Auswahl der wissenschaftlichen Literatur zum Thema „Peptide mimétique“

Les caspases sont une famille de cystéines protéases bien connues pour leurs rôles centraux au cours de l’apoptose et de l’inflammation. Elles interviennent aussi dans des voies de mort cellulaire régulées non-apoptotiques, et contribuent à de très nombreux mécanismes physiologiques. Le développement d’approches thérapeutiques ciblant les caspases a engendré un fort intérêt industriel dès les années 1990, suscitant d’intenses recherches sur les mécanismes biologiques, et conduisant à la mise au point de nombreux inhibiteurs synthétiques. La plupart de ces inhibiteurs sont des dérivés de peptides, ou mimétiques, capables d’interagir avec le site actif des caspases. Cependant, la conservation structurelle observée entre les différentes caspases est un défi pour le développement d’inhibiteurs sélectifs. À ce jour, cinq inhibiteurs de caspases ont été évalués pour leur efficacité clinique, mais aucune autorisation de mise sur le marché n’a été délivrée à ce jour. Contrairement aux présomptions initiales, les inhibiteurs sélectifs de la Caspase-3 n’ont pas atteint le stade d’essais cliniques, alors que le QPI-1007, un siARN dirigé contre la Caspase-2, a fait l’objet d’une étude clinique de phase III pour le traitement de neuropathies optiques ischémiques.

La narcolepsie et la cataplexie sont décrites pour la première fois à la fin du XIXe siècle en Allemagne et en France. La prévalence de la maladie est établie à 0,05 % et un modèle canin est découvert dans les années 1970. En 1983, une étude japonaise révèle que les patients narcoleptiques sont porteurs d’un marqueur génétique unique, l’antigène leucocytaire HLA-DR2, suggérant l’auto-immunité comme cause de la maladie. Il faudra attendre 1992 pour qu’il soit montré, grâce à une étude chez des patients afro-américains, que DQ0602, un autre gène HLA, est la véritable cause de cette association. Des études pharmacologiques conduites sur le modèle canin établissent que la stimulation dopaminergique est le mode d’action des stimulants sur l’éveil, tandis que les antidépresseurs suppriment la cataplexie en inhibant la recapture adrénergique. Aucune association HLA n’est cependant mise en évidence chez les chiens, suggérant une cause distincte de la maladie humaine. Une étude de liaison génétique chez les chiens, initiée en 1988, révèle en 1999 que la narcolepsie canine est causée par des mutations du récepteur 2 de l’hypocrétine (orexine). En 2000, l’hypocrétine-1/orexine A est mesurée dans le liquide céphalo-rachidien (LCR) et on découvre qu’elle est indétectable chez la plupart des patients narcoleptiques, établissant qu’un déficit hypocrétinergique est la cause de la narcolepsie humaine. La diminution de l’hypocrétine-1 dans le LCR, secondaire à la perte des 70 000 neurones hypothalamiques produisant l’hypocrétine, est démontrée, ce qui, avec l’association au locus HLA, suggère qu’une destruction immunitaire de ces cellules est la cause de la maladie. D’autres études génétiques, notamment d’association à l’échelle du génome (GWAS), révèlent l’existence de nombreux facteurs génétiques prédisposant à la narcolepsie, la plupart étant également impliqués dans d’autres maladies auto-immunes. Une association forte et unique avec les loci des récepteurs lymphocytaires T (TCR) alpha et bêta est aussi observée, suggérant un rôle prépondérant des lymphocytes T. En dépit de nombreux efforts, toutes les tentatives visant à démontrer la présence d’auto-anticorps contre les cellules à hypocrétine dans la narcolepsie échouent, et la cause auto-immune présumée de cette maladie reste à l’état d’hypothèse. À la suite de la grippe pandémique influenza A pH1N1 en 2009, de nombreux cas de narcolepsie apparaissent, suggérant un mimétisme moléculaire avec le virus de la grippe qui pourrait déclencher la maladie auto-immune. Cette hypothèse est confirmée par un criblage peptidique montrant une plus grande réactivité des lymphocytes T CD4+ à un segment spécifique de l’hypocrétine (HCRTNH2) et une réactivité croisée des TCR correspondants à un segment d’hémagglutinine de pH1N1 qui partage une homologie avec HCRTNH2. De façon remarquable, le TCR le plus fréquent dans la population et qui reconnaît ces antigènes contient des séquences TRAJ24 ou TRVB4-2, segments modulés par des polymorphismes génétiques associés à la narcolepsie dans les études GWAS. Il est probable que les lymphocytes T CD4+ autoréactifs avec HCRTNH2 recrutent par la suite des lymphocytes T CD8+ qui détruisent les cellules à hypocrétine. On peut s’attendre à ce que d’autres séquences mimiques grippales inconnues soient découvertes prochainement puisque la narcolepsie existait avant 2009. Ces découvertes démontrent enfin la cause auto-immune de la narcolepsie. Les travaux menés au cours des années sur la narcolepsie offrent une perspective unique sur la conduite de la recherche sur l’étiopathogénie d’une maladie bien identifiée.

L’insuffisance cardiaque est une des premières causes de mortalité dans le monde et constitue donc un enjeu important en termes de santé publique. Elle est principalement causée par l’infarctus du myocarde (IDM) qui induit l’obstruction de l’artère coronaire et la perte des cardiomyocytes qui composent le myocarde. Au stade adulte, le renouvellement des cardiomyocytes est limité et le cœur n’est pas capable de restaurer la fonction contractile. En revanche, au stade post-natal, il a été montré que le cœur est capable de se régénérer après une lésion durant 7 jours grâce à la prolifération des cardiomyocytes. À la naissance, le nouveau-né est exposé à un environnement riche en O2, ce qui permet aux cardiomyocytes de passer de la glycolyse à la phosphorylation oxydative mitochondriale. Ce changement métabolique provoque une augmentation de la production des espèces réactives de l’oxygène (ERO) mitochondriales, conduisant à des modifications, par oxydation, des protéines et des lipides ainsi que des endommagements de l’ADN. Ces altérations ont pour conséquence un arrêt du cycle cellulaire. Cependant, l’arrêt du cycle cellulaire peut être levé en hypoxie ou par l’action d’antioxydants capables de neutraliser les effets des ERO. Parmi les systèmes antioxydants, les thiorédoxines (Trx) constituent un puissant système de défense contre les ERO. La Trx-1 (12 kDa), ubiquitaire et très conservée dans toutes les espèces, est localisée dans le cytoplasme mais peut être transloquée dans le noyau ou sécrétée au niveau extracellulaire. Outre ses propriétés antioxydantes, la Trx-1 joue également un rôle anti-inflammatoire et anti-apoptotique. Sous l’action de deux α-sécrétases (ADAM-10 et ADAM-17), la Trx-1 est clivée au niveau de son extrémité C-terminale pour générer une protéine tronquée appelée Trx-80. Contrairement à la Trx-1, la Trx-80 ne présente pas d’activité oxydo-réductrice et exerce des effets pro-inflammatoires et pro-athérogènes puissants. La Trx-2, principalement localisée dans la mitochondrie, joue un rôle majeur dans la détoxification des ERO mitochondriaux. Étant donné que la Trx-1 est clivée en Trx-80, l’utilisation de peptides mimant son site actif devient donc intéressante pour évaluer son rôle dans l’infarctus du myocarde et contourner le processus clivage. Pour cela, nous avons utilisé un peptide mimétique synthétisé appelé CB3. Ces travaux de thèse montrent, pour la première fois, que le peptide CB3 exerce des effets bénéfiques après un IDM en améliorant le remodelage et la contractilité cardiaque. Le CB3 est également capable de réduire la zone infarcie, la fibrose, le stress oxydant, l’apoptose et l’inflammation qui sont des processus intervenant dans l’IDM. Également, il induit l’entrée dans le cycle cellulaire et la prolifération des cardiomyocytes. Ces résultats suggèrent que le CB3 pourrait être une molécule thérapeutique pour traiter l’infarctus du myocarde
Heart failure is one of the most devastating human diseases. It is mainly caused by myocardial infarction (MI) which induces obstruction of the coronary artery and loss of the cardiomyocytes. Although limited renewal of cardiomyocytes takes place in the adult heart, it is not sufficient for the regeneration of the contractile function. In contrast, in the postnatal stage, it has been shown that the heart is able to regenerate after injury for 7 days through cardiomyocyte proliferation. At birth, the neonate is exposed to an O2-rich environment, which allows cardiomyocytes to switch from glycolysis to mitochondrial oxidative phosphorylation. This metabolic shift causes an increase in the production of mitochondrial reactive oxygen species (ROS), leading to oxidative changes in proteins and lipids and damage to DNA. These alterations result in cell cycle arrest. However, cell cycle arrest can be reversed in hypoxia or by the action of antioxidants capable of neutralizing the effects of ROS. Among the antioxidant systems, thioredoxins (Trx) are a powerful defense system against ROS. Trx-1 (12 kDa), ubiquitous and highly conserved in all species, is localized in the cytoplasm but can be translocated into the nucleus or secreted extracellularly. In addition to its antioxidant properties, Trx-1 also plays an anti-inflammatory and anti-apoptotic role. Under the action of two α-secretases (ADAM-10 and ADAM-17), Trx-1 is cleaved at its C-terminus to generate a truncated protein called Trx-80. In contrast to Trx-1, Trx-80 lacks oxidative-reducing activity and exerts potent pro-inflammatory and pro-atherogenic effects. Trx-2, localized exclusively in the mitochondria, plays a key role in the detoxification of mitochondrial ROS. Since Trx-1 is cleaved to Trx-80, the use of peptides mimicking its active site thus becomes interesting to evaluate its role in myocardial infarction and bypass the cleavage. Therefore, we used a synthesized mimetic peptide called CB3. This thesis work shows for the first time that CB3 peptide has beneficial effects after MI by improving cardiac functions through cardiac remodeling and cardiac improvement contractility. CB3 is also able to reduce fibrosis, oxidative stress, apoptosis and inflammation which are processes involved in MI. It also induces cell cycle entry and proliferation of cardiomyocytes. These results suggest that CB3 could be a promising therapeutic molecule for MI and heart failure treatment

La migration cellulaire est un processus complexe. Lors du développement, elle permet aux cellules de rejoindre leur destination finale, puis à l'âge adulte elle intervient dans de nombreux processus tels la réponse immunitaire ou le développement de pathologies.La migration est modulée par l'action de molécules d'adhérence. Nous nous sommes intéressés à la molécule NCAM (Neural Cellular Adhesion Molecule) dont les effets sont modulés par l'acide polysalique (PSA). Lors de précédentes études, il a été montré que le peptide mimétique de PSA-NCAM, PR-21 stimulait la migration issus de la zone sous-ventriculaire (SVZ).Nous avons synthétisés des analogues non-peptidiques de PR-21 en nous appuyant sur des analogies structurales. ces analogues ont été testés dans divers modèles de migration cellulaire : explants de SVZ et cellules C6 sur-exprimant PSA. Nous avons mis en évidence la présence de fonctions structurales clés dans la modulation de la migration cellulaire
Cell migration is a complex process. During development, it contributes to cell reaching their final target. during adulthood, cell migration is involved in immune response or pathological processes.Migration is modulated by adhesion molecules. We concentrated on the Neural Cellular Adhesion Molecule (NCAM) which action is regulated by the post traductional addition of polysialic acid (PSA). PR-21 is a mimetic peptide of PSA-NCAM. In previous studies, PR-21 has been shown to stimulate in the migration of meuroblasts from sub-ventricular zone (SVZ) to the olfactory bulb.We designed non-peptidic analogues of PR-21 on the basis of structural analogies. these analogues were tested on various cell migration models : SVZ explants and C6 over-expressing PSA. We then established the need of key structural functions to modulate cell migration

La migration cellulaire est un processus complexe. Lors du développement, elle permet aux cellules de rejoindre leur destination finale, puis à l'âge adulte elle intervient dans de nombreux processus tels la réponse immunitaire ou le développement de pathologies.La migration est modulée par l'action de molécules d'adhérence. Nous nous sommes intéressés à la molécule NCAM (Neural Cellular Adhesion Molecule) dont les effets sont modulés par l'acide polysalique (PSA). Lors de précédentes études, il a été montré que le peptide mimétique de PSA-NCAM, PR-21 stimulait la migration issus de la zone sous-ventriculaire (SVZ).Nous avons synthétisés des analogues non-peptidiques de PR-21 en nous appuyant sur des analogies structurales. ces analogues ont été testés dans divers modèles de migration cellulaire : explants de SVZ et cellules C6 sur-exprimant PSA. Nous avons mis en évidence la présence de fonctions structurales clés dans la modulation de la migration cellulaire
Cell migration is a complex process. During development, it contributes to cell reaching their final target. during adulthood, cell migration is involved in immune response or pathological processes.Migration is modulated by adhesion molecules. We concentrated on the Neural Cellular Adhesion Molecule (NCAM) which action is regulated by the post traductional addition of polysialic acid (PSA). PR-21 is a mimetic peptide of PSA-NCAM. In previous studies, PR-21 has been shown to stimulate in the migration of meuroblasts from sub-ventricular zone (SVZ) to the olfactory bulb.We designed non-peptidic analogues of PR-21 on the basis of structural analogies. these analogues were tested on various cell migration models : SVZ explants and C6 over-expressing PSA. We then established the need of key structural functions to modulate cell migration

Au cours du vieillissement, une inflammation chronique de bas grade, appelée inflamm’aging, se développe au niveau cellulaire, tissulaire et circulant. Elle est définie comme un déséquilibre entre les processus pro- et anti-inflammatoires, et serait le mécanisme étiologique commun des pathologies liées à l’âge. L’inflamm’aging est notamment dû à l’altération des réponses immunitaires (immunosénescence) et à l’accumulation de cellules sénescentes (CS) dans les tissus âgés. Les CS se caractérisent par un arrêt du cycle cellulaire (induction de p16INK4a, p21CIP) et l’expression de marqueurs de la sénescence comme la SA-β-Gal (senescence-associated-β-galactosidase activity). Ces cellules adoptent également un profil sécrétoire associé à la sénescence (SASP) et produisent des cytokines pro-inflammatoires (IL-6, IL-1β, MCP-1…) contribuant ainsi à l’installation de l’inflamm’aging. L’accumulation des CS conduisent à l'activation chronique des cellules de l'immunité innée, en particulier les macrophages. Les macrophages sont des cellules pourvues d’une grande plasticité phénotypique leur permettant de moduler leur physiologie en fonction du microenvironnement. Il a récemment été décrit que les macrophages s’adaptent phénotypiquement au microenvironnement tissulaire riche en CS. En effet, ils peuvent adopter un phénotype senescent-like associé à une forte expression de p16Ink4a, SA-β-Gal et de marqueurs de l'inflammation. Les macrophages âgés présentent également des altérations métaboliques qui correspondent à un phénotype métabolique pro-inflammatoire impliquant notamment une augmentation de la glycolyse. De plus, leur fonction est altérée, avec particulièrement une modification de la réponse aux signaux inflammatoires et de l'activité phagocytaire, favorisant ainsi l'accumulation de CS et la persistance de l’inflammation chronique. Limiter l’accumulation de cellules sénescentes et l'inflamm'aging associée sont aujourd’hui des enjeux majeurs dans le but de prévenir le développement des pathologies liées à l’âge. Parmi les stratégies thérapeutiques possibles, on retrouve l'utilisation de molécules sénomorphiques, qui vont moduler le SASP des CS pour limiter l'inflamm'aging. Dans ce cadre, nous nous intéressons particulièrement à la thiorédoxine-1 (Trx-1). La Trx-1 est une oxydo-réductase qui exerce, via son site catalytique (-Cys32 -Gly-ProCys35 -), des effets anti-oxydants et anti-inflammatoires. Cependant, elle peut être clivée, par un mécanisme encore mal connu, en une forme tronquée, la Trx-80, qui aggrave l’inflammation. Notamment, la Trx-80 augmente, au détriment de la Trx-1, dans le plasma de sujets âgés et sains. L’utilisation thérapeutique de la Trx-1, au cours du vieillissement, étant compromise par son clivage, nous avons développé une nouvelle stratégie basée sur un tri-peptide, reproduisant le site catalytique de la Trx-1 et mimant ses effets, le CB3. Nous avons précédemment démontré que le CB3 exerce des effets antioxydants et anti-inflammatoires dans un modèle murin d'inflammation vasculaire. Cependant, les effets bénéfiques du CB3 dans le contexte du vieillissement restent à démontrer. Dans ce but, nous avons caractérisé un nouveau modèle de vieillissement des macrophages in vitro, basé sur la comparaison d'une culture normale (jour 2) et de cultures à longue durée (7 et 14 jours) de macrophages péritonéaux issus de souris âgées de 3 mois. Les J14 expriment l'ensemble des marqueurs de sénescence et d'immunosénescence précédemment décrits nous permettant ainsi d'évaluer l'efficacité thérapeutique du CB3. Il est capable de diminuer le SASP, les niveaux d’expression de p16INK4a, p21CIP et de relancer le cycle cellulaire en augmentant l’incorporation EdU. Ces résultats ont permis de développer un modèle pertinent pour étudier les fonctions et les caractéristiques altérées des macrophages lors du vieillissement, ainsi qu'une nouvelle approche thérapeutique pour lutter contre la sénescence et l'inflamm'aging
During aging, a low-grade chronic inflammation develops at the cellular, tissue, and circulating levels, known as inflamm'aging. It is defined as an imbalance between pro- and anti-inflammatory processes and is considered as a common etiological mechanism for age-related pathologies. Inflamm'aging is primarily attributed to immune response alterations (immunosenescence) and the accumulation of senescent cells (SC) in aged tissues. SC are characterized by cell cycle arrest (p16INK4a and p21CIP induction) and the expression of senescence markers such as SA-β-Gal (senescence-associated β-galactosidase activity). SC also adopt a senescence-associated secretory phenotype (SASP) and produce pro-inflammatory cytokines (IL-6, IL-1β, MCP-1...), thus contributing to inflamm'aging establishment. The accumulation of SC leads to chronic activation of innate immune cells, particularly macrophages. Macrophages are highly phenotypically plastic cells that can adapt their physiology based on the tissue microenvironment. Recent studies have described that macrophages undergo phenotypic adaptation in the SC-rich tissue microenvironment, adopting a senescent-like phenotype characterized by high expression of p16Ink4a, SA-β-Gal, and inflammation markers. Aged macrophages also exhibit metabolic alterations corresponding to a pro-inflammatory metabolic phenotype, including increased glycolysis. Furthermore, they have reduced capacity to respond to inflammatory signals and carry out phagocytic activity, leading to the accumulation of senescent cells and chronic inflammation. Limiting the accumulation of senescent cells and associated inflamm'aging is a major challenge in preventing age-related pathologies. One potential therapeutic strategy involves the use of senomorphic molecules to modulate the SASP of SC and mitigate inflamm'aging. In this context, we are particularly interested in thioredoxin-1 (Trx-1). Trx-1 is an oxidoreductase that exerts antioxidant and anti-inflammatory effects through its catalytic site (-Cys32-Gly-ProCys35-). However, it can be cleaved, through a mechanism that is still poorly understood, into a truncated form, Trx-80, which exacerbates inflammation. Notably, Trx-80 increases in the plasma of healthy and aged subjects at the expense of Trx-1. Given that, the therapeutic use of Trx-1 during aging is compromised by its cleavage, we have developed a new strategy based on a tripeptide, mimicking the catalytic site of Trx-1 and its effects, called CB3. We have previously demonstrated that CB3 exerts antioxidant and anti-inflammatory effects in a murine model of vascular inflammation. However, the beneficial effects of CB3 in the context of aging remain to be demonstrated. For this purpose, we characterized a new model of macrophage aging in vitro, based on comparing a normal culture (day 2) with prolonged cultures (7 and 14 days) of peritoneal macrophages derived from 3-month-old mice. The D14 cultures express all previously described markers of senescence and immunosenescence, enabling us to evaluate the therapeutic efficacy of CB3. It is capable of reducing SASP, expression levels of p16INK4a, p21CIP, and reinitiating the cell cycle by increasing EdU incorporation. These results have led to the development of a relevant model for studying the altered functions and characteristics of macrophages during aging, as well as a new therapeutic approach to counteract senescence and inflamm'aging

Le stress oxydatif et l'inflammation jouent un rôle pathogène dans l'athérosclérose. La Thiorédoxine-1 (Trx-1) est une protéine anti-oxydante et anti-inflammatoire ayant des effets athéroprotecteurs. Cependant, le clivage in vivo de la Trx-1 génère une protéine tronquée pro-inflammatoire, la Trx-80, qui compromet l'utilisation thérapeutique de la Trx-1. L'objectif de ma thèse est de caractériser une nouvelle stratégie thérapeutique basée sur l’utilisation des peptides mimétiques de la Trx-1 (TxMP) pour le traitement de l'athérosclérose. Nous avons synthétisé un petit peptide basé sur le site actif de la Trx-1 appelé CB3. D’une part, le peptide CB3 a été validé sur des macrophages murins péritonéaux en culture (viabilité cellulaire, réponses anti-oxydantes et anti-inflammatoires). D’une autre part, un modèle de souris athérosclérotique (ApoE2.Ki) nourri avec un régime alimentaire riche en graisse a reçu une injection de CB3 par voie intrapéritonéale afin de mesurer son effet antioxydant, anti-inflammatoire et anti-athérogène. Nos résultats ont clairement montré que le peptide CB3 exerce des effets protecteurs similaires à la Trx-1, à savoir une réduction de l'inflammation et du stress oxydatif chez les macrophages et les souris ApoE.Ki. L'effet athéroprotecteur du CB3 ouvre des perspectives thérapeutiques prometteuses pour le traitement de l'athérosclérose
Oxidative stress and inflammation play a pathogenic role in atherosclerosis. Thioredoxin-1 (Trx-1) is an anti-oxidative, anti-inflammatory protein with atheroprotective effects. However, in vivo cleavage of Trx-1 generates a truncated pro-inflammatory protein, Trx-80, which compromises the therapeutic use of Trx-1. The aim of my thesis is to characterize a new therapeutic strategy based on Trx-mimetic peptides (TxMP) for the treatment of atherosclerosis. We synthesized a small peptide based on the active site of Trx-1 named CB3. Firstly, CB3 was validated on cultured peritoneal murine macrophages (cellular viability, anti-oxidant and anti-inflammatory responses). Secondly, the atherosclerotic mouse model (ApoE2.Ki) fed a high fat diet was intraperitoneally injected with CB3 to measure their anti-oxidant, anti-inflammatory and anti-atherogenic effects. Our results clearly showed that, similar to the full length Trx-1, CB3 exerts protective effects by reducing inflammation and oxidative stress in macrophages and in ApoE.Ki mice. The atheroprotective effect of CB3 opens promising therapeutic approaches for treatment of atherosclerosis

Les récepteurs à sept domaines transmembranaires couplés aux protéines G (RCPG) représentent une grande famille de récepteurs ubiquitaires impliqués dans de nombreux processus métaboliques. Leur grande diversité d'action en fait des cibles pharmacologiques privilégiées pour le développement de médicaments avec des applications dans tous les champs d'activité clinique en particulier au niveau cardio-vasculaire. Les récepteurs 2-adrénergique (2AR) et M2 muscariniques (M2Ach-R) appartiennent à la famille des RCPG et sont impliqués dans la régulation du système cardiovasculaire. De nombreuses études ont montré l'importance de la seconde boucle extracellulaire pour l'activité de ces récepteurs dans certaines pathologies autoimmunes. La première partie du travail concerne le 2AR. Les scFvs issus d'AcM dirigés contre un peptide dérivé de la seconde boucle extracellulaire (SBE) du 2AR ont été produits. La capacité de cette protéine recombinante de reconnaître son peptide antigénique de façon spécifique a été mise en évidence, et les constantes cinétiques d'interaction ont pu être déterminées. Leur capacité à reconnaître le récepteur a été démontrée par immuno-cyto-fluorescence sur cellules A431 exprimant de façon constitutive le 2AR. Sur ces mêmes cellules, ce fragment d'anticorps est capable de façon dose dépendante de diminuer l'augmentation intracellulaire d'AMPc induite par 10 nM de salbutamol (agoniste 2), il est également capable seul de diminuer le niveau basal d'AMPc ce qui en fait un agoniste inverse. Il inhibe de façon non compétitive l'augmentation des battements spontanés de cardiomyocytes de rats nouveau-nés induits par différentes concentrations de clenbutérol (agoniste ). Des souris traitées par injections i. V. De scFv montrent une diminution du rythme cardiaque. Les peptides dérivés des CDRs du scFv 6H8 ont été synthétisés et cyclisés. Le CDR H1, totalement insoluble, n'a pu être utilisé. Les constantes cinétiques d'interaction avec le peptides dérivé du 2AR ont pu être déterminées par SPR pour le CDR L2, L3 et H3. Les CDR H2, L1 et L2 se sont révélés être des modulateurs allostériques négatifs du 2AR en inhibant de façon non compétitive l'augmentation des battements induite par une dose croissante de clenbutérol alors que les CDR H3 et L3 se sont révélés être des modulateurs allostériques positifs en augmentant l'effet du clenbutérol sur ces cellules. La deuxième partie du travail concerne la modulation de l'activité du récepteur M2 muscarinique et cela par deux approches différentes. Dans un premier temps, un lot de souris a été immunisé avec un peptide dérivé de la SBE du M2Ach-R (souris M2). Les sérums issus des souris M2 sont capables de reconnaître le M2Ach-R en immuno-empreinte. Ils sont également capables d'augmenter l'activité du carbachol sur le M2Ach-R in vitro sur des cellules CHO transfectées avec ce dernier. Pour mettre en évidence une modulation du récepteur induite par les anticorps anti-M2Ach-R, les souris ont été traitées par injection i. V. Avec plusieurs ligands muscariniques et adrénergique. Leurs ECGs ont été enregistrés et l'évolution de leurs rythme cardiaque suite à l'injection ainsi que les spectres de variabilité de leur rythme ont été calculés. Suite à l'injection de carbachol, les souris M2 diminuent plus fortement leur rythme que les souris contrôles. De plus, les souris M2 sont moins sensibles à l'injection de gallamine, atropine et isoprotérenol. L'analyse de l'évolution et de la variabilité de leur rythmes cardiaques suite aux différents traitements montre une augmentation du tonus parasympathique chez les souris M2 par rapport aux souris contrôles. Les anticorps anti-M2Ach-R agissent dans ce cas comme des ligands allostériques positifs. Une deuxième approche a également permis de moduler l'activité du M2Ach-R. De la même manière que pour le scFv anti-récepteur 2 adrénergique, un scFv anti-M2Ach-R a été produit et caractérisé à l'aide de la technologie SPR. Des expériences menées in vitro sur cellules CHO transfectées avec le M2Ach-R et sur cardiomyocytes de rats nouveau-nés ont permis de mettre en évidence une activité pharmacologique sur ce récepteur. Il est capable d'inhiber de manière non-compétitive l'action d'un agoniste tel que le carbachol. De plus, seul, il est également capable de diminuer l'activité basale du récepteur ce qui fait également de ce fragment d'anticorps un agoniste inverse. Il est également capable in vivo de modifier la réponse au carbachol et à l'isoprotérénol sur l'activité cardiaque de souris via le M2Ach-R par injection i. V. . Ce travail montre que des fragments d'anticorps recombinants monovalents dirigés contre la SBE de RCPG représentent des agonistes inverses allostériques alors que des anticorps (bivalents) induits contre ce même site, sont des ligands allostériques positifs. De plus, les peptides dérivés des CDRs du scFv anti 2AR, ont gardé une activité pharmacologique sur leur récepteur cible. Outre l'aspect développement de nouvelles molécules, ces fragments d'anticorps ainsi que les peptides mimant les CDRs représentent des outils puissants pour la compréhension des mécanismes d'activation des RCPG
G protein coupled receptor are involved in various metabolic functions. This receptor family represents the main target of cardiovascular and neurological used drugs. The 2 adrenergic receptor (2AR) and the M2 muscarinic receptor (M2Ach-R) belong to this family and are implicated in the regulation of the cardiovascular system. Many studies show the importance of the second extracellular loop of GPCR on their activity in particular in some autoimmune diseases. The first part of this work concern the 2AR. Using a functional monoclonal antibody against the human 2AR, a scFv fragment with high affinity for the target epitope was constructed and produced. The fragment recognized the ß2-adrenergic receptors on A431 cells, blocked cAMP accumulation induced by the ß2-agonist salbutamol, and decreased basal cAMP accumulation in the same cells. Their in vitro activity was tested on neonatal rat cardiomyocytes. The antibody fragments blocked the chronotropic activity induced by the ß2-agonist clenbuterol. They also decreased the in vivo heart beating frequency of mice pretreated with bisoprolol (a ß1-adrenergic receptor antagonist) for 4 minutes after injection. Cyclic peptides derived from the CDR of the scFv 6H8 were produced. The CDR H1 was not used because of its total insolubility in water. Kinetic contants of interaction with their target peptides were determined by SPR technology for the CDR peptides L2, L3 and H3. The CDR H2, L1 et L2 behaved as negative allosteric modulator of the 2AR, they inhibited in a non competitive manner the increase of spontaneous beating rate of neonatal rat cardiomyocytes induced by an increasing dose of clenbuterol. The CDR H3 and L3 behaved as positive allosteric modulators of the 2AR by increasing the clenbuterol effect on these cells. The second part of this work concern the modulation of the M2Ach-R activity using two different strategies. First, we investigated the in vivo consequences on heart rate of such antibodies in mice immunized with a peptide derived from the second extracellular loop of the M2AChR. Nine mice, immunized with a peptide corresponding to the N-terminus of the second extracellular loop of the M2AChR were compared to 9 mice immunized with an irrelevant peptide. Sera of mice immunized with the M2ACh-R derived peptide recognized the M2ACh-R on immunoblots and enhanced the agonist activity of carbachol towards the M2AChR transfected in CHO cells. In vivo, no difference could be shown in heart rate nor in heart rate variability between the two groups of mice. In contrast, the decrease in heart rate induced by carbachol was more pronounced in the M2AChR immunized mice compared to the control mice. The increase in heart rate induced by atropine, gallamine and isoproterenol were alike significantly attenuated in the M2ACh-R immunized mice compared to the control mice. Analysis of heart rate variability further argued for an increased parasympathetic response to the different drugs in the M2ACh-R immunized mice. Antibodies raised against the M2AChR can behave as positive M2AchR allosteric modulators in vivo. They might be protective in boosting the activity of the parasympathetic drive to the heart, in particular in patients with a high sympathetic tone. The second strategy was, to construct and produce a single chain variable fragment, from a partial agonist monoclonal antibody directed against the M2ACh-R. It showed high affinity for its target epitope. The fragment is able to recognize its receptor on Chinese hamster ovary cells transfected with the M2ACh-R, to block the effect of carbachol on this receptor and to exert an inverse agonist activity on the basal activity of the receptor. The antibody fragment is also able to increase the basal rhythm of cultured neonatal rat cardiomyocytes, and to inhibit in a non-competitive manner the negative chronotropic effect of carbachol. This antibody fragment is able to exert its inverse agonist activity in vivo on mice heart activity. This works shows that recombinant monovalent antibody fragments directed against te second extracellular loop of GPCR have inverse agonist activity. Bivalent antibodies directed against the same target, show an allosteric positive activity on the receptor. Peptides derived from CDR of the scFv 6H8, keep a pharmacological function, they act as allosteric modulators of the 2AR. These scFv and cyclic peptides may represent leads for a new class of allosteric modulators of GPCR. They also represent tools for understanding of the activation mechanisms of GPCR

Ce travail avait pour but la synthese d'un mimetique de gamma-turn en vue de son incorporation dans des peptides bioactifs. Dans une premiere partie bibliographique, nous avons montre l'interet d'elaborer des peptidomimetiques qui, compares aux peptides natifs, presentent une meilleure stabilite, une biodisponibilite accrue et une plus longue duree d'action. Dans la seconde partie, nous avons decrit les differentes voies de synthese explorees pour atteindre la cible fixee. Ce mimetique de gamma-turn (compose des residus isoleucine, alanine et glycine), versatile quant a ses groupes protecteurs, est directement incorporable dans une chaine polypeptidique et permet l'elongation de la chaine dans les deux sens

La glycoprotéine VI (GPVT), récepteur d'activation précoce des plaquettes par les collagènes, joue un rôle clé dans la thrombose artérielle, processus pathologique commun aux maladies cardiovasculaires. L'inhibition des interactions GPVI-collagène pourrait être une approche efficace pour le développement de nouvelles molécules antithrombotiques. Pour y parvenir, deux stratégies ont été envisagées lors de cette étude : 1) bloquer GPVI par un fragment d'anticorps recombinant, et 2) utiliser un mime peptidique soluble, compétiteur de GPVI. Voie 1 : A partir de l'hybridome 9O12. 2 sécréteur d'une IgG monoclonale, un fragment d'anticorps recombinant scFv a été conçu et exprimé par voie recombinante. Il conserve les caractéristiques de liaison de l'IgG parentale anti-GPVI (haute affinité et neutralisation de l'interaction GPVI-collagène). Ce scFv recombinant purifié inhibe l'agrégation plaquettaire induite par le collagène in vitro dans des conditions mimant le flux artériel. Le scFv humanisé que nous avons ensuite obtenu dans ce travail peut servir de module de base pour le développement d'un Fab humanisé. Voie 2 : Des mimes peptidiques solubles de GPVI ont été identifiés après criblage d'une banque de dodécapeptides vis-à-vis de l'IgG 9O12. 2. L'un d'entre eux a été synthétisé sous forme de peptide contraint. Il se lie au collagène (KD=10"8M) et entre en compétition avec la GPVI recombinante pour la liaison au collagène. La détection d'une accumulation de collagène (fibrose) a été observée in vivo. Cette propriété le rend particulièrement attractif pour le développement d'une méthode d'imagerie isotopique non invasive permettant le diagnostic et le suivi de la fibrose
Glycoprotein VI (GPVI), the major receptor for platelet activation by collagens, plays an important role in arterial thrombosis, a pathologic process common to cardiovascular diseases. Inhibition of GPVI-collagen interaction could represent an attractive strategy to develop antithrombotic molecules. Two approaches were evaluated in this study : 1) Blocking GPVI with a recombinant antibody fragment, and 2) Using a soluble peptidomimetick witch compete with GPVI for binding to collagen. Strategy 1 : Starting from 9O12. 2 hybridoma secreting a monoclonal IgG, a recombinant single chain antibody fragment was design and expressed as a recombinant protein in the periplasm of bacteria. It retains the binding proprietes of the parental IgG (high affinity, neutralisation of GPVI-collagen interaction). Purified scFv is able to inhibit platelet aggregation induced by collagen in vitro in conditions which mimick the arterial flow. The humanized scFv were next obtained an it can be use as a starting block to design a recombinant therapeutic humanized Fab fragment. Strategy 2 : After screening of a random dodecapeptide library expressed at the bacterial surface with the neutralizing antibody IgG 9O12. 2, solubles peptidomimeticks of human GPVI were identified. One of them were synthetized as constrained peptide. It binds to collagen, compete with GPVI for binding to collagen (KD=10"8M). Fibrosis (collagen accumulation) was detected in vivo using radiolabelled peptide. This capacity to bind to collagen is used to develop an non invasive isotopic imagery method for the diagnostic and the evolution of fibrosis

La recherche d'inhibiteurs de glycosidases est un enjeu majeur en chimie thérapeutique. Cette thèse a consisté en la synthèse et l'évaluation biologique d'inhibiteurs potentiels : De type glycomimétique, mimes du substrat ou de son état de transition au sein du site actif. L'accès à des carbosucres et aminocyclitols de structure cyclooctanique a été réalisé à partir de bis-époxydes issus du D-mannitol, mettant en jeu des étapes clés de cyclisation par métathèse ou par couplage réducteur pinacolique. De type peptidomimétique, mimes du coude b du tendamistat, puissant inhibiteur d'a-amylase. La stratégie de type répartiteur utilise comme châssis moléculaire un squelette 1,4-diazépan-2-one obtenu à partir de deux synthons clés : un amino-époxyde, issu des acides D-iso ou L-ascorbique, et un acide aminé. Les deux étapes clés sont : l'ouverture de l'époxyde par l'amine de l'aminoacide et le couplage peptique entre l'acide carboxylique de l'acide aminé et l'amine du synthon époxydé
Conception of glycosidases inhibitors is a task of major interest in therapeutical chemistry. The purpose of this thesis was the synthesis and the biological evaluation of potential inhibitors : Glycomimetic inhibitors, mimicking the substrate or its transition state within the active site. Access to cyclooctanic carbasugars and aminocyclitols from D-mannitol bis-epoxides involves a key step of carbacyclisation by ring closing metathesis or by pinacolic coupling. Peptidomimetic inhibitors, mimicking tendamistat's b turn, powerfull inhibitor of a-amylase. Access to the 1,4-diazepan-2-one scaffold involves two key intermediates : an amino-epoxyde, obtained from D-iso ou L-ascorbic acid and an amino acid. The two key steps are : the opening of the epoxide by the amine functionnality of the aminoacide and the peptidic coupling between the carboxylic acid of the aminoacid and the amine functionality of the amino-epoxyde