin. Cette m'ethode exploite l'ensemble de l'information stock'ee dans la trajectoire et la qualit'e des valeurs extraites est v'erifi'ee par des simulations. Les deux r'ecepteurs sont confin'es dans un potentiel de type ressort avec une raideur de 0.45 pN/µm. Des exp'eriences apr'es d'epl'etion du cholest'erol par la cholest'erol oxydase et apr'es la d'epolym'erisation du cytosquelette par latrunculin B montrent que le confinement des r'ecepteurs individuels d'epend du taux de cholest'erol et que la d'epolym'erisation de l'actine n'influence pas le confinement. En utilisant la nanoparticule coupl'ee aux toxines comme un amplificateur de la force hydrodynamique applique'e par un flux liquide, nous avons mesur'e la r'eponse du r'ecepteur 'a une force ext'erieure. Les r'esultats indiquent une fixation des domaines de confinement sur le cy- tosquelette. Enfin, un mod'ele pour le confinement du r'ecepteur est propos'e, bas'e sur le couplage hydrophobe entre le r'ecepteur et la bicouche lipidique qui l'entoure. Ce mod'ele permet d'expliquer le potentiel de type ressort 'a l'int'erieur du domaine de confinement.

Chez Arabidopsis thaliana, les protéines SIAMESE-RELATED (SIM/SMR1 à 13) forment une famille plante-spécifique d'Inhibiteurs de Kinase Cycline-dépendante (CKI), homologue des Kip-Related Proteins. SIM et SMR1 sont des régulateurs positifs de la transition du cycle mitotique vers l'endoréplication. L'expression des gènes SIM/SMR est induite en réponse àdes stress. L'un des stress abiotiques majeurs pour les plantes est la sécheresse. Les SIM/SMR pourraient être dégradées par la voie de la protéolyse spécifique de l'Ubiquitin Proteasome System (UPS). Les SIM/SMR sont de bons candidats pour relier l'activité du cycle cellulaire aux stimuli de l'environnement. Ce travail a démontré l'implication de la protéolyse UPS dans le contrôle posttraductionnel de tous membres SIM/SMR testés. Il démontre que SIM, SMR2 et SMR1 sont nécessaires à l'endoréplication des cellules foliaires. Lors d'un stress hydrique, l'expression des gènes SIM, SMR1, SMR3 et SMR5 est induite. Le profil spatio-temporel de ces inductions a mis en évidence deux groupes de gènes avec des fonctions distinctes. Les mutants sim, smr5 et sim.smr1.smr2 sont hypersensibles au stress hydrique.