Auswahl der wissenschaftlichen Literatur zum Thema „Profilage protéomique“

La stéatohépatite liée à une dysfonction métabolique (MASH) représente jusqu’à 35% des carcinomes hépatocellulaires (CHC) dans le monde et constitue la première cause de transplantation pour CHC aux États-Unis. Contrairement à d'autres étiologies, un tiers des CHC liés à la MASH se développent sur un foie non cirrhotique, échappant ainsi aux recommandations de dépistage réservées aux patients cirrhotiques, et conduisant à un diagnostic tardif et un pronostic défavorable. Le dépistage systématique est irréalisable en raison du nombre élevé de patients et il n'existe aucun marqueur prédictif de transformation tumorale. De plus, en cas de CHC avancé, les seules options disponibles sont les thérapies systémiques palliatives. Après des années de monothérapie par sorafénib, l'association atezolizumab/bevacizumab, combinant immunothérapie et antiangiogénique, est désormais recommandée en première ligne. Cependant, le taux de réponse reste limité à 30%, peu de patients accèdent à une deuxième ligne de traitement et il n'existe à ce jour aucun facteur prédictif de réponse. Le profilage protéomique tissulaire par spectrométrie de masse est une approche globale et sans a priori adaptée à ces problématiques complexes. Elle a permis à notre équipe d’identifier une signature prédictive de la non réponse à l’atezolizumab/bevacizumab associée à un shift métabolique.Au cours de ma thèse, mon premier but était d’identifier une signature protéomique prédictive du CHC sur foie MASH et d’étudier les voies de carcinogenèse mises en évidence. Le second but était de valider dans un modèle cellulaire 3D l’implication de la diminution du métabolisme oxydatif dans la résistance à l’atezolizumab/bevacizumab.Premièrement, nous avons mené une étude rétrospective sur biopsies hépatiques de 20 patients atteints de MASH : 11 patients ayant développé un CHC dans les 15 ans suivant leur biopsie initiale (groupe 1, avec une médiane entre la biopsie et le CHC de 7,70 ans) et 9 patients contrôles (groupe 2). Les patients étaient comparables sur les plans clinique et histologique. Nous avons obtenu une signature protéomique de prédiction du CHC de 330 protéines significativement dérégulées et permettant de séparer les deux groupes. Une cohorte de 13 nouveaux patients a permis de valider cette signature protéomique. Parmi ces 330 protéines, la prothymosine alpha (PTMA) était significativement surexprimée dans le groupe 1 avec le plus fort ratio entre les deux groupes. PTMA est surexprimée dans de nombreux cancers dont le CHC et impliquée dans des voies de prolifération cellulaire et de résistance à l’apoptose, ce qui en fait un candidat pertinent. La validation fonctionnelle de PTMA est en cours dans un modèle cellulaire de MASH.Deuxièmement, nous avons mis au point un modèle d’infiltration immunitaire au sein d’un sphéroïde de CHC puis mimé le shift métabolique des patients non répondeurs de façon pharmacologique par un inhibiteur de la chaine respiratoire mitochondriale. Nous avons montré une diminution de l’infiltrat immunitaire dans les sphéroïdes traités, ce qui peut participer à une moindre efficacité de l’immunothérapie chez ces patients.Notre signature protéomique apporte des résultats prometteurs sur la prédiction du CHC sur foie MASH, soulignant une possible implication précoce de la protéine PTMA. L’exploration du rôle de PTMA et des autres cibles identifiées pourra ouvrir des pistes de prévention du développement tumoral. Une validation externe de cette signature sur une plus large cohorte sera nécessaire avant un transfert à la clinique, dans le but d’optimiser le dépistage du CHC chez les patients atteints de MASH. La deuxième partie de cette thèse identifie un mécanisme de résistance du CHC à l’atezolizumab/bevacizumab. Cette approche pourra être étendue à l’ensemble des traitements de première ligne du CHC ouvrant ainsi la voie à une médecine personnalisée et à des pistes de recherche visant à améliorer l’efficacité des traitements
Metabolic dysfunction-associated steatohepatitis (MASH) is responsible for up to 35% of hepatocellular carcinomas (HCC) worldwide and is the leading cause of liver transplantation for HCC in the United States. Unlike other etiologies, a third of MASH-driven HCC develop in non-cirrhotic livers, thereby escaping screening recommendations restricted to cirrhotic patients, and leading to late diagnosis and poor prognosis. Systematic screening is not feasible due to the high number of patients, and there is currently no predictive marker for HCC development. Moreover, in case of advanced HCC, the only available treatments are palliative systemic therapies. After years of monotherapy with sorafenib, the combination of atezolizumab and bevacizumab, which includes immunotherapy and anti-angiogenic treatment, is now recommended as first-line treatment. However, the response rate remains restricted to 30%, few patients have access to second-line treatment, and there are no predictive factors of response. Tissue proteomic profiling by mass spectrometry is a comprehensive and unbiased approach adapted to these complex issues. It enabled our team to identify a predictive signature of non-response to atezolizumab/bevacizumab associated with a metabolic shift.During my PhD, my first aim was to identify a proteomic signature of prediction of MASH-driven HCC and to study pathways involved in carcinogenesis. The second aim was to validate in a 3D cellular model the implication of decreased oxidative metabolism in resistance to atezolizumab/bevacizumab.Firstly, we conducted a retrospective study on liver biopsies from 20 MASH patients: 11 patients who developed HCC within 15 years following their initial biopsy (group 1, with a median time from biopsy to HCC of 7.70 years) and 9 control patients (group 2). The patients were similar in clinical and histological terms. We obtained a proteomic signature of HCC prediction consisting in 330 significantly deregulated proteins, which allowed differentiation between the two groups. This proteomic signature was validated in a cohort of 13 new patients. Among these 330 proteins, prothymosin alpha (PTMA) was significantly overexpressed in group 1, with the highest ratio between the two groups. PTMA is overexpressed in many cancers including HCC and is involved in cell proliferation and apoptosis resistance pathways, making it a relevant candidate. Functional validation of PTMA is ongoing in a cellular model of MASH.Secondly, we developed a model of immune infiltration within an HCC spheroid and mimicked the metabolic shift of non-responder patients with a pharmacological inhibitor of mitochondrial respiratory chain. We demonstrated a decrease in immune infiltration in treated spheroids, which may contribute to the reduced efficacy of immunotherapy in these patients.Our proteomic signature yields promising results for predicting MASH-driven HCC, highlighting a potential early involvement of PTMA. Investigating the role of PTMA and other identified targets could open research avenues for preventing tumor development. External validation of this signature in a larger cohort will be necessary before clinical application, in order to optimize HCC screening in MASH patients. The second part of this thesis identifies a mechanism of HCC resistance to atezolizumab/bevacizumab. This approach could be extended to all first-line treatments of HCC, paving the way for personalized medicine and future research to enhance treatment efficacy

La spermatogenèse chez les mammifères est une fonction biologique complexe incluant des processus de prolifération cellulaire, de méiose et de différenciation uniques visant à la production des gamètes mâles au sein du testicule. Si l’épithélium séminifère est bien décrit sur le plan de son organisation et de la morphologie des cellules qui le composent, les processus par lesquels les cellules germinales diploïdes indifférenciées entrent en méiose pour donner ensuite des cellules haploïdes subissant par la suite de nombreuses transformations morphologiques, ne sont pas totalement décryptés. Ils reposent sur l’expression coordonnée et séquentielle de gènes dont les produits spécifiques de chaque stade de développement des cellules germinales sont essentiels aux étapes clés de la spermatogenèse. La transcriptomique depuis les années 1990 et la protéomique depuis les années 2000 ont contribué à l’amélioration de la connaissance de ces mécanismes. Une étude protéomique visant à caractériser par des approches systématiques et différentielles les protéomes des cellules de Sertoli et de la lignée germinale, et d’autre part une étude récente, réalisée dans notre unité, qui a permis de caractériser et de quantifier le transcriptome des cellules testiculaires isolées de rat en utilisant le séquençage de novo des transcrits (RNA-Seq), ont été à la base de mes travaux de thèse. Cette dernière étude a mis en évidence l’accumulation de longs ARNs non codants (lncRNAs) et de transcrits testiculaires non annotés (TUTs) aux stades méiotique et post- méiotique de la spermatogenèse chez le rat. Dans ce contexte, mon travail a consisté à valider le potentiel codant de nombreux gènes exprimés dans les cellules germinales par une approche dite PIT (Proteomics Informed by Transcriptomics) couplant protéomique Shotgun et RNA-Seq. Dans ce type d’approche, les séquences protéiques déduites des transcrits des différents types cellulaires, assemblés par RNA-Seq, sont intégrées dans une base personnalisée de séquences protéiques utilisée pour interroger les données de spectrométrie de masse obtenues à partir de protéines de cellules méiotiques et post-Méiotiques. L’approche PIT a permis de montrer que 69 TUTs ou lncRNA (correspondant à 44 loci) codent pour des protéines dans les cellules méiotiques et post méiotiques. L’expression post-Méiotique de deux nouveaux transcrits, l’un codant pour la protéine VAMP9, une protéine de la famille SNARE, et l’autre pour une nouvelle énolase T-ENOL a pu être confirmée. L’expression post-Méiotique de T-ENOL a été confirmée par immunohistochimie à l’aide d’un anticorps polyclonal produit contre la protéine recombinante. Cette approche nous a également permis d’identifier de nouvelles isoformes de protéines connues spécifiques de chaque stade de la spermatogenèse. Les cellules germinales et les cellules de Sertoli entretiennent le dialogue nécessaire au bon déroulement de la spermatogenèse. Une autre partie de mon travail a consisté à identifier des protéines membranaires des cellules germinales et des corps résiduels, susceptibles d’intervenir dans le dialogue entre les cellules de Sertoli et les cellules germinales, par une approche protéomique de quantification relative ICPL. Cette approche a permis d’établir une liste de 166 protéines différentiellement exprimées entre les spermatocytes pachytène, les spermatides rondes et les corps résiduels, qui sont susceptibles de jouer un rôle dans la spermiogénèse. Grâce aux annotations de le Gene Ontology, j’ai pu établir une liste de 8 protéines ayant un rôle supposé dans la transduction du signal, la reconnaissance cellulaire ou bien la différenciation. Par ailleurs, j’ai pu établir par protéomique Shotgun un premier protéome des cellules de Sertoli, des cellules germinales et des corps résiduels chez le rat
Spermatogenesis in mammals is a complex biological function including cellular processes such as proliferation, meiosis and differentiation, aiming to the production of male gametes in the testis. If the seminiferous epithelium is well described in terms of organization and cellular morphology of cells that compose it, the processes by which undifferentiated diploid germ cells enter meiosis and give haploid cells that undergo many morphological transformations, are not fully decrypted. These processes rely on the coordinated and sequential expression of genes, including specific products for each stage of germ cell development These gene products are essential at each key stage of spermatogenesis. Transcriptomics since the 1990s, and proteomics since the 2000s have contributed to the improved. understanding of these mechanisms. A long term proteomic study aiming at characterizing the proteomes of Sertoli cells and germ cells, and a recent study that characterized and quantified the transcriptome of isolated rat testicular cells at high resolution using de novo sequencing of transcripts (RNA-Seq), have been the basis of my thesis work. The latter study showed the accumulation of long non-Coding RNAs (lncRNAs) and testicular unannotated transcripts (TUTs) at meiotic and post-Meiotic stages of spermatogenesis in the rat. In this context, my thesis work aimed at validating the coding potential of many genes expressed in germ cells using RNA-Seq combined with shotgun proteomics, a so-Called PIT (Proteomics Informed by transcriptomics) approach. In this approach, the protein sequences translated from the transcripts assembled by RNA-Seq in the different testicular cell types are integrated into a custom database of protein sequences used to query mass spectrometry data obtained from proteins of meiotic and post-Meiotic cells. The PIT approach showed that 69 TUTs or lncRNA (corresponding to 44 loci) code for proteins in meiotic cells and post meiotic cells, and we confirmed experimentally the meiotic and post-Meiotic expression for two new transcripts encoding for VAMP9, a protein of the SNARE family, and a new testicular enolase T-ENOL. The post-Meiotic expression of T-ENOL protein was confirmed by immunohistochemistry using a polyclonal antibody raised against the recombinant protein. This approach also allowed us to identify new isoforms of known proteins, specific to each stage of spermatogenesis. Germ cells and Sertoli cells maintain a dialogue which is necessary to the success of spermatogenesis and spermiogenesis. Another part of my work aimed at identifying membrane proteins, in germ cells and residual bodies, that may be involved in the dialogue between Sertoli cells and germ cells, using a ICPL relative quantification proteomic approach. The ICPL analysis enabled us to establish a list of 166 proteins whose expression is differential between pachytene spermatocytes, round spermatids and residual bodies. Their differential expression suggests that these proteins may play a role in spermiogenesis. Thanks to the Gene Ontology annotations, a list of 8 proteins with a putative role in signal transduction, cell recognition or differentiation, thus potentially involved in the dialogue between Sertoli and germ cells was drawn. In addition, I provided a first proteome of rat Sertoli cells, germ cells and residual bodies obtained by shotgun proteomics

Les micropuces sont devenues incontournables pour la recherche post-génomique en permettant de cribler plusieurs milliers de composés dans quelques microlitres. Plusieurs stratégies ont été développées pour immobiliser sur ce format des petites molécules ou des anticorps pour la recherche de médicaments ou comme diagnostique. L’encodage de chimiothèque de petites molécules par des ‘Peptid Nucleic Acid‘ (PNA), possible par synthèse combinatoire (split and mix), permet d’organiser des micropuces par auto-assemblage des sondes sur ce support et de cribler ainsi l’activité enzymatique sans a priori à partir de mélange complexe tel que des lysats cellulaire. Nous avons développé la chimie peptidique et des PNA pour synthétiser et cribler 3 générations de chimiothèques d’inhibiteurs encodé par des PNA. Ces chimiothèques présentent 625 ou 4000 inhibiteurs basés sur le mécanisme d’action de protéases, étiqueté par une séquence unique de PNA encodant la structure d’un inhibiteur tetrapeptidiques ainsi que sa localisation spécifique sur une micropuce. De gros efforts portés sur l’optimisation du dépôt sur micropuce, la détection du signal et les conditions d’hybridation ont rendu cette stratégie suffisamment sensible et spécifique pour quantifier l’activité enzymatique et pour identifier des spécificités de substrats. Cette technique a été utilisée pour profiler l’activité enzymatique d’extrait allergisant d’acariens et pour détecter des spécificités de substrats d’enzymes purifiés. Les inhibiteurs identifiés sont assez spécifique pour distinguer l’activité d’enzymes proches d’une même famille et les enzymes cibles de ces inhibiteurs peuvent être identifiés par colonne d’affinité couplé à la spectrométrie de masse. De plus, les inhibiteurs identifiés permettent de bloquer l’activité d’un enzyme et d’évaluer sa relation avec un phénotype. Cette stratégie est actuellement la seule méthode fonctionnelle miniaturisée permettant de profiler l’activité enzymatique avec des inhibiteurs
Microarray has become an indispensable technology in postgenomic research area and allows for high throughput screening of several thousand analytes in few microliters. Several strategies have been developed to immobilize small molecules or antibodies on this format for drug discovery or for diagnostic tool. The peptide nucleic acid (PNA)-encoded small molecule library strategy allows for combinatorial libraries synthesize in a split and mix format to be organized into microarray by a self-sorting assembly. This methodology enables enzyme activity screening without a priori knowledge of the target in complex mixture such as crude cell lysates. Peptide and PNA chemistries were developed to synthesize and screen on a microarray format 3 generations of PNA-encoded inhibitor libraries targeting several protease families. Those libraries are presenting 625 to 4000 mechanism based inhibitors individually labelled with a PNA sequences that encodes the structure of a tetrapeptide inhibitor and its specific localisation onto a microarray. Substantial efforts on optimizing microarray spotting as well as signal detection and hybridization conditions presented in this thesis gives to PNA-encoded strategy a sensitive and specific format to quantify enzymatic activities and identify substrate specificities. The PNA-encoded strategy has been used to profiling enzyme activity from allergenic dustmite extract as well as to detect substrate specificities of purified enzyme samples. Identified inhibitors showed to be specific enough to decipher closely related activities of enzyme from the same family, and on the other hand, to identify the inhibitor’s target enzyme by affinity column coupled to mass spectrometry. Finally, identified inhibitors can be used to knock down the activity of an enzyme and evaluate its correlation to a phenotype. This strategy is to date the only functional methodology that enable to profile enzyme activity with inhibitors in a miniaturized format