Dissertationen zum Thema „Pathogènes fongiques“

Le goéland leucophée endémique dans la région méditerranéenne française. Son mycobiote intestinal n'a jamais été étudié. Ce travail visait à décrire le rôle de ces oiseaux comme réservoir et disséminateur de champignons pathogènes pour l’homme. Nous avons collecté 177 guano de goélands dans cinq sites sur le littoral méditerranéen français; La Grande-Motte, Palavas-les-Flots, Pierre-Blanche, Frioul and Riou archipels. Nous avons identifié dix-sept espèces de levure; les plus fréquentes étant Candida krusei, Galactomyces geotrichum, C. glabrata et C. albicans. On notait d’une part une augmentation de la fréquence des espèces anthropiques de levures C. glabrata et C. albicans avec l’anthropisation des biotopes des colonies de goélands dont d’isolats résistants aux antifongiques. Nous avons analysé les communautés de champignons filamenteux aérocontaminants isolés à partir des mêmes échantillons. Nous avons identifié 16 genres de champignons filamenteux. la faible diversité et abondance de champignons filamenteux dans les zones urbaines par rapport aux suburbains ou à un environnement peu affecté par l'anthropisation et l’association claire entre certaines espèces fongiques et des environnements particuliers. nous avons analysé la génétique des populations de la levure C. glabrata. Nous avons typé par MLVA, 111 isolats de goélands et 79 isolats collectés chez des patients des hôpitaux de Nîmes, Montpellier et Marseille. Nous avons observé une diversité génétique similaire entre les populations de C. glabrata isolées chez le goéland ou chez l’homme. Les isolats de C. glabrata résistants au fluconazole se distribuaient uniformément dans les deux populations
The yellow-legged gull is endemic in the French Mediterranean area. Their gut mycobiota has never been studied. This work aimed to describe their role in the spreading of potentially human pathogenic fungi with antifungal resistance. Therefore, we sampled 177 yellow-legged gull’s faecal samples in five sites along the Mediterranean littoral South of France; La Grande-Motte, Palavas-les-Flots, Pierre-Blanche, Frioul and Riou archipelagos. We identified seventeen yeast species; the most frequent were Candida krusei, Galactomyces geotrichum, C. glabrata, C. albicans and Saccharomyces cerevisiae. The frequency of the anthropic yeast species C. glabrata and C. albicans increased with the synanthropy of the gull’s colonies and antifungal resistance was found in each of the five most frequent yeast species. We further analyzed the airborne filamentous fungi species isolated from the same sample cultures. We identified 35 filamentous fungi species in 16 genera including 35 species. Both fungal diversity and abundance were low in urban area when compared to suburban ecocline or environments that were little affected by anthropogenic impact and particular fungal species were clearly associated with distinct environments. Finally, we analyzed the population genetic of the human pathogenic yeast C. glabrata, which were isolated from gulls (111 isolates) and from patients (79 isolates) in Nimes, Montpellier and Marseille hospitals, via MLVA analysis. We found that the C. glabrata populations isolated from gulls or humans shared a similar genetic diversity. Antifungal-resistant C. glabrata isolates were evenly distributed in both gull and human populations

Dans la mucoviscidose, le tableau clinique est dominé par les infections respiratoires qui constituent la cause majeure de morbidité. Diverses espèces fongiques sont décrites dans ces infections, notamment les Scedosporium et le complexe Rasamsonia argillacea pour lesquels les connaissances restent limitées. Dans ce travail, nous avons évalué l’intérêt de l’amplification des séquences répétitives de l’ADN pour la différenciation spécifique et infraspécifique de ces champignons. La rep-PCR a d’abord été appliquée à l’analyse d'isolats du genre Scedosporium. La rep-PCR a produit des résultats concordants avec ceux obtenus par séquençage du gène de la bêta-tubuline, amplification aléatoire de fragments d’ADN polymorphes et séquençage multi-loci. Elle permet également l’identification précise des espèces au sein du complexe R. argillacea. L’analyse des résultats obtenus sur 116 isolats a montré la capacité de ces champignons à coloniser de manière chronique les voies respiratoires, un même profil électrophorétique étant observé généralement chez un même patient. Enfin, nous avons produit de nouvelles données sur l’écologie des Scedosporium en étudiant différents biotopes au Maroc. Comme précédemment rapporté,ces champignons préfèrent les environnements impactés parles activités humaines. On les rencontre dans des sols de pH neutre, riches en matières organiques et pauvres en sels. Enfin, si S. apiospermum était l’espèce la plus abondante, S. boydii, S. aurantiacum et S. dehoogii ont été rencontrés avec des fréquences comparables. En conclusion, les données générées renforcent nos connaissances sur l’épidémiologie des infections causées par ces pathogènes émergents
In cystic fibrosis (CF), respiratory infections are the leading cause of morbidity and mortality. Bacteria are the most common causative agents of these infections, but an increasing number of fungal species may also be found, including Scedosporium species and species of the Rasamsonia argillacea complex. In order to improve our knowledge on the epidemiology of these infections, here we evaluated the interest of PCR amplification of repetitive DNA sequences (rep-PCR) for species identification and strain delineation. rep-PCR was applied to the retrospective analysis of a panel of 63 isolates belonging to the Scedosporiumgenus. Results were consistent with those obtained by beta-tubulingene sequencing, random amplification of polymorphic DNA and Multilocus Sequence Typing. rep-PCR also permitted precise species identification in the R. argillacea complex. Analysis of the data obtained on 116 isolates revealed the capacity of these fungi to chronically colonize the airways of patients with CF, a unique electrophoretic profile being observed usually for each patient. Finally, we produced in this thesis new data about the ecology of Scedosporium species by studying different biotopes in Morocco. As previously reported, these fungi are mainly found in human-impacted areas. Also they prefer soils with a neutral pH, a high organic matter content and a very low mineral salts content. In addition, if S. apiospermum was by far the predominant species, S. boydii, S. aurantiacum and S. dehoogii were encountered with similar frequencies. In conclusion, data provided here reinforce our knowledge on the epidemiology of the infections caused by these emerging pathogens

Les pommiers sont la cible de nombreux ravageurs et maladies fongiques, à l’origine de pertes économiques importantes. Les agriculteurs sont dans l’obligation de traiter les micro-organismes responsables des maladies fongiques, notamment à l’aide de pesticides. Les produits phytosanitaires sont aujourd’hui très controversés. Ainsi, les pouvoirs publics, français et européens, contrôlent leur emploi par de nombreuses règlementations. Par conséquent, il apparaît nécessaire de proposer une alternative peu rémanente permettant de contrôler le développement fongique. L’objectif de cette thèse est d’évaluer l’efficacité d’une alternative innovante basée sur l’emploi d’eau chargée en ozone contre quatre espèces fongiques à l’origine des principales maladies du pommier : Venturia inaequalis, Botrytis cinerea, Neofabraea alba et Phytophthora syringae. Dans un premier temps, ce travail de thèse a permis de vérifier l’action anti-fongique de l’ozone sur les suspensions de spores des quatre espèces fongiques ainsi que sur différents stades de développement des spores de V.inaequalis. Il a été mis en évidence une différence de sensibilité selon l’espèce et le stade de développement considérés. Par ailleurs, l’altération de la membrane sous l’action de l’ozone a été observée par plusieurs expérimentations : quantification du degré de peroxydation des phospholipides membranaires, observations des spores au Microscope Electronique à Balayage et au Microscope Optique après colorations. Dans un second temps, l’effet de l’eau chargée en ozone a été évalué sur des jeunes plants de pommiers préalablement contaminés par les spores de V.inaequalis. Cette étude a confirmé l’action anti-fongique de l’eau chargée en ozone. Il a également été observé l’importance des quantités d’eau et d’ozone apportées qui doivent être maîtrisées pour optimiser l’efficacité du traitement. Ces résultats permettent de valider la candidature de l’ozone comme fongicide alternatif à l’emploi de produits phytosanitaires. Les modalités d’application devront faire l’objet de recherches supplémentaires en vue du transfert de la technologie du laboratoire au verger
Apple trees are the target of a lot of pests and fungal diseases, responsible for many economic losses. Farmers treat these micro-organisms mainly with pesticides. Plant-protection products are today very controversial. French and European authorities control their use by means of numerous regulations. Therefore, an alternative solution with a low remanence must be found in order to limit fungal diseases. The aim of this thesis is to evaluate the innovative process efficiency based on the use of ozonated water against four fungal species: Venturia inaequalis, Botrytis cinerea, Neofabraea alba and Phytophthora syringae. Firstly, this work of thesis verified the ozone antifungal action on spores suspensions of the four fungal species and on different stages of development of V.inaequalis spores. According to the species and stages of development considered, a difference of sensibility was detected. Moreover, alteration of the membrane, due to ozone action, was observed thanks to several experimentations: quantification of phospholipids peroxidation, spore observations with Scanning Electron Microscopy and with Optical Microscopy after staining. Secondly, the ozonated water effects on seedlings previously contaminated by V.inaequalis spores were evaluated. This study confirmed the anti-fungal action of water containing ozone. It was also observed the importance of the water and of ozone quantities supplied. These quantities must be controlled to optimize the antifungal action of the treatment. These results validated the ozone application as a fungicide alternative of use of pesticides. Additional researches will be made concerning the treatment modalities: the aim is to transfer the technology from the laboratory to the orchard

Les infections fongiques représentent un problème émergeant de santé publique dans les pays développés. C. albicans est une levure dimorphique, commensale des muqueuses orales, génitales et intestinales d’une majorité de la population saine. Elle peut cependant conduire à des infections locales, comme les candidoses orales et vaginales voire à des infections systémiques chez les patients immunodéprimés. Si les interactions entre C. albicans et le système immunitaire de l’hôte sont désormais de mieux en mieux connues, l’invasion des épithélia qui est pourtant à l’origine des processus d’infection, demeure mal comprise. Quatre étapes ont été décrites : l’adhésion de la levure aux cellules de l’hôte, suivi par la filamentation qui permet d’obtenir une hyphe capable d’invasion et parfois de dommage infligé aux les cellules hôtes pouvant aboutir à une translocation dans les tissus profonds. Plusieurs facteurs ont été décrits, tant du côté de l’hôte que du pathogène, comme jouant un rôle dans l’invasion des epithelia, incluant les adhésines et invasines fongiques, la toxine candidalysine et l’E-cadherin de la cellule hôte. Une étude récente de notre équipe basée sur une technique de microscopie live à l’échelle cellulaire a permis de déterminer que l’invasion précoce des cellules épithéliales HeLa et Caco-2 peut faire intervenir deux modes d’interaction et donc deux modes de vie fongiques distincts : (1) l’invasion conduisant au dommage cellulaire, au cours de laquelle la membrane plasmique de la cellule hôte est rompue, fréquemment suivie de la mort de la cellule hôte (2) l’invasion au travers de tunnels trans-cellulaires (CaTCT) au cours de laquelle les hyphes envahissent les cellules hôtes entourés de tunnels de membrane cellulaire, sans dommage. Ces tunnels peuvent être multicellulaires et sont constitués de couches membranaires successives. Les mécanismes moléculaires conduisant à la formation de ces tunnels tant du point de vue fongique que du point de vue de l’hôte ne sont pas connus. L’objectif de ma thèse était d’identifier et de caractériser les facteurs d’hôte et du pathogène impliqués dans l’infection des cellules épithéliales Caco-2, qui ne fait intervenir que l’invasion au travers de CaTCT jusqu’à 9 heures d’infection. A cette fin j’ai développé un outil expérimental de microscopie permettant de quantifier de façon objective, universelle (i.e. pouvant s’appliquer à de nombreux modèles fongiques et de cellules hôtes) et à haut débit l’adhésion, la filamentation l’invasion et le dommage cellulaire au cours d’une seule expérience d’infection in vitro. Cet outil a ensuite été utilisé afin d’étudier plusieurs aspects dede la formation des CaTCT : (1) le rôle de la protéine fongique Als3 au cours de l’adhésion et de l’invasion (2) l’origine cellulaire des membranes impliquées dans les CaTCT (3) le rôle de la toxine peptidique candidalysine et des aspartyl-protéases (4) le métabolisme fongique au cours de l’invasion et notamment du métabolisme du glycogène (5) l’immunité de l’hôte au niveau des muqueuses au travers de la secrétion d’IgA. Le protocole mis en place m’a également permis de screener des souches cliniques commensales et issues d’infections systémiques afin de rechercher de nouveaux facteurs de virulence fongiques. Pour conclure, la nouvelle méthode expérimentale développée au cours de ce projet a permis quelques avancées dans la compréhension du processus énigmatique des CaTCT, et pourra servir à de futures études de l’infection de epithelia par C. albicans mais aussi à celles d’autres pathogènes
Fungal infections are an emerging threat to human health in developed countries. Candida albicans is a dimorphic yeast which colonizes the oral, genital and intestinal mucosa as part of the commensal flora of most of the healthy population. However, it can also lead to local infections such as oral and vaginal thrush and in susceptible patients to severe systemic infections. While much effort has been made in deciphering the interplay between C. albicans and the host at the immunological level, infection begins with invasion of the host epithelium, a process that is only partially understood. At the onset of infection, C. albicans transforms from a yeast to a filamentous hyphal form that can invade and damage epithelial cells, sometimes followed by translocation deeper into host tissues. Several fungal and host molecular factors have been shown to regulate epithelial invasion, including fungal adhesins, invasins and secreted factors such as the fungal toxin candidalysin, as well as host factors such as E-cadherin, which plays a role in C. albicans endocytic uptake. Recent work from our lab based on single cell, live imaging of early invasion into HeLa and Caco-2 cell lines revealed that two invasive lifestyles involving distinct host cellular niches can be exploited by the fungus: (1) Damaging invasion, in which host membranes are breached, leading most often to host cell death; (2) C. albicans trans-cellular tunnelling (CaTCT), in which hyphae extend within host membrane-derived transcellular tunnels without host damage. During CaTCT, hyphae can traverse through several host cells in sequence, leading to the formation of multi-layered tunnel structures. Currently, the molecular factors and cellular mechanisms regulating CaTCT from both the fungal and host sides remain almost entirely undescribed. The objective of my thesis project was to identify and characterize molecular factors and cellular processes regulating early Caco-2 infection by C. albicans, which occurs exclusively via CaTCT for up to 9 hours post-infection. For this purpose, I developed a novel quantitative, high-throughput and universal (i.e. applicable to a wide variety of fungal and host models) experimental imaging assay that uses an automated non-biased approach to provide single cell readouts pertaining to adhesion, hyphal formation, invasion and host damage in a single experiment. I then applied this assay to study several distinct aspects of CaTCT: (1) the function of the fungal Als3 protein in C. albicans adhesion and invasion; (2) the reservoir of host membranes implicated in trans-cellular tunnel formation and extension; (3) the function of the fungal toxin candidalysin and fungal secreted aspartyl proteases (Saps); (4) nutrient uptake and glycogen metabolism ; (5) the role of host secreted IgA in immune defence at the epithelial surface. In order to identify new potential virulence factors, I also employed the assay to screen for differences in epithelial infection between C. albicans clinical strains isolated from commensal and invasive origins. Overall, my work has provided several new insights into the mechanism of CaTCT, which act to further enhance our knowledge of this enigmatic process. Furthermore, the experimental assay developed in this project has important potential applications for future targeted studies and screens relating to C. albicans epithelial infection, as well as infection by other fungal pathogens

Des molecules appelees eliciteurs isolees de la paroi ou du filtrat de culture d'agents microbiens sont capables d'induire chez la plante des reactions de defense dont la synthese de phytoalexines. Chez l'illet, la synthese de phytoalexines, dianthalexine et methoxydianthramide, a ete observee apres traitement des boutures par les filtrats de culture des champignons pathogenes fusarium oxysporum f. Sp. Dianthi et phytophthora parasitica dastur cultives in vitro. Le fractionnement par chromatographie sur deae-cellulose du filtrat de culture de f. Oxysporum a permis d'isoler une fraction non retenue active sur illet. Un fractionnement supplementaire des composes polysaccharidiques de f. Oxysporum f. Sp. Dianthi sur cl4b a conduit a la purification d'une fraction fa composee de glycanes de 10 kda. Ces glycanes, actifs sur illet, contiennent du mannose, du galactose et du glucose lies en (1>3) et (1>4) avec de nombreuses ramifications en 2, 3 et 6 ainsi qu'un hexofuranose di-o-substitue. La fraction non retenue isolee du filtrat de culture de p. Parasitica est tres faiblement active sur illet, elle contient des (1>3)(1>6)-d-glucanes. Par contre l'activite se retrouve essentiellement dans la fraction liee (pl) qui contient en melange des polysaccharides et des proteines. L'eliciteur present dans la fraction pl de p. Parasitica dastur a ete isole par electrophorese preparative. Il s'agit d'une glycoproteine de 25 425 da composee de 17 acides amines differents et dont la partie polysaccharidique renferme du mannose, du galactose et du glucose ainsi que les oses amines galactosamine et glucosamine presents en tres faible quantite. Cette etude (preliminaire) montre que l'eliciteur de phytoalexines chez l'illet possede une nature chimique differente selon la source fongique. Il s'agit d'un glycane de faible masse moleculaire pour f. Oxysporum f. Sp. Dianthi alors que pour p. Parasitica dastur il s'agit d'une glycoproteine de 25 425 da. Les (1>3)(1>6)-d-glucanes exocellulaires de p. Parasitica dastur et la glycoproteine de 25 425 da (gp30) se retrouvent dans le filtrat de culture d'isolats pathogenes et non pathogenes sur tabac appartenant a la variete nicotianae. Ces composes exocellulaires sont tres faiblement actifs sur l'illet. De plus les isolats fortement pathogenes sur tabac (t) produisent une proteine (p) de 11 kda differente de la parasiticeine (e) produite par les isolats faiblements pathogenes (t) ou non pathogenes (nt). Cette proteine p est active sur l'illet. Les isolats de p. Parasitica peuvent etre classes en te p + (isolats pathogenes sur tabac, non producteurs d'elicitine, producteurs de la proteine p), te +p (isolats faiblement pathogenes sur tabac, producteurs de la parasiticeine, non producteurs de la proteine p) et nt e +p (isolats non pathogenes sur tabac, producteurs de la parasiticeine, non producteurs de la proteine p). La glycoproteine (gp30) presente dans les trois classes d'isolats est un marqueur de l'espece parasitica.

Candida albicans est une levure commensale de la flore gastro-intestinale de l'homme. C'est également un des principaux organismes pathogènes opportunistes fongiques. La population de C. Albicans est structurée en clades. Le travail de thèse présenté dans ce manuscrit est consacré à l'étude des événements moléculaires qui sous-tendent la diversité intra- et inter-clades chez C. Albicans. Nous avons montré que la diversification des isolats au cours du commensalisme fait fréquemment intervenir des événements de recombinaison conduisant à de larges pertes d'hétérozygotie (LOH). Par ailleurs, nous avons mis en évidence un excès d'hétérozygotie dans la population, suggérant l'existence d'un mécanisme de contre-sélection des LOH. De plus, nous avons démontré que les échanges génétiques entre les clades et au sein des clades sont rares et que, par conséquent, les clades ne constituent pas des espèces cryptiques. Une étude exhaustive de la variabilité génomique au sein de l'espèce a montré que les souches de C. Albicans peuvent différer par un nombre significatif de SNPs et d'insertions/délétions impliquant majoritairement des éléments transposables et des séquences répétées en tandem. Enfin, et de façon importante, nous avons montré que la distribution de ces indels est hautement corrélée avec la structuration de la population en clades. L'ensemble de ces résultats a contribué à une meilleure compréhension de la diversité génétique et des mécanismes de diversification au sein de l'espèce C. Albicans
Candida albicans is a common component of the human digestive tract and is considered the major opportunistic fungal pathogen. Candida albicans is an asexual yeast with a largely clonal propagation and a population structured in clades. The research project introduced in this manuscript aimed to shed light on the genetic diversity underlying the C. Albicans population, between and within clades. We have shown that, during commensalism, large Loss of Heterozygosity (LOH) events are fréquent. Moreover, we have evidenced an excess of heterozygosity in the C. Albicans population, suggesting that large LOH events ïnust be counter-selected to maintain a high level of heterozygosity. Additionally, we hâve shown that genetic exchanges are rare between and within clades, demonstrating that clades do not depict cryptic species. Finally, we have performed a comprehensive investigation of the genomic variability in the C. Albicans species. The results have shown a significant number of SNPs and insertions/deletions differentiating C. Albicans strains. Indels events, mainly attributed to transposable éléments and tandem repeats, contributed to a gene content variability among strains. Importantly, we have demonstrated that the distribution of the SVs in the population of C. Albicans is superimposable with the assignment of strains to clades. Taken together, our results contribute to a comprehensive overview of the different events underlying the genetic diversity in the C. Albicans population

Candida albicans est un microorganisme commensal du tractus gastro-intestinal et génital de l'Homme, responsable de la majorité des mycoses systémiques. Le succès de C. Albicans en tant que pathogène opportuniste est lié à sa capacité à alterner entre une forme levure et une forme hyphale. Ce dimorphisme est contrôlé par des voies de régulation positives et négatives, coordonnées au sein d'un réseau de signalisation complexe, en réponse à des signaux multiples. Le travail de thèse présenté dans ce manuscrit a été mené dans le but d'approfondir nos connaissances concernant la régulation de la morphogenèse chez C. Albicans. D'une part, nous avons identifié douze gènes régulateurs de la filamentation en réalisant un crible de surexpression pour l'altération de la morphogenèse dans une souche sauvage. Les résultats obtenus à partir d'expériences complémentaires de transcriptomique, de délétion de gènes et surtout de surexpression, nous ont permis de montrer que trois de ces gènes interagissent au sein d'une nouvelle voie de régulation et de positionner ces gènes par rapport à des acteurs majeurs connus de la morphogenèse chez C. Albicans. D'autre part, nous avons mis en évidence trois points importants pour la régulation de la protéine-kinase Yak1, impliquée dans la différenciation hyphale chez C. Albicans : cette protéine s'autorégule sur au moins deux sites de phosphorylation ; sa fonction est réprimée par la kinase AMPc-dépendante ; et, elle interagit avec la protéine Bmhl. De plus, nos données issues d'un crible de suppression et d'une approche de phosphoprotéomique quantitative nous permettent de proposer de nouvelles pistes pour la recherche de cibles de la protéine-kinase Yak1. L'ensemble de nos résultats montre le potentiel de nouvelles stratégies - la construction d'un premier ORFéome partiel et une approche de surexpression systématique - dans l'étude des réseaux de régulation chez C. Albicans
Candida albicans is a commensal organism of the human digestive and genital tracts, responsible for the majority of systemic fungal infections. Its success as an opportunistic pathogen is linked to its ability to undergo a reversible yeast-to-hypha transition. This switch is controlled by both positive and negative regulatory pathways that interact in a complex signalling network in response to multiple signals. The research project introduced in this manuscript aimed to improve our knowledge about the regulation of morphogenesis in C albicans. First, we have performed a screen for genes whose overexpression altered morphogenesis in a wild-type strain and identified twelve regulators of filamentation. Results obtained using transcript profiling, gene inactivation and especially gene overexpression showed that three of these genes form a new regulatory module governing morphogenesis and we have positioned this module relative to known players of morphogenesis in C. Albicans. Second, we have identified three important aspects for the regulation of Yak1, a kinase involved in hyphal differentiation in C. Albicans: this protein is auto-regulated by phosphorylation at two different sites; its fonction is repressed by the cAMP-dependent protein kinase; and it interacts with the Bmhl protein. In addition, data obtained from a screen for multi-copy suppressors of a knock-out mutation in thé YAKJ gène and using a quantitative phosphoproteomics approach allowed us to propose targets of the Yakl protein kinase. Taken together, our results show the potential of new strategies, including the construction of a partial ORFeome and genetic screens based on gene overexpression, in the study of regulatory networks in C. Albicans

Candida albicans est un organisme commensal présent dans le microbiote, qui peut cependant provoquer des infections superficielles mais aussi systémiques, engageant alors le pronostic vital chez les patients immunodéprimés. La transition entre forme bourgeonnante et forme filamenteuse hyphale hautement polarisée, ce qui nécessite une réorganisation du cytosquelette et un trafic membranaire soutenu, est associée à la virulence. Chez les eucaryotes, les GTPases de la famille Rab (Ras related protein in the brain) et leurs régulateurs jouent un rôle central dans le trafic membranaire. L'objectif de ce travail est de comprendre le rôle de ces protéines, en particulier de Ypt6, l'homologue de Rab6 humain, dans la transition morphologique et la virulence de C. albicans. Dans ce but, j'ai construit des mutants « perte de fonction » et déterminé que YPT6 n'est pas essentiel à la viabilité, mais est critique pour l'intégrité de la paroi cellulaire et la croissance hyphale invasive ; les hyphes du mutant ypt6 sont plus courtes que celles de la souche sauvage. En outre, YPT6 est critique pour la virulence dans deux modèles murins de candidose. Lors de la croissance hyphale, Ypt6 est co-localisé avec Arl1, une GTPase de la famille Arf (ADP Ribosylation Factor), également nécessaire pour la croissance hyphale et la virulence de C. albicans. De plus, la surexpression de YPT6 compense spécifiquement le défaut de croissance hyphale du mutant de délétion arl1, mais pas l'inverse. La délétion de YPT6 résulte également en une augmentation du nombre de citernes Golgiennes, suggérant que l'intégrité du Golgi est altérée dans ce mutant. Utilisant de l'imagerie sur cellules vivantes, j'ai montré que la distribution d’Abp1 (Actin binding protein 1), qui est un rapporteur des sites d’endocytose, est aussi altérée dans le mutant ypt6, en ceci qu’elle n’est plus restreinte à l’apex de l’hyphe, comme observé dans les cellules sauvages. Ces données suggèrent que le défaut de maintien de la croissance hyphale du mutant ypt6 est au moins en partie associé à une altération de la distribution des sites d’endocytose. En résumé, j’ai identifié le rôle de Ypt6 dans la croissance hyphale invasive et la virulence du pathogène fongique opportuniste de l’homme C. albicans, et mis en évidence une interaction entre deux GTPases, Ypt6 et Arl1, lors du processus de croissance hyphale
Candida albicans is a harmless constituent of the human microbiota that causes superficial infections as well as life threatening infections in immune compromised individuals. The transition from a budding form to the highly polarized hyphal form is associated with virulence and requires cytoskeleton reorganization and sustained membrane trafficking. In a range of eukaryotes, Ras related protein in the brain (Rab) G proteins and their regulators have been shown to play a central role in membrane traffic. The objective of this work is to understand the role of Rab proteins, in particular Ypt6, the homolog of Human Rab6, in the morphological transition and virulence of C. albicans. To this aim, I generated loss of function mutants and found that YPT6 is not essential for viability, yet was critical for cell wall integrity and invasive hyphal growth, with ypt6 hyphal filaments shorter compared to that of the wild type (WT). Furthermore, YPT6 was important for virulence in two murine candidiasis models. I determined that Ypt6 was localized at the late Golgi compartment during hyphal growth, where it co-localized with Arl1, a small GTPase of the Arf (ADP Ribosylation Factor) family, also required for hyphal growth and virulence. Interestingly, overexpression of YPT6 specifically rescued the hyphal growth defect of the arl1 mutant, but not the converse. Further characterization of the ypt6 deletion mutant showed that the number of Golgi cisternae is increased in this mutant compared to that of WT strain, suggesting an alteration of Golgi integrity. In addition, using live cell imaging I showed that the distribution of Actin binding protein 1 (Abp1), which is a reporter for actin patches, was altered in the ypt6 mutant, in that it was no longer restricted to the tip of the filament, as is observed in WT cells. These data suggest that the defect in hyphal growth maintenance of the ypt6 deletion mutant is at least partly associated with an alteration of the distribution of endocytic sites. Thus, I identified a critical role of Ypt6 during invasive hyphal growth and virulence in the human fungal opportunistic pathogen C. albicans and revealed an interaction between Ypt6 and Arl1 in the hyphal growth process

Candida glabrata est le second agent étiologique des candidoses de l'adulte. Nous avons développé une PCR pour le différentier de C. Bracarensis et C. Nivariensis deux espèces phénotypiquement identiques. Le développement d’une méthode de typage par microsatellites, nous a permis de montrer une répartition des souches principalement au sein de six complexes clonaux, l’un ne comportant que des souches MATα. La méthode a été validée pour le traçage des souches. L’analyse des génotypes de souches isolées du tube digestif humain et d’hémocultures a montré que C. Glabrata pouvait micro-évoluer au niveau du tube digestif, qu’une transmission intrafamiliale existait et que les souches digestives présentaient une diversité génétique plus importante. Celle-ci a été aussi retrouvée par l’analyse du polymorphisme de taille des gènes EPA. Nous avons étudié comparativement l’adhésion in vitro sur cellules Caco2, de souches présentant des génotypes différents. Le niveau d’adhésion n’était pas corrélé aux caractéristiques génétiques mais il existait d’importantes variations selon les souches. Ces résultats devraient être utiles pour des études ultérieures

Pendant l’infection, les agents phytopathogènes sécrètent un arsenal de molécules, appelées effecteurs, éléments clés de la pathogénie qui modulent l’immunité innée de la plante et facilitent l’infection. Leptosphaeria maculans est le champignon responsable de la nécrose du collet du colza. Plus de 650 gènes codant des effecteurs potentiels ont été identifiés dans son génome, dont 7 ont un rôle reconnu dans l’avirulence du champignon. Les effecteurs fongiques correspondent principalement à de petites protéines potentiellement sécrétées (PPS), n’ayant pas d’homologues dans les bases de données et pas de motifs connus. Par conséquent, leur fonction biologique est difficile à prédire, et très peu de choses sont connues sur le mode d’action des effecteurs de L. maculans au cours de l’infection.L’objectif de ma thèse était de caractériser fonctionnellement des effecteurs de L. maculans afin de mieux comprendre leur rôle au cours du processus infectieux. Cette caractérisation fonctionnelle a consisté en : i) la détermination de la localisation subcellulaire de ces effecteurs dans Nicotiana benthamiana et Arabidopsis thaliana ; ii) la recherche de cibles végétales ciblées par ces effecteurs ; et iii) la détermination des processus cellulaires impactés par ces effecteurs par expression stable dans A. thaliana et tests de suppression de mort cellulaire dans N. benthamiana. Quatre effecteurs ont été choisis pour cette étude : AvrLm10-1, AvrLm10-2, AvrLm4-7 et AvrLm3.AvrLm10-1 et AvrLm10-2 sont tous les deux nécessaires pour induire une reconnaissance par le gène de résistance Rlm10. Des orthologues d’AvrLm10-1 et AvrLm10-2 ont été identifiés chez des Dothidéomycètes et des Sordariomycètes phytopathogènes ainsi que plusieurs paralogues exprimés spécifiquement pendant l’infection chez L. maculans. AvrLm10-1 et AvrLm10-2 présentent toutes les deux une localisation nucléo-cytoplasmique. Une interaction physique entre AvrLm10-1 et AvrLm10-2 a été mise en évidence, ainsi qu’une interaction potentielle de ces deux protéines avec une protéine PR1 (Pathogenesis-related 1) et une cystéine-protéase végétale.AvrLm4-7 est reconnu par deux gènes de résistance, Rlm4 et Rlm7, et sa présence empêche la reconnaissance d’AvrLm3 par Rlm3. AvrLm4-7 est capable de supprimer la mort cellulaire provoquée aussi bien par des inducteurs généraux de la mort cellulaire que par des inducteurs de la PAMP-Triggered Immunity (PTI) et de l’Effector-Triggered Immunity (ETI). AvrLm4-7 présente une localisation nucléo-cytoplasmique, qu’il soit exprimé avec ou sans son peptide signal, ce qui suggère un mode d’action intracellulaire. AvrLm4-7 interagit potentiellement avec une protéine ribosomale végétale, de la même manière qu’un effecteur de Blumeria graminis avec lequel il partage des analogies structurales. Cependant, des lignées d’A. thaliana exprimant AvrLm4-7 de façon constitutive ne présentent aucune différence morphologique ou de sensibilité aux maladies comparativement à l’écotype sauvage Col0.AvrLm3 est un gène d’avirulence très conservé dans les populations de L. maculans dont la reconnaissance par le gène de résistance Rlm3 est supprimée en présence d’AvrLm4-7. AvrLm3 est capable de supprimer la mort cellulaire associée à la PTI et à l’ETI. Cet effecteur est localisé dans l’apoplasme des cellules foliaires lorsqu’il est exprimé avec son peptide-signal, suggérant un mode d’action extracellulaire. AvrLm3 interagit potentiellement avec une myrosinase-associated proteine sécrétée impliquée dans le système myrosinase-glucosinolate, suggérant qu’AvrLm3 perturberait la synthèse des glucosinolates, ce qui est un mode d’action inédit pour un effecteur d’agent phytopathogène.Cette thèse a permis de mieux comprendre le mode d’action des effecteurs de L. maculans et de proposer de nouvelles stratégies de contrôle des maladies fongiques
During infection, plant pathogens secrete an arsenal of molecules collectively known as effectors that circumvent plant innate immunity and trigger infection. The phytopathogenic fungus Leptosphaeria maculans is the causal agent of stem canker of oilseed rape. More than 650 putative effector-encoding genes have been identified in its genome, 7 of them corresponding to avirulence genes. Fungal effectors mainly correspond to small secreted proteins (SSP) with no known homologs and no predicted functions. Their biological function is therefore difficult to predict, and very little is known about the mode of action of L. maculans effectors during infection.The objective of my thesis was to elucidate the role of L. maculans effectors during infection through their functional characterization which included: i) the determination of their subcellular localization in Nicotiana benthamiana et Arabidopsis thaliana; ii) a search for their plant targets; and iii) the determination of the cellular processes targeted by those effectors through their stable expression in A. thaliana and by testing their ability to suppress cell-death in N. benthamiana. We investigated four effectors in that study: AvrLm10-1, AvrLm10-2, AvrLm4-7 and AvrLm3.AvrLm10-1 and AvrLm10-2 are both necessary to trigger recognition by the Rlm10 resistance gene. We have identified orthologs for AvrLm10-1 and AvrLm10-2 in Dothideomycetes and Sordariomycetes phytopathogens, and several paralogs in L. maculans which are expressed specifically during oilseed rape infection. AvrLm10-1 and AvrLm10-2 both have a nucleo-cytoplasmic localization. AvrLm10-1 and AvrLm10-2 physically interact, and may also interact with a PR1 (Pathogenesis-related 1) protein and a secreted cysteine-protease. AvrLm4-7 is recognized by two resistance genes, Rlm4 and Rlm7, and suppresses recognition of AvrLm3 by Rlm3. AvrLm4-7 suppresses cell-death triggered by general inducers, PAMP-Triggered Immunity (PTI) and Effector-Triggered Immunity (ETI). AvrLm4-7 has a nucleo-cytoplasmic localization, whether expressed with or without its signal peptide, suggesting an intracellular mode of action. One of the potential plant targets for AvrLm4-7 is a ribosomal protein, just like a Blumeria graminis effector with structural analogy to AvrLm4-7. Transgenic lines of A. thaliana constitutively expressing AvrLm4-7 do not show any morphological phenotypes or any difference in their susceptibility to diverse fungal pathogens. AvrLm3 is an avirulence gene strongly conserved in L. maculans populations. Recognition of AvrLm3 by Rlm3 is suppressed by the presence of AvrLm4-7. AvrLm3 suppresses cell-death triggered by several inducers of PTI and ETI. AvrLm3 is localized in plant apoplasm when expressed with its signal peptide, suggesting an extracellular localization. AvrLm3 potentially interacts with a secreted myrosinase-associated protein implicated in the myrosinase-glucosinolate system, suggesting that AvrLm3 could disturb glucosinolate production, which is a novel mode of action never described for a plant pathogen effector.My thesis allowed us to improve our knowledge on fungal effector function during infection and to propose new strategies for plant diseases management

Les protéines de type STE12 sont des facteurs de transcription qui régulent la croissance invasive chez Saccharomyces cerevisiae et le pouvoir pathogène des champignons parasites. Ces protéines renferment un homéodomaine impliqué dans la liaison à l'ADN. Chez les champignons filamenteux, un domaine supplémentaire contenant un doublet de doigts de zinc de type C2H2/Zn2+ est présent dans la région amino-terminale, de rôle inconnu. Un gène de type STE12 (CLSTE12) a été isolé récemment du champignon filamenteux parasite du haricot, Colletotrichum lindemuthianum. L'étude de l'expression du gène a révélé la présence de deux types d'ARNm, issus de l'épissage différentiel d'un exon. La délétion de l'exon conduit à la perte d'un doigt de zinc dans la protéine correspondante. En conditions de pathogenèse, les deux transcrits sont induits rapidement, puis le niveau de transcrit dépourvu d'un exon chute brutalement au moment de la formation de l'appressorium, une structure spécialisée dans l'infection, tandis que celui de pleine taille reste élevé. La fonction des deux protéines a été testée par expression hétérologue dans la levure. .
STE12-like proteins are transcription factors that regulate invasive growth in Saccharomyces cerevisiae and pathogenicity in parasitic fungi. These proteins harbour a homeodomain involved in DNA binding. In filamentous fungi, an additional domain is found, containing a couple of C2H2/Zn2+ fingers, whose role is unknown. Recently, a STE12-like gene (CLSTE12) was isolated from the fungal bean pathogen, Colletotrichum lindemuthianum. Gene expression studies revealed the presence of two mRNAs, resulting from the alternative splicing of an exon. The skipping of the exon leads to the deletion of one zinc finger in the corresponding protein. At the onset of pathogenesis, both transcripts were induced rapidly, then the expression level of the shorter transcript suddenly decreased during the formation of a specialized infection structure -the appressorium-, whereas that of the full-length transcript remained high. .

Le champignon Fusarium graminearum est l'un des principaux agents responsables de la fusariose des épis, une maladie nécrosante des céréales associée à une contamination des grains et des aliments par des mycotoxines. De récentes observations suggèrent une évolution de l’agressivité des populations de ce pathogène, questionnant l’efficacité et la durabilité des moyens de luttes actuels. Mieux anticiper cette évolution nécessite une meilleure caractérisation de la diversité phénotypique et génotypique existante entre souches. Six nouveaux génomes de F. graminearum ont été séquencés et ont permis l’identification et la caractérisation de 243 000 variations génétiques. La majorité de ces variants (77%) est concentrée dans des îlots de polymorphisme, représentant 32% du génome et enrichis en probables effecteurs liés à la pathogénicité de F. graminearum. La construction d’une population recombinante, et son génotypage avec 1 300 marqueurs moléculaires, ont permis le développement de la première carte génétique à haute-densité de l’espèce. La corrélation entre le taux de recombinaison et le polymorphisme a mis en évidence une organisation « à deux-vitesses » du génome de cette espèce. Finalement, l’intégration de ces données dans une approche de génétique quantitative a permis l’identification d’un locus polymorphe, affectant le gène FgVeA, et responsable de 90% de la variation d’agressivité et de la production de mycotoxine observée. Les différents résultats obtenus durant ces travaux font l’objet d’une discussion générale sur le potentiel adaptatif et d’évolution de ce pathogène
F. graminearum is one of the main causal agents of the fusarium head-blight (FHB), a cereal disease leading to head necrosis, in addition to grain and food/feed contamination by stable and toxic metabolites. Recent observations refer to an increase of pathogenicity, questioning efficiency and durability of current management practices. In order to anticipate this evolution, we must bring a deeper characterization of the currently existing diversity. Six new genomes of F. graminearum were sequenced, and 243,000 genetic variations have been identified and characterized. Seventy seven percent of the total number of the variants was located within 32% of the genome, delineating highly polymorphic islands. These islands are enriched with probable effectors linked to Fusarium’s pathogenicity. The construction and the genotyping on 1,300 molecular markers of a recombinant population have enabled the development of the first high-density genetic map of the species. The remarkable correlation between polymorphism and recombination rate highlighted the 'two-speed' genome organization of this pathogen. Finally, the integration of these data through a quantitative genetic approach allowed the discovery of one quantitative trait locus, likely to affect the gene FgVeA, and responsible for 90% of the observed variation of aggressiveness and mycotoxin production. These results are discussed in the light of F. graminearum’s adaptive potential and evolution

Le microbiote des plantes peut moduler leur fitness. Comprendre les processus écologiques qui dirigent son assemblage est nécessaire pour promouvoir la croissance et la santé des plantes via la manipulation de sa composition. La graine et le sol sont les deux principaux réservoirs du microbiote de la plante et donc essentiels pour son assemblage. Dans cette thèse, nous avons montré que la structure du microbiote des graines de Brassica napus est surtout façonnée par l’environnement mais également par le génotype de l’hôte. Le produit de la coalescence des communautés des graines et du sol a été évalué avec des sols de diversité microbienne contrastée et des lots de graines distincts. Seule la diversité microbienne du sol module la structure du microbiote des racines et des tiges.Les plantules favorisent l’émergence de taxons rares issus des graines et du sol. L’influence de ces niveaux de diversité sur une maladie a été mesurée avec le champignon pathogène Rhizoctonia solani. Le sol de diversité élevée entraîne une réduction de maladie pour un lot de graines, révélant un rôle du microbiote des graines. Aucun lien entre le microbiote des graines, le microbiote des plantules et la maladie n’a pu être établi. La transmission de communautés synthétiques bactériennes a ensuite été mesurée. Leur inoculation sur graines impacte la diversité du microbiote des plantules et la maladie. La connaissance de la coalescence, la transmission de taxons rares et l’utilisation de communautés synthétiques révèlent de nouveaux leviers de pilotage de l’assemblage du microbiote des plantules et
Plant microbiota can modulate host fitness. Understanding the ecological processes that drive its assembly is a prerequisite for promoting plant growth and health via the manipulation of its composition. Seed and soil are two main sources of plant microbiota inoculum and are therefore critical for its assembly. In this thesis, we showed that the structure of the seed microbiota of Brassica napus is primarily shaped by the environment and to a lesser extent by host genotype. The output of community coalescence between seed and soil microbiota was assessed with soils of contrasting microbial diversity and with distinct seed samples. Soil diversity but not seed diversity modulates seedling microbiota structure in roots and stems.Overall, seedling favors the emergence of seed- and soil-borne rare taxa. Impact of these different levels of initial diversity on a plant disease were monitored during inoculation with the pathogenic fungus Rhizoctonia solani. The soil of high diversity promotes disease reduction for one particular seed lot, giving rise for a role of the seed microbiota. No link between initial seed microbiota, seedling microbiota and disease could be established. The transmission of bacterial synthetic communities was subsequently monitored. Their inoculation on seed influences seedling microbial diversity and disease. Coalescence knowledge, transmission of rare taxa from seed to seedling and synthetic community using, give new inputs to drive seedling microbiota assembly and disease reduction

La carotte, légume racine le plus consommé au monde, voit sa production fortement impactée par diverses maladies dont la brûlure foliaire. Cette maladie, provoquée par le champignon nécrotrophe Alternaria dauci, est considérée comme la plus préjudiciable des maladies foliaires de la carotte. Développer des variétés présentant un niveau de résistance fort et durable à cette maladie est l'un des objectifs principaux des sélectionneurs, notamment en cumulant différentes résistances partielles dans un même génotype. Afin d'optimiser un tel cumul, il est nécessaire de comprendre les mécanismes associés à ces résistances. Dans la première partie de cette thèse, nous avons étudié l'implication de métabolites de défense produits par la carotte dans la résistance partielle de la plante à A. dauci. Nous avons montré un effet inhibiteur de la 6- méthoxymelléine (6-MM) et du falcarindiol, sur le développement du champignon. Cet effet est plus important avec le falcarindiol. De plus, la teneur en falcarindiol est supérieure chez le génotype résistant (Boléro) en comparaison avec le génotype sensible (Presto) et, suite à l'inoculation de la plante par A. dauci, la 6-MM s'accumule de façon plus importante dans les feuilles du génotype résistant. Ces molécules de défense pourraient ralentir le développement du champignon et participer ainsi à la résistance. Dans une seconde partie, nous nous sommes intéressés à l'effet de métabolites toxiques produits par le champignon sur des cultures cellulaires de carotte. Nos résultats montrent une corrélation entre le comportement des cellules traitées (viabilité cellulaire, embryogenèse somatique et activité enzymatique) et la sensibilité/résistance des génotypes évaluée au niveau de la plante entière. Parmi les génotypes les plus résistants au champignon, le génotype I2 résiste mieux à l'application d'extraits fongiques que le génotype K3. Ainsi, la résistance partielle de la carotte face à A. dauci semble inclure des résistances aux toxines. Dans le dernier chapitre, nous avons recherché un lien entre la résistance partielle et les mécanismes de défense de la plante, en particulier ceux liés à la voie des jasmonates. Nos premiers résultats montrent la surexpression du gène PR4 chez le génotype résistant K3, comparativement aux autres génotypes, y compris I2. Nous avons par ailleurs recherché des sites polymorphes (SNP) dans les séquences de quatre gènes de défense. Deux gènes (PAL, GLP) présentent un polymorphisme de séquence entre génotypes. Dans le cas de GLP, les SNPs mis en évidence permettent de différencier un génotype sensible (H1) du génotype K3. L'ensemble de ces résultats semble indiquer la présence d'une diversité des modalités de la résistance partielle de la carotte face à A. dauci. Ainsi, la résistance aux toxines semble jouer un rôle plus important chez I2 que chez K3. Inversement, la résistance de K3, et non celle de I2, semble impliquer la voie des jasmonates. Audelà de leur application en amélioration, ces travaux jettent une lueur sur les mécanismes de la résistance partielle, mécanismes encore très peu connus, même parmi les interactions modèles.

La paroi cellulaire fongique est une couche externe et robuste composée principalement de polysaccharides, qui protège la cellule fongique de son environnement, médie l'interaction cellule-cellule et est responsable de la forme de la cellule. La paroi cellulaire du pathogène opportuniste Aspergillus fumigatus est essentiellement composée de ß(1,3)glucane qui est synthétisé au niveau de la membrane plasmique par un complexe transmembranaire puis modifié dans l'espace pariétal par des activités de ramification, de réticulation et de dégradation. La paroi cellulaire est une structure hautement dynamique qui subit des changements constants au cours de la morphogenèse fongique. Dans cette étude, nous avons étudié le rôle de trois familles de glycoside-hydrolases (GH16, GH17 et GH55) dans le remodelage du ß(1,3)glucane la paroi cellulaire de ce pathogène fongique par différentes approches. Les activités transglycosidase et glucanase respectivement de AfCrh5p et AsScw11p ont été étudiées en utilisant des protéines recombinantes et la première structure cristallographique de la famille Crh a été résolue. D’autre part, une délétion complète des gènes de chaque famille a été réalisée pour étudier la fonction biologique de ces enzymes et a mis en évidence un rôle à de multiples facettes de ces glycosides-hydrolases dans la morphogenèse du champignon filamenteux, A. fumigatus
The fungal cell wall is an outer and robust layer mainly composed of polysaccharides, which protects the fungal cell from its environment, mediates cell-cell interaction, and is responsible for the shape of the cell. The cell wall of the opportunistic pathogen Aspergillus fumigatus is essentially composed of ß(1,3)glucan which is synthesized at the plasma membrane by a transmembrane complex and then modified in the cell wall space by branching, cross-linking and degradating activities. The cell wall is a highly dynamic structure, which undergoes constant change during cell division, growth and morphogenesis. In this study, we investigated the role of three glycoside-hydrolases families (GH16, GH17 and GH55) in cell wall remodeling of this fungal pathogen by different approaches. Transglycosidase and glucanase activities of respectively AfCrh5p and AsScw11p have been studied by using recombinant proteins and the first crystal structure of the Crh family have been resolved. Furthermore, complete deletion of each family's genes has been performed to study the biological function of these enzymes and highlighted a multi-faceted role of this glycosides-hydrolases in the morphogenesis of the filamentous fungus, A. fumigatus

Les interactions entre plantes et agents pathogènes sont fréquentes dans la nature, mais conduisent rarement à une maladie. En effet, les plantes ont un système immunitaire efficace capable de faire face à la plupart des attaques microbiennes. Les agents pathogènes fongiques représentent néanmoins une menace majeure pour la sécurité alimentaire dans le monde. Sclerotinia sclerotiorum est un champignon pathogène de la famille des Ascomycetes responsable de la maladie de la pourriture blanche sur des centaines d'espèce de plantes. Il n'y a aucune source génétique de résistance complète à ce pathogène connue et les moyens de lutte reposent essentiellement sur l'utilisation de fongicides. Mieux comprendre les bases moléculaires de l'interaction entre S. sclerotiorum et ses plantes hôtes est indispensable à l'amélioration des cultures végétales. La résistance à S. sclerotiorum se caractérise par un continuum de symptômes dans les populations végétales naturelles. Cette observation suggère que la résistance est contrôlée par de multiples gènes, un phénotype appelé résistance quantitative (QDR). Mon projet de thèse a consisté dans une première partie à identifier les mécanismes moléculaires sous-jacents à la QDR vis-à-vis de S. sclerotiorum dans des accessions naturelles de la plante modèle Arabidopsis thaliana. Une analyse de génétique d'association à l'échelle du génome (GWA) m'a permis d'associer la variabilité génétique avec le niveau résistance à S. sclerotiorum et d'identifier trois loci potentiellement impliqués dans la QDR à S. sclerotiorum. J'ai effectué l'analyse fonctionnelle des gènes candidats et étudié la diversité génétique à ces différents loci. Mes résultats ont révélé qu'une prolyl-oligopeptidase (POQR) et une protéine reliée au complexe d'actine (ARPC4) sont impliqués dans la résistance quantitative à S. sclerotiorum. L'étude du réseau d'actine par microscopie confocale a révélé le rôle des filaments d'actine dans la réponse immunitaire à S. sclerotiorum. Je montre par ailleurs que l'allèle de POQR conférant résistance à S. sclerotiorum a évolué de façon convergente chez plusieurs espèces de plantes, suggérant que certains mécanismes de la QDR sont communs à différentes espèces végétales. Alors que de nombreux champignons pathogènes ne sont capables d'infecter que quelques génotypes de plantes, S. sclerotiorum est un agent pathogène dit généraliste, c'est-à-dire capable d'infecter de nombreuses espèces d'hôtes. Dans la deuxième partie du projet, je me suis intéressé aux propriétés du génome de S. sclerotiorum associées à son caractère généraliste. La théorie prédit que le généralisme est coûteux énergétiquement, si bien qu'il doit engendrer d'importants compromis avec d'autres traits. Au niveau génétique, certains codons (triplets de nucléotides) permettent une traduction plus efficace que leurs synonymes. En effet, le code génétique décryptant ADN/ARN en protéines est redondant, plusieurs codons pouvant coder pour le même acide aminé. Optimiser l'usage de codons au niveau du génome permet ainsi de réduire les coûts liés à la production de protéines. J'ai analysé l'usage de codons chez les 45 espèces fongiques et révélé que les séquences codantes chez les espèces de pathogènes généralistes étaient fortement optimisées. Par ailleurs, je montre que les codons adaptés sont sous sélection purifiante dans une population naturelle de S. sclerotiorum, suggérant que l'optimisation de l'usage de codons est une adaptation évolutive au généralisme chez les champignons parasites
In nature, plant pathogen interactions are frequent but disease is not the most prevalent outcome. Indeed, plants evolved an efficient immune system able to face multiple pathogen attacks. Getting insights into plant microbe interactions at multiple levels will improve our understanding of how plants defend against pathogens and help building sustainable agronomy. Fungal plant pathogens are major threats to food security worldwide. Sclerotinia sclerotiorum is an Ascomycete generalist plant pathogen causing mold diseases on hundreds of plant species. There is no genetic source of complete plant resistance to this generalist pathogen known to date. Instead, natural plant populations show a continuum of resistance levels controlled by multiple genes, a phenotype designated as quantitative disease resistance (QDR). Little is known about the molecular mechanisms controlling the interaction between plants and S. sclerotiorum, and more generally which are the molecular bases underlying QDR in plants. My thesis project consisted in a first part in identifying molecular mechanisms underlying QDR to S. sclerotiorum in natural accessions of the model plant Arabidopsis thaliana. A Genome wide association study (GWAS) allowed me to associate genetic variation with disease resistance to S. sclerotiorum. The analysis pinpointed three genes in A. thaliana genome as putative candidates involved in QDR to S. sclerotiorum. I led the functional characterization of these genes and investigated natural diversity at these loci. The results revealed that a prolyl-oligopeptidase (POQR) and an actin-related protein complex member (ARPC4) are associated with QDR against S. sclerotiorum. The analysis of actin filament networks highlighted their role in response to S. sclerotiorum. Furthermore, I showed that POQR alleles evolved convergently in different plant lineages, suggesting that some QDR molecular mechanisms are conserved across plants. Among fungal parasites, some like S. sclerotiorum are able to infect multiple species while others are restricted to one or few hosts. In the second part of the project, I investigated the properties of S. sclerotiorum genome associated to its ability to infect hundreds of plant species. Theory predicts that generalism comes at a cost and may underlie important fitness trade-offs. At the genome level, some codons (nucleotide triplets) allow more efficient translation than their synonymous. Indeed, the genetic encoding of proteins is redundant with multiple codons specifying the same amino acid. The optimization of codon-usage is a mean to reduce the costs associated with protein production. I analysed codon-usage at the genome level in 45 fungal species to reveal that generalist parasites are highly codon optimized. Moreover, I showed that optimized codons are under purifying selection, suggesting that codon optimization is an adaptation to generalist parasitism in fungi

Nous avons étudié la voie MAPK Mps1/Slt2 du champignon pathogène du riz Magnaporthe Oryzae. Chez la levure, Slt2 active les facteurs de transcription Rlm1, Swi4 et Swi6. Nous avons identifié le gène orthologue de ScSWI4 chez M. oryzae et étudié les rôles de Mps1, Rlm1, Swi4 et Swi6 en comparant les phénotypes de leurs mutants nuls. Δmps1, Δswi4, Δswi6 ont le même défaut de mélanisation, tandis que Δmps1 et Δrlm1 sont déficients pour la sporulation. L'absence d'hyphes aériens et d'hydrophobicité du mycélium sont des phénotypes spécifiques de Δmps1, tandis qu'une réduction de croissance est associée spécifiquement à Δswi4 et Δswi6. Aucun de ces mutants ne présente une hypersensibilité aux enzymes de dégradation de la paroi (EDPs) et aux inhibiteurs de la paroi (aculeacine A, nikkomycin Z, calcofluor white : CFW). La pathogénie de Δswi4 est réduite, tandis que celle de Δswi6 est similaire à la souche sauvage. Δmps1 et Δrlm1 sont non pathogènes. La transcriptomique comparative de la souche sauvage, Δmps1, Δrlm1 et Δswi4 montre qu'il n'existe qu'un petit nombre de gènes sur- ou sous- exprimés chez ces mutants, le nombre maximal étant observée entre Δmps1 et Δswi4. Le gène AGS1 encodant l'alpha-1, 3-glucane synthase, une cible supposée de Mps1, n'est ni sur- ni sous-exprimé chez ces mutants. La souche sauvage et Δmps1 ont la même sensibilité aux EDPs et au CFW à pH6. Cependant, à pH5, la souche sauvage devient résistante aux EDPs et au CFW à pH6. Cependant, à pH5, la souche sauvage devient résistante aux EDPs et au CFW, tandis que Δmps1 perd cette résistance, suggérant qu'elle nécessite Mps1. Notre étude montre que la voie MAPK Mps1 joue un rôle important dans plusieurs processus biologiques de M. oryzae et précise quels sont les cibles
We have studied the Mps1/Slt2 MAPK signalling pathway in the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. In yeast, Slt2 activates the transcription factors Rlm1, Swi4 and Swi6. We have identified the M. oryzae gene orthologous to ScSWI4 and studied the roles of Mps1, Rlm1, Swi4 and Swi6 in M. oryzae by comparing the phenotypes of their null mutants. Δmps1, Δswi4, Δswi6 displayed the same defects in melanisation, while Δmps1 and Δrlm1 are defective in sporulation. Loss of aerial hyphae formation and mycelium hydrophobicity are phenotypes specific of Δmps1, while reduced growth is a specific phenotype of Δswi4 and Δswi6. None of these mutants displayed an increased sensitivity against cell wall degrading enzymes (CWDEs) and cell wall inhibitors (aculeacine A, nikkomycin Z, calcofluor white : CFW). Pathogenicity was reduced in Δswi4, while Δswi6 was as pathogenic as WT. Δmps1 and Δrlm1 were non-pathogenic. Comparative transcriptomic of WT, Δmps1, Δrlm1 and Δswi4 highlighted only a limited number of genes up- and down-regulated in these mutants, with the largest number observed between Δmps1 and Δswi4. The alpha-1,3-glucan synthase encoding gene AGS1, a suggested Mps1 target, was not up- nor down-regulated in these mutants. WT and Δmps1 have a similar sensitivity to CWDE and CFW at pH6. However, at pH5, WT displays a resistance to CWDEs and CFW, while Δmps1 loses this pH5 induced resistance, suggesting it requires the Mps1 pathway. This work shows that Mps1 MAPK pathway has an important role in different M. oryzae biological processes and provides new insights on its transcriptional targets