Auswahl der wissenschaftlichen Literatur zum Thema „Porphyrie érythropoïétique“

Background: Erythropoietic protoporphyria is a rare photodermatosis of childhood, and the diagnosis can be delayed. A deficient ferrochelatase enzyme leads to accumulation of protoporphyrins in the dermis, causing phototoxic burning. Objective: To report three cases with great variability in severity of symptoms and age at diagnosis. We discuss clinical and biochemical findings, mutation analysis, and therapeutic options. Methods: We report three cases with different degrees of photosensitivity, laboratory results, psychosocial impact, and preventive and therapeutic treatments. Results: The diagnosis of erythropoietic protoporphyria was confirmed by both typical elevation of plasma porphyrins and the discovery of a mutated FECH gene. Conclusion: Erythropoietic protoporphyria should be suspected in any cases of childhood photosensitivity. Systemic complications are unusual. Mutation analysis confirms the diagnosis. Photoprotection is the cornerstone of treatment. Renseignements de base: La protoporphyrie érythropoïétique est une photodermatose infantile rare, et le diagnostic peut être retardé. Une déficience de l'enzyme ferrochélatase produit une accumulation de protoporphyrines dans le derme ce qui provoque une réaction phototoxique. Objectif: Présenter trois cas qui illustrent une grande variabilité de la gravité des symptômes et de l'âge au moment du diagnostic. Nous discutons des résultats cliniques et biochimiques, de l'analyse des mutations, et des options thérapeutiques. Méthodes: Nous exposons trois cas qui présentent différents degrés de photosensibilité, les résultats d'examen de laboratoire, l'impact psychosocial, et les traitements préventifs et thérapeutiques. Résultats: Le diagnostic de la protoporphyrie érythropoïétique a été confirmé à la fois par l'élévation caractéristique des porphyrines plasmatiques et par la mise en évidence d'une mutation du gène FECH. Conclusion: La protoporphyrie érythropoïétique doit être soupçonnée dans tous les cas de photosensibilité infantile. Les complications systémiques sont inhabituelles. L'analyse des mutations confirme le diagnostic. La photoprotection est la pierre angulaire du traitement.

Les porphyries sont des maladies génétiques causées par une dysfonction d'une enzyme de la voie de biosynthèse de l'hème responsable de l'accumulation de métabolites toxiques. On distingue les porphyries d'origine hépatique, où l'hème est le principal régulateur de sa synthèse, des porphyries érythropoïétiques, où c'est la biodisponibilité du fer qui est le déterminant majeur de la synthèse d'hème. Lors de ce travail, des méthodes de dosages par spectrométrie de masse ont été développées afin de mieux caractériser la physiopathologie des porphyries. En premier lieu, le dosage des précurseurs de la voie, l'ALA et le PBG, dans le sang et les urines, qui a ensuite été appliqué au diagnostic et à l'amélioration du suivi de patients atteints de porphyrie hépatique aiguë. Dans une deuxième partie, ce travail s'est intéressé au lien entre métabolisme du fer et porphyrie érythropoïétique. Il a démontré l'efficacité biologique et clinique de l'induction d'une carence martiale chez des patients atteints de porphyrie érythropoïétique. L'étude de culture primaire de progéniteurs érythroïdes de patients a confirmé l'impact des variations de la biodisponibilité du fer sur l'accumulation des porphyrines toxiques. Enfin, un modèle de cellulaire de protoporphyrie érythropoïétique a été caractérisé, notamment par dosage de l'hème intracellulaire par spectrométrie de masse. Il récapitule les accumulations de porphyrines et les variations observées chez les patients en cas de carence martiale. Les développements méthodologiques des dosages par spectrométrie de masse, de l'ALA et du PBG, et du produit final, l'hème, présentés ici, sont une première étape nécessaire à l'étude de la voie métabolique sans l'angle du flux. Cette vision dynamique permettra de répondre à une série de questions fondamentales concernant la physiopathologie des porphyries, notamment hépatiques aiguës : la voie est-elle activée différemment chez les patients malades et porteurs ? Y-a-t-il une carence en hème à l'état basal ou lors d'une crise ? Une crise induit-elle une augmentation de synthèse de l'hème ?
Porphyrias are genetic diseases caused by dysfunction of an enzyme in the heme biosynthesis pathway, responsible for the accumulation of toxic metabolites. They are subdivided in porphyrias of hepatic origin, where heme is the main regulator of its synthesis, and erythropoietic porphyrias, where iron bioavailability is the main determinant of heme synthesis. In this work, mass spectrometry methods were developed to better characterize the pathophysiology of porphyrias. Firstly, the determination of the precursors of the pathway, ALA and PBG, in blood and urine, was applied to the diagnosis and improved monitoring of patients suffering from acute hepatic porphyrias. The second part of the project focused on the link between iron metabolism and erythropoietic porphyrias. It demonstrated the biological and clinical efficacy of inducing martial deficiency in patients with erythropoietic porphyrias. A study of the primary culture of patients' erythroid progenitors confirmed the impact of variations in iron bioavailability on the accumulation of toxic porphyrins. Finally, a cellular model of erythropoietic protoporphyria was characterized, in particular by determining intracellular heme using mass spectrometry. It reproduces the porphyrin accumulations and variations observed in patients with martial deficiency. The methodological developments in the mass spectrometric assays of ALA and PBG, and of the final product, heme, presented here, are a necessary first step in the study of the metabolic pathway from a flow perspective. This dynamic vision will provide answers to a series of fundamental questions concerning the pathophysiology of porphyrias, in particular acute hepatic porphyrias: is the pathway activated differently in patients with and without porphyria? Is there a heme deficiency in the basal state or during an attack? Does an attack induce an increase in heme synthesis?

Le système CRISPR-Cas9 a révolutionné le monde de la génétique. Il est aujourd’hui utilisé dans de nombreux domaines de recherches comme la médecine, l’agronomie, l’environnement etc. Il commence également à être utilisé en clinique. Cependant, depuis quelques années, de plus en plus d’études soulignent les risques génotoxiques de la nucléase Cas9. Alors que les premières études s’intéressaient au manque de spécificité et aux risques hors cibles du système et que des solutions ont été apportées, les nouvelles constatations pointent du doigt les risques de génotoxicité au locus ciblé. En effet, des risques d’apparition d’insertions/délétions non voulue au locus lors d’expériences d’HDR, d’inversion de séquences, de larges délétions chromosomiques terminales ont été décrits. Le travail de thèse présenté ici a pour but de trouver des solutions contre ces évènements génotoxiques au locus ciblé. Dans un premier temps, nous avons développé des solutions dans les lignées cellulaires, et les cellules souches hématopoïétiques en développant le système nickase, puis nous nous sommes intéressés aux cellules humaines pluripotentes induites avec l’utilisation d’un guide allèle-spécifique. Enfin, nous avons mis au point un système sensible de détection des risques génotoxiques dans des cellules diploïdes immortalisées afin de mieux les caractériser. Bien que très efficace, CRISPR-Cas9 nucléase reste un outil à optimiser. Des contrôles qualités doivent être mis en place pour une utilisation correcte de ce nouvel outil révolutionnaire pour la biologie et ses limites doivent être connues pour mieux les maitriser
CRISPR-Cas9 system has revolutionized genetic world. Nowadays, it is used in various research domains as medicine, agronomy, environment… It is also involved in clinic. However, for a few years, more and more studies have underlined the Cas9 genotoxicity risks. As the first studies focused on the system lack of specificity and on its off-target risks, solutions were brought. Now, new ascertainments emphasize the on-target genotoxic risks. Indeed, non-desired insertions / deletions at the locus in HDR experiments, sequence inversions, large chromosomic truncations were described. The thesis work presented here, aims at finding solutions against these on-target genotoxic risks. In a first time, we have developed solutions in cell lines and hematopoietic stem cells with the nickase system development, and then we have focused on human induced pluripotent stem cells with the use of an allele-specific guide. Finally, we have worked out in sensitive detection genotoxic risks system in immortalized diploid cells to characterized them better. Quality controls must be set up to a correct use of this new biologic revolutionary tool and its limits must be known to controlled them better

Les porphyries érythropoïétiques (PE) : Porphyrie Erythropoïétique Congénitale -PEC- et Protoporphyrie Erythropoïétique -PPE- sont caractérisées par le déficit d’une des enzymes de la voie de biosynthèse de l’hème. Le traitement curatif des formes sévères de PE est la transplantation de moelle osseuse allogénique (TMOA). La PPE est parfois compliquée d’une insuffisance hépatique majeure nécessitant une greffe hépatique. Dans un modèle murin de PPE (Fechm1Pas/Fechm1Pas), nous avons démontré l’apparition progressive de lésions hépatiques dès la 2ème semaine de vie. Une TMO précoce (nouveau-né) a permis de prévenir l’apparition de ces lésions hépatiques et de corriger la photosensibilité cutanée démontrant l’efficacité de cette approche thérapeutique pour les formes sévères de PPE. La thérapie génique par greffe de cellules souches hématopoïétiques autologues corrigées représente une alternative à la TMOA en l’absence de donneur HLA-compatible. Nous avons développé des cellules souches pluripotentes induites (iPS) à partir de cellules épidermiques issues de modèles murins de PE et d’un patient PEC. La correction génique a été obtenue par transfert du gène lentiviral (ferrochélatase ou uroporphyrinogène III synthase (UROS). La pluripotence des cellules iPS a été caractérisée in vitro par la formation de corps embryoïdes et in vivo par la formation de tératomes. In vitro, la correction métabolique a été obtenue après différenciation des cellules iPS humaines en progéniteurs hématopoïétiques. Enfin dans une dernière partie, nous nous sommes intéressés à une approche pharmacologique de la PEC. Nous avons montré que les mutations C73R et P248Q entraînaient une instabilité et une dégradation accélérée de l’UROS par la voie du protéasome. Le traitement de souris UrosP248Q par un inhibiteur du protéasome (Velcade®) a permis la correction de la photosensibilité cutanée. Ces travaux ouvrent de nouvelles perspectives pour le traitement des porphyries érythropoïétiques
Erythropoietic porphyrias (EP) : Congenital Erythropoietic Porphyria -CEP- and Erythropoietic Protoporphyria -EPP-) are characterized by a deficit of one enzyme implicated in heme biosynthetic pathway. The curative therapy for severe cases of EP is an HLA-compatible Bone Marrow Transplantation (BMT). EPP is sometimes complicated by a major hepatic failure requiring hepatic graft. In a murine model of EPP (Fechm1Pas/Fechm1Pas), we have demonstrated that hepatic lesions progressively appear 2 weeks after birth. Early BMT (in neonates) has made it possible to prevent hepatic lesions and correct skin photosensitivity, demonstrating the efficiency of this therapeutic approach in severe cases of EPP. The gene therapy by graft of corrected autologous hematopoietic stem cells represents an alternative to BMT when HLA-compatible donors are lacking. We have developed induced pluripotent stem cells (iPSC) from epidermic cells of murine models of EP and of one PEC patient. The gene correction was obtained by lentiviral gene transfer (ferrochelatase and uroporphyrinogen III synthase -UROS). The pluripotency of iPSC was characterized in vitro by the formation of embryoid bodies and in vivo by the formation of teratomas. In vitro, the metabolic correction was obtained after differentiation of human IPSC into hematopoietic progenitors. In the last part of this thesis, we have focused on a pharmacological approach of CEP. We have shown that C73R and P248Q mutations lead to instability and accelerated degradation of the UROS protein via the proteasome. Treating UrosP248Q mice with a proteasome inhibitor (Velcade®) has allowed the correction of skin photosensitivity. These works offer new prospects for the treatment of erythropoietic porphyrias

La porphyrie erythropoietique congénitale (PEC) est une maladie monogénique hématologique sévère liée à un déficit en uroporphyrinogène III synthase, conduisant à l'accumulation toxique de porphyrines dans les issus hématopoietiques. La greffe allogénique de cellules souches hématopoietiques (CSH) génétiquement modifiées peut être une alternative à l'allogreffe de moelle osseuse en cas d'absence de donneurs HLA compatibles. Dans notre étude, des vecteurs dérivés de lentivirus ont été développés pour obtenir un tranqfert de gène efficace et stable dans les CSH murines et humaines. Ces vecteurs permettent une expression erythroide-spécifique du gène thérapeutique entraînant une correction enzymatique, métabolique et phénotypique complète du modèle murin PEC. L'évaluation de l'efficacité du transfert de gène dans les CSH humaines in vivo dans des souris immunodéficientes NOD/SCID sera un prérequis avant la mise en place d'un protocole clinique de thérapie génique
Congenital erythropoietic porphyria (CEP) is an hematological genetic disease characterized by an uroporphyrinogen III synthase deficiency, leading to an accumulation of toxic porphyrin in hemotopoietic tissues. Transplantation of genetically modified hematopoietic stem cells (HSCs) could represent an alternative to bone marrow transplantation when a match-HLA graft is not available. In our work, lentiviral vectors were developed to obtain a stable and efficient gene transfer in murine and human HSCs. These vectors allow an erythroid-specific expression of the therapeutic gene leading to a complete enzymatic, metabolic and phenotypic correction of CEP mice. Evaluation of efficiency of gene transfer in human HSCs in an immunodeficient NOD/SCID model is a necessary step before we consider a gene therapy clinical trial for this disease

La protoporphyrie érythropoïétique (PPE) est une maladie héréditaire rare caractérisée par un déficit en activité FECH responsable d’une accumulation de PPIX. Elle se manifeste par une photosensibilité très invalidante. Il n’existe pas de traitement efficace pour la PPE. 95 % des malades présentent un allèle FECH hypomorphe (c.315-48C) en trans d'une mutation FECH délétère, ce qui entraine une diminution de l'activité FECH résiduelle dans les érythroblastes en dessous d'un seuil critique d'environ 35 % de l'activité normale. L’allèle hypomorphe (c.315-48C) favorise l'utilisation d'un site cryptique d'épissage situé en -63 de l’intron 3 générant un ARNm FECH incluant une partie de l’intron 3 et possédant un codon stop prématuré. L’ARN est alors dégradé par NMD pendant sa maturation. Nous avons déjà identifié un oligonucléotide antisens (ASO-V1) qui redirige l'épissage vers le site accepteur physiologique de l’intron 3 et augmente la production d’ARN FECH WT. Nous avons développé par ce travail une nouvelle stratégie d’adressage d’ASO-V1 en utilisant des peptides ciblant le récepteur de la transferrine (RTf1) qui est exprimé à un niveau très élevé dans les progéniteurs érythroïdes en différenciation concomitamment à la FECH. Nous avons développé des peptides bifonctionnels à partir des séquences peptidiques ciblant le RTf1 tout en les couplant à des séquences Cell Penetrating Peptide (CPP) qui facilitent la sortie de l’ASO-V1 de la vésicule endosomale. Après la transfection des lignées lymphoblastoïdes de malades PPE par différents nanocomplexes RTf1-CPP/ASO-V1, nous avons pu montrer que plusieurs des peptides bifonctionnels utilisés permettaient une redirection efficace et prolongée de l’épissage cryptique vers l’épissage physiologique exon3-exon4 et que cela permettait une correction des taux d’ARN FECH WT. Nous avons ensuite testé l’effet des nanocomplexes RTf1-CPP/ASO-V1, ex vivo, dans les progéniteurs érythroïdes en différenciation de différents sujets atteints de PPE et nous sommes arrivés à augmenter l’ARN FECH WT et diminuer significativement l’accumulation de la PPIX dans ces cellules par rapport à celles transfectées par des nanocomplexes RTf1-CPP/ASO-Mock. La prochaine étape de notre étude serait d’apporter la preuve de concept, in vivo, dans un modèle murin humanisé de PPE après l'administration de nanocomplexes RTf1-CPP/ASOV1
Erythropoietic protoporphyria (EPP) is a rare hereditary disease characterized by a deficiency in FECH activity responsible for the accumulation of PPIX. EPP is manifested by a very disabling photosensitivity. There is no effective treatment for EPP. 95% of the patients present a hypomorphic FECH allele (c.315-48C) in trans of a deleterious FECH mutation, resulting in a decrease in residual FECH activity in erythroblasts below a critical threshold of about 35% of normal activity. The hypomorphic allele (c.315-48C) promotes the use of a cryptic splicing site located at -63 of the intron 3 generating a FECH mRNA including a part of the intron 3 and possessing a premature stop codon. The RNA is then degraded by NMD during its maturation. We have previously identified an antisense oligonucleotide (ASO-V1) that redirects splicing to the physiological acceptor site of intron 3 and increases the production of WT FECH mRNA. Here, we developed a new ASO-V1 addressing strategy using transferrin receptor (TRf1) targeted peptides. TfR1 is expressed at a very high level in differentiating erythroid progenitors concomitantly with FECH. We developed bifunctional peptides from peptide sequences targeting TfR1 while coupling them to Cell Penetrating Peptide (CPP) sequences that facilitate the release of ASO-V1 from the endosomal vesicle. We transfected the lymphoblastoid cell lines from EPP patients by different TfR1-CPP/ASO-V1 nanocomplexes and we demonstated that several of the bifunctional peptides allowed an efficient and prolonged redirection of the cryptic splicing towards the exon3-exon4 physiological splicing and the correction of the WT FECH mRNA levels. Then, we tested the effect of TfR1-CPP/ASO-V1 nanocomplexes, ex vivo, in differentiating erythroid progenitors of different EPP subjects and we were able to increase WT FECH mRNA and decrease significantly the accumulation of the PPIX in these cells compared to those transfected by TfR1-CPP/ASO-Scr nanocomplexes. The next step of our study would be to provide a proof of concept, in vivo, in a humanized murine model of EPP after the administration of TfR1-CPP/ASOV-1 nanocomplexes