Zeitschriftenartikel zum Thema „Protéine recombinase“

Un des buts de notre projet est de fournir une source commode, économique et pure de protéine pour être testée dans des réactions diagnostiques et dans des vaccins contre la cowdriose. L'insertion d'ADN dans E. coli recombinante de la colonie F5.2, exprimant une protéine immunodominante de Cowdria ruminantium, a été séquencée. L'ADN était riche en A et T (74 p. 100), et hybridait avec tous les isolats de C. ruminantium testés et non pas avec de l'ADN bovin ou d'Anaplasma marginale. Il contient deux longs cadres ouverts de lecture (COL) de 627 et 831 paires de bases. Les COL étaient plus riches en G et C, comparés à la composition globale en bases et les deux COL codaient potentiellement pour des protéines contenant un peptide N-terminal. Des expériences de délétion suivies par des tests d'expression suggéraient que le COL de 627 paires de bases codait pour la protéine immunodominante de C. ruminantium reconnue par des sérums d'animaux infectés. Le COL pour ce polypeptide mature a été amplifié par réaction en chaîne de la polymérase et inséré dans un vecteur d'expression élevée où il a été exprimé comme protéine de fusion. Le peptide de fusion attaché, de 9 acides aminés, a permis une purification rapide de la protéine recombinante de C. ruminantium.

Différents types de vaccins sont actuellement disponibles ou en cours de développement. Ils peuvent être divisés en deux catégories : vaccins vivants et vaccins inertes. Les vaccins vivants traditionnels incluent des souches atténuées par des moyens conventionnels, comme la croissance dans des conditions de culture inhabituelles (bactéries), ou dans des cellules ou des animaux vis-à-vis desquels les souches ne sont pas initialement adaptées (virus). Les nouvelles générations de vaccins vivants utilisant les techniques de recombinaison génétique (vaccins recombinants) peuvent être fabriquées par mutagénèse dirigée de gènes de virulence, ou par clonage de gènes de protéines immunogènes dans des vecteurs viraux ou bactériens qui possèdent les propriétés souhaitées d’innocuité et d’efficacité. Les vaccins inactivés conventionnels sont fabriqués par traitement des microorganismes par des agents physiques ou chimiques. Dans la mesure où les fractions immunogènes des microorganismes sont de mieux en mieux connues, elles peuvent être utilisées pour fabriquer des vaccins ne comprenant que ces fractions immunogènes majeures (vaccin subunitaires) par purification, ou par expressionin vitro de protéines (un autre type de vaccin recombinant) ou enfin synthèse chimique de peptides. Récemment, il a été démontré, chez différentes espèces, que l’inoculation directe dans le muscle d’un gène codant pour une protéine immunogène (immunisation génétique) permettait d’induire une réponse immune cellulaire et humorale. Cette méthode correspond à un dernier type de vaccin recombinant. L’immunité systémique et muqueuse obtenue après injection de vaccin vivant est comparée à celle obtenue après injection de vaccin inerte.

Le test Elisa recombinant (Elisar) utilisant la protéine de 80 à 90 kDa spécifique de Chlamydophila abortus, développé à l’Inra de Nouzilly en France, a été évalué au Maroc. Trois cent sept sérums appartenant à cinq groupes d’ovins et de caprins, provenant d’élevages aux taux d’avortements élevés ou bien présentés pour contrôle vétérinaire, ont été testés. La comparaison des résultats obtenus avec le test de fixation du complément (Tfc) a montré une grande discordance entre les deux techniques. En effet, seulement 16 sérums ont été positifs avec Elisar contre 130 positifs avec Tfc. En particulier, parmi les 55 sérums provenant d’animaux avortés, 48 ont été positifs avec Tfc et 16 avec Elisar. Ceci soulève avec acuité la problématique du rôle de Chlamydophila pecorum dans les avortements des petits ruminants au Maroc. La recherche différentielle des pathologies à Chlamydophila abortus et Chlamydophila pecorum est nécessaire pour préciser l’origine des divergences observées entre Elisar et Tfc.

O uso crônico de glicocorticóides no tratamento de doenças sistêmicas causa diminuição da velocidade de crescimento (VC), podendo acarretar perda estatural final. As interações entre o eixo adrenal e o eixo GH-sistema IGF têm sido descritas, podendo ocorrer em nível hipotalâmico-hipofisário e na regulação do sistema IGF, inclusive modulando o sinal do IGF-1R. Pode-se dizer que o quadro clínico deve ser considerado como estado de deficiência de Igf-1, absoluta e/ou funcional. As intervenções que possibilitam a normalização funcional do eixo GH-IGF poderiam reduzir a perda estatural destas crianças. Os estudos realizados em pacientes com artrite reumatóide juvenil em tratamento com corticóides mostraram aceleração da VC e diminuição da perda protéica com o uso de GH recombinante humano (hrGH). A aceleração da VC foi também descrita em pacientes sob corticoterapia crônica por causa da doença intestinal inflamatória ou do transplante renal após o uso de hrGH. A dose de hrGH guarda correlação positiva com a aceleração da VC e os resultados reforçam que esta deficiência funcional do eixo GH-IGF pode ser revertida com a administração de hrGH. O efeito do hrGH é restrito ao período de tratamento e depende do esquema de reposição do hrGH, do estado nutricional e das condições da doença de base.

Since 1998, nine bluetongue virus (BTV) strains from serotypes 1, 2, 4, 6, 8, 9 11, 16 and 25 have invaded Europe, killing more than two million animals (mainly sheep). Live attenuated vac­cines of BTV-2, 4, 9 and 16 have also been used in the region, in some cases causing further outbreaks of disease. Recent sequence analysis have shown that there have been cases of reassortment between field strains and live attenuated vaccine strains, hence the need for safer vaccines such as killed vaccines or recombi­nant protein-based subunit vaccines. The outer capsid protein VP2 of Culicoides-borne orbiviruses is the cell-attachment pro­tein, which carries sero-neutralization epitopes. We have cloned the open reading frame (ORF) (of segment 2) encoding VP2 and expressed the protein from BTV-4 in a bacterial expression sys­tem. The entire protein was found to be insoluble. Bioinformatic and evolutionary analysis showed that VP2 was composed of two ‘domains’, which were expressed separately using the same system. Optimization of expression conditions generated soluble proteins, indicating a correct fold of the expression products. These protein domains were used as antigens in mice experi­ments to raise antibodies against conformational epitopes. VP2 of BTV-4 was also expressed in a baculovirus system and was found to be soluble. The ORF encoding VP2 was cloned into a mammalian expression vector (pcDNA3.1) and is currently used (as a DNA vaccine) in animal experiments (using Chitosan as an adjuvant) to assess the antibody raising capacity of this formula­tion. One of the intended uses of this protein or its domains is to generate crystals for determination of the VP2 atomic structure using X-ray crystallography. VP5 of orbiviruses is a fusion pro­tein that is involved in membrane penetration during initiation of infection. The ORF (of genome segment 6) encoding VP5 of BTV-4 was cloned and expressed in the same bacterial system. Bioinformatic analysis also defined two domains of VP5. Only about 10% of the full length protein was soluble, while the two separated domains were over 90% soluble. Currently, VP5 and the two separate domains are being used in mice experiments to determine whether these can influence the immune response when concomitantly injected with the VP2 domains. VP5 was also cloned in pcDNA and used in mice experiments, formu­lated using Chitosan as an adjuvant. Antibodies collected from the mice reacted with the recombinant expressed VP5 showing high titres of antibodies. VP5 and its domains will also be used in X-ray crystallography. A plaque reduction assay was developed to determine whether the antibodies generated against VP2 domains or the VP2/VP5 mixture can neutralize virus infectivity in cell culture assays, opening the way for challenge assays in animals.

Que a resistência bacteriana é tida como um problema de saúde pública não é mais uma novidade! Bactérias das mais diversas espécies estão adquirindo resistência aos antibióticos mais potentes que existem. Isso interfere significativamente em diversos aspectos da prática clínica, como a diminuição da eficiência terapêutica de substâncias e a redução no controle de doenças infectocontagiosas, colocando em risco profissionais da área da saúde e pacientes. Caracteriza-se por resistência bacteriana os mecanismos desenvolvidos por diferentes espécies que buscam reduzir ou eliminar o efeito de agentes antimicrobianos como os antibióticos. Estes mecanismos podem ser a produção de enzimas que degradam ou alteram a molécula antimicrobiana, eliminando seus efeitos nas células, ou ainda, proteínas capazes de formar uma bomba de efluxo, que seria um transportador de membrana capaz de expulsar os antimicrobianos da célula [1]. Além dos mecanismos de resistência, as bactérias têm adquirido cada vez mais habilidades de colonizarem e proliferarem em seus hospedeiros, por meio de melhora na captação de nutrientes e a utilização destes para a produção de biofilme e fatores de virulência [2]. Atualmente, diversas espécies bacterianas têm ampliado a lista de resistência, o que tem gerado o aumento na preocupação por parte dos sistemas de saúde de como controlar e contornar tal problema. Espécies como Acinetobacter baumanii, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus e Clostridium defficile encabeçam esta lista por possuírem cepas capazes de resistir a antibióticos de segunda linha, ou seja, antibióticos específicos utilizados em infecções graves e que geralmente são mais tóxicos ou apresentam efeitos colaterais mais pronunciados do que os de primeira linha [3] . A infectividade e patogênese dessas bactérias têm sido relacionadas com um grupo de transportadores conhecidos como transportadores do tipo ABC (ATP-Binding Cassete – Conjunto de proteínas ligadoras de ATP) envolvidos principalmente com mecanismos de evasão, resistência ao hospedeiro, fatores de superfície celular e excreção, auxílio na captação de nutrientes, entre outros [4; 5]. Transportadores do tipo ABC utilizam a energia liberada pela hidrólise de adenosina trifosfato (ATP) para translocar diferentes compostos através das membranas celulares. Isso ocorre devido a estrutura complexa destes transportadores (Figura 1) que é formada por duas proteínas ligadoras de nucleotídeos (Nucleotide Binding Domain – NBD), também conhecidas como ATPases e duas proteínas transmembranas (Transmembrane Domain – TMD) que formam um canal de passagem através da membrana celular, também conhecidas como permeases. Os transportadores do tipo importadores, ainda contam com uma proteína a mais: a proteína ligadora de substrato (Substrate Binding Protein – SBP), que é responsável por identificar e se ligar de forma específica a molécula a ser internalizada. Por se encontrar no periplasma (espaço entre a membrana e a parede celular), esta proteína também é popularmente conhecida como periplasmática [6]. Figura 1: Esquema simplificado dos componentes dos transportadores ABC do tipo exportadores e importadores. Fonte: própria autora. O conhecimento detalhado da estrutura e de etapas do transporte pode fazer dos transportadores ABC novos alvos para a terapêutica antimicrobiana [7] e o desenvolvimento de vacinas [8], principalmente porque os transportadores responsáveis pela internalização de nutrientes para as células são exclusivos de bactérias. Dessa maneira, os antimicrobianos desenvolvidos para inibir a captação e transporte de nutrientes a partir da ação de transportadores ABC não influenciarão a atividade dos transportadores exportadores encontrados nos eucariotos. Existem muitos gargalos para o estudo de estruturas e funções de proteínas e um deles é a complexidade da produção destas moléculas em laboratório de forma recombinante e sua manutenção para os ensaios de atividade e inibição. O custo para produzir grande quantidade de uma proteína para testar diferentes inibidores é alto e pode desmotivar muitos pesquisadores. Mas existe um caminho alternativo. As proteínas são formadas por aminoácidos, cuja sequência é determinada pela sequência de nucleotídeos de DNA do indivíduo, assim, as análises destas sequências nos permite saber muito sobre as proteínas, de forma que podemos predizer alguns comportamentos destas moléculas. A forma como as proteínas adquirem sua estrutura é determinada em parte pela sua sequência de aminoácidos, que obedece uma série de leis físicas e químicas para que a molécula fique estável [9]. Hoje já sabemos quais posições os aminoácidos podem adotar ou não em uma estrutura tridimensional protéica e, a partir de então, com o auxílio de algoritmos específicos, podemos determinar computacionalmente a estrutura de uma proteína apenas com a sua sequência linear de aminoácidos. É o que chamamos de análises in silico. E qual a importância disso? Podemos estimar com uma relativa precisão a função de uma proteína a partir da sua estrutura, a partir de simulações de possíveis interações entre esta proteína e diversas moléculas. É possível, por exemplo, criar um modelo tridimensional para testar diversos compostos, a fim identificar aqueles que têm uma maior probabilidade de se ligar aos transportadores ABC de bactérias resistentes, possivelmente podendo causar a sua inibição. Este método é conhecido como docagem molecular. Aqueles compostos que apresentarem os maiores índices de interação serão validados experimentalmente, a fim de determinar sua eficácia como inibidores da proteína alvo. Esta metodologia é interessante pois seleciona quais compostos deverão ser testados experimentalmente, eliminando aqueles que certamente não apresentam características que favorecem a interação, reduzindo assim o número de ensaios que precisarão ser feitos, tempo e recursos. A aplicação da bioinformática para o desenvolvimento de novos tratamentos contra infecções é muito ampla e crescente, dada a importância do tema na saúde pública [10-11]. Entretanto, muitas outras áreas têm usado destas análises computacionais, na busca por novos alvos terapêuticos para diferentes tipos de câncer, doenças genéticas, terapias gênicas e compreensão e monitoramento de epidemias e surtos de doenças infecciosas. Sendo assim, a bioinformática se mostra essencial para a melhoria da saúde humana, aprimoramento da prática clínica e desenvolvimento de novos fármacos.