Dissertationen zum Thema „Peptídios bioativos“

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2017.
Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-10-20T17:07:12Z No. of bitstreams: 1 2017_MarianaMagalhãesNóbrega.pdf: 4174042 bytes, checksum: 9430066583171a82f1e6611d82358934 (MD5)
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A caracterização de peptídeos encriptados em proteínas pode ser uma estratégia que possibilita diversas aplicações na biotecnologia, que vão desde o desenvolvimento de novos fármacos até a produção de plantas geneticamente modificadas. O presente estudo tem como objetivo geral a prospecção, bem como, o desenho de novas moléculas a partir de peptídeos encriptados em proteínas que possam apresentar atividades biológicas. Dessa forma, foram desenhados dois peptídeos que apresentam dupla atividade (opioide e hipotensora). Tais peptídeos foram sintetizados isoladamente e também de maneira que formassem uma única cadeia polipeptídica, dando origem a uma pequena proteínas de 35 resíduos contendo duas pontes dissulfeto denominada MTOXI. O objetivo do desenho da MTOXI é a otimização da atividade frente à ação de proteases, permitindo uma liberação possivelmente controlada de peptídeos. Tanto os peptídeos separadamente, quanto a proteína MTOXI foram sintetizados por meio de síntese química em fase sólida, seguida da purificação em cromatografia líquida em alta eficiência. O grau de pureza e a confirmação foram determinados por espectrometria de massa, MALDI e ESI. Os peptídeos foram testados em camundongos por via intraperitoneal, com intuito de avaliar sua possível atividade antinociceptiva nos testes da placa quente (Hot Plate) e teste de retirada da cauda (Tail Flick). Os testes in vivo demonstraram que os peptídeos sintéticos PSLEM 11011 e 11012 apresentaram atividade antinociceptiva com perfil de atividade mais lento e duradouro em relação à morfina. A proteína MTOXI foi digerida com tripsina, em quadruplicatas, sendo avaliado o perfil de proteólise e liberação dos fragmentos peptídicos durante uma hora. O ensaio da digestão foi analisado por LC-MS incluindo os controles positivo (digestão da proteína reduzida) e negativo. A área de cada fragmento no respectivo tempo foi determinada. Os peptídeos bioativos permaneceram íntegros durante o processo de digestão e apresentaram aumento na área ao longo do tempo, o que sugere que a estratégia desenvolvida é promissora para a liberação controlada de peptídeos e para otimização do perfil de atividade. Posteriormente foi iniciada a expressão de peptídeos antimicrobianos encriptados no genoma de Arabidopsis thaliana (planta modelo) para serem reinseridos no genoma da própria planta com o objetivo de diminuir a suscetibilidade da planta contra o fungo Botrytis cinerea. A utilização de peptídeos encriptados para desenhar peptídeos e proteínas com atividade biológica mostrou-se promissora para futuras aplicações biotecnológicas.
The characterization of encrypted peptides from source proteins can be a strategy that enables several biotechnological applications, ranging from the development of new drugs to the production of genetically modified organisms. The following work aimed at prospecting and designing new molecules using peptides encrypted in proteins that may present biological activities. Thus, two peptides with dual activity (opioid and hypotensive) were designed and subsequently inserted into a small protein (MTOXI) with two dissulfide bridges, in order to optimize activity against the action of proteases and allowing a controlled release of the peptides. The peptides and the MTOXI protein were synthesized by chemical solid-phase synthesis using the fmoc strategy, followed by High Performance Liquid Cromatography (HPLC) purification. The purity and sequence confirmation were determined by MALDI and ESI mass spectrometry. The peptides were intraperitoneally injected in mice with the purpose of evaluating the antinociceptive activity via Hot plate and Tail Flick tests. In the in vivo assays, the synthetic peptides PSLEM 11011 and PSLEM 11012 presented antinociceptive activity with a later and long-lasting activity profile compared to morphine. The MTOXI protein was digested with trypsin, in four replicates, and the proteolysis profile and peptide fragment release analyzed during 5, 10, 15, 30, 45 and 60 minutes. The digestion assay was analyzed in each time by LC-MS, including the positive (reduced protein digestion) and negative controls. Determination of the area of each fragment in the respective time was obtained and disulfide pair formation identified. Bioactive peptides remained intact during the digestion process and showed increased area over time, which suggests that the developed strategy for the controlled release of peptides and optimization of activity profile is promising. Later, the identification and selection of peptides with antimicrobial physicochemical properties, encrypted in the genome of Arabidopsis thaliana was conducted. These peptides were reintroduced into A. thaliana´s own genome aiming at reducing plant susceptibility to the pathogen Botrytis cinerea. The use of encrypted peptides to design peptides and proteins with biological activity has shown promise for future biotechnological applications.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2007.
Submitted by Luis Felipe Souza (luis_felas@globo.com) on 2009-01-06T11:50:53Z No. of bitstreams: 1 Tese_2007_GuilhermeBrand.pdf: 2881183 bytes, checksum: 288d28ea9218253f925a58ab10586cf5 (MD5)
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Os capítulos um e dois tratam da prospecção de peptídeos bioativos da secreção de Phyllomedusa hypochondrialis. Mais especificamente, o primeiro aplica técnicas proteômicas, principalmente espectrometria de massa, para o estudo de peptídeos relacionados à bradicinina (BRPs). Estes estavam presentes tanto na secreção solúvel quanto em fragmentos dissecados de pele do anfíbio. Dezoito BRPs, assim como suas modificações pós-traducionais, foram caracterizados por seqüenciamento MS/MS denovo e experimentos de geração de imagens por MALDI em um fragmento de pele. Essas moléculas tiveram alta similaridade de seqüência com as cininas plasmáticas de alguns mamíferos e répteis. Tamanha diversidade de moléculas dentro da mesma família peptídica e pertencendo a mesma espécie pode estar relacionada à especializações funcionais desses peptídeos a uma variedade de receptores correspondentes em diferentes predadores. Também um novo análogo, [Val]1,[Thr]6-bradicinil-Gln,Ser teve sua atividade biológica detectada em culturas celulares expressando o receptor de bradicinina humana B2 e em preparações de íleo de porquinho-da-índia. O capítulo dois descreve a mesma aproximação metodológica para o estudo de peptídeos antimicrobianos da família das dermaseptinas. As estruturas primárias dessas moléculas, nomeadas de DShypo 01, 02, 03, 04, 06 e 07 foram obtidas por experimentos MS/MS de novo, degradação de Edman e seqüenciamento de cDNA. O quinto peptídeo foi o mesmo DS 01 de Phyllomedusa oreades, previamente descrito pelo nosso grupo. A maioria dos peptídeos purificados do extrato cutâneo total de P. hypochondrialis pôde ser diretamente localizada e mapeada em um fragmento de pele dorsal usando técnicas de obtenção de imagens por espectrometria de massa. Comparações foram feitas entre peptídeos e drogas comerciais com relação à suas atividades antimicrobianas e contra Leishmania amazonensis. Também foram executados estudos comparativos dos efeitos líticos em células do sangue de mamíferos e da interação com vesículas de DMPC por ressonância plasmônica de superfície. Os capítulos três e quatro tratam do estudo da interação de peptídeos membranoativos com membranas modelo, com ênfase em sua categorização em grupos e predição de atividade. Para tal, dezessete peptídeos membrano-ativos foram sintetizados e tiveram suas interações com vesículas unilamelares de DMPC e de DMPC/DMPG (2:1 mol/mol) estudadas por uma série de técnicas biofísicas. Estas técnicas permitiram a dissecção das interações entre peptídeos e membranas em termos de sua interação inicial, grau de inserção em membranas e indução de extravasamento de marcadores fluorescentes. Por esta aproximação, ficou clara a existência de no mínimo cinco sub-grupos funcionais de peptídeos membrano-ativos, sendo três desses grupos compostos por antimicrobianos, um de peptídeos penetradores de células e mais um de peptídeos membrano-ativos capazes unicamente de adsorção em membranas. Também as relações estrutura e função são revistas de acordo com esta nova perspectiva. O capítulo quatro descreve a determinação de parâmetros termodinâmicos para a adsorção do mesmo grupo de dezessete peptídeos em vesículas fosfolipídicas. Para tal, as isotermas de interação obtidas por calorimetria de titulação isotérmica (ITC) foram analisadas pelo método de partição em superfície. Esse método é capaz de extrair das isotermas uma constante de afinidade intrínsica ao peptídeo (Kp), a qual exclui efeitos eletrostáticos, além de uma constante de afinidade aparente (Kapp). Somente quatro dos dezessete peptídeos tiveram isotermas passíveis de ajuste com extração de parâmetros verossímeis. Esses peptídeos tiveram interação primariamente eletrostáticas com membranas, conforme classificado no capítulo três. As causas do não ajuste das isotermas de interação para alguns peptídeos foram discutidas em detalhe e relacionadas ao seu mecanismo de interação específico. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT
Chapters one and two deal with the isolation and identification of bioactive peptides from the skin secretion of Phyllomedusa hypochondrialis. The first chapter demonstrates the use of protemic techniques, mainly mass spectrometry, for the study of bradykinin related peptides (BRPs) present in the amphibian´s secretion and freshly dissected skin fragments. Eighteen BRPs, along with their post-translational modifications, were characterized in the secretion by de novo MS/MS sequencing and direct MALDI imaging experiments on the frog skin. These molecules revealed strong sequence similarities to the main plasma kinins of mammals and reptiles. Such a diversity of molecules, within the same peptide family, belonging to a single amphibian species may be related to functional specializations of these peptides and a variety of corresponding receptors that might be present in a number of different predators. Also, a novel analog, [Val]1,[Thr]6-bradykinyl-Gln,Ser had its biological activity positively detected in cell culture expressing the human bradykinin B2 receptor and in guinea pig ileum preparations. Chapter two describes the same methodological approach to the study of antimicrobial peptides from the dermaseptin family. The primary structures of these molecules, named DShypo 01, 02, 03, 04, 06, and 07, were determined by de novo MS/MS experiments, Edman degradation, and cDNA sequencing. The fifth peptide was found to be precisely the same DS 01 from Phyllomedusa oreades, previously described by our group. The majority of the peptides purified from the crude skin secretion could be directly localized and mapped onto a freshly dissected dorsal skin fragment using mass spectrometry-imaging techniques. Comparisons between peptides and commercial drugs on their antibacterial and anti-Leishmania amazonensis efficiencies, associated with peptide lytic effects on mammalian blood cells and surface plasmon resonance interaction studies on immobilized DMPC vesicles, were also performed. Chapters three and four describe the study of membrane-active peptides with model membranes, emphasizing their categorization and bioactivity prediction. Seventeen membrane-active peptides were synthesized and had their interaction with DMPC and DMPC/DMPG (2:1 mol/mol) large unilamelar vesicles studied by a series of biophysical techniques. These techniques allowed the dissection of the interaction of peptides with membranes in terms of their initial recognition, degree of insertion in the bilayer and induction of fluorescent dye leakage. This approach made clear the existence of at least five functional groups of membrane-active peptides, three of them composed of antimicrobial molecules, one of cell-penetrating peptides and one of peptides only capable of adsorption. Also, structural and functional relationships relevant to the interaction of peptides and membranes were re-evaluated according to this new perspective. Chapter four deals with the extraction of thermodynamical parameters from the adsorption of the same group of seventeen peptides into phospholipid vesicles. For such, interaction isotherms were obtained by isothermal titration calorimetry (ITC) and analyzed by the surface partition method. This method is capable of estimating an intrinsic affinity constant (Kp), that excludes electrostatic effects, as well as an apparent affinity constant (Kapp). Membrane adsorption of only four out of seventeen peptides resulted in isotherms capable of adjustment to the surface partition model. These peptides had interactions mainly driven by electrostatic effects, as categorized in chapter three. The reasons for the incapacity to fit the isotherms were discussed and related to specific peptide mechanisms.

Peptídeos antimicrobianos (AMP) são importantes componentes do sistema imune de todos os organismos vivos. No plasma de Acanthoscurria rondoniae isolamos 15 AMP com similaridade com a hemocianina. As sete subunidades da hemocianina foram sequenciadas e sua estrutura tridimensional determinada. A rondonina, processada a partir de uma enzima do plasma em condições ácidas apresentou melhor atividade em pH ácido, sinergismo com gomesina, não citotóxico, não interagiu com membranas artificiais lipídicas, protegeu as células da infecção por vírus humanos de RNA e seu mecanismo de ação em leveduras está associado com material genético. Nossos resultados nos ajudam a entender porque aracnídeos sobreviveram por um longo tempo na escala evolutiva. E como as doenças infecciosas estão entre as principais causas de morte da população humana torna-se vital investir na busca de substâncias naturais ou sintéticas que exibam atividades antimicrobianas específicas e, acima de tudo, que as exerçam através de mecanismos de ação alternativos daqueles dos antibióticos disponíveis.
Antimicrobial peptides (AMP) are important components of the immune system of all living organisms. In the plasma of Acanthoscurria rondoniae we isolated 15 AMP with similarity to hemocyanin. The seven subunits hemocyanin were sequenced and determined its three-dimensional structure. The rondonin, processed from a plasma enzyme under acidic conditions showed best activity at acid pH, synergism with gomesin, non-cytotoxic, does not interacted with lipid artificial membrane, protected the cells from infection by human virus RNA and its mechanism of action in yeast is associated with genetic material. Our results help us understand why arachnids have survived for a long time on the evolutionary scale. And how infectious diseases are among the leading causes of death in human population becomes vital to invest in the search for natural or synthetic substances that exhibit specific antimicrobial activities and, above all, that engage through alternative mechanisms of action of these antibiotics available.

Orientador: Luciana Francisco Fleuri
Resumo: A fermentação em estado sólido (FES) é um bioprocesso especialmente adequado para obtenção de produtos de alto valor biotecnológico, tais como enzimas resultantes do metabolismo de micro-organismos. É particularmente interessante para fungos filamentosos, que são adaptados ao sistema, crescendo em substratos sólidos com baixo ou nenhum teor de água livre. A FES oferece diversas vantagens em relação à fermentação submersa, com destaque para a sustentabilidade e economia do processo pelo baixo consumo de água e a aproveitamento de resíduos agroindustriais, que podem ser utilizados como substratos e são amplamente disponíveis. Mundialmente, a demanda industrial por enzimas está em ascensão: movimentou USD 4,4 bilhões em 2015 e possui crescimento estimado em 7,8% (USD 2 bilhões) para 2015-2020. As enzimas obtidas por FES apresentam elevada versatilidade, relacionada às diferentes capacidades hidrolíticas e propriedades bioquímicas, cujas enzimas proteolíticas produzidas por esse sistema podem ser aplicadas na produção de fragmentos proteicos com atividades biológicas distintas capazes de beneficiar a saúde humana e animal, denominados peptídeos bioativos. Já foram obtidos peptídeos bioativos com ações antimicrobiana, antioxidante, antihipertensiva, imunomodulatória, opióide e antineoplásica. É reportado que estes compostos podem ser mais seletivos quando comparados a outras pequenas moléculas empregadas como fármacos. O leite é uma das principais fontes de obtenção de peptídeos r... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)
Doutor

This work consists of studies on the structure and interactions with membrane-mimetic media of the antimicrobial peptides distinctin, an heterodimer composed of two peptide chains (chain 1 and chain 2) covalently bonded through a dissulfide bond and isolated from the skin of Phyllomedusa distincta anurans, native from the Brazilian Atlantic Forest; Hylaseptin P2 (HSP2) and the phenylseptins [L-Phe2]-Phenylseptin (L-Phes) and [D-Phe2]-Phenylseptin (D-Phes), all three isolated from Hypsiboas punctatus anurans, found on the Amazon tropical forest. All these peptides show considerable activity against both Gram-positive and Gram-negative bacteria, reason why there is growing interest in better understanding the mechanistic pathway these molecules follow on exerting their biological activities. The most widely accepted model for such mechanism is the Shai-Matsuzaki-Huang model (Matsuzaki, 1999; Shai, 1999; Huang, 2000; Yang, 2000; Papo, 2005), which takes into account a strong influence of the peptides structures on their biological activities. Hence the need to study these peptides on a structural level in order to propose a consistent model. The aforementioned peptides had their structures studied and determined by means of Circular Dichroism (CD) and solution Nuclear Magnetic Resonance (NMR). The results showed that all peptides presented well-ordered tertiary structures, all of them also quite rich on a-helical secondary structure and with a sharp amphipathic character. Distinctins structural model, albeit showing considerable ordering when taking into account each monomeric chain separately, did not present a very well-defined overall orientation of one chain in relation to the other. The CD results, however, indicated stark a-helical structuration for both the chains as well as for the heterodimer, although it suggests that the interaction between the peptide and the phospholipid is better described as an equilibrium with more than two states. For the HSP2, the results of the CD experiments on small unilamelar vesicles and the NMR experiments in 2,2,2-triluoroethanol (TFE) showed a high content of a-helix and the models derived from the NMR data also showed a sheer amphipathic character. For the phenylseptins, the NMR experiments in DPC also led to a-helix-rich structures, being that D-Phes showed a slightly higher structuration degree than LPhes. The solid-state NMR experiments were performed for HSP2 and the two phenylseptins, with mechanically-oriented samples containing 1-palmitoyl-2-oleoylphosphatidylcholine (POPC) bilayers and the peptides selectively-labeled with 15N and 2H. From the measurements of anisotropic properties such as 15N chemical shifts, and 2H quadrupolar splitting, it was possible to calculate the possible orientations for the structure determined from the solution NMR data. For HSP2, the concomitant analysis of both solid-state and solution NMR results showed that the peptide interacts strongly with the bilayer, in way such that its hydrophobic side is in direct contact with the phospholipids aliphatic chains and in a quasi-paralell orientation in relation to the bilayers surface. The epimers L-Phes and D-Phes, albeit showing very similar tertiary structures, their calculated orientations are significantly different, which suggests that these peptides interact with the bilayer in distinct manners when comparing one to the other. Another part of this work comprises the study of the HSP2 peptide-lyposome interactions thermodynamics through Isotermal Titration Calorimetry (ITC). These studies showed that the interaction in question is strongly dependent on the concentration of the peptide on the media and that, in spite of having a sharp electrostatic character at an initial moment which consist on the approximation of the peptide to the membrane, it is mostly maintained by hydrophobic interactions between the non-polar sidechains and the membranes hydrophobic core. The analysis of these results together with the NMR ones, allowed us to build a more complete and detailed model for the interaction between the peptide and the bacterial membrane.
Este trabalho consiste no estudo de estrutura e interação com meios miméticos de membrana dos peptídeos antimicrobianos Distinctina, heterodímero composto de duas cadeias polipeptídicas (cadeia 1 e cadeia 2) ligadas covalentemente por meio de uma ligação de dissulfeto entre resíduos de cisteína, e isolada de secreções epiteliais de anuros da espécie Phyllomedusa distincta, nativa da Mata Atlântica brasileira; Hilaseptina P2 (HSP2) e das fenilseptinas, constituídas pelo par de epímeros [L-Phe2]-Fenilseptina (L-Phes) e [D-Phe2]-Fenilseptina (DPhes), todas as três isoladas de glândulas epiteliais de anuros da espécie Hypsiboas punctatus, nativa da Floresta Amazônica. Todos esses peptídeos apresentam considerável atividade contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas e, por isso, há interesse em se estudar o mecanismo pelo qual essas substâncias exercem essa atividade biológica. O modelo de mecanismo mais aceito para esse tipo de peptídeo, denominado modelo de Shai-Matsuzaki-Huang (Matsuzaki, 1999; Shai, 1999; Huang, 2000; Yang, 2000; Papo, 2005) leva em conta forte influência da estrutura dos peptídeos sobre suas atividades biológicas. Tendo isso em vista, surge a necessidade de se estudar as estruturas dessas biomoléculas para se elucidar o mecanismo de suas atividades antimicrobianas. Os peptídeos em questão foram estudados a nível estrutural utilizando-se técnicas de Dicroísmo Circular (CD) e Ressonância Magnética Nuclear (RMN) em solução. Resultados mostraram que todos eles apresentam estruturas terciária ordenadas, ricas em a-hélice e de caráter altamente anfipático. O modelo estrutural do peptídeo distinctina, embora tenha apresentado ordenação considerável levando-se em conta cada cadeia monomérica separadamente, não apresenta orientação relativa entre as duas cadeias muito bem definida. Resultados de CD, no entanto, indicam forte estruturação a-helicoidal, tanto do heterodímero quanto de suas cadeias monoméricas individuais, apesar de sugerir que a interação peptídeo fosfolipídeo se dá por meio de um equilíbrio envolvendo mais de dois estados. Para a HSP2, resultados de CD em vesículas unilamelares e RMN em 2,2,2-trifluoretanol (TFE) mostraram alto conteúdo de a-hélice e os modelos obtidos a partir da RMN apresentam ainda alto grau de anfipaticidade. Estudos de RMN em DPC das fenilseptinas levaram a modelos também ricos em a-hélice, sendo que a D-Phes mostrou grau de estruturação ligeiramente maior que a L-Phes. Os experimentos de RMN em fase sólida foram realizados para a HSP2 e as fenilseptinas, com amostras mecanicamente orientadas contendo bicamadas do fosfolipídeo 1-palmitoil-2- oleoilfosfatidilcolina (POPC) e os respectivos peptídeos seletivamente marcados com 15N e 2H. A partir da medição de propriedades anisotrópicas como deslocamento químico de 15N e desdobramento quadrupolar de 2H, foi possível determinar as possíveis orientações das estruturas calculadas com base nos dados de RMN em solução e inferir a respeito da maneira pela qual a interação peptídeo-membrana ocorre. Para a HSP2, a análise conjunta dos resultados de RMN em solução e em fase sólida mostrou que o peptídeo interage fortemente com a bicamada, de forma que sua face hidrofóbica está em contato direto com o interior alifático da estrutura fosfolipídica e orientado quase totalmente paralelo à superfície da bicamada. Os epímeros L-Phes e D-Phes, embora tenham estruturas terciárias próximas, mostraram orientações bastante diferentes entre si, evidenciando que os peptídeos interagem com membrana de formas distintas. Uma outra parte do trabalho diz respeito aos estudos termodinâmicos da interação peptídeo-lipossoma da HSP2 por meio da técnica de Calorimetria de Titulação Isotérmica (ITC). Esses estudos mostraram que a interação em questão é fortemente dependente da concentração do peptídeo no meio e que, apesar de possuir um caráter mais eletrostático em um momento inicial, que envolve a aproximação do peptídeo com a membrana, ela é mantida principalmente por interações do tipo hidrofóbicas entre os resíduos de cadeia lateral apolares e o interior alifático da bicamada fosfolipídicas. A análise conjunta de todos os resultados obtidos por diferentes metodologias permitiu construir um modelo mais detalhado para a interação entre o peptídeo e a membrana bacteriana.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2009.
Submitted by Allan Wanick Motta (allan_wanick@hotmail.com) on 2010-03-05T17:31:42Z No. of bitstreams: 1 2009_CarlaSimoneVizzotto.pdf: 3539881 bytes, checksum: b07d43eaf6ed86b3ae63ef89eab91b2f (MD5)
Approved for entry into archive by Lucila Saraiva(lucilasaraiva1@gmail.com) on 2010-03-06T00:48:28Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_CarlaSimoneVizzotto.pdf: 3539881 bytes, checksum: b07d43eaf6ed86b3ae63ef89eab91b2f (MD5)
Made available in DSpace on 2010-03-06T00:48:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_CarlaSimoneVizzotto.pdf: 3539881 bytes, checksum: b07d43eaf6ed86b3ae63ef89eab91b2f (MD5) Previous issue date: 2009
A peçonha de aranhas constitui-se como um conjunto diverso de moléculas bioativas, usado para subjugar a presa e eventualmente para defesa. Essas moléculas atuam de formas variadas em muitos sistemas biológicos e despertam interesse pelo seu potencial para a prospecção de produtos naturais. Pouco se sabe sobre as peçonhas de aranhas caranguejeiras do Brasil. Este estudo apresenta a caracterização de componentes da peçonha de Lasiodora sp. bem como sua atividade biológica. Foram detectados 191 componentes na peçonha de Lasiodora sp. com predominância de componentes com massa molecular menor que 1000 Da e entre 4000 e 8500 Da. A atividade cardiotóxica foi atribuída aos componentes de baixo peso molecular da peçonha. Quatro peptídeos tiveram sua estrutura primária parcialmente elucidada. A análise de similaridade desses peptídeos isolados e caracterizados sugeriu a atividade em canais iônicos, que não foi detectada nos ensaios eletrofisiológicos. A peçonha bruta de Lasiodora sp. inibiu de maneira significativa o crescimento das bactérias Escherichia coli e Staphylococcus aureus. A atividade antibacteriana foi identificada em oito frações cromatográficas e em um grupo de frações com baixa massa molecular (JL1), sendo que não foi possível a determinação de MIC. Este estudo contribui para a compreensão da diversidade e complexidade da peçonha da aranha Lasiodora sp., bem como preenche lacunas até então não esclarecidas para essa espécie. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT
The spider venom is a diverse set of bioactive molecules, used to subdue the prey and possibly for defense. These molecules act in various forms in many biological systems and arouse interest in its potential for the exploration of natural products. Little is known about the Tarantula venoms from Brazil. This study presents the characterization of components from the venom of Lasiodora sp. and its biological activity. We identified 191 molecular mass components in the Lasiodora sp. venom, with prevalence of components smaller than 1000 Da and between 4000 and 8500 Da. The cardiotoxic activity was attributed to low molecular weight components. Four peptides had their primary structure partially elucidated. The analysis of similarity of these isolated and characterized peptides suggest activity on ion channels, which was not detected in the electrophysiological testing. The Lasiodora sp. crude venom significantly inhibited the bacteria Escherichia coli and Staphylococcus aureus growth. The antibacterial activity was identified in eight chromatographic fractions, and in a group of low molecular weight fractions (JL1), which was not possible to determine MIC. This study contributes to understanding the diversity and complexity of the venom of the spider Lasiodora sp. and then fills gaps unclear for this species.

Orientador: Ana Maria Minarelli Gaspar
Coorientador: Reinaldo Marchetto
Coorientador: Miguel Angel Rodriguez
Banca: Marlus Chorilli
Banca: Rondinelli Donizetti Herculano
Banca: Carlos Alberto Fortulan
Banca: Eliana Cristina da Silva Rigo
Resumo: O desenvolvimento de biomateriais que promovam a reparação de tecidos lesionados tem sido objeto de intensa investigação. Em relação à reparação do tecido ósseo, as cerâmicas são materiais muito pesquisados em função de sua ampla possibilidade de uso, inclusive na confecção de pastas cimentícias moldáveis. A sílica mesoporosa apresenta elevada área de superfície específica (~1000 m 2 .g - 1 ) e tamanho de poros usualmente em torno de 2 - 30 nm, atraindo atenção para aplicações como importantes carreadores de fármacos e proteínas. O peptídeo de crescimento osteogênico (OGP) é um tetradecapeptídeo endóge no, cuja forma ativa atua como agente anabólico e estimulador hematopoiético, promovendo a diferenciação osteoblástica. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi desenvolver um cimento ósseo injetável, reabsorvível e bioativo, com sílica mesoporosa e pept ídeo de crescimento osteogênico. O peptídeo foi sintetizado pelo método em fase sólida, purificado por Cromatografia Líquida (HPLC) e caracterizado por Espectrometria de Massas. O material mesoporoso foi sintetizado pela metodologia sol - gel e sua porosidad e confirmada por Adsorção - dessorção de N 2, Espalhamento de Raios X à Baixo Ângulo e Microscopia Eletrônica de Transmissão. Os cimentos foram preparados a partir de sulfato de cálcio (CaS), fosfato de cálcio (CaP) e aluminato de cálcio (CaAl), sem e com síl ica mesoporosa, e analisados quanto suas características físico - químicas. Os experimentos in vitro foram realizados para avaliar o potencial citotóxico e genotóxico dos cimentos em cultura de células de ovário (CHO - K1) e análise da viabilidade celular e fo rmação da matriz mineralizada em células pré - osteosblásticas (MC3T3 - E1). O estudo in vivo foi realizado em defeitos ósseos críticos em calvária de ratos e analisado quanto à formação de tecido ósseo, por histo...
Abstract: The development of biomaterials that promote repair of injured tissues ha s been the subject of intense research. Regarding the bone tissue repair, ceramics are one of the most researched biomaterials groups due to its wide possibility of use, including cement pastes with good moldability. The mesoporous silica has high specific surface area (~1000 m 2 .g - 1 ) and pore size usually around 2 - 30 nm attracting attention for its applications as drugs and proteins carriers. The osteogenic growth peptide (OGP) is an endogenous tetradecapeptide, whose active form acts as an anabolic agent a nd hematopoietic stimulator, promoting osteoblast differentiation. Thus, the aim of this study was to develop an injectable bone cement, resorbable and bioactive, mesoporous silica and osteogenic growth peptide. The peptide was synthesized by the solid pha se method, purified by High Performande Liquid Chromatography (HPLC) and characterized by Mass Spectrometry. The mesoporous materials were synthesized by sol - gel method and its porosity confirmed by Adsorption - desorption of N 2, Small - angle X - ray Scattering and Transmission Electronic Microscopy. Cements were prepared from calcium sulfate (CaS), calcium phosphate (CaP) and calcium aluminate (CaAl), without and with mesoporous silica, and analyzed for its physicochemical characteristics. In vitro experiments were carried out to evaluate the cements cytotoxic and genotoxic potential in CHO - K1 hamster ovary cell line and analysis of the mineralized matrix formation in MC3T3 - E1 osteosblastics cell line. The in vivo study was performed in critical defects in rat c alvaria, and it has analized as formation of bone tissue by histomorphometry and density of newly formed tissue by X - ray images. The cements analysis have shown that the presence of mesoporous silica particles promoted different physico - chemical behavior w hen compared to those without silica...
Doutor

Submitted by LARISSA MENDES DE LÁZARI null (la_mendes@hotmail.com) on 2016-04-15T18:28:04Z No. of bitstreams: 1 TeseDoutorado_LarissaMendes_2016_Biotecnologia.pdf: 8907863 bytes, checksum: 3f7981847cc9e559ac7b11f4d8bfd245 (MD5)
Approved for entry into archive by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br) on 2016-04-18T19:50:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 lazari_lm_dr_araiq_par.pdf: 1543856 bytes, checksum: 1cc6d6cd934ed8b9a35d1931133a26cd (MD5)
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Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)
O desenvolvimento de biomateriais que promovam a reparação de tecidos lesionados tem sido objeto de intensa investigação. Em relação à reparação do tecido ósseo, as cerâmicas são materiais muito pesquisados em função de sua ampla possibilidade de uso, inclusive na confecção de pastas cimentícias moldáveis. A sílica mesoporosa apresenta elevada área de superfície específica (~1000 m2.g-1) e tamanho de poros usualmente em torno de 2-30 nm, atraindo atenção para aplicações como importantes carreadores de fármacos e proteínas. O peptídeo de crescimento osteogênico (OGP) é um tetradecapeptídeo endógeno, cuja forma ativa atua como agente anabólico e estimulador hematopoiético, promovendo a diferenciação osteoblástica. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi desenvolver um cimento ósseo injetável, reabsorvível e bioativo, com sílica mesoporosa e peptídeo de crescimento osteogênico. O peptídeo foi sintetizado pelo método em fase sólida, purificado por Cromatografia Líquida (HPLC) e caracterizado por Espectrometria de Massas. O material mesoporoso foi sintetizado pela metodologia sol-gel e sua porosidade confirmada por Adsorção-dessorção de N2, Espalhamento de Raios X à Baixo Ângulo e Microscopia Eletrônica de Transmissão. Os cimentos foram preparados a partir de sulfato de cálcio (CaS), fosfato de cálcio (CaP) e aluminato de cálcio (CaAl), sem e com sílica mesoporosa, e analisados quanto suas características físico-químicas. Os experimentos in vitro foram realizados para avaliar o potencial citotóxico e genotóxico dos cimentos em cultura de células de ovário (CHO-K1) e análise da viabilidade celular e formação da matriz mineralizada em células pré-osteosblásticas (MC3T3-E1). O estudo in vivo foi realizado em defeitos ósseos críticos em calvária de ratos e analisado quanto à formação de tecido ósseo, por histomorfometria, e densidade do tecido neoformado, por imagens de raios X. As análises dos cimentos demostraram que a presença de partículas de sílica mesoporosa promoveu diferentes comportamentos físico-químicos quando comparados aos cimentos sem sílica, como maior razão líquido/pó e, consequentemente, maior porosidade e menor resistência mecânica à compressão. Os cimentos CaP e CaAl, sem e com sílica, mostraram bioatividade in vitro quando imersos em solução que simula o fluido corpóreo (Simulated Body Fluid - SBF). No estudo de liberação do peptídeo OGP, incorporado nas partículas de sílica mesoporosa pré-misturada aos cimentos, o cimento CaS apresentou maior velocidade de liberação em relação aos cimentos estudados, com 80% do conteúdo peptídico liberado em 24 horas. Em relação à viabilidade celular, os cimentos CaS, com e sem sílica, não foram citotóxicos, mas os cimentos CaP e CaAl, apresentaram citotoxicidade; todavia esse comportamento não comprometeu a proliferação celular e nos ensaios de avaliação da mutagenicidade, os cimentos não promoveram dano celular significante. Os testes envolvendo células MC3T3-E1 mostraram que a viabilidade celular e a capacidade de formação da matriz mineralizada foram independentes da presença do peptídeo OGP, sendo mais sensível à presença de sílica e ao tempo de tratamento com os meios condicionados. Os resultados do teste in vivo, com os cimentos CaP, com e sem sílica mesoporosa e peptídeo OGP, demostraram que esses se degradaram e promoveram maior formação óssea durante os primeiros 15 dias pós-cirúrgico, com aproximadamente 30% do defeito preenchido por tecido neoformado, assim como maior densidade nas margens dos defeitos quando comparados com o controle. No entanto, a presença do peptídeo OGP foi significante somente nos primeiros 30 dias pós-cirúrgico de análise e não houve diferença estatística com o cimento com sílica e sem peptídeo. Além do mais, não houve diferença entre os grupos experimentais e o controle nos períodos mais tardios de análise. De acordo com os resultados obtidos, conclui-se que, dentre os cimentos estudados, aqueles com partículas de sílica mesoporosa e peptídeo OGP são os mais promissores para o reparo do tecido ósseo, principalmente nos períodos iniciais de cicatrização, devido ao seu potencial osteogênico.
The development of biomaterials that promote repair of injured tissues has been the subject of intense research. Regarding the bone tissue repair, ceramics are one of the most researched biomaterials groups due to its wide possibility of use, including cement pastes with good moldability. The mesoporous silica has high specific surface area (~1000 m2.g-1) and pore size usually around 2-30 nm attracting attention for its applications as drugs and proteins carriers. The osteogenic growth peptide (OGP) is an endogenous tetradecapeptide, whose active form acts as an anabolic agent and hematopoietic stimulator, promoting osteoblast differentiation. Thus, the aim of this study was to develop an injectable bone cement, resorbable and bioactive, mesoporous silica and osteogenic growth peptide. The peptide was synthesized by the solid phase method, purified by High Performande Liquid Chromatography (HPLC) and characterized by Mass Spectrometry. The mesoporous materials were synthesized by sol-gel method and its porosity confirmed by Adsorption-desorption of N2, Small-angle X-ray Scattering and Transmission Electronic Microscopy. Cements were prepared from calcium sulfate (CaS), calcium phosphate (CaP) and calcium aluminate (CaAl), without and with mesoporous silica, and analyzed for its physicochemical characteristics. In vitro experiments were carried out to evaluate the cements cytotoxic and genotoxic potential in CHO-K1 hamster ovary cell line and analysis of the mineralized matrix formation in MC3T3-E1 osteosblastics cell line. The in vivo study was performed in critical defects in rat calvaria, and it has analized as formation of bone tissue by histomorphometry and density of newly formed tissue by X-ray images. The cements analysis have shown that the presence of mesoporous silica particles promoted different physico-chemical behavior when compared to those without silica, such as higher ratio Liquid/Powder, higher porosity and, hence, decreases the mechanical resistance. CaP and CaAl cements showed bioactivity in vitro when immersed in Simulated Body Fluid solution. Concerning OGP liberation, the CaS cement showed the fastest release in the OGP-mesoporous silica-loaded cement release studies, releasing 80% peptide loaded in 24 hours. Regarding cell viability, CaS cements with and without silica, were not cytotoxic, but the CaP and CaAl cement showed cytotoxicity; however this behavior did not affect cell proliferation. And in mutagenicity tests, the cements did not promote significant cell damage. The tests involving MC3T3-E1 cells showed that cell viability and mineralized matrix formation capacity is independent of the OGP peptide presence and it is more sensitive to the presence of silica and the treatment time with the conditioned culture media. The test in vivo, with CaP cements, with and without mesoporous silica and OGP, demonstrated that these cements have degraded and promoted increased bone formation during the first 15 postoperative days, with approximately 30% of the defect filled by newly formed tissue as well as higher density on the defects borders when compared to the control. However, the presence of OGP peptide was significant only during the first 30 days postoperative, but there was no statistical difference with silica cement and without this peptide. Furthermore, there was no difference between experimental groups and the control in the later study periods. According to the results, it is concluded that, among the cements studied, those with mesoporous silica particles and OGP peptide are the most promising for bone tissue repair, especially in the initial stages of healing due to its osteogenic potential.
FAPESP: 2012/21735-6
CAPES: 0224-13-8

Submitted by Pedro Barros (pedro.silvabarros@ufpe.br) on 2018-07-31T22:13:07Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Nathalia Albuquerque Roberto.pdf: 2170710 bytes, checksum: d4675cfd7d221fc806601335f88f71e1 (MD5)
Approved for entry into archive by Alice Araujo (alice.caraujo@ufpe.br) on 2018-08-02T17:18:18Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Nathalia Albuquerque Roberto.pdf: 2170710 bytes, checksum: d4675cfd7d221fc806601335f88f71e1 (MD5)
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CAPES
Os resíduos de processamento de peixe são uma importante fonte de recursos subutilizados que apresentam potencial para diversas aplicações biotecnológicas. A espécie Coryphaena hippurus, conhecida no Brasil como dourado, representa um importante recurso pesqueiro com uma ampla distribuição global. O colágeno, é uma proteína fibrosa encontrada em todo o reino animal, que possui uma variedade de aplicações industriais, principalmente nos setores farmacêutico, de cosméticos e alimentos. Devido aos baixos riscos de transmissão de doenças, alto rendimento nos processos de extração e ausência de toxicidade, organismos aquáticos têm se destacado como uma alternativa frente ao colágeno comercial (obtido a partir de animais terrestres). Assim, o presente trabalho teve por objetivo produzir peptídeos bioativos através da hidrólise do colágeno isolado da pele de dourado (C. hippurus), empregando colagenase extraída de suas vísceras intestinais. O rendimento da extração do colágeno ácido solúvel (ASC) e pepsino solúvel (PSC) foi de 43% e 3%, respectivamente. A SDS-PAGE do ASC e PSC apresentaram padrão de bandas semelhante ao encontrado na literatura para amostras de colágeno, com cadeias α 1 e α 2, bem como cadeia β. O espectro de absorção ultravioleta (UV) de ambos colágenos apresentou absorção máxima a 230 nm. A solubilidade de ASC e PSC foi maior na faixa de pH ácida, alcançando seu máximo em pH 1 e 2, respectivamente. A solubilidade do ASC foi superior em baixas concentrações de NaCl, apresentando diminuição da solubilidade em concentrações acima de 1%. Os espectros FTIR do ASC e PSC exibiram picos característicos de Amida I, II, III bem como amida A e B, semelhantes a colágenos do tipo I de outros peixes. Os resultados obtidos neste estudo indicam a possibilidade de obtenção de proteases e colágeno do tipo I a partir da pele do dourado para a produção de peptídeos bioativos.
Fish processing wastes are an important source of underutilized resources that have potential for various biotech applications. The species Coryphaena hippurus, represents an important fishery resource with a wide global distribution. Collagen is a fibrous protein found throughout the animal kingdom, which has a variety of industrial applications, mainly in the pharmaceutical, cosmetics and food industries. Due to the low risks of disease transmission, high yields in the extraction processes and absence of toxicity, aquatic organisms have stood out as an alternative against commercial collagen (obtained from terrestrial animals). Therefore, the present work aimed to produce bioactive peptides through the hydrolysis of collagen isolated from the skin of gold (C. hippurus), using collagenase extracted from its intestinal viscera. The extraction yield of ASC and PSC was 43% and 3%, respectively. The SDS-PAGE of the ASC and PSC presented bands pattern similar to that found in the literature for samples of collagen, with α 1 and α 2 chains, as well as β chain. The ultraviolet (UV) absorption spectrum of both collagens showed maximum absorption at 230 nm. The solubility of ASC and PSC was higher in the acid pH range, reaching its maximum at pH 1 and 2, respectively. The solubility of the ASC was higher at low NaCl concentrations, with a decrease in solubility at concentrations above 1%. FTIR spectra of ASC and PSC exhibited characteristic peaks of Amide I, II, III as well as amide A and B, similar to type I collagens of other fish. The results obtained in this study indicate the possibility of obtaining proteases and type I collagen from the skin of gilt for the production of bioactive peptides.

A lagarta da espécie Lonomia obliqua é medicamente importante, cujo veneno, presente nas espículas, causa uma síndrome hemorrágica caracterizada por equimoses, alterações da coagulação, dentre outros sintomas. Isto sugere a presença de peptídeos bioativos com potencial farmacêutico, devido à capacidade de modular o comportamento das células endoteliais. O objetivo deste estudo é analisar os potenciais efeitos do veneno de Lonomia obliqua na angiogênese. Uma linhagem celular endotelial (HUVEC) foi exposta a diferentes concentrações do extrato de espículas da Lonomia obliqua (Lonomia obliqua Bristle extract - LOBE) 5 μg/mL, 10 μg/mL, 20 μg/mL e 50 μg/mL. Empregando citometria de fluxo, observou-se que nenhuma das doses afetou o ciclo celular, viabilidade ou apoptose das células endoteliais após 24h de exposição. Os esferóides das células HUVEC foram plaqueados numa matriz 3D de colágeno e observou-se que LOBE (10 μg/mL, 20 μg/mL e 50 μg/mL) induz um aumento na migração celular, consistente com o processo de angiogênese. A análise da dinâmica da VE-caderina indica que a exposição imediata a LOBE (10 μg/mL) induz um desprendimento da junção célula-célula, o que corrobora com a hemorragia observada nas vítimas de envenenamento. Através de espectrometria de massa, observou-se que LOBE possui vários potenciais peptídeos bioativos. Grupos destes peptídeos foram isolados por fracionamento com metanol a partir do veneno bruto. Os peptídeos presentes, em cada uma das 10 frações, foram caracterizados por espectrometria de massa e foram analisados os efeitos de cada fração sobre a angiogênese. Os resultados sugerem que alguns dos efeitos do envenenamento por Lonomia obliqua são devidos à presença de peptídeos bioativos que modulam o comportamento das células endoteliais.
The caterpillar of the species Lonomia obliqua is medically important, whose venom present in the bristles leads to an hemorrhagic syndrome characterized by ecchymosis, coagulation disorders and others symptoms. This suggests the presence of bioactive peptides with pharmaceutical potencial due to the ability to modulate the behavior of endothelial cells. The aim of this study is to analyze the potential effects of Lonomia obliqua venom on angiogenesis. An endothelial cell line (HUVEC) was exposed to different concentrations (5 μg/mL, 10 μg/mL, 20 μg/mL and 50 μg/mL) of Lonomia obliqua bristle extract (LOBE). Using flow cytometry, it was observed that none of the doses affected endothelial cell cycle, cell viability or apoptosis after 24h of exposition. Spheroids of HUVEC cells were plated in a 3D-collagen matrix and it was observed that LOBE (10 μg/mL, 20 μg/mL and 50 μg/mL) induced an increase on cell migration consistent with the angiogenesis process. Analysis of VE-cadherin dynamics indicates that the immediate exposition to LOBE (10 μg/mL) induced a loosening of cell-cell junction, which corroborates with the hemorrhage observed in the victims. By mass spectroscopy, it was observed that LOBE possesses several potentially bioactive peptides. Groups of these peptides were isolated by a methanol-based fractioning of the crude venom. The peptides present in each of the 10 fractions were characterized by mass spectroscopy and it was analyzed the effects of each fraction on angiogenesis. The results suggest that some of the effects of Lonomia obliqua envenomation are due to the presence of bioactive peptides that modulate the behavior of endothelial cells.

Submitted by Maike Costa (maiksebas@gmail.com) on 2017-09-04T14:55:31Z No. of bitstreams: 1 arquivotal.pdf: 1914187 bytes, checksum: 451665c737c19a32a97906a57d305870 (MD5)
Made available in DSpace on 2017-09-04T14:55:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivotal.pdf: 1914187 bytes, checksum: 451665c737c19a32a97906a57d305870 (MD5) Previous issue date: 2017-06-02
The chicken’s comb and wattle are part of the by-products they are composed of a large number of collagenous proteins, they are considered a promising source for obtaining bioactive peptides. The objective of this thesis was to develop a technical procedure aimed at making better use of the chicken’s comb and wattle. For this, the authors carried out studies on the protein hydrolysis of a comb/wattle mixture (1:1 w/w), focusing on the production of peptides with bioactivities such as iron chelation and antioxidant capacity. At first, the following were evaluated: centesimal composition, mineral profile and protein quality (percentage of collagen, percentage of total amino acids and free amino acids, hydrophobicity profile and electrophoretic profile) of the comb, the wattle and a mixture of both (1:1 w/w). These by-products displayed a high protein concentration (61 to 83% dry base), especially proteins of collagenous origin (47 to 51% dry base). The amino acid profile presented a high level of glutamic acid (10.01 g/100g) aspartic acid (7,38 g/100g), glycine (9,05 g/100g). The minerals iron (8 mg/100g), phosphorus (337 mg/100g) and zinc (2,62 mg/100g) were present in high amounts, which emphasizes the byproducts as an excellent sources of these nutrients. Considering the protein quality of the chicken’s comb and wattle, and the absence of studies regarding their use in functional products, a study was then carried out to evaluate the obtaining of peptides from these by-products. Firstly, comparative analysis of proteolytic activity was carried out in order to select the enzyme (Alcalase, Flavourzyme, Protamex, Brauzyn and Colagenase) to be used in the hydrolysis of the comb and wattle mixture (1:1 w/w). The enzyme Alcalase displayed the highest degree of hydrolysis (DH = 19%) when compared to the other proteases (DH < 3%). After selecting the enzyme, the next step was to optimize the Alcalase hydrolysis process. The researchers selected the samples with the lowest degree of hydrolysis (< DG: enzyme substrate ratio of 1% and 60 min of hydrolysis) and the highest degree of hydrolysis (> DG: enzyme substrate ratio of 5% and 240 min of hydrolysis). These experimental samples were analyzed for their protein profile, (percentage of total amino acids and free amino acids, hydrophobicity profile and electrophoretic profile), mineral profile and were characterized according to their iron chelating and antioxidant (ABTS, DPPH e FRAP) capacities. The hydrolysate with the higher DH exhibited a higher quantity of peptides with low molecular weight and hydrophilic character, as well as a higher quantity of free amino acids. The minerals Fe, F and Zn were present in quantities that allow the samples to be characterized as sources. As for bioactivity, they showed excellent Fe2+ chelation capacity (> 94%) and antioxidant activity through the inhibition of ABTS● (> 46%), DPPH● (> 41%) and FRAP through the reduction of Fe3+ (> 95 mg/100g trolox equivalent). Comb and wattle have the potential to be used in the production of hydrolysates and are also sources of minerals and peptides with bioactivities antioxidant capacity and iron chelating. As a result of these studies, the process patent BR 10 2016 027430 3 was registered.
A crista e a barbela do frango fazem parte dos subprodutos que apresentam elevada quantidade de proteínas colagenosas, sendo consideradas matérias-primas promissoras para a obtenção de peptídeos bioativos. O objetivo desta pesquisa foi desenvolver procedimento tecnológico voltado a um melhor aproveitamento dos subprodutos cristas e barbelas de frango. Para tanto foram realizados estudos de hidrólise proteica da mistura de crista e barbelas (1:1 p/p) para produção de peptídeos com bioatividades de quelação ao mineral ferro e capacidade antioxidante. Inicialmente foi avaliada a composição centesimal, perfil de minerais e a qualidade proteica (% colágeno, % aminoácidos totais e livres, perfil de hidrofobicidade e perfil eletroforético) da crista, barbelas e sua mistura (1:1 p/p). Estes subprodutos apresentaram elevada concentração de proteínas (61 a 83% b.s.) com destaque para as proteínas de origem colagenosa (47 a 51% b.s.). O perfil de aminoácidos apresentou elevado teor de ácido glutâmico (10,01 g/100g), ácido aspártico (7,38 g/100g), glicina (9,05 g/100g). Os minerais ferro (8 mg/100g), fósforo (337 mg/100g) e zinco (2,62 mg/100g) também foram encontrados em grandes quantidades nos subprodutos, destacando-se como fontes destes nutrientes. Foi realizada uma analise comparativa de melhor atividade proteolítica para seleção da enzima (Alcalase, Flavourzyme, Protamex, Brauzyn e Colagenase), a ser utilizada na hidrolise da mistura crista e barbelas (1:1 p/p). A enzima Alcalase apresentou o maior grau de hidrólise (DH = 19%) em comparação com as demais proteases (DH < 3%). Definida a enzima foi realizada a otimização do processo de hidrólise com a Alcalase. Mediante a avaliação foram selecionados os experimentos que obtiveram o menor grau de hidrólise (< GH: relação enzima substrato de 1% e 60 min de hidrólise) e o maior grau de hidrólise (> GH: relação enzima substrato de 5% e 240 min de hidrólise). Os hidrolisados selecionados foram analisados em relação ao seu perfil proteico (% aminoácidos totais e livres, perfil de hidrofobicidade e perfil eletroforético), perfil de minerais e caracterizados quanto a sua capacidade quelante ao ferro e antioxidante (ABTS, DPPH e FRAP). O hidrolisado de >GH exibiu maiores quantidades de peptídeos com baixo peso molecular e caráter hidrofílicos, além de maiores quantidades de aminoácidos livres. Ambos os hidrolisados (> GH e < GH) apresentaram concentrações de minerais que os caracterizam como fontes Fe, F e Zn. Quanto a bioatividade os hidrolisados exibiram capacidade quelante ao Fe2+ (> 94%) e atividade antioxidante através da inibição dos radicais ABTS● (> 46%), DPPH● (> 41%) e FRAP 9 por redução do Fe3+ (> 95 mg / 100 g equivalente trolox). As cristas e barbelas apresentam potencial para elaboração de hidrolisados, fonte de minerais e peptídeos funcionais com bioatividades, como capacidade antioxidante e capacidade quelante ao mineral ferro. Com isto foi registrado a patente de processo de obtenção dos peptídeos bioativos da mistura de crista e barbela de frango - BR 10 2016 027430 3.

O estudo de peptídeos grampeados, que estabilizam voltas de hélices-α com a ligação de uma cadeia química, desenvolveu-se na última década, uma vez que a adição de um elemento não peptídico (grampo) mostrou aumentar o conteúdo de hélice e a estabilidade conformacional destas moléculas. A consequente manutenção de um arcabouço estrutural definido possibilita, em princípio, simular regiões específicas da superfície de proteínas e, assim, modular terapeuticamente potenciais vias de sinalização associadas. Neste sentido, a capacidade de antecipar a eficácia de grampos sobre peptídeos específicos através de simulações computacionais pode contribuir na aceleração e na redução de custos no processo de planejamento racional de novos fármacos. O presente trabalho buscou avaliar a capacidade de simulações por dinâmica molecular em reproduzir o efeito conformacional de grampos olefínicos em um peptídeo derivado da RNAse A. Foram utilizados três diferentes campos de força: AMBER99SB-ILDN, CHARMM36 e GROMOS54a7, e os resultados foram comparados a dados de dicroismo circular obtidos experimentalmente, além de análises de RMSD, RMSF, estrutura secundária e conteúdo de hélice. Os parâmetros utilizados com o campo de força átomo unido GROMOS54a7 foram os que mais se aproximaram dos dados experimentais, embora não tendo sucesso na descrição de dois dos três grampos nos parâmetros simulados, mas tendo um desempenho melhor do que campos de força que descrevem todos os átomos do sistema. Tais resultados indicam que, com melhorias na parametrização, a dinâmica molecular pode ser utilizada para antecipar efeitos conformacionais de grampos olefínicos em peptídeos.
The study of stapled peptides, which stabilize turns of an alpha-helix through the addition of a linker, has developed in the last decade since it was shown that the addition of the staple enhanced helical content and conformational stability of peptides. The maintenance of a structural scaffold allows the simulation of specific regions of protein surfaces, and thus allows the therapeutical modulation of signaling pathways of interest. The ability to anticipate the efficacy of the addition of a staple in a peptide through computational simulations may contribute to enhance the speed and lower the costs associated with rational drug design. This work evaluated the capability of molecular dynamics simulations to reproduce the effect of all-hydrocarbon staples in an RNAse A-derived peptide. We used three different force fields: AMBER99SB-ILDN, CHARMM36 and GROMOS54a7, and the results were compared to experimentally obtained circular dichroism data. The parameters used with the GROMOS54a7 united-atom force field revealed themselves to be more closely related to experimental data, even though it does not reproduce the effect of the addition of a staple in two of three stapled peptides, but it also shows an enhanced performance when compared to all-atom force fields. These results indicate that, with further enhancement of parametrization, molecular dynamics simulations may be used to anticipate conformational effects of all-hydrocarbon staples in peptides.

Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa de Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto.
Submitted by giuliana silveira (giulianagphoto@gmail.com) on 2016-02-19T18:08:21Z No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_PropecçãoPeptídeosBioativos.pdf: 3147932 bytes, checksum: cb1d8983cbab4d5d804dd91c66b36c7a (MD5)
Approved for entry into archive by Gracilene Carvalho (gracilene@sisbin.ufop.br) on 2016-02-25T16:55:46Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_PropecçãoPeptídeosBioativos.pdf: 3147932 bytes, checksum: cb1d8983cbab4d5d804dd91c66b36c7a (MD5)
Made available in DSpace on 2016-02-25T16:55:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_PropecçãoPeptídeosBioativos.pdf: 3147932 bytes, checksum: cb1d8983cbab4d5d804dd91c66b36c7a (MD5) Previous issue date: 2015
A busca de peptideos bioativos com potencial capacidade de interacao e modulacao da atividade proteolitica do proteassoma 20S constitui tema de grande interesse em biologia celular. O uso de inibidores de proteassoma ja vem sendo aplicado no tratamento de doencas como o cancer, e varias moleculas encontram-se atualmente em fase de testes clinicos. O presente trabalho teve como objetivos a purificacao do proteassoma 20S e a avaliacao do potencial inibitorio de peptideos sobre a atividade quimotripsina-simile do complexo 20S. Neste intuito duas abordagens distintas foram utilizadas: 1) analise do potencial inibitorio de moleculas analogas ao inibidor de proteassoma PR-11, e 2) obtencao de novos alvos com capacidade de interacao e modulacao da atividade proteassomal por meio de tripsinolise de proteinas sericas. Para purificacao do proteassoma 20S utilizou-se de filtracao molecular e troca ionica, as quais proporcionaram a obtencao de dois perfis distintos do complexo 20S, apos analise por eletroforese unidimensional. A confirmacao das identidades das subunidades do proteassoma e a identificacao de proteinas co-eluidas foram realizadas por espectrometria de massas. Quanto ao potencial inibitorio dos analogos do PR-11, foram selecionados os peptideos F12, G9F12 e I9F12. Esses demonstraram eficacia nas taxas de inibicao da atividade proteolitica do proteassoma 20S com destaque para o F12 o qual foi capaz de inibir em cerca de 70 e 53% a atividade quimotripsina simile, quando utilizado na concentracao de 0,25 e 0,125 ƒÊM respectivamente. Para a identificacao de novos alvos moduladores de atividade do proteassoma, proteinas sericas foram digeridas com tripsina seguido de avaliacao do potencial inibitorio dos peptideos resultantes. Os ensaios de atividade demonstraram cerca de 40 e 10% de inibicao quando os peptideos tripticos totais foram empregados nas concentracoes de 50 ƒÊM e 6,25 ƒÊM, respectivamente. A identificacao dos peptideos tripticos ligantes de proteassoma por espectrometria de massas necessitara de novas abordagens tecnicas para ligacao e recuperacao da fracao peptidica ligada. Os resultados obtidos neste trabalho permitiram concluir que analogos estruturais do PR-11 representam moleculas inibidoras de alta potencia e ainda que a tecnica de tripsinolise serica utilizada, e capaz de fornecer peptideos alternativos para modulacao da atividade proteassomal. ________________________________________________________________________________
ABSTRACT : The search for bioactive peptides endowed with modulatory capability over the activity of 20S proteasomes is a subject of major interest in cell biology. Proteasome inhibitors have been applied in the treatment of diseases such as cancer, and several new molecules are currently under investigation. This study aimed the purification of the 20S murine proteasome and the evaluation of potential inhibitory peptides over its chymotrypsin-like activity. To accomplish these goals two different approaches were used: 1) analysis of the inhibitory activity of three PR-11 derivatives, and 2) generation of new proteasome target molecules through trypsinolysis of serum proteins. 20S proteasome purification was achieved by gel filtration and ion exchange. These chromatographic steps resulted in two distinct and highly homogeneous 20S complexes as judged by one-dimensional gel electrophoresis. Confirmation of the identities for alpha and beta proteasome subunits and co-eluted proteins was made by mass spectrometry. The inhibitory potential of three PR-11 analogs F12, G9F12 and I9F12 was then evaluated. These PR-11 derivatives proved to be efficient 20S proteasome inhibitors highlighting that F12 was able to inhibit approximately 70 and 53% of the chymotrypsin-like activity when used at a concentration of 0.25 and 0.125 μM respectively. For the identification of new target modulators of proteasome activity, serum proteins were digested with trypsin, followed by evaluation of the inhibitory potency of the resulting peptides. Activity assays showed approximately 40 and 10% inhibition when total tryptic peptides were used at concentrations of 50 and 6.25 μM, respectively. The identification of such novel proteasome ligands by mass spectrometry will require the utilization of new approaches for binding and recovering of the bound peptide fraction. The results of this study indicate that structural analogues of PR-11 represent inhibitory molecules endowed with high potency and serum trypsinolysis may offer alternative molecules for modulating proteasome activity.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biología Celular Programa de Pós-graduação em Biología Molecular, 2014.
Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2014-07-03T13:58:58Z No. of bitstreams: 1 2014_RosaAmaliaDuenasCuellar.pdf: 2777574 bytes, checksum: 2c36dd345046a1697ce460d95bd0d978 (MD5)
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Algumas toxinas isoladas da peçonha de escorpiões têm a capacidade de se ligar especificamente à superfície de células malignas, bactérias ou células excitáveis. Estes componentes, em alguns casos, têm se revelado capazes de inibir a progressão do câncer e da proliferação bacteriana, ou então de modificar a conformação de canais iônicos dependentes de voltagem presentes nas células excitáveis. Câncer, infecções microbianas e problemas neurológicos são objetos de preocupação em todo mundo, estimulando muitos cientistas a identificar e caracterizar novos agentes terapêuticos derivados de venenos e peçonhas animais. O objetivo do presente estudo foi realizar o isolamento e a caracterização preliminar de componentes citotóxicos, citolíticos e neurotóxicos presentes na peçonha do escorpião colombiano Centruroides margaritatus. Indivíduos adultos da espécie C. margaritatus foram coletados na Colômbia, na região do Vale do Patia. A peçonha, obtida por estimulação elétrica, foi liofilizada e armazenada a -20 °C, tendo sido, em seguida, fracionada por RP-HPLC em coluna C8. Linhagens de fibroblastos murinos normais (NIH3T3) e de células cancerosas MCF-7 (humana) e B16F10 (murina) foram utilizadas para avaliar os efeitos citotóxicos das diferentes frações cromatográficas empregando-se teste colorimétrico (MTT). Tais frações também foram avaliadas quanto à sua capacidade em inibir a proliferação de bactérias patogênicas. As frações biologicamente ativas foram analisadas por espectrometria de massa do tipo MALDI-TOF e algumas frações, mais homogêneas, foram purificadas por meio de RP-HPLC em coluna C18. Um novo peptídeo neurotóxico e antimicrobiano foi isolado e parcialmente caracterizado. Tal peptídeo, denominado F34, foi capaz de inibir a proliferação da bactéria Gram-negativa Klebsiella pneumoniae com uma concentração inibitória mínima (MIC) de 64 μM. Análises da sequência N-terminal da toxina F34 revelaram uma estreita relação estrutural com a toxina Cn11, uma toxina modificadora de canais para sódio previamente isolada da peçonha do escorpião Centruroides noxius. Como a toxina F34 apresenta similaridade com outras toxinas moduladoras de canais iônicos, foram avaliados os efeitos dessa toxina sobre o potencial de ação de neurônios do gânglio dorsal de ratos (DRG). A toxina F34 (200 nM) promoveu um aumento na excitabilidade neuronal, causando despolarização da membrana e aumento na frequência de disparo de potenciais de ação. Durante a aplicação da toxina F34, injeções de pulsos hiperpolarizantes suficientes para repolarizar a membrana para os valores do potencial de repouso foram capazes de restaurar o comportamento normal de disparo dos potenciais de ação. Os efeitos da toxina F34 são reversíveis, assim como o disparo normal de potenciais de ação é recuperado após a retirada da toxina da preparação. Concluindo, o presente estudo produziu avanços na área de Toxinologia, uma vez que permitiu a identificação e caracterização parcial de uma série de peptídeos biologicamente ativos (neurotóxicos, citotóxicos e citolíticos) presentes na peçonha do escorpião Centruroides margaritatus, evidenciando a riqueza de componentes moleculares presentes nessa peçonha, bem como o potencial de tais toxinas como agentes terapêuticos. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT
Some toxins, isolated from scorpion venoms, have been reported to bind specifically to the surface of malignant cells, bacteria or excitable cells. These components have the ability to inhibit cancer and bacterial proliferation, or change the conformational arrangement of different subtypes of voltage-gated ion channels on excitable cells. Cancer, bacterial infections and neurological problems cause serious concerns around the world, and stimulate research and development of new therapeutic agents from animal poisons and venoms. The aim of the present study was to perform the isolation and preliminary characterization of neurotoxic, cytotoxic and cytolytic components presents in Centruroides margaritatus scorpion venom. Adult specimens of C. margaritatus were collected in Colombia, in the Patia Valley region. The venom, obtained by electrical stimulation, was lyophilized and stored at -20°C. Their components were purified using RP-HPLC in a C8 column. Normal fibroblasts (NH3T3) and cancer cells lineages (MCF-7 and B16F10) were used to evaluate the cytotoxic effects of the different chromatographic fractions using a colorimetric assay (MTT). These fractions were also tested against pathogenic bacteria to evaluate their capacity to inhibit cellular proliferation. The biologically active fractions were analyzed by MALDI-TOF mass spectrometry and some fractions, which exhibited a more homogenous profile, were submitted to RP-HPLC using a C18 column. One new neurotoxic and antimicrobial peptide was purified and partially characterized. This peptide, named F34, was able to completely inhibit the proliferation of K. pneumoniae with a MIC of 64 μM. Since F34 shares a significant similarity to Cn11, a Na+-channel blocking toxin previously isolated from the venom of the scorpion C. noxius, in their N-terminal sequence, the effects of F34 on the action potential in DRG neurons was tested. Bath application of F34 (200 nM) depolarized the neuron and induced multiple action potential firing. Application of the toxin also reduced the after-hyperpolarization which may explain the repetitive firing. At present we do not know if the decreased after-hyperpolarization is a direct action of the toxin or a consequence of the depolarization. During application of F34, injection of hyperpolarizing current sufficient to repolarize the membrane to its control resting potential restored normal firing. The effects of F34 were reversible as normal firing returned after washout of F34 from the bath. In conclusion, this study yielded advances in the Toxinology field, since it allowed the identification and partial characterization of a series of biologically active peptides (with neurotoxic, cytotoxic and cytolytic activities) present in the venom of the scorpion Centruroides margaritatus, showing the richness of molecular components present in this venom, and the potential of such toxins as therapeutic agents.

The Caseous Lymphadenitis (CL) is a disease caused by Corynebacterium pseudotuberculosis, which affects mainly sheep and goats. This illness is responsible for significant economic losses related to productivity of animals. Currently, there is no satisfactory diagnosis for CL. In this work the tool Phage Display was used that selects peptides using bacteriophages to express random sequences of peptides on their surface. Phage Display has been used successfully in many applications such as mapping and mimicry antigens, vaccine development and immunogenicity tests. The main goal of the study was to perform the selection and identification of mimotopes peptides of secreted and /or excreted and total C. pseudotuberculosis 1002 proteins through Phage Display technique. A commercial librarary of 12 linear peptides (Ph.D.-12 mer - New England Biolabs - NEB) was used. After three cycles of selection, 366 peptides were obtained, including 116 distinct sequences. In silico analysis of the peptides obtained in Phage Display were tested against the predicted proteome of C. pseudotuberculosis 1002. The indentified proteins showed similarity to protein involved in signaling, nutrition, metabolism, bacterial pathogenesis and transcription factors. The reactivity and specificity of isolated clones were tested by ELISA and Spot synthesis. Through immunoassays for both methods, was possible to select 12 peptides among them three were synthesized, bound to two different formulations of liposomes, with a hydrogenated phosphatidylcholine (HPC) and soy phosphatidylcholine (SPC), the three peptide were used for testing and immunization of BALB/c. Immunization with the peptides 1 and 2 was able to induce a high Th1 immune response before infection. After the challenge, we observed a high production of IFN- in animals immunized with either peptide/SPC or peptide/HPC, and the levels of IL-10 were higher in animals immunized with peptide/SPC only. In contrast, control groups of mice exhibited low levels of IFN- and IL-10. The identification of new antigens or C. pseudotuberculosis specific genes can potentially provide new specific biomarkers with antigens for obtaining vaccine candidate antigens and sub-clinical diagnosis tests for more accurate control and eradication of the CL.
A linfadenite caseosa (LC) é uma doença causada por Corynebacterium pseudotuberculosis, que acomete principalmente caprinos e ovinos. Esta enfermidade é responsável por perdas econômicas significativas relacionadas à produtividade dos animais infectados. E, apesar de sua importância, atualmente não existem vacinas, diagnóstico e tratamentos satisfatórios para LC. No presente trabalho, foi utilizada a ferramenta Phage Display a qual seleciona peptídeos através de bacteriófagos geneticamente modificados para expressar aleatoriamente sequências de peptídeos na sua superfície. Estas bibliotecas têm demonstrado sucesso em numerosas aplicações, como mapeamento e mimetismo de antígenos reconhecidos por anticorpos, desenvolvimento de vacinas, e em testes de imunogenicidade. Sendo assim, este trabalho teve como objetivos selecionar e identificar pela técnica de Phage Display peptídeos ligantes específicos para proteínas secretadas e/ou excretadas e totais de C. pseudotuberculosis linhagem 1002. Para isso foi utilizada uma biblioteca comercial de 12 peptídeos lineares (Ph.D.-12 mer - New England Biolabs - NEB) e após três ciclos de seleção foram obtidos 366 peptídeos, sendo que 116 são seqüências distintas. Foram realizadas análises in silico desses peptídeos com o proteoma predito de C. pseudotuberculosis, onde apresentaram similaridade com proteínas envolvidas na sinalização, nutrição, metabolismo, patogênese bacteriana e fatores de transcrição entre outras. A reatividade e especificidade dos clones isolados foram testadas por ELISA e Spot síntese. Através de imunoensaios para ambas as metodologias foi possível selecionar 12 peptídeos (dos 116 identificados por Phage Display), entre os quais três foram sintetizados, agregados a duas formulações distintas de lipossomas, uma com fosfatidilcolina hidrogenada (HPC) e a outra com fosfatidilcolina de soja (SPC), e utilizados em ensaios de imunização de camundongos BALB/c. A imunização com os peptídeos sintetizados foi capaz de induzir uma elevada resposta imune do tipo Th1 antes da infecção. Após o desafio, foi observada uma produção elevada de IFN- nos animais imunizados tanto com peptídeo/SPC quanto com peptídeo/HPC, e os níveis de IL-10 foram mais elevados nos animais imunizados com peptídeo/SPC. Em contraste, camundongos dos grupos controle exibiram baixos níveis de IFN e de IL-10. A identificação de novos antígenos ou genes específicos de C. pseudotuberculosis pode prover novos biomarcadores específicos potencialmente antigênicos para a obtenção de antígenos candidatos à vacina e diagnósticos subclínicos mais acurados para o controle e erradicação da LC.

Peptídeos bioativos são foco de pesquisas devido ao interesse relacionado a suas propriedades antioxidantes, anti-hipertensivas, entre outras. Enzimas proteolíticas microbianas aparecem como potentes biocatalisadores para a obtenção de hidrolisados protéicos e peptídeos bioativos em escala industrial/comercial. Neste estudo, hidrolisados de caseinato ovino e soro de queijo ovino foram produzidos utilizando enzimas proteolíticas de Bacillus sp. P7, e as atividades antioxidantes (sequestro de radicais, atividade quelante de ferro e poder redutor), antimicrobiana e anti-hipertensiva (inibição da enzima conversora de angiotensina-I (ECA)) dos hidrolisados foram avaliadas. A atividade antioxidante dos hidrolisados de caseinato ovino, quando avaliada pelo método da captura do radical ácido 2,2’-azinobis-(3-etil-benzotiasolina-6- ácido sulfônico) aumentou com o tempo de hidrólise em até 2 h, mantendo-se estável durante 4 h. Os hidrolisados mostraram baixa capacidade em capturar o radical 2,2-difenil-1-picrilidrazila (DPPH), apresentando maior atividade (31%) após 1 h de hidrólise. A capacidade de quelação de Fe2+ foi máxima em 0,5 h de hidrólise (83,3%), decrescendo em seguida, e o maior poder redutor foi observado após 1h de hidrólise. A inibição da atividade da ECA aumentou até 2h de hidrólise (94% de inibição), diminuindo após esse tempo. Hidrolisados após 3h mostraram inibir a multiplicação de Bacillus cereus, Corynebacterium fimi, Aspergillus fumigatus, e Penicillium expansum. Nos hidrolisados de soro de queijo ovino a proteína solúvel e aminoácidos livres tenderam a aumentar durante o tempo de hidrólise por até 4h. A atividade antioxidante dos hidrolisados avaliados pelo método da captura do radical ácido 2,2’-azinobis-(3- etil-benzotiasolina-6-ácido sulfônico), aumentou de 0h (15,9%) para 6h (51,3%). A máxima quelação de Fe2+ foi observada em hidrolisados após 3h, e o pico do poder redutor em 1h de hidrólise, representando aumentos de 6,2 e 2,1 vezes, respectivamente, quando comparado com o soro de queijo não hidrolisado. A inibição da ECA pelo soro de queijo ovino (12%) aumentou através da hidrólise, alcançando valor máximo (55% inibição) em 4h de hidrólise; no entanto, uma inibição de 42% foi observada após 1h de hidrólise.
Bioactive peptides are a focus of research due to the interest related to their antioxidant and antihypertensive properties, among others. Microbial proteolytic enzymes appear as potent biocatalysts to obtain protein hydrolysates and bioactive peptides on an industrial/commercial scale. In this study, ovine cheese whey and ovine caseinate were produced using proteolytic enzymes from Bacillus sp. P7, and the antioxidant (scavenging of the radical, iron-chelating activity, and reducing power), antimicrobial, and antihypertensive (inhibition of the angiotensin-I converting enzyme(ACE)) activities of the hydrolysates were evaluated. Antioxidant activity measured by the 2,2_-azino-bis-(3- ethylbenzothiazoline)-6-sulfonic acid method increased with hydrolysis time up to 2 h, remaining stable for up to 4 h. Hydrolysates showed low 2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl radical scavenging abilities, with higher activity (31%) reached after 1 h of hydrolysis. Fe2+-chelating ability was maximum for 0.5 h hydrolysates (83.3%), decreasing thereafter; and the higher reducing powerwas observed after 1h of hydrolysis. ACE-inhibitory activity was observed to increase up to 2 h of hydrolysis (94% of inhibition), declining afterwards. 3 h hydrolysates were shown to inhibit the growth of Bacillus cereus, Corynebacterium fimi, Aspergillus fumigatus, and Penicillium expansum. Soluble protein and free amino acids tended to increase during hydrolysis of SCW for up to 4 h. Antioxidant activity of hydrolysates, evaluated by the 2,2’azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline)-6-sulfonic acid radical scavenging method, increased 3.2-fold from 0 h (15.9%) to 6 h of hydrolysis (51.3%). Maximum Fe2+ chelation was reached in 3-h hydrolysates, and the reducing power peaked at 1 h of hydrolysis, representing 6.2- and 2.1-fold increments, respectively, when compared to that of non-hydrolyzed SCW. ACE inhibition by SCW (12%) was improved through hydrolysis, reaching maximal values (55% inhibition) in 4-h hydrolysates; however, a 42% inhibition was already observed after 1 h of hydrolysis.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:54:53Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo88_1.pdf: 861536 bytes, checksum: 11993c5a3da46ed594a599203ef0f7e0 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2010
Faculdade de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco
O queijo de coalho é um dos principais produtos produzidos no Estado de Pernambuco a partir de leite de vaca cru e/ou leite pasteurizado. Esta pesquisa teve como objetivo avaliar o perfil dos peptídeos bioativos do queijo de coalho fresco produzidos no município de Cachoeirinha PE As amostras de queijo coalho foram coletadas em março e julho do ano de 2008 e transportadas para o Laboratório de Imunopatologia Keizo Azami - LIKA/UFPE. Para a extração dos peptídeos solúveis, 40g da amostra dos queijos foram homogeneizadas com duas vezes do seu peso em água ultrapura, usando um misturador automático, em seguida foram centrifugadas 3 vezes a 10.000 rpm por 20 minutos a 4°C. Após esse procedimento o sobrenadante final foi filtrado em papel de filtro, liofilizado e armazenado a -20°C. Os extratos dos peptídeos solúveis do queijo de coalho de Cachoeirinha da primeira e segunda coleta foram submetidos à Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) realizada no AKTA system Amersham Pharmacia Biotech usando coluna de exclusão molecular tipo Superdex Peptide HR10/30 equilibrada com água ultrapura a fluxo de 0,2 mL/ min e coluna de troca iônica Mono Q HR 10/10 equilibrada com tampão Tris-HCl 25mM, pH 7,0, a fluxo de 1,0mL/min. A fração catiônica foi eluída em tampão de equilíbrio, enquanto que a aniônica foi eluída no tampão de equilíbrio em gradiente de NaCl a 1M. O eluato protéico das cromatografias realizadas foi acompanhado por um detector UV a 260 e 280nm. O extrato de peptídeos solúveis do queijo coalho e o pool dos picos obtidos após as corridas cromatográficas em ambas as colunas, serviram como amostra para a avaliação do perfil eletroforético em SDS-PAGE. A massa dos peptídeos quando não visualizadas na eletroforese foi conhecida através da análise em espectro de massa do tipo MALDI-TOF, aparelho do tipo Autoflex III, de matriz de ácido alfa-ciano 4- hidroxicinâmico em acetonitrila 33% e ácido trifluoroacético 0,1%, operada com modo de aquisição linear positivo. A atividade antimicrobiana dos extratos dos peptídeos solúveis e dos pools catiônicos obtidos após cromatografia de troca iônica foi testada frente à Enterococcus faecalis ATCC 6057, Bacillus subtilis ATCC 6633, Staphylococcus aureus ATCC 6538 (bactéria gram-positiva), Escherichia coli ATCC 25922, Pseudômonas aeroginosa ATCC 27853, Klebsiela pneumoniae ATCC 29665 (bactéria gram-negativa) e Candida albicans ATCC 50 - IBB (fungo) pela técnica de poço, disco-difusão e microdiluição para a determinação concentração inibitória mínima (CIM). Os resultados obtidos após as análises cromatográficas realizadas em coluna de exclusão molecular mostraram perfil peptídico similar com a observação de picos eluídos no mesmo tempo de retenção enquanto que a cromatografia de troca iônica mostrou perfil similar apenas para a fração catiônica não apresentando similaridade para a fração aniônica. Perfil eletroforético similar também foi observado nos extratos dos peptídeos solúveis com 17 bandas para as duas coletas realizadas. O pool dos picos I obtidos por cromatografia de exclusão molecular apresentou 14 e 15 bandas, para 1° e 2° coleta, respectivamente. O pool pico II obtidos por cromatografia de exclusão não foram visualizados no gel de eletroforese, sendo suas massas moleculares conhecidas através de análises em espectro de massa. Essas análises evidenciaram a presença de 5 diferentes peptídeos. Inibição do crescimento de Bacillus subtilis ATCC 6633 foi observada em todos os testes realizados, apresentando média de halos de inibição de 5,25 mm para a técnica de difusão em poço e 3,75 mm para a técnica de disco-difusão. Bacillus subtilis ATCC 6633 foi sensível a ação do extrato dos peptídeos solúveis e a fração catiônica com concentração inibitória mínima de 9,37 mg/ mL e 6,22 μg/ mL, respectivamente. Enquanto que Enterococcus faecalis ATCC 6057 foi sensível apenas ao pool da fração catiônica com concentração inibitória mínima de 199,37 μg/ mL

O aparecimento de cepas microbianas com resistência aos antibióticos comumente usados em âmbito mundial constitui um sério problema de saúde pública, estimulando a busca por novos compostos antimicrobianos para os quais a resistência ainda não foi adquirida. A secreção cutânea de várias espécies de anuros (rãs, sapos e pererecas) é uma rica fonte de peptídeos com amplo espectro de atividade antibacteriana e antifúngica, com grande potencial para o desenvolvimento de fármacos. O presente trabalho visou à investigação da presença de agentes antimicrobianos na secreção cutânea das espécies brasileiras Dermatonotus muelleri, Leptodactylus labyrinthicus, Phyllomedusa burmeisteri, Rhinella icterica, Trachycephalus resinifictrix. Utilizando a estimulação mecânica do tegumento para extração e posteriormente a liofilização dessas secreções. Os testes antimicrobianos foram realizados através da técnica de disco difusão, onde as secreções testadas foram solubilizadas em diferentes solventes e em placas contendo bactérias Gram-negativas e Gram-positivas. As secreções com maior potencial antibacteriano foram fracionadas por Cromatografia líquida de alta eficiência fase reversa em uma coluna C8 e C18 5μm. Tendo suas frações também testadas em disco-difusão. As frações que formaram halos de inibição foram submetidas à espectrometria de massa para a identificação de suas moléculas. Desta forma foi comprovado a ação antimicrobiana das secreções de Rhinella icterica, Phyllomedusa burmeisteri e Trachycephalus resinifictrix e de suas receptivas frações.
The appearance of microbial strains that are resistant to common antibiotics used in a global scope represents a serious public health issue, stimulating the search for new antimicrobial compounds that resistance was not acquired yet. The cutaneous secretion of several anurans species (frogs, toads and tree frogs) is a rich source of peptides with a broad spectrum of antimicrobial and antifungal activity, with a big potential to drug development. The present work aimed the investigation of the presence of antimicrobial agents in the cutaneous secretion of the Brazilian species Dermatonotus muelleri, Leptodactylus labyrinthicus, Phyllomedusa burmeisteri, Rhinella icterica, Trachycephalus resinifictrix. For the extraction of these secretions it was utilized the integument mechanical stimulation and later on these secretions were lyophilized. For the antimicrobial tests it was used the disk diffusion technique, where the test secretions were solubilized in different solvents and in plates containing Gram-negative and Gram-positive bacteria. The secretions with the highest antimicrobial potential were fractionated by a high-performance liquid chromatography reverse phase in the columns C8 and C18 5μm. These fractions were also tested in disk diffusion. The fractions that formed inhibition zones were submitted to mass spectrometry for the identification of their molecules. This way it was evidenced antimicrobial activity of secretions from Rhinella icterica, Phyllomedusa burmeisteri and Trachycephalus resinifictrix and from their respective fractions.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Biologia, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2014.
Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2015-03-04T19:06:35Z No. of bitstreams: 1 2014_EderAlvesBarbosa.pdf: 4378638 bytes, checksum: 00877b1f9ca18fc438dfee9ec43f6fb0 (MD5)
Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2015-04-29T21:01:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_EderAlvesBarbosa.pdf: 4378638 bytes, checksum: 00877b1f9ca18fc438dfee9ec43f6fb0 (MD5)
Made available in DSpace on 2015-04-29T21:01:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_EderAlvesBarbosa.pdf: 4378638 bytes, checksum: 00877b1f9ca18fc438dfee9ec43f6fb0 (MD5)
Esse trabalho descreve um modelo experimental o qual emprega análises da expressão de peptídeos da secreção cutânea de anfíbios, com enfoque nas variações dos níveis de transcrição de genes de interesse e no mapeamento de peptídeos estocados nas glândulas granulares. A partir desse modelo, foram utilizadas ferramentas de biologia molecular e espectrometria de massa para investigar processos de maturação das glândulas granulares em Phyllomedusa azurea durante a metamorfose e para avaliar como esse anfíbio responde a diferentes estímulos. Os resultados evidenciam a presença dos peptídeos no tecido cutâneo, em pequenas concentrações, apenas a partir do estágio 41 de desenvolvimento. Um súbito aumento da concentração de peptídeos na pele de P. azurea é observado quando este migra para o hábitat terrestre. Contudo, mesmo logo após o término da metamorfose, as glândulas granulares não apresentaram o mesmo padrão de conteúdo peptídico do animal adulto. Os resultados indicam também que glândulas individuais armazenam um conteúdo próprio e que a presença de microrganismos modula tanto os processo de transcrição gênica, quanto os de tradução e estocagem de peptídeos. Ainda, fundamentado no modelo experimental proposto, a expressão diferencial de peptídeos nas glândulas granulares dorsais e inguinais foi investigada em anfíbios adultos da espécie Physalaemus nattereri. Observa-se, a partir dos resultados, que peptídeos antimicrobianos foram flagrados uniformemente distribuídos ao longo de todo o tecido cutâneo de P. nattereri, ao passo que os peptídeos relacionados a bradicininas são preferencialmente sintetizados nas glândulas inguinais. Isto sugere uma fina sintonia entre o sistema fisiológico e o comportamento deimático apresentado por esse anfíbio. O modelo experimental apresentado aqui pode ser estendido a outros grupos de animais, assim como, em experimentos que envolvam questionamentos relacionados a interações peptídeos/proteínas em tecidos das mais diversas origens. _____________________________________________________________________________________ ABSTRACT
The present work describes a strategy that involves peptide frog skin expressing analysis, based on RNA transcription level measurement and glandular peptide skin mapping, to respond biological relevant questions. The chosen experimental model is based on molecular biology and mass spectrometry techniques to investigate granular glands maturation process of Phyllomedusa azurea through metamorphose and the peptide skin composition when this anuran is submitted to biotic stress. The results show that larvae of P. azurea on stage 37 presents right levels of RNA transcriptions, although low concentration of peptides were identified on skin just from stage 41. There was a sudden increased peptide skin concentration when P. azurea migrates to terrestrial habitat (stage 43). But, after metamorphose end, the standard glandular peptide content of juvenile frogs is different from adult frogs. The results show that individual glands have an intrinsic peptide content stored and that the microorganisms can alter the transcriptional level processes, as well as, the peptide skin gland content. The same experimental model was applied to investigate the differential peptide expression on granular glands and inguinal macro glands from Physalaemus nattereri. The results show that the antimicrobial peptides are present on entire animal skin, while the bradykinin related peptides are present mainly on inguinal macro glands. Our finding suggest an amazing fine-tuning among animal behavior, skin physiology and gene expression. The experimental model introduced here represents an alternative strategy for differential gene expression analysis and peptide interaction identification directly on biological tissue that can be applied on different animal models.

Orientadores: Adriane Elisabete Antunes de Moraes, Izildinha Moreno
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Aplicadas
Made available in DSpace on 2018-08-24T08:36:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ferreira_NataliaChinellatodeAzambuja_M.pdf: 4159232 bytes, checksum: 2e7450f8e5d25cd46199b110960d9b48 (MD5) Previous issue date: 2013
Resumo: A utilização de culturas adjuntas é uma das novas alternativas tecnológicas que vem sendo estudada por pesquisadores de diversos países visando a melhoria da qualidade geral de produtos alimentícios, em especial produtos lácteos como queijos, leites fermentados, iogurte e outros. Outra vantagem é a obtenção de novas variedades de produtos que passam a apresentar sabor, aroma e outras características diferenciadas. O presente trabalho teve como objetivo a avaliação do papel da cultura de L. helveticus (LH-B02 / CHR-Hansen) na acidificação, proteólise, redução do amargor, determinação do perfil de aminoácidos das amostras de queijo Prato e possível liberação de peptídeos bioativos. No estudo os queijos foram fabricados com cultura CHN-22 (cultura mesofílica aromática / CHR-Hansen) com e sem adição da cultura adjunta L. helveticus (LH) de modo a verificar se a presença da cultura adjunta influencia na qualidade da maturação do queijo Prato e se esta cultura é possível produtora de peptídeo bioativo inibidores da Enzima Conversora de Angiotensina (ECA). Para obtenção dos queijos Prato foram realizados três processamentos em planta piloto, com dois tratamentos diferentes, com e sem adição da cultura adjunta de L. helveticus. Dentro do período de maturação, ou tempo de estocagem, dos queijos, foram realizadas as análises microbiológicas, físico-químicas, eletroforéticas, cromatográficas e análise sensorial. Os queijos elaborados apresentaram composição típica de queijo Prato e atenderam aos padrões microbiológicos exigidos para o consumo do produto. Em relação ao perfil eletroforético observou-se aumento no desdobramento da fração ?s1-caseína pela ação do coalho, com surgimento de uma banda de maior intensidade, correspondente à ?s1-I-caseína, mais evidente no queijo com a adição da cultura de L. helveticus. Essa cultura também intensificou a degradação da ?-caseína com aparecimento das bandas de ?3-, ?1- e ?2-, já visíveis com 10 dias de maturação. A amostra de queijo adicionado da cultura adjunta foi mais bem aceita sensorialmente do que a amostra controle (apenas adicionado de CHN-22) e queijo comercial diferindo estatisticamente (p?0,05) destes em alguns parâmetros, tais como aceitação global, aroma, sabor e intenção de compra. Os índices de extensão de proteólise (IEP) e profundidade da proteólise (IPP) dos queijos Prato com e sem adição de cultura adjunta, praticamente não diferiram entre si, embora em todos os casos tenham sido observados aumento dos índices ao longo do tempo de maturação. Através da análise de aminoácidos livres, as amostras de queijo adicionadas de L. helveticus apresentaram teores maiores de aminoácidos comparadas com as amostras sem adição desta cultura. Pelo teste estatístico apenas os aminoácidos histidina, cistina e triptofano não diferiram quantitativamente entre os tratamentos (p?0,05). Na eletroforese capilar (CE) foi encontrado apenas para a amostra adicionada da cultura adjunta aos 31 dias de maturação um pico com tempo de retenção na faixa de 9 a 12 minutos, indicando a possível presença dos tripeptídeos de interesse na amostra
Abstract: The use of adjunct cultures is a new alternative technology that have been studied by researchers from several countries in order to improve the overall quality of food products , especially dairy products such as cheese , fermented milk , yogurt and others. Another advantage is to obtain new varieties of products with new flavours and texture. This study aimed to evaluate the role of culture L. helveticus (LH-B02 / CHR- Hansen) acidification, proteolysis, reducing bitterness, determination of the amino acid profile of Prato cheese and possible release of bioactive peptides. In the present study the cheeses were manufactured with culture CHN-22 (mesophilic aromatic culture / CHR-Hansen) with and without adjunct culture of L. helveticus (LH) in order to verify if the presence of the adjunct culture influences the quality of the cheese ripening and if this culture can produce bioactive peptide that may couse the inhibition of Angiotensin Converting Enzyme (ACE). To obtain the Prato cheese three processins in pilot plant were done, with two different treatments, with and without addition of adjunct culture of L. helveticus. Within the period of maturation, and storage time it was conducted microbiological, physicochemical, electrophoretic, chromatographic and sensory analysis. The cheeses produced presented composition typical of Prato cheese and attended the microbiological standards required for the consumption of the product. Regarding the electrophoretic profile it was observed an increase in a break on the fraction ?s1-casein by the action of rennet, with the appearance of a band of greater intensity, corresponding to ?s1-I-casein, most evident in the cheese with the addition of the culture of L. helveticus. This culture also intensified the degradation of ?-casein with the appearance of bands ?3, ?1 and ?2-casein, already visible at 10 days of ripening. The sample of the cheese added adjunct culture was more acceptable sensory than the control sample (just added CHN-22) and was statistically different (p?0.05) of commercial cheese in some of these parameters, such as overall aceptability, aroma, taste and purchase intent. The extension rates of proteolysis (IEP) and depth of proteolysis (IPP) of the Prato cheese with and without addition of adjunct culture were different. In all cases it was observed increased rates over time for maturation. By analyzing the free amino acid, samples of cheese added L. helveticus presented higher levels of amino acids compared with the samples without the addition of this culture. By the statistical test only the amino acid histidine, cysteine and tryptophan did not differ between treatments (p?0.05). In capillary electrophoresis (CE) a peak with retention time in the range of 9 to 12 minutes, indicating the possible presence of tripeptides of interest was found in the sample added by the adjunct culture after 31 days of ripening
Mestrado
Nutrição
Mestra em Ciências da Nutrição e do Esporte e Metabolismo

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:12:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Quimica Eliane S F Alves.pdf: 4161656 bytes, checksum: 36361e76b0e7ad73aea61043645102f1 (MD5) Previous issue date: 2012-02-24
Currently, the emergence of fungi, bacteria and viruses resistant to multiple drugs has stimulated interest in the development of antimicrobial peptides with increased therapeutic potential. They generally have properties of extreme importance as antimicrobial selective toxicity, rapid action, specific mechanisms of action and a broad spectrum of antimicrobial action. Many of these features can be found in peptides isolated from frog skin secretions. The main factor that differentiates antimicrobial peptides from other commonly antibiotics used in the conventional therapy is related to their mechanism of action. The driving force for much of the action of antimicrobial peptides is their ability to lysis cell membranes, rapidly killing a broad spectrum of microorganisms. Accordingly, the conformation of the peptide has a great importance in their interaction with the amphiphilic structure of biological membranes. The determination of the tridimensional structure by Nuclear Magnetic Resonance (NMR) technique allows the identification of the spatial position of each amino acid residue and highlighting those that are important for its action and, therefore, could be modified to increase the antimicrobial activity. The study of the three-dimensional structure of peptides in solution is an advantage of the NMR spectroscopy, since it can simulate the physiological environment, by means of surfactants. In this context, the tridimensional structures of two synthetic peptides: ocellatin-P1G16 (GLLDTLKGAAKNVVGGLASKVMEKL-NH2), isolated from the amphibians Leptodactylus labyrinthicus, and hylin a1 (IFGAILPLALGALKNLIK-NH2), isolated from Hypsiboas Albopunctatus, were proposed by NMR. The amphipathic caracter can be visualized by separation of the helix into two distinct sides, one hydrophobic (nonpolar) and the other hydrophilic (polar). The peptide hylin a1 in presence of SDS-d25 showed helical structure between residues Ile-5 to Ile-17 and the peptide ocellatin-P1G16 in SDS-d25 micelles showed a α-helical structure between residues Leu-3 to Lys-24, both are presented in amphipathic α-helix Finally, the molecular analyses of amphipathicity, electrostatic interaction, polarity and exchange hydrogen/deuterium, corroborate the proposed model, suggesting a model of parallel orientation to the peptide hylin a1 and the peptide ocellatin-P1G16 a parallel orientation, but with the cterminal portion immersed in the micelle SDS-d25 between residues Ser-19 to Leu-25, as observed by analyzing exchange hydrogen/deuterium. These structural characteristics make these peptides promising candidates for the development of a new antimicrobial drug.
Atualmente o surgimento de fungos, bactérias e vírus resistentes a múltiplos fármacos tem estimulado o interesse pelo desenvolvimento de peptídeos antimicrobianos com maior potencial terapêutico. Eles em geral possuem propriedades de extrema importância como um amplo espetro ação antimicrobiana, toxicidade seletiva, ação rápida e mecanismos de ação específicos. Muitas dessas características podem ser encontradas em peptídeos isolados da secreção cutânea de anuros. O principal fator que diferencia peptídeos antimicrobianos de antibióticos utilizados na terapia convencional está relacionado com o seu mecanismo de ação. A força motriz para a ação de grande parte de peptídeos antimicrobianos é sua habilidade em provocar lise em membranas celulares, matando rapidamente um amplo espectro de microorganismos. Nesse sentido, a conformação do peptídeo tem uma grande importância em sua interação com a estrutura anfifílica das membranas biológicas. Nesse contexto, a determinação da estrutura tridimensional por meio da espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) possibilita a identificação da posição espacial de cada resíduo de aminoácido na estrutura terciaria, destacando aqueles que são importantes para a sua ação e que, portanto, poderiam ser modificados para aumentar a atividade antimicrobiana. O estudo da estrutura 3D dos peptídeos em soluçao é uma vantagem da espectroscopia de RMN, pois se consegue simular o ambiente fisiológico por meio de sulfactantes. Nesse contexto, determinou-se através da RMN a estrutura tridimensional de dois peptídeos sintéticos: ocellatina-P1G16 (GLLDTLKGAAKNVVGGLASKVMEKL-NH2) isolado dos anfíbios Leptodactylus labyrinthicus, e o peptídeo hilina a1 (IFGAILPLALGALKNLIKNH2), isolado do anfíbio Hypsiboas albopunctatus. A anfipaticidade da estrutura pode ser observada pela separação da estrutura em duas faces distintas, uma hidrofobica (apolar) e outra hidrofilica (polar). O peptídeo hilina a1, em presença de SDS-d25, apresentou estrutura helicoidal entre os resíduos Ile-5 a Ile-17 e o peptídeo ocellatina-P1G16, em presença de SDS-d25, apresentou estrutura em α-hélice entre os resíduos Leu-3 a Lys-24, ambos em α-hélice anfipática. Por fim, as análises moleculares de anfipaticidade, interação eletrostática, polaridade e troca H2O/D2O, apontaram a mesma face de interação dos peptídeos com a membrana, propondo um modelo de orientação paralela para o peptídeo hilina a1 e para o peptídeo ocellatina- P1G16 uma orientação paralela, porém com a porção c-terminal mergulhada na micela de SDS-d25 entre os resíduos Ser-19 e Leu-25. Tais características estruturais tornam esses peptídeos candidatos promissores para o desenvolvimento de um novo fármaco antimicrobiano.

Carcinoma adenóide cístico é uma neoplasia maligna de glândula salivar com alto grau de recorrência e metástase. Células tumorais que invadem tecidos subjacentes formam invadopódios, protrusões de membrana ricas em actina, cortactina e MT1-MMP capazes de degradar a matriz extracelular (MEC). Proteólise de moléculas da MEC, como a laminina, promove liberação de fragmentos e peptídeos bioativos. Nesse trabalho, estudamos o papel dos peptídeos AG73 e C16, da laminina-111, na atividade de invadopódios de células derivadas de carcinoma adenóide cístico (CAC2). Nossos resultados mostram que AG73 e C16 regulam atividade de invadopódio e aumentam a expressão de MT1-MMP em células CAC2. Silenciamento da integrina b1 e inibição da via ERK diminuem a atividade de invadopódio induzida por esses peptídeos. Já a inibição da via Rac diminui a atividade de invadopódios induzida apenas por AG73. Propomos que os peptídeos AG73 e C16 regulariam a atividade de invadopódios através da integrina b1 e da via ERK 1/2. Já a via Rac1 transduziria sinais gerados apenas pelo peptídeo AG73.
Adenoid cystic carcinoma is a frequently occurring malignant salivary gland neoplasm with high level of recurrence and metastasis. Tumor cells that invade surrounding tissues rely on invadopodia to degrade extracellular matrix (ECM). Invadopodia are actin and cortactin-rich membrane protrusions that localize MT1-MMP required for ECM degradation. Breakdown of ECM molecules, such as laminins, releases fragments and bioactive peptides. Here we addressed the role of laminin-111 peptides AG73 and C16 in invadopodia activity of cells derived from human adenoid cystic carcinoma (CAC2). Our results show that AG73 and C16 increase invadopodia activity and MT1-MMP expression in CAC2 cells. Silencing of b1 integrin and ERK pathway inhibition decrease AG73 and C16-induced invadopodia. Rac1 pathway inhibition decreases only AG73-induced invadopodia formation. We propose that AG73 and C16 increase invadopodia activity in CAC2 cells through b1 integrin. ERK1/2 pathway would transduce signals generated by both peptides, while Rac1 pathway is related to AG73 signaling.