Auswahl der wissenschaftlichen Literatur zum Thema „Poly(ADP-Ribosyl)polymérase“

La progéria de Hutchinson-Gilford (HGPS) est une maladie génétique rare causée dans la majorité des cas par une mutation du gène LMNA. Cette mutation conduit à l’expression d’une lamine A mutée appelée "progérine". Parmi toutes les caractéristiques cliniques, les atteintes du système cardiovasculaire sont la principale cause du décès prématuré des patients. Les cellules musculaires lisses vasculaires (VSMC) sont importantes pour le maintien de l'intégrité de l'aorte. Il est connu que l'abondance et la fonctionnalité des VSMCs diminuent dans les modèles animaux de syndromes progéroïdes. L’objectif de cette thèse a été d'étudier les mécanismes par lesquels la progérine conduit à une perte massive de VSMCs. En utilisant l’aorte d’un modèle murin de HGPS, les souris LmnaG609G/G609G, j’ai montré une augmentation de la mort cellulaire des VSMCs associée à un défaut de réparation des dommages à l'ADN. Mes résultats démontrent pour la première fois qu’une augmentation de PARylation se produit dans les VSMCs de souris LmnaG609G/G609G. L’augmentation de la PARylation est associée à une diminution du nicotinamide adénine dinucléotide (NAD+). Le traitement de souris LmnaG609G/+ avec un inhibiteur de la PARylation permet de restaurer les niveaux de NAD+ dans les VSMCs et d’améliorer la pathologie vasculaire. Dans l’ensemble, ces travaux de thèse soutiennent l’hypothèse selon laquelle la PARylation peut être impliquée dans les altérations génomiques qui provoquent la perte de VSMCs chez les patients atteints de HGPS et suggèrent une nouvelle approche thérapeutique pour l'implication cardiovasculaire dans la HGPS
Hutchinson-Gilford progeria syndrome (HGPS) is an extremely rare genetic disorder associated with clinical and molecular features of premature aging caused by LMNA gene mutation. Among all of the clinical features associated with premature aging, the cardiovascular disease is the cause of death in almost all patients. Despite its great importance, investigation of the arterial pathology has been extremely limited mainly due to the low incidence of progeroid syndromes. Vascular smooth muscle cells (VSMC) are important for maintaining aortic integrity. It is known that the abundance and functionality of VSMC decline with aging in animal models of progeroid syndromes. The main project was to study the mechanisms of how progerin leads to massive VSMC loss. Using aorta tissue from a mouse model of HGPS, LmnaG609G/G609G mice, we showed an increase of VSMCs death associated with an inability to correctly repair DNA damages. Our results demonstrate for the first time that aberrant PARylation occurs in VSMCs of premature aging mouse model. Increased PARylation in VSMCs from LmnaG609G/G609G mice were associated with a decrease in nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+), which is a critical regulator of metabolism and thus, contributes to the pathogenesis. Treatment of LmnaG609G/+ mice with a PARylation inhibitor restores NAD+ levels in VSMCs and improves vascular pathology. Taking together, these thesis works support our hypothesis that PARylation can be involved in genomic alterations, which causes VSMC loss in patients with HGPS and suggest a novel approach towards therapeutics for cardiovascular involvement in HGPS

Les mitochondries sont des organites essentiels pour la production d'énergie cellulaire grâce à la synthèse d'ATP au cours des étapes de phosphorylations oxydatives (OXPHOS). Les complexes de la chaine respiratoire sont en partie codés par le génome mitochondrial (ADNmt), dont la structure est très sensible aux facteurs exogènes ou endogènes. De nombreuses mutations de l'ADNmt sont associées à des dysfonctionnements de la chaine respiratoire conduisant à des pathologies. La production d'Espèces Oxygénées Réactives (EOR) mitochondriale est la principale source de dommages à l'ADNmt. Une voie de réparation particulière, le système de réparation par excision de bases (BER) est mis en oeuvre dans ce cas. Nous avons, au cours de notre étude, analysé le système BER mitochondrial chez la drosophile. Dans une première approche, nous avons caractérisé de manière globale par une technologie de puces à ADN un ensemble de glycosylases et endonucléases impliquées dans la voie BER mitochondriale et comparé leur variation au cours du vieillissement. Cette étude a été complétée par une analyse transcriptionnelle sur des modèles de drosophiles mutantes pour des enzymes spécifiques de la voie BER, ceci afin de déterminer les éventuelles interactions transcriptionnelles entre les acteurs de cette voie. L'ARNm de Parp présentait de fortes variations dans les différents contextes mutants testés. C'est une molécule essentielle de la réparation BER. Elle a fait l'objet dans un deuxième temps, d'une étude plus approfondie. Dans le modèle des cellules S2, PARP bien que majoritairement nucléaire est également présent dans la mitochondrie. Le comportement différentiel des deux variants ARNm de Parp a pu être mis en évidence lors de stress cellulaires. Les isoformes protéiques de PARP observées dans nos études apparaissent différentes de celles habituellement décrites dans la littérature. Cet aspect a été discuté.

La poly(ADP-ribosyl)ation est une modification post-traductionnelle de protéines catalysée par les Poly(ADP-ribose) polymérases (PARPs, 17 membres). Depuis 2011, le laboratoire décortique les propriétés biologiques de PARP3 qui est désormais bien décrite pour son rôle dans la réparation des cassures double-brin de l’ADN, la mitose et la transition épithélio-mésenchymateuse. Ces recherches combinées aux données de la littérature semblent indiquer que les fonctions de PARP3 sont très étendues et participent aussi à des processus physiologiques. Ainsi, mes travaux de thèse révèlent une nouvelle fonction clé de PARP3 dans la différenciation des cellules souches neurales et musculaires. Nous avons observé une forte augmentation de l’expression de PARP3 au cours de la neurogénèse, la gliogenèse et la myogénèse. En l’absence de PARP3, la différenciation des cellules souches neurales (NSPC) en astrocytes et neurones est perturbée et les souris PARP3KO présentent une incapacité à régénérer le tissu cérébral au niveau du striatum après ischémie hypoxique. Concernant les cellules musculaires, la disruption de PARP3 (Crispr/Cas9) empêche toute différenciation des myoblastes C2C12 en myotubes et conduit à une désoganisation du cytosquelette, une dégénérescence mitochondriale et une répression de gènes de l’identité. La réexpression de PARP3 catalytiquement active restaure la capacité de différenciation des C2C12. Enfin, nous avons identifié de nouvelles protéines cibles de PARP3 qui permettent de suspecter un rôle dans l’autophagie et le métabolisme énergétique au cours de la différenciation cellulaire. L’ensemble de ces résultats nous ont permis de découvrir que PARP3 a un rôle central dans la différenciation cellulaire et d’ouvrir de solides pistes de recherche afin d’identifier les mécanismes mis en jeu
Poly (ADP-ribosyl)ation is a post-translational modification of proteins catalysed by Poly (ADP-ribose) polymerases (PARPs, 17 members). Since 2011, the laboratory has been dissecting the biological properties of PARP3 which is now well described for its role in the repair of DNA double-strand breaks, in mitosis and in epithelial-mesenchymal transition. This investigation combined with data from the literature suggests that PARP3 functions are very wide and could participate in physiological processes. Thus, my thesis work reveals a new key function of PARP3 in neural and muscular stem cell differentiation. We observed a strong increase in PARP3 expression during neurogenesis, gliogenesis and myogenesis. In the absence of PARP3, the differentiation of neural stem cells (NSPCs) into astrocytes and neurons is impaired and PARP3KO mice display an inability to regenerate brain tissue in the region of the striatum after hypoxic ischemia. Regarding muscle cells, PARP3 disruption (Crispr/Cas9) prevents C2C12 myoblast differentiation into myotubes and leads to cytoskeleton disorganisation, mitochondrial degeneration, and repression of identity genes. The reexpression of a catalytically active PARP3 restores the C2C12 differentiation capacity. Finally, we have identified new PARP3 target proteins that suggest a role in autophagy and energetic metabolism during cell differentiation.Together, these results reveal that PARP3 has a central role in cell differentiation and opens solid lines of research to identify the mechanisms involved

La poly(ADP-ribosyl)ation est une modification post-traductionnelle des protéines catalysée par une famille d’enzymes : les poly(ADP-ribose) polymérases. Parmi les plus étudiées, PARP-1 et PARP-2 interviennent dans l’organisation, l’expression et le maintien de l’intégrité du génome. Nous avons initié l'étude d'un nouveau partenaire de PARP-1 préalablement identifié par double-hybride, et encore peu étudié à ce jour : HMG2L1 (High-Mobility Group protein 2 Like-1). La protéine humaine de 601 acides aminés contient un domaine HMG (High-Mobility Group) normalement impliqué dans l’interaction avec l’ADN. Quelques études ont montré que HMG2L1 régule la transcription en agissant comme co-régulateur négatif ou positif. Dans un premier temps, nous avons caractérisé le lien entre PARP-1 et HMG2L1. L’interaction avec PARP-1 a été confirmée in-vivo et in vitro. Nous avons montré que HMG2L1 pouvait également interagir avec PARP-2. HMG2L1 est poly(ADP-ribosyl)ée par PARP-1 et PARP-2, de même qu’elle est capable d’interagir avec le poly(ADP-ribose). La construction de formes tronquées de HMG2L1 en fusion avec la GFP nous a permis de montrer que le domaine N-terminal – en amont du domaine HMG – est impliqué dans ces interactions. Ce domaine N-terminal est très électropositif et intrinsèquement désordonné ce qui lui confère de nombreuses potentialités d’interactions. L’expression des fusions GFP dans des cellules HeLa nous a permis de montrer la localisation nucléaire et nucléolaire de HMG2L1, comme c’est le cas pour PARP-1 et PARP- 2. En outre, HMG2L1 colocalise avec UBF (Upstream Binding Factor), le facteur de transcription de l’ARN polymérase I responsable de la transcription des ARN ribosomaux. La surexpression de GFP-hHMG2L1 entraîne un stress nucléolaire caractérisé par l’inhibition de la transcription des ADNr et la formation de coiffes nucléolaires. Nous avons également entrepris une recherche de partenaires de HMG2L1 par spectrométrie de masse. De nombreuses protéines nucléolaires, impliquées dans la biogenèse des ribosomes ou la maturation des ARNs ont été identifiées, suggérant un rôle de HMG2L1 dans ces processus. Nous avons montré que la protéine purifiée interagit avec l’ADN via son domaine HMG principalement, et qu’elle interagit avec l’ARN via son domaine N-terminal. Mais surtout, nous avons mis en évidence une activité ARN-chaperonne, qui peut être régulée par le poly(ADP-ribose). La localisation de HMG2L1, son réseau d’interaction ainsi que son activité chaperonne nous laissent à penser qu’elle pourrait être impliquée dans des processus de maturation des ARN, régulés par la poly(ADPribosyl)ation
Poly(ADP-ribosyl)ation is a post-translational modification of proteins mediated by a family of enzymes called poly(ADP-ribose) polymerases. Among the best studied, PARP-1 and PARP-2 are both implicated into the transcription, organization and integrity of genome. We have initiated the characterization of a new PARP-1 partner previously identified in a yeast two-hybrid screen, and still poorly studied: HMG2L1 (High-Mobility Group protein 2 Like-1). The human protein of 601 amino acids contains one HMGbox domain normally implicated in the recognition of DNA. Some studies have reported the role of HMG2L1 in the regulation of transcription by acting as a negative or positive coregulator. First, we characterized the link between PARP-1 and HMG2L1. We confirmed the interaction between both proteins in vivo and in vitro. We also showed that HMG2L1 couldinteract with PARP-2. HMG2L1 is poly(ADP-ribosyl)ated by PARP-1 and PARP-2, and is able to interact with poly(ADP-ribose). The construction of GFP-fused truncated versions of HMG2L1 allowed us to show that the N-terminal part – upstream to the HMGbox – is responsible for all these interactions. This N-terminal domain is highly electropositive and intrinsically disordered conferring a lot of interactions potentialities. The expression of the GFP-fused proteins in HeLa cells allowed us to localizeHMG2L1 into the nucleus and the nucleolus, like PARP-1 and PARP-2. Moreover, HMG2L1 colocalizes with UBF (Upstream Binding Factor), the transcription factor responsible for the transcription of ribosomal ARNs by RNA polymerase I. The overexpression of GFPhHMG2L1 leads to a nucleolar stress illustrated by the inhibition of transcription and the formation of nucleolar caps. We also undertook a proteomic study to find new partners of HMG2L1. We found a huge amount of nucleolar proteins, involved in ribosome biogenesis or RNA maturation, suggesting that HMG2L1 could be involved in these processes. Finally, we demonstrated the ability of the purified protein to interact with DNA mostly through its HMGbox domain and RNA through its N-terminal domain. Moreover, we discovered that HMG2L1 is endowed with a RNA-chaperone activity, that can be regulated by poly(ADP-ribose). Taken together, the localization of HMG2L1, its interacting partners and its RNA chaperone activity allow us to make the assumption that HMG2L1 could be implicated in RNA maturation processes, regulated by poly(ADP-ribosyl)ation

Les poly (ADP-ribose) polymérases dépendantes de l’ADN (PARPs) PARP1, PARP2 et PARP3 agissent comme des détecteurs de cassures d'ADN signalant des dommages à l'ADN. Lors de la détection des dommages à l'ADN, ces PARPs utilisent le nicotinamide adénine dinucléotide comme substrat pour synthétiser un monomère ou un polymère d'ADP-ribose (MAR ou PAR, respectivement) attaché de manière covalente au résidu accepteur des protéines cibles. Récemment, il a été démontré que les protéines PARP1–3 peuvent directement ADP-ribosyler les cassures d'ADN en attachant les oligomères MAR et PAR aux phosphates terminaux.Néanmoins, peu de choses sont connues sur les mécanismes régissant la reconnaissance et la spécificité du substrat de PARP1, qui représente la majeure partie de l'activité de PARylation cellulaire, ainsi que sur les protéines responsables de la détection et de l'élimination des adduits d'ADN ADP-ribosylés et son rôle dans une multitude de processus cellulaires. Dans cette étude, nous avons caractérisé de manière détaillée la spécificité du substrat (ADN) de PARP1 et des mécanismes de la PARylation de l'ADN. Nous avons montré que le résidu phosphate 3'-terminal aux extrémités des cassures de l'ADN double brin servait de site accepteur majeur pour la PARylation catalysée par PARP1 en fonction de l'orientation et de la distance entre les cassures du brin d'ADN dans une seule molécule d'ADN. De plus, une préférence pour l’ADP-ribosylation des molécules d'ADN contenant du phosphate 3'-terminal a été observée par rapport à l'auto-ADP-ribosylation de PARP1, et un modèle de modification de l'ADN par PARP1 a été proposé. Des résultats similaires ont été observés avec l’enzyme PARP1 recombinante purifiée et des extraits provenant des cellules HeLa. Ainsi, les effets biologiques de l’ADP-ribosylation médiée par PARP peuvent dépendre fortement de la configuration des cassures complexes des brins d'ADN. De plus, nous avons élaboré une nouvelle approche permettant d’identifier et valider les protéines responsables de la détection («readers») ou de l'élimination («erasers») des adduits ADN- ADP-ribose. Nos données protéomiques ont révélé que les adduits de l'ADN MARylé modulaient sélectivement la reconnaissance de l'ADN par un grand nombre de protéines impliquées dans différentes voies de signalisation cellulaire. Environ 90 protéines, y compris des complexes protéiques, ont été sélectionnées comme lecteurs («readers») potentiels d'adduits ADN-MARylé. Le rôle de l'ADP-ribosylation de l’ADN dans la jonction d'extrémités non homologues (NHEJ) a été partiellement caractérisé dans une étude in vitro. Nous avons démontré que l'ADP-ribosylation de l’extrémité de la cassure double brin («DSB») peut conduire à l'inhibition de la réparation de la DSB bout franc par la voie NHEJ canonique si elle n'est pas éliminée par la glycohydrolase PARG. Au contraire, la présence d'une coupure («nick») proximale avec un site apurinique / apyrimidinique stabilisé conduit à une efficacité NHEJ accrue, apparemment de manière indépendante de l'ADP-ribosylation. Enfin, nous avons recherché de nouveaux inhibiteurs de PARP1, PARP2 et PARP3 parmi les dérivés de 1,4-dihydropyridine, ayant une capacité de liaison à l'ADN. Nos résultats ont révélé que certains analogues de NAD + pourraient être utilisés par les PARPs pour la modification de l'ADN conduisant à la stabilisation des adduits MARylés et PARylés correspondants, en raison de leur résistance à l'activité d'hydrolyse des PARG. Ensemble, ces données mettent en évidence la pertinence physiologique et les résultats biologiques possibles de l’ADP-ribosylation de l’ADN catalysée par les protéines PARPs, tels que la fourniture d'une référence stable de l'emplacement d'une cassure du brin d'ADN sur une carte de chromatine, le recrutement de protéines de réparation de l'ADN et l'inhibition du mécanisme NHEJ toxique
DNA-dependent poly(ADP-ribose) polymerases (PARPs) PARP1, PARP2 and PARP3 act as DNA break sensors signaling DNA damage. Upon detecting DNA damage, these PARPs use nicotine adenine dinucleotide as a substrate to synthesize a monomer or polymer of ADP-ribose (MAR or PAR, respectively) covalently attached to the acceptor residue of target proteins. Recently, it was demonstrated that PARP1–3 proteins can directly ADP-ribosylate DNA breaks by attaching MAR and PAR moieties to terminal phosphates. Nevertheless, little is still known about the mechanisms governing substrate recognition and specificity of PARP1, which accounts for most of cellular PARylation activity, as well, about proteins responsible for detection and removal of ADP-ribosylated DNA adducts and its role in multitude of cellular processes.In this study we provide a detailed characterization of PARP1 DNA substrate specificity and mechanisms of DNA PARylation. We showed that the 3′-terminal phosphate residue at double-strand DNA break ends served as a major acceptor site for PARP1-catalysed PARylation depending on the orientation and distance between DNA strand breaks in a single DNA molecule. Moreover, a preference for ADP-ribosylation of DNA molecules containing 3′-terminal phosphate over PARP1 auto-ADP-ribosylation was observed, and a model of DNA modification by PARP1 was proposed. Similar results were obtained with purified recombinant PARP1 and HeLa cell-free extracts. Thus, the biological effects of PARP-mediated ADP-ribosylation may strongly depend on the configuration of complex DNA strand breaks. Furthermore, we elaborated a new research technique to identify and validate proteins responsible for ADP-ribose-DNA adducts detection (“readers”) or removal (“erasers”). Our proteomic data revealed that MARylated DNA adducts selectively modulated DNA recognition of a large number of proteins involved in different cellular pathways. About 90 proteins including protein complexes were selected as potential MAR-DNA adduct readers. The role of DNA ADP-ribosylation in non-homologous end-joining (NHEJ) was partially characterized in an in vitro study. We demonstrated that ADP-ribosylation of DSB terminus can lead to inhibition of blunt DSB repair by canonical NHEJ if not removed by PARG glycohydrolase. Contrary, presence of a proximal nick with a stabilized apurinic/apyrimidinic site leads to increased NHEJ efficiency, apparently in ADP-ribosylation-independent manner. Finally we searched for novel PARP1, PARP2 and PARP3 inhibitors among derivatives of 1,4-dihydropyridine with DNA binding capacity. Our results revealed that some of NAD+ analogues analogs could be used by PARPs for DNA modification leading to stabilization of corresponding MARylated and PARylated adducts due to their PARG hydrolysis activity resistance. Taking together, these data highlight the physiological relevance and possible biological outcomes of PARP-catalyzed DNA-ADP-ribosylation such as providing a stable benchmark of the location of a DNA strand break on a chromatin map, recruitement of DNA repair proteins and inhibition of the toxic NHEJ