Dissertationen zum Thema „Peptide mimétique“

L’insuffisance cardiaque est une des premières causes de mortalité dans le monde et constitue donc un enjeu important en termes de santé publique. Elle est principalement causée par l’infarctus du myocarde (IDM) qui induit l’obstruction de l’artère coronaire et la perte des cardiomyocytes qui composent le myocarde. Au stade adulte, le renouvellement des cardiomyocytes est limité et le cœur n’est pas capable de restaurer la fonction contractile. En revanche, au stade post-natal, il a été montré que le cœur est capable de se régénérer après une lésion durant 7 jours grâce à la prolifération des cardiomyocytes. À la naissance, le nouveau-né est exposé à un environnement riche en O2, ce qui permet aux cardiomyocytes de passer de la glycolyse à la phosphorylation oxydative mitochondriale. Ce changement métabolique provoque une augmentation de la production des espèces réactives de l’oxygène (ERO) mitochondriales, conduisant à des modifications, par oxydation, des protéines et des lipides ainsi que des endommagements de l’ADN. Ces altérations ont pour conséquence un arrêt du cycle cellulaire. Cependant, l’arrêt du cycle cellulaire peut être levé en hypoxie ou par l’action d’antioxydants capables de neutraliser les effets des ERO. Parmi les systèmes antioxydants, les thiorédoxines (Trx) constituent un puissant système de défense contre les ERO. La Trx-1 (12 kDa), ubiquitaire et très conservée dans toutes les espèces, est localisée dans le cytoplasme mais peut être transloquée dans le noyau ou sécrétée au niveau extracellulaire. Outre ses propriétés antioxydantes, la Trx-1 joue également un rôle anti-inflammatoire et anti-apoptotique. Sous l’action de deux α-sécrétases (ADAM-10 et ADAM-17), la Trx-1 est clivée au niveau de son extrémité C-terminale pour générer une protéine tronquée appelée Trx-80. Contrairement à la Trx-1, la Trx-80 ne présente pas d’activité oxydo-réductrice et exerce des effets pro-inflammatoires et pro-athérogènes puissants. La Trx-2, principalement localisée dans la mitochondrie, joue un rôle majeur dans la détoxification des ERO mitochondriaux. Étant donné que la Trx-1 est clivée en Trx-80, l’utilisation de peptides mimant son site actif devient donc intéressante pour évaluer son rôle dans l’infarctus du myocarde et contourner le processus clivage. Pour cela, nous avons utilisé un peptide mimétique synthétisé appelé CB3. Ces travaux de thèse montrent, pour la première fois, que le peptide CB3 exerce des effets bénéfiques après un IDM en améliorant le remodelage et la contractilité cardiaque. Le CB3 est également capable de réduire la zone infarcie, la fibrose, le stress oxydant, l’apoptose et l’inflammation qui sont des processus intervenant dans l’IDM. Également, il induit l’entrée dans le cycle cellulaire et la prolifération des cardiomyocytes. Ces résultats suggèrent que le CB3 pourrait être une molécule thérapeutique pour traiter l’infarctus du myocarde
Heart failure is one of the most devastating human diseases. It is mainly caused by myocardial infarction (MI) which induces obstruction of the coronary artery and loss of the cardiomyocytes. Although limited renewal of cardiomyocytes takes place in the adult heart, it is not sufficient for the regeneration of the contractile function. In contrast, in the postnatal stage, it has been shown that the heart is able to regenerate after injury for 7 days through cardiomyocyte proliferation. At birth, the neonate is exposed to an O2-rich environment, which allows cardiomyocytes to switch from glycolysis to mitochondrial oxidative phosphorylation. This metabolic shift causes an increase in the production of mitochondrial reactive oxygen species (ROS), leading to oxidative changes in proteins and lipids and damage to DNA. These alterations result in cell cycle arrest. However, cell cycle arrest can be reversed in hypoxia or by the action of antioxidants capable of neutralizing the effects of ROS. Among the antioxidant systems, thioredoxins (Trx) are a powerful defense system against ROS. Trx-1 (12 kDa), ubiquitous and highly conserved in all species, is localized in the cytoplasm but can be translocated into the nucleus or secreted extracellularly. In addition to its antioxidant properties, Trx-1 also plays an anti-inflammatory and anti-apoptotic role. Under the action of two α-secretases (ADAM-10 and ADAM-17), Trx-1 is cleaved at its C-terminus to generate a truncated protein called Trx-80. In contrast to Trx-1, Trx-80 lacks oxidative-reducing activity and exerts potent pro-inflammatory and pro-atherogenic effects. Trx-2, localized exclusively in the mitochondria, plays a key role in the detoxification of mitochondrial ROS. Since Trx-1 is cleaved to Trx-80, the use of peptides mimicking its active site thus becomes interesting to evaluate its role in myocardial infarction and bypass the cleavage. Therefore, we used a synthesized mimetic peptide called CB3. This thesis work shows for the first time that CB3 peptide has beneficial effects after MI by improving cardiac functions through cardiac remodeling and cardiac improvement contractility. CB3 is also able to reduce fibrosis, oxidative stress, apoptosis and inflammation which are processes involved in MI. It also induces cell cycle entry and proliferation of cardiomyocytes. These results suggest that CB3 could be a promising therapeutic molecule for MI and heart failure treatment

La migration cellulaire est un processus complexe. Lors du développement, elle permet aux cellules de rejoindre leur destination finale, puis à l'âge adulte elle intervient dans de nombreux processus tels la réponse immunitaire ou le développement de pathologies.La migration est modulée par l'action de molécules d'adhérence. Nous nous sommes intéressés à la molécule NCAM (Neural Cellular Adhesion Molecule) dont les effets sont modulés par l'acide polysalique (PSA). Lors de précédentes études, il a été montré que le peptide mimétique de PSA-NCAM, PR-21 stimulait la migration issus de la zone sous-ventriculaire (SVZ).Nous avons synthétisés des analogues non-peptidiques de PR-21 en nous appuyant sur des analogies structurales. ces analogues ont été testés dans divers modèles de migration cellulaire : explants de SVZ et cellules C6 sur-exprimant PSA. Nous avons mis en évidence la présence de fonctions structurales clés dans la modulation de la migration cellulaire
Cell migration is a complex process. During development, it contributes to cell reaching their final target. during adulthood, cell migration is involved in immune response or pathological processes.Migration is modulated by adhesion molecules. We concentrated on the Neural Cellular Adhesion Molecule (NCAM) which action is regulated by the post traductional addition of polysialic acid (PSA). PR-21 is a mimetic peptide of PSA-NCAM. In previous studies, PR-21 has been shown to stimulate in the migration of meuroblasts from sub-ventricular zone (SVZ) to the olfactory bulb.We designed non-peptidic analogues of PR-21 on the basis of structural analogies. these analogues were tested on various cell migration models : SVZ explants and C6 over-expressing PSA. We then established the need of key structural functions to modulate cell migration

La migration cellulaire est un processus complexe. Lors du développement, elle permet aux cellules de rejoindre leur destination finale, puis à l'âge adulte elle intervient dans de nombreux processus tels la réponse immunitaire ou le développement de pathologies.La migration est modulée par l'action de molécules d'adhérence. Nous nous sommes intéressés à la molécule NCAM (Neural Cellular Adhesion Molecule) dont les effets sont modulés par l'acide polysalique (PSA). Lors de précédentes études, il a été montré que le peptide mimétique de PSA-NCAM, PR-21 stimulait la migration issus de la zone sous-ventriculaire (SVZ).Nous avons synthétisés des analogues non-peptidiques de PR-21 en nous appuyant sur des analogies structurales. ces analogues ont été testés dans divers modèles de migration cellulaire : explants de SVZ et cellules C6 sur-exprimant PSA. Nous avons mis en évidence la présence de fonctions structurales clés dans la modulation de la migration cellulaire
Cell migration is a complex process. During development, it contributes to cell reaching their final target. during adulthood, cell migration is involved in immune response or pathological processes.Migration is modulated by adhesion molecules. We concentrated on the Neural Cellular Adhesion Molecule (NCAM) which action is regulated by the post traductional addition of polysialic acid (PSA). PR-21 is a mimetic peptide of PSA-NCAM. In previous studies, PR-21 has been shown to stimulate in the migration of meuroblasts from sub-ventricular zone (SVZ) to the olfactory bulb.We designed non-peptidic analogues of PR-21 on the basis of structural analogies. these analogues were tested on various cell migration models : SVZ explants and C6 over-expressing PSA. We then established the need of key structural functions to modulate cell migration

Au cours du vieillissement, une inflammation chronique de bas grade, appelée inflamm’aging, se développe au niveau cellulaire, tissulaire et circulant. Elle est définie comme un déséquilibre entre les processus pro- et anti-inflammatoires, et serait le mécanisme étiologique commun des pathologies liées à l’âge. L’inflamm’aging est notamment dû à l’altération des réponses immunitaires (immunosénescence) et à l’accumulation de cellules sénescentes (CS) dans les tissus âgés. Les CS se caractérisent par un arrêt du cycle cellulaire (induction de p16INK4a, p21CIP) et l’expression de marqueurs de la sénescence comme la SA-β-Gal (senescence-associated-β-galactosidase activity). Ces cellules adoptent également un profil sécrétoire associé à la sénescence (SASP) et produisent des cytokines pro-inflammatoires (IL-6, IL-1β, MCP-1…) contribuant ainsi à l’installation de l’inflamm’aging. L’accumulation des CS conduisent à l'activation chronique des cellules de l'immunité innée, en particulier les macrophages. Les macrophages sont des cellules pourvues d’une grande plasticité phénotypique leur permettant de moduler leur physiologie en fonction du microenvironnement. Il a récemment été décrit que les macrophages s’adaptent phénotypiquement au microenvironnement tissulaire riche en CS. En effet, ils peuvent adopter un phénotype senescent-like associé à une forte expression de p16Ink4a, SA-β-Gal et de marqueurs de l'inflammation. Les macrophages âgés présentent également des altérations métaboliques qui correspondent à un phénotype métabolique pro-inflammatoire impliquant notamment une augmentation de la glycolyse. De plus, leur fonction est altérée, avec particulièrement une modification de la réponse aux signaux inflammatoires et de l'activité phagocytaire, favorisant ainsi l'accumulation de CS et la persistance de l’inflammation chronique. Limiter l’accumulation de cellules sénescentes et l'inflamm'aging associée sont aujourd’hui des enjeux majeurs dans le but de prévenir le développement des pathologies liées à l’âge. Parmi les stratégies thérapeutiques possibles, on retrouve l'utilisation de molécules sénomorphiques, qui vont moduler le SASP des CS pour limiter l'inflamm'aging. Dans ce cadre, nous nous intéressons particulièrement à la thiorédoxine-1 (Trx-1). La Trx-1 est une oxydo-réductase qui exerce, via son site catalytique (-Cys32 -Gly-ProCys35 -), des effets anti-oxydants et anti-inflammatoires. Cependant, elle peut être clivée, par un mécanisme encore mal connu, en une forme tronquée, la Trx-80, qui aggrave l’inflammation. Notamment, la Trx-80 augmente, au détriment de la Trx-1, dans le plasma de sujets âgés et sains. L’utilisation thérapeutique de la Trx-1, au cours du vieillissement, étant compromise par son clivage, nous avons développé une nouvelle stratégie basée sur un tri-peptide, reproduisant le site catalytique de la Trx-1 et mimant ses effets, le CB3. Nous avons précédemment démontré que le CB3 exerce des effets antioxydants et anti-inflammatoires dans un modèle murin d'inflammation vasculaire. Cependant, les effets bénéfiques du CB3 dans le contexte du vieillissement restent à démontrer. Dans ce but, nous avons caractérisé un nouveau modèle de vieillissement des macrophages in vitro, basé sur la comparaison d'une culture normale (jour 2) et de cultures à longue durée (7 et 14 jours) de macrophages péritonéaux issus de souris âgées de 3 mois. Les J14 expriment l'ensemble des marqueurs de sénescence et d'immunosénescence précédemment décrits nous permettant ainsi d'évaluer l'efficacité thérapeutique du CB3. Il est capable de diminuer le SASP, les niveaux d’expression de p16INK4a, p21CIP et de relancer le cycle cellulaire en augmentant l’incorporation EdU. Ces résultats ont permis de développer un modèle pertinent pour étudier les fonctions et les caractéristiques altérées des macrophages lors du vieillissement, ainsi qu'une nouvelle approche thérapeutique pour lutter contre la sénescence et l'inflamm'aging
During aging, a low-grade chronic inflammation develops at the cellular, tissue, and circulating levels, known as inflamm'aging. It is defined as an imbalance between pro- and anti-inflammatory processes and is considered as a common etiological mechanism for age-related pathologies. Inflamm'aging is primarily attributed to immune response alterations (immunosenescence) and the accumulation of senescent cells (SC) in aged tissues. SC are characterized by cell cycle arrest (p16INK4a and p21CIP induction) and the expression of senescence markers such as SA-β-Gal (senescence-associated β-galactosidase activity). SC also adopt a senescence-associated secretory phenotype (SASP) and produce pro-inflammatory cytokines (IL-6, IL-1β, MCP-1...), thus contributing to inflamm'aging establishment. The accumulation of SC leads to chronic activation of innate immune cells, particularly macrophages. Macrophages are highly phenotypically plastic cells that can adapt their physiology based on the tissue microenvironment. Recent studies have described that macrophages undergo phenotypic adaptation in the SC-rich tissue microenvironment, adopting a senescent-like phenotype characterized by high expression of p16Ink4a, SA-β-Gal, and inflammation markers. Aged macrophages also exhibit metabolic alterations corresponding to a pro-inflammatory metabolic phenotype, including increased glycolysis. Furthermore, they have reduced capacity to respond to inflammatory signals and carry out phagocytic activity, leading to the accumulation of senescent cells and chronic inflammation. Limiting the accumulation of senescent cells and associated inflamm'aging is a major challenge in preventing age-related pathologies. One potential therapeutic strategy involves the use of senomorphic molecules to modulate the SASP of SC and mitigate inflamm'aging. In this context, we are particularly interested in thioredoxin-1 (Trx-1). Trx-1 is an oxidoreductase that exerts antioxidant and anti-inflammatory effects through its catalytic site (-Cys32-Gly-ProCys35-). However, it can be cleaved, through a mechanism that is still poorly understood, into a truncated form, Trx-80, which exacerbates inflammation. Notably, Trx-80 increases in the plasma of healthy and aged subjects at the expense of Trx-1. Given that, the therapeutic use of Trx-1 during aging is compromised by its cleavage, we have developed a new strategy based on a tripeptide, mimicking the catalytic site of Trx-1 and its effects, called CB3. We have previously demonstrated that CB3 exerts antioxidant and anti-inflammatory effects in a murine model of vascular inflammation. However, the beneficial effects of CB3 in the context of aging remain to be demonstrated. For this purpose, we characterized a new model of macrophage aging in vitro, based on comparing a normal culture (day 2) with prolonged cultures (7 and 14 days) of peritoneal macrophages derived from 3-month-old mice. The D14 cultures express all previously described markers of senescence and immunosenescence, enabling us to evaluate the therapeutic efficacy of CB3. It is capable of reducing SASP, expression levels of p16INK4a, p21CIP, and reinitiating the cell cycle by increasing EdU incorporation. These results have led to the development of a relevant model for studying the altered functions and characteristics of macrophages during aging, as well as a new therapeutic approach to counteract senescence and inflamm'aging

Le stress oxydatif et l'inflammation jouent un rôle pathogène dans l'athérosclérose. La Thiorédoxine-1 (Trx-1) est une protéine anti-oxydante et anti-inflammatoire ayant des effets athéroprotecteurs. Cependant, le clivage in vivo de la Trx-1 génère une protéine tronquée pro-inflammatoire, la Trx-80, qui compromet l'utilisation thérapeutique de la Trx-1. L'objectif de ma thèse est de caractériser une nouvelle stratégie thérapeutique basée sur l’utilisation des peptides mimétiques de la Trx-1 (TxMP) pour le traitement de l'athérosclérose. Nous avons synthétisé un petit peptide basé sur le site actif de la Trx-1 appelé CB3. D’une part, le peptide CB3 a été validé sur des macrophages murins péritonéaux en culture (viabilité cellulaire, réponses anti-oxydantes et anti-inflammatoires). D’une autre part, un modèle de souris athérosclérotique (ApoE2.Ki) nourri avec un régime alimentaire riche en graisse a reçu une injection de CB3 par voie intrapéritonéale afin de mesurer son effet antioxydant, anti-inflammatoire et anti-athérogène. Nos résultats ont clairement montré que le peptide CB3 exerce des effets protecteurs similaires à la Trx-1, à savoir une réduction de l'inflammation et du stress oxydatif chez les macrophages et les souris ApoE.Ki. L'effet athéroprotecteur du CB3 ouvre des perspectives thérapeutiques prometteuses pour le traitement de l'athérosclérose
Oxidative stress and inflammation play a pathogenic role in atherosclerosis. Thioredoxin-1 (Trx-1) is an anti-oxidative, anti-inflammatory protein with atheroprotective effects. However, in vivo cleavage of Trx-1 generates a truncated pro-inflammatory protein, Trx-80, which compromises the therapeutic use of Trx-1. The aim of my thesis is to characterize a new therapeutic strategy based on Trx-mimetic peptides (TxMP) for the treatment of atherosclerosis. We synthesized a small peptide based on the active site of Trx-1 named CB3. Firstly, CB3 was validated on cultured peritoneal murine macrophages (cellular viability, anti-oxidant and anti-inflammatory responses). Secondly, the atherosclerotic mouse model (ApoE2.Ki) fed a high fat diet was intraperitoneally injected with CB3 to measure their anti-oxidant, anti-inflammatory and anti-atherogenic effects. Our results clearly showed that, similar to the full length Trx-1, CB3 exerts protective effects by reducing inflammation and oxidative stress in macrophages and in ApoE.Ki mice. The atheroprotective effect of CB3 opens promising therapeutic approaches for treatment of atherosclerosis

Les récepteurs à sept domaines transmembranaires couplés aux protéines G (RCPG) représentent une grande famille de récepteurs ubiquitaires impliqués dans de nombreux processus métaboliques. Leur grande diversité d'action en fait des cibles pharmacologiques privilégiées pour le développement de médicaments avec des applications dans tous les champs d'activité clinique en particulier au niveau cardio-vasculaire. Les récepteurs 2-adrénergique (2AR) et M2 muscariniques (M2Ach-R) appartiennent à la famille des RCPG et sont impliqués dans la régulation du système cardiovasculaire. De nombreuses études ont montré l'importance de la seconde boucle extracellulaire pour l'activité de ces récepteurs dans certaines pathologies autoimmunes. La première partie du travail concerne le 2AR. Les scFvs issus d'AcM dirigés contre un peptide dérivé de la seconde boucle extracellulaire (SBE) du 2AR ont été produits. La capacité de cette protéine recombinante de reconnaître son peptide antigénique de façon spécifique a été mise en évidence, et les constantes cinétiques d'interaction ont pu être déterminées. Leur capacité à reconnaître le récepteur a été démontrée par immuno-cyto-fluorescence sur cellules A431 exprimant de façon constitutive le 2AR. Sur ces mêmes cellules, ce fragment d'anticorps est capable de façon dose dépendante de diminuer l'augmentation intracellulaire d'AMPc induite par 10 nM de salbutamol (agoniste 2), il est également capable seul de diminuer le niveau basal d'AMPc ce qui en fait un agoniste inverse. Il inhibe de façon non compétitive l'augmentation des battements spontanés de cardiomyocytes de rats nouveau-nés induits par différentes concentrations de clenbutérol (agoniste ). Des souris traitées par injections i. V. De scFv montrent une diminution du rythme cardiaque. Les peptides dérivés des CDRs du scFv 6H8 ont été synthétisés et cyclisés. Le CDR H1, totalement insoluble, n'a pu être utilisé. Les constantes cinétiques d'interaction avec le peptides dérivé du 2AR ont pu être déterminées par SPR pour le CDR L2, L3 et H3. Les CDR H2, L1 et L2 se sont révélés être des modulateurs allostériques négatifs du 2AR en inhibant de façon non compétitive l'augmentation des battements induite par une dose croissante de clenbutérol alors que les CDR H3 et L3 se sont révélés être des modulateurs allostériques positifs en augmentant l'effet du clenbutérol sur ces cellules. La deuxième partie du travail concerne la modulation de l'activité du récepteur M2 muscarinique et cela par deux approches différentes. Dans un premier temps, un lot de souris a été immunisé avec un peptide dérivé de la SBE du M2Ach-R (souris M2). Les sérums issus des souris M2 sont capables de reconnaître le M2Ach-R en immuno-empreinte. Ils sont également capables d'augmenter l'activité du carbachol sur le M2Ach-R in vitro sur des cellules CHO transfectées avec ce dernier. Pour mettre en évidence une modulation du récepteur induite par les anticorps anti-M2Ach-R, les souris ont été traitées par injection i. V. Avec plusieurs ligands muscariniques et adrénergique. Leurs ECGs ont été enregistrés et l'évolution de leurs rythme cardiaque suite à l'injection ainsi que les spectres de variabilité de leur rythme ont été calculés. Suite à l'injection de carbachol, les souris M2 diminuent plus fortement leur rythme que les souris contrôles. De plus, les souris M2 sont moins sensibles à l'injection de gallamine, atropine et isoprotérenol. L'analyse de l'évolution et de la variabilité de leur rythmes cardiaques suite aux différents traitements montre une augmentation du tonus parasympathique chez les souris M2 par rapport aux souris contrôles. Les anticorps anti-M2Ach-R agissent dans ce cas comme des ligands allostériques positifs. Une deuxième approche a également permis de moduler l'activité du M2Ach-R. De la même manière que pour le scFv anti-récepteur 2 adrénergique, un scFv anti-M2Ach-R a été produit et caractérisé à l'aide de la technologie SPR. Des expériences menées in vitro sur cellules CHO transfectées avec le M2Ach-R et sur cardiomyocytes de rats nouveau-nés ont permis de mettre en évidence une activité pharmacologique sur ce récepteur. Il est capable d'inhiber de manière non-compétitive l'action d'un agoniste tel que le carbachol. De plus, seul, il est également capable de diminuer l'activité basale du récepteur ce qui fait également de ce fragment d'anticorps un agoniste inverse. Il est également capable in vivo de modifier la réponse au carbachol et à l'isoprotérénol sur l'activité cardiaque de souris via le M2Ach-R par injection i. V. . Ce travail montre que des fragments d'anticorps recombinants monovalents dirigés contre la SBE de RCPG représentent des agonistes inverses allostériques alors que des anticorps (bivalents) induits contre ce même site, sont des ligands allostériques positifs. De plus, les peptides dérivés des CDRs du scFv anti 2AR, ont gardé une activité pharmacologique sur leur récepteur cible. Outre l'aspect développement de nouvelles molécules, ces fragments d'anticorps ainsi que les peptides mimant les CDRs représentent des outils puissants pour la compréhension des mécanismes d'activation des RCPG
G protein coupled receptor are involved in various metabolic functions. This receptor family represents the main target of cardiovascular and neurological used drugs. The 2 adrenergic receptor (2AR) and the M2 muscarinic receptor (M2Ach-R) belong to this family and are implicated in the regulation of the cardiovascular system. Many studies show the importance of the second extracellular loop of GPCR on their activity in particular in some autoimmune diseases. The first part of this work concern the 2AR. Using a functional monoclonal antibody against the human 2AR, a scFv fragment with high affinity for the target epitope was constructed and produced. The fragment recognized the ß2-adrenergic receptors on A431 cells, blocked cAMP accumulation induced by the ß2-agonist salbutamol, and decreased basal cAMP accumulation in the same cells. Their in vitro activity was tested on neonatal rat cardiomyocytes. The antibody fragments blocked the chronotropic activity induced by the ß2-agonist clenbuterol. They also decreased the in vivo heart beating frequency of mice pretreated with bisoprolol (a ß1-adrenergic receptor antagonist) for 4 minutes after injection. Cyclic peptides derived from the CDR of the scFv 6H8 were produced. The CDR H1 was not used because of its total insolubility in water. Kinetic contants of interaction with their target peptides were determined by SPR technology for the CDR peptides L2, L3 and H3. The CDR H2, L1 et L2 behaved as negative allosteric modulator of the 2AR, they inhibited in a non competitive manner the increase of spontaneous beating rate of neonatal rat cardiomyocytes induced by an increasing dose of clenbuterol. The CDR H3 and L3 behaved as positive allosteric modulators of the 2AR by increasing the clenbuterol effect on these cells. The second part of this work concern the modulation of the M2Ach-R activity using two different strategies. First, we investigated the in vivo consequences on heart rate of such antibodies in mice immunized with a peptide derived from the second extracellular loop of the M2AChR. Nine mice, immunized with a peptide corresponding to the N-terminus of the second extracellular loop of the M2AChR were compared to 9 mice immunized with an irrelevant peptide. Sera of mice immunized with the M2ACh-R derived peptide recognized the M2ACh-R on immunoblots and enhanced the agonist activity of carbachol towards the M2AChR transfected in CHO cells. In vivo, no difference could be shown in heart rate nor in heart rate variability between the two groups of mice. In contrast, the decrease in heart rate induced by carbachol was more pronounced in the M2AChR immunized mice compared to the control mice. The increase in heart rate induced by atropine, gallamine and isoproterenol were alike significantly attenuated in the M2ACh-R immunized mice compared to the control mice. Analysis of heart rate variability further argued for an increased parasympathetic response to the different drugs in the M2ACh-R immunized mice. Antibodies raised against the M2AChR can behave as positive M2AchR allosteric modulators in vivo. They might be protective in boosting the activity of the parasympathetic drive to the heart, in particular in patients with a high sympathetic tone. The second strategy was, to construct and produce a single chain variable fragment, from a partial agonist monoclonal antibody directed against the M2ACh-R. It showed high affinity for its target epitope. The fragment is able to recognize its receptor on Chinese hamster ovary cells transfected with the M2ACh-R, to block the effect of carbachol on this receptor and to exert an inverse agonist activity on the basal activity of the receptor. The antibody fragment is also able to increase the basal rhythm of cultured neonatal rat cardiomyocytes, and to inhibit in a non-competitive manner the negative chronotropic effect of carbachol. This antibody fragment is able to exert its inverse agonist activity in vivo on mice heart activity. This works shows that recombinant monovalent antibody fragments directed against te second extracellular loop of GPCR have inverse agonist activity. Bivalent antibodies directed against the same target, show an allosteric positive activity on the receptor. Peptides derived from CDR of the scFv 6H8, keep a pharmacological function, they act as allosteric modulators of the 2AR. These scFv and cyclic peptides may represent leads for a new class of allosteric modulators of GPCR. They also represent tools for understanding of the activation mechanisms of GPCR

Ce travail avait pour but la synthese d'un mimetique de gamma-turn en vue de son incorporation dans des peptides bioactifs. Dans une premiere partie bibliographique, nous avons montre l'interet d'elaborer des peptidomimetiques qui, compares aux peptides natifs, presentent une meilleure stabilite, une biodisponibilite accrue et une plus longue duree d'action. Dans la seconde partie, nous avons decrit les differentes voies de synthese explorees pour atteindre la cible fixee. Ce mimetique de gamma-turn (compose des residus isoleucine, alanine et glycine), versatile quant a ses groupes protecteurs, est directement incorporable dans une chaine polypeptidique et permet l'elongation de la chaine dans les deux sens

La glycoprotéine VI (GPVT), récepteur d'activation précoce des plaquettes par les collagènes, joue un rôle clé dans la thrombose artérielle, processus pathologique commun aux maladies cardiovasculaires. L'inhibition des interactions GPVI-collagène pourrait être une approche efficace pour le développement de nouvelles molécules antithrombotiques. Pour y parvenir, deux stratégies ont été envisagées lors de cette étude : 1) bloquer GPVI par un fragment d'anticorps recombinant, et 2) utiliser un mime peptidique soluble, compétiteur de GPVI. Voie 1 : A partir de l'hybridome 9O12. 2 sécréteur d'une IgG monoclonale, un fragment d'anticorps recombinant scFv a été conçu et exprimé par voie recombinante. Il conserve les caractéristiques de liaison de l'IgG parentale anti-GPVI (haute affinité et neutralisation de l'interaction GPVI-collagène). Ce scFv recombinant purifié inhibe l'agrégation plaquettaire induite par le collagène in vitro dans des conditions mimant le flux artériel. Le scFv humanisé que nous avons ensuite obtenu dans ce travail peut servir de module de base pour le développement d'un Fab humanisé. Voie 2 : Des mimes peptidiques solubles de GPVI ont été identifiés après criblage d'une banque de dodécapeptides vis-à-vis de l'IgG 9O12. 2. L'un d'entre eux a été synthétisé sous forme de peptide contraint. Il se lie au collagène (KD=10"8M) et entre en compétition avec la GPVI recombinante pour la liaison au collagène. La détection d'une accumulation de collagène (fibrose) a été observée in vivo. Cette propriété le rend particulièrement attractif pour le développement d'une méthode d'imagerie isotopique non invasive permettant le diagnostic et le suivi de la fibrose
Glycoprotein VI (GPVI), the major receptor for platelet activation by collagens, plays an important role in arterial thrombosis, a pathologic process common to cardiovascular diseases. Inhibition of GPVI-collagen interaction could represent an attractive strategy to develop antithrombotic molecules. Two approaches were evaluated in this study : 1) Blocking GPVI with a recombinant antibody fragment, and 2) Using a soluble peptidomimetick witch compete with GPVI for binding to collagen. Strategy 1 : Starting from 9O12. 2 hybridoma secreting a monoclonal IgG, a recombinant single chain antibody fragment was design and expressed as a recombinant protein in the periplasm of bacteria. It retains the binding proprietes of the parental IgG (high affinity, neutralisation of GPVI-collagen interaction). Purified scFv is able to inhibit platelet aggregation induced by collagen in vitro in conditions which mimick the arterial flow. The humanized scFv were next obtained an it can be use as a starting block to design a recombinant therapeutic humanized Fab fragment. Strategy 2 : After screening of a random dodecapeptide library expressed at the bacterial surface with the neutralizing antibody IgG 9O12. 2, solubles peptidomimeticks of human GPVI were identified. One of them were synthetized as constrained peptide. It binds to collagen, compete with GPVI for binding to collagen (KD=10"8M). Fibrosis (collagen accumulation) was detected in vivo using radiolabelled peptide. This capacity to bind to collagen is used to develop an non invasive isotopic imagery method for the diagnostic and the evolution of fibrosis

La recherche d'inhibiteurs de glycosidases est un enjeu majeur en chimie thérapeutique. Cette thèse a consisté en la synthèse et l'évaluation biologique d'inhibiteurs potentiels : De type glycomimétique, mimes du substrat ou de son état de transition au sein du site actif. L'accès à des carbosucres et aminocyclitols de structure cyclooctanique a été réalisé à partir de bis-époxydes issus du D-mannitol, mettant en jeu des étapes clés de cyclisation par métathèse ou par couplage réducteur pinacolique. De type peptidomimétique, mimes du coude b du tendamistat, puissant inhibiteur d'a-amylase. La stratégie de type répartiteur utilise comme châssis moléculaire un squelette 1,4-diazépan-2-one obtenu à partir de deux synthons clés : un amino-époxyde, issu des acides D-iso ou L-ascorbique, et un acide aminé. Les deux étapes clés sont : l'ouverture de l'époxyde par l'amine de l'aminoacide et le couplage peptique entre l'acide carboxylique de l'acide aminé et l'amine du synthon époxydé
Conception of glycosidases inhibitors is a task of major interest in therapeutical chemistry. The purpose of this thesis was the synthesis and the biological evaluation of potential inhibitors : Glycomimetic inhibitors, mimicking the substrate or its transition state within the active site. Access to cyclooctanic carbasugars and aminocyclitols from D-mannitol bis-epoxides involves a key step of carbacyclisation by ring closing metathesis or by pinacolic coupling. Peptidomimetic inhibitors, mimicking tendamistat's b turn, powerfull inhibitor of a-amylase. Access to the 1,4-diazepan-2-one scaffold involves two key intermediates : an amino-epoxyde, obtained from D-iso ou L-ascorbic acid and an amino acid. The two key steps are : the opening of the epoxide by the amine functionnality of the aminoacide and the peptidic coupling between the carboxylic acid of the aminoacid and the amine functionality of the amino-epoxyde

Les α-hélices sont des éléments clés de la reconnaissance biomoléculaire, comme en témoigne le fait qu'une quantité significative de complexes protéine-protéine, dans la banque de données protéiques (PDB), présentent des interfaces inter-hélices. Cependant, de courtes hélices peptidiques isolées dans le but de bloquer ces interactions ne sont généralement que faiblement présentes en milieu aqueux et sont sensibles à la dégradation protéolytique, limitant ainsi leur potentiel thérapeutique. Diverses approches chimiques ont été proposées pour augmenter la propension au repliement en hélice des α-peptides. Une stratégie consiste à pré-organiser les premières liaisons amides à l'aide d'une « capping box » ou d'un substitut de liaison hydrogène. Récemment, nous nous sommes intéressés à la possibilité d'interfacer des peptides-α et des foldamères afin d’élaborer des « foldamères à blocs » générant ainsi un nouveau type d’architecture mime de l'hélice-α. Dans notre laboratoire, nous avons développé des foldamers à base d’urées qui s’organisent pour former des structures hélicoïdales. Les similitudes du sens d’enroulement, du pas et de la polarité entre l’hélice-α peptidique et l’hélice-2.5 d'oligourée suggéraient qu'il serait possible de combiner ces deux squelettes. Au cours de cette thèse, nous avons montré que les chimères : oligourée/α-peptide, forment des structures hélicoïdales bien définies dans les solvants organiques polaires avec la propagation d'un réseau de liaisons hydrogène intramoléculaires continu couvrant la totalité de la séquence. Ces études ont suggéré que le squelette de l'oligourée qui possède une forte propension à adopter une structuration en hélice pourrait conduire au développement d’un « cap » permettant la pré-organisation des quatre premiers NHs ainsi que des quatre derniers groupements carbonyles d’une hélice-α peptidique. Nous avons donc étudié l'influence de courts fragments oligourées sur la stabilisation de séquences peptidiques modèles solubles dans l'eau en hélices-α, conduisant au développement de la « foldamer capping box ». Grâce à cette nouvelle stratégie de stabilisation des hélices peptidiques, nous avons pu concevoir des inhibiteurs de l’interaction protéine/protéine p53/MDM2
Α-Helices are key elements of biomolecular recognition, as reflected by the fact that a large fraction of the protein-protein complexes in the Protein Data Bank (PDB) feature helical interfaces. However, short isolated peptide helices are generally only weakly populated in aqueous environment and are sensitive to proteolytic degradation, thus limiting their therapeutic potential. Various chemical approaches have been proposed to increase the helix folding propensity of α-peptides. One strategy is to pre-organize the first amide bonds through the use of a "capping box" or a hydrogen bond surrogate. Recently we became interested by the possibility to interface peptide and foldamer helical backbones in order to develop “block co-foldamers“, to generate new generations of α-helix mimics. In our laboratory, we have developed oligourea foldamers which are organized to form helical structures. The similarities in helix screw sense, pitch, and polarity between the peptide α-helix and the oligourea 2.5-helix suggested that it would be feasible to combine these two backbones. In this thesis, we have shown that the resulting oligourea/α-peptide chimeras form well-defined helical structures in polar organic solvents with the propagation of a continuous intramolecular hydrogen bonding network spanning the entire sequence. These studies provided a rationale for the use of the oligourea backbone which is strongly biased towards helix formation could lead to the development of pre-organized caps for the initial four amide NHs and the final four carbonyl groups of a peptide α-helix. We have therefore studied the influence of short oligourea fragments on the stabilization of model water-soluble peptide sequences in α-helices, leading to the development of the foldamer capping box. This strategy awas pplied for the first time to the design of potent inhibitors of protein/protein interactions (e.g. p53/MDM2)

Le passage des médicaments a travers la membrane cellulaire représente souvent une limitation majeur dans un grand nombre de thérapies (anti-cancéreuse, anti-virale par exemple). Des peptides vecteurs connus comme les CPPs (cell penetrating peptides) ont été utilises avec succès pour introduire a l’intérieur des cellules diverses molécules (protéines, peptides, siRNA, quantum dots) et présentent un fort potentiel dans l'adressage de médicaments. Parmi les différents CPPs décrits dans la littérature la plupart sont des peptides basiques ou amphiphiles.Nous nous sommes intéressés a l'utilisation d’oligomères non charges construits a partir de motifs contraints mimes de dipeptides comme vecteurs de pénétration cellulaire. L'internalisation cellulaire et leur localisation ont été établies a l'aide de dérivés fluorescents par microscopie confocale. L' étude de pénétration cellulaire par mesure de fluorescence a montre que des oligomères de (3S)-amino-5-carbonylmethyl-2,3-dihydro-1,5-benzothiazepine-4(5H)-one] (DBT) sont aussi puissants que les oligomères d'arginine (oligoArg), vecteurs de référence. Par microscopie confocale nous avons montré que ces composés sont internalisés dans les lysosomes. L’efficacité d'internalisation de nos composés a été confirmé par une méthode de quantification par spectrométrie de masse MALDI-TOF développée dans notre groupe. Cette méthode repose sur l'utilisation conjointe d'un marqueur UV-absorbant dérivé de l'acide alfa-cyano-4-hydoxycinnamique (HCCA) et d'une matrice MALDI adaptée. Un effet important de discrimination spectrale est obtenu, permettant une amplification du signal de la molécule d' intérêt dans un mélange complexe. Ainsi les faibles concentrations internalisées peuvent être détectées. Grâce a cette technique et l'utilisation d'un étalon deutéré, nous avons calculé la concentration intracellulaire de deux CPP de référence l'octa-arginine et la pénétratine. Nous avons aussi étudier l’internalisation de petits oligomères construits a partir d'acide 2-aminomethyl-phenyl-acetique (AMPA). Par microscopie confocal nous avons constaté que ces petits oligomères sont internalisés par voie endo-lysosomale.L’efficacité de la pénétration cellulaire de ces petits oligomères aromatiques (oligoAMPA et oligoDBT) offre une nouvelle classe de vecteurs qui ont la particularité d’être non-cationiques et hydrophobes. De tels composés pourraient être utilisés pour la délivrance de médicaments dans le traitement des maladies comme le cancer, les maladies lysosomales ou la maladie d'Alzheimer. Afin de montrer que cette nouvelle classe de vecteurs est capable d'internaliser des composés biologiquement actifs, nous les avons associés a un inhibiteur puissant de la Cathepsine D (CD) la pepstatine. CD est une endopeptidase lysosomale qui dans des conditions normales est localisée dans les endosomes et les lysosomes. Pour certains cancers, la CD est surexprimée et secrétée a l’extérieur de la cellule. La CD est probablement impliquée dans la prolifération des cellules cancéreuses par l'activation de certains facteurs de croissances dans les endosomes. La pepstatine est une inhibiteur puissant de la CD. Cependant son efficacité thérapeutique potentielle est limitée par une faible capacité de pénétration des membranes cellulaires et une faible solubilité nécessitant de fortes doses pour l'inactivation de la CD in vitro et in vivo. Afin d’améliorer son efficacité et sa biodisponibilité, des conjugues de la pepstatine avec nos vecteurs de pénétration cellulaire, oligo (AMPA)4 et (DBT)4, et une partie solubilisante ont été développés. Certains de ces bioconjugués ont montre une toxicité élevée (IC50 = 2.10-6) in vitro sur différentes lignées cellulaires tumorales. Des tests in vivo sur des souris sont prévus pour le futur
As a part of a program for foldamer design two ¦Â-turn mimetics (3S)-amino-5-(carboxylmethyl)-2,3-dihydro-1,5-benzothiazepin-4(5H)-one or DBT and 2-aminomethyl-phenyl-acetic acid or AMPA were selected as frameworks from a molecular modeling study for their suitability to adopt helical structure. At first we developed a highly efficient scale up synthesis of the DBT moiety protected by 9-fluorenylmetoxycarbonyl (Fmoc) group. By standard solid phase peptide synthesis (SPPS) we synthesized DBT oligomers of different lenghts and modifications were introduced at their N-terminus. Our first task was to perform structural analysis of the oligomers by NMR and X-Ray. Numerous NOE interactions in the DBT pentamer and hexamer molecules were detected by NMR 2D NOESY experiments. These data strongly suggest the organization of these DBT oligomers. Small crystals were obtained from the same molecules in DMSO but at the time being their size is not importan t enough for X-Ray crystallography studies. In a parallel study we hypothesized that short oligomers constructed by DBT or AMPA frameworks could translocate the cellular membrane and could be used as new cell penetrating non-peptides - CPNP. Even though these compounds are not charged as most cell penetrating peptides (CPP)5 or CPNP, we considered that by virtue of their aromaticity, hydrophobicity and their well-organized structure they could have a non-specific interaction with the lipid bilayer and thus be internalized into the cell. Short oligomers were synthesized on Rink amide (RA) resin following SPPS methodology and labelled at their N-terminus with fluorescein isothiocyanate (FITC). At first the cellular uptake of the (DBT)2-4 oligomers in MDA-MB-231 breast cancer cells was analyzed by fluorescence emission measurement and compared to the potent and well-studied CPP octa-arginine (Arg)8 as a positive control and carboxyfluorescein as a negative control. The highest intracellular fluorescence intensity was found for (DBT)4 with a drastic decrease (>4-times) for (DBT)3 and (DBT)2 oligomers. Thus, the cellular uptake appeared length-dependent with an increase of the internalization with the oligomer size. Moreover, the amount of (DBT)4 that was internalized was more significant than that of (Arg)8 despite the fact that it is uncharged. By confocal microscopy we determined that (DBT)4 is mainly localized in the endosomes after 3 hours of incubation and in the lysosomes after 16 hours of incubation. Altogether, these data indicate the ability of these oligomers to target the endolysosomal pathway. Although most of the initial drug delivery studies aimed to avoid lysosomal addressing to prevent subsequent drug degradation, more recent studies demonstrated the relevant clinical utility to target this compartment for drug delivery in the treatment of lysosomal storage diseases, Alzheimer¡¯s disease, and cancer.While analyzing the internalization efficiency of our CPNP we decided to straightforward evaluate their concentration inside the cells. We studied our compounds internalization by total fluorescence emission measurement and by confocal microscopy but none of these techniques gave us the possibility to determine the exact amount of compound internalized per cell. A study reported by Burlina et al. brought a great improvement in proposing a highly reproducible quantification method based on MALDI-TOF MS to measure the concentration of the internalized peptides. However, after cell lysis, this method requires the capture of the biotin-labelled CPP by streptavidin coated magnetic beads. This step is particularly critical for the accuracy of the quantification. This is the reason why we decided to develop a new general methodology based on MALDI-TOF mass spectrometry (MS) which does not require any purification or separation steps. We studied the internalization of CPP/CPNP compou nds by using an UV light-absorbing tag alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid (HCCA) and preparing the samples in a neutral matrix such as alpha-cyano-4-hydroxycinnamic methyl ester (HCCE). This combination (HCCA tag and HCCE matrix) enabled us to discriminate MS signals induced by peptides of interest that were present in low concentration from those of unlabelled more abundant peptides. By addition of a precise amount of deuterated-HCCA-tagged CPP/CPNP prior the MALDI TOF MS experiment, the internalized CPP/CPNP could be quantified on the basis of the ratio between the [M+H]+ peaks of the deuterated and nondeuterated HCCA-tagged CPP.Another direction for research was to synthesize bioconjugates between our newly discovered CPNP and some biologically active compounds that are unable to cross the cell membrane. We selected pepstatine which is a powerful transition state inhibitor of the Cathepsin D (CD). Pepstatine while a very potent inhibitor of the CD is unable to cross the cellular membrane. Moreover pepstatine activity in vitro or in vivo is hampered by its poor solubility in water. CD is a soluble lysosomal aspartic endopeptidase synthesized in rough endoplasmic reticulum as preprocathepsin D (pCD).12 Upon entering the acidic endosomal and lysosomal compartments proteolytic cleavages of the pCD result in the formation of the active enzymatic form of CD. Under normal physiological conditions pCD is sorted to the lysosomes and found intracellularly but in some pathological and physiological conditions like cancer pCD/CD escape the normal targeting mechanism and is secreted from the cell. Once secreted to the outside, pCD can be endocytosed via M6PR or yet unknown receptor by both cancer cells and fibroblasts. The endocytosed pCD undergoes maturation into the enzymatically active CD. An enzymatic activity of CD outside of the cell or inside the endosomes could be responsible for the activation of several growth factors and growth factor receptors. Several groups have proven that the tumour growth is not inhibited by the powerful CD inhibitor pepstatine. These results exclude the importance of the CD enzymatic activity outside of the cell but as already mentioned pepstatine is unable to penetrate into the cell thus CD activation of growth factors inside the endosomes or the lysosomes is still a possibility. Different CPNP-Pepstatine conjugates were synthesized and tested in vitro for their ability to inhibit MDA-MB-231 breast cancer cells growth. Some of these conjugates showed high cytotoxicity, probably via a Cathepsin D inhibition in the endosomes or the lysosomes. One o f the most potent tested compounds was JMV4463. This compound was obtained by the conjugation of pepstatine with a CPNP as delivery system (AMPA4) and with solubilizing moiety composed of polyethylene glycol and D-Arginine residue. The good in vitro results obtained with the vectorized pepstatine encouraged us to perform in vivo tests. We performed scale up synthesis of JMV4463 in order to obtain enough product for anti-cancer activity on mice in the near future

L’utilisation de peptides et d’oligonucléotides comme médicaments est une nouvelle approche plus sélective pour le traitement de nombreuses pathologies. Cependant cette nouvelle stratégie se heurte aux problèmes de stabilité de ces macromolécules dans les milieux biologiques. Une solution peut être d’utiliser des mimétiques de peptide et d’oligonucléotides dont les propriétés permettront de pallier ces problèmes. Dans ce travail nous nous sommes intéressés au développement de mimes oligonucléotidiques : les acides peptidiques nucléiques (PNA), ainsi qu’à des mimes de peptides. Nous avons choisi dans ces deux modèles de remplacer certaines liaisons amides de la structure peptidique ou pseudopeptidique par des liens phosphiniques dans le but d’améliorer, pour le peptide la stabilité enzymatique et pour le PNA la solubilité en milieu aqueux. Dans un premier temps nous avons développé une nouvelle méthode de synthèse générale des acides phosphiniques non symétriques (R’P(O)OHR’’). Cette nouvelle méthode utilise des conditions douces qui permettent l’utilisation de substrats fonctionnalisés. Nous avons ensuite appliqué cette méthode pour la synthèse d’un dipeptide simple Gly[P(O)(OH)CH2]Gly, puis d’un dipeptide Ala[P(O)(OH)CH2]Ala et nous avons évalué son incorporation dans la séquence d’un peptide anti-angiogénique (A-p-AWLPPR). Le dernier aspect de ce travail a été d’étudier les stratégies d’obtention d’un synthon dimère PNA phosphinique TpT qui pourrait être incorporé dans diverses positions dans une séquence de PNA (TTTTCTTTT) : la séquence du polypurine tract (PPT) de l’ARN viral du virus HIV-1
The use of oligonucleotides and peptides as more selective drug is a new strategy more and more studied to treat several diseases. However the main drawback in the use of these macromolecules as therapeutic agent is their poor stability in biological media. A solution could be to synthesize mimetic with improved properties. In our work we focused on the development of oligonucleotide mimics: peptide nucleic acids PNA and on peptide mimic. For these two mimics we choose to replace amide bond in the peptidic or pseudopeptidic structure by a phosphinic linkage, in order to increase for the peptide the stability towards enzymatic degradation and for the PNA to increase the aqueous solubility. First, we developed a new methodology for the obtaining of asymmetric phosphinic acids (R’P(O)OHR’’). This new synthetic strategy is carry out in mild conditions which allowed the use of functionalized substrates. We then apply this methodology to the synthesis of a simple dipeptide Gly[P(O)(OH)CH2]Gly and secondly of a dipeptide Ala[P(O)(OH)CH2]Ala. We evaluated the incorporation of this later dipeptide in the sequence of an antiangiogenic peptide (A-p-AWLPPR). The last aspect of this work was to study several strategies for the obtaining of a phosphinic dimer synthon of PNA: TpT which could be introduced in diverse position in a PNA sequence (TTTTCTTTT): the sequence of HIV-1 polypurin Tract (PPT) RNA

L’hyperglycémie de stress et la variabilité glycémique, consécutives à la réaction inflammatoire péri opératoire, sont associées à une morbidité et une mortalité accrues en chirurgie cardiaque. L’insulinothérapie intraveineuse administrée à l’aide de protocoles complexes, dits « dynamiques », constitue à l’heure actuelle le traitement de référence de l’hyperglycémie de stress. L’intérêt du contrôle glycémique péri-opératoire est admis par tous, sans qu’il existe de consensus véritable quant aux objectifs à atteindre, et reste très exigeant en termes de charge de soins. Dans la 1ère partie de ce travail, nous avons voulu vérifier si, 7 ans après sa mise en place, l’observance du protocole d’insulinothérapie utilisé dans notre Unité de Soins Intensifs de Chirurgie Cardiaque était conforme à celle mesurée lors de son implantation. Nous avons constaté des dérives majeures dans l’application du protocole qui ont pu être corrigées par la mise en place de mesures correctrices simples. Dans une 2ème partie du travail, nous avons cherché à évaluer si, à l’instar de la chirurgie cardiaque classique, une variabilité glycémique accrue était associée à une altération du pronostic des patients bénéficiant d’une procédure moins invasive (remplacement valvulaire aortique percutané ou TAVI). Nous avons ainsi analysé les données des patients ayant bénéficié d’un TAVI dans notre centre, et inclus dans les registres multicentriques français France et France-2. Nos résultats suggèrent une association entre une augmentation de la variabilité glycémique et un risque accru de complications cardiovasculaires majeures dans les 30 premiers jours, indépendamment de la qualité du contrôle glycémique obtenu. Enfin, dans une 3ème partie nous avons voulu savoir si exenatide, analogue de synthèse de GLP-1, permettait d’améliorer le contrôle glycémique péri opératoire en chirurgie cardiaque. Nous avons conduit un essai randomisé contrôlé de phase II/III montrant que l’administration intraveineuse (IV) d’exenatide, ne permettait pas d’améliorer la qualité du contrôle glycémique ou de réduire la variabilité glycémique par rapport à l’insuline IV, mais permettait de retarder l’administration d’insuline et de diminuer la quantité d’insuline administrée. Notre étude suggère également une diminution de la charge en soins. Du fait des données rapportées chez l’animal et dans l’infarctus du myocarde, nous avons également conduit une étude ancillaire suggérant l’absence d’effets cardioprotecteurs majeurs d’exenatide sur les lésions d’ischémie-reperfusion myocardiques, ne permettant pas d’améliorer la fonction cardiaque gauche à court et à moyen terme. L’optimisation du contrôle glycémique en chirurgie cardiaque nécessite ainsi la recherche de stratégies visant à améliorer l’observance des protocoles de soins et à réduire la variabilité glycémique. La place des analogues du GLP-1 reste à définir dans cette indication
Stress hyperglycemia and glycemic variability are associated with increased morbidity and mortality in cardiac surgery patients. Intravenous (IV) insulin therapy using complex dynamic protocols is the gold standard treatment for stress hyperglycemia. If the optimal blood glucose target range remains a matter of debate, blood glucose control using IV insulin therapy protocols has become part of the good clinical practices during the postoperative period, but implies a significant increase in nurse workload. In the 1st part of the thesis, we aimed at checking the nurse-compliance to the insulin therapy protocol used in our Cardiac Surgery Intensive Care Unit 7 years after its implementation. Major deviations have been observed and simple corrective measures have restored a high level of nurse compliance. In the 2nd part of this thesis, we aimed at assessing whether blood glucose variability could be related to poor outcome in transcatheter aortic valve implantation (TAVI) patients, as reported in more invasive cardiac surgery procedures. The analysis of data from patients who undergone TAVI in our institution and included in the multicenter France and France-2 registries suggested that increased glycemic variability is associated with a higher rate of major adverse events occurring between the 3rd and the 30th day after TAVI, regardless of hyperglycemia. In the 3rd part if this thesis, we conducted a randomized controlled phase II/III trial to investigate the clinical effectiveness of IV exenatide in perioperative blood glucose control after coronary artery bypass graft surgery. Intravenous exenatide failed to improve blood glucose control and to decrease glycemic variability, but allowed to delay the start in insulin infusion and to lower the insulin dose required. Moreover, IV exenatide could allow a significant decrease in nurse workload. The ancillary analysis of this trial suggested that IV exenatide did neither provide cardio protective effect against myocardial ischemia-reperfusion injuries nor improve the left ventricular function by using IV exenatide. Strategies aiming at improving nurse compliance to insulin therapy protocols and at reducing blood glucose variability could be suitable to improve blood glucose control in cardiac surgery patients. The use of the analogues of GLP-1 in cardiac surgery patients needs to be investigated otherwise

Actuellement, il est largement reconnu que la décision des cellules souches de maintenir leur caractère souche ou se différencier vers une lignée spécialisée dépend particulièrement de la nature de leur microenvironnement, appelé niche cellulaire. Une des composantes essentielles de cette niche cellulaire est la matrice extracellulaire (MEC), qui au-delà de sa fonction de support cellulaire, détermine le devenir des cellules souches en fonction de sa composition biochimique, sa structure et sa localisation. D’un point de vue rationnel, un biomatériau destiné à remplacer la fonction d’un tissu endommagé doit non seulement jouer le rôle d’échafaudage cellulaire mais également mimer les propriétés de la MEC dans son ensemble. Malheureusement, il est extrêmement difficile de concevoir des biomatériaux mimétiques de la MEC naturelle tenant compte de sa complexité structurelle et fonctionnelle. Pour pallier à cette problématique, il semble nécessaire d’effectuer un travail en amont de déconstruction/reconstruction de la complexité de la MEC en étudiant l’effet individuel puis combiné de ses propriétés sur la différenciation des cellules souches. Ce projet de doctorat rentre dans le cadre de ce travail et vise à déterminer le rôle spécifique ou concomitant de différentes propriétés inhérentes à la MEC sur la différenciation ostéoblastique des cellules souches mésenchymateuses humaines (hCSMs). En effet, nous avons évalué l’effet de la composition biochimique de la MEC et la distribution spatiale des ligands sur la différenciation des hCSMs, en fonctionnalisant la surface d’un matériau modèle avec les peptides RGD et/ou BMP-2, distribués d’une manière aléatoire ou structurée
Actually, it is well-established that maintaining the stemness character of stem cells or eliciting their lineage-specific differentiation is closely related to the nature of their microenvironment, known as stem cell niche. The extracellular matrix (ECM), a key component of stem cell niche, not only provides a support function for stem cells but also dictates their fate decision. From a rational point of view, a biomaterial intended to replace a damaged tissue should mimic the natural ECM in all its aspects, including its biochemistry, 3D structure, topography, porosity, rigidity…. etc. Unfortunately, the design of biomaterials that fully mimic the natural ECM is still a big challenge, due to its high structural and functional complexity. Towards the development of finely-tuned biomaterials, it seems important to start by deconstructing and then reconstructing the complexity of the ECM. In this context, the thesis project, herein, seeks to evaluate both the individual and the synergistic effect of different properties inherent to the natural ECM on human mesenchymal stem cells (hMSCs) osteogenic differentiation. Indeed, we investigated whether the biochemical composition of the ECM and the spatial distribution of its components modulate hMSCs osteogenesis. This was achieved by creating different artificial ECMs, in vitro, containing RGD and/or BMP-2 mimetic peptides, distributed randomly or as specific micropatterns on the surface of a model material

Ce travail de thèse a consisté à synthétiser des peptides à visée antidiabétiques, à déterminer leur structure tridimensionnelle et à étudier leur activité biologique lors de tests biologiques in vitro et in vivo. Les peptides étudiés dérivent soit des chaînes A et B isolées de l’insuline humaine soit de peptides décrits dans la littérature comme ayant une activité biologique. L’effet pharmacologique des peptides a été testé sur des modèles cellulaires et sur un modèle animal. Les études structurales réalisées par RMN, DC et dynamique moléculaire ont permis de proposer un modèle tridimensionnel pour deux de ces peptides. Une approche séquentielle impliquant la reconstruction du pont disulfure à partir du dérivé dithiol a été suivie lors de simulations de l’ordre de la microseconde. Enfin, une méthode générale d’étude de l’impacte de pont disulfure intramoléculaire dans le repliement des peptides a été mise au point par dynamique moléculaire en présence de solvant implicite « GB »
This work of thesis consisted in synthesizing antidiabetic peptides with aiming, determining their three-dimensional structure and studying their biological activity during in vitro and in vivo biological essay. Studied peptides derive either from chains A and B isolated from human peptide insulin or described in the literature like having a biological activity. The pharmacological effect of peptides was tested on cellular models and an animal model. The structural studies carried out by NMR, CD and molecular dynamics made it possible to propose a three-dimensional model for two of these peptides. A sequential approach implying the rebuilding of the disulphide bridge starting from derived the sulfhydryl was followed during simulations of about a microsecond. Lastly, a general method of impact study intramolecular disulphide bridge in the folding of peptides was developed by molecular dynamics in the presence of implicit solvent "GB"