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Dissertationen zum Thema „Protéine recombinase“
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Liu, Siyu. „Dynamics of Rad51 during homologous recombination in living yeast“. Electronic Thesis or Diss., Université Paris sciences et lettres, 2022. http://www.theses.fr/2022UPSLS050.
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L'ADN est le principal vecteur d'information génétique et son intégrité est vitale pour la survie des cellules. Pourtant, l'ADN est sous la pression des dommages causés par des facteurs exogènes et endogènes. Les cassures double brin (CDB) sont parmi les dommages les plus toxiques puisqu’une CDB non réparée peut être léthale. Les cellules ont développé plusieurs voies pour réparer les CDB, dont la jonction d'extrémités non homologues (NHEJ) et la recombinaison homologue (RH). RH est une voie de réparation fidèle qui utilise une séquence homologue intacte comme modèle pour réparer les dommages. Cela implique d'identifier la séquence homologue parmi les mégabases du génome et dans le volume nucléaire des cellules eucaryotes. Au niveau moléculaire, la recherche d’homologie de l'ADN et l'invasion de l’ADN double brin homologue sont réalisées par un filament nucléoprotéique (NPF), formé par la recombinase, RecA chez les bactéries et Rad51 chez les eucaryotes, associée à l'ADN simple brin flanquant la CDB. Ce mécanisme a été largement étudié in vitro et in vivo par des approches génétiques et moléculaires au niveau des populations cellulaires, mais sa dynamique n'a pas pu être étudiée dans les cellules vivantes faute de version fluorescente fonctionnelle de Rad51. Ainsi, comment l'ADN brisé peut-il trouver une séquence homologue dans le volume du noyau et parmi les mégabases d'ADN reste mystérieux.Sur la base d’études structurales, en collaboration avec Raphael Guerois (I2BC, CEA, France), nous avons développé et caractérisé la première version fonctionnelle étiquetée d'une recombinase chez la levure S. cerevisiae.Suite à l'induction de DSB unique, nous observons pour la première fois dans des cellules vivantes, Rad51 formant des filaments pouvant atteindre un ou deux microns de longueur et traverser le volume du noyau pour contacter une séquence homologue. Comme prédit par des études génétiques et des données obtenues in vitro, leur formation nécessite le chargeur de recombinase Rad52 et la formation d'un long fragment d'ADNsb. De plus, les filaments Rad51 adoptent une variété de formes qui sont modulées par des facteurs auxiliaires de Rad51, apportant un nouvel éclairage sur la fonction de ces facteurs dans les cellules vivantes.Contrairement à ce qui a été rapporté pour les filaments RecA chez les bactéries, les filaments Rad51 montrent un comportement étonnamment dynamique : avec de fréquents événements de compaction suivis d’une ré-extension offrant des opportunités pour le filament d'être projeté dans une zone nucléaire différente, et ainsi d'explorer de nouvelles régions génomiques. La modélisation biophysique du processus de recherche d'homologie par notre collaborateur Leonid Mirny (MIT, USA) révèle que ces cycles de compaction/extension constituent une stratégie très robuste pour qu'une identité unique trouve sa cible dans l'espace nucléaireDNA is the major carrier of genetic information in prokaryotic and eukaryotic cells and its integrity is vital for the survival of cells. However, DNA is under pressure of damages caused by both exogenous and endogenous factors. Double strand break (DSB) is one of the most toxic DNA damages and even one unrepaired DSB is lethal to cells. Cells have evolved several pathways to repair DSBs, including non-homologous end joining (NHEJ), and homologous recombination (HR). HR is an error free repair pathway that uses an intact homologous sequence as a template to repair the damage. This involves identifying the homologous sequence among the mega bases of the genome and in the nuclear volume of eukaryotic cells. At the molecular level, DNA sampling and strand invasion of the homologous dsDNA is achieved by a nucleoprotein filament (NPF), formed by the recombinase, RecA in bacteria and Rad51 in eukaryotes, coating ssDNA. This mechanism has been extensively studied in vitro and in vivo through genetic and molecular approaches at the level of cell populations, but its dynamics could not be studied in living cells due to lack of functional fluorescent version of Rad51. Thus, how broken DNA can find a homologous sequence in the volume of the nucleus and among the megabases of DNA remains mysterious.Thanks to structural insights from our collaborator Raphael Guerois (I2BC, CEA, France), we developed and characterized the first functional, internally tagged version of a recombinase in the yeast S. cerevisiae. Following the induction of unique DSB, we observe for the first time in living cells, Rad51 forming micrometer long filaments spanning across the whole nucleus and contacting the donor sequence. As predicted from genetic and in vitro data, their formation requires the recombinase loader Rad52 and the formation of long stretch of ssDNA. Furthermore, emerging filaments adopt a variety of shapes, not reported in vitro and modulated by Rad51 ancillary factors, shedding new light on the function of these factors in living cells.In contrast to what has been reported for RecA filaments in bacteria, Rad51 filaments show a surprisingly dynamic behavior: with frequent compaction events followed by re-extension providing opportunities for the NPF to be projected into a different nuclear area, and thus explore new genomic regions. Biophysical modeling of the homology search process by our collaborator Leonid Mirny (MIT, USA) reveals that these cycles of compaction/extension constitute a very robust strategy for a unique identity to find its target in the nuclear space
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Jaunet, Titouan. „Modélisation et simulation de nouveaux inhibiteurs de Rad51 au sein d'une protéine de transport“. Thesis, Nantes, 2017. http://www.theses.fr/2017NANT4050/document.
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La protéine RAD51 est l’un des acteurs majeurs des mécanismes de la résistance et de la reconstruction des cellules cancéreuses. La modulation de son activité ouvre une nouvelle voie dans la lutte contre le cancer. De nouveaux inhibiteurs potentiels de RAD51 ont été recensés, notamment, les dérives du stilbène disulfonique (SD). Dans cette thèse, nous étudions ces inhibiteurs dans différents milieux (solvant et protéine). La première partie de cette thèse est dédiée à l’étude des propriétés physico-chimiques en solution des dérivés SD. À l’aide de spectres optiques expérimentaux et de simulations par calculs quantiques (DFT et TD-DFT), nous avons montré que les SD se présentent sous leur forme dianionique en condition physiologique et la prise en compte du couplage vibronique est cruciale pour simuler des bandes des spectres d’absorption. La seconde partie se focalise sur la modélisation du complexe SD2- en interaction avec la protéine de transport albumine sérique humaine (ASH), qui joue un rôle prépondérant dans le transport de molécule au sein du corps humain. Elle apparaît être un excellent candidat pour acheminer des inhibiteurs SD2- vers les cellules cancéreuses. Sans donnée cristallographique du complexe ASH-SD2-, la modélisation moléculaire est le seul outil prédictif utilisable pour obtenir des données structurales, et nous avons associé ici des méthodes de docking moléculaire et de dynamique moléculaire. Cette méthodologie nous a permis (i) d’identifier le(s) résidu(s) important(s), (ii) d'évaluer les énergies d'interaction par des calculs MM-GBSA et (iii) d'identifier les sites d’accueil les plus adéquats pour les composés de type SD2-In this PhD thesis, the SD behavior is studied in various environments (in solution and within protein). In the first part, the physico-chemical properties of SD molecules in solution are explored in a joint experimental and theoretical (DFT and TD-DFT) investigation. The latter demonstrates the dianionic nature of SD compounds in physiological conditions and indicates that accounting for vibronic coupling is crucial to reproduce the bandshape of the absorption spectra. The second part is focused on the modeling of SD2- complexes within a carrier protein, the human serum albumin (HSA), which is essential for the drug transport process through the human body. HSA appears to be an excellent candidate to carry SD2- compounds into cancer cells. Without any cristallographic structure of HSA-SD2- complex, molecular modelling is the only predictive tool to obtain structural data. We performed molecular docking and molecular dynamic methodology to (i) identify the key residues, (ii) investigate the complex energies by MM-GBSA calculations and (iii) determine the most potent binding sites to host SD2- derivatives
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Miladi, Baligh. „Développement d’outils moléculaires de production et de purification de protéines recombinantes par suivi en temps réel“. Thesis, Cergy-Pontoise, 2011. http://www.theses.fr/2011CERG0533/document.
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Les besoins en protéines recombinantes dans les diverses activités des bio-industries a considérablement augmenté ces dernières années. Cependant, les procédés de leur production sont encore limités par le manque de marqueurs permettant de suivre l'expression et la purification des protéines d'intérêt, la formation des corps d'inclusion et les faibles degrés de pureté.Afin de pallier à ces difficultés, nous avons développé et mis en œuvre un nouveau procédé de production et de purification de protéines recombinantes chez Escherichia coli. Ce procédé est basé sur l'utilisation d'une cassette d'expression appelée Multitags et sur le clivage par une TEV protéase immobilisée sur une matrice de streptavidine. Le Multitags comporte, à partir de son extrémité N-terminale, un double tag d'affinité (10xHis et SBP), le domaine de fixation de l'hème du cytochrome b5 et le site de clivage de la TEV protéase. En utilisant deux modèles différents de protéine d'intérêt (MyRIP et la Pfu DNA polymérase), nous avons montré l'efficacité du cytochrome b5 dans le suivi visuel et quantitatif par mesure d'absorbance des différentes étapes de production et de purification. Nous avons obtenu plus de 90% de chacune des deux protéines de fusion dans la phase soluble. L'application d'une chromatographie double via les deux tags d'affinité 10xHis et SBP a permis d'atteindre un degré de pureté du Multitags-MyRIP et du Multitag-Pfu de 99%. Nous avons construit des colonnes protéolytiques en produisant la TEV protéase sauvage et sa version mutée (S219V) en fusion avec le Streptag II et en immobilisant ces enzymes par affinité sur colonne de streptavidine-agarose. La caractérisation des colonnes protéolytiques et leur application aux protéines recombinantes d'intérêt modèles ont montré l'avantage de cette méthode d'immobilisation en termes d'activité protéase retenue, de stabilité des enzymes, de leur réutilisation et de simplification du schéma de purification et de récupération des protéines d'intérêt à haut degré de pureté. En conclusion, ces travaux de thèse ont permis de développer et de valider des outils innovants pour l'expression et la purification de protéines recombinantesIn recent years, the need for recombinant proteins has substantially increased in various bio-industry activities. However, actual recombinant processes are still limited by the lack of markers allowing real-time expression and purification monitoring of target proteins, by inclusion bodies formation and by low quality of purity of the products. To overcome these difficulties, we have developed a new process for production and purification of recombinant proteins in Escherichia coli. The method combines the use of a multifunctional expression cassette, termed Multitags and an immobilized modified TEV protease on a streptavidin matrix. The Multitags contains, its N-terminus, two affinity purification tags (10xHis and SBP) and as a marker tag, the heme-binding domain of cytochrome b5 followed by the TEV cleavage site. Using two model proteins (MyRIP and Pfu DNA polymerase), we have demonstrated the visual and the quantitative monitoring capability of the cytochrome b5 during the expression and purification steps. When expressed in E. coli KRX more than 90% of both fusion proteins were produced in a soluble form. In addition, high purity (99%) of Multitags-MyRIP and Multitags-Pfu was achieved after two consecutive affinity purification steps using the dual affinity tag. We also produced the wild-type and the S219V mutant TEV proteases fused to the Streptag II affinity sequence and realized their affinity immobilization on a streptavidin-agarose matrix. The characterization of the proteolytic columns and their application to the recombinant model proteins demonstrated the advantage of this immobilization method in terms of retaining activities, enzyme stabilities, possibility of reuse and simplification of the cleavage downstream steps.In conclusion, this study allowed the development and the validation of innovative tools for expression and purification of recombinant proteins
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Philibert, Pascal. „Construction et optimisation d’anticorps intracellulaires pour l’analyse in vivo des protéines“. Montpellier 1, 2009. http://www.theses.fr/2009MON13524.
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L’immunisation intracellulaire utilise des fragments d’anticorps (intracorps) exprimés à l’intérieur de la cellule afin de se lier à une protéine et d’inhiber sa fonction. Le problème majeur limitant l’utilisation des intracorps est l’absence de formation des ponts disulfures en milieu cytoplasmique (réducteur). En utilisant un fragment d’anticorps, le scFv 13R4, sélectionné pour sa forte expression et sa très bonne solubilité dans le cytoplasme malgré l’absence des ponts disulfures, nous avons construit par greffage des boucles hypervariables (CDR) un anticorps dirigé contre l'oncoprotéine E6 du papillomavirus. L'anticorps obtenu après optimisation présente des caractéristiques d'expression et de solubilité proche de l'anticorps 13R4 originel en ayant acquis les propriétés de reconnaissance de l'anticorps anti-protéine E6. Toutefois, devant les difficultés rencontrées pour obtenir des intracorps par greffages des boucles hypervariables, nous avons créé une banque d'anticorps optimisés pour l'immunisation intracellulaire. Pour cela, différentes boucles hypervariables ont été greffées sur la charpente de l'anticorps 13R4 en respectant la diversité des CDR observée dans les anticorps naturels humains. Cette banque a été testée contre différentes cibles intracellulaires et confirme son utilité pour isoler rapidement des intracorpsIntracellular immunization consists in the expression of antibody fragments inside the cell that bind to a protein and interfer with its function. The main problem limiting the use of intrabodies is the absence of disulfide bonds in the reducing conditions pertaining in the cell cytoplasm. We used the scFv13R4 antibody fragment, selected for its high soluble expression level in the cytoplasm, to construct, by loop (CDR) grafting, an antibody fragment against the E6 protein of human papillomavirus type 16. After several optimization steps, cytoplasmic soluble expression of the grafted anti-E6-protein antibody fragment was comparable to that of the original antibody (13R4). To circumvent this long procedure, we designed and constructed an optimised library of antibody fragments for intracellular immunization, based on the scFv13R4 framework with randomized CDR3 loops mimicking the natural diversity of human CDR loop sequences. This library has been tested against several proteins, demonstrating that it is now possible to rapidly obtain intrabodies against any protein
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Gomord, Véronique. „Contrôle de l'adressage de la sporamine dans la cellule végétale“. Rouen, 1994. http://www.theses.fr/1994ROUES054.
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Le système endomembranaire ou système de sécrétion est constitué de compartiments spécifiques et distincts et de vésicules qui assurent le transport entre ces différents compartiments. Les protéines sécrétées, solubles ou membranaires, sont introduites de façon co-traductionnelle dans le réticulum endoplasmique (RE). Du RE, ces protéines sont transportées tout au long du système endomembranaire de sécrétion jusqu'à leur compartiment cible: l'appareil de Golgi, la vacuole le tonoplaste, la membrane plasmique ou le compartiment extracellulaire. Des travaux récents ont permis d'identifier des signaux spécifiques d'adressage et de rétention qui par leur interaction avec des récepteurs, permettent le transport de certaines protéines vers leur localisation finale. Nos travaux font appel aux approches de la biologie cellulaire et moléculaire pour l'étude du transport et de l'adressage des protéines dans le système endomembranaire de sécrétion chez les plantes. Nous avons modifié par mutagénèse dirigée les signaux d'adressage d'une protéine recombinante modèle, la sporamine. De plus nous avons développé un système d'expression stable de ces protéines recombinantes dans des cellules de tabac (nicotiana tabacum CV BY2). Nous avons ainsi obtenu des cellules transgéniques exprimant fortement une même protéine modèle transportée vers la vacuole (sporamine), vers le milieu extracellulaire (dpro-sporamine) ou retenue dans la fraction microsomale (SpoHDEL ou dproHDEL). L'étude de la localisation intracellulaire de SpoHDEL a permis de montrer l'accumulation de cette protéine dans un compartiment présentant une activité IDPase
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Gainche, Isabelle. „Les animaux transgéniques : intérêt et perspectives d'avenir dans la production de protéines d'intérêt thérapeutique“. Paris 5, 1993. http://www.theses.fr/1993PA05P069.
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Marque, Pierre-Emmanuel. „Modulation de l'activité de la thrombine“. Paris 5, 2002. http://www.theses.fr/2002PA05P625.
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La coagulation du sang est déclenchée par une activation enzymatique en cascade de zymogènes initialement inactifs. Cette cascade, bien que de nature explosive, est sélective et auto-contrôlée. C'est la dernière enzyme générée (la thrombine) qui la module directement et indirectement. L'activité de la thrombine est elle même régulée par trois mécanismes : 1) un auto-contrôle de sa génération, 2) une modulation par la thrombomoduline et 3) sa neutralisation par l'antithrombine. Ces deux derniers mécanismes ont été abordés au cours de cette thèse, plus particulièrement celui de la voie de la protéine C, qui est le seul système anticoagulant inductible donc auto-régulé. La neutralisation directe de la thrombine par son principal inhibiteur plasmatique a été étudiée à l'aide d'un anticorps monoclonal qui permet de distinguer la conformation de l'antithrombine complexée de tous les autres conformères de cette serpine. Cette étude a fourni des informations incontournables sur la nature de l'interaction enzyme-serpine. L'étude sur la "thrombomodulation" a commencé par une cartographie de la spécificité des sous-sites catalytiques de la thrombine à l'aide de substrats à fluorescence réprimée. .Blood coagulation results in sequential activation of plasma proenzyme to their enzyme form. This burst of activation is very selective and auto-regulated. It is the last enzyme (thrombin) who controls directely and indirectely this cascade. Thrombin activity is regulated through three mechanisms 1) an auto-control of its generation, 2) modulation by thrombomodulin and 3) neutralization by antithrombin. The last two mechanisms were discussed in this thesis, especially Protein C activation which is the only inductible anticoagulant system. Direct neutralization of thrombin by antithrombin was investigated through the characterization of a monoclonal antibody that selectively recognizes complexed antithrombin. This antibody reacts with none of the monomeric conformers of antithrombin. These observations limit drastically the possible locations of the defeated protease within the complex. .
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Lu, Yang. „Functional studies of new protein-protein interactions potentially involved in homologous recombination in hyperthermophilic archaea : study of interactions between PCNA and Mre11-Rad50 complex & Primase and RadA“. Thesis, Brest, 2018. http://www.theses.fr/2018BRES0077/document.
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Les archées hyperthermophiles ont une température optimale de croissance supérieure à 80°C.Les cellules exposées à un stress thermique subissent une augmentation de la sensibilité aux agents induisant des cassures double brin de l’ADN. Les études sur les eucaryotes et bactéries ont démontré que la recombinaison homologue joue un rôle essentiel non seulement dans la réparation de l’ADN, mais aussi dans le redémarrage des arrêts de la fourche de réplication. Les enzymes associées aux étapes initiales de la recombinaison homologue chez les archées sont homologues à celles des eucaryotes, et différentes des analogues bactériens. De plus, plusieurs études ont démontré que les protéines impliquées dans la recombinaison homologue sont essentielles chez les archées hyperthermophiles, soulignant l’importance biologique de cette voie de réparation chez ces organismes particuliers. Le rôle de la recombinaison homologue pour la stabilité génomique a été bien étudié chez les eucaryotes et les bactéries, cependant, peu de ses propriétés fonctionnelles ont été étudiées chez les archées hyperthermophiles. Pour mieux comprendre le mécanisme de recombinaison homologue impliquée au niveau de la maintenance génomique chez les archées, un réseau d’interactions protéine-protéines a été révélé précédemment au laboratoire à partir des protéines de Pyrococcus abyssi. Ces travaux ont démontré de nouvelles interactions où interviennent les protéines de la réplication et les protéines de la recombinaison de l’ADN. L’objet de cette étude de thèse est de présenter deux interactions : PCNA/Mre11-rad50 (MR) complexe et Primase/RadA. Pour la première fois chez P. furiosus, une interaction physique et fonctionnelle a été démontrée entre le PCNA et le complexe MR (l’initiateur de HR). Un motif, situé en position Cterminale de Mre11, permet l’interaction avec PCNA.PCNA stimule l’activité endonucléase du complexe MR à distance proche de l’extrémité 5’ d’une cassure double brin. Cette propriété est en accord avec l’intervention ultérieure des enzymes assurant la suite du mécanisme de réparation par recombinaison homologue. Par ailleurs, les protéines RadA, Primase et P41 ont été produites et purifiées. Leurs fonctions enzymatiques ont été confirmées. Cependant, nous n’avons pas pu caractériser la fonction de l’association de RadA/PrimaseHyperthermophilic archaea (HA) are found in high-temperature environments and grow optimally above 80°C. Usually, cells exposed to heat stress display an increased sensitivity to agents inducing double-stranded DNA breaks (DSBs). Studies in Eukaryotes and Bacteria have revealed that homologous recombination (HR) plays a crucial role not only in DNA DSBs repair, but also in the collapsed/stalled DNA replication fork restart.Recombinase and various HR-associated enzymes in archaea specifically resemble the eukaryotic homologues, rather than bacterial homologues.Furthermore, several studies have demonstrated the necessity of HR proteins in HA, suggesting that, HR is an important mechanism in HA. HR influencing genome stability has been well studied in Eukaryotes andBacteria, however, few of its functional properties have been studied in HA.To better understand how HR mechanism is involved in the archaeal genome maintenance process, a previous work proposed a protein-protein interaction network based on Pyrococcus abyssi proteins. Through the network, new interactions involving proteins from DNA replication and DNA recombination were highlighted. The targets of the study presented here for two protein interaction are: PCNA/Mre11-rad50 complex (MR complex) and Primase/RadA. For the first time in P. furiosus, we showed both physical and functional interactions between PCNA (Maestro in DNA replication) and MR complex (initiator of HR). We have identified a PCNA-interaction motif (PIP) located in the C-terminal of Mre11, and shown that PCNA stimulated MR complex endonuclease cleavage proximal to the s’ strand of DNA DSBs at physiological ionic strength. For the second interaction, we have purified the proteins PabRadA/PfuRadA, PabPrimase and PabP41, and confirmed its enzymatic functions. However, we were not able to characterize the function of Primase/RadA association
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Kobir, Ahasanul. „Physiological roles of Eukaryotic Hanks type Ser/Thr kinase in transition to stationary phase in Bacillus subtilis“. Phd thesis, Université Paris Sud - Paris XI, 2012. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00911812.
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Bacillus subtilis is the model organism for low GC Gram-positive bacteria and is of great biotechnological interest. Protein phosphorylation is an important regulatory mechanism in bacteria and it has not been extensively studied yet. Recent site-specific phosphoproteomic studies identified a large number of novel serine/threonine phosphorylation sites in B. subtilis, including a) two transition phase global gene regulators DegS and AbrB and b) RecA, that plays a major role in double-strand break repair and DNA recombination. .B. subtilis disposes of several putative Ser/Thr kinases like PrkA, YbdM, YabT and a characterizd kinase PrkC, but very few physiological substrates for these have been defined so far. In vitro phosphorylation assays were used to identify which of these kinases were able to phosphorylate DegS, RecA and AbrB. DegS phosphorylation on serine 76 by the kinase YbdM influenced its activity towards DegU both in vitro and in vivo, and expression of DegS S76D( on replacing serine to aspartate) in B. subtilis perturbed cellular processes regulated by the DegS/DegU two component system. This suggests a link between DegS phosphorylation at serine 76 and the level of DegU phosphorylation, establishing this post-translational modification as an additional trigger for this two-component system. At the onset of sporulation, B. subtilis expresses an unusual serine/threonine kinase YabT, which exhibits a septal localization and is activated by non-sequence-specific DNA binding. Activated YabT phosphorylates RecA at the residue serine 2, which in turn promotes the formation of RecA foci at the onset of spore development. On the other hand, non-phosphorylatable RecA or inactivated YabT lead to reduced spore formation in the presence of DNA lesions . This suggests a functional similarity between B. subtilis developmental stage dependent RecA phosphorylation and its eukaryal homologous Rad51 phosphorylation, which leads to its recruitment to the lesion sites. We therefore proposed that RecA phosphorylation serves as an additional signal mechanism that promotes focus formation during spore development. AbrB is phosphorylated by YabT, YbdM and PrkC in vitro and AbrB phosphorylation leads to reduced affinity for its target DNA and abolished binding cooperativity in vitro and in vivo. Expression of the phosphomimetic AbrB-S86D or of the non-phosphorylatable AbrB-S86A mutant protein in B. subtilis disturbed some stationary phase phenomena such as exoprotease production, competence and the onset of sporulation, probably by deregulation of AbrB-target genes and operons. We therefore, proposed that AbrB phosphorylation as an additional regulatory mechanism needed to switch off this ambiactive gene regulator during the transition phase.
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Betemps, Dominique. „Production de protéines recombinantes en système colibacille pour le virus de l'immunodéficience bovine et la protéine prion“. Lyon 1, 2001. http://www.theses.fr/2001LYO10252.
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Nous avons utilisé le système colibacille pour produire des protéines de fusion avec un polypeptide de six histidines, dans le cas du virus de l'immunodéficience bovine et des maladies à prion. L'impact de l'infection par le VIB (Virus de l'Immunodéficience Bovine) sur le statut sanitaire des troupeaux est peu connu en France. Une protéine recombinante correspondant à la protéine p26 de la capside du (VIB) a été produite pour développer un test de dépistage sérologique des animaux infectés par ce virus. Le fragment du gène gag codant pour la protéine p26 a été cloné dans le vecteur d'expression pMH79, en aval d'une séquence codant pour six histidines, et a permis d'obtenir la protéine de fusion (His)6p26, purifiée par chromatographie sur résine par affinité avec des ions métalliques bivalents. Nos travaux montrent que la protéine (His)6-p26 recombinante est reconnue spécifiquement par des sérums issus de lapins et de bovins infectés expérimentalement avec la souche originelle R29 du VIB, en western blot ainsi qu'en l'ELISA. Dans le cas des sérums de bovins, les anticorps dirigés contre la protéine recombinante apparaissent dès la troisième semaine après l'inoculation, et se maintiennent à un taux détectable au moins un an après l'infection. Les Encéphalopathies Spongiformes Subaigue͏̈s Transmissibles (ESST), ou maladies à prion, sont des maladies neuro-dégénératives, touchant aussi bien l'homme que l'animal. L'agent infectieux responsable de ces maladies serait composé de la protéine PrPsc elle-même, qui s'accumule dans le cerveau de l'hôte. Cette protéine correspond à une forme anormale, résultant d'une modification post-traductionnelle d'une protéine PrPc (PrP cellulaire) codée par l'hôte. Nous nous sommes proposés de produire en colibacille les protéines prion ovine et murine, de les caractériser au niveau immunologique, et d'essayer d'obtenir une réponse anticorps chez des souris PrP0/0, dépourvues du gène prion. Nous avons mis en évidence des différences de réactivité des sérums polyclonaux produit chez la souris PrP0/0, vis-à-vis de la PrPres (PrP résistante à la protéinase K) de différentes espèces (bovine, ovine et murine). Ces deux sérums reconnaissent les trois glycoformes de PrPres, selon un profil différent de celui obtenu avec un sérum dirigé contre la séquence peptidique bovine 106-121.
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Lamy, Aude. „Production de protéines d'intérêt thérapeutique par les plantes transgéniques : réalisations et perspectives“. Paris 5, 1999. http://www.theses.fr/1999PA05P087.
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Byrne, Deborah. „Du gène à la protéine : une approche rationnelle pour concevoir des expériences d'expression des protéines recombinantes“. Thesis, Aix-Marseille 2, 2011. http://www.theses.fr/2011AIX22127.
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Protéines difficiles à exprimer: un goulot d'étranglement pour la plupart des biologistes. J'ai choisi d'utiliser comme modèle d’étude Acanthamoeba polyphaga Mimivirus. Ce virus géant à ADN possède des protéines subissant des modifications post-traductionnelles, des structures multi-protéiques ou encore des voies enzymatiques jamais identifiées auparavant dans un virus, ce qui en font un modèle idéal pour l’étude de protéines récalcitrantes. Le but ultime de cette thèse, était de produire les protéines de capsides de Mimivirus. Le rôle de la protéine de capside dans l’assemblage de la particule virale, son infectivité et ses caractéristiques moléculaires sont d’une grande importance. Pour aller du gène à la protéine, J’ai participé à la compréhension de ce qui gouverne la terminaison de la transcription de Mimivirus et également participé à l'analyse globale du transcriptome au cours du cycle d'infection des amibes par Mimivirus. Nous avons montré que les transcrits de Mimivirus sont systématiquement polyadénylés dans des régions formant une structure secondaire en tige-boucle, même s’il n’existe pas de signal de polyadénylation canonique en amont. Nous en avons conclu que la polyadénylation de Mimivirus suit exclusivement une règle «épingle à cheveux». De plus, l’étude du transcriptome a révélé 3 phases temporelles distinctes dans le cycle infectieux: précoce, intermédiaire et tardive. Les transcrits de capsides sont tous exprimés durant la phase tardive mais leur profil d’expression ne sont pas superposables dans le temps. Les données de transcriptomique ont révélées la présence de plusieurs glycosyltransférases chez Mimivirus, dans la phase tardive du cycle, concomitant avec la production de la protéine de capside. Les informations recueillies sur l'expression des gènes à différents temps post-infection ont contribué à la conception de protocoles pour la production des protéines de capsides (la protéine majeure de capside (MCP) et ses paralogues) dans de systèmes eucaryoteDifficult to express proteins: a bottleneck for most biologists. I have chosen to use Acanthamoeba polyphaga Mimivirus as my study model. This giant dsDNA virus possesses post-translationally modified proteins, multi-protein structures and enzyme pathways never before seen in a virus, which makes it ideal for refractory studies. The ultimate goal of my thesis was to produce the capsid proteins of Mimivirus. The role of the capsid protein in the assembly of the viral particle, its infectivity, and molecular features are of great importance. To go from gene to protein, I participated in the comprehension of what governs the post-transcriptional termination in Mimivirus and equally participated in the global analysis of the transcriptome during the infectious cycle of Acanthamoeba by Mimivirus. We have shown that the Mimivirus transcripts are systematically polyadenylated in the regions forming a stem-loop secondary structure; even when a canonical poyadenylation signal is absent We concluded that Mimivirus polyadenylation obeys a strict “Hairpin rule”. Moreover, the transcriptomic study revealed three distinct temporal phases: early, intermediate and late. The capsid transcripts are all expressed during the late phase but their expression profiles are not superimposable. The transcriptomic data also revealed the presence of several Mimivirus glycosyltransferases in the late temporal phase, concomitant with the capsid proteins. The expression data gathered throughout my thesis has contributed to the rational design of a protein production experiment to produce the major capsid protein and its three paralogs in eukaryotic systems
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Baron, Michel. „Optimisation au niveau moléculaire de souches transformées de Tolypocladium geodes pour la sécrétion de deux protéines humaines d'intérêt thérapeutique“. Toulouse 3, 1991. http://www.theses.fr/1991TOU30143.
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Afin de demontrer les possibilites des champignons filamenteux pour la production de proteines recombinantes, deux modeles proteiques ont ete choisis possedant des applications en therapeutique humaine, le lysozyme et l'erythropoietine humain. Les premiers travaux abordes ont porte sur le developpement d'un systeme de transfert genetique chez t. Reesei et t. Geodes. Ce systeme est base sur l'expression heterologue du gene sh ble conferant un phenotype de resistance aux bleomycines et phleomycines. Afin de developper de nouveaux modeles d'excretion de proteines heterologues, l'activite de la proteine sh en fusion n et c terminale a ete analysee dans des proteines hybrides sh::gal et gal::sh. Dans les deux cas, la double fonctionnalite, activite sh et -gal a ete mise en evidence et correlee a la synthese de la proteine fusionnelle. Les possibilites de production de l'erythropoietine et du lysozyme humain par t. Geodes ont ete analysees. Les methodologies employees sont similaires dans les deux cas: genes synthetiques, vecteurs d'expression bases sur des fusions transcriptionnelles ou traductionnelles avec la proteine sh. L'excretion de la proteine epo par les transformants fongiques n'a pu etre mise en evidence. L'utilisation du modele fusionnel sh::epo a permis d'une part de detecter une synthese intracellulaire, d'autre part d'associer a l'absence de production extracellulaire des evenements proteolytiques affectant la proteine epo. Les resultats obtenus pour la production de lysozyme sont par contre tres positifs, cette proteine etant detectable extracellulairement quel que soit le modele d'expression utilise. Les meilleures productions ont ete observees dans les transformants fongiques exprimant la fusion sh ble::epo
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Nominé, Yves. „Caractérisation biophysique de la qualité des protéines de fusion : application à l'étude structurale et fonctionnelle de l'oncoprotéine virale E6“. Strasbourg 1, 2002. https://publication-theses.unistra.fr/public/theses_doctorat/2002/NOMINE_Yves_2002.pdf.
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"L'oncoprotéine E6 des papillomavirus humains (HPV) à " haut-risque " est à l'origine du cancer du col de l'utérus. Elle participe à l'oncogénèse notamment en dégradant p53, la protéine cellulaire suppresseur de tumeurs. Le but de la thèse était d'obtenir la structure tridimensionnelle par Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) de la protéine E6. Le manuscrit revient d'abord sur les différents états (micro- et macroscopique) d'une protéine globulaire en solution, et sur des notions telles que repliement et stabilité. Il rappelle ensuite les principes et limites de différentes techniques biophysiques appliquées à l'étude de protéines. Enfin, il décrit brièvement le contexte biologique de E6. Bien que sa séquence primaire soit connue depuis 1985, la protéine E6 n'avait pas encore été purifiée. Nous décrivons ici un protocole d'expression et de purification de cette molécule, en montrant tout d'abord que l'expression bactérienne de fusions MBP-E6 (Maltose Binding Protein) génère des " corps d'inclusion solubles ". Ces particules, engendrés par l'agrégation de protéines E6 mal repliées, restent toutefois en solution grâce à la haute solubilité de MBP. Grâce à ces observations, nous avons pu produire des échantillons de la protéine E6 entière soluble et repliée, puis de ses deux domaines à zinc. Nous avons finalement obtenu la détermination de la structure tridimensionnelle par RMN du domaine C-terminal de E6. L'amélioration de la qualité de E6 recombinante a permis également de démontrer l'interaction de E6 avec un motif structural d'ADN présent dans l'ADN cruciforme, puis de déterminer les paramètres cinétiques de cette interaction par BIAcore. Ce travail ouvre donc la voie à une meilleure compréhension moléculaire des modes d'actions de E6, et donc à de nouvelles stratégies de thérapie du cancer du col de l'utérus. De plus, nos méthodologies de contrôle et d'optimisation de la qualité des protéines de fusion sont généralisables à l'étude de toute protéine récalcitrante. "E6 is an oncoprotein produced by "high risk" Human Papillomaviruses (HPVs) involved in cervical cancers. E6 participates oncogenesis through different pathways, in particular by degrading the cellular tumor suppressor protein p53. The aim of this thesis was to solve the solution structure of E6 by Nuclear Magnetic Resonance (NMR). The introduction chapter first focuses on the different states (micro- and macroscopic) adopted by globular proteins in solution, including notions such as folding and stability. Then we record the principles, applications and limits of various biophysical techniques for the study of proteins. Finally, we briefly introduce the biological context of E6 protein. At the start of this work, E6 had never been purified although its sequence was known since 1985. In the results section, we first demonstrate that bacterial expression of E6 fused to the C-terminus of MBP (Maltose Binding Protein) generates " soluble inclusion bodies ". These particles, which originate from agregation of misfolded E6 moieties, remain soluble thanks to the high solubility of MBP moities. These observations have allowed us to produce soluble and folded samples of full-length E6 as well as its two zinc-binding domains. Finally, we have managed to solve the NMR structure of the C-terminal zinc-binding domain. On another hand, the optimized quality of our E6 samples have allowed us to demonstrate E6 binding to a particular DNA structural motif found in four-way DNA junctions. The kinetic parameters of this interaction have been determined by BIAcore. This work will provide a better understanding of the molecular pathways of E6 action and opens the way for new therapeutic strategies against cervical cancers. Furthermore, our methods for control and optimization of protein fusion quality can be generalized for future studies of other recalcitrant proteins
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Moreira, Tavares Eliana. „Mechanistic Study of D-loop Formation during Homologous Recombination by Molecular Microscopy“. Electronic Thesis or Diss., Université Paris-Saclay (ComUE), 2018. http://www.theses.fr/2018SACLS306.
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La Recombinaison Homologue (RH) est une des voies majeures, hautement fidèle, de réparation des cassures double brin de l’ADN et du redémarrage des fourches de réplication arrêtées ou bloquées. La RH utilise une séquence homologue pour réparer avec précision l'ADN. Elle est essentielle pour le maintien de la stabilité des génomes dans tous les organismes et également pour assurer la transmission et l'échange de l'information génétique pendant la méiose. L'étude mécanistique de la RH est importante pour comprendre l'instabilité génétique, la perte d'hétérozygotie, les aberrations chromosomiques, la mort cellulaire et la cancérogenèse associée à une RH déficiente. Les étapes clés de la RH et les protéines impliquées sont très conservées dans toutes les espèces. Chez Saccharomyces cerevisiae, la recombinase Rad51 forme un filament présynaptique avec l’ADNsb qui est capable de rechercher les homologies de séquences dans tout le génome, en partenariat avec d'autres partenaires protéiques. Une fois l'homologie identifiée, une structure de D-loop (pour Displacement loop) est formée pour favoriser l'échange de brins. Le moteur moléculaire Rad54 assiste Rad51 dans la formation de la D-loop. Son rôle dans la recherche d'homologie et la formation des complexes synaptiques, avant mêle la formation de la D-loop reste un sujet de débat. Cette thèse porte sur mes travaux d’étude in vitro des mécanismes de formation de la D-Loop, en utilisant des protéines de la RH purifiées Rad51 et Rad54 avec d'autres partenaires protéiques et des substrats d'ADN synthétisés, mimant les structures de la RH. J'ai utilisé la microscopie électronique (ME) pour visualiser directement l'ADN et les complexes ADN-protéines intervenant au cours de la formation de D-loop in vitro avec Rad51, Rad54 et un mutant de Rad54. Ces approches d’imagerie, combinées à la biochimie suggèrent que Rad54 est crucial pour la recherche d'homologie et la formation du complexe synaptique, avant la formation de la D-loop, dans une coopération étroite avec Rad51. J'ai également montré que les paralogues de Rad51, Rad55-Rad57, stimulent la formation de la D-loop et que cet hétérodimère présente une activité ATPase dix fois plus forte que Rad51. Par ailleurs, j'ai également développé d'autres outils méthodologiques en ME et en microscopie à force atomique à haute vitesse (HS-AFM) pour mieux caractériser différents intermédiaires de la RHHomologous recombination (HR) is a major high-fidelity DNA repair pathway of double-stranded breaks and recovery of stalled and collapsed replication forks. HR uses a homologous template to accurately repair DNA that is essential for maintaining genomic stability in all organisms and to ensure the transmission and exchange of the genetic information during meiosis. The importance of HR study is highlighted by genetic instability, loss of heterozygosity, chromosomal aberrations, cell death and carcinogenesis associated with a defected HR. The key recombinational stages and proteins are well conserved throughout species. In Saccharomyces cerevisiae, the Rad51 recombinase forms a presynaptic filament with ssDNA that along with other protein partners is able to search for homology within the entire genome. Once homology is identified, a Displacement-loop (D-loop) is formed to promote strand-exchange. The Rad54 molecular motor assists Rad51 in the D-loop formation, and it is still a matter of debate whether it also plays a key role in homology search and synaptic complex formation, prior to D-loop. This dissertation covers my in vitro assays using purified key HR proteins Rad51 and Rad54, other protein partners and designed DNA substrates, mimicking HR structures.I used electron microscopy (EM) to directly visualize the HR DNA and DNA-protein complexes generated by D-loop in vitro assay with Rad51, Rad54 and a Rad54 mutant, and these studies combined with biochemistry suggest Rad54 is crucial to homology search and synaptic complex formation, prior to D-loop formation, in a tight intercooperation by Rad51 and Rad54. In a multiprotein system, I also showed the Rad51 paralogs Rad55-Rad57 stimulate the D-loop formation and that this heterodimer presents a ten times stronger ATPase activity than Rad51. I also developed other EM and high speed atomic force microscopy (HS-AFM) methodological tools to characterize other HR intermediates
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Alout, Haoués. „Evolution de la résistance aux insecticides au locus ace-1 chez les moustiques“. Montpellier 2, 2009. http://www.theses.fr/2009MON20019.
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L'acétylcholinestérase (AChE) est une enzyme qui contrôle l'influx nerveux et est la cible des insecticides organophosphorés (OP) et carbamates (CX). Nous avons identifié les mutations du gène ace-1 qui sont impliquées dans la résistance aux insecticides chez les moustiques de plusieurs espèces. Trois mutations de l'AChE1 (G119S, F290V et F331W) ont été caractérisées biochimiquement et leur rôle dans la résistance a été démontré. La mutation G119S qui est la plus fréquente en populations naturelles confère une résistance plus forte et à un plus large spectre d'insecticides que les deux autres mutations. L'étude des séquences des différents allèles a confirmé que la mutation G119S s'est produite chez plusieurs espèces. La mutation F290V n'a été trouvée que chez Culex pipiens et s'est produite au moins 7 fois indépendamment dans le bassin méditerranéen. Enfin, la mutation F331W n'a été trouvée que chez Culex tritaeniorhynchus où elle semble fixée sur un transect de 2000 km en Chine. De plus, de nombreuses duplications associant une copie sensible et une copie résistante (G119S ou F290V) du gène ace-1 ont été mises en évidence dans les populations de C. Pipiens. Une duplication du gène ace-1 G119S a été également détectée chez Anopheles gambiae. Le petit nombre de mutations observé chez cinq espèces ainsi que l'existence de duplications supposées réduire le coût génétique associé à ces mutations suggèrent l'existence de contraintes importantes exercées sur l'AChE1. Ce constat nous a amené à rechercher de nouvelles molécules inhibant l'AChE1 G119S qui permettraient de contrôler les populations résistantes de C. Pipiens et d'An. GambiaeThe acetylcholinesterase-1 (AChE1) is a key nervous system enzyme, which is the target of organophosphorous and carbamates insecticides. We identified mutations at the ace-1 locus responsible for insecticide resistance in mosquitoes and characterized them biochemically. Only three mutations (G119S, F290V and F331W) were found in natural populations and the AChE1 G119S, which appears to be the most frequent, provides a broader spectrum of resistance. While the G119S mutation is present in several mosquito species, the F290V mutation was found only in C. Pipiens where it occurs seven times independently in the Mediterranean countries. The F331W was also found only in C. Tritaeniorhynchus where it appears to be fixed along a 2000 km transect in China. Additionally, several duplicated ace-1 alleles, associating a susceptible and a resistant copy (G119S or F290V) were detected in natural populations of C. Pipiens. The ace-1 duplication associated with the G119S mutation was also detected in An. Gambiae mosquitoes. The duplicated alleles are expected to reduce the fitness cost of these mutations. The low number of mutations found in five mosquito species and the existence of many duplicated alleles in natural populations suggest an important constraint on AChE1 enzyme. The probability to select for a further mutation responsible for resistance is very low. Then, we attempt to develop new chemical insecticides to control specifically the G119S AChE1 resistant mosquitoes in order to limit the selection for a new resistant mechanism
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Nars, Guillaume. „Dynamique fonctionnelle des protéines : études d'une lipase et d'une protéine A de la membrane externe de bactérie“. Thesis, Toulouse 3, 2015. http://www.theses.fr/2015TOU30111/document.
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La compréhension de la fonction des protéines et des systèmes biologiques passe par une connaissance fine des mécanismes moléculaires sous-jacents. La cristallographie et la résonance magnétique nucléaire permettent d'appréhender ces mécanismes au niveau atomique en fournissant des informations sur la structure et sur la dynamique des macromolécules biologiques. Nous nous sommes ainsi intéressés à deux protéines, la lipase lip2 de la levure Yarrowia lipolytica et la protéine membranaire OmpA de la bactérie Klebsiella pneumoniae. Nous avons recherché des conditions d'expression de la protéine lip2 marquée uniformément ou spécifiquement sur une boucle (appelée " lid ") afin d'en étudier la dynamique. Des conditions de marquage uniforme à l'azote 15 de lip2 recombinante dans Yarrowia lipolytica ont été mises au point, mais le marquage acide aminé spécifique n'a pu être réalisé à cause de phénomènes de dilution isotopique trop importants dans cette levure. Nous avons résolu par cristallographie aux rayons X la structure du domaine C-terminal de la protéine OmpA et étudié sa dynamique en solution par RMN (techniques de relaxation 15N). Nous avons caractérisé la dynamique de son domaine N-terminal membranaire reconstitué en liposomes par RMN du solide : en utilisant la rotation à l'angle magique à 60kHz et à la détection 1H sur un spectromètre 1 GHz, nous avons pu attribuer une majorité des résonances du tonneau ? et établir un profil de paramètre d'ordre des vecteurs NH. Des expériences de protéolyse ménagée ont révélé par ailleurs un site de coupure unique à la trypsine au sein de la boucle extracellulaire L3. Enfin, une première caractérisation de la protéine complète exprimée dans la membrane externe d'Escherichia coli a été entreprise par RMN du solide sur membranes externes nativesUnderstanding the function of proteins and biological systems requires an accurate knowledge of the underlying molecular mechanisms. Crystallography and nuclear magnetic resonance provide a detailed description of these mechanisms, with an atomic resolution, by providing data on both structures and motions. We investigated two proteins, the lip2 lipase from the yeast Yarrowia lipolytica and the membrane protein OmpA from the bacteria Klebsiella pneumoniae. We tried to produce lip2 with uniform and amino-acid specific stable isotope labelling on its functional loop (the lid) for NMR experiments. The homologous recombinant expression in Yarrowia lipolytica turned out to be the most efficient for uniform labelling but failed for specific labelling due to extensive isotope scrambling. We solved the structure of OmpA C-terminal domain by X-ray crystallography, and analyzed its dynamics in solution by NMR (15N relaxation techniques). We characterized its transmembrane N-terminal domain in proteoliposomes by solid state NMR: using state of the art ultra-fast MAS (60 kHz), 1H detection and a 1 GHz spectrometer, we could assign most ?-barrel resonances and establish a NH order parameter profile. In a complementary approach, we used proteolysis to reveal a unique trypsin cleavage site on the extracellular loop 3. Finally, a first characterization of the full-length protein expressed in the outer membrane of Escherichia coli was initiated by solid state NMR on intact outer membranes
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So, Ayeong. „RAD51 Protects Against RAD52-Dependent Non-Conservative Double-Strand Break Repair Processes, by Impeding the Annealing Step“. Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2018. http://www.theses.fr/2018SACLS171.
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Les cellules utilisent deux stratégies principales pour réparer les cassures double-brin (CDB) de l’ADN : la recombinaison homologue (RH) et la ligature d’extrémités non homologues (NHEJ). D’autres voies de réparation plus minoritaires existent qui mènent nécessairement à des altérations génétiques : Single Strand Annealing (SSA) et Alternative End Joining (A-EJ). Nous avons proposé que le choix entre les mécanismes de réparation des CDB nécessite deux étapes : 1) la compétition entre C-NHEJ et la résection, 2) sur les extrémités d’ADN résectées, la compétition entre RH, A-EJ et SSA. Ici, nous avons étudié la régulation de la deuxième étape de ce choix. En outre, la létalité synthétique a été décrite entre RAD52 et BRCA2/PALB2. Étant donné que BRCA2 et PALB2 sont nécessaires pour le chargement de RAD51 sur l’ADN simple brin, cela suggère que la formation d’un nucléofilament RAD51/ADNsb ordonné et RAD52 sont des acteurs essentiels dans le choix de la réparation à la deuxième étape. Nous avons trouvé que l’extinction de RAD51 ou BRCA2 stimule à la fois le SSA et EJ, d’une manière épistatique et que RAD52 contrôle la stimulation de SSA et A-EJ, en absence de RAD51. De plus, par séquençage haut débit, nous montrons que l’inhibition de RAD51 induit une instabilité génomique médiée par la microhomologie au niveau du génome. Cependant l’inhibition de RH n’est pas la réparation directe suffisante vers SSA et A-EJ. En effet, en utilisant des mutants dominants négatifs de RAD51, nous avons trouvé que les mutants du site de fixation/hydrolyse de l’ATP inhibent la RH et stimulent le SSA et que la chimère SMRAD51, qui inhibe la RH, inhibe également le SSA et EJ. Par TEM, nous avons observé que SMRAD51 perturbe spécifiquement la structure de l’ADNsb/SMRAD51. De l’autre côté, deux mutants d’hydrolyse de l’ATP de RAD51 ont montré que la liaison à l’ATP et l’hydrolyse d’ATP sont nécessaires pour une charge efficace de RAD51 sur l’ADN endommagé, dans les cellules vivantes. Ces deux mutants d’ATP ne se fixent pas à l’ADN en opposition à SMRAD51. Enfin, nous montrons que RAD51 n’empêche pas la résection étendue, mais que, in vitro, la protéine RAD51 empêche l’annealing de l’ADNsb complémentaire. Au total, les données montrent que RAD51 joue effectivement un rôle crucial dans la deuxième étape du choix de la voie de réparation des CDB à travers deux mécanismes distincts : 1- il déclenche la RH par son activité catalytique, 2- mail il empêche également les mécanismes non conservateurs dépendants de RAD52, SSA et A-EJ, en altérant l’étape de l’annealing. Par conséquent, le choix en deuxième étape entre la RH et les mécanismes mutagènes, SSA et A-EJ, est orchestré par un antagonisme entre RAD51 et RAD52Cells use two primary strategies to repair DNA double-strand break (DSB): Homologous Recombination (HR) and Non-homologous end joining (NHEJ). Beside other mechanisms exist that necessarily lead to genetic alterations: Single Strand Annealing (SSA) and Alternative End Joining (A-EJ). We have proposed that the choice between DSB repair mechanisms requires two steps: 1) competition between C-NHEJ and resection; 2) on resected DNA ends, competition between HR, A-EJ and SSA. Herein we investigated the regulation of the second step of this choice. Furthermore, synthetic lethality has been described between RAD52 and BRCA2/PALB2. Since BRCA2/PALB2 are required for the loading of RAD51 onto the ssDNA, suggesting that both the formation of an ordered RAD51/ssDNA nucleofilament and RAD52 are central players in the choice of repair at the 2nd step.We found that silencing RAD51 or BRCA2 stimulate both SSA and EJ, in an epistatic manner and that silencing RAD51 induced microhomology mediated genomic instability at a genome wide level. Moreover, we show that RAD52 controls the stimulation of SSA and A-EJ, upon RAD51 silencing. However inhibition of HR is not sufficient redirect repair toward SSA and A-EJ. Indeed, using dominant negative mutants of RAD51 we found that the chimera SMRAD51, which inhibits HR, also inhibits SSA and EJ. By TEM we observed that SMRAD51 specifically disrupts the structure of the ssDNA/SMRAD51. On the other side, two ATP hydrolysis mutants of RAD51 showed that ATP binding and hydrolysis is required for efficient loading of RAD51 on damaged DNA, in living cells. These two ATP mutants that do not bind DNA in opposition to SMRAD51, do not inhibit A-EJ and stimulate SSA. Finally we show RAD51 do not prevents extended resection, but that, in vitro, RAD51 protein prevents the annealing of complementary ssDNA.Altogether the data show that RAD51 indeed plays a pivotal role in the second step of DSB repair pathway choice through two separable mechanisms: 1- it triggers HR through its catalytic HR activity 2- but it also prevents RAD52-dependent non-conservative mechanisms SSA and A-EJ, by impairing the annealing step. Therefore, the choice between HR and alternative mutagenic mechanisms A-EJ and SSA (2nd step) is orchestrated by an antagonism between RAD51 and RAD52
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Martin-Vandelet, Nathalie. „Inhibiteur inter-alpha de la trypsine : assemblage et sécrétion des chaînes recombinantes dans les cellules COS“. Rouen, 1998. http://www.theses.fr/1998ROUES009.
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Les protéines de la famille de l'inhibiteur inter-α de la trypsine (ITI) humain sont synthétisées et structurées dans le foie à partir de 4 précurseurs protéiques : 3 chaînes lourdes H1, H2, H3 et une chaîne légère L. Ces précurseurs maturent et donnent naissance aux formes HC et à la bikunine. Trois protéines de cette famille ont été identifiées dans le plasma humain : l'ITI, l'inhibiteur pré-α de la trypsine (Pαl) et la protéine HC2-bikunine. Les chaînes constitutives de ces protéines sont assemblées par une structure covalente particuliére, de nature glycosidique, composée de glycosaminoglycanne. Cette liaison, une fois constituée, est intitulée Protéine-Glycosaminoglycanne-Protéine ou PGP. Compte-tenu de la complexité de la structure de ces protéines, nous avons mis en oeuvre un système original de transfection permettant l'expression des chaînes recombinantes H1, H2, H3 et L dans les cellules COS. La première partie de notre étude porte sur la biosynthèse de chaque chaîne constitutive des protéines de la famille de l'ITI en utilisant le modèle de transfection transitoire dans les cellules COS. Chaque chaîne possède une synthèse et une maturation indépendantes des autres chaînes (à l'exception de H2). La seconde partie de notre étude tend à mettre en évidence les mécanismes d'assemblages des chaînes H1, H2, H3 et L dans le but de générer les protéines de la famille de l'ITI. Dans notre système, quelle que soit la combinaison engageant la chaîne H1, la forme HC1 n'est jamais observée dans une protéine pluricaténaire. La maturation de H1 en HC1 et l'assemblage de HC1 au sein des protéines pluricaténaires se feraient selon un mécanisme différent de ceux des chaînes H2 et H3. Les chaînes H2 et H3 possèdent des comportements opposés au cours de l'assemblage. Le clivage de la chaîne H3 précéderait l'assemblage, alors que celui de H2 serait concomitant ou postérieur à son assemblage au sein des protéines pluricaténaires. D'autre part, la protéine Pαl observée dans notre modèle apparaît être un produit de synthèse alors que la protéine HC2-bikunine qui n'est jamais observée dans notre système représenterait un produit de dégradation de la forme ITI-like. La réalisation de la liaison originale PGP commune aux protéines pluricaténaires de l'ITI, ne nécessite pas la machinerie cellulaire de l'hépatocyte.
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Mevelec, Marie Noëlle. „Caractérisation du gène codant pour GRA4, protéine de granules dnses de Toxoplasma gondii et expression sous forme de protéines recombinantes procaryotes : antigénicité-immunogénicité“. Tours, 1995. http://www.theses.fr/1995TOUR3805.
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Iatmanen, Soria. „Production et caractérisation structurale et fonctionnelle de la protéine membranaire recombinante TSPO“. Thesis, Paris 6, 2014. http://www.theses.fr/2014PA066561/document.
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La TSPO préalablement connue sous le nom de récepteur périphérique aux benzodiazépines (PBR), est une protéine membranaire principalement impliquée dans le transport du cholestérol du cytosol vers la matrice des mitochondries, étape limitante dans la synthèse des stéroïdes et des sels biliaires.La production de la forme murine de la TSPO recombinante a été réalisée par un plasmide exprimé dans la bactérie Escherichia coli. La purification a été obtenue par colonne d'affinité grâce à l'étiquette polyhistidine codée dans le gène recombinant. Différents environnements mimétiques membranaires, détergents, lysodérivés, lipides ont été testés d'un point de vue structural et fonctionnel. Parmi les détergents étudiés, la dodécyl phosphocholine (DPC) a permis le meilleur repliement de la protéine. L'ajout de lysodérivés (LMPE) ou de phospholipides (DMPC/DMPE) a permis d'accroître la stabilité. La liaison des ligands spécifiques de la TSPO (PK 11195, cholestérol, protoporphyrine IX) a été observée dans plusieurs conditions étudiées par différentes approches biophysiques et biochimiques. Les trois approches structurales (ME, RX et RMN) ont pu être réalisées après optimisation des conditions de production et de stabilisation. Les résultats obtenus sont discutés en lien avec la structure de la TSPO publiée ces derniers mois. En parallèle à l'étude structurale, des mesures fonctionnelles par mutagenèse dirigée ont été réalisées afin d'obtenir des informations sur la liaison du ligand PK 11195. Ces données ont été confrontées à la structure récemment déterminée permettant de proposer un rôle pour les résidus mutés. Le mécanisme de transport du cholestérol par la TSPO est discutéTSPO previously named peripheral-type benzodiazepine receptor (PBR) is a membrane protein mostly involved in cholesterol transport from the cytosol to the matrix of mitochondria, a limiting step in steroids and bile salts biosynthesis.Production of recombinant mouse TSPO has been performed by plasmid expression in Escherichia coli bacteria. Purification has been obtained by immobilized affinity chromatography (IMAC) using polyhistidine tag encoded by recombinant gene. Various membranous mimetic environments such as detergents, lysoderivates, lipids have been tested from structural and functional point of view. Among tested detergents, dodecyl phosphocholine (DPC) has permitted the best protein refolding. The presence of lysoderivate (LMPE) or phospholipids (DMPC/DMPE) increased protein stability. Binding of TSPO high affinity ligands (PK 11195, cholesterol, protoporphyrin IX) has been measured in different conditions studied by biochemical and biophysical techniques. Three structural approaches (EM, XR and NMR) have been performed after optimization of production conditions and protein stabilization. Results gained have been discussed in line with TSPO atomic structure published within these last months. In parallel with structural studies, functional measurements have been carried out by site directed mutagenesis in order to gain data on binding site of PK 11195. These data have been faced with recently published TSPO atomic structure stabilized with this ligand and enabled to propose functional implication of mutated amino acids. Transport mechanism of cholesterol by TSPO is discussed
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Mamigonian, Bessa Luíza. „Investigation of the hepatitis C virus RNA polymerase NS5B in solution by nuclear magnetic resonance and its interaction with intrinsically disordered domain 2 of the NS5A protein“. Thesis, Lille 1, 2017. http://www.theses.fr/2017LIL10117/document.
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NS5B est l’ARN polymérase du virus de l’hépatite C (VHC). Sa structure a beaucoup été étudiée par radiocristallographie, elle contient trois sous-domaines appelés doigts, paume et pouce. Cependant, les études structurales de cette protéine en solution sont très limitées. La résonance magnétique nucléaire (RMN) a été utilisée pour étudier NS5B en solution ainsi que son interaction avec différents partenaires. L’emploi d’un échantillon de NS5B (65kDa) perdeuterée et sélectivement enrichie au niveau des méthyles 1 des résidus d’isoleucines a permis d’obtenir un spectre simplifié et de bonne qualité. Cette étude a confirmé la présence d’une dynamique particulière dans le pouce et a permis de mettre en évidence des effets à longues distances que se transmettent aux autres sous-domaines. Cette approche a alors été utilisée pour étudier l’interaction entre NS5B et le domaine 2 de la protéine NS5A (NS5A-D2) du VHC. Celui-ci est un domaine intrinsèquement désordonné qui interagit directement avec NS5B in vitro. Nous avons identifié que NS5A-D2 se lie via deux sites d’interaction sur le sous-domaine du pouce. Puisqu’un de ces sites est le site de liaison de l’inhibiteur allostérique filibuvir, nous avons étudié la liaison de cette molécule à la polymérase. Sa liaison cause des effets à longues distances tout au long de NS5B. Enfin, nous avons caractérisé la liaison d’un ARN simple brin à NS5B et nous avons identifié que NS5A-D2 et filibuvir réduisent mais ne suppriment pas l’interaction de NS5B avec l’ARN. L’analyse de NS5B par RMN en solution a permis d’étudier des interactions et d’accéder à des paramètres dynamiques très complémentaires des études cristallographiquesNS5B is the hepatitis C virus (HCV) RNA-dependent RNA polymerase. This protein has been extensively studied by X-ray crystallography and shows an organization in three subdomains called fingers, palm and thumb. Whereas static crystallographic data are abundant, structural studies of this protein in solution are limited. Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy was used to study the 65 kDa NS5B in solution as well as its interaction with binding partners. It was characterized using selective isotopic labeling of isoleucine side-chain methyl groups, which gives rise to a simplified NMR spectrum with an improved signal-to-noise ratio. This characterization confirmed the presence of particular dynamics in the subdomains, especially in the thumb, as well as long-range effects that are transmitted through to other subdomains. Furthermore, this system was used to investigate the binding of the domain 2 of NS5A (NS5A-D2), a disordered domain of another HCV protein that has been shown to directly interact with NS5B in vitro. With paramagnetic relaxation enhancement experiments we showed that NS5A-D2 binds to NS5B via, at least, two binding sites on the thumb subdomain. As one of these sites was the binding site of allosteric inhibitor filibuvir, we characterized the binding of this small molecule to NS5B by NMR and found long-range effects of its binding throughout the polymerase. Finally, we studied the binding of a small RNA template strand to NS5B and found that both NS5A-D2 and filibuvir reduce but do not abolish the interaction between the polymerase and RNA. In sum, NMR spectroscopy was used to study dynamic properties of NS5B and its interactions with binding partners
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Girard, Loïc. „Expression d'une protéine recombinante humaine dans des cellules végétales :le CD14“. Rennes 1, 2003. http://www.theses.fr/2003REN10108.
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Le travail réalisé durant cette thèse a permis de démontrer la possibilité de produire du CD14 par des cellules végétales cultivées en suspension. L'ADNc cd14 a été inséré dans le génome de la cellule végétale sous le contrôle du promoteur CaMV35S, a été transcrit et l'ARNm en résultant a été reconnu par la machinerie traductionnelle. Cette intégration du transgène dans le génome est un événement stable puisque la protéine a été détectée 2 ans après la transformation des cellules. Deux clones exprimant du CD14 ont été mis en évidence par western-blot et les distances de migration sur gel de polyacrylamide laissent à penser que ces protéines sont glycosylées. Les faibles taux d'expression constatés (entre 2,5 et 10 æg/L) ne permettent pas encore d'analyses complémentaires nécessaires pour déterminer l'intégrité et la fonctionnalité de la protéine. La sécrétion de la protéine semble effective, que ce soit en utilisant un peptide signal végétal ou humain.
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Noizet, Mildred. „Etude d'une protéine recombinante impliquée dans la formation de structures menbranaires : expression de la protéine de fusion IBV M-GUS dans des cellules de tabac“. Compiègne, 2001. http://www.theses.fr/2001COMP1348.
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La production de protéines hétérologues dans les plantes est maintenant possible grâce à la technique de transfert de gènes. Néanmoins, le rendement reste faible et nécessite d'être amélioré. L'adressage et la séquestration dans un compartiment cellulaire particulier est un moyen de favoriser la stabilité des protéines recombinantes et donc d'augmenter leur taux de production. Un nouvel organite observé dans les cellules de tabac transformées par le gène chimérique ibv m- gus pourrait devenir un lieu de stockage intéressant. Cet organite est constitué de tubules de réticulum endoplasmique superposées et enroulées formant une structure concentrique de diamètre d'environ 1,5 pm. Sa formation serait la conséquence d'un mécanisme d'auto-assemblage induit par les propriétés de tétramérisation de la protéine GUS qui permettrait un rapprochement des membranes. Ce système, déjà mis en évidence par une autre équipe, a été reproduit sur le cultivar de tabac SRI. Différents tissus différenciés (feuilles et racines) et indifférenciés (cals) ont été étudiés afin de mettre en évidence la plus forte expression de la protéine 1BV M- GUS. Les tissus indifférenciés, sous forme de cals, semblent accumuler des organites artificiels en grandes quantités. Ce phénomène est particulièrement intéressant sachant la rapidité de croissance des cellules indifférenciées. Après la mise en suspension cellulaire des cals, l'étude de ces cellules au cours d'un cycle de culture a montré une augmentation de l'expression du gène ibv m-gus au cours de la culture avec une forte expression en phase stationnaire de croissance, correspondant à une accumulation des protéines 1BV M-GUS. Celles-ci semblent protégées des dégradations par leur insertion dans la membrane des organites adificiels. L'utilisation de ces compartiments cellulaires serait susceptible d'ouvrir de nouveaux horizons pour la production et la récupération de protéines recombinantes stables dans les plantes.
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Hounsa, Charlemagne-Gilles. „Optimisation en milieu minimum de la production d'une pectate lyase de bactéroïdes clonée chez Escherichia coli“. Lille 1, 1994. http://www.theses.fr/1994LIL10006.
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L'etude a porte sur l'optimisation en milieu minimum de la production d'une pectate lyase (ec 4. 2. 2. 2) de bacteroides thetaiotaomicron 217 clonee chez escherichia coli hb101 (pbt4). Cette etude nous a conduit, a partir de l'utilisation de deux types de plans d'experiences factoriels a deux niveaux inspires du modele de box-wilson (1951), a rechercher les facteurs pouvant influencer la production de l'enzyme. Nos resultats ont montre que l'extrait de caseine, le glucose et le magnesium sont les constituants du milieu les plus influants sur la production de pectate lyase. Ces deux plans ont ete completes par la methodologie de reponse de surface de doehlert (1970) qui nous a permis de determiner la bonne combinaison des concentrations de glucose et de magnesium pour une meilleure production de pectate lyase. Le plasmide pbt4 est plus stable a 30c qu'a 37c, meme en presence de tetracycline et d'ampicilline utilises comme pressions de selection. Un plan factoriel d'experiences de type 2#4 nous a permis de montrer que la presence simultanee de tetracycline, d'ampicilline et de glucose dans le milieu de culture contribue a une meilleure stabilite du pbt4 chez e. Coli hb101 et a une meilleure reproductibilite dans la production de la pectate lyase. Apres 8 heures de culture en fermenteur, les concentrations du glucose et des sels d'ammonium sont reduites de moitie. Le reajustement de leurs concentrations entraine une augmentation de la production de biomasse accompagnee d'une diminution importante de celle de pectate lyase. Sachant que la production d'acetate, que nous avons observee lors de la croissance de la cellule recombinee, est un des principaux facteurs limitant la production de biomasse et de pectate lyase en fermenteur, nous avons etudie l'influence de l'addition de l'extrait de levure a 1 g/l ou du 3-bromopyruvate a 50 m sur la production de l'acetate par e. Coli hb101 (pbt4). Bien que ces deux substances reduisent de facon importante la quantite d'acetate produite dans le milieu de culture suivant des mecanismes differents, seul l'extrait de levure a permis une production de 3,7 g/l de biomasse et de 670 unites de pectate lyase par millilitre de culture en fermenteur. Ainsi, par etapes successives, nous sommes parvenus a augmenter la production de pectate lyase par la cellule recombinee d'environ 21 fois en erlenmeyers puis ensuite de 3 fois en fermenteur.
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Fournel, Tutik. „Production of recombinant E6 protein of HPV type 16 responsible for cervical cancers : identification and characterization of specific interaction between E6 protein and four-way DNA junctions“. Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008), 2001. http://www.theses.fr/2001STR13171.
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Senay, Claire. „L'UDP-glucuronosyltransférase hépatique humaine, l'UGT1A6 : étude mécanistique et structurale de la protéine recombinante“. Nancy 1, 1997. http://www.theses.fr/1997NAN12165.
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Les UDP-glucuronosyltransférases appartiennent à une famille d'enzymes membranaires impliquées dans le métabolisme des médicaments de substances endogènes (hormones, bilirubine) et la synthèse de macromolécules polysaccharidiques (glycosaminoglycanes). Nous avons développé la caractérisation du site actif de l'UDP-glucuronosyltransférase hépatique humaine glucuronoconjuguant les composés phénoliques plans, l'UGT1A6. L'enzyme recombinante est exprimée de façon stable dans les cellules V79. Au cours de ce travail, la modification chimique de cette enzyme par des inhibiteurs irréversibles tels que les carbodiimides ou la butanedione à permis de mettre en évidence la présence de résidus arginine, aspartique/glutamique impliqués dans la réaction de glucuronoconjugaison. La position de ces acides aminés essentiels a été postulée par alignement de séquence d'après leur conservation entre isoformes. La mutagenèse dirigée de ces résidus a été réalisée. Elle a permis de confirmer la contribution importante des résidus His 54 et Arg 52 dans la réaction de glucuronoconjugaison, après caractérisation des mutants en termes cinétiques et immunologiques. [. . . ]
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Laqueyrerie, Anne. „Clonage du gène codant pour les antigènes de 45/47 KDA de "Mycobacterium tuberculosis" et expression dans "M. Smegmatis" et "E. Coli"“. Paris 5, 1994. http://www.theses.fr/1994PA05P009.
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Antil-Delbeke, Stéphanie. „Quels sont les déterminants moléculaires impliqués dans la spécificité d'interaction de neurotoxines pour les récepteurs nicotiniques de type musculaire et neuronal de type alpha7 ?“ Paris 5, 2000. http://www.theses.fr/2000PA05P617.
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Rivera-Madrid, Renata. „Caractérisation du système thiorédoxines h thiorédoxine réductase chez Arabidopsis thaliana“. Perpignan, 1994. http://www.theses.fr/1994PERP0186.
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Nous avons caracterise chez arabidopsis thaliana cinq adnc differents codant pour des thioredoxines h et deux adnc codant pour des thioredoxines reductases nadph dependantes. Ces proteines font partie d'un systeme thioredoxine/thioredoxine reductase nadph dependant, qui presente des analogies avec celui qui existe chez la plupart des micro-organismes non photosynthetiques ainsi que chez les animaux. Les thioredoxines sont des proteines presentes chez tous les organismes elles ont des caracteristiques en commun telles que la thermostabilite, la masse moleculaire (12 kda), un site actif tres conserve cys-gly-pro-cys et l'aptitude a fournir des hydrogenes aux proteines cibles. La thioredoxine reductase (ntr) nadph dependante est une flavoproteine de 70 kda composee de deux sous unites dont chacune est associee a une molecule de fad. Arabidopsis est le premier organisme connu presentant un systeme thioredoxine/thioredoxine reductase aussi complexe. Son role dans le controle du metabolisme de la plante est discute. Nous avons montre que les cinq adnc qui codent pour des thioredoxines h ne presentent pas d'hybridation croisee. L'analyse des sequences en acides amines des proteines correspondantes, et leur comparaison avec les thioredoxines vegetales connues, indiquent que les cinq thioredoxines h d'arabidopsis thaliana derivent d'un ancetre commun et qu'elles ont diverge bien avant la separation des angiospermes en mono et dicotyledones. La surexpression des cinq sequences codantes de thioredoxines dans escherichia coli a permis de confirmer que les cinq clones codent pour des proteines presentant une activite thioredoxine in vitro. De plus elles sont preferentiellement reduites par la nadph thioredoxine reductase d'arabidopsis, ce qui confirme que ce sont des thioredoxines h. L'etude sur le niveau de l'accumulation des cinq transcrits et des proteines correspondantes dans la plante a montre que l'accumulation des arnm est differente de celle des proteines, ce qui suggere un controle traductionnel. Le fait que trois thioredoxines (trx2, trx3 et trx5) soient detectees essentiellement dans certains tissus en division de la plante (cellules en suspension, plantule in vitro, siliques boutons floraux) suggere une participation probable de ces proteines dans le processus de croissance. La presence d'une accumulation differentielle des thioredoxines et la detection des thioredoxines reductases a un niveau equivalent dans tous les organes de la plante chez arabidopsis laisse penser que c'est l'absence de la thioredoxine de certains tissus qui interrompt le couplage d'une voie metabolique a une disponibilite en nadph
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Maquaire, Sarah. „Caractérisation immunobiologique et moléculaire des antigènes d'excrétion-sécrétion de L. Amazonensis : interêt de la partie carboxyterminale des Promastigotes Surface Antigen dans une approche diagnostique ou vaccinale“. Montpellier 2, 2001. http://www.theses.fr/2001MON20103.
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Tahrat-Benslimane, Halima. „Études cinétiques de la production d'une fucosyltransférase soluble et instable par des cellules CHO recombinées : effet de différents paramètres physico-chimiques au cours de procédés discontinus et continus“. Vandoeuvre-les-Nancy, INPL, 2002. http://www.theses.fr/2002INPL012N.
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L'objectif général de ce travail est l'étude dans divers systèmes de cultures (boîtes de roux, flacon agité et fermenteur) du comportement d'une lignée cellulaire CHO recombinée et stable productrice d'une protéine hétérologue d'origine humaine: l' α 1/3-4 fucosyltransférase ou Fuc-TIII. Les performances de la cellule à produire la Fuc-TIII en culture discontinue, en mode statique et agité, ont été comparées et l'influence exercée par le sérum de veau fœtal, le glucose, les acides aminés et la température sur le métabolisme initial des principaux substrats et produits du milieu de culture a été testée. Le résultat le plus marquant de cette étude est l'influence de la température: l'évolution de l'activité Fuc-TIII produite a mis en évidence son caractère particulièrement instable au cours de la culture à 37ʿC. La mesure de la perte d'activité de l'enzyme lors de stockages à différentes températures a permis de calculer les constantes de dénaturation de l'enzyme à 34 et 37ʿC et ce afin d'établir des bilans réels de production au cours des cultures, et de déterminer les conditions optimales de sa stabilité. Il est apparu que l'activité enzymatique est maintenue stable pendant 100 jours à -80ʿC, 20 jours à 4ʿC et 7 jours à 37ʿC sous forme immobilisée. La présence du glycérol améliore aussi sa stabilité. Pour limiter la dénaturation thermique de la Fuc- TIII au cours des cultures, deux approches ont été développées: la diminution de la température de culture et la réduction du temps de séjour de cette enzyme en bioréacteur. Lorsque la température de culture en réacteur discontinu est diminuée de 37ʿC à 34ʿC l'activité enzymatique est améliorée d'un facteur 9. Des analyses par westem-blot ont permis de montrer que cette dégradation est indépendante d'activités protéasiques, mais probablement liée à une dénaturation conformationnelle irréversible de la Fuc- TIII. La réduction du temps de séjour de cette enzyme dans le réacteur perfusé a permis d'améliorer sa productivité (320 mU/h) d'un facteur 7 par rapport au mode discontinu et d'un facteur 5 lorsqu'on passe du mode continu au mode perfusé et de maintenir les cellules dans un état de productivité optimale sur une longue durée.
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Poenou, Géraldine. „Assemblage de la machinerie moléculaire de la coagulation : apprendre de l'évolution adaptative du Facteur X de venin de serpent“. Electronic Thesis or Diss., Sorbonne université, 2024. http://www.theses.fr/2024SORUS042.
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L'hémostase humaine est régulée par l'activité de complexes enzyme-cofacteurs macromoléculaires qui nécessitent une surface membranaire chargée négativement pour leur assemblage. Outre l'organisation spatiale des réactions de coagulation lors de lésions vasculaires, la formation du complexe FX / FV à la surface phospholipidique permet l'amplification de la conversion de la FIl en Flla. Cependant, les connaissances sur les mécanismes moléculaires précis du phénomène d'amplification de l'hémostase à la surface de membrane lipidique sont incomplètes. L'objectif est de préciser les connaissances des mécanismes moléculaires du peptide d'activation sur le FX, le rôle du domaine Gla de la sérine protéase le FXa et du variant résistant aux anticoagulants oraux directs (AOD) qui régulent l'assemblage des complexes enzyme-cofacteur, complexes conduisant à la coagulation sanguine. En particulier, dans ce travail de thèse est étudié : 1/ le rôle dans l'évolution de la longueur du peptide d'activation du FX du venin de serpent et notamment un rôle potentiel dans la vitesse d'activation du FX et de l'amplification du phénomène de coagulation. 2/ le rôle du domaine GLA de la sérine protéase le FXa lié à la surface des phospholipides, qui associé au facteur Va convertit la Flla en FIl, une étape clé de la coagulation sanguine. Des variantes de ces protéines présentant des propriétés procoagulantes améliorées peuvent être trouvées dans la nature, avec, comme exemple le plus frappant, les protéines FVa-Xa exprimées dans le venin du serpent commun australien Pseudonaja textilisHuman hemostasis is regulated by the activity of enzyme-cofactor complexes macromolecular molecules that require a negatively charged membrane surface for their assembly. In addition to the spatial organization of coagulation reactions during vascular lesions, the formation of the FX/FV complex on the phospholipid surface allows the amplification of the conversion of FIl to Flla. However, the knowledge on the precise molecular mechanisms of the phenomenon of amplification of hemostasis on the lipid membrane surface are incomplete. The objective is to clarify the knowledge of the molecular mechanisms of the peptide activation on FX, the role of the Gla domain of the serine protease Fa and the variant resistant to direct oral anticoagulants (DOACs) that regulate the assembly of enzyme-cofactor complexes, complexes leading to blood clotting. In this thesis is studied 1/ the role in the evolution of the length of the FX activation peptide of the venom of snake and in particular a potential role in the speed of activation of the FX and the amplification of the coagulation phenomenon. 2/ the role of the GLA domain of the serine protease FXa linked to the surface of phospholipids, which associated with factor Va converts Flla into Fil, a key step in blood clotting. Variants of these proteins exhibiting properties Enhanced procoagulants can be found in nature, with, as an example most strikingly, the FVa-Xa proteins expressed in common snake venom Australian Pseudonaja textilis
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Yvon, Stéphane. „Purification de protéines recombinantes du virus de l'hépatite C. Application au diagnostic“. Aix-Marseille 3, 1997. http://www.theses.fr/1997AIX30121.
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Le virus de l'hépatite C (VHC), découvert en 1988, est responsable de la plupart des hépatites non-A non-B à transmission parentérale. Véritable problème de santé publique, l'infection chronique par le VHC touche 1 à 2 % de la population française. Son dépistage est donc de la plus grande importance du fait d'un mode de contamination mal défini et de l'absence de vaccin. En absence d'antigène natif, la mise au point d'un test de dépistage détectant les anticorps spécifiques du VHC présents dans les sérums des patients infectés nécessite l'obtention de protéines recombinantes du virus. La protéine structurale de nucléocapside (Core), la protéine d'enveloppe E2 et la protéine non structurale C33 possèdent de nombreuses régions antigéniques. L'objet de ce travail a donc été de développer des stratégiesde purification de ces protéines, surexprimées sous forme de protéines fusion, de les intégrer dans des applications diagnostiques (détection d'anticorps anti-VHC et antigénémie) et de sélectionner les constructions les plus adaptées au diagnostic du VHC. Fortement glycosylée, la protéine E2 est produite dans un système hétérologue eucaryote (cellules d'insectes infectées par un baculovirus recombinant) tandis que les protéines Core et C33 sont surexprimées chez Escherichia coli. Des constructions génétiques différentes en fusion avec un motif 6-His et incluant les acides aminés 1-48, 1-119, 1-120 et 1-191 de la protéine Core (191 acides aminés) ont été purifiées sur supports chromatographiques et par des méthodes électrophorétiques. La séquence nucléotidique de la protéine C 33 (272 ou 93 acides aminés) a été exprimée en fusion avec la glutathione S-transférase ou avec le motif 6-His et les protéines ont été purifiées sur des supports d'affinité. L'étude comparée des protéines GST-C33 (272 aa) et C33-H a montré que le système histidine aboutit d'une part à une purification plus aisée des protéines et d'autre part, à une augmentation de la sensibilité de détection des anticorps lors de l'utilisation de ces constructions C33 à des fins diagnostiques. La sensibilité de détection des immunoglobulines anti-Core est optimisée avec une protéine recombinante ne comprenant que les 119 premiers acides aminés de la protéine CoreThe Hepatitis C virus (HCV), first isolated in 1988, is the causative agent of most parenterally transmitte non-A, non-B hepatitis. Chronic HCV infection affects 1-2 % of the French population, and is a major public healthcare problem. The mode of contamination of HCV is poorly defined, and no vaccine is currently available, making detection of the disease essential. Since no native antigen has been isolated, the development of a screening test for the detection of HCV-specific antibodies present in the sera of infected patients requires recombinant proteins of the virus to be obtained. The structural nucleocapside protein (Core), the E2 envelope protein and the non-structural protein C33 possess numerous antigenic regions. The purpose of this research was therefore to develop purification techniques for these proteins, which are overexpressed in the form of fusion proteins, to integrate these techniques in diagnostic applications (detection of anti-HCV antibodies and antigenemia) and to select the constructions most adapted to HCV diagnosis. Highly glycosylated, the E2 protein is produced in a heterologous eucaryote system (insect cells infected with a recombinant baculovirus), whereas the Core and C33 proteins are overexpressed in Escherichia coli. Different genetic constructions in fusion with a 6-His tag, and including the amino acids 1-48, 1-119, 1-120 and 1-191 of the Core protein (191 amino acids), were purified on chromatographic supports and using electrophoretic techniques. The nucleotide sequence of the C33 protein (272 or 93 amino acids) was expressed in fusion with the glutathione S-transferase or the 6-His tag, and the proteins were purified on affinity supports. A comparative study of proteins GST-C33 (272 aa) and C33-H showed that the histidine system results in both easier purification of the proteins and increased detection sensitivity of the antibodies when using these C33 constructions for diagnostic purposes. The detection senstivity of anti-Core immunoglobulins is optimized with a recombinant protein which uses only the first 119 amino acids of the Core protein
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Giry-Lozinguez, Claire. „Etude fonctionnelle des collagènes FACITs par expression de protéines recombinantes“. Lyon 1, 1996. http://www.theses.fr/1996LYO10145.
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Les collagenes sont des proteines structurales de la matrice extracellulaire possedant un ou plusieurs domaines en triple helice. Ce sont des molecules homo ou heterotrimeriques. Lors de la formation d'une molecule de collagene, les trois chaines s'assemblent par leur extremite c-terminale, et ka triple helice progresse jusqu'a l'extremite n-terminale, a la maniere d'une fermeture a glissiere. Les evenements initiaux qui regissent ces processus sont encore meconnus (reconnaissance des chaines, selection). Nous avons etudie les parametres de l'assemblage des collagenes facits (ix, xii, xiv et xvi), qui sont caracterises par des domaines collageniques courts (col) interrompus par des domaines non collageniques (nc). Nous avons en particulier construit des chaines recombinantes du collagene ix, heterotrimerique, et avons etudie leur assemblage dans un systeme d'expression eucaryote. Les resultats obtenus montrent que la selection des chaines est assuree par les domaines col1 et nc1, et d'autre part par l'intervention de facteurs cellulaires. De plus, la concentration des chaines dans le reticulum endoplasmique semble etre un facteur determinant pour leur assemblage trimerique. La fonction des collagenes facits est a ce jour inconnue. Nous avons privilegie une approche par domaine de la fonction de ces collagenes. Pour cela, nous avons surproduit le domaine nc1 du collagene xiv de poulet dans un systeme bacterien. Nous montrons qu'il possede un site de liaison a l'epharine, et que ce site adopte une conformation en helice alpha en presence de son ligand
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Guinet, Fraize Marion. „Étude in vitro et in vivo du pouvoir immunogène de trois protéines recombinantes d'échinocoques“. Lyon 1, 2004. http://www.theses.fr/2004LYO10246.
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Exprimées au stade protoscolex des échinocoques, EgA31, EgTrp et FABP1 sont des protéines candidates pour une préparation vaccinale contre Echinococcus granulosus, agent de l'hydatidose, et Echinococcus multilocularis, agent de l'echinococcose alvéolaire. Le but de ce travail a été d'étudier l'immunogénicité de ces protéines recombinantes dans deux modèles : (1) un modèle in vitro développé en alternative à l'expérimentation chez l'hôte définitif qui consiste en un système de co-culture de cellules leucocytaires et entérocytaires humaines. Ce modèle permet une première approche du profil cytokinique Th1/Th2 en réponse à un antigène, (2) un modèle in vivo, la souris BALB/c où les réponses cellulaires et humorales ont été analysées. Globalement, dans les deux modèles, EgA31, utilisée seule ou en association avec l'une et/ou l'autre des protéines recombinantes candidates, génère un forte réponse mixte Th1 et Th2
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Selmane, Tassadite. „Etude de l'interaction des protéines reca d'Escherichia coli et xrad51. 1 de xenopus laevis avec l'ADN et les nucléotides atp et adp afin de comprendre le mécanisme d'activation de ces protéines par le cofacteur ATP dans le processus de la recombinaison homologue“. Paris 13, 2001. http://www.theses.fr/2001PA132008.
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Les protéines reca et rad51, homologue eucaryotique, jouent un rôle crucial dans la conservation de l'intégrité du génome. Elles catalysent la recombinaison homologue. Reca intervient aussi dans le choix du processus de réparation de l'ADN alors que rad51 intervient dans la régulation de l'apoptose. Elles miment in vitro leurs fonctions en interagissant avec l'ADN et d'autres protéines et nécessitent de l'atp. Pour comprendre le mécanisme d'activation de reca par l'atp, j'ai examine l'effet de nucléotides sur l'interaction reca-ADN. Seuls les nucléotides triphosphates dont la base est une adénine stimulent l'interaction reca-ADN alors que les autres nucléotides, sauf utp, dissocient reca-ADN. D'après l'analyse de la structure cristallographique du complexe reca-adp, la base adénine de l'adp est proche du résidu tyr103 de reca. J'ai examine l'effet de remplacement de cette Tyr par d'autres acides amines aromatiques. Les protéines modifiées sont stimulées uniquement par les nucléotides ayant une adénine comme nucleobase, comme pour reca sauvage. Cependant, on observe une activation partielle par le nucléotide ctp de rad51 modifiée en tyr103 par un trp, alors qu'il inhibe l'activité de reca sauvage, confirmant l'importance de ce contact. J'ai aussi montre que le peptide l2 (résidus 195-209) de reca interagit avec l'ADN simple-brin de manière similaire a reca entière avec l'atp. Cette boucle est le centre catalytique de la réaction d'échange de brins d'ADN par reca et interagit avec l'ADN et l'atp. Ce résultat suggère que l'atp active reca via un changement de conformation de la boucle l2. Enfin, j'ai observé que rad51 de xenope interagit avec l'ADN de manière similaire à reca. J'ai examiné l'implication éventuelle de résidu
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Cheynet, Valérie. „De la détection du virus VIH-1 : protéines recombinantes et modèles cellulaires d'infection“. Lyon 1, 1994. http://www.theses.fr/1994LYO1T211.
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Crombez, Laurence. „Le TIMP-1 humain, une protéine multifacette : production sous forme recombinante et intérêt thérapeutique“. Université Joseph Fourier (Grenoble), 2006. http://www.theses.fr/2006GRE10006.
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Les TIMPs (Tissue Inhibitor of Metalloprokinases) sont lès inhihiteurs spécifiques des métalloprokases matricielles (MMPs). Ils participent à la regulation du remodelage matriciel, mais présentent aussi des fonctions indépendantes de cette activité (facteur de croissance, facteur de survie). A travers ces multiples facettes, la protéine TIMP-1 est impliquée dans des processus phvsiologiques et pathologiques. Nos objectifs sont de caractériser et d'utiliser les propriétés biochimiques de TIMP-1 afin d'évaluer son potentiel thérapeutique. Nous avons établi un protocole d'expression en système mammifère puis un schéma de purification de la protéine rh-TIMP-1 (recombinant human TIMP-1) nous permettant d'obtenir 30 mg/l de TlMP-1 pure, dépassant largement les taux dejà décrits. Ceci nous a permis d'évaluer son efficacité en tant qu'agent thérapeutique dans un modèle murin d'arthrite au collagène (mimant la polyarthrite rhumatoïde). Des analvses cliniques et sérologiques suggèrent un effet bénéfique des injections de rh-TIMP-1 à dose élevée contrairement aux doses faibles. Des investigations supplémentaires sont nécessaires pour déterminer le réel effet de TIMP-1. En parallèle, nous avons étudié la propriété de transduction de TIMP-1 dans les cellules tumorales. Nous avons montré que les acides aminés C-terminaux portent cette propriété et désormais nous devons optimiser ce processus et tester le transport d'une protéine thérapeutique (p. 53). Ce travail confirme l'intérêt biotechnologique de la proteine TIMP-1 en tant que navette et suggère l'intérêt thérapeutique potentiel qui nécessite des investigations additionnelles en particulier dans d'autres modèles pathologiquesTissue Inhibitor of Metalloproleinases (TIMPs) are specifie inhibitors of metalloproleinases involved in the regulation ofmatrix remodeling. TIMPs also present functions independent to their inhibitory role (growth and survival factors). Through these multiple activitics, TIMP-1, a member of the TIMPs, is involved in many physiologieal and pathological processes. The aim of this thesis was to characterise and exploit the biochemical properties of TIMP-1 to ultimately evaJuale its therapeutic potentiaL 1 developed a methodology for the expression and purification of a recombinant human TIMP-1. L'sing this procedure a total of 30mg/l of highly pure TIMPs was purified which represents a 30-fold increase ofpreviously published data. Therefore this mcthod could be specifically applied for the expression and puri fication of seerekd proteins. TIMP-1 was used in a mouse model of collagen induced arthritis to evaluate its efficiency as therapeutic agent. Clinical observations and serological analysis suggest a benefit of the TIMP-1 injections at high level. On the contrary, low doses of TIMP-1 show an increase in inflammation. Further work is required in order to determine the real effects of TIMP-1. Moreover we studied the transduction properties of TIMP-1 by following its uptake of TIMP-1 into tumoral cells. 1 demonstrated that the last 60 amino-acids of TIMP-1 are required for cell entry. Further work will require first the optimisation of TIMP-1 transduction efficiency and secondly, the characterization of cellular uptake of a therapeutic protein (p. 53)
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Allard, Laure. „Couplage orienté de protéines recombinantes sur des polymères de synthèse : étude des mécanismes et analyse de la bioréactivité“. Lyon 1, 2001. http://www.theses.fr/2001LYO10201.
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L'immobilisation de protéines peut être requise dans divers domaines d'application tels que le diagnostic médical ou la thérapie génique. Cependant, le processus d'immoblisation peut altérer l'activité biologique de la protéine. L'objectif de ce travail est la mise au point d'un système générique de couplage orienté de protéines recombinantes sur des polymères de synthèse permettant de conserver l'activité biologique après immobilisation. La protéine modèle retenue pour l'étude est la protéine p24 de capside du virus de l'immunodéficience humaine et le support d'immobilisation est un copolymère d'anhydride maléique et de méthyl vinyl éther. Le couplage, basé sur la réaction entre les amines primaires des protéines et les groupements anhydride maléique du polymère, conduit à la formation d'une laison amide. La réaction de couplage a été modulée par introduction de groupements réactifs (tags) sur la protéine et par hydrolyse ménagée du polymère. L'incidence de la composition et de la position du tag sur l'efficacité de couplage a été étudiée. Plus spécifiquement, il a été montré que l'efficacité du couplage est directement corrélé à la densité d'amines primaires et de charges dans le tag. Des mesures d'accessibilité d'épitopes et de sites de protéolyse ont permis de montrer l'incidence de la position du tag dans la protéine et de la densité de groupements réactifs sur le polymère sur la conservation des propriétés biologiques de la protéine immobilisée. Finalement, l'utilisation d'un bioconjugué protéine-polymère, en phase de capture dans un test ELIS, permet de détecter de très faibles quantités d'anticorps dans les sérums de patients infectés par le VIH-1, conduisant à une amélioration la sensibilité du testProtein immobilization is often required for many applications such as diagnostic or gene therapy. Nevertherless, the immobilization process may alter the biological activity of the protein. The aim of this work is to achieve a generic system allowing the control of the orientation of proteins covalently bound onto copolymers without loss of the biological properties. The model protein retained for the investigation is the HIV-1 p24 capsid protein and the immobilization support is a maleic anhydride alterned copolymer. The coupling reaction takes place between the primary amines of the protein and the anhydride moities of the polymer leading to the formation of an amid bond. Proteins were modified by introducing sequence tags coding for reactives residues and the reactivity of the polymer was decrease by partial hydrolysis. The influence of the composition and the position of the tag within the protein was investigated. We demonstrated that the coupling efficiency depends directly on the primary amine and charge density of the tag. Then, the biological activity of the immobilized proteins was investigated using monoclonal antibodies and anzymatic disgestion. The position of the tag and the reactivity of the polymer are the two main parameters involved in the preservation of the biological activity of the immobilized protein. Finaly, using a proteins -polymer bioconjugate as a capture phase in an ELISA test allows detection of lower antibodies level in HIV-1 positives sera leading to an enhancement of the sensivity of the test
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Bettan, Mickaël. „Transfert de gènes par électrotransfert dans le muscle squelettique et dans des modèles de tumeurs“. Paris, Muséum national d'histoire naturelle, 2000. http://www.theses.fr/2000MNHN0032.
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De nombreuses maladies sont liées à l'absence ou à une concentration insuffisante d'une protéine plasmatique. Actuellement, deux approches sont proposées pour corriger ces déficiences : l'injection répétée de protéines recombinantes ou la thérapie génique utilisant des vecteurs viraux ou non viraux. Les travaux présentés ici montrent une sécrétion élevée et prolongée de différentes protéines secrétées par le muscle de souris. Ces résultats ont été obtenus par l'application d'impulsions électriques d'onde carrée, de faible champ électrique (200 v/cm) et de longue durée (20 ms) à travers le muscle squelettique préalablement injecté avec un plasmide codant la protéine secrétée. Cette méthode d'électrotransfert intramusculaire permet d'augmenter de 30 à 150 fois la sécrétion d'une protéine rapporteuse comparée à l'injection d'ADN nu. Cette augmentation permet d'obtenir des taux élevés de protéines secrétées (2200 ng/ml de HSE AP). De plus, cette sécrétion élevée reste stable pendant plusieurs mois (au moins 12 mois). Grâce à cette technologie, nous avons pu obtenir des effets physiologiques et thérapeutiques en utilisant des plasmides codant l'érythropoietine ou l'hormone de croissance. L'électrotransfert de 200 g de plasmide COdant l'HGH dans le muscle de rats déficients en hormone de croissance a significativement accéléré leur croissance. De même, nous avons montré une amélioration du phénotype d'un modèle de -thalassémie après un seul électrotransfert de 20 g d'un plasmide codant l'érythropoietine dans le muscle de souris malades. Nous avons aussi montre qu'il était possible, en utilisant cette technologie, d'augmenter le transfert d'un gène rapporteur de 10 à 1200 fois dans différents modèles de tumeurs implantées par rapport à l'injection d'ADN nu. Toutefois, cette amplification du transfert de gènes n'a pas permis d'obtenir un effet antitumoral lors de l'électrotransfert d'un gène codant un peptide antiangiogénique, le fragment amino-terminal de l'urokinase
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Raymond, Frédérique. „Purification et caractérisation moléculaire de la protéine naturelle et recombinante P30 (SAG-1) de Toxoplasma gondii“. Lyon 1, 1998. http://www.theses.fr/1998LYO10053.
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Dans le domaine de la sante publique, la toxoplasmose est un probleme epidemiologique d'importance chez les femmes enceintes et les malades immunodeprimes. Le role antigenique majeur d'une proteine membranaire de toxoplasma gondii de 30 kda (p30 ou sag-1) a ete largement decrit. L'integration de cette proteine dans un kit de detection des immunoglobulines humaines antitoxoplasmiques presente un interet diagnostique. A cette fin, le gene de la p30 a ete clone et exprime chez la levure schizosaccharomyces pombe sous deux formes : p30 recombinantes glycosylee et non glycosylee (a 0,7 g/ml dans le milieu). Le but de ce travail a d'abord consiste a optimiser la culture de ces deux souches pour obtenir un niveau d'expression de proteines recombinantes acceptable. Ainsi, la fermentation en continu permet d'obtenir une biomasse superieure a celle observee lors de fermentations en batch. Puis les techniques chromatographiques (echange d'ions et immunoaffinite) permettant la capture et la purification des proteines a partir du milieu de fermentation ont ete testees a l'echelle analytique (5 a 50 ml). Pour l'industrialisation (2 a 4 litres) de ces deux etapes, trois strategies de purification ont ete comparees : - clarification et concentration du milieu avant les chromatographies ; - clarification et purification par chromatographies conventionnelles en colonne remplie ; - purification des milieux bruts, directement en sortie de fermenteur, par chromatographie en lit fluidise, en utilisant le systeme streamline. La premiere etape de purification sur sulfo-propyl permet d'obtenir un rendement variant de 50 a 95%, pour un facteur de purification de 3 a 100. La deuxieme etape de polissage par immunoaffinite presente un rendement d'environ 50% pour un facteur final de purification de 500 a 7000. La proteine est obtenue avec une purete de l'ordre de 80%. Enfin, la caracterisation moleculaire des p30 recombinantes et de la p30 native extraite de t. Gondii a ete realisee (etude serologique, electrophorese 2d, spectrometrie de masse, sequencage). Ce travail a permis d'une part le developpement de techniques de fermentation et de purification de p30 recombinantes transposables a l'echelle industrielle, et d'autre part l'evaluation de l'activite antigenique de p30 recombinante pour le diagnostic de la toxoplasmose.
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Vallet, Corinne. „Etude de l'organisation transcriptionnelle et de la régulation post-transcriptionnelle du groupe d'ORF codant l'érythrose 4-phosphate déshydrogénase, la phosphoglycérate kinase et la Fructose-1,6-bisphosphate aldolase de classe II chez Escherichia coli : Applications à la production de protéines recombinantes“. Nancy 1, 2005. http://docnum.univ-lorraine.fr/public/SCD_T_2005_0191_VALLET.pdf.
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Le triplet d'ORF Erythrose-4-phosphate déshydrogénase (E4PDH)-phosphoglycérate kinase (PGK)-fructose-1,6-bisphosphate aldolase (FBA), correspondant à trois enzymes intervenant dans le métabolisme du carbone, est retrouvé uniquement dans une partie des γprotéobactéries. Nous avons montré que, chez Escherichia coli, ce triplet d'ORF forme un opéron comportant un promoteur fortement régulé epd P0 et un promoteur étendu pgk P1. Les différents transcrits obtenus sont ensuite maturés par la RNase E au niveau des régions epdpgk et pgk-fbaA, ce qui conduit à une stabilité différentielle des différents transcrits, avec par ordre croissant de demie-vie epd, pgk et fbaA. Par des expériences en fermentation continue, nous avons montré que le taux d'expression des ORF epd, pgk, fbaA et gapA augmente lorsque le taux de croissance augmente. La faible production d'acide acétique par les bactéries possédant un transporteur EIIBCGlc inactif nous a conduit à tester si ces bactéries pouvaient être intéressantes pour la production de protéines recombinantes. Nous avons mis au point des conditions permettant d'obtenir une forte densité cellulaire et une forte production de protéines recombinantesThe Erythrose-4-phosphate déshydrogénase (E4PDH)-phosphoglycerate kinase (PGK)fructose-1,6-bisphosphate aldolase (FBA) ORF cluster, corresponding to three enzymes from carbon metabolism, is found in a part of the γ-proteobacteria. We showed that, in Escherichia coli, this ORF cluster is an operon with one strong regulated promoter epd P0 and one extended promoter pgk P1. The different transcripts are maturated by RNase E, in epd-pgk and pgk-fbaA region. This result in the differential stability of the transcripts, with by increasing half-life, epd,pgk and fbaA. By continuous fermentation, we showed that epd, pgk, fbaA and gapA expression increases with the growth rate. The low production of acetic acid form by strains with an inactivated transport protein EIIBCGlc led us to test whether they can be used for recombinant protein production. We developed conditions to get high cellular density and high level of recombinant protein production
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Lopez, Michel. „Contribution à l'étude du potentiel de glycosylation des lignées cellulaires d'insectes“. Lille 1, 1997. https://pepite-depot.univ-lille.fr/LIBRE/Th_Num/1997/50376-1997-529.pdf.
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La production de protéines recombinantes dans le système baculovirus/cellules d'insectes est aujourd'hui en plein essor. Au cours de nos travaux, nous avons étudié le potentiel de glycosylation des lignées de lépidoptères détenues par la société PROTEINE PERFORMANCE et l’INRA de St Christol-les-Alès. Premièrement, nous avons étudié les N-glycannes de la lactoferrine bovine produite chez Mamestra brassicae. La glycosylation est fonction du site de glycosylation, les sites porteurs de structures oligomannosidiques dans la glycoprotéine naturelle sont en majorité porteurs de structures oligomannosidiques lourdes (Man5-9GlcNAc2) dans la glycoprotéine recombinante. En revanche, le site Asn476 naturellement substitué par des glycannes N-acétyllactosaminiques est porteur pour une faible part de structures hybrides (Man3-4GlcNAc3) et, surtout de glycannes légers (Man2-3[Fuc0-1]GlcNAc2) pouvant provenir du catabolisme de structures N-acétyllactosaminiques en voie de biosynthèse. Dans un deuxième temps, nous avons étudié la O-glycosylation de trois lignées cellulaires au moyen de lectines et par la mesure des activités glycosyltransférasiques impliquées dans la biosynthèse des O-glycannes. Les lignées Spodoptera frugiperda et Trichoplusia ni expriment des O-glycoprotéines essentiellement substituées par l'antigène Tn (GalNAcAlpha1-O-Ser/Thr), que nous avons associé à une forte activité polypeptide N-acétylgalactosyltransférase. Par contre, l'activité core-1 Beta1,3-galactosyltransférase est très faible chez toutes les lignées de lépidoptères, ce qui explique la faible synthèse d'antigène-T (GalBeta1-3GalNAcAlpha1-O-Ser/Thr). La lignée Mamestra brassicae se singularise par la présence d'activité Alpha1,4-galactosyltransférase responsable de la synthèse de la structure O-glycannique GalAlpha1-4GalBeta1-3GalNAcAlpha1-O-Ser/Thr. Cette activité alpha-galactosyltransférasique nous a permis de synthétiser le composé GalAlpha1-4GalBeta1-3GalNAcAlpha1-O-benzyl qui est capable d'inhiber l'agglutination des hématies Pk1 et Pk2 par les anticorps anti-Pk, spécifiques du glycosylcéramide GalAlpha1-4GalBeta1-4GlcBeta1-Cer.
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Marinho, Paulo. „Thiorédoxines cytoplasmiques de Nicotiana tabacum : caractérisation biochimique, immunodétection et tests fonctionnels“. Perpignan, 1994. http://www.theses.fr/1994PERP0182.
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Les thioredoxines sont des oxydoreductases presentant un site actif caracteristique try cys gly pro cys. Elles existent chez tous les organismes et participent a des reactions multiples comme agents reducteur d'autres proteines. Chez les vegetaux, deux types de thioredoxines sont connues, cytoplasmiques (h-heterotophes) ou chloroplastiques, classees selon leurs compartimentation dans la cellule. L'objectif de notre travail etait de mieux caracteriser la thioredoxine h1 de tabac. Trois approches ont ete choisis: la production de la proteine dans e. Coli, afin de confirmer l'activite enzymatique, la production d'anticorps afin de la detecter dans la plante et dans les cultures de cellules et la construction de plantes transgeniques afin de progresser vers sa fonction. Nous avons demontre que la thioredoxine h1 presente une activite typique de thioredoxine activatrice de la mdh in vitro. L'etude par western blots de tissus vegetaux a montre que la proteine n'est presente que dans les cals et dans la suspension cellulaire, bien que les arn messagers soient presents dans tous les tissus meristematiques. Les plantes transgeniques obtenues, ne presentent aucun phenotype, la construction sens ayant ete perdue lors du transfert ou la construction antisens etant incapable de bloquer la synthese de la proteine. Ces resultats suggerent que la synthese de la thioredoxine h1 est necessaire a une etape de la vie cellulaire ou de la regeneration de plantes, et qu'elle doit etre bloquee a d'autres etapes
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Cabanes-Macheteau, Marion. „N-glycosylation d'un anticorps recombinant produit dans du tabac transgénique“. Rouen, 1998. http://www.theses.fr/1998ROUES071.
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La production de protéines recombinantes d'intérêt thérapeutique dans des plantes transgéniques connaît actuellement un essor considérable. En outre, des anticorps monoclonaux fonctionnels ont pu être exprimés dans du tabac transgénique. La plupart des protéines d'intérêt sont N-glycosylées et cette N-glycosylation est fondamentale à l'acquisition par la protéine de la conformation active. Afin d'évaluer la capacité des cellules de tabac à glycosyler des protéines recombinantes complexes, nous avons analysé dans un premier temps, la N-glycosylation de glycoprotéines endogènes de tabac, ainsi que la N-glycosylation d'une glycoprotéine modèle, l'invertase de carotte, exprimée de façon recombinante dans des cellules de tabac en culture. Puis, nous avons analysé la N-glycosylation d'un anticorps de souris, l'anticorps Guy's 13, dont l'expression dans du tabac transgénique a été réalisée par l'équipe de J. Ma (Guy's Hospital, Londres). Nous avons comparé la N-glycosylation des deux sites de N-glycosylation de l'anticorps Guy's 13 produit chez la souris ou dans du tabac transgénique. Cette étude a permis de démontrer que bien que les structures des N-glycannes diffèrent, la N-glycosylation introduit par la plante transgénique sur l'anticorps recombinant, est suffisante à l'acquisition d'une structure fonctionnelle. L'analyse structurale détaillée de l'anticorps recombinant associée aux résultats préliminaires obtenus par l'équipe de J. Ma sur l'activité biologique de cet anticorps, constitue la première étude comparée d'une glycoprotéine de mammifères produite dans une plante transgénique.
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Sans, Emmanuelle. „Étude du rôle de la protéine ICAM-1 dans l'extravasation des neutrophiles“. Grenoble 1, 2000. http://www.theses.fr/2000GRE10254.
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La diapedese leucocytaire est basee sur une cascade d'interactions adhesives etablies entre leucocytes et cellules endotheliales. L'adherence et la migration trans-endotheliale font intervenir des molecules adhesives de la superfamille des immunoglobulines, en particulier icam-1 dans l'adherence et pecam-1 dans la migration. La participation specifique de la proteine icam-1 a l'extravasation des leucocytes n'a jamais ete clairement demontree, du fait de son implication dans la phase precedente d'adherence, ainsi que de la multiplicite des recepteurs adhesifs presents sur l'endothelium. J'ai donc etabli un modele d'etude de l'adherence et de l'extravasation des neutrophiles, base sur l'utilisation de cellules cho recombinantes exprimant les proteines icam-1 et pecam-1 humaines, seules ou en combinaison. Ce modele m'a permis de demontrer le role specifique d'icam-1 dans la migration intercellulaire des neutrophiles et plus particulierement, l'implication de l'interaction fibriogene/icam-1 dans ce phenomene. La partie cytoplasmique d'icam-1 est indispensable pour cette fonction et met en jeu une voie de signalisation impliquant la proteine rho. Enfin, la mutation de l'acide amine d26 sur icam-1, qui est situe sur le site de liaison du fibrinogene, aboutit a l'inhibition de l'extravasation des neutrophiles.
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Roux, Lauriane. „Développement et validation d’un modèle cellulaire de kératopathie associée à l’aniridie“. Thesis, Sorbonne Paris Cité, 2018. http://www.theses.fr/2018USPCC276.
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L’aniridie est une pathologie rare principalement due à des mutations hétérozygotes sur PAX6, le gène contrôlant le développement oculaire et le maintien de l’homéostasie cornéenne. Elle est caractérisée par une hypo/aplasie de l’iris, des atteintes de la rétine et du cristallin. La totalité des patients atteints développe aussi une kératopathie associée à l’aniridie (KAA), conduisant à une opacification progressive de leur cornée. La KAA a pour origine un déficit en cellules souches limbiques et diverses perturbations de l’épithélium et du stroma cornéens. Actuellement, il n’existe ni traitement pour soulager efficacement les patients, ni modèle cellulaire pour cette pathologie. Afin de pallier ces manques, le système CRISPR/Cas9 a été utilisé pour intégrer une mutation hétérozygote non-sens dans le gène PAX6 de cellules épithéliales limbiques immortalisées. Les cellules mutées présentent une expression réduite de PAX6 et une modulation de celle de ses gènes cibles, un ralentissement de la prolifération, de la clonogénicité et de la migration ainsi qu’une adhésion accrue. De plus, nous avons montré qu’un traitement de ces cellules avec une protéine recombinante PAX6, portant un peptide de pénétration cellulaire, permet une induction de l’expression endogène de PAX6 et également une restauration partielle du phénotype décrit précédemment. Cette réversion phénotypique valide le modèle d’haploinsuffisance développé et suggère l’implication de PAX6 dans les différentes fonctions restaurées. Les cellules mutées peuvent maintenant être utilisées pour le criblage d’outils thérapeutiques potentiels pour la KAA et pour d’autres défauts liés à une diminution du dosage de PAX6Aniridia is a rare panocular disease mainly due to PAX6 heterozygous mutations. PAX6 is the master gene of the eye development and it controls also the corneal homeostasis maintenance. Aniridia is characterized by an iris hypo/aplasia, retina and lens defects. All the aniridia patients will also develop an aniridia-related keratopathy (ARK) leading to a progressive corneal opacification. ARK is due to a limbal stem cell deficiency and alterations of corneal epithelium and stroma functions. Unfortunately, there is currently no efficient treatment to relief the patients and no cellular model for this pathology. To remedy these lacks, CRISPR/Cas9 system was used to insert a nonsense mutation into PAX6 gene of immortalized limbal epithelial cells. The mutated cells produce less PAX6 than the wild-type and PAX6 targets gene expression was modulated. They also display a marked slow-down proliferation, clonogenicity, migration and an enhanced adhesion. Moreover, we have shown that addition of recombinant PAX6 protein fused to a cell penetrating peptide to the culture medium was able to activate the endogenous PAX6 expression and to rescue some phenotypic defects of the mutated cells. Therefore, it validates the PAX6 haploinsufficiency model and suggests that PAX6 could be involved in all the rescued functions. The mutated cells can now be used to screen potential therapeutic tools for ARK and for other defects due to low levels of PAX6
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Zaarour, Marwa. „Ré-allocation des ressources cellulaires pour la production de protéines hétérologues chez Bacillus subtilis“. Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2019. http://www.theses.fr/2019SACLS213.
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La synthèse de protéines recombinantes chez les microorganismes est d'un intérêt majeur pour la production de produits biopharmaceutiques, thérapeutiques et enzymatiques industriels. Cependant, la surproduction de protéines a un effet néfaste sur la physiologie cellulaire. Les ressources cellulaires (métabolites, énergie, machinerie moléculaire, espace cytosolique, etc.) sont en effet partagées entre les protéines de l'hôte et la protéine "gratuite". Cette surcharge non naturelle entraîne une croissance plus lente et des rendements en protéines plus faibles, un phénomène connu sous le nom de "burden". Dans mon projet de doctorat, il s'agissait (1) de déchiffrer les conséquences de la surproduction de protéines gratuites sur la physiologie cellulaire, (2) d'identifier le type de ressources limitantes, et (3) de surmonter cette limitation pour améliorer la production de protéines. Afin de déchiffrer les conséquences de la surproduction de protéines (1), nous avons analysé le taux de croissance, la production de protéines d'intérêt et le protéome de souches de Bacillus subtilis surproduisant divers niveaux de protéines rapportrices. Les protéines rapportrices ont été choisies de manière à être facilement quantifiables par fluorescence et par des tests d'activité (i.e. GFP, mKate2, LacZ, etc.). Pour obtenir les différents niveaux d'expression, nous avons construit des séquences synthétiques par assemblage de promoteurs constitutifs et inductibles et de régions d'initiation de traduction (TIR, RBS) variés. Nous avons ainsi montré que plus la quantité (et la taille) de la protéine produite était élevée, plus les taux de croissance étaient faibles et plus la taille des cellules était élevée. Par exemple, le taux de croissance a diminué de plus de 20 % lorsque la GFP était surproduite à plus de 5 % de la quantité totale de protéines solubles, selon des quantifications biochimiques et de fluorescence. Pour identifier le type de ressources limitantes (2), nous avons effectué une quantification relative des protéines sur les souches surproductrices de GFP et montré que certaines protéines non essentielles étaient moins abondantes dans ces souches. Nous avons ensuite dégradé spécifiquement les protéines rapportrices à l'aide d'un outil de biologie de synthèse précédemment mis au point pour B. subtilis, afin que les acides aminés puissent être recyclés dans le pool de ressources cellulaires. Avec une dégradation de 50-60% de GFP et mKate2, nous avons observé une restauration de 50% du taux de croissance. Ces résultats suggèrent que la quantité d'acides aminés (et par conséquent leur utilisation dans la synthèse des protéines) est le principal type de ressources limitantes. Pour améliorer la production de protéines (3), nous avons cherché à développer un système synthétique de recyclage des acides aminés basé sur le système de dégradation mentionné ci-dessus en surproduisant les protéases d'E. coli et B. subtilis (ClpXP) avec une protéine adaptatrice (SspB) d'E. coli. Cet outil pourrait permettre de dégrader spécifiquement des protéines non essentielles pour économiser des ressources cellulaires. Nous avons montré que la surproduction de ClpXP ou de SspB/ClpXP était suffisante pour permettre une dégradation complète des protéines produites à des niveaux bas et intermédiaires, et jusqu'à 50% des protéines fortement produites. Comme ClpXP est une protéase impliquée dans la réponse au stress, nous avons cherché à savoir si la surproduction de ClpXP pouvait avoir des conséquences négatives sur la physiologie cellulaire. Une quantification relative des protéines sur une souche surproductrice de ClpXP a montré que la surproduction de ClpXP provoque une réorganisation globale du protéome sans toutefois affecter le taux de croissance de la celluleRecombinant protein production in microorganisms is of great interest for the production of biopharmaceuticals, therapeutics and industrial enzymes. However, recombinant protein production has always shown a harmful effect on the microorganism cell physiology when excessively produced. Cell resources (i.e. metabolites, energy, molecular machinery, cytosolic space, etc.) are used to produce the host's proteins and the overproduced gratuitous protein. As a result, this unnatural extra load typically leads to slower growth and lower protein yields, a phenomenon known as ʻburdenʼ. This burden comes from the fact that the recombinant protein has no benefit for the microorganism, and that it only uses cell resources at the expense of the production of the endogenous essential proteins. In my PhD project, the issues were (1) to decipher the consequences of gratuitous protein overproduction on the cell physiology, (2) to identify the limiting type of resources, and (3) to overcome this limitation to improve protein production. To address the first issue (1), we analyzed growth rates, production of several proteins of interest, and genome-wide proteomes of Bacillus subtilis strains overproducing various levels of reporter proteins. The reporter proteins were chosen so that they were easily quantifiable by fluorescence and β-galactosidase activity assays (i.e. GFP, mKate2, LacZ, etc.). To obtain the various levels of expression, we built synthetic sequences made of the assembly of various constitutive and inducible promoters and translation initiation regions (TIR, RBS). Hence, we showed that higher was the amount (and size) of the protein produced, lower were the rates of growth and higher were the cell sizes. For instance, the growth rate decreased down by over 20% when GFP was overproduced above 5% of the total soluble protein amount according to both biochemical and fluorescence assays. To further identify the limiting type of resources (2), we performed a relative protein quantification on the strains overproducing GFP at different levels. Hence, we showed that some non-essential proteins were less abundant in the strains overproducing GFP. We next targeted the reporter proteins for degradation using a synthetic tool previously engineered in B. subtilis, so that amino acids can be recycled back to the pool of cell resources. Degrading the reporter gratuitous protein should also relieve the constraint on the cytosolic density by liberating intracellular space. With a degradation of 50-60% of GFP and mKate2, we observed a 50% restoration of the growth rate. This result together with the proteome analysis suggested that the amount of amino acids (and consequently their utilization in protein synthesis) was the main limiting type of resources. To overcome this limitation and improve protein production (3), we aimed at exploring a synthetic, amino acid recycling system based on the above mentioned degradation system. We decided to improve the targeted degradation system by overproducing the E. coli and B. subtilis ClpXP proteases together with an E. coli adaptor protein SspB. This tool may allow to target proteins for degradation in order to save resources and improve the production of a protein of interest. We showed that the overproduction of either ClpXP or SspB/ ClpXP were sufficient to allow a complete degradation of the proteins produced low and intermediate levels, and up to 50% of degradation of the proteins highly produced. As ClpXP is a protease involved in stress responses, we aimed to know whether the overproduction of ClpXP may have negative consequences on the cell physiology. We therefore performed relative protein quantification on a strain overproducing ClpXP. The results showed that ClpXP overproduction causes a global reorganisation on the proteome without affecting the growth rate of the cell
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Bally, Julia. „Synthèse et repliement des protéines dans les chloroplastes : effets collatéraux de l'expression massive d'un transgène“. Thesis, Lille University of Science and Technology, 2008. https://ori-nuxeo.univ-lille1.fr/nuxeo/site/esupversions/112079bf-330d-489a-bfba-85ebc0c2c48c.
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Plastid genome engineering is an emerging technology which is being considered for the improvement of plant agronomic traits as well as for the molecular farming of biomaterials and therapeutic proteins. In the first part of this work, the potential of these organelles of prokaryotic origin to correctly fold and accumulate a disulfide bond containing enzyme has been investigated. Unlike a normal bacterial cytosol, the stroma of tobacco chloroplasts was found to support the formation of a recombinant alkaline phosphatase from Escherichia coli, whose activity and stability depend on the presence of two intra-molecular disulfide bonds. Targeting this enzyme to the thylakoid lumen via the Sec pathway resulted in stronger accumulation levels and higher specific activity. Complementary approaches have been initiated in tobacco using bacterial chaperones involved in the catalysis of disulfide bond formation, and a redox sensitive green fluorescent protein. These findings shed some light on the folding properties within chloroplasts, and have important biotechnological implications for the production in plants of many therapeutic proteins. Recombinant chloroplasts have the capacity to accumulate massive amounts of recombinant protein. The second part of this work focused on the consequences on the plant fitness and physiology of such extreme expression levels. We have analyzed tobacco plastid transformants accumulating alkaline phosphatase, a green fluorescent protein, and a bacterial hydroxyphenyl pyruvate dioxygenase. These lines exhibited a normal wild-type growth rate, and no significant perturbation of the chloroplast transcriptome was observed. In contrast, a proteomic approach on leaves revealed some differences, in particular a massive drop in the amount of Rubisco. The impact of recombinant protein expression on plant metabolism is discussed.